KR102532614B1 - 가공식품 및 농산물의 설치류 오염여부를 판별하는 방법 - Google Patents

가공식품 및 농산물의 설치류 오염여부를 판별하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 농산물 또는 식품의 생산 및 가공품에 대한 설치류의 오염을 확인하는 검사법에 대한 것으로 곤충 및 설치류에 의한 교차오염은 방충/방서관리를 통해 시스템적으로 수행하고 있으나, 제품에서의 직접적인 검사는 실시하고 있지 않다는 점에서 시료 내에 설치류 유전자를 추출하는 방법, PCR 및 RT-PCR을 이용하여 오염여부를 정성/정량적으로 판별하는 방법을 제공한다. 구체적으로 시료에서 핵산인 DNA를 추출하는 1단계; RT-PCR 또는 PCR을 이용하여 설치류에 의한 오염여부를 확인하는 2단계;를 포함하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법에 있어서, 상기 1단계는 a) 식품으로부터 샘플을 획득하는 단계; b) 상기 획득한 샘플을 반응 용기로 옮겨 상기 샘플을 수-비혼화성상(water-immiscible phase)에 접촉시키는 단계; c) 상기 수-비혼화성상에 접촉된 상기 샘플을 용해시키는 단계; d) 상기 용해된 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.

Description

가공식품 및 농산물의 설치류 오염여부를 판별하는 방법 {Method for determining whether processed foods and agricultural products are contaminated with rodents}
본 발명은 농산물 또는 식품의 생산 및 가공품에 대한 설치류의 오염을 확인하는 검사법에 대한 것이다.
농산물 생산 및 식품 가공에서의 이물의 발생 요인, 유입 경로는 다양하다. 예를 들어 다양한 농산물 및 식품 제조/생산에 있어 공급되는 원·부재료를 통한 유입이 가능하며, 식품을 생산하는 과정에서의 유입, 작업장 종사자의 개인 위생관리 미흡에 따른 유입, 작업장 내 방충/방서관리 미흡에 따른 유입, 보관 및 유통에서의 유입이 가능하다.
식품 등에 생물학적 이물이 혼입되어 제품의 품질을 현저히 떨어뜨리는 것은 일반적으로 알려져 있는 사실이다. 특히 HACCP을 취득한 업체의 경우 방충/방서관리가 필수적이다. 그러나 이러한 관리에도 불구하고 설치류에 의한 이물 사고가 발생하고 있다.
제조과정 중 교차오염을 통한 생물학적 위해요소를 제어하기 위해 대장균을 위생지표(분변 오염의 지표)로 제품에서 검사를 수행하고 있다. 그러나 최근 위생지표로 대장균만을 검사하는 것은 위험성이 있음이 보고되고 있다.
곤충 및 설치류에 의한 교차오염은 방충/방서관리를 통해 시스템적으로 수행하고 있으나, 제품에서의 직접적인 검사는 실시하지는 않고 있다. 특히 설치류의 경우 감염병을 유발할 수 있는 바이러스 및 세균에 대한 보균 가능성은 매우 높기 때문에 이에 대한 관리가 필요하다.
0001)한국 등록특허 제10-2017-0033194호 0002)일본 등록특허 제4714947호 0003)일본 공개특허 제2003-265181호 0004)일본 등록특허 제5036272호
본 발명을 통하여 설치류에 오염된 농산물 및 가공식품의 제조·유통을 사전에 차단할 수 있도록 유전자분석법을 통해 판별법을 개발하고 생물학적 위해요소를 지표로 선정하고자 한다.
본 발명은 식품 및 농산품의 설치류 오염을 과학적으로 검사하기 위한 기술로 시료 내에 설치류 유전자를 추출하는 방법, PCR 및 RT-PCR을 이용하여 오염여부를 정성/정량적으로 판별하는 방법에 관한 기술이다.
한편, 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 시료에서 핵산인 DNA를 추출하는 1단계; RT-PCR 또는 PCR을 이용하여 설치류에 의한 오염여부를 확인하는 2단계;를 포함하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법에 있어서, 상기 1단계는 a) 식품으로부터 샘플을 획득하는 단계; b) 상기 획득한 샘플을 반응 용기로 옮겨 상기 샘플을 수-비혼화성상(water-immiscible phase)에 접촉시키는 단계; c) 상기 수-비혼화성상에 접촉된 상기 샘플을 용해시키는 단계; d) 상기 용해된 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 용해된 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계는 A260/A280 및 A260/A230이 1.7 내지 2.2 일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단하는 것을 포함하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 2단계는 서열번호 1 내지 5의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR 또는 PCR을 수행하는 단계인 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 단계 a)의 식품으로부터 획득하는 샘플은 절임배추, 고춧가루, 가공식품으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 단계 b)는 상기 식품 샘플을 식품 농축 배양하여, 250 μl 내지 500 μl를 반응용기로 전달하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 원심 분리단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단계b)는 식품 샘플을 수-비혼화성상과 접촉시킴으로써, 식품 유래 억제제와 같은 억제제를 식품 샘플로부터 제거하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단계b)의 수-비혼화성상(water-immiscible phase)은 유기상인 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단계b)의 수-비혼화성상(water-immiscible phase)은 알코올과 혼화되지 않는 것임을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단계b)의 수-비혼화성상(water-immiscible phase)은 사이클릭, 포화 또는 불포화 탄화수소 또는 방향족 탄화수소를 포함하는 것임을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단계c)는 열 처리가 수행되어 식품 농축 샘플의 용해를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 열 처리는 80 ℃ 내지 89 ℃에서 3 내지 5분 동안 가열하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의하여 식품 생산 및 가공에 있어서 위생 관리 및 질병 예방을 효율적이고 통합적으로 관리하기 위한 관리 방법을 제공하고, 그에 따라 식품 가공업체의 이물 관리 및 쥐 매개에 의한 교차오염(세균, 곰팡이, 바이러스 등)을 사전에 막음으로써 식품 가공업체에서 이물신고에 의한 피해를 줄이고, 안전한 식품을 생산할 수 있다.
다만, 본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 특성 및 장점에 대한 중요성은 첨부된 도면을 참조하여 더욱 잘 이해하게 될 것이다. 그러나, 도면은 단지 예시의 목적으로 고안된 것이지 본 발명의 제한을 정의하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
도1은 양성시료(마우스 분변) 및 음성 시료 PCR 결과에 관한 것이다.
도2는 DNA 농도별 RT-PCR 결과에 대한 그래프이다.
이하에서는, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시 예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시 예에 불과하므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.
본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다.
"제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결될 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다고 언급된 때에는 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 한편, 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용되는 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석될 수 없다.
본 발명은 농산물 또는 식품의 생산 및 가공품에 대한 설치류의 오염을 확인하는 검사법을 제시하고자 한다.
식품 샘플에서 DNA를 추출하는 단계
본 발명에 따르면, 식품 샘플로부터 핵산, 특히 설치류의 DNA를 분리하는 방법이 제공되며, 이는 다음 단계를 포함한다 :
a) 식품으로부터 샘플을 획득하는 단계;
b) 상기 획득한 샘플을 반응 용기로 옮겨 상기 샘플을 수-비혼화성상(water-immiscible phase)에 접촉시키는 단계;
c) 상기 수-비혼화성상에 접촉된 상기 샘플을 용해시키는 단계;
d) 상기 용해된 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;
본 발명의 각각의 개별 단계 a) 내지 d)를 이하에서 상세히 설명한다.
단계 a)에서, 식품 샘플이 제공된다. 식품 샘플은 절임배추, 고춧가루 등의 가공식품을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
단계 b)에서, 식품 샘플의 일부가 반응 용기로 전달된다. 이를 위해, 일반적으로 식품 농축 배양의 적절한 분량, 예를 들어 100 μl 내지 1500 μl, 150 μl 내지 1000 μl, 200 μl 내지 750 μl 또는 바람직하게는 250 μl 내지 500 μl가 반응 용기로 전달된다.
반응 용기는 임의의 형태 또는 크기를 가질 수 있다.
필요한 경우, 원심 분리 단계가 수행 될 수 있다. 그러나, 이러한 단계는 필수는 아니다. 식품 샘플에 수-비혼화성 조성물(water-immiscible phase), 예를 들어 미네랄 오일에 의해 식품 샘플이 접촉하는 수-비혼화성상(water-immiscible phase) 층을 제공한다. 이것은 본 발명에 따른 방법의 필수 단계이다.
식품 샘플과 접촉하는 수-비혼화성상을 제공하면 핵산 분리 결과가 개선된다. 수-비혼화성상은 식품 샘플의 상부에 제공되거나 식품 샘플의 하부에 제공 될 수있다. 바람직하게는 식품 농축 샘플의 상부에 제공된다. 식품 샘플을 수-비혼화성상과 접촉시킴으로써, 식품 유래 억제제와 같은 억제제가 식품 샘플로부터 제거되는 것으로 예상된다. 이러한 억제제는 핵산 분리 공정을 방해 할 수 있고, 분리 된 핵산에서 효과적으로 제거되지 않으면 검출 방법을 방해 할 수 있는 억제제이다. 핵산 분리 프로토콜이 단순하고 신속해야하므로, 이러한 억제제는 문제를 야기한다. 식품 샘플과 접촉하는 수-비혼화성상을 제공하는 것은 현저한 효과를 갖는데, 특히 유기 또는 지용성 억제 성분이 식품 농축 샘플로부터 수-비혼화성상으로 추출된다. 이에 의해, 식품 농축 샘플이 각 억제제로부터 분리되어, 핵산 분리 효과가 향상 될 수 있다. 각각의 억제제는 음식 샘플로부터 유래 될 수 있고, 따라서 음식을 포함하거나 음식 샘플에 포함 된 병원체, 각각 음식 농축 샘플로부터 유래 될 수 있다. 최대한의 효과를 위해, 수-비혼화성상을 제공하는 수-비혼화성 조성물은 생균 성 및 온전한 박테리아를 함유하는 가공되지 않은 식품 샘플과 직접 접촉된다. 이 단계는 샘플이 화학적으로 변형되기 전과 병원체가 용해되기 전에 억제제를 감소시키는 중요한 사전 세척 단계에 해당한다.
수-비혼화성상은 먼저 식품 샘플을 반응 용기로 옮긴 후, 예를 들어 수-비혼 화성 상으로 식품 농축 샘플을 덮음으로써 제공 될 수있다. 대안 적으로, 수-비혼 화성 조성물이 먼저 제공 될 수 있고, 식품 농축 샘플은 수-비혼화성 층의 상부에 피펫팅 될 수 있다. 이러한 과정을 통하여 식품 농축 샘플과 접촉하는 수-비혼화성상이 제공된다. 바람직하게는, 식품 샘플을 수-비혼화성 조성물과 접촉시킨 후, 수-비혼화성상이 식품 농축 샘플의 상부에 형성된다.
수-비혼화성상은 바람직하게는 유기상이다. (친 유성이다). 실질적으로 물과 혼화 할 수 없고 뚜렷한 상 경계를 갖는 상을 형성 한 물을 첨가 할 때의 모든 액체 또는 액체 혼합물은 수-비혼화성상을 제공하는데 사용될 수 있다. 수-비혼화성 조성물은 바람직하게는 알코올 또는 다른 친수성 또는 수성 유체와도 혼화되지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 수-비혼화성상은 하나 이상의 치환 또는 비치 환, 분지 또는 비 분지 탄화수소에 의해 제공된다. 또한, 수-비혼화성상은 사이클릭, 포화 또는 불포화 탄화수소 (예를 들어 사이클로 헥산) 또는 방향족 탄화수소 (예를 들어 벤젠 또는 톨루엔 등)를 포함 할 수 있으며, 이러한 탄화수소는 물과 혼화성이 아니다. 일 구현 예에 따르면, 수-비혼화성상을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용 된 탄화수소는 예를 들어 하나 이상의 할로겐 원자, 나이트로 기 및 / 또는 아미노기를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체 예에서, 수-비혼화성 층은 탄화수소, 바람직하게는 포화 탄화수소를 포함하거나 이들로 구성된다. 적합한 탄화수소는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 탄소를 갖는 분 지형 또는 비분 지형, 치환 또는 비치 환 된 비 환식 또는 환식 탄화수소이다. 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 탄소 원자를 갖는 분 지형 또는 비분 지형 치환 탄화수소가 사용될 수있다. 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 개의 탄소 원자를 갖는 비치 환, 분 지형 또는 비분 지형 탄화수소가 사용될 수 있으며, 그 중에서 n- 옥탄, n- 노난, n- 데칸 및 / 또는 n- 도데 칸 또는 미네랄 오일은 매우 바람직하다. N- 옥탄, n- 노난, n- 데칸 또는 n- 도데 칸뿐만 아니라 이들의 혼합물이 더욱 바람직하다. 용어 "미네랄 오일"은 특히 예를 들어 미네랄 원료로부터 유래 된 액체 증류 생성물을 지칭한다. 실질적으로 지방족 및 포화 탄화수소의 혼합물로 이루어진 석유, 갈탄 및 흑탄, 목재 등을 포함한다. 증류 생성물 또는 탄화수소 혼합물, 예를 들어 바람직하게는 13 내지 20 개, 특히 바람직하게는 14 내지 16 개의 탄소 원자를 갖는 알케인을 주로 함유하는 백색 오일 및 / 또는 다른 파라핀 오일이 특히 바람직하다. 다른 예는 액체 왁스를 포함한다. 바람직하게는 식품 농축 샘플 상에 층을 형성하는 수-비혼화성상은 실리콘 오일을 포함하거나 이로 구성 될 수 있다. 실리콘 오일은 다른 기질에 대해 고도로 불활성이고 높은 퍼짐성을 나타내기 때문에 적합하며, 이는 특정 특성의 형성과 함께 발생한다. 소수성. 특히, 적합한 실리콘 오일은 반 유기 중합체 및 실리콘-산소 단위와 유기 측쇄의 공중 합체에 기초한 합성 오일이다. 규소 및 산소 원자로 이루어진 비 분지 중합체 또는 공중 합체가 바람직하다. 상기 언급 된 모든 화합물은 식품 농축 샘플을 덮는데 사용될 수 있는 수-비혼화성상을 제공하기 위해 혼합물 형태 (예를 들어, 미네랄 오일과 같은 탄화수소 혼합물)로 사용될 수있다.
수-비혼화성상 조성물은 바람직하게는 식품 샘플의 상부에 제공되는 폐쇄 된 수-비혼화성상을 제공하기에 적합한 양으로 첨가된다. 폐쇄된 층을 제공하면 수-비혼화성상과 식품 샘플 사이의 밀접한 상호 작용을 보장하여 우수한 분리 효과를 달성하는데 유리하다. 식품 샘플의 각각의 전체를 덮을 수 있도록 하기 위해 첨가되어야하는 수-비혼화성상의 양은 특히 식품 샘플을 처리하기 위해 사용되는 반응 용기의 디자인 및 치수에 의존한다. 바람직하게는, 식품 샘플은 넓은 표면적을 제공하는 반응 용기에 포함되어, 수-비혼화성상과 식품 샘플 사이의 상호 작용을 개선되도록 한다. 이것은 억제제를 분리하도록 하는 효과에 유리하다. 또한, 식품 농축 샘플이 고농도의 식품 매개 억제제를 포함하는 경우, 수-비혼화성상은 더 두꺼운 것이 바람직하다. 적절한 양은 본원에 제공된 정보 및 지침을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
식품 농축 샘플과 접촉하여 수-비혼화성상을 제공 한 후, 바람직하게는 식품 농축 샘플의 상단에 상기 샘플은 단계 c)에서 용해 준비가 된다. 본 발명의 방법의 바람직한 구체 예에 따르면, 단계 c)에서 열 처리가 수행되어 식품 농축 샘플의 용해를 촉진시킨다. 단계 c)는 본 발명의 바람직한 교시에 따라 매우 효율적이고 간단한 중요한 단계이다. 여기서 상기 열처리는 접촉하는 음식물 농축 샘플을 가열하는 것을 포함하고, 바람직하게는 수-비혼화성상과 2 분 동안 접촉되는 것을 포함한다. 적어도 80 ℃에서, 바람직하게는 적어도 85 ℃에서, 보다 바람직하게는 적어도 89 ℃에서 20 분, 바람직하게는 3 내지 15 분, 더욱 바람직하게는 3 내지 10 분, 가장 바람직하게는 3 내지 5 분. 식품 샘플은 대략 89 ℃ 내지 100 ℃에서 5 분 동안 가열 될 수 있다. 이 가열 단계는 시간 소모적이며 값 비싼 효소 용해 단계를 대체 할 수 있다.
d) 상기 용해된 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계는 본원에 제공된 정보 및 지침을 사용하여 당업자에 의해 수행될 수 있으며 이에 대하여 구체적인 방법을 특별히 한정하지는 않는다.
DNA의 농도 및 순도 판단
DNA 원액의 농도는 DNA 원액을 TE 완충용액(pH 8.0)으로 적절히 희석한 후 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때 DNA 농도가 50 ng/μL인 것으로 하여 계산한다. 한편, 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260, 280 nm에서 흡광도를 각각 측정한다. A260/A280과 A260/A230이 1.7∼2.2일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단한다.
A260/A280가 1.7 이하인 경우 단백질 유래 불순물의 혼입으로 추정할 수 있으며, A260/A230이 1.7 이하 일 경우 유기화합물(phenol, guanidine salt, ethanol) 등 부식산의 혼입을 예상할 수 있다. 이러한 경우 PCR을 수행하는데 방해물질로 작용하여 PCR 증폭 효율의 감소를 야기할 수 있다. 따라서 A260/A280과 A260/A230이 1.7∼2.2일 경우가 가장 바람직하다.
다만, 가공식품의 경우 이러한 순도 적용이 어려운 경우가 있으므로 반드시 적용되는 것은 아니다. 만일 A260/A280이 낮아 단백질 유래 불순물의 혼입이 우려되는 경우 단백질 분해효소(protease)로 처리한 후 DNA를 회수하며, A260/A230이 낮을 경우 전분 분해효소(amylase)로 처리한 후 DNA를 회수하여 PCR에 사용한다.
DNA 원액에 대한 DNA 농도로부터 PCR에 필요한 DNA 농도가 되도록 TE 완충용액(pH 8.0) 또는 멸균증류수로 희석하여 잘 흔들어 섞은 후 spin down한 것을 PCR용 DNA로 하고, 20 μL씩 0.5 mL 튜브에 분주하여 -20℃ 이하에서 냉동 보존한다. 소분 보관 중인 PCR용 DNA는 사용 전 실온에서 서서히 녹여 잘 흔들어 섞은 후 spin down하여 사용하고, PCR 후 남은 용액은 재사용하지 않고 폐기한다. 또한 DNA 원액의 농도가 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 재추출하고, 그래도 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 원액을 PCR용 DNA로 사용하거나 다음과 같은 농축과정을 실시하여 사용한다.
추출 DNA 원액의 농축은 시중에 판매되고 있는 DNA 농축킷트를 사용하거나, 다음과 같은 방법에 의한다. 3 M 초산나트륨 (pH 5.2)을 DNA 용액량의 1/10배 (10 M 초산암모늄을 사용할 경우에는 1/5배를 첨가)를 첨가하고 차게 한 에탄올을 2배량 가한 후 12,000 G에서 15분간 원심분리한다 (이소프로판올을 사용할 경우에는 1배량을 첨가한 후 상온에서 원심분리한다). 원심분리 후 상층액은 버리고 염(salt)을 제거하기 위하여 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, TE 완충용액(pH 8.0) 또는 멸균증류수 적당량으로 녹인 후 사용한다.
최초의 DNA 원액이 소량일 경우에는 멸균증류수를 사용하여 시작량을 300∼400 μL로 한 후 농축해도 무방하다.
실험예1. 시료에서의 핵산인 DNA 추출 방법 선정
유전자 추출 비교(DNeasy mericon Food kit, Fast DNA spin kit for Soil, DNeasy Blood & Tissue kit)
총 3개의 kit에서 DNA를 추출하였으며, 이 중 DNeasy blood & Tissue kit는 식품시료(100 mg 이상) 추출에서 어려움이 있으며, RT-PCR 결과에서도 부정확한 결과를 얻었다. DNeasy mericon Food kit와 Fast DNA spin kit for Soil 간의 DNA 추출 후 농도 및 purity를 비교하였으며, DNA 농도의 경우 soil kit가 상대적으로 높게 나왔으나, mericon kit가 A260/280 및 A260/230에 대한 purity가 높게 측정되었다. A260/A280 및 A260/230이 1.7~2.2 일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단하였다.
표 1. 유전자 추출 키트 비교_DNA 추출 농도 및 purity
시료
(soil kit)		 DNA 농도
(ng/μL)		 A260/280 A260/230 시료
(mericon food kit)		 DNA 농도
(ng/μL)		 A260/280 A260/230
1 137.9 1.78 0.92 1 90.3 1.80 1.77
2 105.4 1.75 1.21 2 79.2 1.81 1.66
3 121.7 1.54 0.50 3 74.6 1.82 1.83
4 84.2 1.73 1.11 4 80.4 1.79 1.65
5 192.0 1.79 1.55 5 135.0 1.83 2.11
6 109.8 1.75 1.25 6 65.3 1.85 1.93
7 42.7 1.66 0.67 7 26.9 1.83 1.54
8 164.1 1.78 1.43 8 63.9 1.82 1.92
9 100.9 1.76 0.99 9 71.5 1.80 1.75
10 160.1 1.73 0.97 10 101.5 1.78 1.71
mouse 137.85 1.78 0.92 mouse 65.38 1.85 1.93
red pepper 105.35 1.75 1.30 red pepper 90.32 1.80 1.77
mouse
+red pepper		 109.75 1.75 1.10 mouse
+red pepper		 101.51 1.82 1.83
추출된 DNA로 RT-PCR을 수행한 결과 soil kit는 마우스 분변에서 불검출이 나왔으며, mericon kit는 양성 결과가 나왔으며, 쥐에 오염이 되지 않은 고춧가루에서 마우스 분변을 첨가하여 추출하였을 때도 양성 결과를 확인하였다.
표 2. 유전자 추출 키트 비교_RT-PCR
시료
(soil kit)		 Ct value 시료
(mericon food kit)		 Ct value
mouse 불검출 mouse 30.54±0.42
red pepper 불검출 red pepper 불검출
mouse+red pepper 불검출 mouse+red pepper 32.59±0.27
실험예 2. RT-PCR 을 이용하여 설치류에 의한 오염여부를 확인하기 위한 프라이머 디자인
cytb 유전자에 기초한 한 쌍의 범용 뮤린 프라이머 (Seq-F, Seq-R)는 표적 뮤린 종의 증폭 된 서열을 확인하도록 설계하였다. PCR 산물을 시퀀싱하고 정렬 한 다음 Primer Premier 5.0을 사용하여 쥐와 관련된 프라이머 및 프로브를 설계하였다 .(표 3 참조) 실험실 쥐, 실험실 마우스 및 야생 마우스의 프로브 표적화 영역에서, 야생 마우스로부터의 하나의 뉴클레오티드(T)는 다른 두 종과 상이 하였다. (C).따라서, 하나의 축퇴 염기 (Y)가 발산 염기 C / T를 강화하기 위해 사용되었고, 프로브 RM-P는 3 종의 모든 쥐 종에 적합하다.
재조합 서열을 플라스미드 pUC57에 삽입하여 IPC를 구축 하였다. 본 발명에 사용 된 모든 프라이머 및 프로브의 서열을 표 3에 나타내었다. IPC 플라스미드를 real-time PCR 시스템에서 10 배 연속 희석하여 반응 당 0.01 ng 인 것으로 결정된 최적의 IPC 양을 결정 하였다.
실험예3.PCR 을 이용하여 설치류에 의한 오염여부를 확인하기 위한 프라이머 디자인
프라이머는 표적 종의 ATPase 서브 유닛 8 유전자 서열의 다중 증폭을 위해 설계되었다. 프라이머의 선택은 물리적 변수 : 용융 온도, 자기 상보성, 2 차 구조 및 Oligo 4.0 및 BLAST 프로그램 (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)을 사용하여 검사 된 교차 반응성과 같은 물리적 매개 변수를 기반으로 하였다.
더욱이, 설계된 프라이머를 사용하여 증폭 된 PCR 단편의 크기는 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 구별 될 수 있어야한다. 선택된 프라이머 및 예상되는 PCR 산물 크기는 표 3에 제시되어있다.
실험예4. 마우스 분변을 이용한 RT-PCR 및 PCR 확인
표3. 설치류 검사를 위한 RT-PCR 및 PCR primer
종류 프라이머 서열정보 길이
(mer)		 PCR 산물
크기(bp)		 타겟 gene
RT-PCR RM-F CCG CCC AAT CAC CCA AA 17 133 bp cytochrome b
RM-R GCC TCC GAT TCA TGT TAA GA 20
RM-P TAC TGA ATY CTA GTA GCC AAC 21
PCR mou_F ACT AAA AGT CTC ATC ACA AAC ATT CCC ACT G 31 295 bp
mou_R GTG CTC AGG TTC GTC CTT TTG GTG T 25
rat_F AAA ATT GTA GCC ACA GGA AAA ACA GAC AAT 30 261 bp
rat_R GTG CTC AGG TTC GTC CTT TTG GTG T 25
양성시료(마우스 분변) 및 음성 시료 PCR 결과를 통해 설치류에 의해 오염된 시료를 확인할 수 있었다. (도 1 참조)
위 실험에서 Ct value와 DNA농도와의 관계는 도2에 나타나 있다.
실험예5. 시중에 유통 중인 고춧가루를 구입하여 설치류 오염여부를 RT-PCR로 확인
시중에 유통 중인 고춧가루를 구입하여 설치류 오염여부를 RT-PCR로 확인하였다. 총 48개의 시료에 대해서 RT-PCR을 수행한 결과 23개에서 양성 결과를 얻었다.
표 4. 고춧가루에서 RT-PCR 분석한 결과
시료 Ct value 시료 Ct value 시료 Ct value
1 35.41096 17 35.95478 33 35.33505
2 35.49582 18 불검출 34 36.41255
3 불검출 19 불검출 35 33.47163
4 불검출 20 불검출 36 32.24548
5 37.78354 21 불검출 37 35.0457
6 37.38982 22 불검출 38 불검출
7 34.80507 23 35.73937 39 33.60645
8 36.33444 24 34.79736 40 33.48935
9 불검출 25 불검출 41 33.2307
10 불검출 26 불검출 42 34.88395
11 불검출 27 32.46074 43 불검출
12 불검출 28 불검출 44 36.16161
13 불검출 29 불검출 45 31.51155
14 불검출 30 불검출 46 불검출
15 불검출 31 불검출 47 30.26416
16 불검출 32 불검출 48 36.66758
식품 샘플에 양성시료가 얼마나 많은 양으로 포함되어 있는지 판별하기 위해서는 qPCR을 통해 도2의 정량 곡선 및 시료의 Ct 값을 통해 정량할 수 있다.
(예시) 시료 1의 0.2 g에서 DNA를 추출하였을때, 전체 DNA는 100 μL 용출하였으며, 이 중 2 μL를 qPCR을 통해 DNA 증폭하여 Ct 값이 35.41096이 나왔을 때, 다음과 같이 계산한다.
Figure 112020099443320-pat00001
설치류의 전체 genome sequence는 2.5~2.9 Gbp이며, 660 g/mole은 평균 1 bp dsDNA의 질량이며, 6.022 ×1023은 아보가드로 수로 다음과 같이 계산한다.
Figure 112020099443320-pat00002
그러므로 고춧가루에서 검출된 설치류 DNA(Cyc b)의 Ct 값이 35.4일 때 다음과 같이 계산된다.
Figure 112020099443320-pat00003
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Method for determining whether processed foods and agricultural products are contaminated with rodents <130> A20-377 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 ccgcccaatc acccaaa 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gcctccgatt catgttaaga 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 tactgaatyc tagtagccaa c 21 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 actaaaagtc tcatcacaaa cattcccact g 31 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 gtgctcaggt tcgtcctttt ggtgt 25 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 aaaattgtag ccacaggaaa aacagacaat 30 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 gtgctcaggt tcgtcctttt ggtgt 25

Claims (12)

  1. 시료에서 핵산인 DNA를 추출하는 1단계;
    RT-PCR 또는 PCR을 이용하여 설치류에 의한 오염여부를 확인하는 2단계;를 포함하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법에 있어서,
    상기 1단계는 a) 식품으로부터 샘플을 획득하는 단계;
    b) 상기 획득한 샘플을 반응 용기로 옮겨 상기 샘플을 수-비혼화성상(water-immiscible phase)에 접촉시키는 단계;
    c) 상기 수-비혼화성상에 접촉된 상기 샘플을 용해시키는 단계;
    d) 상기 용해된 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 2단계는 서열번호 1 내지 5의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR 또는 PCR을 수행하는 단계인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 용해된 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계는 A260/A280 및 A260/A230이 1.7 내지 2.2 일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단하는 것을 포함하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)의 식품으로부터 획득하는 샘플은 절임배추, 고춧가루, 가공식품으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 원심 분리단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계b)의 수-비혼화성상(water-immiscible phase)은 유기상인 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계b)의 수-비혼화성상(water-immiscible phase)은 알코올과 혼화되지 않는 것임을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계b)의 수-비혼화성상(water-immiscible phase)은 사이클릭, 포화 또는 불포화 탄화수소 또는 방향족 탄화수소를 포함하는 것임을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계c)는 열 처리가 수행되어 상기 수-비혼화성상에 접촉된 상기 샘플의 용해를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 열 처리는 80 ℃ 내지 89 ℃에서 3 내지 5분 동안 가열하는 것을 특징으로 하는 식품의 오염여부를 판별하는 방법.
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