KR100386135B1 - 신증후성출혈열바이러스의검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열 목록에서 SEQ ID Nos. 1 내지 5로 표시되는 핵산 및 그것의 상보 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 최소한 하나의 핵산의 일부분을 역전사 및 2단계의 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는 것으로 이루어지는, 신증후성 출혈열 바이러스(이하 HFRSV라 언급한다)의 검출 방법, 이 방법에 의해 DNA가 증폭되는 시험될 샘플중의 HFRSV를 검출하기 위한 방법, 및 특정의 핵산 서열 또는 그것의 변이 서열을 가지는, HFRSV 검출에 사용하기 위한 프라이머에 관한 것이다.

Description

신증후성 출혈열 바이러스의 검출방법
본 발명은 신증후성 출혈열 바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유전 공학 방법에 의한 바이러스의 특정 핵산 영역의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전 공학적 수단에 의한 검출에 사용하기 위한 프라이머에 관한 것이다.
신증휴성 출혈열(이하 "HFRS"라 함)은 설치류(들쥐 또는 실험실 래트)에 의해 운반되고 사람 및 동물에서 모두 공통적인 감염성 질병이다. 사람에서 신증후성 출혈열은 주요 증상으로서 신장 질환을 수반하는 급성 감염을 유발하는 한편, 설치류에서는 영구적인 감염이 자주 발견되며, 이는 따라서 감염원이 된다.
이 증후군은 극동 아시아, 러시아 및 유럽 전역에 걸친 광범위한 지역에서 발견되었을 뿐만아니라, 최근에는 미국에서도 보고되었다[Science, 262, 914-917 (1993)]. 이 질병에 걸리는 환자들의 수는 전 세계적으로 매년 수십만명에 달한다. 일본에서는 실험실 래트에 의해 운반된 감염 및 이에 의해 유발된 치사 사건들이 보고되었다.
1978년에 리(Lee) 등에 의하여 아포데무스 아그라리우스(Apodemus agrarius)의 폐로부터 한탄 균주(strain)가 단리된 이래로, 일본에서 실험실 래트로부터 단리된 B-1 균주를 포함하여, 10개 이상의 한탄 바이러스 균주(이하 "HFRSV"로 언급함)이 야생 또는 실험실 마우스 및 HFRS 환자들의 폐, 혈액, 종양, 췌장 등으로부터 단리되었다.
한탄 바이러스 속에 속하는 HFRSV 한탄 균주는 극등 아시아에서 가장 강력한 병원성을 가지며, 10 내지 15%의 치사율을 유발한다[Anitekkusu, 5(6), 273-276 (1993)].
B-1은 서울 속에 속하는 HFRSV의 균주로, 그의 병원성은 한탄 균주에 비해 약하나, 일본에서는 숙주로서 래트를 통해, 현재 우세하고 강력한 감염성을 갖는다.
HFRSV는 부니야비리대(Bunyaviridae)과에 속하는 단일 가닥의 RNA 바이러스로, 이의 RNA는 라지(L 사슬), 미디움(M 사슬) 및 스몰(S 사슬)로 표시되는 세 개의 절편으로 구성된다.
HFRSV RNA의 복제는 RNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 이루어지며, 바이러스가 활성인 상태의 감염된 세포는 (-) 사슬 게놈성 RNA(vRNA)뿐만 아니라 vRNA에 상보성이고 vRNA 복제에 필요한 (+) 사슬 RNA(cRNA), 및 (+) 사슬 mRNA를 함유한다. HFRS는 현재 임상적인 증상에 근거한 판단 이외에 혈청 진단법에 의해 진단된다. 최근에, HFRS의 진단은 또한 중합효소 연대 반응(PCR) 방법을 사용하고 있다[JP-A-3-120000; Science, 상기 참조].
혈청 진단법은 간접 형광 항체 기법 및 유사한 검출 방법을 사용하여 수행된다. 항체 검출 기법은 특이성이 높기 때문에, HFRS의 개시후 초기 단계에서의 진단을 가능하게 한다. 그러나, 항체 검출 기법은 단지 바이러스의 상태를 간접적으로만 보여주며, 바이러스의 존재를 직접적으로 보여주지 못한다.
각각의 HFRSV 입자들은 4가지 타입의 단백질 및 유전자로 구성되며, HFRSV의 성질은 유전자에 의해 규정된다.
바이러스의 존재는 PCR을 사용하여 HFRSV유전자에 특징적인 누클레오티드 서열을 증폭시킴으로써 질병의 보다 초기 단계에서 매우 높은 민감성으로 직접적이고 신속하게 검출될 수 있다.
그러나, 지금까지 보고된 PCR 기법들은 임상적으로 수집된 샘플들, 특히 바이러스가 극미량으로 존재하는 혈액 샘플에서의 바이러스의 검출을 위해서는 민감성의 견지에서 만족스럽지 못하다.
그러므로, 본 발명의 목적은 보다 큰 민감성으로 PCR에 의해 증폭될 수 있는 HFRSV 핵산의 영역을 밝혀내는 것이고, 이에따라 이의 검출 방법및 상기 방법에서 HFRSV의 검출에 사용을 수 있는 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 1관점은 HFRSV의 검출 방법에 관한 것으로, 이 방법은 각각 서열 목록에 서열 변호 1 내지 서열 번호 5로 표시된 핵산들 및 이들의 상보 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산의 일부를 역전사 및 후속되는 2개의 PCR 단계들에 의해 증폭시키는 것을 포함한다.
본 발명의 제 2관점은 HFRSV의 검출 방법에 관한 것으로서, 이 방법은,
(a) 시험할 샘플로부터 핵산을 단리하는 단계;
(b) 단리한 핵산에 대해, 서열 목록에 서열 번호 6으로 표시된 핵산 단편 또는 이의 변이 서열 및/또는 서열 목록에 서열 변호 7로 표시된 핵산 단편 또는 이의 변이 서열로부터 선택된 프라이머를 사용하여 역전사를 수행하므로써, 역전사 DNA생성물을 수득하는 단계;
(c) 역전사 DNA 생성물에 대해, 서열 목록에 서열 변호 6으로 표시된 핵산 단편 또는 이의 변에 서열을 서열 목록에 서열 변호 7로 표시된 핵산 단편 또는 이의 변이 서열과 조합하여 사용하는 제 1의 PCR 단계를 수행하므로써, DNA를 증폭시키는 단계;
(d) 증폭시킨 DNA에 대해, 서열 목록에 서열 번호 8로 표시된 핵산 단편 또는 이의 변이 서열을 서열 목록에 서열 번호 9로 표시된 핵산 단편 또는 이의 변이 서열과 조합하여 사용하는 제 2의 PCR 단계를 수행하므로써, DNA를 증폭시키는 단계; 및
(e) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 제 3의 관점은 서열 목록에 서열 번호 6 내지 서열 번호 9로 표시된 핵산 서열 또는 이의 변이 서열을 가지는, HFRSV의 검출에 사용하기 위한 프라이머에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 제 4의 관점은 HFRSV를 검출하기 위한 키트에 관한 것으로서, 이 키트는 서열 목록에 서열 변호 6으로 표시된 핵산 서열 또는 이의 변이 서열과 서열 목록에 서열 번호 7로 표시된 핵산 서열 또는 이의 변이 서열을 가지는프라이머 쌍 및 서열 목록에 서열 번호 8로 표시된 핵산 서열 또는 이의 변이 서열과 서열 목록에 서열 번호 9로 표시된 핵산 서열 또는 이의 변이 서열을 가지는 다른 프라이머 쌍을 포함한다.
HFRS의 진단은 HFRSV 유전자를 검출하므로써 이루어질 수 있다. 많은 유전자 검출 방법이 있으나, 높은 민감성 검출을 달성하기 위해서는 2단계 PCR이 가장 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 프라이머들은 극동 아시아에서 가장 강력한 병원성을 가지고 있고 지역적으로 분포되어 있는 한탄 속에 속하는 HFRSV, 및 일본에 널리 분포되어 있는 서을 속에 속하는 바이러스의 유전자 서열을 고려하여 디자인될 수 있다. 한탄 속과 서울 속의 HFRSV의 유전자 서열들과 높은 상동성을 나타내며, 2 단계 PCR에 의해 높은 민감성으로 검출될 수 있는 영역을 결정할 목적으로, 본 발명자들은 이들 유전자들을 표적으로서 사용하는 다양한 프라이머들을 조사하였고, M 사슬 G2영역에서 목적하는 핵산 영역을 발견하였으며, 이로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명을 하기에서 상세하게 설명하기로 한다.
한탄 속에 속하는 공지의 HFRSV 균주들의 예로는 한탄 76-118 균주 및 리(Lee) 균주가 있으며, 서울 속에 속하는 것들로는 서울 B-1 균주, 80-39 균주 및 SR-11 균주가 있다. 이들 균주의 게놈 RNA의 cDNA는 이미 클로닝되었고, 이들의 누클레오티드 서열들도 각기 문헌에 보고되었다[Virology, 157, 31-39 (1987), J. Gen. Virol., 69, 1949-1955 (1988), Nucleic Acids Research, 18, 4936-4937(1990), Virus Research, 19, 47-58 (1991)및 Virology, 176, 114-125 (1990)].
이들 누클레오리드 서열에 기초하여, 한탄 HFRSV 및 서울 HFRSV와 높은 상동성을 가지는 핵산 영역들이, 선택된 핵산 영역의 역전사에 사용하기 위한 프라이머들, 즉 주형으로서 역전사 DNA 생성물을 사용하는 제 1의 PCR 단계(이하 "제 1 PCR"이라 한다) 증폭에 사용하기 위한 한쌍의 프라이머들 및 주형으로서 제 1 PCR에 의해 증폭된 DNA 생성물을 사용하는 제 2의 PCR 단계(이하 "제 2 PCR"이라 한다) 증폭에 사용하기 위한 다른 쌍의 프라이머들을 디자인하고 합성하기 위해 선택된다. 이와같이 본 발명자들에 의해 선택된 한탄 속과 서울 속에 공통적인 RNA 영역들의 예에는 서열 목록에 서열 변호 10으로 표시된 서을 B-1 균주 M 사슬(cDNA)의 누클레오티드 위치 791 내지 1224(영역 A), 누클레오티드 위치 2079 내지 2522(영역 B), 누클레오티드 위치 2068 내지 2585(영역 C; 상기 Science 문헌에 개시된 2 단계 PCR 증폭 영역), 누클레오티드 위치 2495 내지 2877(영역 D) 및 누클레오티드 위치 3083 내지 3288(영역 E)와 각각 상응하는 것들이 있으며, 이들은 한탄 속과 서울 속 사이에 놓은 상동성을 갖는 핵산 영역이다.
다음으로, 이들 핵산 영역의 역전사에 사용하기 위한 프라이머들, 즉 제 1 PCR을 위한 한 쌍의 프라이머 및 제 2 PCR을 위한 다른 쌍의 프라이머를 제조하였다. 역전사에 사용하기 위한 프라이머로서 제 1 PCR을 위한 프라이머 쌍 중 어느 하나를 사용할 수 있지만, 프라이머 쌍의 동시 사용은 시험된 샘플에서 (-) 사슬 vRNA, (+) 사슬 cRNA 및 mRNA가 동시에 역전사 되도록 할 수 있으며, 따라서 고민감성 검출 방법으로서 적절하다.
이들 프라이머들은 특별히 제한되지 않지만, 단 이들은 상기한 선택된 영역의 어닐링 및 원하는 증폭을 실시하는데 유용하여야 한다. 본 발명자들에 의해 제조된 역전사 및 제 1 PCR에 사용하기 위한 프라이에 쌍(이하 "프라이머 쌍 A"라 언급한다) 및 제 2 PCR에 사용하기 위한 다른 프라이머 쌍(이하 "프라이머 쌍 B"라 언급한다)의 예들을 하기 표 1에 나타낸다.
표 1
프라이에 쌍 A와 프라이에 쌍 B를 사용한 검출용 HFRSV RNA는 예를 들어, 한탄 균주 또는 서울 균주로 감염된 A 549 (ATCC CCL 185), 베로(Vero)(ATCC CCL B1) 또는 베로-E6(일본 오오사까 대학의 미생물 질병 연구소(Research Institute forMicrobial Diseases)로부터 입수 가능한 스톡 배양물)의 각각의 세포로부터, HFRSV-감염된 동물의 기관, 예컨대 폐, 비장 또는 뇌, 혈액, 타액, 뇨 또는 분변으로부터 또는 HFRS 환자의 체액, 예컨대 혈액, 타액 또는 뇨로부터 제조될 수 있다. 베로-E6이 하기 실시예에서 사용되기는 하지만, 상기 세포중 어느 것이든지 사용될 수 있다.
PCR 단계들은 예를 들면, 문헌에 기재되어 있는 바와 같이[Methods in Enzymology, 155, 335-350 (1987)], 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 시판 중인 PCR 키트, 예컨대 다카라 쯔죠사(Takara Shuzo)로부터 입수 가능한 Taq-종합효소 및 역전사효소를 함유하는 RNA-PCR 키트와, 역시 다카라 쯔죠사로부터 얻을 수 있는 자동 유전자 증폭 장치(Perkin-Elmer Corp.)를 제조입자의 지시를 따라 사용하는 것이 편리하다.
이러한 키트 및 장치와 상기 표 1의 프라이머 쌍들을 사용하여 HFRSV의 검출이 수행된다. 역전사 반응에서, 단일 가닥의 cDNA는 주형 RNA로부터, 예컨대 효소로서 조류 골수아세포증 바이러스(AMV)-유래된 역전사효소, 프라이머 쌍 A 및 네가지 기질들(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)로 구성되는 혼합물을 42℃에서 인큐베이션시킴으로써 합성된다. 후속되는 제 1 PCR에서, 목적하는 유전자는 예를 들어, 열안정성 Taq-중합효소 및 프라이머 쌍 A를 사용하고 DNA의 변성 단계(94℃), 프라이머 DNA의 어닐링 단계(50℃) 및 DNA 상보성 사슬의 효소적 합성 단계(72℃)를 포함하는 가열 사이클을 임의의 횟수만큼 반복함으로써 증폭된다. 다음 제 2 PCR이 주형으로서 상기 유전자를 사용하여 수행된다. 제 2 PCR에서, 목적하는 유전자는 예를들어, 열안정성 Taq-중합효소 및 프라이머 쌍 B를 사용하고 DNA의 변성 단계(94℃), 프라이머 DNA의 어닐링 단계(45℃) 및 DNA 상보성 사슬의 효소적 합성 단계(72℃)로 구성되는 가열 사이클을 임의의 횟수만큼 반복함으로써 증폭된다.
하기 표 2는 주형으로서 서울 B-1 균주로 감염된 베로-E6 세포로부터 유래된 RNA(0.001 내지 0.1pg)와 상기 표 1에 기재한 프라이머쌍 A 및 B를 사용하는 각 핵산 영역의 검출에서의 검출 한계를 나타낸다.
표 2
상기 표 2로부터 명백한 바와 같이, 단지 영역 E만이 다른 영역들 보다 10배 이상의 민감성으로 검출될 수 있었다. 따라서, 이 영역이 HFRSV의 검출을 위해 가장 우수한 영역으로 간주된다.
다음, HFRSV-감염된 래트로부터 채혈한 혈액에서 HFRSV의 검출에 대한 예가 하기에서 설명된다. 즉, 서울 B-1 균주-감염된 래트로부터 채혈하고 0.31% 시트르산 나트륨으로 처리하였다. 혈액의 1㎖ 부분을 인산염 완충액으로 2배로 희석하고,1㎖의 피콜(비중, 1.0940)상에 오버레이시킨 다음, 25℃에서 원심분리하여 림프양 세포를 회수하였다. 림프양 세포를 인산염 완충액으로 철저하게 세척한 다음, 구아니딘 이소티오시아네이트(또는 구아니딘 티오시아네이트)를 림프양 세포에 첨가하여 세포를 용해시킨다. 용해의 결과 수축된 세포 추출물을 페놀 및 클로로포름으로 처리한 후, 2-프로판올로 침전시켜 RNA를 회수한다. 하기 표 3은 이와같이 회수된 RNA를 주형으로서 사용하고 상기 표 1에서 기재한 바와 같은 E 영역에 각각 상응하는 프라이머 쌍 A 및 B를 사용한 E 영역의 증폭의 결과를 도시한다. 대조표준으로서, 감염 전의 래트의 혈액 세포를 사용하여 동일한 처리를 수행하였다.
표 3
상기 표 3에 기재한 바와 같이, 특이적인 DNA의 증폭은 감염된 래트의 혈액에서만 발견될 수 있고, 혈액 샘플중의 HFRSV-유래된 RNA는 E 영역을 검출함으로써 높은 민감성으로 쉽게 검출될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에서 HFRSV를 검출하는데 유용한 핵산 영역이 결정되었다. 이러한 핵산 영역의 예에는 서열 목록에 서열 번호 1로 표시된 서을 B-1 균주-유래된 영역, 서열 목록에 서열 번호 2로 표시된 서울 80-39 균주-유래된 영역 또는 서열 목록에 서열 번호 3으로 표시된 서울 SR-11균주-유래된 영역, 서열 목록에서열 번호 4로 표시된 한탄 76-118 균주-유래된 영역 또는 서열 목록에 서열 번호 5로 표시된 한탄 리 균주-유래된 영역이 포함된다. HFRSV는 이들 영역의 각각의 일부분 또는 이의 상보성 서열들을 역전사 및 후속되는 2 단계 PCR에 의해 증폭시킴으로써 민감성이 높게 검출될 수 있다. 서열 목록에 서열 번호 1 내지 서열 번호 5의 각각에 의해 표시된 영역은 이하에서 "E' 영역"으로 언급한다.
E' 영역과 이의 상보성 서열의 검출에 사용하기 위한 프라이머 쌍 A 및 프라이머 쌍 B의 예는 서열 목록에 각각 서열 변호 6 및 서열 번호 7과 서열 번호 8 및 서열 번호 9로 표시된 핵산 단편들을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 프라이머들은 상기 핵산 단편들의 변이 서열일 수 있으며, 이러한 변이 서열들은 특별히 제한되지는 않으나, E' 영역 및 이의 상보 서열의 검출에 사용될 수 있어야 하며, 이에는 누클레오티드 서열의 일부의 염기들이 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 또는 다른 염기가 첨가되어 있는 서열 번호 6 내지 서열 변호 9로 표시된 기본 프라이머들, 보다 구체적으로 예시하자면, 한탄 또는 서울 HFmSV의 돌연변이 균주의 유전자의 상응하는 부분의 누클레오티드 서열의 변이체가 포함된다. 프라이머 연장 반응의 효율에 상당한 영향을 발휘하는 것으로 보이는 프라이머의 3' 말단 영역에서는 돌연변이를 피하거나 또는 최소화시키는 것, 보다 바람직하게는 5' 말단 영역에 돌연변이를 도입시키는 것이 바람직하다. E' 영역 및 이의 상보 서열의 돌연변이에 따르기 위해서는 돌연변이 영역에 상응하는 프라이머의 염기를 이노신으로 치환시키는 것이 바람직하다. 서열 번호 27 내지 서열 번호 30으로 표시된 핵산 단편들은 서열 목록에 서열 번호 6 내지 서열 번호 9로 표시된 기본 프라이머들의 각각의 변이 서열들의 예이다. 이들 변이 서열들을 사용하여 상기한 E' 영역 및 이의 상보 서열의 증폭이 효율적으로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 변이 서열과 기본 프라이머는 조합되어 사용될 수 있다.
증폭된 DNA는 검출 가능한 마아커를 본 발명의 프라이머에 결합시킴으로써 쉽고 간단하게 검출될 수 있다. 마아커는 방사성일 수도 있고 아닐 수도 있으나, 방사성이 아닌 물질인 것이 바람직하다. 직접 측정될 수 있는 비-방사성 물질의 예로는 형광 물질, 예컨대 플루오레세인 및 이의 유도체(예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 등) 또는 로다민 및 이의 유도체(예컨대, 데트라메틸로다인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 등), 화학 발광 물질, 예컨대 아크리딘, 및 지연된 형광을 생성하는 물질(예컨대 Pharmacia 제품인 DTTA)이 있다.
본 발명의 프라이머들을 사용하는 HFRSV 검출 방법을 하기에서 상세하게 설명하기로 한다.
(1) 시험 샘플: 목적하는 HFRSV의 존재에 대해 조사될 샘플의 예는 상기한 HFRSV-감염 동물 세포; 감염된 동물로부터 얻어지는 기관, 혈액 등; 및 환자로부터 얻어지는 혈액, 타액, 뇨 등을 포함한다.
이들 샘플중에서 감염된 동물 및 환자로부터 유래된 혈액이 쉽고 연속적으로 진단될 수 있다. 혈액중의 HFRSV의 검출을 위해서는 RNA를 추출하여 농축시키는 것이 바람직하다. 혈액으로부터 RNA를 제조하는 것은 많은 방법들이 사용될 수 있으나, 피콜(Ficoll) 방법에 의해 림프양 세포를 분리한 후에 림프양 세포로부터 RNA를 제조하거나 양이온성 계면활성제[Nature, 362, 186-188 (1993)], 바람직하게는키트리목소(Catrimox)-14(lowa Biotechnology Corp. 제품)를 사용하여 소량의 혈액으로부터 RNA를 제조함으로써 이루어질 수 있다.
(2) 역전사 및 유전자 증폭: 목적하는 HFRSV가 시험될 샘플에 존재하는 경우, E' 영역 및 이의 상보 서열을 역전사효소로 역전사시키는 것은 본 발명의 프라이머 쌍 A를 샘플에 첨가함으로써 이루어질 수 있다. 계속해서 본 발명의 프라이머 쌍 A를 사용하는 제 1 PCR 및 본 발명의 프라이머 쌍 B를 사용하는 제 2 PCR을 수행함에 의해, 역전사의 결과 얻어진 E 영역의 부분이 효과적으로 증폭될 수 있다.
(3) 검출 : 2 단계 PCR에 의해 형성된 목적하는 유전자는 예를 들면, 전기영동에 의해 [Saiki, Science, 230, 1350-1354 (1985)] 또는 표지된 프로브를 사용하는 도트 하이브리드화 방법에 의해 [Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)] 검출될 수 있다. 프로브의 제조를 위해서는, 프로브 DNA는 증폭 영역 내에 있는 서열로부터 선택함에 의해 디자인될 수 있다. 프로브는 방사성동위원소 표지화 뿐만 아니라 효소 표지화, 형광 표지화, 비오틴-아비딘 표지화, 케미프로브 표지화 등과 같은 다양한 공지 방법에 의해 표지될 수 있다.
특정 HFRSV 균주의 검출을 위해서는, 각 균주의 RNA에 상응하는 프라이머들을 적절하게 사용할 수 있다. 각 균주에 대한 프라이머 쌍들의 예를 하기 표 4에 나타낸다.
표 4
HFRSV의 검출은 본 발명의 프라이머 쌍 A 및 프라이머 쌍 B를 함유하는 키트를 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 키트는 림프양 세포를 혈액으로부터 단리하기 위한 시약, 역전사효소, 혈액중의 HFRSV RNA를 고도의 민감성으로 보다 신속하고, 간단하며 쉽게 검출할 수 있도록 하기 위한 PCR 시약들을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 시약들은 용액 또는 동결전조된 제품의 형태일 수 있다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명을 상세하게 예시하기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
(1) 프라이머 DNA의 제조
서열 목록에 서열 번호 6 내지 서열 번호 25로 표시된 각각의 프라이머 단편들을 어플라이드 바이오시스템 사의 제품인 DNA 합성기를 사용하여 합성하었다. 탈보호후, 단편들을 이온 교환 HPLC(TSk 겔, DEAE-25W 컬럼)로 정제한 후, 각각의 DNA를 얻기 위해 탈염시켰다.
(2) 서울 B-1 균주로 감염시킨 세포로부터의 세포내 RNA의 제조 동물 세포주 베로 E6의 세포들을 서울 B-1 균주(일본 오오사까 대학의 미생물 질병 연구소로부터 입수할 수 있는 보존 배양물)로 감염시키고 CO2 인큐베이터안에서 7일 동안 루(Roux) 병에 담긴 이글스 MEM 배지 50㎖ 중에서 배양시켰다. 그 결과의 세포들을 원심분리하여 수집하고 구아니딘 이소티오시아네이트와 혼합시켜 세포를 용해시켰다. 그 결과의 세포 추출물을 페놀 및 클로로포름으로 처리한 다음 2-프로판올로 침전시켜 RNA를 회수하였다.
(3) 역전사 및 2 단계 PCR에 의한 증폭 능력의 측면에서, M 사슬의 다양한 영역들로부터 제조된 프라이머들의 비교
표 1에 제시한 프라이머 쌍 A 및 프라이머 쌍 B의 5가지 타입을 사용함으로써, RNA-PCR 키트(다카라 쯔죠사 제품)를 사용하여 HFRSV 검출 능력을 비교했다.
실시예 1-(2)에서 수득한 B-1 균주-감염된 세포들로부터 유래된 세포내 RNA를 트리스-EDTA 완충액(pH 8.3)으로 106, 107및 108-배로 희석시켰다. 희석시킨 샘플 각각 1㎕씩을 표 1의 각 프라이머 쌍 A, RNA-PCR 키트중의 dNTP 혼함물, 염화마그네슘, 10×RNA-PCR 완충액 및 물과 혼합시켜 총 부피를 18㎕로 만들었다. 그 결과의 혼합물을 70℃에서 3분 동안 가열시킨 후, 급속 냉각시켰다. 여기에 역전사효소와 RNase 억제제를 첨가한 다음, 생성된 혼합물의 총 부피를 20㎕로 조정하고, 30℃에서 10분 동안 인큐베이션시킨 후, 42℃에서 60분 동안 반응을 진행시켰다.
99℃에서 5분 동안 역전사효소를 비활성화시킨 다음, 반응 혼합물을 냉각시키고, 추가로 Taq DNA 중합효소, 10×RNA-PCR 완충액, 염화 마그네슘, 상응하는 프라이머 쌍 A 및 물과 혼합하며 총 부피를 100㎕로 만들었다. 반응 용액의 상층에 100㎕의 미네랄 오일(다카라 쯔죠사에 의해 제조됨)을 첨가하고, 자동 유전자 증폭 장치(써멀 사이클러(Thermal Cycler) 480, Perkin-Elmer 제품)를 사용하여 증폭 반응을 수행시켰다. 반응을 40회 반응 사이클로 수행시키고, 각 사이클을 94℃에서 30초 동안의 변성, 55℃에서 30초 동안의 프라이머 어닐링 및 72℃에서 30초 동안의 합성 반응의 순서로 구성하였다.
반응 후, 반응 용액의 3㎕(3%)를 튜브에 넣고, Taq DNA 중합효소, 10×RNA-PCR 완충액, 염화 마그네슘, dNTP혼합물, 표 1에 제시된 상응하는 프라이머 쌍 B 및 물과 혼합하여 총 부피를 100㎕로 만들었다. 반응 용액의 상층에 100㎕의 미네랄 오일을 첨가한 후, 증폭 반응을 자동 유전자 증폭 장치 써멀 사이클러 480을 사용하여 수행시켰다.
반응을 40회 반응 사이클로 수행시켰으며, 각 사이클은 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 프라이머 어닐링 및 72℃에서 30초 동안 합성 반응의 순서로 구성되도록 했다.
반응 후, 상층의 미네랄 오일을 제거하고, 10㎕의 반응 용액에 대해 3% NuSieve GTG 아가로오스-1% Sea-Kem 아가로오스(FMC 제품) 겔 전기 영동을 수행하였으며, 이어서 에티듐 브로마이드로 DNA를 염색하여 증폭시킨 DNA를 확인하였다.
그 결과로서, 표 1의 각각의 프라이머 쌍 A 및 B를 사용하였을 때, 영역 E는 107-배까지의 희석률에서도 특이한 증폭을 보인 한편, 영역 A 내지 D는 단지 106-배에서의 희석률에서만 증폭을 나타냈으며, 이로써 E 영역이 HFRSV의 검출에 가장 우수한 영역임을 확인하였다. 이런 맥락에서, 0.01pg의 RNA를 B-1 균주-감염된 세포들로부터의 RNA의 107-배 희석된 용액 1㎕'에 함유시켰다.
(4) 키트의 제조
하기 표 5에 나타낸 HFRSV 검출용 키트를 E' 영역 및 이의 상보성 서열의 검출을 위한 프라이머들, AMV-유래된 액전사효소(다카라 쯔죠사에 의해 제조됨), Taq 중합효소(다카라 쯔죠사에 의해 제조됨), RNase 억제제(다카라 쯔죠사에 의해 제조됨), 10×RNA-PCR 완충제, 기질(dNTP 혼합물), 염화 마그네슘 및 양성 대조표준 RNA를 사용하여 제조하였다.
이 경우, 실시예 1-(2)에서 수득한 RNA를 키트중의 시약 G중에 사용하였다.
표 5
실시예 2
HFRSV-감염된 래트의 혈액에서의 HFRSV의 검출
혈액을 서울 B-1 균주로 감염시킨 래트로부터 주기적으로 채혈하여
0.31%, 시트르산 나트륨으로 처리하고, 이렇게 처리한 샘플 각각의 1㎖를 인산염 완충액으로 2배 희석한 다음, 1㎖의 피콜(비중, 1.0940)상에 오버레이시킨 다음, 25℃에서 원심분리하여 림프양 세포를 회수했다. 인산염 완충액으로 철저하게 세척한 다음, 세포에 구아니딘 이소티오시아네이트를 첨가하여 세포를 용해시켰다.
용해 결과의 세포 추출물을 페놀과 클로로포름으로 처리한 다음, 2-프로판올로 침전시켜 RNA를 회수하였다. 그렇게 회수한 RNA를 -80℃에서 보관하였다가 사용시에 10㎕의 트리스-EDTA완층액으로 용해시켰다.
이 경우, 서울 B-1 균주 세포들(약 103f.f.u)을 생후 6주된 수컷 래트에 복강내 투여함으로써 감염 및 질환을 개시시켰고, 감염(개시)후 1주 및 2 주째에 채혈하였다. 또한, 감염전의 래트의 혈액도 대조표준으로서 준비하였다.
HFRSV의 검출은 상기한 동물 혈액으로부터 제조한 RNA 및 실시예 1-(4)에서 설명한 바와 같은 키트를 사용하여 하기 방식으로 수행하였다.
상기한 동물 혈액으로부터 제조한 RNA 용액 1㎕를 프라이머 쌍 A, 염화 마그네슘 및 10×RNA-PCR 완충액, 실시예 1-(4)에서 설명한 키트내에 함유된 전부 및 각각의 1회 검정 양과 혼합시켰다. 총 부피를 물을 사용하여 18㎕로 조정한 다음, 그 결과의 혼합물을 70℃에서 3분 동안 가열한 후, 급속 냉각시켰다. 여기에 1회 검정 양의 역전사효소 및 RNase 억제제를 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 총 부피 20㎕로 조정한 다음, 30℃에서 10분 동안 인큐베이션시키고, 42℃에서 60분 동안 반응시켰다. 역전사효소를 99℃ 에서 5분동안 처리하여 불활성화시키고, 반응 혼합물을 냉각시킨 후 키트 내에 함유된 1회 검정 양의 Taq DNA 중합효소, 10×RNA-PCR 완충액, 염화 마그네슘 및 프라이머 쌍 A와 혼합시키고, 물을 사용하여 총 부피를100㎕ 로 만들었다.
반응 용액의 상층에 100㎕의 미네랄 오일을 첨가하고, 자동 유전자 증폭 장치 써멀 사이클러 480을 사용하여 증폭 반응을 수행하였다. 반응을 40회 반응 사이클로 수행하였고, 각 사이클을 94℃에서 30초 동안의 변성, 55℃에서 30초 동안의 프라이머 어닐링 및 72℃에서 30초 동안의 합성반응의 순서로 구성했다. 반응 후, 3㎕(3%)의 반응 용액을 튜브안에 넣고 키트안에 함유되어 있는 1회 검정 양의 Taq DNA 중합효소, 10×RNA-PCR 완충액, 여화 마그네슘, dNTP 혼합물 및 프라이머 쌍 B와 혼합시킨 후, 혼합물의 총 부피를 물을 사용하데 100㎕로 조정하였다. 그 결과의 반응 용액의 상층에 100㎕의 미네랄 오일을 첨가하고, 자동 유전자 증폭 장치 써멀 사이클러 480을 사용하여 증폭 반응을 수행시켰다.
반응을 40회 반응 사이클로 수행하였으며, 각 사이클을 94℃에서 30초 동안의 변성, 55℃에서 30초 동안의 프라이머 어닐링 및 72℃에서 30초 동안의 합성 반응의 순서로 구성했다.
반응 후, 상층의 미네랄 오일을 제거하고, 10㎕의 반응 용액에 대해 3% NuSieve GTG 아가로오스-1% Sea-Kem 아가로오스 겔 전기영동을 수행한 후, 에티듐 브로마이드로 DNA를 염색하여 증폭된 DNA를 확인하였다.
그 결과로서, 서울 B-1 RNA의 M 사슬 누클레오티드 서열로부터 예상되는 크기(119 bp)를 가지는 단편은 단지 감염된 래트 혈액에서 유래된 샘플에서만 증폭되었다. 이 DNA 단편의 핵산 누클레오티드 서열의 디데옥시 서열분석에 의한 분석을 통해 상기 단편이 서울 B-1 균주로부터 유래된 누클레오티드 서열임이 밝혀졌다.
HFRSV/-감염된 래트로부터 주기적으로 채혈한 혈액중의 HFRSV 검출 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
표 6
- : 특이한 유전자 증폭이 없음을 나타낸다.
+ : 특이한 유전자 증폭이 있음을 나타낸다.
++ : 강한 증폭이 있음을 나타낸다.
상기 표 6에 기재된 바와 같이, 바이러스의 존재는 바이러스가 종래의 혈청학적인 방법으로는 검출될 수 없는 감염의 초기 단계(감염 후 1주째)에서 조차도 본 발명의 방법에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에 따라, 샘플에 함유된 HFRSV가 고민감성으로 쉽고 신속하게 검출될 수 있다. 그러므로, 신증후성 출혈열의 간단하고 용이하며 정확한 진단이 가능하다. 본 발명에 의해 제공된 HFRSV 검출 방법 및 검출 프라이머들은 예컨대 HFRS 환자의 진단 뿐만 아니라, HFRSV 모니터링에 의해 실험 동물을 관리하고 환경을 정화하는데 유용하다.
서 열 목 록
서열 번호 : 1
서열 번호 : 2
서열 번호 : 3
서열 번호 : 4
서열 변호 : 5
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서열 번호 : 43
서열 번호 : 44
서열 번호 : 45
서열 번호 : 46
서열 번호 : 47
서열 번호 : 48
서열 번호 : 49
서열 번호 : 50
서열 목록에서 A, T, U, G 및 C 이외의 기호들은 다음 의미를 갖는다.
Y: T 또는 C, R: G 또는 A, H: A, C 또는 T, W: A 또는 T, K: G 또는 T, M: A 또는 C, D: A, G 또는 T

Claims (7)

  1. 서열 목록에 각각 서열 번호 1 내지 서열 번호 5로 표시된 핵산, 서열 목록에 각각 서열 번호 1 내지 서열 번호 5로 표시된 핵산의 54번 내지 126번 누클레오티드를 포함하는 핵산 및 이들의 상보 서열들로 구성원 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 역전사 및 후속하는 2 단계 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는 것을 포함하여, 신증후성 출혈열 바이러스를 검출하는 방법.
  2. (a) 시험 샘플로부터 핵산을 단리하는 단계;
    (b) 단리한 핵산에 대해, 서열 목록에 서열 번호 6으로 표시된 핵산 단편 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열 및/또는 서열 목록에 서열 번호 7로 표시된 핵산 단편 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열로부터 선택한 프라이머를 사용하여 역전사를 수행함으로써, 역전사 DNA 생성물을 수득하는 단계;
    (c) 역전사 DNA 생성물에 대해, 서열 목록에 서열 번호 6으로 표시된 핵산 단편 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열을 서열 목록에 서열 번호 7로 표시된 핵산 단편 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열과 조합하며 사용하는 제 1 PCR 단계를 수행함으로써, DNA를 증폭시키는 단계;
    (d) 증폭된 DNA에 대해, 서열 목록에 서열 변호 8로 표시된 핵산 단편 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열을 서열 목록에 서열 변호 9로 표시된 핵산 단편 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열과 조합하여 사용하는 제 2 PCR 단계를 수행함으로써, DNA를 증폭시키는 단계; 및
    (e) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함하며, 시험 샘플중에 함유된 신증후성 출혈열 바이러스를 검출하는 방법.
  3. 서열 목록에 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 표시된 핵산 서열, 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열을 가지는, 신증후성 출혈열 바이러스 검출용 프라이머.
  4. 제 3항에 있어서, 프라이머가 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29 또는 서열 번호 30으로 표시된 핵산 서열을 지님을 특징으로 하는 프라이머.
  5. 서열 번호 6으로 표시된 핵산 서열 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열 및 서열 번호 7로 표시된 핵산 서열 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열을 가지는 프라이머 쌍과 서열 번호 8로 표시된 핵산 서열 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열 및 서열 번호 9로 표시된 핵산 서열 또는 이의 3'-말단으로부터 9번째 염기 및 그 이후의 염기중 일부가 결실되거나 다른 염기로 치환되거나 첨가되고 프라이머 연장 반응에서 작용하는 핵산 서열을 가지는 다른 프라이머 쌍을 포함하는, 신증후성 출혈열 바이러스 검출용 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 혈액으로부터의 림프양 세포로부터 RNA를 단리하기 위한 시약, 역전사효소 및 PCR 시약을 추가로 함유함을 특징으로 하는 키트.
  7. 제 5항에 있어서, 역전사효소, DNA 중합효소, RNase 억제제, 완충액, 염화 마그네슘, dNTP 혼합물 및 양성 대조표준 RNA를 추가로 함유함을 특징으로 하는 키트.
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