JP2869018B2 - 腎症候性出血熱ウイルスの検出方法 - Google Patents
腎症候性出血熱ウイルスの検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、腎症候性出血熱ウイル
スの検出方法に関し、更に詳細には該ウイルスの特異的
な核酸領域の遺伝子工学的検出方法に関する。本発明は
また、このような遺伝子工学的検出のために使用する検
出用プライマーに関する。
スの検出方法に関し、更に詳細には該ウイルスの特異的
な核酸領域の遺伝子工学的検出方法に関する。本発明は
また、このような遺伝子工学的検出のために使用する検
出用プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】腎症候性出血熱（hemorrhagic fever wi
th renal syndrome ：以下、ＨＦＲＳと略す）は人畜共
通感染症の一つであり、ネズミによって媒介される。ヒ
トでは腎障害を主症状とする急性感染を引起し、ネズミ
（野ネズミ、あるいは実験室におけるラット）では持続
感染がしばしばみられ感染源となっている。極東アジア
からロシア、欧州一帯に広く分布し、最近では、米国で
も患者の発生が報告されている〔サイエンス（Scienc
e)、第２６２巻、第９１４〜９１７頁（１９９３）〕。
年間の患者発生は世界で数十万にも達し、日本において
も、実験室のラットからの感染、死亡例が報告されてい
る。ＨＦＲＳウイルス（以下ＨＦＲＳＶと略記する）
は、１９７８年にリー (Lee)らによって高麗セスジネズ
ミの肺からハンタン（Hantaan)株が分離されて以来、野
生あるいは実験室のネズミ、更にはＨＦＲＳ患者で１０
種以上のＨＦＲＳＶが、肺、血液、腫瘍、膵などから分
離されており、日本の実験動物ラットからもＢ−１株が
分離されている。極東アジア地区で最も病原性が強いの
はハンタン属ＨＦＲＳＶのハンタン株で死亡率は１０〜
１５％に至る〔アニテックス、第５巻、第６号、第２７
３〜２７６頁（１９９３）〕。Ｂ−１株はソウル属ＨＦ
ＲＳＶでラットを宿主とし、現在日本で流行しているタ
イプのウイルスであり、ハンタン株に比べ病原性は弱い
が、感染力は強い。ＨＦＲＳＶはブニヤウイルス（buny
avirus) 科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであり、その
ＲＮＡは大、中、小（Ｌ鎖、Ｍ鎖、Ｓ鎖）の３分節をな
している。ＨＦＲＳＶのＲＮＡの複製はＲＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼによって行われ、ウイルスが活動中の
感染細胞中には（−）鎖のゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の
ほか、ｖＲＮＡ複製に必要なｖＲＮＡに相補的な（＋）
鎖のＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、また（＋）鎖のｍＲＮＡが存
在する。ＨＦＲＳの診断は臨床症状によるもののほか、
現在は血清診断で行われている。また、最近ではポリメ
ラーゼ チェーンリアクション（Polymerase Chain Rea
ction 、ＰＣＲ）法による診断も行われている（特開平
３−１２００００号公報、前出サイエンス）。
th renal syndrome ：以下、ＨＦＲＳと略す）は人畜共
通感染症の一つであり、ネズミによって媒介される。ヒ
トでは腎障害を主症状とする急性感染を引起し、ネズミ
（野ネズミ、あるいは実験室におけるラット）では持続
感染がしばしばみられ感染源となっている。極東アジア
からロシア、欧州一帯に広く分布し、最近では、米国で
も患者の発生が報告されている〔サイエンス（Scienc
e)、第２６２巻、第９１４〜９１７頁（１９９３）〕。
年間の患者発生は世界で数十万にも達し、日本において
も、実験室のラットからの感染、死亡例が報告されてい
る。ＨＦＲＳウイルス（以下ＨＦＲＳＶと略記する）
は、１９７８年にリー (Lee)らによって高麗セスジネズ
ミの肺からハンタン（Hantaan)株が分離されて以来、野
生あるいは実験室のネズミ、更にはＨＦＲＳ患者で１０
種以上のＨＦＲＳＶが、肺、血液、腫瘍、膵などから分
離されており、日本の実験動物ラットからもＢ−１株が
分離されている。極東アジア地区で最も病原性が強いの
はハンタン属ＨＦＲＳＶのハンタン株で死亡率は１０〜
１５％に至る〔アニテックス、第５巻、第６号、第２７
３〜２７６頁（１９９３）〕。Ｂ−１株はソウル属ＨＦ
ＲＳＶでラットを宿主とし、現在日本で流行しているタ
イプのウイルスであり、ハンタン株に比べ病原性は弱い
が、感染力は強い。ＨＦＲＳＶはブニヤウイルス（buny
avirus) 科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであり、その
ＲＮＡは大、中、小（Ｌ鎖、Ｍ鎖、Ｓ鎖）の３分節をな
している。ＨＦＲＳＶのＲＮＡの複製はＲＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼによって行われ、ウイルスが活動中の
感染細胞中には（−）鎖のゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の
ほか、ｖＲＮＡ複製に必要なｖＲＮＡに相補的な（＋）
鎖のＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、また（＋）鎖のｍＲＮＡが存
在する。ＨＦＲＳの診断は臨床症状によるもののほか、
現在は血清診断で行われている。また、最近ではポリメ
ラーゼ チェーンリアクション（Polymerase Chain Rea
ction 、ＰＣＲ）法による診断も行われている（特開平
３−１２００００号公報、前出サイエンス）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】血清診断は間接蛍光抗
体法を初めとする検出法で行われている。抗体検出法は
特異性も高く、ＨＦＲＳ発症後の早期診断も可能となっ
た。しかし、抗体検出法はウイルスの状態を間接的に示
すものであり、ウイルスの存在を直接示すものではな
い。ＨＦＲＳＶ粒子は４種のタンパク質と遺伝子より構
成されているが、ＨＦＲＳＶの特徴は、その遺伝子によ
り規定されている。このＨＦＲＳＶに特徴的な核酸配列
をＰＣＲ法により増幅すればウイルスの存在を直接的
に、また高感度で、迅速に、より早期に確定することが
できる。しかしながらこれまでに報告されたＰＣＲ法で
は、臨床分離検体、特に血液中のように微量にしか存在
しないウイルスを検出するには、感度の点で不十分であ
った。本発明の目的は、ＨＦＲＳＶ核酸領域中に、ＰＣ
Ｒ法で、より感度よく増幅できる領域を明らかにし、そ
の検出方法及びそれに用いるＨＦＲＳＶ検出用プライマ
ーを提供することにある。
体法を初めとする検出法で行われている。抗体検出法は
特異性も高く、ＨＦＲＳ発症後の早期診断も可能となっ
た。しかし、抗体検出法はウイルスの状態を間接的に示
すものであり、ウイルスの存在を直接示すものではな
い。ＨＦＲＳＶ粒子は４種のタンパク質と遺伝子より構
成されているが、ＨＦＲＳＶの特徴は、その遺伝子によ
り規定されている。このＨＦＲＳＶに特徴的な核酸配列
をＰＣＲ法により増幅すればウイルスの存在を直接的
に、また高感度で、迅速に、より早期に確定することが
できる。しかしながらこれまでに報告されたＰＣＲ法で
は、臨床分離検体、特に血液中のように微量にしか存在
しないウイルスを検出するには、感度の点で不十分であ
った。本発明の目的は、ＨＦＲＳＶ核酸領域中に、ＰＣ
Ｒ法で、より感度よく増幅できる領域を明らかにし、そ
の検出方法及びそれに用いるＨＦＲＳＶ検出用プライマ
ーを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＨＦＲＳＶの検出方法に関し、ＨＦ
ＲＳＶの検出方法において、逆転写及びその後の２段階
ＰＣＲにより、配列表の配列番号１〜５でそれぞれ表さ
れる核酸及びその相補鎖配列より成る群より選択される
少なくとも一つの核酸の一部を増幅する工程を包含する
ことを特徴とする。また本発明の第２の発明は下記工程
を包含する検体中のＨＦＲＳＶ検出方法に関する。
（ａ）検体中より核酸を分離する工程、（ｂ）分離され
た核酸を、配列表の配列番号６で表される核酸断片、あ
るいはその３’末端から少なくとも９塩基以後の一部の
塩基を欠失するか、又は他の塩基で置換若しくは付加さ
れた配列で表され、かつプライマー伸長反応において機
能しうる核酸断片、及び／又は配列表の配列番号７で表
される核酸断片、あるいはその３’末端から少なくとも
９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で
置換若しくは付加された配列で表され、かつプライマー
伸長反応において機能しうる核酸断片から選択されるプ
ライマーを用いて逆転写し、逆転写されたＤＮＡを得る
工程、（ｃ）逆転写されたＤＮＡを配列表の配列番号６
で表される核酸断片、あるいはその３’末端から少なく
とも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩
基で置換若しくは付加された配列で表され、かつプライ
マー伸長反応において機能しうる核酸断片、及び配列表
の配列番号７で表される核酸断片、あるいはその３’末
端から少なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失する
か、又は他の塩基で置換若しくは付加された配列で表さ
れ、かつプライマー伸長反応において機能しうる核酸断
片の組合せで１段階目のＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅さ
せる工程、（ｄ）増幅ＤＮＡを配列表の配列番号８で表
される核酸断片、あるいはその３’末端から少なくとも
９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で
置換若しくは付加された配列で表され、かつプライマー
伸長反応において機能しうる核酸断片、及び配列表の配
列番号９で表される核酸断片、あるいはその３’末端か
ら少なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又
は他の塩基で置換若しくは付加された配列で 表され、か
つプライマー伸長反応において機能しうる核酸断片の組
合せで２段階目のＰＣＲを行いＤＮＡを増幅させる工
程、及び、（ｅ）増幅ＤＮＡを検出する工程。更に本発
明の第３の発明は、配列表の配列番号６〜９でそれぞれ
表される核酸断片、あるいはそれぞれの３’末端から少
なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他
の塩基で置換若しくは付加された配列で表され、かつプ
ライマー伸長反応において機能しうる核酸断片よりなる
ＨＦＲＳＶ検出用プライマーに関する。
発明の第１の発明はＨＦＲＳＶの検出方法に関し、ＨＦ
ＲＳＶの検出方法において、逆転写及びその後の２段階
ＰＣＲにより、配列表の配列番号１〜５でそれぞれ表さ
れる核酸及びその相補鎖配列より成る群より選択される
少なくとも一つの核酸の一部を増幅する工程を包含する
ことを特徴とする。また本発明の第２の発明は下記工程
を包含する検体中のＨＦＲＳＶ検出方法に関する。
（ａ）検体中より核酸を分離する工程、（ｂ）分離され
た核酸を、配列表の配列番号６で表される核酸断片、あ
るいはその３’末端から少なくとも９塩基以後の一部の
塩基を欠失するか、又は他の塩基で置換若しくは付加さ
れた配列で表され、かつプライマー伸長反応において機
能しうる核酸断片、及び／又は配列表の配列番号７で表
される核酸断片、あるいはその３’末端から少なくとも
９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で
置換若しくは付加された配列で表され、かつプライマー
伸長反応において機能しうる核酸断片から選択されるプ
ライマーを用いて逆転写し、逆転写されたＤＮＡを得る
工程、（ｃ）逆転写されたＤＮＡを配列表の配列番号６
で表される核酸断片、あるいはその３’末端から少なく
とも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩
基で置換若しくは付加された配列で表され、かつプライ
マー伸長反応において機能しうる核酸断片、及び配列表
の配列番号７で表される核酸断片、あるいはその３’末
端から少なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失する
か、又は他の塩基で置換若しくは付加された配列で表さ
れ、かつプライマー伸長反応において機能しうる核酸断
片の組合せで１段階目のＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅さ
せる工程、（ｄ）増幅ＤＮＡを配列表の配列番号８で表
される核酸断片、あるいはその３’末端から少なくとも
９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で
置換若しくは付加された配列で表され、かつプライマー
伸長反応において機能しうる核酸断片、及び配列表の配
列番号９で表される核酸断片、あるいはその３’末端か
ら少なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又
は他の塩基で置換若しくは付加された配列で 表され、か
つプライマー伸長反応において機能しうる核酸断片の組
合せで２段階目のＰＣＲを行いＤＮＡを増幅させる工
程、及び、（ｅ）増幅ＤＮＡを検出する工程。更に本発
明の第３の発明は、配列表の配列番号６〜９でそれぞれ
表される核酸断片、あるいはそれぞれの３’末端から少
なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他
の塩基で置換若しくは付加された配列で表され、かつプ
ライマー伸長反応において機能しうる核酸断片よりなる
ＨＦＲＳＶ検出用プライマーに関する。
【０００５】ＨＦＲＳの診断はＨＦＲＳＶ遺伝子の検出
によって行うことができる。遺伝子の検出には種々の方
法があるが、高感度な検出を実現するためには２段階Ｐ
ＣＲが最も好ましい。そのため極東アジアで最も病原性
の強いハンタン属、更に日本で広く分布するソウル属の
ＨＦＲＳＶの遺伝子配列を考慮に入れてプライマーを設
計すれば良い。本発明者らはハンタン属、ソウル属のＨ
ＦＲＳＶの遺伝子配列で相同性が高く、かつ２段階ＰＣ
Ｒで高感度に検出できる領域を決定するために、これら
の遺伝子をターゲットとして種々のプライマーを検討し
た結果、Ｍ鎖Ｇ2 領域内に目的の核酸領域を見出し、本
発明を完成させた。
によって行うことができる。遺伝子の検出には種々の方
法があるが、高感度な検出を実現するためには２段階Ｐ
ＣＲが最も好ましい。そのため極東アジアで最も病原性
の強いハンタン属、更に日本で広く分布するソウル属の
ＨＦＲＳＶの遺伝子配列を考慮に入れてプライマーを設
計すれば良い。本発明者らはハンタン属、ソウル属のＨ
ＦＲＳＶの遺伝子配列で相同性が高く、かつ２段階ＰＣ
Ｒで高感度に検出できる領域を決定するために、これら
の遺伝子をターゲットとして種々のプライマーを検討し
た結果、Ｍ鎖Ｇ2 領域内に目的の核酸領域を見出し、本
発明を完成させた。
【０００６】以下、順を追って本発明を具体的に説明す
る。ハンタン属ＨＦＲＳＶとしては、例えばハンタン属
７６−１１８株、リー（Lee)株が知られており、ソウル
属ＨＦＲＳＶとしては、例えばソウル属Ｂ−１株、８０
−３９株、ＳＲ−１１株が知られている。これらの株の
ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡは既にクローニングされてお
り、その塩基配列はビロロジー（Virology) 、第１５７
巻、第３１〜３９頁（１９８７）、ジャーナル オブ
ジェネラル ビロロジー（Ｊ. Gen. Virol.)、第６９
巻、第１９４９〜１９５５頁（１９８８）、ヌクレイッ
ク アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Research) 、
第１８巻、第４９３６〜４９３７頁（１９９０）、ウイ
ルス リサーチ（Virus Research)、第１９巻、第４７
〜５８頁（１９９１）、ビロロジー、第１７６巻、第１
１４〜１２５頁（１９９０）にそれぞれ記載されてい
る。
る。ハンタン属ＨＦＲＳＶとしては、例えばハンタン属
７６−１１８株、リー（Lee)株が知られており、ソウル
属ＨＦＲＳＶとしては、例えばソウル属Ｂ−１株、８０
−３９株、ＳＲ−１１株が知られている。これらの株の
ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡは既にクローニングされてお
り、その塩基配列はビロロジー（Virology) 、第１５７
巻、第３１〜３９頁（１９８７）、ジャーナル オブ
ジェネラル ビロロジー（Ｊ. Gen. Virol.)、第６９
巻、第１９４９〜１９５５頁（１９８８）、ヌクレイッ
ク アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Research) 、
第１８巻、第４９３６〜４９３７頁（１９９０）、ウイ
ルス リサーチ（Virus Research)、第１９巻、第４７
〜５８頁（１９９１）、ビロロジー、第１７６巻、第１
１４〜１２５頁（１９９０）にそれぞれ記載されてい
る。
【０００７】これらの塩基配列より、ハンタン属ＨＦＲ
ＳＶ、ソウル属ＨＦＲＳＶに相同性が高い核酸領域を選
抜し、選抜核酸領域を逆転写するためのプライマー、逆
転写されたＤＮＡを鋳型として１段階目ＰＣＲ（以後１
ｓｔＰＣＲと略す）で増幅するためのプライマー対、及
び１ｓｔＰＣＲで増幅されたＤＮＡを鋳型として２段階
目ＰＣＲ（以後、２ｎｄＰＣＲと略す）で増幅するため
のプライマー対を設計し、合成する。本発明者らが選抜
したハンタン属、ソウル属に共通のＲＮＡ領域としては
配列表の配列番号１０番で示すソウル属Ｂ−１株のＭ鎖
（ｃＤＮＡ）の塩基番号７９１〜１２２４番（Ａ領
域）、塩基番号２０７９〜２５２２番（Ｂ領域）、塩基
番号２０６８〜２５８５番（Ｃ領域：前出サイエンス記
載の２段階ＰＣＲ増幅領域）、塩基番号２４９５〜２８
７７番（Ｄ領域）、及び塩基番号３０８３〜３２８８番
（Ｅ領域）にそれぞれ対応する領域があり、これらはハ
ンタン属、ソウル属ＨＦＲＳＶ間で相同性の高い核酸領
域である。
ＳＶ、ソウル属ＨＦＲＳＶに相同性が高い核酸領域を選
抜し、選抜核酸領域を逆転写するためのプライマー、逆
転写されたＤＮＡを鋳型として１段階目ＰＣＲ（以後１
ｓｔＰＣＲと略す）で増幅するためのプライマー対、及
び１ｓｔＰＣＲで増幅されたＤＮＡを鋳型として２段階
目ＰＣＲ（以後、２ｎｄＰＣＲと略す）で増幅するため
のプライマー対を設計し、合成する。本発明者らが選抜
したハンタン属、ソウル属に共通のＲＮＡ領域としては
配列表の配列番号１０番で示すソウル属Ｂ−１株のＭ鎖
（ｃＤＮＡ）の塩基番号７９１〜１２２４番（Ａ領
域）、塩基番号２０７９〜２５２２番（Ｂ領域）、塩基
番号２０６８〜２５８５番（Ｃ領域：前出サイエンス記
載の２段階ＰＣＲ増幅領域）、塩基番号２４９５〜２８
７７番（Ｄ領域）、及び塩基番号３０８３〜３２８８番
（Ｅ領域）にそれぞれ対応する領域があり、これらはハ
ンタン属、ソウル属ＨＦＲＳＶ間で相同性の高い核酸領
域である。
【０００８】次に、これらの核酸領域を逆転写するため
のプライマー、１ｓｔＰＣＲ用のプライマー対、２ｎｄ
ＰＣＲ用のプライマー対を作製する。逆転写のためのプ
ライマーとしては１ｓｔＰＣＲ用のプライマー対のいず
れかを使用すれば良いが、プライマー対として同時に用
いれば検体中の（−）鎖のｖＲＮＡ、（＋）鎖のｃＲＮ
Ａ、ｍＲＮＡを同時に逆転写することができ、高感度検
出法としては適している。
のプライマー、１ｓｔＰＣＲ用のプライマー対、２ｎｄ
ＰＣＲ用のプライマー対を作製する。逆転写のためのプ
ライマーとしては１ｓｔＰＣＲ用のプライマー対のいず
れかを使用すれば良いが、プライマー対として同時に用
いれば検体中の（−）鎖のｖＲＮＡ、（＋）鎖のｃＲＮ
Ａ、ｍＲＮＡを同時に逆転写することができ、高感度検
出法としては適している。
【０００９】プライマーとしては前述の選抜領域にアニ
ーリングし、目的の増幅を行えるものであれば良いが、
本発明者らが作製した逆転写及び１ｓｔＰＣＲ用のプラ
イマー対（以後プライマー対Ａと略す）、及び２ｎｄＰ
ＣＲ用のプライマー対（以後プライマー対Ｂと略す）の
１例を表１に示す。
ーリングし、目的の増幅を行えるものであれば良いが、
本発明者らが作製した逆転写及び１ｓｔＰＣＲ用のプラ
イマー対（以後プライマー対Ａと略す）、及び２ｎｄＰ
ＣＲ用のプライマー対（以後プライマー対Ｂと略す）の
１例を表１に示す。
【００１０】
【表１】 表 １ ──────────────────────────────────── 核酸領域 プライマー対Ａ プライマー対Ｂ 配列表の 配列表の プライマー名 配列番号 プライマー名 配列番号 ──────────────────────────────────── Ａ領域 ＨＳ−ＨＦ１−１ １１ ＨＳ−ＨＦ１−２ １３ ＨＳ−ＲＳ１−１ １２ ＨＳ−ＲＳ１−２ １４ ──────────────────────────────────── Ｂ領域 ＨＳ−ＨＦ２−１ １５ ＨＳ−ＨＦ２−２ １７ ＨＳ−ＲＳ２−１ １６ ＨＳ−ＲＳ２−２ １８ ──────────────────────────────────── Ｃ領域 ＨＳ−ＨＦ４−１ １９ ＨＳ−ＨＦ４−２ ２１ ＨＳ−ＲＳ４−１ ２０ ＨＳ−ＲＳ４−２ ２２ ──────────────────────────────────── Ｄ領域 ＨＳ−ＨＦ５−１ ２３ ＨＳ−ＨＦ５−２ ２５ ＨＳ−ＲＳ５−１ ２４ ＨＳ−ＲＳ５−２ ２６ ──────────────────────────────────── Ｅ領域 ＨＳ−ＨＦ３−１ ６ ＨＳ−ＨＦ３−２ ８ ＨＳ−ＲＳ３−１ ７ ＨＳ−ＲＳ３−２ ９ ────────────────────────────────────
【００１１】プライマー対Ａ、及びプライマー対Ｂを用
いて検出するためのＨＦＲＳＶのＲＮＡは例えばＡ５４
９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ８１）、あるいはＶｅｒｏ−Ｅ６（大阪大学微生
物病研究所保存株）の各細胞にハンタン株又はソウル株
を感染させた細胞、またＨＦＲＳＶ感染動物の肺、脾
臓、脳等の臓器、血液、唾液、尿、糞等、更にはＨＦＲ
Ｓ患者の血液、唾液、尿等の体液から調製することがで
きる。
いて検出するためのＨＦＲＳＶのＲＮＡは例えばＡ５４
９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ８１）、あるいはＶｅｒｏ−Ｅ６（大阪大学微生
物病研究所保存株）の各細胞にハンタン株又はソウル株
を感染させた細胞、またＨＦＲＳＶ感染動物の肺、脾
臓、脳等の臓器、血液、唾液、尿、糞等、更にはＨＦＲ
Ｓ患者の血液、唾液、尿等の体液から調製することがで
きる。
【００１２】ＰＣＲ法についてはタックＤＮＡポリメラ
ーゼ（Taq DNA polymerase) と逆転写酵素を含むＲＮＡ
−ＰＣＲキットが宝酒造から市販されており、また自動
遺伝子増幅装置（パーキンエルマー社）も宝酒造から市
販されている。
ーゼ（Taq DNA polymerase) と逆転写酵素を含むＲＮＡ
−ＰＣＲキットが宝酒造から市販されており、また自動
遺伝子増幅装置（パーキンエルマー社）も宝酒造から市
販されている。
【００１３】これらと、表１のプライマー対を用い、Ｈ
ＦＲＳＶの検出を行う。逆転写反応は、酵素として、例
えばＡＭＶ由来の逆転写酵素及びプライマー対Ａを用
い、４種類の基質（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄ
ＴＴＰ）を加え、加温（４２℃）することにより鋳型Ｒ
ＮＡより、一本鎖ｃＤＮＡを合成する。続いて行う２段
階ＰＣＲは、１ｓｔＰＣＲとしては、例えば耐熱性タッ
クＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対Ａを用い、ＤＮ
Ａの変性（９４℃）の工程、プライマーＤＮＡのアニー
リング（５０℃）の工程、ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成
（７２℃）の工程より成る温度サイクルを任意の回数繰
返し、目的遺伝子を増幅する。次に該遺伝子を鋳型とし
て２ｎｄＰＣＲを行う。２ｎｄＰＣＲとしては、例えば
耐熱性タックＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対Ｂを
用いＤＮＡの変性（９４℃）の工程、プライマーＤＮＡ
のアニーリング（４５℃）の工程、ＤＮＡ相補鎖の酵素
的合成（７２℃）の工程より成る温度サイクルを、更に
任意の回数繰返し、目的遺伝子を増幅する。
ＦＲＳＶの検出を行う。逆転写反応は、酵素として、例
えばＡＭＶ由来の逆転写酵素及びプライマー対Ａを用
い、４種類の基質（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄ
ＴＴＰ）を加え、加温（４２℃）することにより鋳型Ｒ
ＮＡより、一本鎖ｃＤＮＡを合成する。続いて行う２段
階ＰＣＲは、１ｓｔＰＣＲとしては、例えば耐熱性タッ
クＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対Ａを用い、ＤＮ
Ａの変性（９４℃）の工程、プライマーＤＮＡのアニー
リング（５０℃）の工程、ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成
（７２℃）の工程より成る温度サイクルを任意の回数繰
返し、目的遺伝子を増幅する。次に該遺伝子を鋳型とし
て２ｎｄＰＣＲを行う。２ｎｄＰＣＲとしては、例えば
耐熱性タックＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対Ｂを
用いＤＮＡの変性（９４℃）の工程、プライマーＤＮＡ
のアニーリング（４５℃）の工程、ＤＮＡ相補鎖の酵素
的合成（７２℃）の工程より成る温度サイクルを、更に
任意の回数繰返し、目的遺伝子を増幅する。
【００１４】ソウル属Ｂ−１株が感染したＶｅｒｏ−Ｅ
６細胞由来のＲＮＡ（０．００１〜０．１pg）を鋳型に
し、表１記載のプライマー対Ａ及びプライマー対Ｂを用
いて各核酸領域の検出を行った場合の検出限界を表２に
示す。
６細胞由来のＲＮＡ（０．００１〜０．１pg）を鋳型に
し、表１記載のプライマー対Ａ及びプライマー対Ｂを用
いて各核酸領域の検出を行った場合の検出限界を表２に
示す。
【００１５】
【表２】 表 ２ ─────────────────────────── 核 酸 領 域 検 出 限 界 ─────────────────────────── Ａ 領 域 ０．１ ｐｇ Ｂ 領 域 ０．１ ｐｇ Ｃ 領 域 ０．１ ｐｇ Ｄ 領 域 ０．１ ｐｇ Ｅ 領 域 ０．０１ｐｇ ───────────────────────────
【００１６】表２に示すようにＥ領域のみ、他の領域の
１０倍の感度で検出でき、この領域はＨＦＲＳＶの検出
に最も優れた部位である。
１０倍の感度で検出でき、この領域はＨＦＲＳＶの検出
に最も優れた部位である。
【００１７】次に、ＨＦＲＳＶ感染ラットより採血し、
血液中のＨＦＲＳＶを検出した例を以下に示す。すなわ
ち、ソウル属Ｂ−１株で感染したラットより採血し、
３．１％クエン酸ナトリウム処理した血液１mlをリン酸
緩衝液で２倍に希釈し、次にフィコール（比重：１．０
９４０）１mlに重層し、２５℃で遠心分離を行い、リン
パ球を集める。リンパ球をリン酸緩衝液で十分に洗浄し
た後、リンパ球にグアニジンイソチオシアネートを加
え、細胞を溶解させる。溶解後の細胞抽出液をフェノー
ル、クロロホルム処理したのち、２−プロパノール沈殿
を行い、ＲＮＡを回収する。このＲＮＡを鋳型とし、表
１記載のＥ領域に対応するプライマー対Ａ、及びプライ
マー対Ｂを用い、Ｅ領域の増幅を行った結果を表３に示
す。なお対照として感染前のラット血球を用い同様に処
理した。
血液中のＨＦＲＳＶを検出した例を以下に示す。すなわ
ち、ソウル属Ｂ−１株で感染したラットより採血し、
３．１％クエン酸ナトリウム処理した血液１mlをリン酸
緩衝液で２倍に希釈し、次にフィコール（比重：１．０
９４０）１mlに重層し、２５℃で遠心分離を行い、リン
パ球を集める。リンパ球をリン酸緩衝液で十分に洗浄し
た後、リンパ球にグアニジンイソチオシアネートを加
え、細胞を溶解させる。溶解後の細胞抽出液をフェノー
ル、クロロホルム処理したのち、２−プロパノール沈殿
を行い、ＲＮＡを回収する。このＲＮＡを鋳型とし、表
１記載のＥ領域に対応するプライマー対Ａ、及びプライ
マー対Ｂを用い、Ｅ領域の増幅を行った結果を表３に示
す。なお対照として感染前のラット血球を用い同様に処
理した。
【００１８】
【表３】 表 ３ ────────────────────────── 感染の有無 ＤＮＡの増幅の有無 ────────────────────────── 有 有 無 無 ──────────────────────────
【００１９】表３に示すように、感染ラット血液にのみ
特異的ＤＮＡの増幅が認められ、Ｅ領域を検出すること
により、血液検体中のＨＦＲＳＶ由来のＲＮＡを簡便
に、高感度に検出することができる。
特異的ＤＮＡの増幅が認められ、Ｅ領域を検出すること
により、血液検体中のＨＦＲＳＶ由来のＲＮＡを簡便
に、高感度に検出することができる。
【００２０】以上、本発明によりＨＦＲＳＶ検出に有用
な核酸領域が決定される。この核酸領域は、ソウル属Ｂ
−１株では配列表の配列番号１で表される領域であり、
ソウル属８０−３９株では配列表の配列番号２で表され
る領域であり、ソウル属ＳＲ−１１株では配列表の配列
番号３で表される領域である。またハンタン属７６−１
１８株では配列表の配列番号４で表される領域であり、
ハンタン属リー株では配列表の配列番号５で表される領
域であり、逆転写、及び２段階ＰＣＲにより、これらの
領域、又はその相補鎖配列の一部を増幅することによ
り、ＨＦＲＳＶを高感度に検出することができる。以
下、配列表の配列番号１〜５で表される領域をＥ′領域
と称す。
な核酸領域が決定される。この核酸領域は、ソウル属Ｂ
−１株では配列表の配列番号１で表される領域であり、
ソウル属８０−３９株では配列表の配列番号２で表され
る領域であり、ソウル属ＳＲ−１１株では配列表の配列
番号３で表される領域である。またハンタン属７６−１
１８株では配列表の配列番号４で表される領域であり、
ハンタン属リー株では配列表の配列番号５で表される領
域であり、逆転写、及び２段階ＰＣＲにより、これらの
領域、又はその相補鎖配列の一部を増幅することによ
り、ＨＦＲＳＶを高感度に検出することができる。以
下、配列表の配列番号１〜５で表される領域をＥ′領域
と称す。
【００２１】このＥ′領域及びその相補鎖配列を検出す
るためのプライマー対Ａ、及びプライマー対Ｂの１例が
それぞれ配列表の配列番号６、７、及び配列番８、９で
示した核酸断片である。本発明に使用するプライマーと
しては、これらの核酸断片の変異配列でも良く、その変
異配列とは、Ｅ′領域及びその相補鎖配列の検出におい
て機能するものであればいずれでも良く、例えば上記の
配列番号６〜９で表される基本的プライマーの核酸断
片、あるいはそれぞれの３’末端から少なくとも９塩基
以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で置換若
しくは付加された配列で表され、かつプライマー伸長反
応において機能しうる核酸断片よりなる。更に具体的に
はハンタン属、ソウル属ＨＦＲＳＶの突然変異株の同遺
伝子の相当部分に対応する塩基配列などが挙げられる。
なお、プライマー伸長反応の効率に大きく影響を与える
と思われるプライマーの３’末端付近については、変異
がないようにするか、あるいはあっても最小限にとどめ
ることが好ましく、より好適には５’末端付近で変異が
あるようにする。またＥ′領域及びその相補鎖配列の突
然変異に対応するため、突然変異部に対応するプライマ
ー中の塩基をイノシンに置換するのも良い方法である。
配列表の配列番号２７〜３０で表される核酸断片は、配
列表の配列番号６〜９で表される基本的プライマーのそ
れぞれの変異配列の１例である。これらの変異配列を用
いて、上記Ｅ′領域及びその相補鎖配列が効率よく増幅
できる。また、変異配列と基本的プライマーを組合せて
使用しても良い。
るためのプライマー対Ａ、及びプライマー対Ｂの１例が
それぞれ配列表の配列番号６、７、及び配列番８、９で
示した核酸断片である。本発明に使用するプライマーと
しては、これらの核酸断片の変異配列でも良く、その変
異配列とは、Ｅ′領域及びその相補鎖配列の検出におい
て機能するものであればいずれでも良く、例えば上記の
配列番号６〜９で表される基本的プライマーの核酸断
片、あるいはそれぞれの３’末端から少なくとも９塩基
以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で置換若
しくは付加された配列で表され、かつプライマー伸長反
応において機能しうる核酸断片よりなる。更に具体的に
はハンタン属、ソウル属ＨＦＲＳＶの突然変異株の同遺
伝子の相当部分に対応する塩基配列などが挙げられる。
なお、プライマー伸長反応の効率に大きく影響を与える
と思われるプライマーの３’末端付近については、変異
がないようにするか、あるいはあっても最小限にとどめ
ることが好ましく、より好適には５’末端付近で変異が
あるようにする。またＥ′領域及びその相補鎖配列の突
然変異に対応するため、突然変異部に対応するプライマ
ー中の塩基をイノシンに置換するのも良い方法である。
配列表の配列番号２７〜３０で表される核酸断片は、配
列表の配列番号６〜９で表される基本的プライマーのそ
れぞれの変異配列の１例である。これらの変異配列を用
いて、上記Ｅ′領域及びその相補鎖配列が効率よく増幅
できる。また、変異配列と基本的プライマーを組合せて
使用しても良い。
【００２２】次に本発明のプライマーに検出可能な標識
物を結合させることにより増幅ＤＮＡの検出を簡便に行
うことができる。ここで標識物としては、非放射性、放
射性物質のどちらを用いてもよいが、好ましくは非放射
性物質である。非放射性の標識物としては、直接測定可
能なものとして蛍光物質〔例えばフルオレッセイン及び
その誘導体（フルオレッセインイソチオシアネート
等）、ローダミン及びその誘導体（テトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート、テキサスレッド等）〕、化学
発光物質（例えばアクリジン等）や遅延蛍光を発する物
質（ＤＴＴＡ：ファルマシア社製）などが挙げられる。
物を結合させることにより増幅ＤＮＡの検出を簡便に行
うことができる。ここで標識物としては、非放射性、放
射性物質のどちらを用いてもよいが、好ましくは非放射
性物質である。非放射性の標識物としては、直接測定可
能なものとして蛍光物質〔例えばフルオレッセイン及び
その誘導体（フルオレッセインイソチオシアネート
等）、ローダミン及びその誘導体（テトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート、テキサスレッド等）〕、化学
発光物質（例えばアクリジン等）や遅延蛍光を発する物
質（ＤＴＴＡ：ファルマシア社製）などが挙げられる。
【００２３】以下、本発明のプライマーを用いるＨＦＲ
ＳＶの検出方法を詳細に説明する。 （１）検体：目的のＨＦＲＳＶの存在の有無を検知しよ
うとする検体としては前出のＨＦＲＳＶを感染させた動
物細胞、感染動物より得られる臓器、血液等、患者より
得られる血液、唾液、尿等が挙げられる。この中でも血
液を使用すれば感染動物、患者の連続診断を簡便に行う
ことができる。血液中のＨＦＲＳＶの検出には、ＲＮＡ
の抽出、濃縮が好ましく、血液からのＲＮＡの調製法と
しては種々あるが、例えばフィコール法でリンパ球を分
離し、該リンパ球よりＲＮＡを調製しても良く、また、
少量の血液からＲＮＡを調製する方法である陽イオン界
面活性剤を用いる方法〔ネーチャー（Nature) 、第３６
２巻、第１８６〜１８８頁（１９９３）〕を用いても良
く、このときはカトリモックス−１４（Catrimox−１
４：バイオテクノロジー社製）を使用するのが良い。
ＳＶの検出方法を詳細に説明する。 （１）検体：目的のＨＦＲＳＶの存在の有無を検知しよ
うとする検体としては前出のＨＦＲＳＶを感染させた動
物細胞、感染動物より得られる臓器、血液等、患者より
得られる血液、唾液、尿等が挙げられる。この中でも血
液を使用すれば感染動物、患者の連続診断を簡便に行う
ことができる。血液中のＨＦＲＳＶの検出には、ＲＮＡ
の抽出、濃縮が好ましく、血液からのＲＮＡの調製法と
しては種々あるが、例えばフィコール法でリンパ球を分
離し、該リンパ球よりＲＮＡを調製しても良く、また、
少量の血液からＲＮＡを調製する方法である陽イオン界
面活性剤を用いる方法〔ネーチャー（Nature) 、第３６
２巻、第１８６〜１８８頁（１９９３）〕を用いても良
く、このときはカトリモックス−１４（Catrimox−１
４：バイオテクノロジー社製）を使用するのが良い。
【００２４】（２）逆転写及び遺伝子増幅：上記検体に
本発明のプライマー対Ａを加えることによって、検体中
の目的とするＨＦＲＳＶが存在すれば、逆転写酵素によ
るＥ′領域及びその相補鎖領域の逆転写を行うことがで
きる。続いて本発明のプライマー対Ａを用いて１ｓｔＰ
ＣＲ、本発明のプライマー対Ｂを用いて２ｎｄＰＣＲを
行うことによって、逆転写されたＥ領域の一部を効率よ
く増幅することができる。
本発明のプライマー対Ａを加えることによって、検体中
の目的とするＨＦＲＳＶが存在すれば、逆転写酵素によ
るＥ′領域及びその相補鎖領域の逆転写を行うことがで
きる。続いて本発明のプライマー対Ａを用いて１ｓｔＰ
ＣＲ、本発明のプライマー対Ｂを用いて２ｎｄＰＣＲを
行うことによって、逆転写されたＥ領域の一部を効率よ
く増幅することができる。
【００２５】（３）検出：２段階ＰＣＲにより生成した
目的遺伝子は電気泳動法〔サイキ（Saiki)、サイエン
ス、第２３０巻、第１３５０〜１３５４頁（１９８
５）〕、あるいは標識プローブを用いるドットハイブリ
ダイゼーション〔サイキ、ネーチャー、第３２４巻、第
１６３〜１６６頁（１９８６）〕等により検出すること
ができる。プローブとしては増幅領域内でプローブＤＮ
Ａを設計、作製すれば良い。プローブ標識化の方法は放
射性同位元素標識法に限らず、酵素標識、蛍光標識、ビ
オチン・アビジン系標識、ケミプローブ標識法等公知の
方法なら何でも良い。
目的遺伝子は電気泳動法〔サイキ（Saiki)、サイエン
ス、第２３０巻、第１３５０〜１３５４頁（１９８
５）〕、あるいは標識プローブを用いるドットハイブリ
ダイゼーション〔サイキ、ネーチャー、第３２４巻、第
１６３〜１６６頁（１９８６）〕等により検出すること
ができる。プローブとしては増幅領域内でプローブＤＮ
Ａを設計、作製すれば良い。プローブ標識化の方法は放
射性同位元素標識法に限らず、酵素標識、蛍光標識、ビ
オチン・アビジン系標識、ケミプローブ標識法等公知の
方法なら何でも良い。
【００２６】本発明のプライマー対Ａ、プライマー対Ｂ
をそろえてキットとしておくことで、ＨＦＲＳＶの検出
を簡便に行うことができる。なおキット中に、血液より
リンパ球を分取するための試薬、逆転写酵素、ＰＣＲ用
試薬等をそろえておくことで血液中のＨＦＲＳＶのＲＮ
Ａの検出をより迅速・簡便・高感度に行うことができ
る。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でも良
い。
をそろえてキットとしておくことで、ＨＦＲＳＶの検出
を簡便に行うことができる。なおキット中に、血液より
リンパ球を分取するための試薬、逆転写酵素、ＰＣＲ用
試薬等をそろえておくことで血液中のＨＦＲＳＶのＲＮ
Ａの検出をより迅速・簡便・高感度に行うことができ
る。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でも良
い。
【００２７】
【実施例】以下、本発明を実施例をもって詳細に説明す
るが、本発明はこれら実施例によって限定されるもので
はない。
るが、本発明はこれら実施例によって限定されるもので
はない。
【００２８】実施例１ (1) プライマーＤＮＡの作製 配列表の配列番号６〜２５でそれぞれ表されるプライマ
ーＤＮＡをアプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機
を用いて合成し、脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（Ｔ
ＳＫゲル、ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム）で精製し、セプ−
パック（Sep-pak)Ｃ18（ウォーターズ社）で脱塩し、各
ＤＮＡを得た。
ーＤＮＡをアプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機
を用いて合成し、脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（Ｔ
ＳＫゲル、ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム）で精製し、セプ−
パック（Sep-pak)Ｃ18（ウォーターズ社）で脱塩し、各
ＤＮＡを得た。
【００２９】(2) ソウル属Ｂ−１株感染細胞内ＲＮＡの
調製 動物細胞ＶｅｒｏＥ６にソウル属Ｂ−１株（大阪大学微
生物病研究所保有株）を感染させルー氏ビンを用いイー
グルＭＥＭ培地５０mlの培養スケールでウイルスをＣＯ
2 インキュベーター内で７日間培養した。遠心分離にて
細胞を集めグアニジンイソチオシアネートを加え、細胞
を溶解させた。溶解後の細胞抽出液はフェノール、クロ
ロホルム処理をしたのち、２−プロパノール沈殿を行
い、ＲＮＡを回収した。
調製 動物細胞ＶｅｒｏＥ６にソウル属Ｂ−１株（大阪大学微
生物病研究所保有株）を感染させルー氏ビンを用いイー
グルＭＥＭ培地５０mlの培養スケールでウイルスをＣＯ
2 インキュベーター内で７日間培養した。遠心分離にて
細胞を集めグアニジンイソチオシアネートを加え、細胞
を溶解させた。溶解後の細胞抽出液はフェノール、クロ
ロホルム処理をしたのち、２−プロパノール沈殿を行
い、ＲＮＡを回収した。
【００３０】(3) Ｍ鎖の種々の領域で作成したプライマ
ーの逆転写、２段階ＰＣＲによる増幅能の比較 表１に示した５種のプライマー対Ａ、プライマー対Ｂを
用い、ＨＦＲＳＶ検出能の比較をＲＮＡ−ＰＣＲキット
（宝酒造社）を用い行った。実施例１−（２）で得られ
たＢ−１株感染細胞内ＲＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液
（ｐＨ８．３）で１０6 倍、１０7 倍、及び１０8 倍に
それぞれ希釈した検体１μｌと表１の各プライマー対
Ａ、ＲＮＡ−ＰＣＲキット中のｄＮＴＰミクスチャー、
塩化マグネシウム、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液及び水
を加え全量を１８μｌとし、７０℃、３分間加熱し、急
冷する。そこへ逆転写酵素とＲＮａｓｅインヒビターを
加え全量を２０μｌとし、３０℃１０分加温した後、４
２℃、６０分反応させた。９９℃５分で逆転写酵素を失
活させ、冷却した後、タックＤＮＡポリメラーゼ、１０
倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウム、それぞれ
に対応するプライマー対Ａ及び水を加え全量を１００μ
ｌとした。この反応液の上層に１００μｌのミネラルオ
イル（宝酒造社製）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サ
ーマル・サイクラー４８０（Thermal Cycler４８０）
（パーキンエルマー社）により増幅反応を行った。反応
条件は、９４℃、３０秒間の変性→５５℃、３０秒間の
プライマーのアニーリング→７２℃、３０秒間の合成反
応のサイクルを４０サイクル行った。
ーの逆転写、２段階ＰＣＲによる増幅能の比較 表１に示した５種のプライマー対Ａ、プライマー対Ｂを
用い、ＨＦＲＳＶ検出能の比較をＲＮＡ−ＰＣＲキット
（宝酒造社）を用い行った。実施例１−（２）で得られ
たＢ−１株感染細胞内ＲＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液
（ｐＨ８．３）で１０6 倍、１０7 倍、及び１０8 倍に
それぞれ希釈した検体１μｌと表１の各プライマー対
Ａ、ＲＮＡ−ＰＣＲキット中のｄＮＴＰミクスチャー、
塩化マグネシウム、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液及び水
を加え全量を１８μｌとし、７０℃、３分間加熱し、急
冷する。そこへ逆転写酵素とＲＮａｓｅインヒビターを
加え全量を２０μｌとし、３０℃１０分加温した後、４
２℃、６０分反応させた。９９℃５分で逆転写酵素を失
活させ、冷却した後、タックＤＮＡポリメラーゼ、１０
倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウム、それぞれ
に対応するプライマー対Ａ及び水を加え全量を１００μ
ｌとした。この反応液の上層に１００μｌのミネラルオ
イル（宝酒造社製）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サ
ーマル・サイクラー４８０（Thermal Cycler４８０）
（パーキンエルマー社）により増幅反応を行った。反応
条件は、９４℃、３０秒間の変性→５５℃、３０秒間の
プライマーのアニーリング→７２℃、３０秒間の合成反
応のサイクルを４０サイクル行った。
【００３１】反応後、反応液の３μｌ（３％）を別のチ
ューブに移し、タックＤＮＡポリメラーゼ、１０倍ＲＮ
Ａ−ＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰミクス
チャー、それぞれに対応する表１に記載のプライマー対
Ｂ、及び水を加え全量を１００μｌとした。この反応液
の上層に１００μｌのミネラルオイルを加えた後、自動
遺伝子増幅装置サーマル・サイクラー４８０により増幅
反応を行った。反応条件は、９４℃、３０秒間の変性→
５５℃、３０秒間のプライマーのアニーリング→７２
℃、３０秒間の合成反応のサイクルを４０サイクル行っ
た。反応後、上層のミネラルオイルを除去した後、反応
液の１０μｌを取り、３％ヌシーブ（NuSieve)ＧＴＧア
ガロース−１％シー・ケム（Sea-Kem)アガロース（ＦＭ
Ｃ社）ゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤ
ＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確認した。
ューブに移し、タックＤＮＡポリメラーゼ、１０倍ＲＮ
Ａ−ＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰミクス
チャー、それぞれに対応する表１に記載のプライマー対
Ｂ、及び水を加え全量を１００μｌとした。この反応液
の上層に１００μｌのミネラルオイルを加えた後、自動
遺伝子増幅装置サーマル・サイクラー４８０により増幅
反応を行った。反応条件は、９４℃、３０秒間の変性→
５５℃、３０秒間のプライマーのアニーリング→７２
℃、３０秒間の合成反応のサイクルを４０サイクル行っ
た。反応後、上層のミネラルオイルを除去した後、反応
液の１０μｌを取り、３％ヌシーブ（NuSieve)ＧＴＧア
ガロース−１％シー・ケム（Sea-Kem)アガロース（ＦＭ
Ｃ社）ゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤ
ＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確認した。
【００３２】その結果、表１に示した各プライマー対
Ａ、プライマー対Ｂを用いた場合、Ｅ領域は１０7 倍希
釈液まで特異的な増幅が認められたが、Ａ〜Ｄ領域では
１０6倍希釈液で増幅が認められたのみであり、Ｅ領域
はＨＦＲＳＶの検出に最適の領域と決定された。この
時、Ｂ−１株感染細胞内ＲＮＡの１０7 倍希釈液１μｌ
中のＲＮＡ量は０．０１pgであった。
Ａ、プライマー対Ｂを用いた場合、Ｅ領域は１０7 倍希
釈液まで特異的な増幅が認められたが、Ａ〜Ｄ領域では
１０6倍希釈液で増幅が認められたのみであり、Ｅ領域
はＨＦＲＳＶの検出に最適の領域と決定された。この
時、Ｂ−１株感染細胞内ＲＮＡの１０7 倍希釈液１μｌ
中のＲＮＡ量は０．０１pgであった。
【００３３】（４）キットの作製 Ｅ′領域及びその相補鎖配列検出用のプライマー、ＡＭ
Ｖ由来逆転写酵素（宝酒造社）、タックポリメラーゼ
（宝酒造社）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社
製）、１０倍ＲＮＡＰＣＲ緩衝液、基質（ｄＮＴＰミク
スチャー）、塩化マグネシウム、及びポジティブコント
ロールＲＮＡで表４に示すＨＦＲＳＶ検出用キットを作
製した。なおキット中の試薬Ｇは、上記実施例１−
（２）記載のＲＮＡを使用した。
Ｖ由来逆転写酵素（宝酒造社）、タックポリメラーゼ
（宝酒造社）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社
製）、１０倍ＲＮＡＰＣＲ緩衝液、基質（ｄＮＴＰミク
スチャー）、塩化マグネシウム、及びポジティブコント
ロールＲＮＡで表４に示すＨＦＲＳＶ検出用キットを作
製した。なおキット中の試薬Ｇは、上記実施例１−
（２）記載のＲＮＡを使用した。
【００３４】
【表４】 表 ４ ──────────────────────────────────── ＨＦＲＳＶ検出キット（１００回分） ──────────────────────────────────── 試薬Ａ・・・逆転写酵素 ５０ユニット／μｌ １０μｌ 試薬Ｂ・・・タックＤＮＡポリメラーゼ ５ユニット／μｌ １００μｌ 試薬Ｃ・・・ＲＮａｓｅインヒビター ４０ユニット／μｌ ５０μｌ 試薬Ｄ・・・１０倍 ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液 ２ml ┌─１００mM トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．３ └─５００mM 塩化カリウム 試薬Ｅ・・・２５mM 塩化マグネシウム １．６ml 試薬Ｆ・・・ｄＮＴＰミクスチャー １．６ml 各２．５mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ 試薬Ｇ・・・ポジティブ・コントロールＲＮＡ １０pg／μｌ ５０μｌ 試薬Ｈ・・・プライマー対Ａ 各２００μｌ ＨＳ−ＨＦ３−１ ２０pmol／μｌ ＨＳ−ＲＳ３−１ ２０pmol／μｌ 試薬Ｉ・・・プライマー対Ｂ 各１００μｌ ＨＳ−ＨＦ３−２ ２０pmol／μｌ ＨＳ−ＲＳ３−２ ２０pmol／μｌ ────────────────────────────────────
【００３５】実施例２ ＨＦＲＳＶ感染ラット血液中のＨＦＲＳＶの検出ソウル 属Ｂ−１株感染ラットから経時的に採血し、採血
した血液を３．１％クエン酸ナトリウム処理し、その処
理液１ｍｌをリン酸緩衝液で２倍に希釈した後、フィコ
ール（比重：１．０９４０）１ｍｌに重層し、２５℃で
遠心分離を行い、リンパ球層を集めた。リン酸緩衝液で
十分に洗浄した後、細胞にグアニジンイソチオシアネー
トを加え、細胞を溶解させた。溶解後の細胞抽出液をフ
ェノール、クロロホルム処理をしたのち、２−プロパノ
ール沈殿を行いＲＮＡを回収した。該ＲＮＡは−８０℃
にて保存し、使用時に１０μｌのトリス・ＥＤＴＡ緩衝
液に溶解した。なおソウル属Ｂ−１株感染ラットはＢ−
１株（約１０３ｆ．ｆ．ｕ）を６週令の雄ラットに腹腔
内投与により、感染、発症させ、感染後（発症後）１週
間目、２週間目に採血した。なお感染前ラット血液を対
照として調製した。
した血液を３．１％クエン酸ナトリウム処理し、その処
理液１ｍｌをリン酸緩衝液で２倍に希釈した後、フィコ
ール（比重：１．０９４０）１ｍｌに重層し、２５℃で
遠心分離を行い、リンパ球層を集めた。リン酸緩衝液で
十分に洗浄した後、細胞にグアニジンイソチオシアネー
トを加え、細胞を溶解させた。溶解後の細胞抽出液をフ
ェノール、クロロホルム処理をしたのち、２−プロパノ
ール沈殿を行いＲＮＡを回収した。該ＲＮＡは−８０℃
にて保存し、使用時に１０μｌのトリス・ＥＤＴＡ緩衝
液に溶解した。なおソウル属Ｂ−１株感染ラットはＢ−
１株（約１０３ｆ．ｆ．ｕ）を６週令の雄ラットに腹腔
内投与により、感染、発症させ、感染後（発症後）１週
間目、２週間目に採血した。なお感染前ラット血液を対
照として調製した。
【００３６】上記動物血液から調製したＲＮＡ及び実施
例１−（４）に記載のキットを用い、ＨＦＲＳＶの検出
を以下のように行った。上記動物血液から調製したＲＮ
Ａの溶液１μｌと実施例１−（４）に記載のキット中の
１回分のプライマー対Ａ、ｄＮＴＰミクスチャー、塩化
マグネシウム、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、及び水を
加え全量を１８μｌとし、７０℃、３分加熱し、急冷し
た。そこへキット１回分の逆転写酵素とＲＮａｓｅイン
ヒビターを加え、全量を２０μｌとし、３０℃１０分加
温した後、４２℃、６０分反応させた。９９℃５分で逆
転写酵素を失活させ、冷却した後、キット１回分のタッ
クＤＮＡポリメラーゼ、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、
塩化マグネシウム、プライマー対Ａ、及び水を加え全量
を１００μｌとした。
例１−（４）に記載のキットを用い、ＨＦＲＳＶの検出
を以下のように行った。上記動物血液から調製したＲＮ
Ａの溶液１μｌと実施例１−（４）に記載のキット中の
１回分のプライマー対Ａ、ｄＮＴＰミクスチャー、塩化
マグネシウム、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、及び水を
加え全量を１８μｌとし、７０℃、３分加熱し、急冷し
た。そこへキット１回分の逆転写酵素とＲＮａｓｅイン
ヒビターを加え、全量を２０μｌとし、３０℃１０分加
温した後、４２℃、６０分反応させた。９９℃５分で逆
転写酵素を失活させ、冷却した後、キット１回分のタッ
クＤＮＡポリメラーゼ、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、
塩化マグネシウム、プライマー対Ａ、及び水を加え全量
を１００μｌとした。
【００３７】この反応液の上層に１００μｌのミネラル
オイルを加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイ
クラー４８０により増幅反応を行った。反応条件は９４
℃、３０秒間の変性→５０℃、３０秒間のプライマーの
アニーリング→７２℃、３０秒間の合成反応のサイクル
を４０サイクル行った。反応後、反応液の３μｌ（３
％）を別のチューブに移し、キット１回分のタックＤＮ
Ａポリメラーゼ、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、塩化マ
グネシウム、ｄＮＴＰミクスチャー、プライマー対Ｂ、
及び水を加え全量を１００μｌとし、この反応液の上層
に１００μｌのミネラルオイルを加えた後、自動遺伝子
増幅装置サーマル・サイクラー４８０により増幅反応を
行った。反応条件は９４℃、３０秒間の変性→４５℃、
３０秒間のプライマーのアニーリング→７２℃、３０秒
間の合成反応のサイクルを４０サイクル行った。反応
後、上層のミネラルオイルを除去した後、反応液の１０
μｌを取り、３％ヌシーブＧＴＧアガロース−１％シー
・ケムアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロ
マイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確認し
た。
オイルを加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイ
クラー４８０により増幅反応を行った。反応条件は９４
℃、３０秒間の変性→５０℃、３０秒間のプライマーの
アニーリング→７２℃、３０秒間の合成反応のサイクル
を４０サイクル行った。反応後、反応液の３μｌ（３
％）を別のチューブに移し、キット１回分のタックＤＮ
Ａポリメラーゼ、１０倍ＲＮＡ−ＰＣＲ緩衝液、塩化マ
グネシウム、ｄＮＴＰミクスチャー、プライマー対Ｂ、
及び水を加え全量を１００μｌとし、この反応液の上層
に１００μｌのミネラルオイルを加えた後、自動遺伝子
増幅装置サーマル・サイクラー４８０により増幅反応を
行った。反応条件は９４℃、３０秒間の変性→４５℃、
３０秒間のプライマーのアニーリング→７２℃、３０秒
間の合成反応のサイクルを４０サイクル行った。反応
後、上層のミネラルオイルを除去した後、反応液の１０
μｌを取り、３％ヌシーブＧＴＧアガロース−１％シー
・ケムアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロ
マイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確認し
た。
【００３８】その結果感染ラット血液由来検体からのみ
ソウル属Ｂ−１株ＲＮＡのＭ鎖の塩基配列上から予想さ
れる大きさのフラグメント（１１９bp）が増幅された。
上記のＤＮＡフラグメントをジデオキシシークエンシン
グ法により核酸の塩基配列を解析した結果、ソウル属Ｂ
−１株由来の塩基配列であることを確認した。ＨＦＲＳ
Ｖ感染ラットより経時的に採血した血液中のＨＦＲＳＶ
の検出結果を表５に示す。
ソウル属Ｂ−１株ＲＮＡのＭ鎖の塩基配列上から予想さ
れる大きさのフラグメント（１１９bp）が増幅された。
上記のＤＮＡフラグメントをジデオキシシークエンシン
グ法により核酸の塩基配列を解析した結果、ソウル属Ｂ
−１株由来の塩基配列であることを確認した。ＨＦＲＳ
Ｖ感染ラットより経時的に採血した血液中のＨＦＲＳＶ
の検出結果を表５に示す。
【００３９】
【表５】 表 ５ ─────────────────────────── 感 染 前 １ 週 ２ 週 ─────────────────────────── − ＋ ＋＋ ───────────────────────────
【００４０】（表５中−は特異的な遺伝子増幅のないこ
と、＋は特異的な遺伝子増幅があること、＋＋は強い増
幅があることを示す。） 表５に示されるように、感染初期の従来の血清学的方法
では検出が不可能である時期（感染１週間目）でも、本
発明の方法により、ウイルスの存在が確認された。
と、＋は特異的な遺伝子増幅があること、＋＋は強い増
幅があることを示す。） 表５に示されるように、感染初期の従来の血清学的方法
では検出が不可能である時期（感染１週間目）でも、本
発明の方法により、ウイルスの存在が確認された。
【００４１】
【発明の効果】本発明により、ＨＦＲＳＶを検体より、
直接、短時間で、高感度に検出することが可能となり、
腎症候性出血熱の確定診断が簡便に行えるようになっ
た。本発明により提供されるＨＦＲＳＶの検出方法、及
び検出用プライマーはＨＦＲＳ患者の診断、実験動物の
管理、ＨＦＲＳＶのモニタリングによる環境浄化等の分
野において有用である。
直接、短時間で、高感度に検出することが可能となり、
腎症候性出血熱の確定診断が簡便に行えるようになっ
た。本発明により提供されるＨＦＲＳＶの検出方法、及
び検出用プライマーはＨＦＲＳ患者の診断、実験動物の
管理、ＨＦＲＳＶのモニタリングによる環境浄化等の分
野において有用である。
【００４２】
【００４３】配列番号：1 配列の長さ：206 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列： GGUGCACCAU CAUCAUAAAC UUUCUCGUUU UCUAACUCAG AGAUACCAUU UACCUUAUCC 60 AGAUGUGGUG CACUGGCUUG GAGGCCAGUU GAUGAACAUU CUUUCCCAUG ACAGCAUUUA 120 AAUGAAGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCA GUAAUUUUGA CAGUAUUUUG UCCUCGUGAG 180 AGUGUUACAC UUUCUGCACC GUAACA 206
【００４４】配列番号：2 配列の長さ：206 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列： GGUGCACCAU CAUCAUAAAC UUUCUCAUUU UCUAACUCAG AGAUUCCAUU UACCUUAUCU 60 AAAUGUGGUG CACUGGCUUG GAGGCCAGUU AAUGAACAUU CUUUCCCAUG ACAGCACUUA 120 AAUGAGGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCG GUAAUUUUGA CAGUAUUUUG UCCUCGUGAG 180 AGUGUCACAC UUUCUGCACC AUAACA 206
【００４５】配列番号：3 配列の長さ：206 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列： GGUGCACCGU CAUCAUAAAC UUUCUCGUUU UCUAACUCAG AGAUACCAUU UACCUUAUCC 60 AGAUGUGGUG CACUGGCUUG GAGGCCAGUU GAUGAACAUU CUUUCCCAUG ACAGCAUUUG 120 AAUGAAGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCG GUAAUUUUGA CAGUAUUUUG UCCUCGUGAG 180 AGUGUCACAC UUUCUGCACC AUAACA 206
【００４６】配列番号：4 配列の長さ：206 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列： GGUGCCCCAU CAUCAUAUAC UUUACUAUUU UCUAUCUCAG AAAUCCCAUU UACCUUGUCA 60 AGGUGAGGUG CAGCAGCAUG GAGUCCAAUU UGUGAACAGU CCUCCCCAUG GCAACACCUA 120 AAUGUUGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCU GAUACCUUGA CUGUAUUUUG UCCUCUUGUC 180 AAUGUUACAC UCUCUGCACC AUAACA 206
【００４７】配列番号：5 配列の長さ：206 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列： GGUGCUCCAU CAUCAUAUUC UUUGCUAUUU UCCAUCUCAG AAAUCCCAUU GACCUUGUCU 60 AGGUGAGGUG CAGCAGCAUG GAGUCCAAUU UGUGAACAGU CCUCCCCAUG GCAACACUUA 120 AAUGUUGAAC CACUAUGGCC ACCUUUUCCU GAUACCUUGA CUGUAUUUUG CCCUCUUGUU 180 AAUGUUACAC UCUCUGCACC AUAACA 206
【００４８】配列番号：6 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGTTATGGYG CAGAGAGTGT RAC 23
【００４９】配列番号：7 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTGCHCCRT CATCATAWWC TTT 23
【００５０】配列番号：8 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGRAAAGGTG GCCATAGTGG TTC 23
【００５１】配列番号：9 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCYAWCTCAG ARATHCCATT KAC 23
【００５２】配列番号：10 配列の長さ：3651 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列： TAGTAGTAGA CTCCGCAAGA AACAGCAGTT AAATAACAGC AGGATCATGT GGAGTTTGCT 60 ATTACTGGCC GCTTTAGTTG GTCAAGGCTT TGCATTAAAA AATGTGTTTG ACATGAGAAT 120 TCAGTGTCCC CACTCAGTCA ACTTCGGGGA AACAAGTGTG TCAGGCTATA CAGAACTGCC 180 CCCACTCTCA TTACAGGAGG CTGAACAGCT GGTGCCAGAG AGCTCATGCA ACATGGACAA 240 CCACCAATCA CTCTCAACAA TAAATAAATT AACCAAGGTC ATATGGCGGA AAAAAGCAAA 300 TCAGGAATCA GCAAACCAGA ATTCATTTGA AGTTGTGGAG AGTGAAGTCA GCTTTAAAGG 360 GTTGTGTATG TTAAAGCATA GAATGGTTGA AGAATCATAT AGAAATAGGA GATCAGTAAT 420 CTATTATGAT CTAGCTGGTA ATAGTACATT CTGTAAGCCA ACTGTTTACA TGATCGTTCC 480 TATACATGCA TGCAACATGA TGAAAAGCTG CTTAATTGGC CTTGGTCCCT ACAGAATCCA 540 GGTTGTCTAT GAAAGGACAT ACTGCACTAC AGGTATATTG ACAGAAGGAA AATGCTTTGT 600 TCCTGACAAG GCTGTTGTCA GTGCATTGAA GAGAGGCATG TATGCCATAG CAAGCATAGA 660 GACAATCTGC TTTTTTATTC ATCAGAAATG GAATAAATAT AAGATAGTGA CTGCCATTAC 720 ATCGGCAATG GGCTCGAAAT GTAATAATAC AGATACTAAA GTTCAAGGAT ATTATATCTG 780 TATTATTGGT GGAAACTCTG CCCCTGTATA TGCCCCTGCT GGTGAAGACT TTAGGGCAAT 840 GGAGGTTTTT TCTGGGATTA TTACATCACC ACATGGAGAA GACCATGACC TCCCTGGCGA 900 AGAAATTGCA ACATACCATA TTTCAGGGCA GATAGAGGCA AAAATCCCTC ATACAGTGAG 960 CTCCAAGAAC TTAAGATTGG CTGCTTTTGC AGGTATTCCA TCATACTCAT CAACTAGTAT 1020 ATTGGCTGCT TCAGAAGATG GTCGTTTCAT ATTTAGTCCT GGTCTATTTC CTAACCTAAA 1080 TCAGTCAGTC TGTGACAACA ATGCACTCCC TTTAATCTGG AGGGGCCTAA TTGATTTAAC 1140 TGGATACTAT GAGGCAGTCC ACCCTTGTAA TGTATTCTGT GTCTTATCAG GACCAGGTGC 1200 TTCATGTGAA GCCTTTTCAG AAGGAGGTAT TTTCAATATT ACTTCTCCAA TGTGCCTGGT 1260 GTCCAAGCAG AATAGGTTTA GAGCAGCTGA GCAGCAGATC AGCTTTGTCT GCCAAAGGGT 1320 TGATATGGAT ATTATAGTGT ACTGTAATGG TCAGAAAAAA ACAATCTTAA CAAAAACATT 1380 AGTTATAGGC CAATGCATTT ATACTATTAC AAGTCTCTTT TCACTGTTAC CAGGGGTTGC 1440 CCATTCTATT GCTATTGAGT TGTGTGTTCC AGGGTTTCAT GGCTGGGCCA CAGCTGCACT 1500 TTTGATCACA TTCTGCTTTG GCTGGGTATT GATTCCTGCA TGTACATTAG CTATTCTTTT 1560 AGTTCTTAAG TTTTTTGCAA ATATCCTTCA TACAAGCAAT CAAGAGAACC GATTCAAAGC 1620 CATTCTACGG AAAATAAAGG AGGAGTTTGA AAAAAGAAAG GGTTCCATGG TTTGTGAGAT 1680 CTGTAAGTAT GAGTGTGAAA CATTAAAAGA ATTGAAGGCA CATAATCTAT CATGTGTTCA 1740 AGGAGAGTGC CCATATTGCT TTACCCACTG TGAACCGACA GAAACTGCAA TTCAGGCACA 1800 TTACAAAGTT TGTCAGGCCA CCCACCGATT CAGAGAAGAT TTAAAAAAGA CTGTAACTCC 1860 TCAAAACATT GGGCCTGGCT GTTACCGCAC ATTAAATCTT TTTAGGTATA AGAGTAGGTG 1920 TTATATTCTG ACAATGTGGA CTCTTCTTCT AATTATTGAA TCCATCCTCT GGGCAGCAAG 1980 TGCAGCAGAA ATCCCCCTTG TCCCGCTCTG GACAGATAAT GCTCATGGCG TTGGGAGTGT 2040 TCCTATGCAT ACAGATCTTG AATTAGACTT TTCTTTGCCA TCCAGTTCTA AGTACACATA 2100 TAAAAGACAT CTCACAAACC CAGTTAATGA CCAACAGAGT GTCTCATTGC ACATAGAAAT 2160 TGAAAGTCAA GGCATTGGTG CTGATGTTCA TCATCTTGGA CATTGGTATG ATGCAAGACT 2220 GAATCTAAAA ACCTCATTTC ATTGTTATGG TGCCTGCACA AAATATCAAT ATCCATGGCA 2280 CACTGCAAAA TGCCATTTTG AGAAAGATTA TGAGTATGAA AATAGCTGGG CATGCAACCC 2340 CCCAGATTGC CCAGGGGTTG GTACAGGTTG TACTGCTTGT GGATTATATC TAGATCAATT 2400 GAAGCCGGTA GGAACAGCCT TCAAAATTAT AAGTGTAAGA TACAGTAGAA AAGTGTGCGT 2460 GCAGTTTGGT GAAGAACACC TTTGTAAAAC AATTGATATG AATGATTGCT TTGTGACTAG 2520 GCATGCCAAA ATATGTATAA TTGGGACTGT ATCTAAGTTT TCTCAAGGTG ACACTCTACT 2580 GTTCCTAGGG CCTATGGAAG GAGGTGGTAT AATCTTTAAA CACTGGTGCA CATCAACCTG 2640 TCATTTTGGA GACCCTCGTG ATGTCATGGG TCCAAAAGAT AAACCATTTA TTTGCCCTGA 2700 ATTCCCAGGG CAATTCAGGA AAAAATGTAA CTTTGCCACG ACTCCAGTTT GTGAATATGA 2760 TGGAAACATT ATCTCAGGTT ATAAGAAAGT TCTTGCAACA ATTGATTCTT TCCAATCATT 2820 TAATACAAGC AACATACACT TCACTGATGA GAGAATTGAA TGGAGAGACC CTGATGGTAT 2880 GCTCCGGGAT CATATTAATA TTGTTATTTC TAAAGATATT GATTTTGAAA ATTTGGCTGA 2940 GAATCCTTGT AAAGTAGGGC TTCAGGCAGC AAACATAGAA GGTGCCTGGG GTTCAGGTGT 3000 CGGGTTTACA CTCACATGTC AGGTGTCTCT CACAGAATGC CCAACATTTC TCACATCAAT 3060 AAAGGCCTGT GACATGGCAA TTTGTTACGG TGCAGAAAGT GTAACACTCT CACGAGGACA 3120 AAATACTGTC AAAATTACTG GGAAAGGTGG CCATAGTGGT TCTTCATTTA AATGCTGTCA 3180 TGGGAAAGAA TGTTCATCAA CTGGCCTCCA AGCCAGTGCA CCACATCTGG ATAAGGTAAA 3240 TGGTATCTCT GAGTTAGAAA ACGAGAAAGT TTATGATGAT GGTGCACCTG AATGTGGCGT 3300 TACTTGTTGG TTTAAAAAAT CAGGTGAATG GGTTATGGGT ATAATCAATG GAAACTGGGT 3360 TGTCCTAATT GTCTTGTGTG TCCTGCTGCT CTTTTCTCTT ATCCTGTTGA GCATCTTGTG 3420 TCCTGTTAGA AAGCATAAAA AATCATAAAT CCTACCTATT ATTCTTCACA GCATGTATTG 3480 AGTTTTAAAC ACTTTACCAT TAAAAACTTA ACCTGGCTCT AATATCTGAT AACTAACTTT 3540 CATTTTTATT TTTATATGGA TTAATTACTA AAAAAAATAC TCTCTTCTAT CTCCCAATCT 3600 TTTATTGATT CACCGGGGTG TTGTCTTGAC ATCCTGCGGA GTCTACTACT A 3651
【００５３】配列番号：11 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGRAACTCYG CMCCHRTATA TG 22
【００５４】配列番号：12 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCTTCWGAAA AGGCYTCACA TGA 23
【００５５】配列番号：13 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCACCRCATG GRGAAGAYCA TGA 23
【００５６】配列番号：14 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： RGGGTGGAYW GCYTCRTAGT ATC 23
【００５７】配列番号：15 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CATCYAGTTC YARGTAYACA TA 22
【００５８】配列番号：16 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCCTAGWYAC AAARCAATCR TTC 23
【００５９】配列番号：17 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCMTTTCAYT GTTATGGTGC 20
【００６０】配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGGTDYTCYT CMCCRAAYTG 20
【００６１】配列番号：19 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTTTTCTTTG CCATCCAGTT CTA 23
【００６２】配列番号：20 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGAACAGTAG AGTGTCACCT TGA 23
【００６３】配列番号：21 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCTCATTTCA TTGTTATGGT GCC 23
【００６４】配列番号：22 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCCTAGTCAC AAAGCAATCA TTC 23
【００６５】配列番号：23 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GATATGAATG ATTGYTTTGT 20
【００６６】配列番号：24 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCATCAGGGT CTYTCCA 17
【００６７】配列番号：25 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGTATAATTG GGACWGTATC TAA 23
【００６８】配列番号：26 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCAAAGTTAC ATTTYTTCCT 20
【００６９】配列番号：27 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGTTAYGGTG CAGARAGTGT RAC 23
【００７０】配列番号：28 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GYGCHCCRTC ATCATAWWCT TT 22
【００７１】配列番号：29 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GRRAAAGGTG GCCATAGTGG TTC 23
【００７２】配列番号：30 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： YCYAWCTCAG ARATHCCATT KAC 23
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 竹迫 一任 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 伊勢川 裕二 大阪府高槻市日吉台一番町７−43 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/70 C12N 7/00 C12Q 1/68 C12N 15/09 C12Q 1/48 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 腎症候性出血熱ウイルスの検出方法にお
いて、逆転写及びその後の２段階ポリメラーゼ チェー
ン リアクション（ＰＣＲ）により、配列表の配列番号
１〜５でそれぞれ表される核酸及びその相補鎖配列より
成る群より選択される少なくとも一つの核酸の一部を増
幅する工程を包含することを特徴とする腎症候性出血熱
ウイルスの検出方法。 - 【請求項２】 下記工程を包含することを特徴とする検
体中の腎症候性出血熱ウイルスの検出方法。 （ａ）検体中より核酸を分離する工程、（ｂ）分離され
た核酸を、配列表の配列番号６で表される核酸断片、あ
るいはその３’末端から少なくとも９塩基以後の一部の
塩基を欠失するか、又は他の塩基で置換若しくは付加さ
れた配列で表され、かつプライマー伸長反応において機
能しうる核酸断片、及び／又は配列表の配列番号７で表
される核酸断片、あるいはその３’末端から少なくとも
９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で
置換若しくは付加された配列で表され、かつプライマー
伸長反応において機能しうる核酸断片から選択されるプ
ライマーを用いて逆転写し、逆転写されたＤＮＡを得る
工程、（ｃ）逆転写されたＤＮＡを配列表の配列番号６
で表される核酸断片、あるいはその３’末端から少なく
とも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩
基で置換若しくは付加された配列で表され、かつプライ
マー伸長反応において機能しうる核酸断片、及び配列表
の配列番号７で表される核酸断片、あるいはその３’末
端から少なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失する
か、又は他の塩基で置換若しくは付加された配列で表さ
れ、かつプライマー伸長反応において機能しうる核酸断
片の組合せで１段階目のＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅さ
せる工程、（ｄ）増幅ＤＮＡを配列表の配列番号８で表
される核酸断片、あるいはその３’末端から少なくとも
９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩基で
置換若しくは付加された配列で表され、かつプライマー
伸長反応において機能しうる核酸断片、及び配列表の配
列番号９で表される核酸断片、あるいはその３’末端か
ら少なくとも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又
は他の塩基で置換若しくは付加された配列で表され、か
つプライマー伸長反応において機能しうる核酸断片の組
合せで２段階目のＰＣＲを行いＤＮＡを増幅させる工
程、及び、（ｅ）増幅ＤＮＡを検出する工程。 - 【請求項３】 配列表の配列番号６〜９でそれぞれ表さ
れる核酸断片、あるいはそれぞれの３’末端から少なく
とも９塩基以後の一部の塩基を欠失するか、又は他の塩
基で置換若しくは付加された配列で表され、かつプライ
マー伸長反応において機能しうる核酸断片よりなる腎症
候性出血熱ウイルス検出用プライマー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2238795A JP2869018B2 (ja) | 1994-05-06 | 1995-01-18 | 腎症候性出血熱ウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-116037 | 1994-05-06 | ||
| JP11603794 | 1994-05-06 | ||
| JP2238795A JP2869018B2 (ja) | 1994-05-06 | 1995-01-18 | 腎症候性出血熱ウイルスの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0819400A JPH0819400A (ja) | 1996-01-23 |
| JP2869018B2 true JP2869018B2 (ja) | 1999-03-10 |
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ID=26359596
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2238795A Expired - Fee Related JP2869018B2 (ja) | 1994-05-06 | 1995-01-18 | 腎症候性出血熱ウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2869018B2 (ja) |
-
1995
- 1995-01-18 JP JP2238795A patent/JP2869018B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
| JPH0819400A (ja) | 1996-01-23 |
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