BRPI0618025A2 - método para controlar ervas daninhas em uma área, polinucleotìdeo isolado, célula de planta e planta resistente a herbicida - Google Patents

Abstract

<B>MéTODO PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS EM UMA áREA, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO, CéLULA DE PLANTA E PLANTA RESISTENTE A HERBICIDA<D>. A presente invenção refere-se a novas plantas que são não somente resistentes a 2,4-D, mas também a herbicidas de piridiloxiacetato. Até o momento, não houve expectativa ou sugestão de que uma planta com ambas estas propriedades vantajosas podem ser produzidas pela introdução de um único gene. A invenção em questão também inclui plantas que produzem uma ou mais enzimas da invenção em questão empilhadas junto com um ou mais genes de resistência a herbicida diferentes. A invenção em questão possibilita novas combinações de herbicidas a serem usados em novos modos. Além disso, a invenção em questão proporciona novos métodos para evitar o desenvolvimento de, e controlar, cepas de ervas daninhas que são resistentes a um ou mais herbicidas tais como glifosato. Uma enzima e gene preferenciais para uso de acordo com a invenção em questão são referidos aqui, neste requerimento de patente, como AAD-12 (AriloxiAlcanoato Dioxigenase). Esta invenção altamente nova é a base de traço significativo de colheita tolerante a herbicida e oportunidades de marcadores selecionáveis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS EM UMA ÁREA, POLINUCLEO-TÍDEO ISOLADO, CÉLULA DE PLANTA E PLANTA RESISTENTE AHERBICIDA".

Antecedentes da Invenção

Ervas daninhas podem rapidamente exaurir o solo de valiososnutrientes necessários para as colheitas e outras plantas desejáveis. Hámuitos tipos diferentes de herbicidas atualmente usados para o controle deervas daninhas. Um herbicida extremamente popular é glifosato.

Têm sido desenvolvidas colheitas, tais como milho, sojas, cano-lal algodão, beterrabas sacarinas, trigo, turfa, e arroz, que são resistentes aglifosato. Deste modo, campos com sojas resistentes a glifosato crescendoativamente, por exemplo, podem ser pulverizados para controlar ervas dani-nhas sem danificar significativamente as plantas de soja.

Com a introdução de colheitas tolerantes a glifosato (GTCs) pro-duzidas por engenharia genética em meados dos anos 90, os produtoresforam capacitados com uma ferramenta simples, conveniente, flexível, e e-conômica para controlar um amplo espectro de ervas daninhas de folhaslargas e de gramíneas sem igual na agricultura. Conseqüentemente, os pro-dutores rapidamente adotaram colheitas tolerantes a glifosato e em muitoscasos rapidamente abandonaram muitas das práticas agronômicas mais a-ceitas tais como rotação de colheita, modo de rotação da ação herbicida,misturação em tanque, incorporação de mecânica com controle químico ecultural de ervas daninhas. Atualmente soja, algodão, milho, e canola tole-rantes a glifosato estão disponíveis comercialmente nos Estados Unidos e emqualquer lugar no Hemisfério Ocidental. Alfafa foi a primeira colheita tolerante aglifosato perene introduzida, promovendo a oportunidade de uso repetido deglifosato sobre a mesma colheita e campos repetidamente durante um períodode anos. Mais GTCs (por exemplo, trigo, arroz, beterrabas sacarinas, turfa, eetc.) são sustentadas para introdução dependendo da aceitação do mercadoglobal. Muitas outras espécies resistentes a glifosato estão em estágios expe-rimentais para desenvolvimento (por exemplo, cana-de-açúcar, girassol, beter-rabas, ervilhas, cenoura, pepino, alface, cebola, morango, tomate, e tabaco;espécies silvícolas como álamo e liquidâmbar; e espécies hortícolas comocravo-de-defunto, petúnia, e begônias; vide o website"isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005"). Adicionalmente, o custo doglifosato tem caído dramaticamente nos últimos anos até o ponto em quepoucos programas de controle de ervas daninhas convencionais podemcompetir de modo eficaz em preço e desempenho com sistemas de GTC deglifosato.

O glifosato tem sido usado com sucesso em manejo e outrasáreas não de colheita para controle da vegetação total por mais de 15 anos.Em muitos casos, como com GTCs, glifosato tem sido usado 1 a 3 vezes porano por 3, 5, 10, até 15 anos em uma leira. Estas circunstâncias têm levadoa uma superconfiança em tecnologia de GTC e glifosato e tem imposto umapesada pressão de seleção sobre espécies de ervas daninhas nativas paraplantas que são naturalmente mais tolerante a glifosato ou as quaisdesenvolveram um mecanismo para resistir à atividade herbicida doglifosato.

O uso extensivo de programas de controle de ervas daninhascom somente glifosato está resultando na seleção de ervas daninhasresistentes a glifosato, e é seletivo para a propagação de espécies de ervasdaninhas que são inerentemente mais tolerantes a glifosato do que a maioriadas espécies alvo (isto é, mudanças de ervas daninhas). (Powles andPreston, 2006, Ng etal., 2003; Simarmata etal., 2003; Lorraine-Colwill et al.,2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002;Martin et al., 2002). Embora glifosato tenha sido amplamtene usadoglobalmente por mais de 15 anos, somente foi relatado que um punhado deervas daninhas desenvolveram resistência a glifosato (Heap, 2005); noentanto, a maioria destas foram identificadas nos últimos cinco anos. Ervasdaninhas resistentes incluem tanto espécies de gramíneas quanto de folhaslargas — Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Sorghumhalepense, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis,Plantago lanceolata, Amaranthus palmerii, e Amaranthus rudis.Adicionalmente, ervas daninhas que previamente não foram um problemaagronômico antes do uso amplo de GTCs estão agora se tornando maisprevalentes e difíceis de controlar no contexto de GTCs, as quaiscompreendem >80% dos acres de algodão e de soja U. S. e >20% dos acresde milho U. S. (Gianessi, 2005). Estas mudanças de ervas daninhas estãoocorrendo predominantemente com (mas não exclusivamente) ervasdaninhas de folhas largas difíceis de controlar. Alguns exemplos incluem asespécies Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum, e Commelina.

Em áreas onde os produtores se deparam com ervas daninhasresistèntes a glifosato ou uma mudança para espécies de ervas daninhasmais difíceis de controlar, os produtores podem compensar as fraquezas doglifosato por misturação em tanque ou alternando com outros herbicidas quecontrolarão as ervas daninhas não atingidas. Um parceiro de mistura detanque popular é eficaz para controlar plantas no estado silvestre de folhaslargas em muitos casos tem sido ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). 2,4-D tem sido usado agronomicamente e em situações de não -colheita paracontrole de ervas daninhas de folha larga de amplo espectro por mais de 60anos. Foram reportados casos individuais de espécies mais tolerante, mas2,4-D permanece um dos herbicidas mais amplamente usados globalmente.Uma limitação ao uso adicional de 2,4-D é que sua seletividade em colheitasdicotiledônea como soja ou algodão é muito pobre, e portanto 2,4-D não étipicamente usado sobre (e geralmente não próximo a) colheitasdicotiledônea sensíveis. Adicionalmente, o uso de 2,4-D's em colheitas degrama é um tanto limitado pela natureza de lesão da colheita que podeocorrer. 2,4-D em combinação com glifosato tem sido usado paraproporcionar um tratamento de manejo mais robusto antes do plantio de sojae algodão não cultivado; no entanto, devido à sensibilidade destas espéciesdicotiledôneas a 2,4-D, estes tratamentos de manejo devem ocorrer nomínimo 14 a 30 dias antes do plantio (Agriliance, 2005).

2,4-D é da classe de herbicidas de fenóxi ácido, como é MCPA.2,4-D tem sido usado em muitas colheitas de monocotiledôneas (tais comomilho, trigo, e arroz) para o controle seletivo de ervas daninhas de folhaslargas sem prejudiciar severamente as plantas da colheita desejada. 2,4-D éum derivado de auxina sintético que age desregulando a homeostasecelular-hormonal normal e impede o crescimento controlado equilibrado; noentanto, ainda não é conhecido o modo de ação exato. Triclopir e fluroxipirsão herbicidas de ácido piridiloxiacético cujo modo de ação também é comouma auxina sintética.

Estes herbicidas têm diferentes níveis de seletividade sobrecertas plantas (por exemplo, dicotiledôneas são mais sensíveis do quegramíneas). Metabolismo diferencial por diferentes plantas é uma explicaçãopara níveis de seletividade variáveis. Em geral, as plantas metabolizam 2,4-D lentamente, de modo que a reação variável das plantas a 2,4-D pode sermais provavelmente explicada por atividade diferente no um ou mais sítiosalvo (WSSA, 2002). O metabolismo vegetal de 2,4-D tipicamente ocorreatravés de um mecanismo de duas fases, tipicamente hidroxilação seguidapor conjugação com aminoácidos ou glucose (WSSA, 2002).

Com o tempo, as populações microbianas desenvolveram umcaminho alternativo e eficiente para degradação deste xenobiótico emparticular, o qual resulta na completa mineralização de 2,4-D. Sucessivasaplicações do herbicida selecionam para micróbios que podem utilizar oherbicida como uma fonte de carbono para crescimento, dando aos mesmosuma vantagem competitiva no solo. Por esta razão, 2,4-D formuladaatualmente tem uma meia-vida no solo relativamente curta, e não sãoencontrados efeitos de transporte significativos para colheitas subseqüentes.

Isto se adiciona à utilidade herbicida de 2,4-D.

Um organismo que que tem sido extensivamente estudado porsua capacidade para degradar 2,4-D é Ralstonia eutropha (Streber et ai,1987). O gene que codifica para a primeira etapa enzimática no caminho demineralização é tfdA. Vide a Patente U. S. Nº 6.153.401 e GENBANK Acc.Nº M16730. TfdA catalisa a conversão do ácido 2,4-D em diclorofenol (DCP)através de uma reação de dioxigenase □-cetoglutarato-dependente (Smejkalet al., 2001). DCP tem pouca atividade herbicida comparado com 2,4-D.TfdA tem sido usado em plantas transgênicas para conferir resistência a 2,4-D em plantas dicotiledônea (por exemplo, algodão e tabaco) normalmentesensíveis a 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993), ePatente U. S. N2 5.608.147).

Um grande número de genes do tipo tfdA que codificamproteínas capazes de degradar 2,4-D foi identificado a partir do ambiente edepositado no banco de dados Genbank. Muitos homólogos são similares atfdA (>85% de identidade de aminoácidos) e têm propriedades enzimáticassimilares a tfdA. No entanto, há uma série de homólogos que têm umaidentidade significativamente menor com tfdA (25 a 50%), e têm os resíduoscaracterísticos associados com α-cetoglutarato dioxigenase Fe+2dioxigenases. Portanto não é óbvio quais são as especificidades desubstrato destas dioxigenases divergentes.

Um único exemplo com baixa homologia com tfdA (31% deidentidade de aminoácidos) é sdpA de Delftia acidovorans (Kohler et al.,1999, Westendorf et al., 2002, Westendorf et al., 2003). Foi demonstradoque esta enzima catalisa a primeira etapa na mineralização de (S)-diclorprop(e outros (S)-fenoxipropiônicos ácidos) bem como 2,4-D (um ácidofenoxiacético) (Westendorf et al., 2003). Até o momento a transformaçãodeste gene em plantas não foi reportada.

O desenvolvimento de novas tecnologias de colheitas tolerantesa herbicidas (HTC) tem tido sucesso limitado devido largamente à eficácia,ao baixo custo, e à conveniência das GTCs. Conseqüentemente, ocorreu umíndice muito elevado de adoção para GTCs entre os produtores. Isto crioupequeno incentivo para o desenvolvimento de novas tecnologias de HTC.

Subestruturas químicas de ariloxialcanoato são uma entidadecomum de muitos herbicidas comercializados incluindo as fenoxiacetatoauxinas (tais como 2,4-D e diclorprop), piridiloxiacetato auxinas (tais comofluroxipir e triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP) acetil-coenzima Acarboxilase (ACCase) inibidores (tais como haloxifop, quizalofop, e diclofop),e fenoxiacetato protoporfirinogênio oxidase IX inibidores 5-substituídos (taiscomo piraflufen e flumiclorac). No entanto, estas classes de herbicidas sãotodas bastante distintas, e não existe evidência na literatura corrente decaminhos de degradação comuns entre estas classes químicas. Umaenzima multifuncional para a degradação de herbicidas cubrindo múltiplosmodos de ação foi descrita recentemente (PCT US/2005/014737; depositadoem 2 de maior de 2005). Outra enzima multifuncional única e usos potenciaissão descritos nas partes que se seguem.

Breve Sumário da Invenção

A invenção em questão proporciona novas plantas que são nãosomente resistentes a 2,4-D, mas também a herbicidas de piridiloxiacetato.Até o momento, não houve expectativa ou sugestão de que uma planta comambas estas vantajosas propriedades pode ser produzida pela introdução deum único gene. A invenção em questão também inclui plantas que produzemuma ou mais enzimas da invenção em questão "empilhado" junto com um oumais diferentes genes de resistência a herbicida, incluindo, mas não limitadoa, genes de resistência a glifosato, a ALS (imidazolinona, sulfoniluréia), aariloxialcanoato, a HPPD, a PPO1 e a glufosinato, de modo a proporcionarplantas tolerantes a herbicida compatíveis com opções de tratamento deresistência a herbicida e controle de ervas daninhas mais amplos e maisrobustos. A presente invenção inclui adicionalmente métodos e composiçõesutilizando homólogos dos genes e proteínas exemplificados aqui, nesterequerimento de patente.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona plantasmonocotiledôneas e dicotiledôneas tolerantes a 2,4-D, MCPA, triclopir,fluroxipir, e um ou mais herbicidas disponíveis comercialmente (por exemplo,glifosato, glufosinato, paraquat, ALS-inibidores (por exemplo, sulfoniluréias,imidazolinonas, triazolopirimidina sulfonanilidas, et al), HPPD inibidores (porexemplo, mesotrione, isoxaflutol, et al.), dicamba, bromoxinil,ariloxifenoxipropionatos, e outros). Vetores compreendendo seqüências deácido nucléico responsáveis por semelhante tolerância a herbicida tambémsão revelados, assim como métodos para usar semelhantes plantastolerantes e combinações de herbicidas para controle de ervas daninhas eprevenção de mudanças de populações de ervas daninhas. A invenção emquestão permite novas combinações de herbicidas a serem usados emnovos modos. Além disso, a invenção em questão proporciona novosmétodos para evitar o desenvolvimento de, e controlar, cepas de ervasdaninhas que são resistentes a um ou mais herbicidas tais como glifosato. Ainvenção em questão permite novos usos de novas combinações deherbicidas e colheitas, incluindo aplicação pré-planta a uma área a serplantada imediatamente antes do plantio com semente para plantas que demodo diverso seriam sensíveis a este herbicida (tal como 2,4-D).

A invenção em questão refere-se em parte à identificação deuma enzima que é não somente capaz de degradar 2,4-D, mas tambémsurpreendentemente possui novas propriedades, as quais distinguem aenzima da invenção em questão de proteínas tfdA previamente conhecidas,por exemplo. Mais especificamente, a invenção em questão refere-se ao usode uma enzima que é capaz de degradar tanto herbicidas de 2,4-D quantode piridiloxiacetato. Não foi reportado previamente que a enzima dioxigenase□-cetoglutarato-dependente tem a capacidade de degradar herbicidas deambos os herbicidas de auxina de fenoxiacetato e piridiloxiacetatos. Aenzima e gene preferenciais para uso de acordo com a invenção em questãosão referidos aqui, neste requerimento de patente, como AAD-12(AriloxiAIcanoato Dioxigenase). Esta descoberta altamente nova é a base deoportunidades de marcador selecionável e traço de colheita tolerante aherbicida (HTC) significativas. As plantas da invenção em questão podemser resistentes do início ao fim de todo o seu ciclo de vida.

Não houve motivação anterior para produzir plantascompreendendo um gene AAD-12 (preferencialmente um polinucleotídeoAAD-12 que tem uma seqüência otimizada para expressão em um ou maistipos de plantas, conforme exemplificado aqui, neste requerimento depatente), e não houve expectativa de que semelhantes plantas pudessemproduzir de modo eficaz uma enzima AAD-12 para tornar as plantasresistentes um herbicida de ácido fenoxiacético (tal como 2,4-D) e/ou um oumais herbicidas de piridiloxiacetatos tais como triclopir e fluroxipir. Portanto,a invenção em questão proporciona muitas vantagens que não foramconsideradas possíveis na técnica até o momento.

Esta invenção também refere-se em parte à identificação e usode genes codificando enzimas ariloxialcanoato dioxigenase que têm acapacidade de degradar herbicidas de fenoxiacetato auxina e/oupiridiloxiacetatos auxina. Os métodos de triagem de proteínas para estasatividades estão dentro do âmbito da invenção em questão. Portanto, ainvenção em questão inclui degradação de ácido 2,4-diclorofenoxiacético eoutros herbicidas de ariloxialcanoato auxina por uma enzima AAD-12expressada de modo recombinante. A invenção em questão também incluimétodos para controlar ervas daninhas em que os referidos métodoscompreendem aplicar um ou mais herbicidas de piridiloxiacetato oufenoxiacetato auxina em plantas compreendendo um gene AAD-12. Ainvenção em questão também proporciona métodos para usar um geneAAD-12 como um marcador selecionável para identificar células vegetais eplantas inteiras transformadas com AAD-12, incluindo opcionalmente um,dois, ou mais genes exógenos inseridos simultaneamente em célulasvegetais alvo. Os métodos da invenção em questão incluem selecionarcélulas transformadas que são resistentes a níveis apropriados de umherbicida. A invenção em questão inclui adicionalmente métodos parapreparar um polipeptídeo, tendo a atividade biológica de ariloxialcanoatodioxigenase, cultivando plantas e/ou células da invenção em questão.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 ilustra a reação química geral que é catalisada porenzimas AAD-12 da invenção da questão.

A Figura 2 é um alinhamento de seqüência de aminoácidos deuma proteína AAD-12 exemplificada, TfdA, AAD-2, AAD-1, e TauD.

A Figura 3 ilustra a atividade de AAD-12 (v2) sobre 2,4-D eenantiômeros de diclorprop.

Breve Descrição das Seqüências

SEQ ID N9: 1 é a seqüência de nucleotídeo de AAD-12 de Delftiaacidovorans.

SEQ ID N9: 2 é a seqüência de proteína traduzida codificada porSEQ ID N9: 1.

SEQ ID Ns: 3 é a seqüência de nucleotídeo otimizada vegetal deAAD-12 (v1).

SEQ ID N°: 4 é a seqüência de proteína traduzida codificada porSEQ ID N°: 3.SEQ ID N°: 5 é a seqüência de nucleotídeo otimizada de E.colide AAD-12 (v2).SEQ ID N°: 6 é a seqüência do iniciador dianteiro M13.SEQ ID N°: 7 é a seqüência do iniciador reverso M13.SEQ ID N°: 8 é a seqüência do iniciador AAD-12 (v1) PTUdianteiro.SEQ ID N°: 9 é a seqüência do iniciador AAD-12 (v1) PTUreverso.SEQ ID N°: 10 é a seqüência do iniciador de PCR codificandoAAD-12 (v1) dianteiro.SEQ ID N°: 11 é a seqüência do iniciador de PCR codificandoAAD-12 (v1) reverso.SEQ ID N°: 12 mostra a seqüência do iniciador "sdpacodF" AAD-12 (v1).SEQ ID N°: 13 mostra a seqüência do iniciador "sdpacodR" AAD-12 (v1).SEQ ID N°: 14 mostra a seqüência do iniciador "Nco1 of Brady".SEQ ID N9: 15 mostra a seqüência do iniciador "Saci of Brady".Descrição Detalhada da Invenção

O desenvolvimento de um gene de resistência a 2,4-D emquestão e colheitas resistentes subseqüentes proporciona excelentesopções para controlar espécies de ervas daninhas resistentes a glifosato, defolhas largas (ou altamente tolerantes e mudadas) para aplicações in-colheita. 2,4-D é um herbicida de folhas largas de amplo espectro,relativamente econômico, e robusto que proporcionaria excelente utilidadepara os produtores se puder ser proporcionada maior tolerância à colheitaem colheitas dicotiledônea e monocotiledônea similares. Colheitasdicotiledônea transgênicas tolerantes a 2,4-D também teriam maiorflexibilidade no momento e índice de aplicação. Uma utilidade adicional dotraço de tolerância a herbicida em questão para 2,4-D é sua utilidade paraprevenir dano a colheitas normalmente sensíveis contra deslocamento de2,4-D, volatilização, inversão (ou outro fenômeno de movimento off-site),mau uso, vandalismo, e semelhantes. Um benefício adicional do gene AAD-12 é que diferentemente de todos os homólogos tfdA caracterizados até omomento, AAD-12 tem capacidade de degradar as piridiloxiacetatos auxinas(por exemplo, triclopir, fluroxipir) além de fenóxi auxinas aquirais (porexemplo, 2,4-D, MCPA, ácido 4-clorofenoxiacético). Vide a Tabela 1. Umailustração geral das reações químicas catalisadas pela enzima AAD-12 emquestão é mostrada na Figura 1. (A adição de O2 é estereospecífica;decomposição de intermediário para fenol e glioxilato é espontâneo). Deveser entendido que as estruturas químicas na Figura 1 ilustram as espinhasdorsais moleculares e que vários grupos R e semelhantes (tais como osmostrados na Tabela 1) são incluídas, mas não são necessária eespecificamente ilustradas na Figura 1. Múltiplas misturas de diferentescombinações de fenóxi auxina têm sido usadas globalmente para tratarespectros de ervas daninhas e condições ambientais específicos em váriasregiões. O uso do gene AAD-12 em plantas proporciona proteção para umespectro muito mais amplo de herbicidas de auxina, deste modoaumentando a flexibilidade e os espectros de ervas daninhas que podem sercontroladas. A invenção em questão também pode ser usada para protegercontra deslocamento ou outra lesão de herbicida de auxina sintética off-sitepara a plena tolerância de fenóxi auxinas disponíveis comercialmente. ATabela 1 define piridilóxi e fenóxi auxinas disponíveis comercialmente eproporciona estruturas químicas relevantes.<table>table see original document page 12</column></row><table><table>table see original document page 13</column></row><table>

Um único gene (AAD-12) foi agora identificado o qual, quandoproduzido por engenharia genética para expressão em plantas, tem aspropriedades de possibilitar o uso de herbicidas de fenóxi auxina em plantasonde nunca existiu tolerância inerente ou não foi suficientemente elevadapara possibilitar o uso destes herbicidas. Adicionalmente, AAD-12 podeproporcionar proteção in planta a herbicidas de piridiioxiacetato ondetolerância natural também não foi suficiente para permitir seletividade,expandindo a utilidade potencial destes herbicidas. Plantas contendo AAD-12 somente aogra podem ser tratadas seqüencialmente ou misturadas emtanque com um, dois, ou uma combinação de vários herbicidas de fenóxiauxina. O índice para cada herbicida de fenóxi auxina pode variar de 25 a4000 g ae/ha, e mais tipicamente de 100 a 2000 g ae/ha para o controle deum amplo espectro de ervas daninhas dicotiledôneas. Do mesmo modo, um,dois, ou uma mistura de vários compostos de piridiioxiacetato auxina podemser aplicados a plantas expressando AAD-12 com reduzido risco de danopelos referidos herbicidas. O índice para cada herbicida de piridiioxiacetatopode variar de 25 a 2000 g ae/ha, e mais tipicamente de 35 a 840 g ae/hapara o controle de ervas daninhas dicotiledônea adicionais.O glifosato é usado extensivamente porque controla um espectromuito amplo de espécies de ervas daninhas de folhas largas e degramíneas. No entanto, o uso repeatido de glifosato em GTCs e emaplicações não-colheita tem selecionado, e continuará a selecionar,mudanças de ervas daninhas para espécies naturalmente mais tolerantes oubiotipos resistentes ao glifosato. Parceiros herbicidas de mistura de tanqueusados em índices eficazes que oferecem controle das mesmas espécies,mas tendo diferentes modos de ação são prescritos pela maioria dasestratégias de tratamento de resistência a herbicida como um método pararetardar o aparecimento de ervas daninhas resistentes. Empilhamento AAD-12 com um traço de tolerância a glifosato (e/ou com traços de tolerância aoutros herbicida) pode proporcionar um mecanismo para permitir o controlede espécies de ervas daninhas dicotiledôneas resistentes a glifosato emGTCs por possibilitar o uso de herbicidas de glifosato, fenóxi auxina(s) (porexemplo, 2,4-D)—e piridiloxiacetatos auxina (por exemplo, triclopir)seletivamente na mesma colheita. As aplicações destes herbicidas podemser simultaneamente em uma mistura de tanque compreendendo dois oumais herbicidas de diferentes modos de ação; aplicações individuais decomposição de herbicida único em aplicações seqüenciais como pré-planta,pré-emergência, ou pós-emergência e determinado tempo dividido deaplicações variando a partir de aproximadamente 2 horas atéaproximadamente 3 meses; ou, alternativamente, qualquer combinação dequalquer número de herbicidas representando cada classe química pode seraplicada em qualquer momento dentro de cerca de 7 meses do plantio dacolheita até a ceifa da colheita (ou o intervalo pré-ceifa para o herbicidaindividual, o que for mais curto).

É importante ter flexibilidade no controle de um amplo espectrode ervas daninhas de gramíneas e de folhas largas em termos de momentode aplicação, índice de herbicidas individuais, e da capacidade de controlarervas daninhas difíceis ou resistentes. As aplicações de glifosato em umacolheita com um empilhamento de gene de resistência a glifosato/AAD-12podem variar a partir de cerca de 250 a 2500 g ae/ha; um ou mais herbicidasde fenóxi auxina (um ou mais) podem ser aplicados a partir de cerca de 25 a4000 g ae/ha; e um ou mais herbicidas de piridiloxiacetatos auxina (um oumais) podem ser aplicados a partir de 25 a 2000 g ae/ha. A uma ou maiscombinações ótimas e momento destas uma ou mais aplicações dependerãoda situação em particular, da espécie, e do ambiente, e serão melhordeterminadas por uma pessoa versada na técnica de controle de ervasdaninhas e tendo o benefício da descoberta em questão.

Plântulas são tipicamente resistentes do início ao fim de todo ociclo de crescimento. Plantas transformadas tipicamente serão resistentes aaplicação de novos herbicidas em qualquer momento que o gene sejaexpressado. Tolerância é mostrada aqui, neste requerimento de patente,para 2,4-D durante o ciclo de vida usando os promotores constitutivostestados até o momento (essencialmente CsVMV e AtUbi 10). Tipicamentese esperaria isto, mas é um aprimoramento em relação a outras atividadesnão metabólicas onde a tolerância pode ser significativamente afetada pelaredução da expressão de um mecanismo de resistência de um sítio de ação,por exemplo. Um exemplo é algodão Roundup Ready, onde as plantasforam tolerantes caso pulverizadas precocemente, mas caso pulverizadastarde demais o glifosato concentrou nos meristemas (porque não pemetabolizado e é translocado); os promotores virais Monsanto usados nãosão bem expressados nas flores. A invenção em questão proporciona umaprimoramento a estes respeitos.

Formulações de herbicida (por exemplo, formulação de éster,ácido, ou sal; ou concentrado solúvel, concentrado emulsificável, ou líquidosolúvel) e aditivos de mistura de tanque (por exemplo, adjuvantes,tensoativos, retardantes de deslocamento, ou agentes de compatibilidade)podem afetar significativamente o controle de ervas daninhas contra umdado herbicida ou combinação de um ou mais herbicidas. Qualquercombinação destes com quaisquer das químicas de herbicidas mencionadosacima está dentro do âmbito desta invenção.

Uma pessoa versada na técnica também veria o benefício decombinar dois ou mais modos de ação para aumentar o espectro de ervasdaninhas controladas e/ou para o controle de espécies de ervas daninhasnaturalmente mais tolerante ou resistentes. Isto também pode ser estender aquímicas para as quais foi possibilitada tolerância a herbicida em colheitasatravés de envolvimento humano (quer transgenicamente ou não transgenicamente) além de GTCs. Na verdade, traços codificando resistênciaa glifosato (por exemplo, EPSPS vegetais ou bacterianos resistentes, glifosatooxidorredutase (GOX), GAT), resistência a glufosinato (por exemplo, Pat, όεή,resistência a herbicida inibidor de acetolactato sintase (ALS) (por exemplo,imidazolinona, sulfoniluréia, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, e outras químicas = AHAS, Csr1, SurA, et ai),resistência à bromoxinila (por exemplo, Bxn), resistência a inibidores deenzima HPPD (4-hidroxilfenil-piruvato-dioxigenase), resistência a inibidores defitoeno dessaturãse (PDS), resistência a herbicidas inibidores do fotossistemaII (por exemplo, psbA), resistência a herbicidas inibidores do fotossistema I, resistência a herbicidas inibidores de protoporfirinogênio oxidase IX (PPO)(por exemplo, PPO-1), resistência a herbicidas de feniluréia (por exemplo,CYP76B1), enzimas degradantes de dicamba (vide, por exemplo, a patente U.S. Nº 2003/0135879), e outros podem ser empilhado sozinhos ou emmúltiplas combinações para proporcionar a capacidade de controlar ou prevenir de modo eficaz mudanças de ervas daninhas e/ou resistência aqualquer herbicida das classes mencionadas acima. EPSPS modificada invivo pode ser usada em algumas modalidades preferenciais, bem como genesde resistência a glifosato Classe I, Classe II, e Classe III.

Com referência a herbicidas adicionais, alguns inibidores de ALS preferenciais adicionais incluem mas não estão limitados às sulfoniluréias(tais como clorsulfuron, halossulfuron, nicossulfuron, sulfometuron,sulfossulfuron, trifloxissulfuron), imidazoloninonas (tais como imazamox,imazetapir, imazaquin), triazolopirimidina sulfonanilidas (tais comocloransulam-metil, diclossulam, florassulam, flumetsulam, metossulam, e penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (tais como bispiribac e piritiobac), eflucarbazone. Alguns inibidores de HPPD preferenciais incluem, mas nãoestão limitados a mesotrione, isoxaflutol, e sulcotrione. Alguns inibidores dePPO preferenciais incluem mas não estão limitados a flumiclorac,flumioxazin, flufenpir, piraflufen, flutiacet, butafenacil, carfentrazone,sulfentrazone, e os éteres difenílicos (tais como acifluorfen, fomesafen,lactofen, e oxifluorfen).

Adicionalmente, AAD-12 sozinho ou empilhado com um ou maistraços HTC adicionais pode ser empilhado com um ou mais traços deentrada (por exemplo, resistência a inseto, resistência a fungos, outolerância a estresse, et al.) ou saída (por exemplo, aumento da produção,perfil de óleo aprimorado, qualidade de fibra aprimorada, et al.) adicionais.Portanto, a invenção em questão pode ser usada para proporcionar umpacote agronômico completo de qualidade de colheita aprimorada com acapacidade de controlar de modo flexível e de custo eficaz qualquer númerode pragas agronômicas.

A invenção em questão refere-se em parte à identificação deuma enzima que não somente tem capacidade de degradar 2,4-D, mastambém surpreendentemente possui novas propriedades, as quaisdistinguem a enzima da invenção em questão de proteínas tfdA previamenteconhecidas, por exemplo. Muito embora esta enzima tenha homologia muitobaixa com tfdA, os genes da invenção em questão ainda podem serclassificados de modo geral na mesma família global de dioxigenases a-cetoglutarato-dependentes. Esta família de proteínas é caracterizada portrês resíduos histidina conservados em um motivo "HX(D/E)X23-26(T/S)Xn4-183HX10-13R" o qual compreende o sítio ativo. As histidinas coordenam íon deFe+2 no sítio ativo que é essencial para atividade catalítica (Hogan et ai,2000). Os experimentos de expressão in vitro preliminares discutidos aqui,neste requerimento de patente, foram adequados para ajudar a selecionarnovos atributos. Estes experimentos também indicam que a enzima AAD-12é única entre outra enzima distinta da mesma classe, revelada em umrequerimento de patente previamente depositado (PCT US/2005/014737;depositado em 2 de maio de 2005). A enzima AAD-1 desta aplicaçãocompartilha somente cerca de 25% de identidade de seqüência com aproteína AAD-12 em questão.Mais especificamente, a invenção em questão refere-se emparte ao uso de uma enzima que não somente tem capacidade de degradar2,4-D, mas também herbicidas de piridiloxiacetato. Não foi reportadopreviamente que enzima dioxigenase D-cetoglutarato-tenha a capacidade dedegradar herbicidas de diferentes classes químicas e modos de ação.Enzimas e genes preferenciais para uso de acordo com a invenção emquestão são referidas aqui, neste requerimento de patente, como proteínas egenes AAD-12 (AriloxiAIcanoato Dioxigenase).

Esta invenção também refere-se em parte à identificação e usode genes codificando enzimas ariloxialcanoato dioxigenase que têm acapacidade de degradar herbicidas de fenóxi auxina e piridiloxiacetato.Portanto, a invenção em questão refere-se em parte à degradação de ácido2,4-diclorofenoxiacético, outros ácidos fenoxiacéticos, e herbicidas de ácidopiridiloxiacético por uma enzima AAD-12 expressada de modo recombinante.

As proteínas em questão testaram positivas para conversão de2,4-D para 2,4-diclorofenol ("DCP"; herbicidamente inativo) em testesanalíticos. Proteínas da invenção em questão parcialmente purificadas podemrapidamente converter 2,4-D em DCP in vitro. Uma vantagem adicional queplantas transformadas AAD-12 proporcionam é que um ou mais herbicidasmatrizes são metabolizados para formas inativas, reduzindo deste modo opotencial para colher resíduos herbicidas em grão ou palha de trigo.

A invenção em questão também inclui métodos para controlarervas daninhas em que os referidos métodos compreendem aplicar umpiridiloxiacetato e/ou um herbicida de fenóxi auxina em plantascompreendendo um gene AAD-12.

À luz destas descobertas, são agora proporcionadas novasplantas que compreendem um polinucleotídeo codificando este tipo deenzima. Até o momento, não houve motivação para produzir semelhantesplantas, e não houve expectativa de que semelhantes plantas possamproduzir de modo eficaz esta enzima para tornar as plantas resistentes nãosomente a herbicidas de fenóxi ácido (tais como 2,4-D), mas também aherbicidas de piridiloxiacetato. Portanto, a invenção em questão proporcionamuitas vantagens que não foram até o momento consideradas possíveis natécnica.

Cepas disponíveis publicamente (depositadas em coleções deculturas como ATCC ou DSMZ) podem ser adquiriras e tríadas, usandotécnicas reveladas aqui, neste requerimento de patente, para novos genes.Seqüências reveladas aqui, neste requerimento de patente, podem serusadas para amplificar e clonar os genes homólogos em um sistema deexpressão recombinante para triagem e experimentação adicionais deacordo com a invenção em questão.

Conforme discutido acima na seção de Antecedentes, umorganismo que tenha sido extensivamente pesquisado para sua capacidadepara degradar 2,4-D é Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). O gene quecodifica para a primeira enzima no caminho de degradação é tfdA. Vide aPatente U. S. N? 6.153.401 e GENBANK Acc. Ne M16730. TfdA catalisa aconversão de ácido 2,4-D para DCP herbicidamente inativo através de umareação de dioxigenase α-cetoglutarato-dependente (Smejkal et al., 2001).TfdA tem sido usado em plantas transgênicas para conferir resistência a 2,4-D em plantas dicotiledôneas (por exemplo, algodão e tabaco) normalmentesensíveis a 2,4-D (Streber et al., 1989; Lyon et al., 1989; Lyon et al., 1993).Um grande número de genes tipo tfdA que codificam proteínas capazes dedegradar 2,4-D foi identificado do ambiente e depositado no banco de dadosGenbank. Muitos homólogos são bastante similares a tfdA (>85% deidentidade de aminoácidos) e têm propriedades enzimáticas similares a tfdA.No entanto, uma pequena coleção de homólogos de dioxigenase a-cetoglutarato-dependentes são atualmente identificadas que têm um baixonível de homologia com tfdA.

A invenção em questão refere-se em parte a surpreendentesdescobertras de novos usos para e funções de uma enzima distantementerelacionada, sdpA, de Delftia acidivorans (Westendorf et al., 2002, 2003)com baixa homologia com tfdA (31% de identidade de aminoácidos). Foidemonstrado previamente que esta enzima dioxigenase a-cetoglutarato-dependente purificada em sua forma nativa degrada 2,4-D e S-diclorprop(Westendorf et al., 2002 and 2003). No entanto, não foi reportadopreviamente que enzima dioxigenase α-cetoglutarato-dependente tem acapacidade de degradar herbícidas da classe química piridiloxiacetato. SdpAnunca foi expressada em plantas, nem houve qualquer motivação para fazerisso em parte devido ao desenvolvimento de novas tecnologias de HTC tersido limitado devido largamente à eficácia, baixo custo, e conveniência deGTCs (Devine, 2005).

À luz da nova atividade, proteínas e genes da invenção emquestão são referidos aqui, neste requerimento de patente, como proteínas egenes AAD-12. Foi presentemente confirmado que AAD-12 degrada umavariedade de herbícidas de fenoxiacetato auxina in vitro. No entanto, foi vistosurpreendentemente que esta enzima, conforme reportado pela primeira vezaqui, neste requerimento de patente, também tem a capacidade de degradarsubstratos adicionais da classe de moléculas de ariloxialcanoato. Substratosde importância agronômica significativa incluem os herbícidas depiridiloxiacetato auxina. Esta descoberta altamente nova é a base deColheita Tolerante a Herbicida (HTC) significativa e oportunidades de traçode marcador selecionável. Esta enzima é única em sua capacidade deliberar atividade degradativa de herbicida para uma série de herbícidas defolhas largas de amplo espectro (fenoxiacetato e piridiloxiacetato auxinas).

Portanto, a invenção em questão refere-se em parte àdegradação de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, outros herbícidas de auxinafenoxiacética, e herbícidas de piridiloxiacetato por uma enzimaariloxialcanoato dioxigenase expressada de modo recombinante (AAD-12).Esta invenção também refere-se em parte à identificação e usos de genescodificando uma enzima de degradação de ariloxialcanoato dioxigenase(AAD-12) capazes de degradar herbícidas de fenóxi e/ou piridilóxi auxina.

A enzima em questão possibilita expressão transgênicaresultando em tolerância a combinações de herbícidas que controlariamquase todas as ervas daninhas de folhas largas. AAD-12 pode servir como umtraço de colheita tolerante a herbicida excelente (HTC) para empilhamentocom outros traços de HTC [por exemplo, resistência a glifosato, resistência aglufosinato, resistência a ALS-inibidor (por exemplo, imidazolinona,sulfoniluréia, triàzolopirimidina sulfonanilida), resistência à bromoxinila,resistência a inibidor de HPPD, resistência a inibidor de PPO, et al.], e traçosde resistência a inseto (CryIFl CryIAb, Cry 34/45, outras Proteínas Bt., ouproteínas inseticidas de uma origem não-Bacillis, et al.) por exemplo.Adicionalmente, AAD-12 pode servir como um marcador selecionável paraauxiliar na seleção de transformantes primários de plantas produzidas porengenharia genética com um segundo gene ou grupo de genes.

Além disso, o gene microbiano em questão tem sidoredesenhado de tal modo que a proteína é codificada por códons tendo umatendência para tanto uso ém planta monocotiledônea quanto dicotiledônea(hemicot). Arabidopsis, milho, tabaco, algodão, soja, canola, e arroz foramtransformados com constructos contendo AAD-12 e demonstraram altosníveis de resistência tanto aos herbicidas de fenóxi quanto de piridilóxiauxina. Portanto, a invenção em questão também refere-se a genes"otimizados para planta" que codificam proteínas da invenção em questão.

Grupos oxialcanoato são úteis para introduzir umafuncionalidade ácida estável em herbicidas. O grupo acidífero pode conferirmobilidade do floema por "captura de ácido", um atributo desejável paraação herbicida e portanto pode ser incorporado em novos herbicidas parafins de mobilidade. Aspectos da invenção em questão também proporcionamum mecanismo para criar HTCs. Existem muitos herbicidas comerciais eexperimentais potenciais que podem servir como substratos para AAD-12.Deste modo, o uso dos genes em questão também pode resultar emtolerância a herbicida aos outros herbicidas também.

Traços de HTC da invenção em questão podem ser usados emnovas combinações com outros traços de HTC (incluindo, mas não limitadosa tolerância a glifosato). Estas combinações de traços dão origem a novosmétodos para controlar espécies de ervas daninhas (e semelhantes), devidoà resistência recém-adquirida ou à tolerância inerente a herbicidas (porexemplo, glifosato). Portanto, além dos traços de HTC, novos métodos paracontrolar ervas daninhas usando herbicidas, para os quais foi criadatolerância a herbicida pela enzima referida em colheitas transgênicas, estãodentro do âmbito da invenção.

Esta invenção pode ser aplicada no contexto decommercialização de um traço de resistência a 2,4-D empilhado com traçosde resistência a glifosato corrente em soja, por exemplo. Portanto, estainvenção proporciona uma ferramenta para combater mudanças de espéciesde ervas daninhas de folhas largas e/ou seleção de ervas daninhas de folhaslargas resistentes a herbicida, a qual culmina da confiança extremamenteelevada da parte dos produtores em glifosato para controle de ervasdaninhas em várias colheitas.

A expressão transgênica dos genes AAD-12 em questão éexemplificada em, por exemplo, Arabidopsis, tabaco, soja, algodão, arroz,milho e canola. Soja são uma colheita preferencial para transformação deacordo com a invenção em questão. No entanto, esta invenção pode serutilizada em múltiplas colheitas monocotiledôneas (tais como gramíneas depastagem ou gramínea de turfa) e dicotiledôneas diferentes como Alfafa,trevo, espécies de árvores, et al. Igualmente, 2,4-D (ou outros substratos deAAD-12) pode ser mais positivamente utilizado em colheitas de gramíneasonde a tolerância é moderada, e aumento da tolerância através deste traçoproveria aos produtores a oportunidade de usar estes herbicidas em índicesmais eficazes e durante um determinado tempo de aplicação mais amplosem o risco de dano da colheita.

Ainda adicionalmente, a invenção em questão proporciona umúnico gene que pode proporcionar resistência a herbicidas que controlamerva daninha de folhas largas. Este gene pode ser utilizado em múltiplascolheitas para possibilitar o uso de uma combinação herbicida de amploespectro. A invenção em questão também pode controlar ervas daninhasresistentes aos produtos químicos correntes, e auxiliar no controle demudança de espectros de ervas daninhas resultantes das práticasagronômicas correntes. O AAD-12 em questão também pode ser usados emesforços para detoxificar de modo eficaz substratos herbicidas adicionaispara formas não herbicidas. Portanto, a invenção em questão proporciona odesenvolvimento de tecnologia de traços de HTC adicionais e/ou demarcadores selecionáveis.

Separado do, ou adicionalmente ao, uso dos genes em questãopara produzir HTCs, os genes em questão também podem ser usados comomarcadores selecionáveis para selecionar com sucesso transformantes emculturas celulares, estufas, e no campo. Há alto valor inerente para os genesem questão simplesmente como um marcador selecionável para projetos debiotecnologia. A promiscuidade de AAD-12 para outros herbicidas auxínicosde ariloxialcanoato proporciona muitas oportunidades para utilizar este genepara fins de HTC e/ou de marcadores selecionáveis.

Proteínas (e isolados de origem) da invenção em questão. Apresente invenção proporciona proteínas funcionais. Por "atividadefuncional" (ou "ativa") se indica aqui, neste requerimento de patente, que asproteínas/enzimas para uso de acordo com a invenção em questão têm acapacidade de degradar ou diminuir a atividade de um herbicida (sozinho ouem combinação com outras proteínas). Plantas produzindo proteínas dainvenção em questão preferencialmente produzirão "uma quantidade eficaz"da proteína de modo que, quando a planta é tratada com um herbicida, onível de expressão de proteína é suficiente para tornar a plantacompletamente ou parcialmente resistente ou tolerante ao herbicida (em umíndice típico, a menos que especificado de modo diverso; índices deaplicação típicos podem ser encontrados no Herbicide Handbook (WeedScience Society of America, Eighth Edition, 2002), de conhecimento geral,por exemplo). O herbicida pode ser aplicado em índices que normalmentematarão a planta alvo, em índices e concentrações normais de uso decampo. (Devido à invenção em questão, o nível e/ou concentração pode seropcionalmente maior do que os que foram usados previamente).Preferencialmente, células vegetais e plantas da invenção em questão sãoprotegidas contra inibição de crescimento ou dano causados por tratamentocom herbicida. Plantas e células vegetais transformadas da invenção emquestão são preferencialmente tornadas resistentes ou tolerantes a umherbicida, conforme discutido aqui, neste requerimento de patente,significando que a planta e células vegetais transformadas podem crescer napresença de quantidades eficazes de um ou mais herbicidas conformediscutido aqui, neste requerimento de patente. Proteínas preferenciais dainvenção em questão têm atividade catalítica para metabolizar um ou maiscompostos de ariloxialcanoato.

Uma pessoa não pode discutir facilmente o termo "resistência" enão usar o verbo "tolerar" ou o adjetivo "tolerante". A indústria tem gastovárias horas debatendo Colheitas Tolerantes a Herbicida (HTC) versusColheitas Resistentes a Herbicida (HRC). HTC é um termo preferencial naindústria. No entanto, a definição oficial de resistência da Weed ScienceSociety of America é "a capacidade hereditária de uma planta parasobreviver e se reproduzir depois de exposição a uma dose de herbicidanormalmente letal à planta selvagem. Em uma planta, resistência podeocorrer naturalmente ou ser induzida por técnicas tais como engenhariagenética ou seleção de variantes produzidas por cultura de tecido oumutagênese". Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, amenos que indicado de outro modo, "resistência" a herbicida é hereditária epermite que uma planta cresça e se reproduza na presença de umtratamento típico herbicidamente eficaz por um herbicida para uma dadaplanta, conforme sugerido pela edição corrente do The Herbicide Handbooksegundo o arquivamento da descoberta em questão. Conforme éreconhecido por aqueles versados na técnica, uma planta ainda pode serconsiderada "resistente" muito embora seja evidente algum grau de lesãovegetal a partir da exposição ao herbicida. Conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, o termo "tolerância" é mais amplo do que o termo"resistência," e inclui "resistência" conforme definido aqui, nesterequerimento de patente, bem como uma capacidade aprimorada de umaplanta em particular para suportar os vários graus de lesão herbicidamenteinduzida que resultam tipicamente em plantas selvagens do mesmo genótipona mesma dose herbicida.

A transferência da atividade funcional para sistemas vegetais oubacterianos pode envolver uma seqüência de ácido nucléico, codificando aseqüência de aminoácidos para uma proteína da invenção em questão,integrada em um vetor de expressão de proteína apropriado para ohospedeiro no qual o vetor estará presente. Um modo para obter umaseqüência de ácido nucléico codificando uma proteína com atividadefuncional é isolar o material genético nativo da espécie bacteriana a qualproduz a proteína de interesse, usando informação deduzida da seqüênciade aminoácidos da proteína, conforme revelado aqui, neste requerimento depatente. As seqüências nativas podem ser otimizadas para expressão emplantas, por exemplo, conforme discutido em mais detalhes abaixo. Umpolinucleotídeo otimizado também pode ser designado com base naseqüência de proteína.

A invenção em questão proporciona classes de proteínas tendonovas atividades conforme identificado aqui, neste requerimento de patente.Um modo para caracterizar estas classes de proteínas e os polinucleotídeosque codificam as mesmas é definindo um polinucleotídeo por suacapacidade para hibridizar, sob uma série de condições especificadas, comuma seqüência de nucleotídeos exemplificada (o complemento da mesmae/ou uma sonda ou sondas derivadas de qualquer filamento) e/ou por suacapacidade para ser amplificada por PCR usando iniciadores derivados dasseqüências exemplificadas.

Existe uma série de métodos para obter proteínas para uso deacordo com a invenção em questão. Por exemplo, anticorpos para asproteínas reveladas aqui, neste requerimento de patente, podem ser usadospara identificar e isolar outras proteínas a partir de uma mistura de proteínas.Especificamente, anticorpos podem ser criados para as porções dasproteínas que são mais conservadas ou mais distintas, comparadas comoutras proteínas relacionadas. Estes anticorpos podem ser então usadospara identificar especificamente proteínas equivalentes com a atividadecaracterística por imunoprecipitação, ensaio imunossorvente encadeado aenzima (ELISA), ou imunoblotting. Anticorpos para as proteínas reveladasaqui, neste requerimento de patente, ou para proteínas equivalentes, oupara fragmentos destas proteínas, podem ser prontamente preparadosusando procedimentos de rotina. Os anticorpos referidos são um aspecto dainvenção em questão. Os anticorpos da invenção em questão incluemanticorpos monoclonais e policlonais, preferencialmente produzidos emresposta a uma proteína exemplificada ou sugerida.

Uma pessoa versada na técnica reconheceria prontamente queproteínas (e genes) da invenção em questão podem ser obtidas a partir deuma variedade de fontes. Como se sabe que operons de degradação deherbicida interios são codificados sobre elementos transponíveis tais comoplasmídeos, bem como proteínas da invenção em questão genomicamenteintegradas, podem ser obtidos a partir de uma ampla variedade demicroorganismos, por exemplo, incluindo bactérias recombinantes e/ouselvagens.

Mutantes de isolados bacterianos podem ser preparados porprocedimentos que são de conhecimento geral na técnica. Por exemplo,mutantes asporogenosos podem ser obtidos através de mutagênese poretilmetano sulfonato (EMS) de um isolado. As cepas mutantes tambémpodem ser preparadas usando luz ultravioleta e nitrosoguanidina por meiode procedimentos de conhecimento geral na técnica.

Uma proteína "de" ou "obtenível de" quaisquer dos isolados emquestão referidos ou sugeridos aqui, neste requerimento de patente, significaque a proteína (ou uma proteína similar) pode ser obtida a partir do isoladoou de alguma outra fonte, tal como outra cepa bacteriana ou uma planta."Derivada de" também tem esta conotação, e inclui proteínas obteníveis apartir de um dado tipo de bactéria que são modificadas para expressão emuma planta, por exemplo. Uma pessoa versada na técnica reconheceráprontamennte que, dada a descoberta de um gene e proteína bacterianos,uma planta pode ser planejada para produzir a proteína. Preparações deanticorpos, sondas de ácidos nucléicos (DNA, RNA, ou PNA, por exemplo),e semelhantes podem ser preparadas usando as seqüências depolinucleotídeos e/ou aminoácidos reveladas aqui, neste requerimento depatente, e usadas para triar e recuperar outros genes relacionados de outrasfontes (naturais).Técnicas de biologia molecular de rotina podem ser usadas paraclonar e seqüenciar as proteínas e genes descritos aqui, neste requerimentode patente. Informações adicionais podem ser encontradas em Sambrook etal., 1989, o qual é incorporado aqui, neste requerimento de patente, pormeio de referência.

Polinucleotídeos e sondas. A invenção em questão proporcionaadicionalmente seqüências de ácido nucléico que codificam proteínas parauso de acordo com a invenção em questão. A invenção em questãoproporciona adicionalmente métodos para identificar e caracterizar genesque codificam proteínas tendo a atividade herbicida desejada. EM umamodalidade, a invenção em questão proporciona seqüências de úniconucleotídeo que são úteis como sondas de hibridização e/ou iniciadores paratécnicas de PCR. Os iniciadores produzem fragmentos genéticoscaracterísticos que podem ser usados na identificação, caracterização, e/ouisolamento de genes específicos de interesse. As seqüências de nucleotídeoda invenção em questão codificam proteínas que são distintas das proteínaspreviamente descritas.

Os polinucleotídeos da invenção em questão podem ser usadospara formar "genes" completos para codificar proteínas ou peptídeos emuma célula hospedeira desejada. Por exemplo, conforme o técnico versadoreconhecerá prontamente, os polinucleotídeos em questão podem sercolocados apropriadamente sob o controle de um promotor em umhospedeiro de interesse, conforme é prontamente sabido na técnica. O nívelde expressão genética e expressão temporal/tecidual específica pode afetarmuito a utilidade da invenção. De modo geral, maiores níveis de expressãode proteína de um gene degradativo resultará em degradação mais rápida emais completa de um substrato (neste caso um herbicida alvo). Serádesejado que os promotores expressem o gene alvo em altos níveis amenos que a alta expressão tenha um impacto negativo resultante sobre asaúde da planta. Tipicamente, se esperaria ter o gene AAD-12 expressadoconstitutivamente em todos os tecidos para proteção completa da planta emtodos os estágios de crescimento. No entanto, alternativamente se podeusar um gene de resistência expressado vegetativamente; isto possibilitariao uso do herbicida alvo em colheita para controle de ervas daninhas esubseqüentemente controlaria a reprodução sexual da colheita alvo poraplicação durante o estágio de floração. Além disso, níveis e tempos deexpressão desejados também podem depender do tipo de planta e do nívelde tolerância desejado. Algumas modalidades preferenciais usam fortespromotores constitutivos combinados com reforçadores de transcrição esemelhantes para aumentar os níveis de expressão e para reforçar atolerância para níveis desejados. Algumas aplicações semelhantes sãodiscutidas em mais detalhes abaixo, antes da seção de Exemplos.

Conforme sabe o técnico versado, DNA existe tipicamente emuma forma de filamento duplo. Nesta disposição, um filamento écomplementar aò outro filamento e vice-versa. À medida que o DNA éreplicado em uma planta (por exemplo), são produzidos filamentos de DNAcomplementares adicionais. O "filamento codificante" é freqüentementeusado na técnica para referir ao filamento que liga com o filamento anti-sentido. O RNAm é transcrito a partir do filamento de DNA "anti-sentido". Ofilamento de "sentido" ou "codificante" tem uma série de códons (um códon étrês nucleotídeos que podem ser lidos como uma unidade de três resíduospara especificar um aminoácido em particular) que pode ser lida como umaestrutura de leitura aberta (ORF) para formar uma proteína ou peptídeo deinteresse. De modo a produzir uma proteína in vivo, um filamento de DNA étipicamente transcrito em um filamento complementar de RNAm o qual éusado como o modelo para a proteína. Deste modo, a invenção em questãoinclui o uso dos polinucleotídeos exemplificados mostrados na listagem deseqüência anexada e/ou equivalentes incluindo os filamentoscomplementares. RNA e PNA (ácidos nucléicos de peptídeo) que sãofunctionalmente equivalentes às moléculas de DNA exemplificadas sãoincluídos na invenção em questão.

Em uma modalidade da invenção em questão, isoladosbacterianos podem ser cultivados sob condições resultando em elevadamultiplicação do micróbio. Depois de tratar o micróbio para proporcionarácido nucléico genômico de filamento único, o DNA pode ser contactadocom os iniciadores da invenção e submetido à amplificação por PCR.Fragmentos característicos de genes de interesse serão amplificados peloprocedimento, deste modo identificando a presença do um ou mais genes deinteresse.

Aspectos adicionais da invenção em questão incluem genes eisolados identificados usando os métodos e seqüências de nucleotídeosrevelados aqui, neste requerimento de patente. Os genes identificados destemodo podem codificar as proteínas de resistência a herbicida da invençãoem questão.

Proteínas e genes para uso de acordo com a invenção emquestão podem ser identificados e obtidos usando sondas deoligonucleotídeo, por exemplo. Estas sondas são seqüências denucleotídeos detectáveis que podem ser detectáveis em virtude de umaetiqueta apropriada ou podem ser tornadas inerentemente fluorescentesconforme descrito no Requerimento Internacional Ns WO 93/16094. Assondas (e os polinucleotídeos da invenção em questão) podem ser DNA,RNA, ou PNA. Além de adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T)1 euracil (U; para moléculas de RNA), sondas sintéticas (e polinucleotídeos) dainvenção em questão também podem ter inosina (uma base neutra capaz depareamento com todas as quatro bases; algumas vezes usada ao invés deuma mistura de todas as quatro bases em sondas sintéticas) e/ou outrasbases sintéticas (não naturais). Portanto, onde um oligonucleotídeo sintético,degenerado é referido aqui, neste requerimento de patente, e "N" ou "n" éusado geralmente, "N" ou "n" pode ser G, A, T, C, ou inosina. Códigos deambigüidade conforme usado aqui, neste requerimento de patente, estão deacordo com convenções da nomenclatura IUPAC padrão de acordo com oarquivamento do requerimento em questão (por exemplo, R significa A ou G,Y significa C ou T, e etc.).

Conforme é de conhecimento geral na técnica, se uma moléculade sonda hibridiza com uma amostra de ácido nucléico, pode ser presumidorazoavelmente que a sonda e a amostra têm substancialhomologia/similaridade/identidade. Preferencialmente, a hibridização dopolinucleotídeo é primeiro conduzida seguida por lavagens sob condições deestringência baixa, moderada, ou elevada por técnicas de conhecimentogeral na técnica, conforme descrito, por exemplo, em Keller, G.H., M.M.

Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pp. 169-170. Porexemplo, conforme determinado no mesmo, condições de baixa estringênciapodem ser obtidas primeiro lavando com 2x SSC (Salina CitratoPadrão)/0,1% de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) por 15 minutos emtemperatura ambiente. Tipicamente são realizadas duas lavagens. Maior estringência pode ser então obtida reduzindo a concentração salina e/ouaumentando a temperatura. Por exemplo, a lavagem descrita acima podeser seguida por duas lavagens com 0,1 χ SSC/0,1% de SDS por 15 minutoscada em temperatura ambiente seguidas por lavagens subseqüentes com0,1 χ SSC/0,1% de SDS por 30 minutos cada a 55°C. Estas temperaturas podem ser usadas com outros protocolos de hibridização e lavagemdeterminados aqui, neste requerimento de patente, e conforme seria deconhecimento de uma pessoa versada na técnica (SSPE pode ser usadocomo o sal ao invés de SSC, por exemplo). A 2x SSC/0,1% de SDS podeser preparada adicionando 50 ml de 20x SSC e 5 ml de 10% de SDS para 445 ml de água. 20x SSC pode ser preparado combinando NaCI (175,3g/0,150 M), citrato de sódio (88,2 g/0,015 M), e água, ajustando o pH para7.0 com 10 N de NaOH, em seguida ajustando o volume para 1 litro. 10% deSDS podem ser preparados dissolvendo 10 g de SDS em 50 ml de águaautoclavada, em seguida diluindo para 100 ml.

A detecção da sonda proporciona um meio para determinar emuma maneira conhecida se foi mantida hibridização. Uma análise de sondasemelhante proporciona um método rápido para identificar genes dainvenção em questão. Os segmentos de nucleotídeo usados como sondasde acordo com a invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador de DNA e procedimentos de rotina. Estas seqüências de nucleotídeotambém podem ser usadas como iniciadores de PCR para amplificar genesda invenção em questão.As características de hibridização de uma molécula podem serusadas para definir polinucleotídeos da invenção em questão. Portanto ainvenção em questão inclui polinucleotídeos (e/ou seus complementos,preferencialmente seus complementos plenos) que hibridizam com umpolinucleotídeo exemplificado aqui, neste requerimento de patente. Isto é,um modo para definir um gene (e a proteína que codifica), por exemplo, épor sua capacidade para hibridizar (sob quaisquer das condiçõesespecificamente reveladas aqui, neste requerimento de patente) com umgene conhecido ou especificamente exemplificado.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, condições"estringentes" para hibridização refere-se a condições as quais atingem omesmo, ou em torno do mesmo, grau de especificidade de hibridização queas condições empregadas pelos correntes requerentes. Especificamente, ahibridização de DNA imobilizado sobre Southern blots com sondas gene-específicas marcadas com 32P pode ser realizada por métodos de rotina(vide, por exemplo, Maniatis et al. 1982). Em geral, hibridização e lavagenssubseqüentes podem ser realizadas sob condições que possibilitam adetecção de seqüências alvo. Para sondas genéticas de DNA de filamentoduplo, pode ser realizada hibridização de um dia para o outro em 20 a 25°Cabaixo da temperatura de fusão (Tm) do DNA híbrido em 6x SSPE, 5xsolução de Denhardt, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de DNA desnatuado.A temperatura de fusão é descrita pela seguinte fórmula (Beltz et ai 1983):

Tm = 81,5°Ç+ 16,6 Log[Na+] + 0,41 (% de G+C) - 0,61 (% deformamida) - 600/extensão do dúplex em pares de bases.

As lavagens podem ser realizadas tipicamente como se segue:

(1) Duas vezes em temperatura ambiente por 15 minutosem 1x SSPE, 0,1% de SDS (lavagem de baixa estringência).

(2) Uma vez em Tm-20°C por 15 minutos em 0,2x SSPE,0,1% de SDS (lavagem de moderada estringência).

Para sondas de oligonucleotídeos, pode ser realizadahibridização de um dia para o outro em 10 a 20°C abaixo da temperatura defusão (Tm) do híbrido em 6x SSPE, 5x solução de Denhardt, 0,1% de SDS10,1 mg/ml de DNA desnaturado. A Tm para sondas de oligonucleotídeospode ser determinada pela seguinte fórmula:

Tm (°C) = 2(número de pares de bases T/A) + 4(número de pares de basesG/C) (Suggs et ai, 1981).

As lavagens tipicamente podem ser como se segue:(1) Duas vezes em temperatura ambiente por 15 minutosem 1x SSPE, 0,1% de SDS (lavagem de baixa estringência).

(2) Uma vez na temperatura de hibridização por 15 minutosem 1x SSPE, 0,1% de SDS (lavagem de moderada estringência).

Em geral, sal e/ou temperatura podem ser alterados para mudara estringência. Com um fragmento de DNA marcado aproximadamente >70bases de extensão, podem ser usadas as seguintes condições:Baixa: 1 ou 2x SSPE, temperatura ambienteBaixa: 1 ou 2x SSPE, 42°CModerada: 0,2x ou 1x SSPE, 65°CAlta: 0,1 χ SSPE, 65°C.

A formação de dúplex e a estabilidade dependem decomplementaridade substancial entre os dois filamentos de um híbrido, e,conforme mencionado acima, pode ser tolerado um certo grau decombinação inadequada. Portanto, as seqüências de sondas da invençãoem questão incluem mutações (tanto única quanto múltipla), eliminações,inserções das seqüências descritas, e combinações das mesmas, em que asreferidas mutações, inserções e eliminações permitem formação de híbridosestáveis com o polinucleotídeo alvo de interesse. Mutações, inserções eeliminações podem ser produzidas em uma dada seqüência depolinucleotídeo de muitos modos, e estes métodos são de conhecimento deum técnica ordinariamente versado. Outros métodos podem se tornarconhecidos no futuro.

Tecnologia de PCR. Reação de Cadeia Polimerase (PCR) é umasíntese repetitiva, enzimática, iniciado de uma seqüência de ácido nucléico.Este procedimento é de conhecimento geral e usado comumente poraqueles versados nesta técnica (vide Mullis, Patentes U. S. Nqs 4.683.195,4.683.202, e 4.800.159; Saiki et aí., 1985). PCR se baseia na amplificaçãoenzimática de um fragmento de DNA de interesse que é flanqueado por doisiniciadores de oligonucleotídeo que hibridizam a filamentos opostos daseqüência alvo. Os iniciadores são preferencialmente orientados com asextremidades 3' apontando uma para a outra. Ciclos repetidos dedesnaturação térmica do modelo, recozimento dos iniciadores a suasseqüências complementares, e extensão dos iniciadores recozidos com umaDNA polimerase resultam na amplificação do segmento definido pelasextremidades 5' dos iniciadores de PCR. O produto de extensão de cadainiciador pode servir como um modelo para o outro iniciador, de modo quecada ciclo essencialmente dobra a quantidade de fragmento de DNAproduzido no ciclo prévio. Isto resulta no acúmulo exponencial do fragmentoalvo específico, até vários milhões de vezes em umas poucas horas. Usandouma DNA polimerase termoestável tal como Taq polimerase, isolada dabactéria termofílica Thermus aquaticus, o processo de amplificação pode sercompletamente automatizado. Outras enzimas as quais podem ser usadassão de conhecimento daqueles versados na técnica.

Seqüências de DNA exemplificadas, ou segmentos das mesmas,podem ser usadas como iniciadores para amplificação por PCR. Ao realizaramplificação por PCR, um certo grau de combinação inadequada pode sertolerado entre iniciador e modelo. Portanto, mutações, eliminações, e inserções(especialmente adições de nucleotídeos à extremidade 5') dos iniciadoresexemplificados estão dentro do âmbito da invenção em questão. Mutações,inserções, e eliminações podem ser produzidas em um dado iniciador pormétodos de conhecimento de versado na técnica.

Modificação de genes e proteínas. Os genes e proteínas emquestão podem ser fundidos a outros genes e proteínas para produzirproteínas quiméricas ou de fusão. Os genes e proteínas úteis de acordo coma invenção em questão incluem não somente as seqüências de extensãototal especificamente exemplificadas, mas também porções, segmentos e/oufragmentos (incluindo fragmentos contíguos e eliminações internas e/outerminais comparadas com as moléculas de extensão total) destasseqüências, variantes, mutantes, quiméricos, e fusões dos mesmos.Proteínas da invenção em questão podem ter aminoácidos substituídoscontanto que conservem a atividade funcional desejada. Genes "variantes"têm seqüências de nucleotídeo que codificam as mesmas proteínas ouproteínas equivalentes tendo atividade equivalente ou similar a uma proteínaexemplificada.

Os dois resultados principais das pesquisas BLAST com aseqüência de nucleotídeos nativa aad-12 apresentam um nível razoável dehomologia (cerca de 85%) sobre 120 pares de bases de seqüência. Pode-seesperar que hibrídização sob certas condições inclua estas duas seqüências.Vide GENBANK Acc. Nss DQ406818.1 (89329742; Rhodoferax) eAJ6288601.1 (44903451; Sphingomonas). Rhodoferax é muito similar aDelftia mas Sphingomonas é uma Classe filogeneticamente inteiramentediferente.

Os termos "proteínas variantes" e "proteínas equivalentes"refere-sem a proteínas tendo a mesma ou essencialmente a mesmaatividade biológica/funcional contra os substratos alvo e seqüênciasequivalentes que as proteínas exemplificadas. Conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, referência a uma seqüência "equivalente" refere-sea seqüências tendo substituições, eliminações, adições, ou inserções deaminoácidos que melhoram ou não afetam de modo adverso a atividade emum grau significativo. Fragmentos conservando a atividade também estãoincluídos nesta definição. Fragmentos e ouitros equivalentos que conservama mesma função ou atividade ou função ou atividade similar que umfragmento correspondente de uma proteína exemplificada estão dentro doâmbito da invenção em questão. Alterações, tais como substituições ouadições de aminoácidos, podem ser feitas para uma variedade definalidades, tais como aumentar (ou reduzir) a estabilidade da protease daproteína (sem reduzir materialmente/substancialmente a atividade funcionalda proteína), remover ou adicionar um sítio de restrição, e semelhantes.Variações de genes podem ser prontamente construídas usando técnicas derotina para preparar mutações características, por exemplo.Além disso, a Patente U. S. N9 5.605.793, por exemplo,descreve métodos para gerar diversidade molecular adicional usandoreunião de DNA depois de fragmentação aleatória ou focada. Isto pode serreferido como "embaralhamento" genético, o qual tipicamente envolve misturar fragmentos (de um tamanho desejado) de duas ou mais moléculasde DNA diferentes, seguidos por rodadas repetidas de renaturação. Istopode melhorar a atividade de uma proteína codificada por um gene departida. O resultado é uma proteína quimérica tendo atividade aprimorada,especificidade de substrato alterada, aumentada estabilidade enzimátíca, estereospecificidade alterada, ou outras características.

O "embaralhamento" pode ser designado e orientado depois deobter e examinar as coordenadas 3D atômicas (tridimensionais) e a estruturacristalina de uma proteína de interesse. Portanto, "embaralhamento focado"pode ser orientado para alguns segmentos de uma proteína que são ideais para modificação, tais como segmentos expostos superficialmente, epreferencialmente segmentos não internos que estão envolvidos comdobramento de proteína e integridade estrutural 3D essencial.

Alterações específicas para o "sítio ativo" da enzima podem serfeitas para afetar a funcionalidade inerente com respeito a atividade ou estereospecificidade (vide a Figura 2 de alinhamento). Muller et. al. (2006).A estrutura cristalina tauD conhecida foi usada como uma dioxigenasemodelo para determinar resíduos de sítio ativo enquanto ligado a seusubstrato taurino inerente. Elkins et al. (2002) "X-ray crystal structure ofEscerichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates," Biochemistry 41(16):5185-5192. Com referência àotimização de seqüência e designabilidade de sítios ativos enzimáticos, videChakrabarti etal., PNAS, (Aug. 23, 2005), 102(34): 12035-12040.

Genes variantes podem ser usados para produzir proteínasvariantes; hospedeiros recombinantes podem ser usados para produzir asproteínas variantes. Usando estas técnicas de "embaralhamento genético",podem ser construídos genes e proteínas equivalentes que compreendemquaisquer 5, 10, ou 20 resíduos contíguos (aminoácido ou nucleotídeo) dequalquer seqüência exemplificada aqui, neste requerimento de patente.Conforme uma pessoa versada na técnica sabe, as técnicas deembaralhamento genético, por exemplo, podem ser ajustadas para obterequivalentes tendo, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142,143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172,173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187,188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202,203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217,218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232,233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247,248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262,263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277,278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292,ou 293 resíduos contíguos (aminoácido ou nucleotídeo), correspondendo aum segmento (do mesmo tamanho) em qualquer uma das seqüênciasexemplificadas ou sugeridas (ou dos complementos (complementos plenos)das mesmas). Segmentos de tamanho similar, especialmente os pararegiões conservadas, também podem ser usados como sondas e/ouiniciadores.

Fragmentos de genes de extensão total podem ser fabricadosusando exonucleases ou endonucleases disponíveis comercialmente deacordo com procedimentos de rotina. Por exemplo, enzimas tais como Ba!31ou mutagênese sítio-dirigida podem ser usadas para cortar sistematicamentenucleotídeos das extremidades destes genes. Além disso, genes quecodificam fragmentos ativos podem ser obtidos usando uma variedade deenzimas de restrição. Proteases podem ser usadas para obter diretementefragmentos ativos destas proteínas.

Está dentro do âmbito da invenção conforme revelado aqui,neste requerimento de patente, que proteínas podem ser truncadas e aindaconservar atividade funcional. Por "proteína truncada" significa que umaporção de uma proteína pode ser clivada enquanto a proteína truncadaremanescente conserva e apresenta a atividade desejada depois declivagem. Clivagem pode ser realizada por várias proteases. Além disso,proteínas clivadas de modo eficaz podem ser produzidas usando técnicas debiologia molecular em que as bases de DNA codificando a referida proteínasão removidas ou através de digestão com endonucleases de restrição ououtras técnicas disponíveis para o técnico versado. Depois de truncação, asproteínas referidas podem ser expressadas em sistemas heterólogos taiscomo E. coli, baculovírus, sistemas virais à base de planta, levedura, esemelhantes e em seguida colocadas em ensaios de inseto conformerevelado aqui, neste requerimento de patente, para determinar a atividade. Éde conhecimento geral na téncica que proteínas truncadas podem serproduzidas com êxito de modo que retenham atividade functional, enquantotendo menos do que a seqüência inteira, de extensão total. Por exemplo,proteínas de B.t. podem ser usadas em uma forma truncada (proteína denúcleo) (vide, por exemplo, Hõfte et al. (1989), e Adang et al. (1985)).Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "proteína"pode incluir truncações functionalmente ativas.

Em alguns casos, especialmente para expressão em plantas,pode ser vantajoso usar genes truncados que expressam proteínastruncadas. Genes truncados preferenciais tipicamente codificarão 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% daproteína de extensão total.

Algumas proteínas da invenção em questão foramespecificamente exemplificadas aqui, neste requerimento de patente. Comoestas proteínas são meramente exemplos das proteínas da invenção emquestão, deve ser prontamente evidente que a invenção em questãocompreende proteínas variantes ou equivalentes (e seqüências denucleotídeo codificando para equivalentes das mesmas) tendo a mesmaatividade ou atividade similar das proteínas exemplificadas. Proteínasequivalentes terão similaridade de aminoácido (e/ou homologia) copm umaproteína exemplificada. A identidade de aminoácido tipicamente será de nomínimo 60%, preferencialmente de no mínimo 75%, mais preferencialmentede no mínimo 80%, ainda mais preferencialmente de no mínimo 90%, e podeser de no mínimo 95%. Proteínas preferenciais da invenção em questãotambém podem ser definidas em termos de faixas mais particulares deidentidade e/ou similaridade. Por exemplo, a identidade e/ou similaridadepode ser de 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% comparada comuma seqüência exemplificada ou sugerida aqui, neste requerimento depatente. Qualquer número listado acima pode ser usado para definir oslimites superior e inferior.

A menos que especificado de modo diverso, conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, a percentagem de identidade deseqüência e/ou similaridade de dois ácidos nucléicos é determinada usandoo algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, modificado como em Karlin e Altschul1993. Um algoritmo semelhante é incorporado nos programas NBLAST eXBLAST de Altschul et ai, 1990. Pesquisas de nucleotídeo BLAST sãorealizadas com o programa NBLAST, escore = 100, extensão de palavra =12. Gapped BLAST pode ser usado conforme descrito em Altschul et ai,1997. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetrosdefault dos programas respectivos (NBLAST e XBLAST) são usados. Vide owebsite NCBI/NIH. Para obter alinhamentos com hiatos (gapped) para finsde comparação, a função AIignX do Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., NorthBethesda, MD, E.U.A.), foi usada empregando os parâmetros default. Estesforam: uma penalidade de abertura de Gap de 15, uma penalidade deextensão de Gap de 6,66, e uma faixa de penalidade de separação de Gapde 8.

Várias propriedades e características tridimensionais da proteínatambém podem ser alteradas sem afetar de modo adverso aatividade/funcionalidade da proteína. Substituições de aminoácidosconservativas podem ser toleradas/feitas para não afetar de modo adverso aatividade e/ou configuração tridimensional da molécula. Aminoácidos podemser postos nas classes seguintes: não polares, polares não carregados,básicos, e acidíferos. Substituições conservativas em que um aminoácido deuma classe é substituído com outro aminoácido do mesmo tipo estão dentrodo âmbito da invenção em questão contanto que a substituição não sejaadversa para a atividade biológica do composto. A Tabela 2 proporcionauma listagem de exemplos de aminoácidos pertencentes a cada classe.

Tabela 2

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Em alguns casos, também podem ser feitas substituições nãoconservadoras. No entanto, substituições preferenciais não diminuemsignificativamente a atividade funcional/biológica da proteína.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, referênciaa polinucleotídeos "isolados" e/ou proteínas "purificadas" refere-se a estasmoléculas quando elas não são associadas com as outras moléculas com asquais seriam encontradas na natureza. Portanto, referência a "isolado" e/ou"purificado" significa o envolvimento da "mão do homem" conforme descritoaqui, neste requerimento de patente. Por exemplo, um "gene" bacteriano dainvenção em questão posto em uma planta para expressão é um"polinucleotídeo isolado". Do mesmo modo, uma proteína derivada de umaproteína bacteriana e produzida por uma planta é uma "proteína isolada".

Devido à degeneração/redundância do código genético, umavariedade de diferentes seqüências de DNA podem codificar as seqüênciasde aminoácidos reveladas aqui, neste requerimento de patente. Está bemdentro do conhecimento de uma pessoa versada na técnica criar seqüênciasde DNA alternativas que codificam as mesmas, ou essencialmente asmesmas, proteínas. Estas seqüências de DNA variantes estão dentro doâmbito da invenção em questão. Isto também é discutido em mais detalhesabaixo na seção intitulada Otimização de seqüência para expressão emplantas".

Otimização de seqüência para expressão em plantas. Para obterelevada expressão de genes heterólogos em plantas é geralmentepreferencial a reengenharia dos genes de maneira a que sejam expressadosde modo mais eficaz em (no citoplasma de) células vegetais. Milho é umadas plantas referidas onde pode ser preferencial redesenhar o um ou maisgenes heterólogos antes de transformação para aumentar o nível deexpressão do mesmo na planta referida. Portanto, uma etapa adicional nodesenho de genes codificando uma proteína bacteriana é reengenharia deum gene heterólogo para ótima expressão, usando preferência de códonmais intimamente alinhado com a seqüência da planta alvo, quer umaespécie dicotiledônea ou monocotiledônea. Seqüências também podem serotimizadas para expressão em quaisquer dos tipos mais particulares deplantas discutidos alhures aqui, neste requerimento de patente.

Hospedeiros transqênicos. Os genes codificando A proteína dainvenção em questão podem ser introduzidos em uma ampla variedade dehospedeiros vegetais ou microbianos. A invenção em questão inclui célulasde plantas transgênicas e plantas transgênicas. Plantas preferenciais (ecélulas vegetais) são milho, Arabidopsis, tabaco, soja, algodão, canola,arroz, trigo, turfa, legume forragens (por exemplo, alfafa e trevo), gramíneasde pasto, e semelhantes. Outros tipos de plantas transgênicas tambémpodem ser fabricadas de acordo com a invenção em questão, tais comofrutas, legumes, plantas ornamentais, e árvores. De modo mais geral,dicotiledôneas e/ou monocotiledôrieas podem ser usadas em váriosaspectos da invenção em questão.

Em modalidades preferenciais, a expressão do gene resulta,diretamente ou indiretamente, na produção intracelular (e manutenção) dauma ou mais proteínas de interesse. Plantas podem ser tornadas resistentesa herbicida desta maneira. Os hospedeiros referidos podem ser referidoscomo hospedeiros e/ou células transgênicos, recombinantes, transformados,e/ou transfectados. Em alguns aspectos desta invenção (na clonagem epreparação do gene de interesse, por exemplo), células microbianas(preferencialmente bacterianas) podem ser produzidas e usadas de acordocom técnicas de rotina, com o benefício da descoberta em questão.

Células vegetais transfectadas com um polinucleotídeo dainvenção em questão podem ser regeneradas em plantas sadias. A invençãoem questão inclui culturas celulares incluindo culturas celulares de tecido,culturas líquidas, e culturas laminadas. Sementes produzidas por e/ouusadas para gerar plantas da invenção em questão também são incluídasdentro do âmbito da invenção em questão. Outros tecidos vegetais e partestambém são incluídos na invenção em questão. A invenção em questãoigualmente inclui métodos para produzir plantas ou células compreendendoum polinucleotídeo da invenção em questão. Um método preferencial paraproduzir plantas semelhantes é plantando uma semente da invenção emquestão.

Embora plantas possam ser preferenciais, a invenção emquestão também inclui produção de AAD-12 recombinante altamente ativoem uma cepa hospedeira de Pseudomonas fluorescens (Pf), por exemplo. Ainvenção em questão inclui temperaturas de crescimento preferenciais paramanter AAD-12 ativo solúvel neste hospedeiro; uma condição defermentação onde AAD-12 é produzido como mais de 40% de proteínacelular total, ou no mínimo 10 g/L; um processo de purificação resulta altarecuperação de AAD-12 recombinante ativo a partir de um hospedeiro Pf;um esquema de purificação o qual produz no mínimo 10 g de AAD-12 ativopor kg de células; um esquema de purificação o qual pode produzir 20 g deAAD-12 ativo por kg de células; um processo de formulação que podearmazenar e restaurar a atividade de AAD-12 em solução; e um processo deliofilização que pode reter atividade de AAD-12 para armazenamento e vidade prateleira de longo-termo.

Inserção de genes para formar hospedeiros transqênicos. Umaspecto da invenção em questão é a transformação/transfecção de plantas,células vegetais, e outras células hospedeiras com os polinucleotídeos dainvenção em questão que expressam proteínas da invenção em questão.Plantas transformadas desta maneira podem ser tornadas resistentes a umavariedade de herbicidas com diferentes modos de ação.

Uma ampla variedade de métodos estão disponíveis paraintroduzir um gene codificando uma proteína desejada no hospedeiro alvosob condições que permitem manutenção estável e expressão do gene.Estes métodos são de conhecimento geral daqueles versados na técnica esão descritos, por exemplo, na Patente U. S. N9 5.135.867.

Vetores compreendendo um polinucleotídeo AAD-12 sãoincluídos no âmbito da invenção em questão. Por exemplo, um grandenúmero de vetores de clonagem compreendendo um sistema de replicaçãoem E. coli e um marcador que permite seleção das células transformadasestão disponíveis para preparação para a inserção de genes estranhos emplantas superiores. Os vetores compreendem, por exemplo, pBR322, sériepUC, série M13mp, pACYC184, e etc. Por conseguinte, a seqüênciacodificando a proteína pode ser inserida no vetor em um sítio de restriçãoadequado. O plasmídeo resultante é usado para transformação em E. coli.As células de E. coli são cultivadas em um meio nutriente adequado, emseguida colhidas e lisadas. O plasmídeo é recuperado por purificaçãodistante de DNA genômico. Análise de seqüência, análise de restrição,eletroforese, e outros métodos bioquímicos-moleculares biológicos sãogeralmente realizados como métodos para análise. Depois de cadamanipulação, a seqüência de DNA usada pode ser digerida por restrição eunida à próxima seqüência de DNA. Cada seqüência de plasmídeo pode serclonada no mesmo plasmídeo ou em outros plasmídeos. Dependendo dosmétodos para inserir genes desejados na planta, podem ser necessáriasoutras seqüências de DNA. Se1 por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri é usadopara a transformação da célula vegetal, então no mínimo a borda direita,mas freqüentemente a borda direita e a borda esquerda do T-DNA doplasmídeo Ti ou Ri, foi unida como a região flanqueante dos genes a sereminseridos. O uso de T-DNA para a transformação de células vegetais temsido intensivamente pesquisado e descrito na patente européia Ne EP 120516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); e An et ai (1985).

Um grande número "de técnicas estão disponíveis para inserirDNA em uma célula hospedeira vegetal. Estas técnicas incluemtransformação com T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens ouAgrobacterium rhizogenes como agente de transformação, fusão, injeção,biolística (bombardeamento de micropartículas), whiskers de carbureto desilício, emissão de aerosol, PEG, ou eletroporação bem como outrosmétodos possíveis. Se são usados Agrobacteria para a transformação, oDNA a ser inserido deve ser clonado em plasmídeos especiais, isto é, ou emum vetor intermediário ou em um vetor binário. Os vetores intermediáriospodem ser integrados no plasmídeo Ti ou Ri por recombinação homólogadevido a seqüências que são homólogas a seqüências no T-DNA. Oplasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para atransferência do T-DNA. Vetores intermediários não podem se replicar emAgrobacteria. O vetor intermediário pode ser transferido em Agrobacteriumtumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). Vetoresbinários podem se replicar tanto em E. coli quanto em Agrobacteria. Elescompreendem um gene marcador de seleção e um encadeador oupoliencadeador os quais são enquadrados pelas regiões de borda de T-DNAdireita e esquerda. Podem ser transformados diretamente em Agrobacteria(Holsters, 1978). O Agrobaeterium usado como célula hospedeira devecompreender um plasmídeo carregando uma região vir. A região vir énecessária para a transferência do T-DNA na célula vegetal. Podecompreender T-DNA adicional. A bactéria transformada deste modo é usadapara a transformação de células vegetais. Explantes vegetais podem sercultivados vantajosamente com Agrobacterium tumefaciens ouAgrobacterium rhizogenes para a transferência do DNA na célula vegetal.Plantas inteiras podem ser então regeneradas a partir de material de plantainfectada (por exemplo, pedaços de folhas, segmentos de caule, raízes, mastambém protoplastos ou células cultivadas em suspensão) em um meioadequado, o qual pode conter antibióticos ou biocidas para seleção. Asplantas obtidas deste modo podem ser então testadas para a presença dosDNA inseridos. Não são feitas demandas especiais dos plasmídeos no casode injeção e eletroporação. É possível usar plasmídeos ordinários, taiscomo, por exemplo, pUC derivados.

As células transformadas crescem dentro das plantas namaneira usual. Podem formar células germinativas e transmitir o um ou maistraços transformados às plantas da progênie. As plantas referidas podem sercultivadas na maneira normal e cruzadas com plantas que têm os mesmosfatores hereditários transformados ou outros fatores hereditários. Os indiví-duos híbridos resultantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Em algumas modalidades preferenciais da invenção, genescodificando a proteína bacteriana são expressados a partir de unidadestranscricionais inseridas no genoma da planta. Preferencialmente, asunidades transcricionais referida são vetores recombinantes capazes deintegração estável no genoma da planta e permitem a seleção de linhagensde plantas transformadas expressando RNAm codificando as proteínas.

Uma vez que o DNA inserido tenha sido integrado no genoma, érelativamente estável aí (e não sai de novo). Normalmente, contém ummarcador de seleção que confere sobre as células vegetais transformadasresistência a um biocida ou um antibiótico, tal como canamicina, G418,bleomicina, higromicina, ou cloranfenicol, entre outros. Marcadores vegetaisselecionáveis também podem proporcionar tipicamente resistência a váriosherbicidas tais como glufosinato (por exemplo, ΡΑΤ^ή, glifosato (EPSPS),ALS-inibidores (por exemplo, imidazolinona, sulfoniluréia, triazolopirimidinasulfonanilida, et ai), bromoxinila, resistência a HPPD-inibidores, PPO-inibidores, ACC-ase inibidores, e muitos outros. O marcador empregadoindividualmente por conseguinte deve permitir a seleção de célulastransformadas ao invés de células que não contêm o DNA inserido. Um oumais genes de interesse são preferencialmente expressados ou porpromotores constitutivos ou indutíveis na célula vegetal. Uma vezexpressado, o RNAm é traduzido em proteínas, deste modo incorporandoaminoácidos de interesse em proteína. Os genes codificando uma proteínaexpressada nas células vegetais pode estar sob o controle de um promotorconstitutivo, um promotor tecidual-específico, ou um promotor indutível.

Existem várias técnicas para introduzir vetores recombinantesestranhos em células vegetais, e para obter plantas que mantêm de modoestável e expressam o gene introduzido. As técnicas referidas incluem aintrodução de material genético revestido sobre micropartículas diretamentenas células (Patente U. S. N° 4.945.050 para Cornell e Patente U. S. N°5.141.131 para DowEIanco, atualmente Dow AgroSciences, LLC). Alémdisso, plantas podem ser transformadas usando tecnologia deAgrobacterium, vide a Patente U. S. N° 5.177.010 para a University ofToledo; a Patente U. S. N° 5.104.310 para Texas A&M; o Requerimento dePatente Européia N° 0131624B1; os Requerimentos de Patente Européia Nss120516, 159418B1 e 176.112 para Schilperoot; as Patentes U. S. Nos5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 e 4.940.838 e 4.693.976 para Schilperoot;os Requerimentos de Patente Européia Nos 116718, 290799, 320500, todaspara Max Planck; os Requerimentos de Patente Européia Nos 604662 e627752, e a Patente U. S. N° 5.591.616, para Japan Tobacco; osRequerimentos de Patente Européia Nos 0267159 e 0292435, e a Patente U.S. N° 5.231.019, todas para Ciba Geigy, agora Syngenta; as Patentes U. S.Nos 5.463.174 e 4.762.785, ambas para Calgene; e as Patentes U. S. Nos5.004.863 e 5.159.135, ambas para Agracetus. Outra tecnologia detransformação inclui tecnologia de whiskers. Vide as Patentes U. S. Nos5.302.523 e 5.464.765, ambas para Zeneca, agota Syngenta. Outratecnologia de transformação de liberação direta de DNA inclui tecnologia defeixe de aerosol. Vide a Patente U. S. N° 6.809.232. Tecnologia deeletroporação também tem sido usada para transformar plantas. Vide aPatente Internacional Ne 87/06614 para Boyce Thompson Institute; asPatentes U. S. Nes 5.472.869 e 5.384.253, ambas para Dekalb; e a PatenteInternacional Ne WO 92/09696 e a Patente Internacional Ns WO 93/21335,ambas para Plant Genetic Systems. Além disso, vetores virais tambémpodem ser usados para produzir plantas transgênicas expressando aproteína de interesse. Por exemplo, plantas monocotiledôneas podem sertransformados com um vetor viral usando os métodos descritos na PatenteU. S. Nq 5.569.597 para Mycogen Plant Science e Ciba-Geigy (agoraSyngenta), bem como nas Patentes U. S. Nes 5.589.367 e 5.316.931, ambaspara Biosource, agora Large Scale Biology.

Conforme mencionado previamente, a maneira na qual oconstructo de DNA é introduzido no hospedeiro vegetal não é crucial paraesta invenção. Pode ser empregado qualquer método que proporcionetransformação eficiente. Por exemplo, vários métodos para transformação decélula vegetal são descritos aqui, neste requerimento de patente, e incluemo uso de plasmídeos Ti ou Ri e semelhantes para realizar transformaçãomediada por Agrobacterium. Em muitos casos, será desejável ter oconstructo usado para transformação limitado sobre um ou ambos os ladospor bordas de T-DNA, mais especificamente a borda direita. Isto éparticularmente útil quando o constructo usa Agrobacterium tumefaciens ouAgrobacterium rhizogenes como um modo para transformação, emborabordas de T-DNA possam encontrar aplicação com outros modos detransformação. Quando Agrobacterium é usado para transformação decélula vegetal, pode ser usado um vetor o qual pode ser introduzido nohospedeiro para recombinação homóloga com T-DNA ou o plasmídeo Ti ouRi presente no hospedeiro. A introdução do vetor pode ser realizada atravésde eletroporação, cruzamento tri-parental e outras técnicas para transformarbactérias Gram-negativas as quais são de conhecimento daqueles versadosna técnica. A maneira de transformação vetorial no hospedeiro deAgrobacterium não é crucial para esta invenção. O plasmídeo Ti ou Ricontendo o T-DNA para recombinação pode ser capaz ou incapaz deprovocar formação de fel, e não é crucial para a referida invenção contantoque os genes vir estejam presentes no hospedeiro referido.

Em alguns casos em que Agrobacterium é usado paratransformação, o constructo de expressão estando dentro das bordas de T-DNA serão inseridos em um vetor de amplo espectro tal como pRK2 ouderivados do mesmo conforme descrito em Ditta et ai. (1980) e em EPOO 120 515. Incluído dentro do constructo de expressão e o T-DNA estarãoum ou mais marcadores conforme descrito aqui, neste requerimento depatente, os quais possibilitam a seleção de Agrobacterium transformado ecélulas vegetais transformadas. O marcador em particular empregado não éessencial para esta invenção, com o marcador preferencial dependendo dohospedeiro e da construção usados.

Para transformação de células vegetais usando Agrobacterium,explantes podem ser combinados e incubados com o Agrobacteriumtransformado por tempo suficiente para permitir transformação do mesmo.Depois da transformação, Agrobacteria são mortos por seleção com osantibióticos apropriados e as células vegetais são cultivadas com o meioseletivo apropriado. Uma vez que sejam formados calos, a formação debroto pode ser estimulada empregando os hormônios vegetais apropriadosde acordo com métodos de conhecimento geral na técnica de cultura detecido vegetal e regeneração de plantas. No entanto, não é semprenecessário um estágio intermediário de calo. Depois da formação de broto,as células vegetais referidas podem ser transferidas por meio o qualestimula a formação de raiz deste modo completando a regeneração daplanta. As plantas podem ser então cultivadas para semente e a sementereferida pode ser usada para estabelecer gerações futuras. Independente datécnica de transformação, o gene codificando uma proteína bacteriana épreferencialmente incorporado em um vetor de transferência genéticaadaptado para expressar o gene referido em uma célula vegetal incluindo novetor um elemento regulador de promotor vegetal, bem como regiões determinação transcripcional não traduzida 3' tais como Nos e semelhantes.

Além de numerosas tecnologias para transformar plantas, o tipode tecido que é contactado com os genes estranhos também pode variar. Otecido referido incluiria mas não seria limitado a tecido embriogênico, tecidode calo tipos I, II, e III, hipocótilo, meristema, tecido de raiz, tecidos paraexpressão em floema, e semelhantes. Quase todos os tecidos vegetaispodem ser transformados durante desdiferenciação usando técnicasapropriadas descritas aqui, neste requerimento de patente.

Conforme mencionado acima, uma variedade de marcadoresselecionáveis pode ser usada, caso desejado. A preferência por ummarcador em particular está a critério do técnico, mas qualquer um dosmarcadores selecionáveis seguintes também pode ser usado junto comqualquer outro gene não listado aqui, neste requerimento de patente, o qualpoderia funcionar como um marcador selecionável. Os marcadoresselecionáveis referidos incluem mas não estão limitados a gene deaminoglicosídeo fosfotransferase do transposon Tn5 (Aph II) o qual codificaresistência aos antibióticos canamicina, neomicina e G41; resistência ahigromicina; resistência a metotrexato, bem como os genes os quaiscodificam para resistência ou tolerância a glifosato; fosfinotricina (bialafos ouglufosinato); herbicidas ALS-inibidores (herbicidas de imidazolinonas,sulfoniluréias e triazolopirimidina), ACC-ase inibidores (por exemplo,airiloxipropionatos ou ciclohexanodionas), e outros tais como bromoxinila, eHPPD-inibidores (por exemplo, mesotriona) e semelhantes.

Além de um marcador selecionável, pode ser desejável usar umgene repórter. Em alguns casos um gene repórter pode ser usado com ousem um marcador selecionável. Genes repórter são genes que tipicamentenão estão presentes no tecido ou organismo receptor e tipicamente codificam para proteínas resultando em alguma alteração fenotípica oupropriedade enzimática. Exemplos de semelhantes genes sãoproporcionados em Weising et ai, 1988. Genes repórter preferenciaisincluem a beta-glucuronidase (GUS) do lócus uidA de E. coli, o gene decloranfenicol acetil transferase de Tn9 de E. coli, a proteína verdefluorescente da Aequorea victoria de água-viva bioluminescente, e os genesIuciferase de Photinus pyralis de vagalume. Um teste para detectarexpressão de gene repórter pode ser então realizado em um momentoadequado depois do gene referido ter sido introduzido nas células doreceptor. Um teste semelhante preferencial acarreta o uso do genecodificando beta-glucuronidase (GUS) do lócus uidA de E. coli conformedescrito por Jefferson et ai, (1987) para identificar células transformadas.

Além de elementos reguladores de promotores vegetais,elementos reguladores de promotores de uma variedade de fontes podemser usados de modo eficaz em células vegetais para expressar genesestranhos. Por exemplo, elementos reguladores de promotores de origembacteriana, tais como o promotor de octopina sintase, promotor de nopalinasintase, promotor de manopina sintase; promotores de origem viral, taiscomo o vírus do mosaico da couve-flor (35S e 19S), 35T (o qual é umpromotor re-planejado 35S, vide a Patente U. S. Ns 6.166.302,especialmente o Exemplo 7E) e semelhantes podem ser usados. Elementosreguladores de promotores de plantas incluem mas não estão limitados aribulose-1,6-bisfosfato (RUBP) carboxilase pequena subunidade (ssu),promotor de beta-conglicinina, promotor de beta-faseolina, promotor deADH, promotores de choque térmico, e promotor de tecidos específicos.Outros elementos tais como regiões de fixação de matriz, regiões de fixaçãode andaime, íntrons, intensificadores, seqüências de poliadenilação esemelhantes podem estar presentes e portanto podem melhorar a eficiênciada transcrição ou integração de DNA. Os elementos referidos podem ser ounão necessários para função de DNA, embora podem proporcionar melhorexpressão ou funcionamento do DNA afetando a transcrição, estabilidade deRNAm, e semelhantes. Os elementos referidos podem ser incluídos no DNAconforme desejado para obter ótima desempenho do DNA transformado naplanta. Elementos típicos incluem mas não estão limitados a Adh-íntron 1,Adh-íntron 6, a seqüência líder da proteína da capa do vírus do mosaico daAlfafa, seqüências UTR de osmotina, a seqüência líder da proteína da capado vírus da listra do milho, bem como outras disponíveis para um técnicoversado. Elementos reguladores de promotores constitutivos também podemser usados deste modo dirigindo a expressão genética contínua em todos ostipos de células e em todos os momentos (por exemplo, actina, ubiquitina,CaMV 35S, e semelhantes). Elementos reguladores de promotores teciduaisespecíficos são responsáveis por expressão genética em tipos de tecidos oucélulas específicos, tais como as folhas ou sementes (por exemplo, zeína,oleosina, napina, ACP, globulina e semelhantes) e estes também podem serusados.

Elementos reguladores de promotores também podem ser ativos(ou inativos) durante um certo estágio do desenvolvimento vegetal bemcomo ativos em tecidos e órgãos vegetais. Exemplos de semelhantesincluem mas não estão limitados a elementos reguladores de promotoresespecíficos de pólen, específicos de embrião, específicos de fibra protéicade milho, específicos de fibra de algodão, específicos de raiz, específicos deendosperma de sementes, ou específicos da fase vegetativa e semelhantes.Sob algumas circunstâncias pode ser desejável usar um elemento reguladorde promotor indutível, o qual é responsável por expressão de genes emresposta a um sinal específico, tal como: estímulo físico (genes de choqueteérmico), luz (RUBP carboxilase), hormônio (Em), metabólitos, produtosquímicos (responsivos a tetraciclina), e estresse. Podem ser usados outroselementos de transcrição e translação desejáveis que funcionam em plantas.Numerosos vetores de transferência de genes planta-específicos sãoconhecidos na técnica.

Sistemas à base de RNA viral de plantas também podem serusados para expressar proteína bacteriana. Fazendo isto, o genecodificando uma proteína pode ser inserido na região de promotor da capade um vírus vegetal adequado o qual infetará a planta hospedeira deinteresse. A proteína pode ser então expressada proporcionando destemodo proteção da planta contra lesão pelo herbicida. Sistemas à base deRNA viral de plantas são descritos na Patente U. S. N9 5.500.360 paraMycogen Plant Sciences, Inc. e nas Patentes U. S. Nqs 5.316.931 e5.589.367 para Biosource, atualmente Large Scale Biology.Meios para aumentar adicionalmente os níveis de tolerância ou resistência.É mostrado aqui, neste requerimento de patente, que as plantas da invençãoem questão podem ser concedidas com novos traços de resistência aherbicida sem efeitos adversos observáveis sobre fenótipo incluindoprodução. As plantas referidas estão dentro do âmbito da invenção emquestão. Plantas exemplificadas e sugeridas aqui, neste requerimento depatente, podem suportar níveis de aplicação típicos 2X, 3X, 4X, e 5X, porexemplo, de no mínimo um herbicida em questão. Aprimoramentos nestesníveis de tolerância estão dentro do âmbito desta invenção. Por exemplo,várias técnicas são conhecidas na técnica, e podem ser otimizadasprevisível e adicionalmente desenvolvidas, para umentar a expressão de umdado gene.

Um método semelhante inclui aumentar o número de cópias dosgenes AAD-12 em questão (em cassetes de expressão e semelhantes).Eventos de transformação também podem ser selecionados para aquelestendo múltiplas cópias dos genes.

Fortes promotores e reforçadores podem ser usados para"supercarregar" a expressão. Exemplos de semelhantes promotores incluemo promotor 35T preferencial o qual usa 35S reforçadores. 35S, ubiquitina domilho, ubiquitina de Arabidopsis, actina de A.t., e CSMV promotores sãoincluídos para semelhantes usos. Outros fortes promotores virais tambémsão preferenciais. Reforçadores incluem 4 OCS e o duplo reforçador 35S.Regiões de fixação de matriz (MARs) também podem ser usadas paraaumentar as eficiências da transformação e a expressão de transgene, porexemplo.

Embaralhamento (evolução dirigida) e fatores de transcriçãotambém podem ser usados para modalidades de acordo com a invenção emquestão.

Proteínas variantes também podem ser designadas que diferemno nível de seqüência, mas que conservam a mesma estruturatridimensional essencial total ou similar, a mesma distribuição de cargasuperficial ou similar, e semelhantes. Vide, por exemplo, a Patente U. S. N27.058.515; Larson et al., Protein Sei. 2002 11: 2804-2813, 'Thoroughlysampling sequence space: Large-scale protein design of structuralensembles".; Crameri et al., Nature Biotechnology 15, 436 - 438 (1997),"Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling";Stemmer, W.P.C.1994. DNA shuffling by random fragmentation andreassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad.Sei. USA 91: 10747-10751; Stemmer, W.P.C.1994. Rapid evolution of aprotein in vitro by DNA shuffling. Nature 370: 389-391; Stemmer,W.P.C.1995. Searching sequence space. Bio/Technology 13: 549-553;Crameri1 A., Cwirla, S. and Stemmer, W.P.C.1996. Construction andevolution of antibody-phage Iibraries by DNA shuffling. Nature Medicine 2:100-103; and Crameri, A., Whitéhorn, E.A., Tate, E. and Stemmer, W.P.C.1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNAshuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319.

A atividade de polinucleotídeos recombinantes inseridos emcélulas vegetais pode ser dependente da influência de DNA vegetalendógeno adjacente ao inserto. Portanto, outra opção é aproveitar oseventos que se sabe que são excelentes localizações em um genoma deplanta para inserções. Vide, por exemplo, d requerimento de patenteinternacional Ns WO 2005/103266 A1, relativo a eventos de algodão cryl F ecrylAc; o gene AAD-12 em questão pode ser substituído nestes Iocigenômicos ao invés dos insertos crylF e/ou crylAc. Portanto, recombinaçãohomóloga orientada, por exemplo, pode ser usada de acordo com ainvenção em questão. Este tipo de tecnologia é o objeto de, por exemplo, orequerimento de patente internacional N2 WO 03/080809 A2 e orequerimento de patente U. S. N3 publicado correspondente (USPA20030232410), relativo ao uso de dedos de zinco para recombinaçãoorientada. O uso de recombinases (cre-lox e flp-frt por exemplo) também éconhecido na técnica.

Acredita-se que a destoxificação de AAD-12 ocorra nocitoplasma. Portanto, meios para estabelecer adicionalmente esta proteína emRNAs (incluindo bloqueio da degradação de RNAm) são incluídos emaspectos da invenção em questão, e por conseguinte podem ser aplicadastécnicas conhecidas na técnica. As proteínas em questão podem serdesignadas para resistir a degradação por proteases e semelhantes (sítiosde clivagem de protease podem ser removidos de modo eficaz porreengenharia da seqüência de aminoácidos da proteína). As modalidadesincluem o uso de estruturas de emparelhamento de base intramolecular 5' e3' como UTRs de osmotina, e per5 (seqüências 5' não traduzidas ricas emAU). 5' caps como grupos 7-metila ou 2'-0-metila, por exemplo, resíduo deácido 7-metilguanílico, também podem ser usados. Vide, por exemplo,: Proc.Natl. Acad. Sei. USA Vol. 74, Ns 7, pp. 2734-2738 (July 1977) Importance of5'-terminal blocking strueture to stabilize mfíNA in eukaryotic proteinsynthesis. Também podem ser usados complexos protéicos ou grupos debloqueio de ligante.

O desenho computacional de 5' ou 3' UTR mais adequado paraAAD-12 (hairpinas sintéticas) também pode ser conduzido dentro do âmbitoda invenção em questão. Modelagem por computador em geral, bem comoembaralhamento genético e evolução dirigida, são discutidos alhures aqui,neste requerimento de patente. Mais especificamente referente àmodelagem por computador e UTRs, técnicas de modelagem porcomputador para uso para prever/avaliar 5' e 3' UTR derivados da presenteinvenção incluem, mas não estão limitadas a: MFoId versão 3.1 disponívelna Genetics Corporation Group, Madison, Wl (vide Zucker et al., Algorithmsand Thermodynamics for RNA Secondary Strueture Predietion: A PracticalGuide. In RNA Bioehemistry and Bioteehnology, 11-43, J. Barciszewski &B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers,Dordrecht, NL, (1999); Zucker et al., Expanded Sequenee Dependenee ofThermodynamie Parameters Improves Predietion of RNA SeeondaryStrueture. J. Moi Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker et al., RNA SecondaryStrueture Predietion.In Current Protocols in Nueleie Aeid Chemistry S.Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, e R.A. Jones eds., John Wiley &Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)), COVE (Análise da estrutura doRNA usando modelos de covariância (métodos de gramática livre decontexto estocástico)) v.2.4.2 (Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22:2079-2088) o qual é distribuído livremente como código fonte e cujodownload pode ser feito acessando o websitegenetics.wustl.edu/eddy/software/, e FOLDALIGN, também distribuídolivremente e disponível para download no website bioinf.au.dk. FOLDALIGN/(vide Finding the most significant common sequence and structure motifs in aset of RNA sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer and G. D. Stormo. NucleicAcids Research, Vol. 25, Ns 18 pp. 3724-3732, 1997; Finding CommonSequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences.. J. Gorodkin, L.J. Heyer, e G. D. Stormo. ISMB 5;120-123, 1997).

Modalidades da invenção em questão podem ser usadas emcombinação com mutantes produzidos naturalmente ou induzidosquimicamente (mutantes podem ser selecionados por técnicas de triagem,em seguida transformados com AAD-12 e possivelmente outros genes).Plantas da invenção em questão podem ser combinadas com resistência aALS e/ou resistência a glifosato desenvolvidas. Resistência a aminopiralida,por exemplo, também pode ser combinada ou empilhado com um geneAAD-12.

Técnicas de reprodução tradicionais também podem sercombinadas com a invenção em questão para combinar, introgressar, emelhorar intensamente traços desejados.

Aprimoramentos adicionais também incluem uso com protetoresapropriados para proteger adicionalmente plantas e/ou adicionar resistênciacruzada a mais herbicidas. (Protetores tipicamente agem reforçando osistema imune vegetal ativando/expressando cP450. Protetores são agentesquímicos que reduzem a fitotoxicidade de herbicidas para plantas decolheitas por um mecanismo fisiológico ou molecular, sem comprometer aeficácia do controle de ervas daninhas).

Protetores herbicidas incluem benoxacor, cloquintocet,ciometrinil, diclormid, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol,fluxofenim, furilazole, isoxadifen, mefenpir, mefenato, anidrido naftálico, eoxabetrinila. Ativadores de plantas (uma nova classe de compostos queprotegem plantas ativando seus mecanismos de defesa) também podem serusados em modalidades da invenção em questão. Estes incluem acibenzolare probenazol.Protetores comercializados podem ser usados para a proteçãode colheitas de gramíneas de sementes grandes, tais como milho, sorgo degrãos, e arroz semeado a úmido, contra herbicidas incorporados pré-plantaou aplicados pré-emergência das famílias de tiocarbamato ecloroacetanilida. Protetores também foram desenvolvidos para protegercolheitas de cereais de inverno tais como trigo contra aplicações pós-emergência de herbicidas de ariloxifenoxipropionato e sulfoniluréia. O uso deprotetores para a proteção de milho e arroz contra herbicidas desulfoniluréia, imidazolinona, ciclohexanodiona, isoxazol, e trlcetona tambémé bem estabelecido. Um reforço induzido por protetor de destoxificação deherbicida em plantas protegidas é amplamente aceito como o principalmecanismo envolvido em ação de protetor. Protetores induzem cofatorestais como glutationa e enzimas detoxificantes de herbicida tais comoglutationa S-transferases, citocromol P450 monooxigenases, e glucosiltransferases. Hatzios KK, Burgos N (2004) "Metabolism-based herbicideresistance: regulation by protetores," Weed Science: Vol. 52, Ns 3 pp. 454-467.

Uso de um gene de citocromo p450 monooxigenase empilhadocom AAD-12 é uma modalidade preferencial. Há P450s envolvidos nometabolismo do herbicida; cP450 pode ser de origem de mamífero ouvegetal, por exemplo. Em plantas superiores, sabe-se que citocromo P450monooxigenase (P450) conduz o metabolismo secundário. Tambémdesempenha um papel importante no metabolismo oxidativo de xenobióticosem cooperação com NADPH-citocromo P450 oxidorredutase (redutase). Foireportada resistência a alguns herbicidas como um resultado dometabolismo por P450 bem como glutationa S-transferase. Uma série deespécies P450 microssômicas envolvidas no metabolismo xenobiótico emmamíferos foi caracterizada por clonagem molecular. Alguns destes foramreportados por metabolizar vários herbicidas de modo eficaz. Portanto,plantas transgênicas com P450 vegetal ou de mamífero podem apresentarresistência a vários herbicidas.

Uma modalidade preferencial do precedente é o uso de cP450para resistência a acetoclor (produtos à base de acetoclor incluem osherbicidas Surpass®, Keystone®, Keystone LA, FulTime® e TopNotch®) e/outrifluralina (tal como Treflan®). A resistência semelhante em soja e/ou milho éincluída em algumas modalidades preferenciais. Para orientação adicionalreferente a modalidades semelhantes, vide, por exemplo, Inui et al.,"A selectable marker using cytochrome P450 monooxygenases forArabidopsis transformation," Plant Biotechnology 22, 281-286 (2005) (relativoa um sistema de seleção para transformação de Arabidopsis thaliana atravésde Agrobacterium tumefaciens que usa citocromo P450 monooxigenaseshumanas que metabolizam herbicidas; mudas tolerantes a herbicida foramtransformadas e selecionadas com os herbicidas acetoclor, amiprofos-metil,clorprofam, clorsulfuron, norflurazon, e pendimetalin); Siminszky et al.,"Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeastand tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides," PNAS Vol.96, Issue 4, 1750-1755, February 16, 1999; Sheldon et al, Weed Science: Vol.48, Ns 3, pp. 291-295, "A cytochrome P450 monooxygenase cDNA(CYP71A10) confers resistance a Iinuron in transgenic Nicotiana tabacum";and "Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor bytransgenic rice plants expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19," JAgric Food Chem. 2006 Apr 19;54(8):2985-91 (relativo à experimentação deuma citocromo p450 monooxigenase de humana em arroz onde as plantas dearroz apresentaram notavelmente alta tolerância a cloroacetomidas (acetoclor,alaclor, metoaclor, pretilaclor, e tenilclor), oxiacetamidas (mefenacet),piridazinonas (norflurazon), 2,6-dinitroanalinas (trifluralin e pendimetalin),fosfamidatos (amiprofos-metil, tiocarbamatos (piributicarb), e uréias(clortoluron)).

Há também a possibilidade de alterar ou usar diferentesquímicas de 2,4-D para tornar os genes AAD-12 em questão mais eficientes.As alterações possíveis referidas incluem criar melhores substratos emelhores grupos de partida (maior eletronegatividade).

Inibidores de transporte de auxina (por exemplo, diflufenzopir)também podem ser usados para aumentar a atividade herbicida com 2,4-D.A menos que especificamente indicado ou sugerido, os termos"um", "uma", e "o", "a" significam "no mínimo um" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente.

Todas as patentes, requerimentos de patente, requerimentosprovisórios, e publicações referidas a ou citadas aqui, neste requerimento depatente, são incorporados por meio de referência em sua totalidde à medidaque não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório.

A seguir estão exemplos que ilustram procedimentos para praticara invenção. Estes exemplos não devem ser considerados como limitantes.Todas as percentagens são em peso e todas as proporções de mistura desolvente são por volume a menos que mencionado de modo diverso.Exemplo 1 - Método para Identificar Genes Que Conferem Resistência a2.4-D In Planta

Como um modo para identificar genes os quais possuematividades de degradação de herbicida in planta, é possível explorar bancosde dados públicos correntes tais como NCBI (National Center forBiotechnology Information). Para iniciar o processo, é necessário ter umaseqüência genética funcional já identificada que codifica uma proteína comas características desejadas (isto é, atividade de a-cetoglutaratodioxigenase). Esta seqüência de proteína é em seguida usada como oalgoritmo de input para o ferramenta BLAST (Basic Local Alignment SearchTool) (Altschul et al, 1997) para comparar contra seqüências de proteínasdepositadas no NCBI. Usando definições padrão, esta pesquisa retornaacima de 100 seqüências de proteínas homólogas em níveis variáveis. Estafaixa de altamente idêntica (85 a 98%) até identidade muito baixa (23 a 32%)no nível de aminoácidos. Tradicionalmente, se esperaria que somenteseqüências com alta homologia conservassem propriedades similares àseqüência de entrada. Neste caso, somente foram escolhidas seqüênciascom ≤50% de homologia. Conforme exemplificado aqui, neste requerimentode patente, clonagem e homólogos expressando recombinantemente comtão pouco quanto 31% de conservação de aminoácidos (relativos a tfdA deRalstonia eutropha) podem ser usados para conferir níveis comerciais deresistência não somente ao herbicida pretendido, mas também a substratosnunca testados previamente com estas enzimas.

Um único gene (sdpA) foi identificado a partir do banco de dadosNCBI (vide o website ncbi.nlm.nih.gov; N° de acesso AF516752) como umhomólogo com somente 31% de identidade de aminoácidos com tfdA.A percentagem de identidade foi determinada primeiro traduzindo ambas asseqüências de DNA sdpA e tfdA depositadsa no banco de dados paraproteínas, em seguida usando CIustaIW no pacote de software VectorNTIpara realizar o múltiplo alinhamento de seqüências.

Exemplo 2 - Otimização de Seqüência para Expressão em Plantas eBactérias

2.1 - Antecedentes

Para obter níveis mais altos de expressão de genes heterólogosem plantas, pode ser preferencial replanejar a seqüência codificandoproteína dos genes de maneira a que sejam expressados de modo maiseficiente em células vegetais. Milho é uma destas plantas onde pode serpreferencial re-desenhar a região codificando proteína heteróloga antes detransformação para aumentar o nível de expressão do gene e o nível deproteína codificada na planta. Portanto, uma etapa adicional no desenho degenes codificando uma proteína bacteriana é reengenharia de um geneheterólogo para ótima expressão.

Uma razão para a reengenharia de uma proteína bacterianapara expressão em milho é devido ao teor não ótimo de G+C do gene nativo.Por exemplo, o teor de G+C muito baixo de um ou mais muitos genesbacterianos nativos (e conseqüente tendendo para alto teor de A+T) resultana geração de seqüências simulando ou duplicando seqüências controle degene vegetal que se sabe que são altamente ricas em A+T. A presença dealgumas seqüências ricas em A+T dentro do DNA de um ou mais genesintroduzidos em plantas (por exemplo, regiões TATA box normalmenteencontradas em promotores genéticos) podem resultar em transcriçãoaberrante do um ou mais genes. Por outro lado, a presença de outrasseqüências regulatórias inerentes no RNAm transcrito (por exemplo,seqüências de sinal de poliadenilação (AAUAAA), ou seqüênciascomplementares a pequenos RNAs nucleares envolvidos em junção pré-RNAm) podem levar à instabilidade de RNA. Portanto, um objetivo no design degenes codificando uma proteína bacteriana para expressão de milho, mais preferencialmente referido como um ou mais genes otimizados para planta, égerar uma seqüência de DNA tendo um maior teor de G+C, epreferencialmente um próximo ao de genes de milho codificando para enzimasmetabólicas. Outro objetivo no design do um ou mais genes otimizados paraplanta codificando uma proteína bacteriana é gerar uma seqüência de DNA na qual as modificações de seqüência não impedem translação.

A Tabela 3 ilustra quão elevado o teor de G+C está em milho.Para os dados na Tabela 3, regiões codificantes dos genes foram extraídasdas inscrições do GenBank (Release 71), e composições básicas foramcalculadas usando o programa MacVector® (Accelerys, San Diego, Califórnia). Seqüências de íntron foram ignoradas nos cálculos._

Tabela 3: Compilação dos teores de G + C de regiões codificantes de proteínade genes de milho

Classe de Proteína a Faixa de % de G + C % Média de G + CbEnzimas Metabólicas (76) 44,4-75,3 59,0 (.+-.8,0)Proteínas Estruturais (18) 48,6-70,5 63,6 (.+-.6,7)Proteínas Regulatórias (5) 57,2-68,8 62,0 (.+-.4,9)Proteínas Não Caracterizadas (9) 41,5-70,3 64,3 (.+-.7,2)Todas as Proteínas (108) 44,4-75,3 60,8 (.+-.5,2)c

a Número de genes em classe dados entre parênteses.b Desvios padrão dados entre parênteses.c Média de grupos combinados ignorados em cálculo médio

Devido à plasticidade proporcionada pela redundância/degeneração do código genético (isto é, alguns aminoácidossão especificados por mais de um códon), a evolução dos genomas emdiferentes organismos ou classes de organismos resultou rm uso diferencialde códons redundantes. Esta "tendência de códon" é refletida nacomposição de base média de regiões codificantes de proteínas. Porexemplo, organismos com conteúdos de G+C relativamente baixos utilizamcódons tendo A ou T na terceira posição de códons redundante, ao passoque aqueles tendo maiores conteúdos de G+C utilizam códons tendo G ou Cna terceira posição. Imagina-se que a presença de códons "menores" dentrode um RNAm pode reduzir o índice de translação absoluto daquele RNAm,especialmente quando a relativa abundância do tRNA carregadocorrespondente ao menor códon é baixa. Uma extensão disto é que adiminuição do índice de translação por códons menores individuais seria nomínimo aditiva para múltiplos códons menores. Portanto, mRNAs tendoelavados conteúdos relativos de códons menores teriam índices detranslação correspondentemente baixos. Este índice seria refletido por níveisbaixos subseqüentes da proteína codificada.

Na engenharia de genes codificando uma proteína bacterianapara expressão em milho (ou outra planta, tal como algodão ou soja), foideterminada a tendência do códon da planta. A tendência do códon paramilho é a distribuição de códons estatística que a planta usa para codificarsuas proteínas e o uso de códons preferenciais é mostrado na Tabela 4.Depois de determinar a tendência, é determinada a percentagem dafreqüência dos códons no um ou mais genes de interesse. Os códonsprimários preferenciais pela planta devem ser determinados, bem como assegunda, terceira, e quarta escolhas de códons preferenciais quandoexistem múltiplas escolhas. Uma nova seqüência de DNA pode ser entãodesignada a qual codifica a seqüência amino da proteína bacteriana, mas anova seqüência de DNA difere da seqüência de DNA bacteriana nativa(codificando a proteína), mas a substituição dos códons da planta (primeiropreferencial, segundo preferencial, terceiro preferencial, ou quartopreferencial) para especificar o aminoácido em cada posição dentro daseqüência de aminoácidos da proteína. A nova seqüência é em seguidaanalisada para sítios enzimáticos de restrição que foram criados pelamodificação. Os sítios identificados são adicionalmente modificadossubstituindo os códons com primeiro, segundo, terceiro, ou quarto códonspreferenciais de escolha. Outros sítios na seqüência os quais podem afetar atranscrição ou translação do gene de interesse são as junções éxon : íntron(5' ou 3'), sinais de poli A adição, ou sinais de terminação de RNApolimerase. A seqüência é adicionalmente analisada e modificada parareduzir a freqüência de dubletos TA ou GC. Além dos dubletos, blocos deseqüências G ou C que têm mais de cerca de quatro resíduos que são osmesmos podem afetar a transcrição da seqüência. Portanto, estes blocostambém são modificados substituindo os códons de primeira ou segundaescolha, e etc, com o próximo códon de escolha preferencial.

Tabela 4. Códons de aminoácidos preferenciais para proteínas

<table>table see original document page 61</column></row><table>É preferencial que um ou mais genes otimizados para plantascodificando uma proteína bacteriana contenham cerca de 63% de códons deprimeira escolha, entre cerca de 22% a cerca de 37% de códons de segundaescolha, e entre cerca de 15% a cerca de 0% de códons de terceira ouquarta escolha, em que a percentagem total é 100%. Um ou mais genesotimizados para plantas preferenciais contêm cerca de 63% de códons deprimeira escolha, no mínimo cerca de 22% de códons de segunda escolha,cerca de 7,5% de códons de terceira escolha, e cerca de 7,5% de códons dequarta escolháTem que a percentagem total é 100%. O método descritoacima possibilita que uma pessoa versada na técnica modifique um ou maisgenes que são estranhos a uma planta em particular de modo que os genessão otimamente expressados em plantas. O método é adicionalmenteilustrado no requerimento de patente internacional PCT WO 97/13402.

Portanto, de modo a desenhar genes otimizados para plantacodificando uma proteína bacteriana, uma seqüência de DNA é designadapara codificar a seqüência de aminoácidos da proteína referida utilizando umcódigo genético redundante estabelecido de uma tabela de tendência decódon compilada a partir das seqüências de genes para a planta ou plantasem particular. A seqüência de DNA resultante tem um maior grau dediversidade de códons, uma composição de base desejável, pode contersítios de reconhecimento de enzima de retrição estrategicamente colocados,e carece de seqüências que podem interferir com a transcrição do gene, outranslação do RNAm do produto. Deste modo, genes sintéticos que sãofuncionalmente equivalentes às proteínas/genes da invenção em questãopodem ser usados para transformar hospedeiros, incluindo plantas.Orientação adicional referente à produção de genes sintéticos pode serencontrada, por exemplo, na Patente U. S. Nq 5.380.831.

2.2 - Análise de reconstrução de planta AAD-12

Análise extensiva dos 876 pares de bases (bp) da seqüência deDNA da região codificante AAD-12 nativa (SEQ ID N9: 1) revelou a presençade vários motivos de seqüências que são considerados prejudiciais paraexpressão vegetal ótima, bem como uma composição de códon não ótima. Aproteína codificada pela SEQ ID N°: 1 (AAD-12) é apresentada como SEQID N°: 2. Para melhorar a produção da proteína recombinante emmonocotiledôneas bem como dicotiledôneas, foi desenvolvida umaseqüência de DNA "otimizada para expressão em planta" AAD-12 (v1) (SEQID N°: 3) que codifica uma proteína (SEQ ID N°: 4) a qual é a mesma que aSEQ ID N°: 2 nativa exceto pela adição de um resíduo alanina na segundaposição (sublinhado na SEQ ID N°: 4). O códon de alanina adicional (GCT;sublinhado na SEQ ID N°: 3) codifica parte de um sítio de reconhecimentoenzimático de restrição Ncol (CCATGG) abarcando o códon de partidatranslacional ATG. Deste modo, serve o propósito duplo de facilitaroperações de clonagem subseqüentes, enquanto melhorando o contexto deseqüência circundando o códon de partida ATG para otimizar a iniciação detranslação. As proteínas codificadas pelas regiões codificantes nativas eotimizadas para expressão em planta (v1) são 99,3% idênticas, diferindosomente no número de aminoácidos 2. Em contraste, as seqüências de DNAnativas e otimizadas para expressão em planta (v1) das regiões codificantessão somente 79,7% idênticas. A Tabela 5 mostra as diferenças nascomposições de códons das seqüências nativas (Colunas A e D) eotimizadas para expressão em planta (Colunas B e E), e possibilitacomparação com uma seqüência otimizada para expressão em plantateorica (Colunas C e F).

<table>table see original document page 63</column></row><table>Tabela 5. Comparações de composições de códons de regioes codificantes de AAD-12 Nativo, Otimizada para Planta (v1) e uma versão Teórica Otimizada versão para Planta. <table>table see original document page 64</column></row><table>

É evidente a partir de exame da Tabela 5 que as regiõescodificantes nativas e otimizadas para expressão em planta, enquantocodificando proteínas quase idênticas, são substancialmente diferentesumas das outras. A versão Plant-Optimized (v1) simula intimamente acomposição de códons de uma região codificante otimizada para expressãoem planta teórica codificando a proteína AAD-12.2.3 Reconstrução para Expressão de E coli

Cepas de Escherichia coli especialmente produzidas e sistemasde vetores associados são freqüentemente usados para produzirquantidades relativamente grandes de proteínas para estudos bioquímicos eanalíticos. Algumas vezes se percebe que um gene nativo codificando aproteína desejada não é bem adequado para alto nível de expressão em E.coli, muito embora o organismo de origem para o gene possa ser outrogênero bacteriano. Em casos semelhantes é possível e desejável re-produzira região codificante de proteína do gene para tornar a mesma maisadequada para expressão em E. coli. Genes de E. coli Classe II sãodefinidos como aqueles que são altamente e continuamente expressadosdurante a fase de crescimento exponencial de células de E coli. (Henaut, A.and Danchin, A. (1996) em Escherichia coli and Salmonella typhimuriumcellular and molecular biology, vol. 2, pp. 2047-2066. Neidhardt, F., CurtissIII, R., Ingraham, J., Lin, E., Low, B., Magasanik, B., Reznikoff, W., Riley, M.,Schaechter, M. e Umbarger, H. (eds.) American Society for Microbiology,Washington, DC). Através do exame das composições de códons dasregiões codificantes de genes de E. coli Classe II, pode-se delinear umacomposição de códons média para estas regiões codificantes de genes deE coli Classe II. Imagina-se que uma região codificante de proteína tendouma composição de códons média simulando a dos genes Classe II seráfavorecida para expressão durante a fase de crescimento exponencial de Ecoli. Usando estas diretrizes, uma nova seqüência de DNA que codifica aproteína AAD-12 (SEQ ID N°: 4); incluindo a alanina adicional na segundaposição, conforme mencionado acima), foi designada de acordo com acomposição de códons média de regiões codificantes de genes de E coliClasse II. A seqüência inicial, cujo desenho foi baseado somente nacomposição de códons, foi adicionalmente produzida para incluir algumasseqüências de reconhecimento enzimático de restrição adequadas paraclonagem em vetores de expressão de E. coli. Características de seqüênciasprejudiciais tais como estruturas de stemloop altamente estáveis foramevitadas, assim como seqüências intragênicas homólogas à extremidade 3'do RNA ribossômico 16S (isto é, seqüências de Shine Dalgarno) Aseqüência otimizada para expressão em E. coli (v2) é revelada como SEQID N9: 5 e codifica a proteína revelada na SEQ ID Ne: 4.

As seqüências de DNA nativas e otimizadas para expressão emE. coli (v2) são 84,0% idênticas, ao passo que as seqüências de DNAotimizadas para expressão em planta (v1) e otimizadas para expressão emE coli (v2) são 76,0% idênticas. A Tabela 6 apresenta as composições decódons da região codificante nativa AAD-12 (Colunas A e D), uma regiãocodificante AAD-12 otimizada para expressão em E. co//'(v2; Colunas BeE)e a composição de códons de uma região codificante teórica para a proteínaAAD-12 tendo uma ótima composição de códons de genes de E coli ClasseII (Colunas C e F).

<table>table see original document page 66</column></row><table>Tabela 6. Comparações de composições de códons de regiões codificantes de AAD-12 Nativo, versão E. coli-Otimizada (v2) e uma versão Teórica E. coli Classe ll-Otimizada. <table>table see original document page 67</column></row><table>

É evidente a partir de exame da Tabela 6 que as regiõescodificantes nativas e otimizadas para expressão em E. coli, enquantocodificando proteínas quase idênticas, são substancialmente diferentesumas das outras. A versão otimizada para expressão em E. coli (v2) simulaintimamente a composição de códons de uma região codificante otimizadapara expressão em E. coli teórica codificando a proteína AAD-12.

2.4 - Desenho de uma seqüência de DNA códon propensa parasoja codificando um EPSPS de soja tendo mutações que conferemtolerância a qlifosato. Este exemplo ensina o desenho de uma novaseqüência de DNA que codifica uma 5-enolpiruvoilchiquimato 3-fosfatosintase (EPSPS) de soja mutado, mas é otimizada para expressão emcélulas de soja. A seqüência de aminoácidos de uma EPSPS de sojatriplamente mutada é revelada como SEQ ID N°: 5 da patente internacionalN° WO 2004/009761. Os aminoácidos mutados na seqüência assimrevelada estão no resíduo 183 (treonina de proteína nativa substituída comisoleucina), no resíduo 186 (arginina na proteína nativa substituída comlisina), e no resíduo 187 (prolina na proteína nativa substituída com serina).Portanto, pode-se deduzir a seqüência de aminoácidos da proteína EPSPSde soja nativa substituindo os aminoácidos substituídos de SEQ ID Ne: 5 dapatente internacional Ne WO 2004/009761 com os aminoácidos nativos nasposições apropriadas. A seqüência de proteína nativa é revelada como SEQID N°: 20 de PCT/US2005/014737 (depositado em 2 de maio de 2005). Umaseqüência de proteína EPSPS soja duplamente mutada, contendo umamutação no resíduo 183 (treonina de proteína nativa substituída comisoleucina), e no resíduo 187 (prolina na proteína nativa substituída comserina) é revelada como SEQ ID Ne: 21 de PCT/US2005/014737.

Uma tabela de uso de códons para seqüências codificandoproteína de soja (Glycine max), calculado a partir de 362.096 códons(aproximadamente 870 seqüências codificantes), foi obtida do site daInternet "kazusa.or.jp/codon". Os dados foram reformatados conformeapresentados na Tabela 7. As Colunas D e H da Tabela 7 apresentam asdistribuições (em % de uso para todos os códons para este aminoácido) decódons sinônimos para cada aminoácido, como visto nas regiões codificantesde proteína de genes de soja. É evidente que alguns códons sinônimos paraalguns aminoácidos (um aminoácido pode ser especificado por 1,2,3, 4, ou 6códons) estão presentes relativamente raramente em regiões codificantes deproteína de soja (por exemplo, uso comparado dos códons GCG e GCT paraespecificar alanina). Uma tabela de uso de códons propensos de soja foicalculada a partir dos dados na Tabela 7. Códons encontrados em genes desoja de menos de cerca de 10% de ocorrências totais para o aminoácidoparticular foram ignorados. Para equilibrar a distribuição das escolhas decódons restantes para um aminoácido, foi calculada uma representaçãomédia ponderada para cada códon, usando a fórmula:

% ponderada de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) χ %C1 χ 100onde C1 é o códon em questão, C2, C3, etc. representam os códonsinônimos restantes, e a % dos valores para os códons relevantes sãotomadas das colunas D e H da Tabela 7 (ignorando os valores de códonsraros em fonte em negrito). O valor da % ponderada para cada códon é dadonas Colunas C e G da Tabela 7. TGA foi escolhido arbitrariamente como oterminador de translação. As freqüências de uso de códons propensos foramentão introduzidas em uma tabela de código genético especializado para usopelo programa de desenho de gene OptGene® (Ocimum Biosolutions LLC,

Tabela 7. Representação de códons sinônimos em seqüências codificantes de proteína de soja, e cálculo de uma série de representação de códons propensos para design de gene sintético otimizado para soja.

<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>

*DNU = Não Usar

Para derivar uma seqüência de DNA otimizada para expressão emsoja codificando a proteína EPSPS duplamente mutada, a seqüência deproteína de SEQ ID N9: 21 de PCT/US2005/014737 foi reverso-traduzida peloprograma OptGerie® usando o código genético propenso para soja derivadoacima. A seqüência de DNA inicial derivada deste modo foi em seguidamodificada compensando alterações de códons (ao mesmo tempo queconservando a representação média ponderada global para os códons) parareduzir os números de dubletos CG e TA entre códons adjacentes, aumentar osnúmeros de dubletos CT e TG entre códons adjacentes, remover estruturassecundárias intra-filamento altamente estáveis, remover ou adicionar sítios dereconhecimento de enzimas de restrição, e remover outras seqüências quepodem ser prejudiciais para expressão ou manipulações de clonagem do geneproduzido. Refinamentos adicionais da seqüência foram feitos para eliminarpotenciais sítios de junção de íntrons de plantas, longas carreiras de resíduosA/T ou C/G, e outros motivos que podem interferir com a estabilidade de RNA,transcrição, ou translação da região codificante em células vegetais. Outrasalterações foram feitas para eliminar longas Estruturas de Leitura Abertainternas (frames diferentes de +1). Estas alterações foram todas feitas dentrodos limites de conservar a composição de códons propensos para sojaconforme descrito acima, e enquanto preservando a seqüência de aminoácidosrevelada como SEQ ID N9: 21 de PCT/US2005/014737.

A seqüência de DNA propensa para soja que codifica a proteínaEPSPS de SEQ ID N9: 21 é revelada como bases 1-1575 de SEQ ID N9: 22de PCT/US2005/014737. Foi realizada síntese de um fragmento de DNAcompreendendo SEQ ID N9: 22 de PCT/US2005/014737 por um fornecedorcomercial (PicoScript, Houston TX).Exemplo 3 - Clonagem de vetores de expressão e transformação3.1 Construção de vetor de expressão pET de E. coli.

Usando as enzimas de restrição correspondentes aos sítiosadicionados com os encadeadores de clonagem adicionais (Xba 1, Xho 1)AAD-12 (v2) foi cortado do vetor picoscript, e ligado em um vetor pET280resistente à estreptomicina/espectinomicina. Produtos ligados foram emseguida transformados em TOPIOF1 E. coli, e laminados sobre lâminas ágarde Luria Broth + 50 μg/ml de Estreptomicina e Espectinomicina (LB S/S).Para diferenciar entre ligações AAD-12 (v2) : pET280 e pCR2.1 :pET280, aproximadamente 20 colônias isoladas foram selecionadas para 6ml de LB-S/S, e cultivadas a 37°C por 4 horas com agitação. Cada cultura foiem seguida manchada sobre lâminas de LB + Canamicina 50 μg/ml) as quais foram incubadas a 37°C de um dia para o outro. Presumiu-se que ascolônias que crescem sobre as LB-K têm o vetor pCR2.1 ligado nestas, eforam descartadas. Plasmídeos foram isolados das culturas remanescentescomo antes, e verificados para correção com digestão por Xbal/Xhol. Aoconstructo de expressão final foi dada a designação pDAB3222. 3.2- Construção de vetor de expressão de Pseudomonas

A estrutura de leitura aberta AAD-12 (v2) foi inicialmente clonadano vetor de expressão pET modificado (Novagen), "pET280 S/S", como umfragmento Xbal - Xhol. O plasmídeo resultante pDAB725 foi confirmado comdigestão por enzima de restrição e reações de seqüenciamento. A estrutura de leitura aberta AAD-12 (v2) de pDAB725 foi transferida para o vetor deexpressão de Pseudomonas, pMYC1803, como um fragmento Xbal - Xhol.Colônias positivas foram confirmadas através de digestão por enzima derestrição. O constructo completado pDAB739 foi transformado nas cepas deexpressão de Pseudomonas MB217 e MB324. 3.3 - Completamento de vetores binários.

O gene AAD-12 (v1) otimizado para expressão em planta foirecebido da Picoscript (o desenho de reconstrução do gene foi completado(vide acima) e terceirizado para Picoscript para construção) e verificada aseqüência (SEQ ID Nº: 3) internamente, para confirmar que não estavam presentes alterações da seqüência esperada. As reações deseqüenciamento foram realizadas com iniciadores M13 dianteiros (SEQ IDNº: 6) e M13 Reversos (SEQ ID Nº: 7) usando os reagents do kit daBeckman Coulter "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit"como antes. Dados de seqüência foram analisados e os resultados indicaram que não havia anomalias presentes na seqüência de DNA AAD-12(v1) otimizada para expressão em planta. O gene AAD-12 (v1) foi clonadoem pDAB726 como um fragmento Nco I - Sac I. O constructo resultante foidesignado pDAB723, contendo: [AtUbiIO promotor: Nt OSM 5'UTR: AAD-12(v1): Nt OSM3'UTR: 0RF1 polyA 3'UTR] (verificado com um digesto derestrição Pvull e um digesto de restrição Not I). Um fragmento Not I-Not Icontendo o cassete descrito foi em seguida clonado no sítio Not I do vetorbinário pDAB3038. O vetor binário resultante, pDAB724, contendo o casseteseguinte [AtUbiIO promotor: Nt 0SM5'UTR: AAD-12 (v1): Nt OSM 3'UTR:ORF1 polyA 3'UTR: CsVMV promotor: PAT: ORF25/26 3'UTR] foi digeridopor restrição (com Bam Hl, Nco I, Not I, Saci, e Xmn I) para verificação daorientação correta. O constructo completado verificado (pDAB724) foi usadopara transformação em Agrobacterium (vide a seção 7.2).

3.4 - Clonagem de constructos de transformação adicionais.

Todos os outros constructos criados para transformação emespécies vegetais apropriadas foram construídos usando procedimentossimilares conforme previamente descrito aqui, neste requerimento de patente,e outros métodos de clonagem molecular de rotina (Maniatis et ai, 1982). ATabela 8 lista todos os constructos de transformação usados com promotoresapropriados e caracteristicas definidas, bem como a colheita transformada.

<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>

*Α = Arabidopsis

CsVMV = Promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca

ZmUbiI = Promotor de Ubiquitina 1 de Zea mays

T = Tabaco

AtUbiI 0 = Promotor de Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana

Hptll = higromicina fosfotransferase

S = Soja

Atubi3 = Promotor de Ubiquitina 3 de Arabidopsis thaliana

Ct = Algodão

AtAct2 = Promotor de Actina 2 de Arabidopsis thaliana

R = Arroz RB7

Marv2 = região associada a matriz de Nicotiana tabacum (MAR)

Cn = Milho Nt

Osm = Região Não traduzida 5' de Osmotina de Nicotiana tabacum e

a Região Não traduzida 3' de Osmotina de Nicotiana tabacum

Ca = CanolaExemplo 4 - Expressão e Purificação de AAD-12 (v2) Recombinante em

Pseudomonas fluorescens

4.1- Fermentação de Pseudomonas fluorescens

Para experimento de frasco de agitação, 200 μΙ de estoque deglicerol de Pseudomonas fluorescens cepa MB324 carregado AAD-12 (v2)constructo pDAB739 (sec 3.2) foi usado para inocular 50 ml de meio LBfresco suplementado com 30 μg/ml de tetraciclina/HCI. A cultura (em umfrasco Erlenmeyer defletido de 250 ml) foi incubada em um agitador (NewBrunswick Scientific Model Innova 44) a 300 rpm e 30°C por 16 horas. 20 mlde cultura de semente foram transferidos para 1 L de meio de cultura dePseudomonas fluorescens (extrato de levedura, 5 g/L; K2HPO4, 5 g/L;(NH4)2PO4, 7,5 g/L; (NH4)2SO4; MgS04-7H20, 1 g/L; KCI, 0,5 g/L; CaCI2-2H20, 0,5 g/L; NaCitrato-2H20, 15 g/L; Glicerol, 95 g/L; Solução deelementos traço, 10 ml/L; Solução de elementos traço: FeCl3-6H20, 5,4 g/L;MnCI2-4H20, 1 g/L; ZnS04-7H20, 1,45 g/L; CuS04-5H20, 0,25 g/L; H3BO3,0,1 g/L; (NH4)6MO7O2^ 0,1 g/L; HCI concentrado, 13 ml/L) suplementadacom 20 Mg/ml de tetraciclina/HCI e 250 μΙ de Pluronic L61 (antiespuma) emum frasco Erlenmeyer defletido de 2,8 L. As culturas foram incubadas a 30°Ce 300 rpm por 24 horas. Isopropil β-D-l-tiogalacto-piranosídeo (IPTG) foiadicionado a 1 mM final nas culturas e continuou a incubar poraproximadamente 48 horas a 252C. As células foram colhidas porcentrifugação a 7 krpm a 4-C por 15 minutos, e a pasta de elulas foiarmazenada a -809C ou imediatamente processada para purificação.

Para experimentos de tanque, 1 ml cada do estoque de glicerolfoi inoculado um frasco defletido de 1 L contendo 200 ml de meio LBsuplementado com 30 μg/ml de tetraciclina/HCI a 300 rpm e 32°C por 16 a24 horas. A cultura combinado dos três frascos (600 ml) foi em seguidaasseticamente transferida para um fermentador de 20 L (B. Braun BioreactorSystems) contendo 10 L de meio definido proprietário da Dow (através daTeknova, Hollister, CA) designado para suportar alto crescimento dadensidade celular. A temperatura de crescimento foi mantida a 32SC e o pHfoi controlado no ponto de ajuste desejado através da adição de amôniaaquosa. Oxigênio dissolvido foi mantido em um nível positivo na culturalíquida regulando o fluxo de ar aspergido e os índices de agitação. Oprocesso de fermentação alimentado em lote foi realizado poraproximadamente 24 horas até a densidade celular atingir 170 a 200 OD575.IPTG foi adicionado a 1 mM para induzir a expressão de proteínarecombinante e a temperatura foi reduzida e mantida a 25°C usandocirculação do suprimento de água fria. A fase de indução da fermentação foideixada para continuar por outras 24 horas. As amostras (30 ml) foramcoletadas para várias análises para Determinar a densidade celular e o nívelde expressão de proteína nos pontos de tempo de 6, 12, e 18 horas pós-indução. Ao final de uma rodada de fermentação, as células foram colhidaspor centrifugação a 10 krpm por 30 min. Os péletes celulares foramcongelados a -80°C para processamento adicional.

4.2- Purificação de AAD-12 (v2) para Caracterização Bioquímica e Produçãode Anticorpos

Aproximamente 100 a 200 g de células de Pseudomonascongeladas (ou frescas) foram degeladas e ressuspensas em 1 a 2 L detampão de extração contendo 20 mM de Tris-HCl, pH 8.5, e 25 ml decoquetel de inibidor de Protease (Sigma cat N° P8465). As células foramrompidas usando Microfluidizer (modelo M110L ou 110Y) (Microfluidics,Newton, MA) sobre gelo com uma passagem a 75,8 a 82,7 MPa (11.000 a12.000 psi). O lisado foi centrifugado a 24.000 rpm por 20 minutos.O sobrenadante foi transferido e dialisado contra 10 volumes de 20 mM deTris-HCl, pH 8.5 de um dia para o outro a 4°C, ou diafiltrado com estetampão e filtrado através de uma membrana de 0,45 μιτι antes de aplicar àsseparações de colunas. Todas as separações de proteínas subseqüentesforam realizadas usando Pharmacia AKTA Explorer 100 e operadas a 49C.Antes do carregamento, uma coluna Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia XK50/00, 500 ml de tamanho de leito) foi equilibrada com 20 mM de tampãoTris-HCl, pH 8,5. A amostra foi aplicada à coluna a 15 ml/minutos e emseguida lavada com este tampão até o elutriado OD2eo ter returnado à linhabasal. Proteínas foram elutriadas com 2 L de gradiente linear a partir de 0até 0,3 M de NaCI em um índice de fluxo de 15 ml/minutos, enquanto foramcoletadas frações de 45 ml. Frações contendo atividade de AAD-12conforme determinado pelo ensaio enzimático colorimétrico e tambémcorrespondentes ao peso molecular previsto da proteína AAD-12 (banda decerca de 32 kDa sobre SDS-PAGE) foram reunidas. Sulfato de amôniosólido para 0,5 M final foi adicionado à amostra, e em seguida aplicado auma coluna Phenyl HP (Pharmacia XK 50/20, 250 ml de tamanho de leito)equilibrada em 0,5 de M de sulfato de amônio em 20 mM de Tris-HCI, pH8,0. Esta coluna foi lavada com o tampão de ligação a 10 ml/minutos até aOü28o do elutriado ter returnado à linha basal, as proteínas foram elutriadasdentro de volumes de 2 coluna a 10 ml/minutos por um gradiente linear de0,5 M para 0 Sulfato de amônio em 20 mM de Tris-HCI, pH 8,0, e frações de12,5 ml foram coletadas. As frações do pico principal contendo AAD-12foram reunidas, e caso necessário, concentradas usando um dispositivo defiltro centrífugo de membrana de corte de 10 kDa MWCO (Millipore). Emalguns casos a amostra foi adicionalmente aplicada a uma coluna defiltração de gel Superdex 75 (Pharmacia XK 16/60, 110 ml de tamanho deleito) com tampão de PBS em um índice de fluxo de 1 ml/min. Frações depico contendo AAD-12 puro foram reunidas e armazenadas a -80 eC. Namaioria dos casos, a pureza da proteína AAD-12 é próxima de ou acima de99% depois de separação em duas etapas seqüencial de coluna de trocaiônica e coluna de interação hidrofóbica. Uma produção típica para AAD-12purificada é 12 a 18 mg/g de células a úmido. A amostra de proteína emvolume foi formulada em 20 mM de Tris-HCI, pH 8.0, 0,1 M de NaCIi 2 mMde DTT, e 1% de Trehalose por diafiltração, e Iiofilizado sobre o modeloVirtis Freezemobile Model 25EL (Virtis, Cardiner, NY) para armazenamentode longo termo.

A concentração de proteína foi inicialmente medida por teste deBradford usando o kit de teste Bio-Rad Protein (cat Nq 500-0006) comalbumina sérica bovina como padrão. Quando necessário, foi determinada aconcentração de proteína mais precisa usando hidrólise de aminoácidostotais. A amostra foi analisada em sistema Agilent 1100 HPLC (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA) com padrões de calibração de aminoácidos(cat N9 PN5061 -3330) adquirido da Agilent.

A atividade de AAD-12 foi determinada do início ao fim doprocessos para assegurar que não houvesse perda da atividade enzimáticapor cada tratamento e manipulação, conforme descrito no Exemplo 5 abaixo.A pureza protéica foi monitorada usando SDS-PAGE e cromatografia deexclusão de tamanho analítica. A amostra de proteína purificada foiadicionalmente verificada e confirmada por seqüenciamento de aminoácidos3è N-terminal, e foi demonstrado que consistia em resíduos esperadosAQTTLQITPT em seu N-término. A estabilidade protéica de curto e longotermo foi testada por atividade enzimática e por análise de gel nativo-PAGEe SDS-PAGE tanto sob condições não redutoras quanto redutoras. E foiobservado que AAD-12 é propensa a oligomerizaão através da formação deligação dissulfeto, portanto tipicamente 2 mM de DTT foi usado paraarmazenamento de proteína. Salina tamponada com fosfato (PBS) e Tris-buffer salina (TBS) foram testados para liofilização de proteína, com e sem apresença de 1% de trealose. Adicionalmente, o conteúdo de endotoxina econtaminante de DNA da amostra purificada foram medidosrespectivamente, e a integridade da proteína AAD-12 também foi avaliadapor análise de focalização isoelétrica (IEF).

Dez miligramas de AAD-12 (v2) purificada foi liberado para oZymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA) para produção deanticorpos policlonais de coelho. O coelho recebeu 5 injeções no período de5 semanas com cada injeção contendo 0,5 mg da proteína purificadasuspensa em 1 ml de Adjuvante de Freund completo. Os soros foramtestados tanto nos experimentos ELISA quanto de Western blotting paraconfirmar a especificidade e a afinidade antes de purificação por afinidade, econjugação de peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Zymed Lab Inc).Exemplo 5 - Testes in vitro da atividade de AAD-12

5.1 - Ensaio através de detecção colorimétrica de fenol.

A atividade enzimática foi medida por detecção colorimétrica doproduto fenólico usando um protocolo modificado do protocolo de Fukumorie Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) para permitir adisposição em um formato de microlâmina de 96 cavidades. O ensaiocolorimétrico foi descrito para uso na medição da atividade de dioxigenasesclivando 2,4-D e diclorprop para liberar o produto 2,4-diclorofenol.

A produção de cor de vários fenóis foi comparada à do 2,4-diclorofenolusando o método de detecção previamente descrito para determinar quaisprodutos fenólicos podem ser prontamente detectados. Fenóis e análogosfenólicos foram testados em uma concentração final de 100 μΜ em 0,15 mlde MOPS a 20 mM pH 6.75 contendo 200 μΜ de NH4(FeSO4)2T 200 μΜ deascorbato de sódio. Piridinóis derivados de fluroxipir e triclopir nãoproduziram cor significativa. A produção de cor de 2,4-diclorofenol foi linear eproporcional à concentração de fenol no teste até -500 μΜ. Uma curva decalibração realizada sob condições de teste padrão (160 μl de volume deteste final) indicou que uma absorvência a 510 nm de 0,1 foi obtida a partirde 17,2 μΜ de fenol.

Ensaios enzimáticos foram realizados em um volume total de0,16 ml de MOPS a 20 mM pH 6.75 contendo 200 μΜ de NH4FeSO4, 200 μΜde ascorbato de sódio, 1 mM de α-cetoglutarato, o substrato apropriado(adicionado de um estoque de 100 mM composto em DMSO), e enzima. Ostestes foram iniciados por adição do substrato de ariloxialcanoato, enzima ouα-cetoglutarato na hora zero. Depois de 5 minutos de incubação a 25°C, areação foi terminada por adição de 30 μΙ de uma mistura a 1:1:1 de 50 mMde Na EDTA; tampão pH 10 (3,09 g de ácido bórico + 3,73 g de KCI + 44 mlde 1 N KOH) e 0,2% de 4-aminoantipirina. Em seguida 10 μΙ de 0,8% deferricianeto de potássio foram adicionados e depois de 5 ou 10 minutos, aabsorvência a 510 nm foi registrada em uma leitora de microlâminasespectrofotométrica. As em branco continham todos os reagentes excetoenzima para ser responsável pela ligeira contaminação ocasional de algunsdos substratos por pequenas quantidades de fenóis.5.2 - Ensaio através e detecção de cloropiridinol

A ação de AAD-12 sobre substratos potenciais tais como oherbicida triclopir contendo uma piridina substituída (ao invés dos anéisbenzeno) liberará um piridinol na clivagem da ligação ariloxialcanoato.Piridinóis não foram detectados usando a detecção deaminoantipirina/ferricianeto fenol descrita na seção precedente. No entanto,foi visto que os cloropiridinóis do produto absorvem fortemente na faixapróxima à luz UV com Xmax de 325 nm em pH 7 (coeficiente de extinção~8,400 M¯1.cm¯1). Isto foi usado para criar um teste espectrofotométrico àbase de microlâminas contínuo. Os testes foram realizados em um volumetotal de 0,2 ml de MOPS a 20 mM pH 6.75 contendo 200 μΜ de NH4FeSO4,200 μΜ de ascorbato de sódio, 1 mM de α-cetoglutarato, o substratoapropriado (adicionado de um estoque de 100 mM composto em DMSO), eenzima. Os testes foram iniciados por adição do substrato deariloxialcanoato, enzima ou α-cetoglutarato ha hora zero e o aumento emabsorvência seguido por 10 minutos a 325 nm em uma leitora demicrolâminas. Os primeiros 2 minutos da reação foram usados paradeterminar índices iniciais. Uma curva de calibração realizada sob condiçõesde teste padrão (200 μΙ de volume de teste final) indicou que foi obtida umaabsorvência a 510 nm de 0,1 a partir de 11,9 μΜ de cloropiridinol.5.3 - Ensaio colorimétrico usando 2-(2-cloro,4-nitrofenóxi)propionato

Um teste conveniente de AAD-12 foi planejado usando 2-(2-cloro,4-nitrofenóxi)propionato (CNPP) como substrato. A clivagem de CNPPpor AAD-12 libera 2-cloro,4-nitrofenol. Este fenol tem uma absorvênciaamarela brilhante a 410 nm em pH 7 possibilitando que a reação sejaseguida continuamente ou por análise de desfecho. A presença da atividadede AAD-12 pode ser monitorada visualmente sem a necessidade de adiçãode reagentes adicionais. Testes espectrofotométricos à base demicrolâminas foram realizados em um volume total de 0,2 ml de MOPS a 20mM pH 6,75 contendo 200 μΜ de NH4FeSO4, 200 μΜ de ascorbato de sódio,1 mM de α-cetoglutarato, a quantidade apropriada de CNPP (adicionada deum estoque de 10 mM composto em DMSO), e enzima. Os testes foraminiciados por adição de CNPP, enzima, ou α-cetoglutarato na hora zero e oaumento na absorvência seguido por 10 min a 410 nm em uma leitora demicrolâminas. Os primeiros 2 minutos da reação foram usados paradeterminar os índices iniciais. Uma curva de calibração realizada sobcondições de teste padrão (200 μΙ de volume de teste final) indicou que umaabsorvência a 410 nm de 0,1 foi obtida a partir de 25,1 μΜ de 2-cloro, 4-nitrofenol. Usando este teste, as constantes cinéticas para CNPP como umsubstrato foram determinadas como sendo Km = 31 ± 5,5 μΜ e kcat = 16,2 ±0,79 min"1. _

Exemplo 6 - Atividade In vitro de AAD-12 sobre vários substratos

6.1 - Atividade de AAD-12 (v2) sobre (R.S)- diclorprop. (R)-diclorprop, (S)-diclorprop e 2.4-D

Usando o teste de detecção de fenol descrito no Exemplo 5.1,quatro fenoxialcanoatos foram testados em uma mistura de reação contendo4,4 μς de AAD-12 (v2) purificado. (R,S)-diclorprop (R1S-DP) foi testado a 1mM e (R)-diclorprop, (S)-diclorprop e 2,4-D foram testados a 0,5 mM. Osresultados são mostrados na Figura 3, a qual ilustra a atividADE DE AAD-12(v2) sobre 2,4-D e enantiômeros de diclorprop. 4,4 μς de AAD-12 (v2) foiincubado com 0,5 mM de substrato (1 mM para (R,S)-diclorprop) e a reaçãofoi iniciada por adição de D-cetoglutarato. Depois de 5 minutos, a reação foiextinta, e a absorvência a 510 nm foi determinada depois da adição dereagentes de detecção colorimétricos. O valor de base sem enzima foisubtraído.

AAD-12 (v2) tem excelente atividade sobre (R,S)-diclorprop e(S)-diclorprop e tem mínima atividade sobre (R)-diclorprop. Isto indica queAAD-12 (v2) tem uma nítida preferência (S)-enantiomérica. A atividade deAAD-12 (v2) sobre 2,4-D foi equivalente à atividade sobre (S)-diclorpropindicando que a enzima pode processar oxipropionato e oxiacetatosefetivamente.

6.2 - Atividade de AAD-12 (v2) sobre piridiloxialcanoatos

Usando o teste de piridinol descrito no Exemplo 5.2, cincopiridiloxialcanoatos foram testados a 1 mM em uma mistura de reaçãocontendo 6,8 μρ de AAD-12 purificado (v2). Os índices de cada reação forammonitorados e são apresentados na Tabela 9. Todos os cincopiridiloxialcanoatos foram clivados para liberar piridinóis por AAD-12 (v2). Osíndices para os substratos de oxipropionato 116844 e 91767 foram um tantomais rápidos do que os para os acetatos correspondentes (triclopir e 93833respectivamente) indicando uma preferência de AAD-12 (v2) por cadeiaslaterais de oxipropionato em relação a oxiacetato. Estes dados mostram queAAD-12 (v2) é capaz de degradar de modo eficaz herbicidas de

piridiloxialcanoato tais como triclopir.

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6.3 - Constantes cinéticas de AAD-12 (v2) para 2,4-D. (R.S)-DCP e triclopir

Os valores Km e kcat de AAD-12 (v2) purificado para osherbicidas 2,4-D, (R,S)-diclorprop e triclopir foram determinados usando ométodo de teste apropriado. Ocorreu inibição de substrato emconcentrações elevadas (>1 mM) de 2,4-D e (R1S)-DCP, portantoconcentrações abaixo disto foram usadas para ajustar os dados à equaçãode Michaelis-Menten usando Grafit 4.0 (Erithacus Software, Reino Unido).

Não foi observada inibição de substrato para triclopir até 2 mM. Asconstantes cinéticas estão resumidas na Tabela 10. A partir destes dados, ataxa de clivagem por AAD-12 (v2) de triclopir é -5% a de 2,4-D, sobcondições de velocidade máxima.

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* Devido à preferência (S)-enantiomérica de AAD-12, o valor de Km foicalculado presumindo que 50% da mistura racêmica estava disponível comoum substrato

Exemplo 7 - Transformação em Arabidopsis e Seleção7.1 - Condições de crescimento de Arabidopsis thaliana

Semente de Arabidopsis selvagem foi suspensa em umasolução a 0,1% de Agarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). A sementesuspensa foi armazenada a 4°C por 2 dias para completar requisitos dedormência e assegurar germinação de semente sincrônica (estratificação).

A mistura Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture, Bellevue,WA) foi coberta com fina vermiculita e subirrigada com solução de Hoaglandaté ficar úmida. A mistura de solo foi deixada para drenar por 24 horas.Semente estratificada foi semeada sobre a vermiculita e coberta com domosde umidade (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) por 7 dias.

As sementes foram germinadas e as plantas foram cultivadasem um Conviron (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled EnvironmentsLimited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dia longo (16 horasde luz/8 horas de escuridão) em uma intensidade luminosa de 120 a 150pmol/m2s sob constante (22°C) e umididade temperaturas (40 a 50%). Asplantas foram inicialmente regadas com solução de Hoagland esubseqüentemente com água deionizada para manter o solo úmido mas nãomolhado.

7.2 - Transformação de Aarobacterium

Uma lâmina de LB + ágar com eritromicina (Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO) (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L) contendo umacolônia DH5a raspada foi usada para proporcionar uma colônia para inocular4 ml de culturas miniprep (LB líquido + eritromicina). As culturas foramincubadas de um dia para o outro a 37°C com agitação constante. MiniPreparações de Spin Qiagen (Valencia, CA), realizadas segundo instruçõesdo fabricante, foram usados para purificar o plasmídeo de DNA.

Células de Agrobacterium tumefaciens eletrocompetentes(cepas Z707s, EHA1Ó1s, e LBA4404s) foram preparadas usando umprotocolo de Weigel e Glazebrook (2002). As células de Agrobacteriumcompetentes foram transformadas usando um método de eletroporaçãoadaptado de Weigel e Glazebrook (2002). 50 μΙ de células agrocompetentesforam degeladas sobre gelo e 10 a 25 ng do plasmídeo desejado foiadicionado às células. A mistura de DNA e células foi adicionada a cuvettesde eletroporação pré-geladas (2 mm). Um Eletroporador 2510 Eppendorf foiusado para a transformação com as seguintes condições, Voltagem: 2.4kV,Comprimento de pulso: 5 ms.

Depois de eletroporação, 1 ml de caldo YEP (por litro: 10 g deextrato de levedura, 10 g de Bacto-peptona, 5 g de NaCI) foi adicionada àcubeta, e a suspensão de células-YEP foi transferida para um tubo decultura de 15 ml. As células foram incubadas a 28°C e, um banho de águacom agitação constante por 4 horas. Depois da incubação, a cultura foilaminada sobre YEP + ágar com eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina(100 mg/L) e estreptomicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (250mg/L). As lâminas foram incubadas por 2 a 4 dias a 28°C.As colônias foram selecionadas e raspadas sobre lâminas deYEP fresco + ágar com eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina (100mg/L) e estreptomicina (250 mg/L) e incubadas a 28°C por 1 a 3 dias. Ascolônias foram selecionadas para análise PCR para verificar a presença doinserto genético usando iniciadores vetoriais específicos. Mini PreparaçõesSpin Qiagen, realizadas segundo as instruções do fabricante, foram usadaspara purifica o plasmídeo de DNA de colônias de Agrobacteriumselecionadas com a seguinte exceção: alíquotas de 4 ml de uma cultura deminiprep de 15 ml de um dia para o outro (YEP líquido + eritromicina (200mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L)) e estreptomicina (250 mg/L)) foramusadas para a purificação de DNA. Uma alternativa a usar Qiagen Spin MiniPrep DNA foi Iisar as células de Agrobacterium transformadas, suspensasem 10 μl de água, a 100°C por 5 minutos. Plasmídeo de DNA do vetorbinário usado na transformação de Agrobacterium foi incluído como umcontrole. A reação de PCR foi completada usando Taq DNA polymerase daTakara Mirus Bio Inc. (Madison, Wisconsin) seguindo as instruções dofabricante em concentrações de 0,5x. As reações de PCR foram realizadasem um MJ Research Peltier Thermal Cycler programado com as seguintescondições; 1) 94°C por 3 minutos, 2) 94°C por 45 segundos, 3) 55°C por 30segundos, 4) 72°C por 1 minuto, por 29 ciclos em seguida 1 ciclo de 72°Cpor 10 minutos. A reação foi mantida a 4°C depois de ciclagem. Aamplificação foi analisada por eletroforese por gel agarose a 1% evisualizada por tintura de brometo de etídio. Foi selecionada uma colôniacujo produto de PCR foi idêntico ao controle de plasmídeo.

7.3 - Transformação de Arabidopsis

Arabidopsis foi transformado usando o método de banho floral.A colônia selecionada foi usada para inocular um ou mais pré-culturas de 15a 30 ml de caldo YEP contendo eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina(100 mg/L) e estreptomicina (250 mg/L). A uma ou mais culturas foramincubadas de um dia para o outro a 28°C com agitação constante a 220 rpm.Cada pré-cultura foi usada para inocular duas culturas de 500 ml de caldoYEP contendo eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L) eestreptomicina (250 mg/L) e as culturas foram incubadas de um dia para ooutro a 28°C com agitação constante. As células foram em seguidapeletizadas em aprox. 8700x g por 10 minutos em temperatura ambiente, e osobrenadante resultante foi descartado. O pélete celular foi gentilmenteressuspenso em 500 ml de meio de infiltração contendo: 1/2x sais deMurashige e Skoog/vitaminas de B5 Gamborg, 10% (em peso/vol) desacarose, 0,044 μΜ de benzilamino purina (10 μΙ/litro de 1 mg/ml de estoqueem DMSO) e 300 μΙ/litro de Silwet L-77. Plantas de aproximadamente 1 mêsde idade foram mergulhadas no meio por 15 segundos, assegurando desubmergir a mais nova inflorescência. As plantas foram em seguida deitadasde lado e cobertas (transparente ou opaco) por 24 horas, em seguidalavadas com água, e colocadas em posição vertical. As plantas foramcultivadas a 22°C, com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas deescuridão. Aproximadamente 4 semanas depois do banho, as sementesforam colhidas.

7.4 - Seleção de plantas transformadas

Semente T1 recém-colhida [gene AAD-12 (v1)] foi deixada parasecar por 7 dias em temperatura ambiente. Semente Ti soi semeada embandejas de germinação de 26,5 χ 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), cada uma recebendo algumas alíquotas de 200 mg de semente Tiestratificada (-10.000 sementes) que tinham sido previamente suspensasem 40 ml de solução de agarose a 0,1% e armazenadas a 4°C por 2 diaspara completar requisitos de dormência e assegurar germinação desementes sincrônica.

A mistura Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue,WA) foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoaglandaté úmida, e em seguida deixada para drenar por gravidade. Cada alíquotade 40 ml de semente estratificada foi semeada uniformemente sobre avermiculita com uma pipeta e coberta com domos de umidade (KORDProducts, Bramalea, Ontario, Canadá) por 4 a 5 dias. Os domos foramremovidos 1 dia antes da seleção de transformante inicial usando spray pós-emergência de glufosinato (selecionando para o gene P/ATco-transformado).Sete dias depois do plantio (DAP) e novamente 11 DAP1 plantasT1 (estágio de cotiledônea e de 2 a 4 folhas, respectivamente) forampulverizadas com uma solução a 0,2% de herbicida Liberty (200 g ai/L deglufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de sprayde 10 ml/bandeja (703 L/ha) usando um bico de spray de ar comprimidoDeViIbiss para liberar um índice eficaz de 280 g ai/ha de glufosinato poraplicação. Os sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foramidentificados 4 a 7 dias depois da pulverização final e transplantadosindividualmente para dentro de potes de 7,62 cm (3 polegadas) preparadoscom meio para colocação em vaso (Metro Mix 360). As plantastransplantadas foram cobertas com domos de umidade por 3 a 4 dias ecolocadas dentro de uma câmara de crescimento a 22°C como antes oumovidas diretamente para a estufa. Em seguida, os domos foram removidose as plantas cultivadas dentro da estufa (22 ± 5°C, 50 ± 30% de umidadeambiente, 14 h de luz : 10 de escuridão, mínimo de 500 pE/m2s1 luz natural+ luz suplementai) no mínimo 1 dia antes da experimentação para acapacidade de AAD-12 (v1) (gene otimizado para expressão em planta) paraproporcionar resistência a herbicida de fenóxi auxina.

Plantas T1 foram em seguida atribuídas aleatoriamente a váriosíndices de 2,4-D. Para Arabidopsis, 50 g ae/ha de 2,4-D é uma dose eficazpara distinguir plantas sensíveis de plantas com níveis significativos deresistência. índices elevados também foram aplicados para determinarníveis relativos de resistência (50, 200, 800, ou 3200g ae/ha). As Tabelas 10e 11 mostram comparações feitas para um gene de resistência a herbicidade ariloxialcanoato (AAD-1 (v3)) previamente descrito emPCT/US2005/014737.

Todas as aplicações de herbicida de auxina foram feitas usandoo pulverizador DeVilbiss conforme descrito acima para aplicar um volume despray de 703 L/ha (0,4 ml de solução/pote de 7,62 cm (3 polegadas)) ouaplicadas por pulverizador de trilha em um volume de spray de 187 L/ha.2,4-D usado foi ou de grau técnico (Sigma, St. Louis, MO) dissolvido emDMSO e diluído em água (<1% de concentração final de DMSO) ou aformulação de sal de dimetilamina comercial (456 g ae/L, NuFarm1 StJoseph, MO). Diclorprop usado foi de grau comercial formulado como sal depotássio de R-diclorprop (600 g ai/L, AH Marks). À medida que os índices deherbicida aumentaram além de 800 g ae/ha, o pH da solução de spray setornou excessivamente acidífero, queimando as folhas de plantasArabidopsis jovens e tenras e complicando a avaliação dos efeitos primáriosdos herbicidas. Tornou-se prática de rotina aplicar estes índices elevados deherbicidas em 200 mM de tampão HEPES, pH 7.5.

Alguns indivíduos T1 foram submetidos a herbicidas comerciaisalternativos ao invés de uma fenóxi auxina. Um ponto de interesse foidetermar se os herbicidas de piridiloxiacetato auxina, triclopir e fluroxipir,podem ser efetivamente degradados in planta. Os herbicidas foramaplicados a plantas Ti com uso de um pulverizador de trilha em um volumede spray de 187 L/ha. Plantas T1 que apresentaram tolerância a 2,4-D DMAforam adicionalmente acessadas na geração T2.

7.5 - Resultados da seleção de plantas transformadas

As primeiras transformações de Arabidopsis foram conduzidasusando AAD-12 (v1) (gene otimizado para expressão em planta).Transformantes T1 foram primeiro selecionados da base de semente nãotransformada usando um esquema de seleção de glufosinato. Mais de300.000 sementes T1 foram triadas e 316 plantas resistentes a glufosinatoforam identificadas (gene PAT), eqüivalendo a uma freqüência detransformação/seleção de 0,10% a qual se situa na faixa normal dafreqüência de seleção de constructos onde PAT + Liberty são usados paraseleção. As plantas T1 selecionadas acima foram em seguida transplantadaspara potes individuais e pulverizadas com vários índices de herbicidas deariloxialcanoato comerciais. A Tabela 11 compara a reação de genes AAD-12 (v1) e genes controles para conferir resistência a 2,4-D a transformantesT1 de Arabidopsis. A reação é apresentada em termos de % de lesão visual2 WAT. Os dados são apresentados como um histograma de indivíduosapresentando pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%),ou lesão grave (>40%). Como cada T1 é um evento de transformaçãoindependente, pode-se esperar variação significativa de reações Tiindividuais dentro de um dado índice. Uma média aritmética e desvio padrãoé apresentada para cada tratamento. A faixa na reação individual também éindicada na última coluna para cada índice e transformação. Arabidopsistransformada com PAT/Cry1F serviu como um controle transformadosensível à auxina. O gene AAD-12 (v1) conferiu resistência a herbicida aplantas Arabidopsis T1 individuais. Dentro de um dado tratamento, o nível dereação das plantas variou bastante e pode ser atribuído ao fato de que cadaplanta representa um evento de transformação independente. Digno de nota,em cada índice de 2,4-D testado, houve indivíduos que não foram afetadosenquanto alguns foram severamente afetados. Uma média de lesãopopulacional global por índice é apresentada na Tabela 11 simplesmentepara demonstrar a significativa diferença entre as plantas transformadas comAAD-12 (v1) versus as plantas selvagens ou controles transformados comPAT/Cry1F. Os níveis de lesão tendem a ser maiores e a freqüência deplantas não danificadas foi menor em índices elevados até 3.200 g ae/ha (ou6x o índice de campo). Além disso nestes índices elevados, a solução despray se torna altamente acidífera a menos que tamponada. Arabidopsiscultivado principalmente na câmara de crescimento tem uma cutícula muitodelgada e graves efeitos de queimadura podem complicar a experimentaçãonestes índices elevados. Não obstante, muitos indivíduos sobreviveram a3.200 g ae/ha de 2,4-D com pouca ou nenhuma lesão.

Tabela 11. Reação de Arabidopsis Ti transformada com AAD-12 (v1) a uma faixa de índices de 2,4-Daplicado pós-emergência, comparado com uma população resistente homozigótica (T4) AAD-1 v3, ou umcontrole sensível à auxina transformado com Pat-Cry1F.

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A Tabela 12 mostra uma resposta a dose conduzida de modosimilar de Arabidopsis Ti ao ácido fenoxipropiônico, diclorprop. Os dadosmostram que o isômero (R-) herbicidamente ativo de diclorprop não servecomo um substrato adequado para AAD-12 (v1). O fato de que AAD-1metabolizará R-diclorprop suficientemente bem para conferir tolerânciacomercialmente aceitável é uma característica de diferenciação que separaos dois genes. (Tabela 12). AAD-1 e AAD-12 são considerados a-cetoglutarato dioxigenases R- e S-específicas, respectivamente.

Tabela 12. Reação de Arabidopsis Ti a uma faixa de índices de R-diclorprop aplicada pós-emergência.

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7.6 - AAD-12 (v1) como um marcador selecionável

A capacidade para usar AAD-12 (v1) como um marcadorselecionável usando 2,4-D como o agente de seleção foi analisadainicialmente com Arabidopsis transformado conforme descrito acima.

Aproximadamente 50 sementes de Arabidopsis da geração T4 (homozigóticapara AAD-12 (v1)) foram espetadas em aproximadamente 5.000 sementesselvagens (sensíveis). Vários tratamentos foram comparados, cada bandejade plantas recebendo ou um ou dois momentos de aplicação de 2,4-D emum dos seguintes esquemas de tratamento: 7 DAP, 11 DAP, ou 7 seguido por 11 DAP. Como todos os indivíduos também continham o gene PAT nomesmo vetor de transformação, AAD-12 selecionado com 2,4-D pode serdiretamente comparado com PATselecionado com glufosinato.

Os tratamentos foram aplicados com um bico de spray DeViIbissconforme previamente descrito. As plantas foram identificadas como Resistentes ou Sensíveis 17 DAP. O tratamento ótimo foi 75 g ae/ha de 2,4-D aplicado 7 e 11 dias depois do plantio (DAP), foi igualmente eficaz nafreqüência de seleção, e resultou em menos lesão por herbicida nosindivíduos transformados do que o esquema de seleção Liberty. Estesresultados indicam que AAD-12 (v1) pode ser usado de modo eficaz comoum marcador selecionável alternativo para uma população de Arabidopsistransformada.

7.7 - Hereditariedade

Uma variedade de eventos Ti foram autopolinizados paraproduzir semente T2. Estas sementes tiveram as progênies testadasaplicando 2,4-D (200 g ae/ha) a 100 parentes T2 aleatórias. Cada planta T2individual foi transplantada para potes de 7,5 cm quadrados antes daaplicação do spray (pulverizador de trilha em índice de aplicação de 187L/ha). Setenta e cinco por cento das famílias Ti (plantas T2) segregaram nomodelo previsto 3 Resistentes : 1 Sensível para um único Iocus herdadodominantemente com herança Mendeliana conforme determinado poranálise Qui quadrada (P > 0,05).

Foram colhidas sementes de 12 a 20 indivíduos T2 (semente T3).Vinte e cinco parentes T3 de cada uma de oito famílias T2 selecionadasaleatoriamente tiveram as progênies testadas conforme previamentedescrito. Aproximadamente um terço das famílias T2 previstas como sendohomozigóticas (populações não segregantes) foi identificado em cadalinhagem. Estes dados mostram que AAD-12 (v1) é integrado de modoestável e herdado em um modo Mendeliano para no mínimo três gerações.

7.8 - Resistência a herbicida de aplicações foliares adicionais emArabidopsis AAD-12

A capacidade de AAD-12 (v1) para proporcionar resistência aoutros herbicidas de ariloxialcanoato auxina em Arabidopsis transgênico foideterminada por aplicação foliar de vários substratos. Semente deArabidopsis da geração T2 foi estratificada, e semeada em bandejas deseleção muito semelhantes às de Arabidopsis (Exemplo 6.4). Uma linhagemcontrole transformada contendo PATe o gene de resistência a insetos CryIFfoi plantado em uma maneira similar. As mudas foram transferidas parapotes individuais de 7,62 cm (3 polegadas) na estufa. Todas as plantasforam pulverizadas com o uso de um pulverizador de trilha ajustado a 187L/ha. As plantas foram pulverizadas com uma série de herbicidas depiridiloxiacetato: 280 a 2240 g ae/ha de triclopir (Garlon 3A, DowAgroSciences) e 280 a 2240 g ae/ha de fluroxipir (Starane, DowAgroSciences); e o metabólito de 2,4-D resultante da atividade de AAD-12,2,4-diclorofenol (DCP, Sigma) (foi usado em um equivalente molar a 280 a2240 g ae/ha de 2,4-D, DCP grau técnico). Todas as aplicações foramformuladas em água. Cada tratamento foi replicado 3 a 4 vezes. As plantasforam avaliadas em 3 e 14 dias depois do tratamento.

Não há efeito do metabólito de 2,4-D, 2,4-diclorofenol (DCP),sobre Arabidopsis controle não-AAD-12 transgênico (Pat/Cry1F). Plantastransformadas com AAD-12 também foram claramente protegidas contralesão pelos herbicidas de triclopir e fluroxipir que foi vista nos controles nãoresistentes transformados (vide a Tabela 13). Estes resultados confirmamque AAD-12 (v1) em Arabidopsis proporciona resistência às auxinaspiridiloxiacéticas testadas. Este é o primeiro relatório de uma enzima comatividade significativa sobre herbicidas de ácido piridiloxiacético. Não foi

Tabela 13. Comparação da reação de plantas Arabidopsis T2 AAD-12 (v1) e controle transformadas a vários herbicidas auxínicos com aplicação foliar.

<table>table see original document page 93</column></row><table>Tabela 13. Comparação da reação de plantas Arabidopsis T2 AAD-12 (v1) e controle transformadas a vários herbicidas

<table>table see original document page 94</column></row><table>

* As plantas neste experimento foram atrofiadas e severamente epinásticas,mas permaneceram verdes e não receberam classificações de lesão > 75%.

7.9 - Análise molecular de AAD-12 (v1) Arabidoosis.

Teste Invader (métodos para procedimentos do kit Third WaveAgbio Kit Procedures) para análise do número de cópias do gene PAT foirealizado com DNA total obtido do kit Qiagen DNeasy sobre múltiplaslinhagens homozigóticas AAD-12 (v1) para determinar integração estável daunidade de transformação vegetal contendo PAT e AAD-12 (v1). A análisepresumiu ligação física direta destes genes uma vez que estavam contidossobre o mesmo plasmídeo.

Os resultados mostraram que todas as plantas resistentes a 2,4-D testadas, continham PAT(e portanto por inferência, AAD-12 (v1)). Análisedo número de cópias mostrou que insertos totais variaram de 1 a 5 cópias.Isto se correlaciona, também, com os dados de expressão de proteína AAD-12 (v1) indicando que a presença da enzima produz níveis significativamenteelevados de resistência a todos os ácidos fenoxiacéticos e piridiloxiacéticosdisponíveis comercialmente.

7.10 - Arabidoosis transformada com empilhamento molecular de AAD-12(v1) e um gene de resistência a qlifosato.

Semente de Arabidopsis Ti foi produzida, conforme previamentedescrito, contendo o plasmídeo pDAB3759 (AAD-12 (v1) + EPSPS) o qualcodifica um traço de resistência a glifosato putativo. Transformantes Tiforam selecionados usando AAD-12 (v1) como o marcador selecionávelconforme descrito no Exemplo 7.6. Plantas T1 (eventos transformadosindividualmente) foram recuperadas da primeira tentativa de seleção etransferidas para potes de 7,62 cm (7,62 cm (três polegadas)) dentro daestufa conforme previamente descrito. Três linhagens de Arabidopsiscontrole diferentes também foram testadas: Linhagens Columbia-Oselvagem, AAD-12 (v1) + PATT4 homozigóticas (pDAB724-transformada), elinhagem PAT + CryIF homozigótica (controle transformado). As plantastransformadas pDAB3759 e pDAB724 foram pré-selecionadas no estágio demuda para tolerância a 2,4-D. Quatro dias depois de serem transplantadas,as plantas foram uniformemente divididas para tratamento foliar porpulverizador de trilha conforme previamente descrito com 0, 26,25, 105, 420,ou 1680 g ae/ha de glifosato (Glyphomax Plus, Dow AgroSciences) emágua. Todos os tratamentos foram replicados 5 a 20 vezes. As plantas foramavaliadas 7 e 14 dias depois do tratamento.

Avaliação da resistência inicial indicou que plantas tolerantes a2,4-D foram subseqüentemente tolerantes a glifosato quando comparadascom a reação das três linhagens controle. Estes resultados indicam quepode ser conferida resistência às plantas a dois herbicidas com modos deação diferentes, incluindo tolerância a 2,4-D e glifosato, possibilitando aaplicação de ambos os herbicidas pós-emergência. Adicionalmente, AAD-12+ 2,4-D foi usado de modo eficaz como um marcador selecionável para umaseleção de resistência verdadeira.

Tabela 14. Reação de Arabidopsis T1 a uma série de índices de glifosato aplicados pós-

emergência (14 DAT).

<table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>

7.11 - Arabidopsis AAD-12 geneticamente empilhado com AAD-1 paraproporcionar amplo espectro de tolerância a herbicida

Plantas AAD-12 (v1) (pDAB724) e AAD-1 (v3) (pDAB721) foramcruzadas reciprocamente e semente F1 foi coletada. Oito sementes F1 foramplantadas e deixadas para crescer para produzir semente. Amostras detecido foram colhidas das oito plantas F1 e submetidas à análise Westernpara confirmar a presença de ambos os genes. Concluiu-se que todas as 8plantas testadas expressaram tanto proteínas AAD-1 quanto AAD-12. Asemente foi avolumada e deixada para secar por uma semana antes doplantio.

Cem sementes F2 foram semeadas e 280 g ai/ha de glufosinatofoi aplicado. Noventa e seis plantas F2 sobreviveram à seleção deglufosinato correspondendo a uma proporção de segregação esperada paradois Ioci classificando independentemente para resistência a glufosinato (15R : 1S). Plantas resistentes a glufosinato foram em seguida tratadas com560 g ae/ha de R-diclorprop + 560 g ae/ha de triclopir, aplicados às plantassob o mesmo regime de spray conforme usado pára a outra experimentação.As plantas foram graduadas em 3 e 14 DAT. Sessenta e três das 96 plantasque sobreviveram à seleção de glufosinato também sobreviveram àaplicação de herbicida. Estes dados são consistentes com um padrão desegregação esperado (9R: 6S) de dois traços dominantes classificando demodo independente onde cada gene proporciona resistência a somente umdos herbicidas auxínicos (ou R-dicIroprop ou triclopir). Os resultados indicamque AAD-12 (pDAB724) pode ser empilhado com sucesso com AAD-1(pDAB721), deste modo aumetando o espectro de herbicidas que podem seraplicados na colheita de interesse [(2,4-D + R-diclorprop) e (2,4-D + fluroxipir+ triclopir), respectivamente]. Isto pode ser útil para proporcionar tolerância a2,4-D a uma espécie muito sensível através de empilhamento convencionalde dois genes de resistência a 2,4-D isolados. Adicionalmente, se qualquergene for usado como um marcador selecionável para um terceiro e quartogenes de interesse através de atividades de transformação independentes,então cada par de genes pode ser trazido junto através de atividades dereprodução convencional e subseqüentmente selecionados na geração F1através de sprays pareados com herbicidas que são exclusivos entre asenzimas AAD-1 e AAD-12 (conforme mostrado com R-diclorprop e triclopirpara AAD-1 e AAD-12, respectivamente, acima).

Outros empilhamentos AAD também estão dentro do âmbito dainvenção em questão. A proteína TfdA discutida alhures aqui, nesterequerimento de patente, (Streber et ai), por exemplo, pode ser usada juntocom os genes AAD-12 em questão para conferir espectros de resistência aherbicida mais novos em plantas transgênicas da invenção em questão.Exemplo 8 - Transformação de milho mediada por WHISKERS usandoseleção por imazetapir8.1 - Clonagem de AAD-12 (v1).

O gene AAD-12 (v1) foi cortado do vetor intermediáriopDAB3283 como um fragmento Nco1/Sac1. Este foi ligado direcionalmenteno vetor pDAB3403 similarmente cortado contendo o promotor demonocotiledônea ZmUbiI. Os dois fragmentos foram ligados juntos usandoT4 DNA Iigase e transformados em células DH5a. Minipreps foramrealizados sobre as colônias resultantes usando kit QIA Spin mini prep daQiagen, e as colônias foram digeridas para verificar a orientação. Esteprimeiro constructo intermediário (pDAB4100) contém o cassete ZmUbiI :AAD-12 (v1). Este constructo foi digerido com Notl e Pvul para liberar ocassete genético e digerir a espinha dorsal indesejada. Isto foi ligado apDAB2212 cortado Not1, o qual contém o marcador selecionável AHASdirigido pelo promotor dé Actina de arroz OsActI. O constructo final foidesignado pDAB4101 ou pDAS1863, e contém ZmUbijI/AAD-12(v1 j/Zm Per5: :0sAct1 /AHAS /LZm Lip.8.2 - Iniciação de calo/suspensão.

Para obter embriões imaturos para iniciação da cultura de calo,foram realizados cruzamentos Fi entre as matrizes Hi-Il AeB cultivadas emestufa (Armstrong et al. 1991). Quando os embriões tinham 1,0 a 1,2 mm detamanho (aproximadamente 9 a 10 dias pós-polinização), as espigas foramcolhidas e esterilizadas superficialmente esfregando com sabão Liqui-Nox®,imersas em etanol a 70% por 2 a 3 minutos, e em seguida imersas emalvejante comercial a 20% (0,1% de hipoclorito de sódio) por 30 minutos.

As espigas foram enxaguadas em água destilada estéril, eembriões zigóticos imaturos foram excisados asseticamente e cultivadossobre meio 15Ag10 (Meio N6 (Chu et al., 1975), 1,0 mg/L de 2,4-D, 20 g/Lde sacarose, 100 mg/L de hidrolisado de caseína (digesto enzimático), 25mM de L-prolina, 10 mg/L de AgNO3,2,5 g/L de Gelrite, pH 5.8) por 2 a 3semanas com o escutelo virado para longe do meio. Tecido mostrando amorfologia apropriada (Welter et ai, 1995) foi transferido seletivamente emintervalos bissemanais para sobre meio fresco 15Ag10 por cerca de 6semanas, em seguida transferido para meio 4 (Meio N6, 1,0 mg/L de 2,4-D,20 g/L de sacarose, 100 mg/L de hidrolisado de caseína (digestoenzimático), 6 mM de L-prolina, 2,5 g/L de Gelrite, pH 5.8) em em intervalosbissemanais por aproximadamente 2 meses.

Para iniciar culturas de suspensões embriogênicas,aproximadamente 3 ml de volume celular acumulado (PCV) de tecido decalo originário de um único embrião foi adicionado a aproximadamente 30 mlde meio líquido H9CP+ (mistura salina basal MS (Murashige e Skoog, 1962),Vitaminas MS modificadas contendo 10 vezes menos ácido nicotínico e 5vezes superior tiamina-HCI, 2,0 mg/L de 2,4-D, 2,0 mg/L de ácido □-naftalenoacético (NAA), 30 g/L de sacarose, 200 mg/L de hidrolisado decaseína (digesto ácido), 100 mg/L de myo-inositol, 6 mM de L-prolina, 5%em v/v de água de coco (adicionada logo antes da subcultura), pH 6.0). Asculturas da suspensão foram mantidas sob condições de escuro dentro defrascos Erlenmeyer de 125 ml em um agitador de de temperatura controladaajustado a 125 rpm em 28°C. As linhagens celulares tipicamente setornaram estabelecidas dentro de 2 a 3 meses depois da iniciação. Duranteo estabelecimento, as suspensões foram subcultivadas a cada 3,5 diasadicionando 3 ml de PCV de células e 7 ml de meio condicionado a 20 ml demeio líquido H9CP+ fresco usando uma pipeta de orifício largo. Uma vezque o tecido começou a dobrar o crescimento, as suspensões foramreduzidas proporcionalmente e mantidas dentro de frascos de 500 ml pelosquais 12 ml de PCV de células e 28 ml de meio condicionado foi transferidopara 80 ml de meio H9CP+. Uma vez que as suspensões foram plenamenteestabelecidas, foram criopreservadas para uso futuro.

8.3 - Criopreservacão e degelo de suspensões .

Dois dias pós-subcultura, 4 ml de PCV de células da suspensão

e 4 ml de meio condicionado foram adicionados a 8 ml de crioprotetor(dissolvido em meio H9CP+ sem água de coco, 1 M de glicerol, 1 M deDMSO, 2 M de sacarose, esterilizado por filtro) e deixado para agitar a 125rpm em 4°C por uma hora em um frasco de 125 ml. Depois de uma hora 4,5ml foi adicionado a um crio frasco Corning de 5,0 ml gelado. Uma vez quefrascos individuais preenchidos foram mantidos por 15 minutos a 4°C em um freezer de índice controlado, em seguida deixados para congelar em umíndice de -0,5°C/minuto até atingir uma temperatura final de -40°C. Depoisde atingir a temperatura final, os frascos foram transferidos para caixasdentro de prateleiras dentro de uma unidade de armazenamento Cryoplus 4(Forma Scientific) enchida com vapores de nitrogênio líquido.

Para degelo, os frascos foram removidos da unidade dearmazenamento e colocados em um recipiente de gelo seco fechado, emseguida mergulhados em um banho de água mantido em 40 a 45°C até a"ebulição" ceder. Quando degelados, os conteúdos foram vertidos sobre umempilhamento de ~8 papéis-filtro Whatman estéreis de 70 mm (No. 4) em placas de Petri cobertas de 100x25 mm. O líquido foi deixado para absorverdentro dos filtros por vários minutos, em seguida o filtro superior contendo ascélulas foi transferido para meio GN6 (meio N6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L desacarose, 2,5 g/L de Gelrite, pH 5.8) por uma semana. Depois de umasemana, somente tecido com morfologia promissora foi transferido do papel- filtro diretamente sobre meio fresco GN6. Este tecido foi subcultivado a cada7 a 14 dias até 1 a 3 gramas estava disponível para iniciação da suspensãoem aproximadamente 30 ml de meio H9CP+ dentro de frascos Erlenmeyerde 125 ml. Três mililitros de PCV foi subcultivado em meio fresco H9CP+ acada 3,5 dias até um total de 12 ml de PCV ser obtido, ponto no qual ocorreu subcultura conforme descrito previamente.

8.4 - Transformação Estável

Aproximadamente 24 horas antes da transformação, 12 ml dePCV de células da suspensão de milho embriogênico previamentecriopreservado mais 28 ml de meio condicionado foram subcultivados em 80 ml de meio líquido GN6 (meio GN6 deficiente Gelrite) dentro de um frascoErlenmeyer de 500 ml, e colocado sobre um agitador a 125 rpm em 28°C.Isto foi repetido 2 vezes usando a mesma linhagem celular de tal modo queum total de 36 ml de PCV foi distribuído através de 3 frascos. Depois de 24horas o meio líquido GN6 foi removido e substituído com 72 ml de meioosmótico GN6 S/M (Meio N6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarose, 45,5g/L de sorbitol, 45,5 g/L de manitol, 100 mg/L de myo-inositol, pH 6.0) porfrasco de modo a plasmolisar as células. Os frascos foram colocados sobreum agitador agitado em 125 RPM no escuro por 30 a 35 minutos a 28°C, edurante este tempo uma suspensão de 50 mg/ml de whiskers de carburetode silício foi preparada adicionando o volume apropriado de 8,1 ml de meiolíquido GN6 S/M a -405 mg de whiskers de carbureto de silício esterilizadospré-autoclavados (Advanced Composite Materials, Inc.).

Depois de incubação em GN6 S/M, os conteúdos de cada frascoforam reunidos dentro de um frasco de centrífuga de 250 ml. Assim quetodas as células sedimentaram no fundo, tudo porém ~14 ml de líquido GN6S/M foram decantados e coletados dentro de um frasco estéril de 1 L parauso futuro. A suspensão pré-umedecida de whiskers foi turbilhonada por 60segundos em velocidade máxima e 8,1 ml foi então adicionado ao frasco, aoqual 170 pg de DNA foi adicionado como uma última etapa. O frasco foiimediatamente colocado em um misturador de tinta comercial Red Devil5400 modificado e agitado por 10 segundos. Depois de agitação, o coquetelde células, meio, whiskers e DNA foi adicionado aos conteúdos do frasco de1 L junto com 125 ml de meio líquido fresco GN6 para reduzir o osmoticante.As células foram deixadas para recuperar sobre um agitador a 125 RPM porduas horas a 28°C antes de serem filtradas sobre papel-filtro Whatman Ne 4(5,5 cm) usando uma unidade coletora de célula de vidro que estavaconectada a uma linha de vácuo doméstico.

Aproximadamente 2 ml de suspensão dispersada foi pipetadasobre a superfície do filtro enquanto o vácuo foi extraído. Os filtros foramcolocados sobre lâminas de 60 χ 20 mm de meio GN6. As lâminas foramcultivadas por uma semana em 28º C dentro de uma caixa escura.

Depois de uma semana, os papéis-filtro foram transferidos paralâminas de 60x20 mm de meio GN6 (3P) (Meio N6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30g/L de sacarose, 100 mg/L de myoinositol, 3 μΜ de imazetapir da Pursuit®DG1 2,5 g/L de Gelrite, pH 5.8). As lâminas foram colocadas dentro de caixase cultivadas por uma semana adicional.

Duas semanas pós-transformação, o tecido foi embutidoraspando todas as células sobre a lâmina dentro de 3,0 ml de meio agaroseGN6 fundido (meio N6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarose, 100 mg/L demyo-inositol, 7 g/L de agarose Sea Plaque, pH 5.8, autoclavado por somente10 minutos a 121 °C) contendo 3 μΜ de imazetapir da Pursuit® DG. O tecidofoi rompido e os 3 ml de agarose e tecido foram vertidos uniformementesobre a superfície de uma lâmina de 100 χ 15 mm de GN6 (3P). Isto foirepetido para todas as lâminas restantes. Assim que embutido, as lâminasforam seladas individualmente com Nescofilm® ou Parafilm M®, e emseguida cultivadas até aparecerem isolados putativos.8.4.1- Protocolo para recuperação e regeneração de Isolados

Eventos putativamente transformados foram isolados daslâminas embutidas contendo Pursuit® aproximadamente 9 semanas pós-transformação transferindo para meio de seleção fresco da mesmaconcentração em lâminas de 60 χ 20 mm. Se foi evidente crescimentosustentado depois de aproximadamente 2 a 3 semanas, o evento foiconsiderado resistente e foi submetido a análise molecular.

A regeneração foi iniciada transferindo tecido de calo para ummeio de indução à base de citocinina, 28 (3P), contendo 3 μΜ de imazetapirda Pursuit® DG1 vitaminas e sais de MS, 30,0 g/L de sacarose, 5 mg/L deBAP, 0,25 mg/L de 2,4-D, 2,5 g/L de Gelrite; pH 5.7. As células foramdeixadas para crescer em baixa luz (13 OEm'2s"1) por uma semana, emseguida mais luz (40 DEm 2S"1) por outra semana, antes de seremtransferidas para meio de regeneração, 36 (3P), o qual foi idêntico a 28 (3P)exceto que careceu de reguladores de crescimento vegetal. Pequenas (3 a 5cm) plântulas foram removidas e colocadas dentro de tubos de cultura de150 χ 25 mm contendo meio SHGA livre de seleção (vitaminas e sais basaisde Schenk e Hildebrandt, 1972; 1 g/L de myo-inositol, 10 g/L de sacarose,2,0 g/L de Gelrite, pH 5.8). Assim que as plântulas desenvolveram umsistema de raiz e broto suficiente, foram transplantadas para terra na estufa.De 4 experimentos, plântulas plenas, consistindo em um broto eraiz, foram formadas in vitro sobre as lâminas de seleção embutidas sobcondições de escurição sem sofrerem uma fase de calo tradicional. O tecidodas folhas de nove destes "regeneradores precoces" foram submetidos aPCR da região codificante e PCR da unidade de transcrição vegetal (PlantTranscription Unit, PTU) para o gene AAD-12 e cassete genético,respectivamente. Todos tinham uma região codificante AAD-12 intacta,enquanto 3 não tinham uma PTU de extensão total (Tabela 15). Estes"regeneradores precoces" foram identificados como 4101 eventos paradiferenciar os mesmos dos eventos derivados tradicionalmente, os quaisforam identificados como eventos "1283". Plantas de 19 eventos adicionais,obtidas através de seleção padrão e regeneração, foram enviados para aestufa, cultivados até a maturidade e polinizados por cruzamento com umalinhagem endógama proprietária de modo a produzir semente T1. Alguns doseventos parecem ser clones uns dos outros devido a padrões de formaçãode bandas similares após Southern blot, de modo que somente 14 eventosúnicos foram representados. Plantas T0 dos eventos foram tolerantes a 70g/ha de imazetapir. Análise Invader (gene AHAS) indicou complexidade deinserção variando de 1 a >10 cópias. Treze eventos continham a regiãocodificante compete para AAD-12; no entanto, análise adicional indicou quea unidade de transformação vegetal completa não tinha sido incorporadapara nove eventos. Nenhum dos 1863 eventos comprometidos foi avançadoalém do estágio T1 e caracterização adicional utilizou os 4101 eventos.

8.5- Análise Molecular: Materiais e Métodos de Milho

8.5.1 - Isolamento e quantificação de DNA de cultura de tecido. Tecidofresco é colocado dentro de tubos e Iiofilizado a 4SC por 2 dias. Depois dotecido ser totalmente secado, uma conta de tungstênio (VaIenite) é colocadadentro do tubo e as amostras são submetidas a 1 minuto de trituração aseco usando um moinho de esferas Kelco. O procedimento de isolamento deDNA DNeasy padrão é seguido em seguida (Qiagen, DNeasy 69109). Umaalíquota do DNA extraído é em seguida corada com Pico Green (MolecularProbes P7589) e lida no fluorômetro (BioTek) com padrões conhecidos paraobter a concentração em ng/μΙ.

8.5.2 - Análise do teste Invader. As amostras de DNA sãodiluídas para 20 ng/μl em seguida desnaturadas por incubação em umtermociclador a 95°C por 10 minutos. Em seguida a mistura Signal Probe épreparada usando a oligo mistura proporcionada e MgCI2 (Third WaveTechnologies). Uma alíquota de 7,5 μl é colocada dentro de cada cavidadeda lâmina de teste Invader seguida por uma alíquota de 7,5 μl de controles,padrões, e 20 ng/μl de amostras desconhecidas diluídas. Cada cavidade érevestida com 15 μl de óleo mineral (Sigma). As lâminas são em seguidaincubadas a 63°C por uma hora e lidas no fluorômetro (Biotek). O cálculo da% de sinal sobre a base para a sonda alvo dividido pela % de sinal sobresonda controle interna de base calculará a proporção. A proporção depadrões de cópia conhecidos desenvolvidos e validados com análiseSouthern blot é usada para identificar a cópia estimadados eventosdesconhecidos.

8.5.3 - Reação de cadeia polimerase. Um total de 100 ng deDNA total é usado como o modelo. 20 mM de cada iniciador é usado com okit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Iniciadores para oAAD-12 (v1) PTU são dianteiro - GAACAGTTAGACATGGTCTAAAGG(SEQ ID Ne: 8) e Reverso - GCTGCAACACTGATAAATGCCAACTGG (SEQID N9: 9). A reação de PCR é realizada no termociclador 9700 Geneamp(Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C por 3 minutos e 35ciclos de 94°C por 30 segundos, 63°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minutoe 45 segundos seguidos por 72°C por 10 minutos.

Iniciadores para PCR de Região Codificante AAD-12 (v1) sãodianteiro - ATGGCTCAGACCACTCTCCAAA (SEQ ID Ns: 10) e Reverso -AGCTGCATCCATGCCAGGGA (SEQ ID NQ: 11). A reação de PCR érealizada no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems),submetendo as amostras a 94°C por 3 minutos e 35 ciclos de 94°C por 30segundos, 65°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto e 45 segundosseguidos por 72°C por 10 minutos. Os produtos de PCR são analisados poreletroforese sobre um gel agarose a 1% corado com EtBr.8.5.4 - Análise Southern blot

Análise Southern blot é realizada com DNA genômico obtido dokit Qiagen DNeasy. Um total de 2 pg de DNA de folha genômica ou 10 pg deDNA de calo genômico é submetido a uma digestão de um dia para o outrousando enzimas de restrição BSM I e SWA I para obter dados de PTU.

Depois da digestão de um dia para o outro uma alíquota de -100ng é passada sobre um gel a 1% para assegurar completa digestão. Depoisdesta certeza as amostras são passadas sobre um largo gel agarose a 0,85% de um dia para o outro a 40 volts. O gel é em seguida desnaturado em 0,2M de NaOH, 0,6 M de NaCI por 30 minutos. O gel é em seguida neutralizadoem 0,5 M de Tris HCI, 1,5 M de NaCI pH de 7.5 por 30 minutos. Um aparelhode gel contendo 20x SSC é em seguida ajustado para obter umatransferência de gel de gravidade para membrana de náilon (MilliporeINYC00010) de um dia para o outro. Depois da transferência de um dia parao outro a membrana é em seguida submetida à luz UV através de umreticulador (Stratagene UV stratalinker 1800) a 1200 X100 microjoules. Amembrana é em seguida lavada em 0,1% de SDS, 0,1 SSC por 45 minutos.Depois da lavagem de 45 minutos, a membrana é cozida por 3 horas a 80°Ce em seguida armazenada a 49C até hibridização. O fragmento modelo dehibridização é preparado usando o PCR da região codificante acima usandoplasmídeo de DNA. O produto é passado sobre um gel agarose a 1% eexcisado e em seguida extraído com gel usando o procedimento de extraçãopor gel Qiagen (28706). A membrana é em seguida submetida a uma etapade pré-hibridização a 609C por uma hora em tampão Perfect Hyb (SigmaH7033). O procedimento de marcação Prime it RmT dCTP rxn (Stratagene300392) é usado para desenvolver a sonda à base de p32 (Perkin Elmer). Asonda é limpada usando as colunas Probe Quant. G50 (Amersham 27-5335-01). Dois milhoões de contagens de CPM são usadas para hibridizar osSouthern blots de um dia para o outro. Depois da hibridização de um diapara o outro os blots são em seguida submetidos a duas lavagens de 20minutos a 65°C em 0,1% de SDS, 0,1 SSC. Os blots são em seguidaexpostos a filme de um dia para o outro, incubando a -80°C.8.6 - Tolerância a Herbicida Pós-emerqência em Milho T0 transformado comAAD-12

Quatro eventos T0 foram deixados para aclimatar na estufa eforam cultivados até 2 a 4 folhas novas de aparência normal terem surgidodo verticilo (isto é, as plantas terem passado de cultura de tecido paracondições de crescimento em estufa). As plantas foram cultivadas a 27°Csob condições de 16 horas de luz : 8 horas de escuridão na estufa. Emseguida, as plantas foram tratadas com formulações comerciais de ouPursuit® (imazetapir) ou 2,4-D Amina 4. Pursuit® foi pulverizado parademonstrar a função do gene marcador selecionável presente dentro doseventos testados. Foram feitas aplicações de herbicida com um pulverizadorde trilha em um volume de spray de 187 L/ha, spray de 50 cm de altura. Asplantas foram pulverizadas com ou uma dose letal de imazetapir (70 g ae/ha)ou um índice de 2,4-D de sal de DMA capaz de lesão significativa emlinhagens de milho não transformadas (2240 g ae/ha). Uma dose letal édefinida como o índice que causa >95% de lesão para o endógamo Hi-II. Hi-II e a base genética dos mutantes da presente invenção.

Vários indivíduos foram safened contra os herbicidas para osquais os respectivos genes deviam proporcionar resistência. O cloneindividual '001' do evento "001" (a.k.a.,4101(0)-001-001), no entanto, nãoincorre em lesão menor, mas recuperou por 14 DAT. Três dos quatroeventos foram movidos para diante e os indivíduos foram cruzados com5XH751 e levados para a próxima geração. Cada planta tolerante aherbicida foi positiva para a presença da região codificante AAD-12 (teste dePCR) ou a presença do gene AHAS (teste Invader) para plantas tolerantes a2,4-D e imazetapir, respectivamente. A proteína AAD-12 foi detectada emtodos os eventos de plantas T0 tolerantes a 2,4-D contendo uma regiãocodificante intacta. O número de cópias do um ou mais transgenes (AHAS, epor inferência AAD-12) variou significativamente de 1 a 15 cópias. Plantas T0individuais foram cultivadas até a maturidade e polinizadas por cruzamentocom uma linhagem endógama proprietária de modo a produzir semente T1.Tabela 15. Caracterização de plantas de milho To transformadas com AAD-12. <table>table see original document page 107</column></row><table>

8.7 - Verificação de alta tolerância a 2.4-D em milho Ti

Sementes AAD-12 (v1) Ti foram plantadas dentro de potes de7,62 cm (3 polegadas) contendo meio Metro Mix e no estágio de duas folhasforam pulverizadas com 70 g ae/ha de imazetapir para eliminar nulas. Asplantas sobreviventes foram transplantadas para potes de 3,8 I (1 galão)contendo meio Metro Mix e colocadas nas mesmas condições decrescimento como antes. No estágio V3-V4 as plantas foram pulverizads nopulverizador de trilha ajustado a 187 L/ha em ou 560 ou 2240 g ae/ha de 2,4-D DMA. As plantas foram classificadas em 3 e 14 DAT e comparadas complantas controle 5XH751 χ Hi II. Uma escala de graduação de 0 a 10 (semlesão até lesão por auxina extrema) foi desenvolvida para distinguir lesão daraiz de suporte. Os graus da raiz de suporte foram tirados de 14DAT paramostrar tolerância a 2,4-D. 2,4-D causa malformação da raiz de suporte, e éum indicador consistente de lesão por herbicida auxínico em milho. Dadosda raiz de suporte (conforme visto na tabela abaixo) demonstra que 2 dos 3eventos testados foram robustamente tolerantes a 2240 g ae/ha de 2,4-DDMA. O evento "pDAB4101 (0)001.001" foi aparentemente instável; noentanto, os outros dois eventos foram robustamente tolerantes a 2,4-D e 2,4-D+imazetapir ou 2,4-D glifosato(vide a Tabela 16.).

<table>table see original document page 108</column></row><table>

8.8 - Hereditariedade AAD-12 (v1) em milho

Um teste de progênie também foi conduzido sobre sete famíliasAAD-12 (v1) T1 que foram cruzadas com 5XH751. As sementes foram0 plantadas dentro de potes de 7,62 cm (três polegadas) conforme descritoacima. No estágio de 3 folhas todas as plantas foram pulverizadas com 70 gae/ha de imazetapir no pulverizador de trilha conforme previamente descrito.Depois de 14 DAT, foram contadas as plantas resistentes e sensíveis.Quatro das seis linhagens testadas segregaram como um traço Mendelianodominante de único locus, (1R:1S) conforme determinado por análise Quiquadrada. As plantas sobreviventes foram em seguida pulverizadas com 2,4-D e todas as plantas foram consideradas tolerantes a 2,4-D (índices £ 560 gae/ha). AAD-12 é hereditário como um robusto gene de resistência aariloxialcanoato auxina em múltiplas espécies quando cruzadoreciprocamente com um híbrido comercial.

8.9 - Empilhamento de AAD-12 (v1) para aumentar o espectro de herbicidas

AAD-12 (v1) (pDAB4101) e um endógamo Roundup Ready elite(BE1146RR) foram cruzadas reciprocamente e semente F1 foi coletada. Assementes de duas linhagens Fi foram plantadas e tratadas com 70 g ae/hade imazetapir no estágio V2 para eliminar nulas. Para as plantassobreviventes, representantes foram separados e ou tratados com 1120 gae/ha de 2,4-D DMA + 70 g ae/ha de imazetapir (para confirmar a presençado gene AHAS) ou 1120 g ae/ha de 2,4-D DMA + 1680 g ae/ha de glifosato(para confirmar a presença do gene Round Up Ready) em um pulverizadorde trilha calibrado para 187 L/ha. As plantas foram graduadas 3 e 16 DAT.Dados do spray mostraram que AAD-12 (v1) pode ser convencionalmenteempilhado com um gene de tolerância a glifosato (tal como o gene RoundupCP4-EPSPS) ou outros genes de tolerância a herbicida para proporcionarum aumento do espectro de herbicidas que podem ser aplicadosseguramente ao milho. Igualmente foi observada tolerância à imidazolinona+ 2,4-D + glifosato em plantas F1 e não apresentaram fenótipo negativopelas combinações moleculares ou empilhamento de reprodução destesmultiplos transgenes.

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Foram conduzidas provas de tolerância a nível de campo sobredois eventos AAD-12 (v1) pDAB4101 (4101(0)003.R.003.AF e4101 (0)005.R001 .AF) e um contole híbrido Roundup Ready (RR) (2P782)em Fowier, Indiana and Wayside1 Mississippi. As sementes foram plantadascom plantador de cone em espaçamento de Ieira de 1,016 m (40 polegadas)em Wayside e espaçamento de 0,762 m (30 polegadas) em Fowier.O design experimental foi um design de bloco completo randomizado com 3replicações. Os tratamentos herbicidas foram 2,4-D (sal de dimetilamina) a1120, 2240 e 4480 g ae/ha, triclopir a 840 g ae/ha, fluroxipir a 280 g ae/ha eum controle não tratado. Os eventos AAD-12 (v1) continham o gene AHAScomo um marcador selecionável. Os eventos de milho F2 foram segregantesde modo que as plantas AAD-12 (v1) foram tratadas com imazetapir a 70 gae/ha para remover as plantas nulas. Os tratamentos herbicidas foramaplicados quando o milho atingiu o estágio V6 usando pulverizador portátilde ar comprimido liberando 187 L/ha de volume de carregador em 130 a 200kpa de pressão. Foram feitas classificações de lesão visual em 7, 14 e 21dias depois do tratamento. Foram feitas classificações de lesão da raiz desuporte em 28DAT em uma escala de 0 a 10 com 0 a 1 sendo ligeira fusãoda raiz de suporte, 1 a 3 sendo moderada dilatação/desvio da raiz desuporte e proliferação de raiz, 3 a 5 sendo moderada fusão da raiz desuporte, 5 a 9 grave fusão da raiz de suporte e malformação e 10 sendoinibição total das raízes de suporte.

A reação do evento AAD-12 (v1) a 2,4-D, triclopir, e fluroxipir em14 dias depois do tratamento é mostrada na Tabela 18. A lesão da colheitafoi mais grave em 14 DAT. Õ milho RR controle (2P782) foi gravementedanificado (44% a 14 DAT) por 2,4-D em 4480 g ae/ha, o qual é 8 vezes (8X)o índice de uso de campo normal. Os eventos AAD-12 (v1) todosdemonstraram excelente tolerância a 2,4-D em 14 DAT com 0% de lesãonos índices 1, 2 e 4X, respectivamente. O milho controle (2P782) foigravemente danificado (31% a 14 DAT) por 2X o índice de triclopir (840 gae/ha). Os eventos AAD-12 (v1) demonstraram tolerância a índices de 2X detriclopir com uma média de 3% de lesão em 14 DAT através dos doiseventos. Fluroypyr a 280 g ae/ha causou 11% de lesão visual para o milhoselvagem a 14 DAT. Os eventos AAD-12 (v1) demonstraram aumento detolerância com uma médída de 8% de lesão a 5 DAT.

Aplicações de herbicidas auxínicos a milho no estágio decrescimento V6 pode causar malformação das raízes de suporte. A Tabela18 mostra a gravidade da lesão da raiz de suporte causada por 2,4-D,triclopir, e fluroxipir. Triclopir a 840 g ae/ha causou a mais grave fusão daraiz de suporte e malformação resultando em um escore médio de lesão daraiz de suporte de 7 no milho tipo controle 2P782. Tanto eventos de milhoAAD-12 (v1) não apresentaram lesão da raiz de suporte a partir dotratamento com triclopir. Lesão da raiz de suporte em milho 2P782aumentada com índices crescentes de 2,4-D. Em 4480 g ae/ha de 2,4-D, oseventos AAD-12 não apresentaram lesão da raiz de suporte; ao passo quefoi vista grave fusão da raiz de suporte e malformação no híbrido 2P782.Fluroxipir causou somente moderada dilatação e desvio da raiz de suporteno milho selvagem com os eventos AAD-12 (v1) não apresentando lesão daraiz de suporte.

Estes dados mostram claramente que AAD-12(v1) transmite altonível de tolerância em milho para 2,4-D, triclopir e fluroxipir em índices queexcedem bastante os usados comercialmente e que causam grave lesãovisual e da raiz de suporte em milho não-AAD-12 (v1).

Tabela 18. Lesão Visual de eventos AAD-12 e milho selvagem depois de aplicações foliares de 2,4-D, triclopir e fluroxipir sob condições de campo.

<table>table see original document page 111</column></row><table>Tabela 19. Classificações da lesão da raiz de suporte para plantas de milho AAD-12 e selvagem em resposta a 2,4-D, triclopir e fluroxipir sob condições de campo. <table>table see original document page 112</column></row><table>

Exemplo 9. Detecção de proteína de plantas transformadsa através deanticorpos

9.1 - Extração de AAD-12 (v1) de folhas de plantas

Aproximadamente 50 a 100 mg de tecido de folhas foi cortadoem pequenos pedaços (ou 4 discos de folhas vazados em furo único) epostos dentro de tubos de cluster de 2 ml contendo duas contas BB de açoinoxidável (4,5 mm; Daisy Co., cat. Ns 145462-000). Quinhentos microlitrosde tampão de extração vegetal (PBS contendo 0,05% de Tween 20 e 1% dealbumina sérica bovina) foi adicionado a cada amostra. Os tubos foramcapeados e fixados no Geno/Grinder (Modelo 2000-115, Certiprep,Metuchen, NJ) e agitados por 6 min com ajuste a 1x de 500 rpm. Os tubosforam centrifugados a 5000x g por 10 min e os sobrenadantes contendo asproteínas solúveis foram analisados para AAD-12 (v1) usando Western Blotse ELISA.

9.2 - Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)O teste foi conduzido em temperatura ambiente a menos quedeterminado de modo diverso. Cem microlitros de anticorpo anti-AAD-12purificado (0,5 pg/ml) foram revestidos sobre cavidade de microtitulação de96 cavidades e incubados a 4eC por 16 horas. A lâmina foi lavada quatrovezes com tampão de lavagem (100 mM de salina tamponada com fosfato(PBS; pH 7.4) contendo 0,05% de Tween 20) usando uma lavadora delâminas, seguida por bloqueio com leite desnatado a 4% dissolvido em PBSpor uma hora. Depois da lavagam, 100 μΙ_ de AAD-12 padrão deconcentrações conhecidas ou extratos vegetais de diferentes amostrasforam incubados nas cavidades. Para curva padrão, AAD-12 purificado foidiluído duas vezes serialmente de 52 a 0,813 ng/ml em triplicatas. Extratosde plantas foram diluídos 5, 10, 20, e 40 vezes em PBS e analisados emduplicatas. Depois de uma hora de incubação, a lâmina foi lavada comoacima. Cem microlitros de conjugado anticorpo anti-AAD-12-HRP (0,5 ug/ml)foram incubados em cada cavidade por uma hora antes da lavagem. Cemmicrolitros de substrato HRP, 1-Step® Ultra TMB-ELISA (Pierce, Rockford,IL), foi incubado em cada cavidade por 10 minutos antes da reação serinterrompida adicionando 100 pL de H2SO4 a 0,4 Ν. A OD de cada cavidadefoi medida usando uma leitora de microlâmina a 450 nm. Para determinar asconcentrações de AAD-12 (v1) no extrato vegetal, foi feita a média do valorda OD de duplicatas e extrapolada da curva padrão usando o Softmax® Prover. 4.0 (Molecular Devices).

Para comparação, cada amostra foi normalizada com seu pesofresco e foi calculada a percentagem de expressão.

9.3 - Análise Western blotting.

Extratos de planta ou padrões AAD-12 (5 e 0,5 µg/ml) foramincubados com tampão de amostra Laemmli a 95°C por 10 minutos eseparados eletroforeticamente em gel a 8 a 16% Tris-Glicina Precast. Emseguida as proteínas foram eletro-transferidas para sobre membrana denitrocelulose usando protocolo padrão. Depois de bloquear em leitedesnatado a 4% em PBS, proteína AAD-12 (v1) foi detectada por anti-soroanti-AAD-12 seguido por conjugados anti-coelho/HRP de cabra. A proteínadetectada foi visualizada por reagente de análise Western de substrato dequimiluminescência (ECL Western Analysis Reagent, Amersham, NJ).

Exemplo 10 - Transformação de Tabaco

A transformação de tabaco com Agrobacterium tumefaciens foirealizada por um método similar, mas não idêntico, aos métodos publicados(Horsch et ai., 1988). Para proporcionar tecido fonte para a transformação,semente de tabaco (Nicotiana tabacum cv. KY160) foi esterilizadasuperficialmente e plantada sobre a superfície de meio TOB-, o qual é ummeio de Murashige e Skoog livre de hormônios (Murashige e Skoog, 1962)solidificado com ágar. As plantas foram cultivadas por 6 a 8 semanas em umambiente de incubadora iluminado em 28 a 30°C e as folhas foram coletadasesterilmente para uso no protocolo de transformação. Pedaços deaproximadamente um centímetro quadrado foram cortados esterilmentedestas folhas, excluindo a nervura central das folhas. Culturas das cepas deAgrobacterium (EHA101S contendo pDAB3278, aka pDAS1580, AAD-12(v1) + PAT), cultivadas de um dia para o outro dentro de um frasco sobre umagitador ajustado a 250 rpm em 28°C, foram peletizadas em uma centrífugae ressuspensas em sais estéreis de Murashige e Skoog, e ajustadas parauma densidade ótica final de 0,5 a 600 nm. Os pedaços de folhas forammergulhados nesta suspensão bacteriana por aproximadamente 30segundos, em seguida secados com mata-borrão sobre toalhas de papelesterilizadas e colocados com o lado correto sobre meio TOB+ (meio deMurashige e Skoog contendo 1 mg/L de ácido indol acético e 2,5 mg/L debenziladenina) e incubados no escuro a 28°C. Dois dias depois os pedaçosde folhas foram movidos para meio TOB+ contendo 250 mg/L de cefotaxima(Agri-Bio, North Miami, Florida) e 5 mg/L de glufosinato amônio (ingredienteativo em Basta, Bayer Crop Sciences) e incubados em 28 a 30°C na luz. Ospedaços de folhas foram movidos para meio TOB+ fresco com cefotaxima eBasta duas vezes por semana pelas primeiras duas semanas e uma vez porsemana depois disso. Quatro a seis semanas depois dos pedaços de folhasserem tratados com as bactérias, pequenas plantas surgindo de focostransformados foram removidas desta preparação de tecido e plantadas emmeio TOB- contendo 250 mg/L de cefotaxima e 10 mg/L de Basta emrecipientes Phytatray® Il (Sigma). Estas plântulas foram cultivadas em umambiente de incubadora iluminado. Depois de 3 semanas, cortes de cauleforam tirados e reenraizados no mesmo meio. As plantas estavam prontaspara serem enviadas para a estufa depois de 2 a 3 semanas adicionais.

As plantas foram movidas dentro da estufa lavando o ágar dasraízes, transplantando no solo em potes de 13,75 cm quadrados, colocandoo pote dentro de um saco Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.), colocando águacorrente no fundo do saco, e colocando em luz indireta em uma estufa a30°C por uma semana. Depois de 3 a 7 dias, o saco foi aberto; as plantasforam fertilizadas e deixadas para crescer no saco aberto até as plantasestarem aclimatadas à estufa, ocasião na qual o saco foi removido. Asplantas foram cultivadas sob condições ordinárias de estufa quente (30°C,dia de 16 horas, noite de 8 horas, luz natural mínima + luz suplementar =500 ME/m2s1).

Antes da propagação, plantas T0 foram amostradas para análisede DNA para determinar o número de cópias de insertos. O gene PATo qualfoi encadeado molecularmente a AAD-12 (v1) foi testado para conveniência.Tecido fresco foi colocado dentro de tubos e Iiofilizado a 4SC por 2 dias.Depois do tecido estar totalmente seco, uma conta de tungstênio (VaIenite)foi colocada dentro do tubo e as amostras foram submetidas a 1 minuto detrituração a seco usando um moinho de esferas da Kelco. Em seguida foiseguido o procedimento de isolamento de DNA DNeasy padrão (Qiagen,DNeasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído foi em seguida corado comPico Green (Molecular Probes P7589) e lido no fluorômetro (BioTek) compadrões conhecidos para obter a concentração em ng/μΙ.

As amostras de DNA foram diluídas para 9 ng/μΙ e em seguidadesnaturadas por incubação em um termociclador a 95°C por 10 minutos.Em seguida foi preparada mistura de Signal Probe usando a oligo misturaproporcionada e MgCI2 (Third Wave Technologies). Uma alíquota de 7,5 μΙfoi colocada dentro de cada cavidade da lâmina de teste Invader seguida poruma alíquota de 7,5 μΙ de controles, padrões, e 20 ng/μΙ de amostrasdesconhecidas diluídas. Cada cavidade foi revestida com 15 μΙ de oleomineral (Sigma). As lâminas foram em seguida incubadas a 63°C por 1,5hora e lidas no fluorômetro (Biotek). O cálculo da % de sinal sobre a basepara a sonda alvo dividido pela % de sinal sobre a sonda controle interna debase calculará a proporção. A proporção de padrões de cópiasdesenvolvidos e validados com análise Southern blot foi usada paraidentificar a cópia estimada dos eventos desconhecidos.

Todos os eventos também foram analisados para a presença dogene AAD-12 (v1) por PCR usando as mesmas amostras de DNA extraídas.Um total de 100 ng de DNA total foi usado como modelo. 20 mM de cadainiciador foram usados com o kit Takara Ex Taq PCR Polymerase.Iniciadores para o AAD-12 da reação de PCR da unidade de transcriçãovegetal (PTU) foram (SdpacodF: ATGGCTCA TGCTGCCCTCAGCC) (SEQID N°: 12) e (SdpacodR: CGGGCAGGCCTAACTCCACC AA) (SEQ ID Ne:13). A reação de PCR foi realizada no termociclador 9700 Geneamp (AppliedBiosystems), submetendo as amostras a 94°C por 3 minutos e 35 ciclos de94°C por 30 segundos, 64°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto e 45segundos seguido por 72°C por 10 minutos. Os produtos de PCR foramanalisados por eletroforese sobre um gel agarose a 1% corado com EtBr.Quatro a 12 linhagens clonais de cada um dos 18 eventos PCR positivoscom 1 a 3 cópias do gene PAT (e presumivelmente AAD-12 (v1) uma vezque estes genes são encadeados fisicamente) foram regenerados e movidospara a estufa.

10.1 Tolerância a herbicida pós-emergência em tabaco Tn transformado comAAD-12 (v1)

Plantas T0 de cada um dos 19 eventos foram testadas com umaampla faixa de 2,4-D, triclopir, ou fluroxipir pulverizado sobre plantas quetinham 7,62 a 10,16 cm (3 a 4 polegadas) de altura. As aplicações de sprayforam feitas conforme previamente descrito usando um pulverizador de trilhaem um volume de spray de 187 L/ha. 2,4-D sal de dimetilamina (RiversideCorp) foi aplicado a 0, 140, 560, ou 2240 g ae/ha em clones representativosde cada evento misturado em água deionizada. Fluroxipir foi igualmenteaplicado a 35, 140, ou 560 g ae/ha. Triclopir foi aplicado a 70, 280, ou 1120g ae/ha. Cada tratamento foi replicado 1 a 3 vezes. Os índices de lesãoforam registrados 3 e 14 DAT. Cada evento testado foi mais tolerante a 2,4-D do que a linhagem controle não transformada KY160. Em vários eventos,ocorreu alguma epinastia relacionada com herbicida auxínico inicial emdoses de 560 g ae/ha de 2,4-D ou mesno. Alguns eventos foram nãodanificados em 2,4-D aplicado em 2240 g ae/ha (equivalente a 4X o índicede campo). No total, os eventos AAD-12 (v1) foram mais sensíveis afluroxipir, seguido por triclopir, e menos afetados por 2,4-D. A qualidade doseventos com respeito à magnitude da resistência foi discernida usandoreações de plantas To a 560 g ae/ha de fluroxipir. Os eventos foramclassificados em "baixa" (>40% de lesão 14 DAT), "média" (20 a 40% delesão), "alta" (<20% de lesão). Alguns eventos foram inconsistentes emresposta entre replicatas e foram considerados "variáveis".

Tabela 20. Eventos TO de tabaco transformado com pDAS"l580 (AAD-12 (v1) + PAT)

<table>table see original document page 117</column></row><table>Tabela 20. Eventos TO de tabaco transformado com pDAS1580 (AAD-12 (v1) + PAT1)

<table>table see original document page 118</column></row><table>

® A diferenciação da desempenho de tolerância a herbicida dos eventosnecessitou de avaliação da tolerância relativa quando tratados com 560 gae/ha de fluroxipir onde a tolerância foi variável entre os eventos.10.2 Verificação de alta tolerância a 2.4-D em tabaco T1Dois a quatro indivíduos T0 sobreviventes a altos índices de 2,4-

D e fluroxipir foram salvos de cada evento e deixados para autofertiIizar naestufa para dar origem à semente T1. A semente Ti foi estratificada, esemeada em bandejas de seleção muito semelhantes às de Arabidopsis(Exemplo 7.4), seguida por remoção seletiva de nulas não transformadasnesta população segregante com 560 g ai/ha de glufosinato (seleção degene PAT). Os sobreviventes foram transferidos para potes individuais de7,62 cm (3 polegadas) dentro da estufa. Estas linhagens proporcionaramaltos níveis de resistência a 2,4-D na geração T0. A consistência aprimoradada reação é prevista em plantas T-1 não tendo originado diretamente dacultura de tecido. Estas plantas foram comparadas com tabaco KY160selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador detrilha ajustado a 187 L/ha. As plantas foram pulverizadas a partir de umafaixa de 140 a 2240 g ae/ha de 2,4-D sal de dimetilamina (DMA), 70 a 1120 g ae/ha de triclopir ou 35 a 560 g ae/ha de fluroxipir. Todas as aplicaçõesforam formuladas em água. Cada tratamento foi replicado duas a quatrovezes. As plantas foram avaliadas em 3 e 14 dias depois do tratamento. Foiatribuída classificação de lesão às plantas com respeito à atrofia, clorose, enecrose. A geração T1 é segregante, portanto se espera alguma reação variável devido a diferença na zigosidade.

Não foi observada lesão em 4X o índice de campo (2240 gae/ha) para 2,4-D ou abaixo. Alguma lesão foi observada com tratamentoscom triclopir em uma linhagem do evento, mas a maikor lesão foi observadacom fluroxipir. A lesão por fluroxipir foi de vida curta e novo crescimento sobre um evento foi quase indistinguível do controle não tratado por 14 DAT(Tabela 21). É importante observar que o tabaco não transformado éextremamente sensível a fluroxipir. Estes resultados indicaram que pode serproporcionada tolerância a 2,4-D de nível comercial por AAD-12 (v1), mesmoem uma colheita dicotiledônea muito sensível à auxina como tabaco. Estes resultados também mostram que pode ser conferida resistência aosherbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir e fluroxipir. Ter a capacidade deprescrever tratamentos em uma colheita tolerante a herbicida protegida porAAD-12 com vários ingredientes ativos tendo espectros variáveisde controlede ervas daninhas é extremamente útil para os produtores.Tabela 21. Avaliação da resposta de tolerância cruzada de plantas de tabaco T1 AAD-12 (v1) a vários herbicidas de fenóxi e piridilóxi auxina. <table>table see original document page 120</column></row><table>

10.3 Hereditariedade AAD-12 (v1) em tabaco

Um teste da progênie de 100 plantas também foi conduzidosobre sete linhagens T1 de linhagens AAD-12 (v1). As sementes foramestratificadas, semeadas, e transplantadas com respeito ao procedimentoacima com a exceção de que plantas nulas não foram removidas porseleção de Liberty. Todas as plantas foram em seguida pulverizadas com560 g ae/ha de 2,4-D DMA conforme previamente descrito. Depois de 14DAT1 foram contadas as plantas resistentes e as sensíveis. Cinco das setelinhagens testadas segregaram como um traço Mendeliano dominante deúnico locus, (3R.1S) conforme determinado por análise Qui quadrada. AAD-12 é herdável como um robusto gene de resistência a ariloxialcanoatoauxina em múltiplas espécies.10.4 - Tolerância de campo de plantas de tabaco pDAS1580 a herbicidas de2.4-D. dicloprop. triclopir e fluroxipir

Provas de tolerância a nível de campo foram conduzidas sobretrês linhagens de AAD-12 (v1) (eventos pDAS1580-[1]-018.001, pDASl580-[13-004.001 e pDAS1580-[1]-020.016) e uma linhagem selvagem (KY160)em estações de campo em Indiana e Mississippi. Transplantes de tabacoforam cultivados na estufa plantando semente T1 em superfícies niveladasde transplante de 72 cavidades (Hummert International) contendo meioMetro 360 de acordo com as condições de crescimento indicadas acima. Asplantas nulas foram seletivamente removidas por seleção de Libertyconforme previamente descrito. As plantas do transplante foramtransportadas para as estações de campo e plantadas ou com 35,56 ou com60,96 cm (14 ou com 24 polegadas) de afastamento usando plantadores devegetais industriais. Irrigação por gotejamento no sítio de Mississippi eirrigação aérea no sítio de Indiana foram usadas para manter as plantascrescendo vigorosamente.

O design experimental foi um design de lote bipartido (split plof)com 4 replicações. O principal lote foi tratamento com herbicida e o subplotfoi linhagem de tabaco. Os tratamentos herbicidas foram 2,4-D (sal dedimetilamina) a 280, 560, 1120, 2240 e 4480 g ae/ha, triclopir a 840 g ae/ha,fluroxipir a 280 g ae/ha e um controle não tratado. Os lotes tinham uma Ieirapor 7,62 a 9,14 m (25 a 30 pés). Tratamentos herbicidas foram aplicados 3 a4 semandas depois da transplantação usando pulverizador portátil de arcomprimido liberando 187 L/ha de volume de carregador a 130 a 200 kpa depressão. Foi feita classificação visual de lesão, inibição de crescimento, eepinastia a 7,14 e 21 dias depois de tratamento.

Reação do evento AAD-12 (vi) a 2,4-D, triclopir, e fluroxipir sãomostradas na Tabela 22. A linhagem de tabaco não transformado foigravemente danificada (63% a 14 DAT) por 2,4-D a 560 g ae/ha a qual éconsiderada o índice de aplicação em campo de 1X. As linhagens AAD-12(v1) todas demonstraram excelente tolerância a 2,4-D a 14 DAT com lesãomédia de 1, 4, e 4% de lesão observada nos índices de 2, 4 e 8X,respectivamente. A linhagem de tabaco não transformado foi gravementedanificada (53% a 14 DAT) pelo índice de 2X de triclopir (840 g ae/ha); aopasso que as linhagens AAD-12 (v1) demonstraram tolerância com umamédia de 5% de lesão a 14 DAT através das três linhagens. Fluroxipir a 280g ae/ha causou grave lesão (99%) à linhagem não transformada a 14 DAT.As linhagens AAD-12 (v1) demonstraram aumento da tolerância com umamédia de 11% de lesão a 14 DAT.

Estes resultados indicam que linhagens de eventostransformados AAD-12 (v1) apresentaram um alto nível de tolerância a 2,4-D, triclopir e fluròxipir em múltipleos de índices de uso comercial que foramletais ou causaram graves malformações epinásticas em tabaco não

Tabela 22. Reação de plantas de tabaco AAD-12 (v1) a 2,4-D, triclopir, e fluròxipir sob condições de campo. <table>table see original document page 122</column></row><table>

10.5 Proteção de AAD-12 (v1) contra índices elevados de 2.4-D

Resultados apresentando proteção de AAD-12 (v1) contraíndices elevados de 2,4-D DMA na estufa são mostrados na Tabela 23.Plantas AAD-12 (v1) T1 de um evento segregando 3R:1S quandoselecionadas com 560 g ai/ha de Liberty usando o mesmo protocoloconforme previamente descrito. Semente AAD-1 (v3) T1 também foi plantadapara controles de tabaco transformado (vide PCT/US2005/014737). KY160não transformado serviu como o controle sensível. As plantas forampulverizadas usando uma pulverizador de trilha ajustado para 187 L/ha a140, 560, 2240, 8960, e 35840 g ae/ha de 2,4-D DMA e classificadas 3 e 14DAT.

Tanto AAD-12 (v1) quanto AAD-1 (v3) protegeram de modoeficaz tabaco contra lesão por 2,4-D em doses até 4X os índices de usocomercial. AAD-12 (v1), no entanto, demonstrou claramente uma notávelvantagem em relação a AAD-1 (v3) protegendo até 64X os índices de campode rotina.

Tabela 23. Resultados demonstrando proteção proporcionada por AAD-12 (v1) e AAD-1 (v3) contra índices elevados de 2,4-D.

<table>table see original document page 123</column></row><table>

10.6 Empilhamento de AAD-12 para aumentar o espectro herbicida

Plantas homozigotas AAD-12 (v1) (pDAS1580) e AAD-1 (v3)(pDAB721) (vide PCT/US2005/014737 para a última) foram tanto cruzadasreciprocamente e semente Fi foi coletada. A semente Fi de doiscruzamentos recíprocos de cada gene foi estratificada e tratada. 4representantes de cada cruzamento foram tratadas sob o mesmo regime despray conforme usado para a outra experimentação com um dos seguintestratamentos: 70, 140, 280 g ae/ha de fluroxipir (seletivo para o gene AAD-12(v1))\ 280, 560, 1120 g ae/ha de R-dicloroprop (seletivo para o gene AAD-1(v3))\ ou 560, 1120, 2240 g ae/ha de 2,4-D DMA (para confirmar a tolerânciaa 2,4-D). Plantas T2 homozigotas de cada gene também foram plantadaspara uso como controles. As plantas foram graduadas a 3 e 14 DAT. Osresultados da pulverização são mostrados na Tabela 24.

Os resultados confirmam que AAD-12 (v1) pode ser empilhadocom sucesso com AAD-1 (v3), deste modo aumentando o espectro deherbicidas que podem ser aplicados à colheita de interesse (ácidosfenoxiacéticos + ácidos fenoxipropiônicos vs ácidos fenoxiacéticos + ácidospiridiloxiacéticos para AAD-1 e AAD-12, respectivamente). A naturezacomplementar dos padrões de resistência cruzada a herbicida possibilita ouso conveniente destes dois genes como marcadores selecionáveis decampo complementares e empilhável. Em colheitas onde a tolerância comum único gene pode ser marginal, uma pessoa versada na técnicareconhece que uma pessoa pode aumentar a tolerância empilhamento umsegundo gene de tolerância para o mesmo herbicida. Isto pode ser feitousando o mesmo gene com os mesmos promotores ou diferentes; noentanto, conforme observado aqui, empilhamento e rastreando dois traçoscomplementares pode ser facilitado diferenciando proteção cruzada paraácidos fenoxipropiônicos [de AAD-1 (v3)] ou ácidos piridiloxiacéticos [AAD-12 (v1)]

<table>table see original document page 124</column></row><table>Exemplo 11 - Transformação de Soia

Aprimoramento de soja através de técnicas de transferênciagenética foi realizada para traços tais como tolerância a herbicida (Padgetteet al., 1995), modificação de aminoácidos (Falco et al., 1995), e resistência ainsetos (Parrott et al., 1994). A introdução de traços estranhos em espéciesde colheitas requer métodos que possibilitarão a produção de rotina delinhagens transgênicas usando seqüências de marcadores selecionáveis,contendo simples insertos. Os transgenes devem ser herdados como umúnico Iocus funcional de modo a simplificar a reprodução. Foram reportadasa liberação de genes estranhos em soja cultivado por bombardeamento demicroprojéteis de eixos de embriões zigóticos (McCabe et al., 1988) ouculturas embriogênicas somáticas (Finer e McMuIIen, 1991), e atransformação mediada por Agrobacterium de explantes cotiledonários(Hinchee et al., 1988) ou embriões zigóticos (Chee et al., 1989).

Transformantes derivados de transformação mediada porAgrobacterium tendem a possuir simples insertos com baixo número decópias (Birch, 1991). Há benefícios e desvantagens associados com cadaum dos três tecidos alvo investigados para transferência de gene em eixoembrionário zigótico de soja (Chee et al., 1989; McCabe et al., 1988),cotiledon (Hinchee et al., 1988) e culturas embriogênicas somáticas (Finer eMcMuIIen, 1991). As últimas foram extensivamente investigadas como umtecido alvo para transferência genética direta. Culturas embriogênicastendem a ser bastante prolíficas e podem ser mantidas por um períodoprolongado. No entanto, esterilidade e aberrações cromossômicas dostransformantes primários têm sido associadas com a idade das suspensõesembriogênicas (Singh et al., 1998) e portanto parece ser necessária ainiciação contínua de novas culturas para sistemas de transformação de sojautilizando este tecido. Este sistema necessita de um alto nível de 2,4-D,concentração de 40 mg/L, para iniciar o calo embriogênico e isto propõe umproblema fundamental no uso do gene AAD-12 (v1) uma vez que o Iocustransformado não pode ser desenvolvido adicionalmente com 2,4-D no meio.Portanto, a transformação à base de meristema é ideal para odesenvolvimento de planta resistente a 2,4-D usando AAD-12 (v1).11.1 Clonagem por Gateway de Constructos Binários

A seqüência codificante AAD-12 (v1) foi clonada em cincovetores doadores de Gateway (Gateway Donors) diferentes contendodiferentes promotores vegetais. Os cassetes de expressão de planta AAD-12(v1) resultante foram subseqüentemente clonados em um vetor binário dedestinação de Gateway (Gateway Destination Binary) através da reação LRClonase (Invitrogen Corporation, Carlsbad Ca, Cat N9 11791 -019).

Um fragmento Ncol - Sacl contendo a seqüência codificanteAAD-12 (v1) foi digerido do DASPIC012 e ligado em sítios de restrição Ncol- Sacl correspondentes dentro dos seguintes vetores doadores de Gateway:pDAB3912 (attL1 // CsVMV promotor // AtuORF23 3'UTR // attL2);pDAB3916 (attL1 // AtUbiIO promotor // AtuORF23 3'UTR // attl_2);pDAB4458 (attL1 // AtUbi3 promotor // AtuORF23 3'UTR // attl_2); pDAB4459(attL1 // ZmUbiI promotor // AtuORF23 3'UTR // attL2); e pDAB4460 (attL1 //AtAct2 promotor // AtuORF23 3'UTR // attL2). Os constructos resultantescontendo os seguintes cassetes de expressão de planta foram desenhados:pDAB4463 (attL1 // CsVMV promotor // AAD-12 (v1) Il AtuORF23 3'UTR //attl_2); pDAB4467 (attL1 // AtUbiIO promotor // AAD-12 (v1) // AtuORF233'UTR // attl_2); pDAB4471 (attL1 // AtUbi3 promotor // AAD-12 (v1) HAtuORF23 3'UTR // attl_2); pDAB4475 (attL1 // ZmUbiI promotor // AAD-12(v1) U AtuORF23 3'UTR // attl_2); e pDAB4479 (attL1 // AtAct2 promotor //AAD-12 (v1) Il AtuORF23 3'UTR // attl_2). Estes constructos foramconfirmados através de digestão enzimática de restrição e seqüenciamento.

Os cassetes de expressão vegetal foram recombinados no vetorbinário de destinação de Gateway pDAB4484 (RB7 MARv3 // attR1 - ccdB -resistência a cloranfenicol - attR2 // CsVMV promotor // PATv6 // AtuORFI3'UTR) através da reação de Gateway LR Clonase. A tecnologia GatewayTechnology usa recombinação sítio-específica à base de fago lâmbda aoinvés de endonuclease de restrição e Iigase para inserir um gene deinteresse em um vetor de expressão. Invitrogen Corporation, GatewayTechnology: A Universal Technology to Clone DNA Sequences forFunctional Analysis and Expression in multiple Systems, Technical Manual,Catalog Nᵒ 's 12535-019 and 12535-027, Gateway Technology Version E,9/22/2003, Nᵒ 25-022. As seqüências de recombinação de DNA (attL, eattR,) e a mistura enzimática LR Clonase permite que qualquer fragmento deDNA flanqueado por um sítio de recombinação seja transferido paraqualquer vetor contendo um sítio correspondente. O sítio attL1 do vetordonor corresponde a attR1 do vetor binário. Do mesmo modo, o sítio attL2site do vetor donor corresponde a attR2 do vetor binário. Usando a GatewayTechnology o cassete de expressão vegetal (do vetor doador) o qual éflanqueado pelos sítios attL pode ser recombinado nos sítios attR do vetorbinário. Os constructos resultantes contendo os seguintes cassetes deexpressão vegetal foram marcados como: pDAB4464 (RB7 MARv3 //CsVMV promotor // AAD-12 (v1) Il AtuORF23 3'UTR // CsVMV promotor //ΡΑΤνβ Il AtuORFI 3'UTR); pDAB4468 (RB7 MARv3 // AtUbiIO promotor //AAD-12 (v1) Il AtuORF23 3'UTR // CsVMV promotor // PATv6 Il AtuORFI3'UTR); pDAB4472 (RB7 MARv3 // AtUbi3 promotor // AAD-12 (v1) IlAtuORF23 3'UTR // CsVMV promotor// ΡΑΤνβ Il AtuORFI 3'UTR);pDAB4476 (RB7 MARv3 // ZmUbiI promotor // AAD-12 (v1) Il AtuORF233'UTR // CsVMV promotor // ΡΑΤνβ Il AtuORFI 3'UTR); e pDAB4480 (RB7MARv3 // AtAct2 promotor // AAD-12 (v1) Il AtuORF23 3'UTR // CsVMVpromotor // ΡΑΤνβ Il AtuORFI 3'UTR) (vide a Tabela 8). Estes constructosforam confirmados através de digestão enzimática de restrição eseqüenciamento.

11.2 Método de Transformação 1: transformação de nó cotiledonário de soiamediada por Aarobacterium tumefaciens

Os primeiros relatórios de transformação de soja tinham por alvocélulas meristemáticas na região do nó cotiledonário (Hinchee et ai, 1988) emultiplicação de brotos de meristemas apicais (McCabe et al., 1988). Nométodo do nó cotiledonário à base de A. tumefaciens, a preparação deexplante e composição de meios de cultura estimulam a proliferação demeristemas auxiliares no nó (Hinchee et al., 1988). Permanece incerto seuma cultura de calo verdadeiramente desdiferenciada, mas totipotente, éiniciada por estes tratamentos. A recuperação de múltiplos clones de umevento de transformação de um único explante e a recuperação infreqüentede plantas quiméricas (Clemente et aí., 2000; Olhoft et al., 2003) indica umaúnica origem celular seguida por multiplicação da célula transgênica paraproduzir ou uma cultura de meristema transgênica proliferante ou um brotouniformemente transformado que sofre multiplicação de brotos adicionais. Ométodo de multiplicação de brotos de soja, baseado originalmente embombardeamento de microprojéteis (McCabe et al., 1988) e, maisrecentemente, adaptado para transformação mediada por Agrobacterium(Martinell et al., 2002), aparentemente não sofre o mesmo nível ou tipo dedesdiferenciação que o método do nó cotiledonário porque o sistema sebaseia em identificação com sucesso de quimeras da linhagem germinativa.A faixa de genótipos que foram transformados através do método do nócotiledonário à base de Agrobacterium está crescendo firmemente (Olhoftand Somers, 2001). Este método de multiplicação de meristema e broto denovo é menos limitado a genótipos específicos. Além disso, este é umprotocolo não à base de 2,4-D o qual seria ideal para sistema de seleção de2,4-D. Portanto, o método do nó cotiledonário pode ser o método de escolhapara desenvolver cultivares de soja resistentes a 2,4-D. Embora este métodotenha sido descrito tão cedo quanto 1988 (Hinchee et al., 1988), somentemuito recentemente foi otimizado para transformação de alta freqüência derotina de vários genótipos de soja (Zhang et ai, 1999; Zeng et ai, 2004).

11.2.1 - Produção de transformação de plantas de fenótipos tolerantes AAD-12 (v1)

Explantes derivados de sementes de "Maverick" e o protocolo detransformação de nó cotiledonário mediado por Agrobacterium foi usadopara produzir plantas transgênicas AAD-12 (v1).

11.2.2 - Preparação e inoculacão de AgrobacteriumAgrobacterium cepa EHA101 (Hood et al. 1986), carregandocada de cinco vetores binários pDAB (Tabela 8) foi usado para iniciartransformação. Cada vetor binário contém o gene AAD-12 (v1) e um cassetede gene planta-selecionável (PAT) dentro da região T-DNA. Cada gene éorientado pelos promotores listados na Tabela 8 e estes plasmídeos forammobilizados na cepa EHA101 de Agrobacterium por eletroporação. Ascolônias selecionadas foram em seguida analisadas para a integração degenes antes de tratamento com Agrobacterium dos explantes de soja.Sementes Maverick foram usadas em todos os experimentos detransformação e as sementes foram obtidas da University of Missouri,Columbia, MO.

Foi realizada transformação mediada por Agrobacterium de soja(Glycine max) usando o gene PAT como um marcador selecionávelacoplado com o herbicida glufosinato como um agente seletivo seguindo umprocedimento de Zeng et al. modificado (2004). As sementes foramgerminadas sobre meio basal B5 (Gamborg et al. 1968) solidificado com 3g/L de Phytagel (Sigma-AIdrich, St. Louis, Mo.); adicionada l-cisteína aomeio de co-cultura a 400 mg/L e a co-cultura durou 5 dias (Olhoft andSomers 2001); iniciação de broto, alongamento de broto, e meios deenraizamento foram suplementados com 50 mg/L de cefotaxime, 50 mg/L detimentin, 50 mg/L de vancomicina, e solidifiaram com 3 g/L de Phytagel.Brotos selecionados foram então transferidos para o meio de enraizamento.

0 esquema de seleção ótimo foi o uso de glufosinato a 8 mg/L através doprimeiro e segundo estágios de iniciação de broto no meio e 3 a 4 mg/Ldurante alongamento de brotos no meio.

Antes de transferir brotos alongados (3 a 5 cm) para meio deenraizamento, a extremidade excisada dos entrenós foram mergulhadas em

1 mg/L de ácido indol 3-butírico por 1 a 3 min para promover o enraizamento(Khan et al. 1994). Os brotos lançaram raízes dentro de tubos de cultura devidro de 25x100 mm contendo meio de enraizamento e em seguida foramtransferidos para mistura de solo para aclimatização das plântulas em Metro-mix 200 (Hummert International, Earth City, Mo.) dentro de caixas Magentaabertas em Convirons. Glufosinato, o ingrediente ativo do herbicida Liberty(Bayer Crop Science), foi usado para seleção durante iniciação ealongamento do broto. As plântulas enraizadas foram aclimatadas dentro decaixas Magenta abertas por várias semanas antes de serem triadas etransferidas para a estufa para aclimatação adicional e estabelecimento.11.2.3 - Teste de plãntulas putativamente transformadas, e análisesestabelecidas de plantas Tn na estufa.

As folhas pequenas terminais de folhas selecionadas destasplãntulas tiveram as folhas pintadas com 50 mg/L de glufosinato duas vezescom um intervalo de uma semana para observar os resultados para triagemde transformantes putativos. As plãntulas triadas foram em seguidatransferidas para a estufa e depois de aclimatação as folhas foram pintadascom glufosinato novamente para confirmar o estado de tolerância destasplãntulas no GH e consideradas transformantes putativos.

Plantas que são transferidas para a estufa podem ser avaliadaspara a presença de um gene PAT aWvo adicionalmente com uma maneiranão destrutiva pintando uma seção de folha do transformante primário T0, ouprogênie do mesmo, com uma solução de glufosinato [0,05 a 2% v/v deHerbicida Liberty, preferencialmente 0,25 a 1,0% (v/v), = 500 a 2000 ppm deglufosinato, Bayer Crop Science]. Dependendo da concentração usada,pode ser feita avaliação para lesão por glufosinato 1 a 7 dias depois dotratamento. As plantas também podem ser testadas para tolerância a 2,4-Dem uma maneira não destrutiva por aplicação seletiva de uma solução de2,4-D em água (0,25 a 1% v/v de 2,4-D comercial formulação de sal dedimetilamina, preferencialmente 0,5% v/v = 2280 ppm 2,4-D ae) à folhapequena terminal do trifoliolado recém-expandindo um ou dois,preferencialmente dois, nós abaixo do trifolioado emergente mais jovem.Este teste possibilita a avaliação de plantas sensíveis a 2,4-D 6 horas avários dias depois de aplicação por avaliação de inversão ou rotação defolha >90 graus do plano das folhas pequenas adjacentes. Plantas tolerantesa 2,4-D não responderão a 2,4-D. Plantas T0 serão deixadas para autofertilizar na estufa para dar origem a semente T1. Plantas Ti (e na extensãoclones de plantas T0 suficientes são produzidos) serão pulverizadas comuma faixa de doses herbicidas para determinar o nível de proteção herbicidaproporcionado pelos genes AAD-12 (v1) e PATevn soja transgênico. índicesde 2,4-D usados sobre plantas T0 tipicamente compreenderão um ou doisíndices seletivos na faixa de 100 a 1120 g ae/ha usando uma pulverizadorde trilha conforme previamente descrito. Plantas Ti serão tratadas com umamaior dose herbicida variando de 50 a 3200 g ae/ha de 2,4-D. Do mesmomodo, plantas T0 e T1 podem ser tríadas para resistência a glufosinato portratamento pós-emergência com 200 a 800 e 50 a 3200 g ae/ha deglufosinato, respectivamente. Gene de resistência a glifosato (em plantastransformadas com constructos que contêm EPSPS) ou outro gene detolerância a glifosato pode ser avaliado na geração Ti por aplicações pós-emergência de glifosato com uma faixa de dose de 280 a 2240 g ae/ha deglifosato. A análise de expressão de proteína ocorrerá conforme descritoabaixo. Plantas T0 individuais foram avaliadas para a presença da regiãocodificante do gene de interesse (AAD-12 (v1) ou PAT v6) e número decópias. A determinação da hereditariedade de AAD-12 (v1) será feita usandosegregação da progênie T1 e T2 com respeito a tolerância a herbicidaconforme descrito nos exemplos prévios.

Um subgrupo dos transformantes iniciais foi avaliado na geraçãoT0 de acordo com os métodos acima. Qualquer planta confirmada comotendo a região codificante AAD-12 (v1), independente do promotororientando o gene não respondeu à pintura de folhas com 2,4-D ao passoque soja Maverick selvagens responderam (Tabela Sec 11.2.3). Plantastransformadas P/\T-somente responderam do mesmo modo que plantasselvagens a aplicações de pintura de 2,4-D.

2,4-D foi aplicado a um subgrupo das plantas que foram detamanho similar às plantas controle selvagens com ou 560 ou 1120 g ae de2,4-D. Todas as plantas contendo AAD-12 (v1) foram claramente resistentesà aplicação de herbicida versus os soja Maverick selvagens. Um leve nívelde lesão (2 DAT) foi observado para duas plantas AAD-12 (v1), no entanto, alesão foi temporária e não foi observada lesão 7 DAT. Plantas controleselvagens foram gravemente danificadas 7-14 DAT a 560 g ae/ha de 2,4-D emortas em 1120 g ae/ha. Estes dados são consistentes com o fato de queAAD-12 (v1) pode conferir alta tolerância (>2X índices de campo) a umacolheita sensível como soja. As plantas tríadas foram em seguidaamostradas para análises molecular e bioquímica pasra a confirmação daintegração de genes AAD12 (v1), número de cópias, e seus níveis deexpressão genética conforme descrito abaixo e reportado na Tabela 25.<table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>11.2.4 - Análises Moleculares: Soia11.2.4.1 - Isolamento e quantificação de DNA de cultura de tecido

Tecido fresco é colocado dentro de tubos e liofilizado a 49C por 2dias. Depois do tecido ser totalmente secado, uma conta de tungstênio(Valenite) é colocada dentro do tubo e as amostras são submetidas a 1minuto de trituração a seco usando um moinho de esferas Kelco. Oprocedimento de isolamento de DNA DNeasy padrão é então seguido(Qiagen, DNeasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído é então coradacom Pico Green (Molecular Probes P7589) e lida no fluorômetro (BioTek)com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/μL.11.2.4.2 - Reação de cadeia polimerase

Um total de 100 ng de DNA total é usado como o modelo. 20mM de cada iniciador é usado copm o kit Takara Ex Taq PCR Polymerase(Mirus TAKRR001A). Iniciadores para o AAD-12 (v1) PTU são (dianteiro -ATAATGCCAGC CTGTTAAACGCC) (SEQ ID N°: 8) e (reverso -CTCAAGCATATGAATGACCT CGA) (SEQ ID N°: 9). A reação de PCR érealizada no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems),submetendo as amostras a 94°C por 3 minutos e 35 ciclos de 94°C por 30segundos, 63°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto e 45 segundosseguidos por 72°C por 10 minutos. Iniciadores para PCR da RegiãoCodificante AAD-12 (v1) são (dianteiro - ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQ ID N°: 10) e (reverso - CGGGC AGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ IDN°: 11). A reação de PCR é realizada no termociclador 9700 Geneamp(Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C por 3 minutos e 35ciclos de 94°C por 30 segundos, 65°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minutoé 45 segundos seguidos por 72°C por 10 minutos. Produtos de PCR sãoanalisados por eletroforese sobre um gel agarose a 1 % corado com EtBr.11.2.4.3- Análise Southern blotAnálise Southern blot é realizada com DNA total obtido do kitQiagen DNeasy. Um total de 10 pg de DNA genômico é submetido a umadigestão de um dia para o outro para obter dados de integração. Depois dadigestão de um dia para o outro uma alíquota de -100 ng é passada sobreum gel a 1% para assegurar digestão completa. Depois desta certeza asamostras são passadas sobre um largo gel agarose a 0,85% de um dia parao outro a 40 volts. O gel é em seguida desnaturado em 0,2 M de NaOH, 0,6M de NaCI por 30 minutos. O gel é em seguida neutralizado em 0,5 M deTris HCI1 1,5 M de NaCI pH de 7.5 por 30 minutos. Um equipamento de gelcontendo 20x SSC é em seguida ajustado para obter um gel de gravidadepara transferência por membrana de nylon (Millipore INYC00010) de um diapara o outro. Depois da transferência de um dia para o outro a membrana éem seguida submetida a luz UV através de um reticulador (Stratagene UVstratalinker 1800) a 1200 X100 microjoules. A membrana é em seguidalavada em 0,1% de SDS, 0,1 de SSC por 45 minutos. Depois da lavagem de45 minutos, a membrana é cozida por 3 horas a 80°C e em seguidaarmazenada a 4QC até hibridização. O fragmento modelo de hibridização épreparado usando o PCR da região codificante acima usando DNA deplasmídeo. O produto é passado sobre um gel agarose a 1% e excisado eem seguida o gel é extraído usando o procedimento de extração de gelQiagen (28706). A membrana é em seguida submetida a uma etapa de pré-hibridização a 60°C por uma hora em tampão Perfect Hyb (Sigma H7033).O procedimento Prime it RmT dCTP-labeling rxn (Stratagene 300392) éusado para desenvolver a sonda à base de p32 (Perkin Elmer). A sonda élimpada usando as colunas Probe Quant. G50 (Amersham 27-5335-01). Doismilhões de contagens CPM são usadas para hibridizar os Southern blots deum dia para o outro. Depois da hibridização de um dia para o outro os blotssão em seguida submetidos a duas lavagens de 20 minutos a 65°C em 0,1 %de SDS, 0,1 SSC. Os blots são em seguida expostos a filme de um dia parao outro, incubando a -80SC.

11.2.5 - Análises Bioquímicas: Soia

11.2.5.1 - Amostragem de Tecido e Extração de proteína AAD-12 (vlídefolhas de soia

Aproximadamente 50 a 100 mg de tecido de folhas foiamostrado das folhas N-2 que foram pintadas com 2,4-D, mas depois de 1DAT. A folha pequena N-2 terminal foi removida e ou cortada em pequenospedaços ou 2 discos de folhas vazados em furo único (~0,5 cm de diâmetro)e foram congeladas sobre gelo seco instantaneamente. Análise protéicaadicional (análises ELISA e Western) foi completada de acordo commétodos descritos no Exemplo 9.

11.2.6 - Avaliação da Proqênie T1

Plantas T0 serão deixadas para autofertilizar para derivarfamílias T1. A experimentação da progênie (análise de segregação) seráavaliada usando glufosinato a 560 g ai/ha como o agente de seleçãoaplicado no estágio de crescimento V1-V2. Plantas sobreviventes serãoadicionalmente avaliadas para tolerância a 2,4-D em um ou mais estágios decrescimento de V2-V6. Sementes serão produzidas através de autofertilização para permitir experimentação de herbicida mais ampla sobre asoja transgênica.

Foram geradas plantas de soja Maverick transgênicas AAD-12(v1) através de sistema de transformação de nó de cotiledônea mediada porAgrobacterium. As plantas T0 obtidas toleraram níveis de até 2X deaplicações de campo de 2,4-D e desenvolveram sementes férteis. Afreqüência de plantas de soja transgênicas férteis foi de até 5,9%.A integração do gene AAD1-12 (v1) no genoma da soja foi confirmada poranálise Southern blot. Esta análise indicou que a maior parte das plantastransgênicas continha um baixo número de cópias. As plantas triadas comanticorpos AAD-12 (v1) se apresentaram positivas para ELISA e a bandaapropriada em análise Western.

11.3 Método de Transformação 2: Transformação de tecido de calo de soiaembrioqênico mediada por feixe de aerosol

Cultura de tecido de calo de soja embriogênico e subseqüenteirradiação podem ser realizadas conforme descrito na Patente U. S. Ne6.809.232 (Held et al.) para criar mutantes usando um ou mais constructosna Tabela 8.

11.4 Método de Transformação 3. Bombardeamento biolístico de Soia

Isto pode ser realizado usando meristema de eixos embrionáriosderivados de sementes maduras (McCabe et al. (1988)). Seguindo métodosestabelecidos para bombardeamento biolfstico, pode-se esperarrecuperação de plantas de soja transformadas. Uma vez que as plantas sãoregeneradas pode ocorrer avaliação de eventos conforme descrito no

Exemplo 11.2.

11.5 Método de Transformação 4. Transformação mediada por Whiskers

A preparação de whiskers e a transformação de whiskers podeser prevista de acordo com métodos descritos previamente por Terakawa etal. (2005) Seguindo métodos estabelecidos para bombardeamento biolístico,pode-se esperar recuperação de plantas de soja transformadas. Uma vezque as plantas são regeneradas pode ocorrer avaliação de eventosconforme descrito no Exemplo 11.2.

Sementes Maverick foram esterilizadas superficialmente em70% de etanol por 1 min seguido por imersão em 1% de hipoclorito de sódiopor 20 min. e em seguida enxaguadas três vezes em água destilada estéril.As sementes foram embebidas em água destilada por 18 a 20 horas. Oseixos embrionários foram excisados de sementes, e os meristemas apicaisforam expostos removendo as folhas primárias. Os eixos embrionários foramposicionados no meio de bombardeamento [BM: MS (Murashige and Skoog1962) meio de sais basais, 3% de sacarose e 0,8% de fitagel Sigma, pH 5,7]com a região apical orientada para cima em placas de cultura de 5 cmcontendo 12 ml de meio de cultura.

11.6 Método de Transformação 5

Transformação mediada por bombardeamento de partículaspara tecido de calo embriogênico pode ser otimizada de acordo commétodos prévios (Khalafalla et al., 2005; El-Shemy et al., 2004, 2006).Plantas regeneradas também podem ser avaliadas de acordo com oExemplo 11.2.

Exemplo 12 - AAD-12 (v1) em Algodão12.1 - Protocolo de transformação de algodão

Sementes de algodão (genótipo Co310) são esterilizadassuperficialmente em 95% de etanol por 1 minuto, enxaguadas, esterilizadascom 50% de alvejante comercial por vinte minutos, e em seguida enxaguado3 vezes com água destilada esterilizada antes de serem germinadas sobremeio G (Tabela 26) em vasos Magenta GA-7 e mantidas sob altaintensidade luminosa de 40 a 60 μΕ/ιτι2, com o fotoperíodo ajustado em 16horas de luz e 8 horas de escuridão a 289C.

Quadrados de segmentos de cotiledônea (~5 mm) são isoladosde mudas de 7 a 10 dias de idade para meio líquido M líquido (Tabela 26)em placas de Petri (Nunc, item Ns 0875728). Segmentos de corte sãotratados com uma solução de Agrobacterium (por 30 minutos) e em seguidatransferidos para meio M semi-sólido (Tabela 26) e sofrem co-cultivo por 2 a3 dias. Depois de co-cultivo, os segmentos são transferidos para meio MG(Tabela 26). Carbenicilina é o antibiótico usado para matar o Agrobacteriume glufosinato-amônio é o agente de seleção que possibilitaria o crescimentode somente as células que contêm o gene transferido.

Preparação de Agrobacterium. Inocular 35 ml de meio Y (Tabela26) (contendo estreptomicina (100 mg/ml de matéria-prima) e eritromicina(100 mg/ml de matéria-prima)), com uma alça de bactérias para crescer deum dia para o outro no escuro a 28e C, enquanto agitando a 150 rpm. No diaseguinte, verter a solução de Agrobacterium em um tubo de oakridge estéril(Nalge-Nunc, 3139-0050), e centrifugar em Beckman J2-21 a 8.000 rpm por5 minutos. Verter o sobrenadante e ressuspender o pélete em 25 ml delíquido M (Tabela 26) e vórtice. Colocar uma alíquota dentro de um tubo decultura de vidro (Fisher, 14-961-27) para leitura de Klett (Klett-Summerson,modelo 800-3). Diluir a nova suspensão usando meio líquido M para umaleitura em Klett-metro de 108 unidades formadoras de colônia por ml com umvolume total de 40 ml.

Depois de três semanas, calo dos segmentos de cotiledônea éisolado e transferido para meio MG fresco. O calo é transferido por umadicional de 3 semanas sobre meio MG. Em uma comparação lado a lado,meio MG pode ser suplementado com diclorprop (adicionado ao meio emuma concentração de 0,01 e 0,05 mg/L) para suplementar par aadegradação do 2,4-D, uma vez que diclorprop não é um substrato para aenzima AAD-12, no entanto diclorprop é mais ativo sobre algodão do que2,4-D. Em uma comparação separada, segmentos os quais foram laminadossobre meio MG não contendo regulador de crescimento comparado commeio MG padrão, apresentaram reduzida formação de calo, mas ainda hácrescimento de calo. Calo é em seguida transferido para meio CG (Tabela26), e transferido de novo para meio de seleção fresco depois de trêssemanas. Depois de outras três semanas o tecido do calo é transferido parameio D (Tabela 26) deficiente de reguladores de crescimento vegetal paraindução de calo embriogênico. Depois de 4 a 8 semanas sobre este meio,forma-se calo embriogênico, e pode ser diferenciado do calo nãoembriogênico pór suas células granulares e cor branco amarelada. Osembriões começam a regenerar logo depois e são de cor verde distinta.Algodão pode levar tempo para regenerar e formar embriões, um dos modospara acelerar este processo é submeter o tecido a tensão. Dessecação é ummodo comum para realizar isto, atravé de alterações no microambiente dotecido e lâmina, usando menos meio de cultura e/ou adotando vários modosde fechamento de lâmina (cobrir com fita versus parafilme).

Embriões maiores e bem-desenvolvidos são isolados etransferidos para meio DK (Tabela 26) para desenvolvimento de embriões.Depois de 3 semanas (ou quando os embriões se desenvolveram), embriõesgerminados são transferidos para meio fresco para desenvolvimento debroto e raiz. Depois de 4 a 8 semanas, quaisquer plantas be-desenvolvidassão transferidas para o solo e cultivadas até a maturidade. Depois de um parde meses, a planta cresceu até um ponto que em pode ser pulverizada paradeterminar se tem resistência a 2,4-D.Tabela 26

<table>table see original document page 141</column></row><table>12.2 - Transformação celular.

Foram iniciados vários experimentos nos quais segmentos decotiledônea foram tratados com Agrobacterium contendo pDAB724. Mais de2000 dos segmentos resultantes foram tratados usando várias opções deauxina para a proliferação de calo de algodão pDAB724, ou: 0,1 ou 0,5 mg/Lde R-diclorprop, concentração padrão de 2,4-D e sem tratamento comauxina. O calo foi selecionado sobre glufosinato-amônio, devido à inclusãodo gene PAT no constructo. A análise da linhagem do calo sob a forma dePCR e Invader será usada para determinar se e para assegurar que o geneestava presente no estágio de calo; em seguida linhagens de calo que sãoembriogênicas serão enviadas para análise Western, essencialmenteconforme descrito na seção 11.2.3. Calo de algodão embriogênico foisubmetido a tensão usando técnicas de dessecação para melhorar aqualidade e a quantidade do tecido recuperado.

Quase 200 eventos de calo foram triados para PTU intacto eexpressão usando análise Western para o gene AAD-12 (v1). Abaixo estáum subgrupo dos dados para algum do calo de algodão que foi testado.

<table>table see original document page 142</column></row><table>12.3 - Regeneração de planta

Linhagens de algodão AAD-12 (v1) que produziram plantas deacordo com o protocolo acima serão enviadas apra a estufa. Parademonstrar que o gene AAD-12 (v1) proporciona resistência a 2,4-P noalgodão, tanto a planta de algodão AAD-12 (v1) quanto plantas de algodãoselvagens serão pulverizadas com um pulverizador de trilha liberando 560 gae/ha de 2,4-D em um volume de spray de 187 L/ha. As plantas serãoavaliadas em 3 e 14 dias depois de tratamento. Plantas sobreviventes a umíndice seletivo de 2,4-D serão autopolinizadas para criar sementes Ti oucruzadas com uma linhagem de algodão elite para produzir sementes F1. Assementes subseqüentes produzidas serão plantadas e avaliadas pararesistência a herbicida conforme previamente descrito. Eventos AAD-12 (v1)podem ser combinados com outros traços de tolerância a herbicida (HT) oude resistência a inseto (IR) desejados conforme descrito nos experimentos18, 19, 22, e 23.

Exemplo 13 - Transformação por Agrobacterium de Outras Colheitas

À luz da descrição em questão, colheitas adicionais podem sertransformadas de acordo com a invenção em questão usando técnicas quesão conhecidas na técnica. Para transformação de centeio mediada porAgrobacterium, vide, por exemplo., Popelka e Altpeter (2003). Paratransformação de soja mediada por Agrobacterium, vide, por exemplo.,Hinchee et ai, 1988. Para transformação de sorgo mediada porAgrobacterium, vide, por exemplo., Zhao et ai, 2000. Para transformação decevada mediada por Agrobacterium, vide, por exemplo., Tingay et ai, 1997.Para transformação de trigo mediada por Agrobacterium, vide, por exemplo.,Cheng et ai., 1997. Para transformação de arroz mediada porAgrobacterium, vide, por exemplo., Hiei et ai., 1997.

Os nomes em Latim para estas e outras plantas são dadosabaixo. Deve ser evidente que estas e outras técnicas de transformação(não-Agrobacterium) podem ser usadas para transformar AAD-12 (v1), porexemplo, em estas e outras plantas, inclusive mas não limitadas a Milho(Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. e Zizania spp.), Cevada(Hordeum spp.), Algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), Soja (Glycinemax), Beterrabas sacarinas e de mesa (Beta spp.), Cana-de-açúcar (Arengapinnata), Tomate (Lycopersicon esculentum e outras espécies, Physalisixocarpa, Solanum incanum e outras espécies, e Cyphomandra betacea), Batata (Solanum tubersoum), Batata-doce (Ipomoea betatas), Centeio(Secale spp.), Pimentas (Capsicum annuum, sinense, e frutescens), Alface(Laetuea sativa, perennis, e pulehellá), Repolho (Brassica spp), Aipo (Apiumgraveolens), Berinjela (Solanum melongena), Amendoim (Araehis hypogea),Sorgo (todas as espécies de Sorghum), Alfafa (Medieago sativua), Cenoura (Daueus carota), Feijões (Phaseolus spp. e outros gêneros), Aveia (Avenasativa e strigosa), Ervilhas (Pisum, Vignay e Tetragcnolobus spp.), Girassol(Helianthus annuus), Abóbora (Cueurbita spp.), Pepino (Cueumis sativa),Tabaco (Nieotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Turfgrass(Lolium, Agrostis, Poa, Cynadon, e outros gêneros), Trevo (Tifolium), Ervilhaca (Vicia). As plantas referidas, com genes AAD-12 (v1), por exemplo,são incluídas na invenção em questão.

AAD-12 (v1) tem o potencial de aumentar a aplicabilidade deherbicidas auxínicos chave para uso na temporada de em muitos sistemasde cultivo de madeiras decíduas e perenes. Espécies de madeirasresistentes a triclopir, 2,4-D, e/ou fluroxipir aumentariam a flexibilidade deuso acima do máximo destes herbicidas sem preocupações de danos. Estasespécies incluiriam, mas não se limitariam a: Amieiro (Alnus spp.), freixo(Fraxinus spp.), espécies faia preta e álamo (Populus spp.), faia (Fagusspp), bétula (Betula spp.), cereja (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogueira-amarga (Carya spp.), bordo (Acer spp.), carvalho (Quercus spp), epinho (Pinus spp). O uso de resistência a auxina para o controle seletivo deervas daninhas em espécies ornamentais e que carregam frutos tambémestá dentro do âmbito desta invenção. Exemplos podem incluir, mas não serlimitados a, rosa (Rosa spp.), evônimo-da-américa (Euónymus spp.), petúnia (Petunia spp), begônia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp),maçã ácida ou maçã (Malus spp.), pera (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp),e cravo-de-defuntos (Tagetes spp.).Exemplo 14 - Evidência Adicional de Resultados Surpreendentes: AAD-12vs. AAD-2

14.1 - Clonagem inicial AAD-2 (v1)

Outro gene foi identificado a partir do banco de dados NCBI(vide o website ncbi.nlm.nih.gov; nol de acesso AP005940) como umhomólogo com somente 44% de identidade de aminoácido com tfdA. Estegene é referido aqui, neste requerimento de patente, como AAD-2 (v1) porconsistência. A percentagem de identidade foi determinada primeirotraduzindo tanto as seqüências de DNA AAD-2 quanto tfdA (SEQ ID Ne: 12de PCT/US2005/014737 e GENBANK N° de Acesso M16730,respectivamente) para proteinas (SEQ ID N°. 13 de PCT/US2005/014737 3GENBANK N° de Acesso M16730, respectivamente), em seguida usandoCIustaIW no pacote de software VectorNTI para realizar o alinhamento deseqüência múltiplo.

A cepa de Bradyrhizobium japonicum contendo o gene AAD-2(v1) foi obtida do Northern Regional Research Laboratory (NRRL, cepa N9B4450). A cepa Iiofilizada foi revivida de acordo com o protocolo NRRL earmazenada a -80°C em 20% de glicerol para uso interno como Dow Bacterialcepa DB 663. Deste estoque de freezer, uma placa de ágar Tryptic Soy Ágarfoi em seguida riscada com um Ioopful (N.T.: fio de platina usado paratransferência de microorganismos.) de células para isolamento, e incubada a28°C por 3 dias. Uma única colônia foi usada para inocular 100 ml de caldo desoja tríptico (Tryptic Soy Broth) em um frasco de 500 ml tridefletido, o qual foiincubado de um dia para o outro a 28°C sobre um agitador de piso a 150 rpm.Deste, DNA total foi isolado com o protocolo gram negativo do kit DNeasy daQiagen (Qiagen cat. Ng 69504). Os seguintes iniciadores foram designadospara amplifivar o gene alvo a partir de DNA genômico, Dianteiro: 5' ACT AGTAAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3' [(brjap 5'(spel) SEQ IDNQ: 14 de PCT/US2005/014737 (adicionado sítio de restrição Spe I e Sítio deLigação de Ribossoma (RBS))] e Reversa: 5' TTC TCG AGC TAT CAC TCCGCC GCC TGC TGC TGC 3' [(br jap 3' (xhol) SEQ ID Ns: 15 dePCT/US2005/014737 (adicionado um sítio Xho I)].Reações de cinqüenta microlitros foram ajustadas como sesegue: Fail Safe Buffer 25 μl, ea. iniciador 1 μl (50 ng/μl), gDNA 1 μl (200ng/μl), H2O 21 μl, Taq polymerase 1 μl (2,5 unidades/μl). Três tampões FailSafe — A, B, e C — foram usados em três reações isoladas. Em seguida foirealizado PCR sob as seguintes condições: 95°C ciclo de desnaturaçãotérmica de 3,0 minutos; 95°C 1,0 minuto, 50°C 1,0 minuto, 72°C 1,5 minutos,por 30 ciclos; seguidos por um ciclo final de 72°C 5 minutos, usando osistema FaiISafe PCR System (Epicenter cat. N° FS99100). O produto dePCR de ~1 kb resultante foi clonado em pCR 2,1 (Invitrogerí cat. N° K4550-40) seguindo o protocolo incluído, com E. coli TOP10F' quimicamentecompetente corno a cepâ hospedeira, para verificação da seqüência denucleotídeo.

Dez das colônias brancas resultantes foram escolhidas em 3 μlde caldo Luria + 1000 μg/ml de Ampicilina (LB Amp), e cultivadas de um diapara o outro a 37°C com agitação. Plasmídeos foram purificados de cadacultura usando o kit Nucleospin Plus Plasmid Miniprep Kit (BD Biosciencescat. N° K3063-2) e seguindo o protocolo incluído. Digestão de restrição dosDNA's isolados foi completada para confirmar a presença do produto dePCR no vetor pCR2.1. DNA de plasmídeo foi digerido com a enzima derestrição EcoRI (New England Biolabs cat. Nq R0101S). Foi realizadoseqüenciamento com o kit Beckman CEQ Quick Start Kit (Beckman Coultercat. Ne 608120 ) usando iniciadores M13 Dianteiro [5' GTA AAA CGA CGGCCA G 3'] (SEQ ID N°: 6) e Reverso [5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3'](SEQ ID N°: 7), seguindo instruções dos fabricantes. Esta seqüênciagenética e sua proteína correspondente foi dada uma nova designação geralAAD-2 (v1) para consistência interna.14.2 - Completamento de vetor binário AAD-2 (v1)

O gene AAD-2 (v1) foi amplificado por PCR a partir depDAB3202. Durante a reação de PCR foram feitas alterações dentro dosiniciadores para introduzir os sítios de restrição Afllll e Sacl no iniciador 5' eno iniciador 3', respectivamente. Vide PCT/US2005/014737. Os iniciadores"Ncol of Brady" [5' TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT3'] (SEQ ID N°: 14) e "Saci of Brady" [5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGCCTG CTG CTG CAC 3'] (SEQ ID N°: 15) foram usados para amplificar umfragmento de DNA usando o sistema Fail Safe PCR System (Epicentre).Oproduto de PCR foi clonado no vetor de clonagem pCR2.1 TOPO TA(Invitrogen) e foi verificada a seqüência com iniciadores M13 Dianteiro e M13Reverso usando os reagentes de seqüenciamento Beckman Coulter "DyeTerminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit". Dados de seqüênciaidentificaram um clone com a seqüência correta (pDAB716). O fragmentogenético Afllll/Sacl AAD-2 (v1) foi em seguida clonado no vetor Ncol/SaclpDAB726. O constructo resultante (pDAB717); AtUbi10 promotor: Nt OSM5'UTR: AAD-2 (v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 polyA 3'UTR foi verificado comdigestos de restrilção (com Ncol/Sacl). Este constructo foi clonado no bináriopDAB3038 como um fragmento de DNA Notl - Notl. O constructo resultante(pDAB767); AtUbiIO promotor: Nt 0SM5OTR: AAD-2 (v1): Nt OSM 3'UTR:ORF1 polyA 3'UTR: CsVMV promotor: PAT: ORF25/26 3'UTR foi digeridopor restrição (com Notl, EcoRI1 HinDIII1 Ncol, Pvull, e Sall) para verificaçãoda orientação correta. O constructo completado (pDAB767) foi em seguidausado para transformação em Agrobacterium.14.3 - Avaliação de Arabidopsis transformado.

Semente T1 recém-colhida transformada com um gene AAD-12(v1) otimizado para planta ou gene AAD-2 (v1) nativo foram plantadas eselecionadas para resistência a glufosinato conforme previamente descritoAs plantas foram em seguida atribuídas aleatoriamente a vários índices de2,4-D (50 a 3200 g ae/ha). Aplicações de herbicida foram aplicadas porpulverizador de trilha em um volume de spray de 187 L/ha. 2,4-D usado foi aformulação de sal de dimetilamina comercial (456 g ae/L, NuFarm1 StJoseph, MO) misturado em 200 mM de tampão Tris (pH 9,0) ou 200 mM detampão HEPES (pH 7,5).

AAD-12 (v1) e AAD-2 (v1) proporcionaram resistência a 2,4-Ddetectável versus as linhagens controle transformadas e não transformadas;no entanto, constructos individuais foram amplamente variáveis em suacapacidade para conferir resistência a 2,4-D a plantas Arabidopsis T1individuais. Surpreendentemente, AAD-2 (v1) e AAD-2 (v2) transformantesforam bem menos resistentes a 2,4-D do que o gene AAD-12 (v1), tanto deuma freqüência de plantas altamente tolerantes bem como lesão médiaglobal. Nenhuma planta transformada com AAD-2 (v1) sobreviveu a 200 gae/ha de 2,4-D relativamente sem dano (<20% de lesão visual), e a lesão dapopulação global foi cerca de 83% (vide PCT/US2005/014737). Ao invés,AAD-12 (v1) teve uma média de lesão da população de cerca de 6% quandotratada com 3.200 g ae/ha de 2,4-D (Tabela 11). Tolerância ligeiramenteaprimorada para AAD-2 (v2) otimizado para planta versus o gene nativo; noentanto, comparação de tanto genes AAD-12 quanto AAD-2 otimizados paraplanta indica urna importante vantagem para AAD-12 (vi) in piania.

Estes resultados são inesperados dado que a comparação invitro de AAD-2 (v1) (vide PCT/US2005/014737) e AAD-12 (v2) indicou queambos foram altamente eficazes na degradação de 2,4-D e ambos partilhamuma especificidade tipo-S com respeito a substratos de ariloxialcanoatoquiral. AAD-2 (v1) é expressado em plantas Ti individuais em níveisvariáveis; no entanto, pouca proteção contra lesão por 2,4-D éproporcionada por esta proteína expressada. Não foi evidente diferençasubstancial no nível de expressão de proteína (in planta) para os genesnativos e otimizados para planta AAD-2 (vide PCT/US2005/014737). Estesdados corroboram achados anteriores que tornam inesperadas a expressãofuncional de AAD-12 (v1) in planta, e resistência a herbicida 2,4-D resultantee herbicidas de piridiloxiacetato.

Exemplo 15 - Aplicações de Maneio Pré-planta

Este e os exemplos seguintes são exemplos específicos denovos usos herbicidas tornados possíveis pela invenção de AAD-12 emquestão.

Aplicações de herbicidas de manejo pré-planta são pretendidaspara matar ervas daninhas que surgiram durante o inverno ou no início daprimavera antes do plantio de uma dada colheita. Tipicamente estasaplicações são aplicadas em sistemas de tratamento sem lavrar ou dereduzida lavoura onde a remoção física de ervas daninhas não é completadaantes do plantio. Portanto, um programa herbicida deve controlar umespectro muito amplo de ervas daninhas de folhas largas e de gramíneaspresentes no momento do plantio. Glifosato, gramoxone, e glufosinato sãoexemplos de herbicidas não-seletivos, não-residuais amplamente usadospara aplicações de herbicidas de manejo pré-planta. Algumas ervasdaninhas, no entanto, são difíceis de controlar neste momento da estaçãodevido a um ou mais dos seguintes: insensibilidade inerente das espécies oubiotipo de ervas daninhas ao herbicida, tamanho relativamente grande deervas daninhas anuais de inverno, e condições de clima frio limitando acaptação e a atividade do herbicida. Várias opções de herbicidas estãodisponíveis para mistura de tanque com estes herbicidas para aumentar oespectro e a atividade sobre ervas daninhas onde os herbicidas nãoseletivos são fracos. Um exemplo seria aplicações de mistura de tanque de2,4-D com glifosato para ajudar no controle de Conyza canadensis(horseweed). Glifosato pode ser usado a partir de 420 até 1680 g ae/ha,mais tipicamente 560 a 840 g ae/ha, para o controle de manejo pré-planta damaioria das ervas daninhas presentes; no entanto, 280 a 1120 g ae/ha de2,4-D pode ser aplicado para ajudar no controle de muitas espécies de ervasdaninhas de folhas largas (por exemplo, horseweed). 2,4-D é um herbicidade escolha porque é eficaz sobre uma faixa muito ampla de ervas daninhasde folhas largas, eficaz mesmo em baixas temperaturas, e extremamenteeconômico. No entanto, se a colheita subseqüente for uma colheitadicotiledônea sensível, resíduos de 2,4-D no solo (embora de vida curta)podem afetar negativamente a colheita. Soja são uma colheita sensível erequerem um período de tempo mínimo de 7 dias (para índice de 280 gae/ha de 2,4-D) a no mínimo 30 dias (para aplicações de 2,4-D de 1120 gae/ha) a ocorrer entre aplicações de manejo e plantio. 2,4-D está proibidocomo um tratamento de manejo antes do plantio de algodão (vide rótulosfederais, a maioria estão disponíveis na CPR, 2005 ou online emcdms.net/manuf/manuf.asp). Com AAD-12 (v1) algodão ou sojatransformados, estas colheitas devem ser capazes de sobreviver a resíduosde 2,4-D no uso de aplicações de manejo aplicadas por ocasião do plantio emesmo depois do plantio antes da emergência da colheita. A aumentadaflexibilidade e custo reduzido de parceiros de mistura de tanque (ou pré-mistura comercial) melhorarão as opções de controle de ervas daninhas eaumentarão a resistência de aplicações de manejo em importantes situaçõessem lavrar e de reduzida lavoura. Este exemplo é um de muitas opções queestarão disponíveis. Os versados na técnica de controle de ervas daninhasobservarão uma variedade de outras aplicações incluindo, mas não limitadasa gramoxone + 2,4-D ou glufosinato + 2,4-D utilizando produtos descritos emrótulos de herbicidas federais (CPR, 2005) e usos descritos no AgrilianceCrop Protection Guide (2005), como exemplos. Os versados na técnicatambem reconhececao que o exemplo acima pode ser aplicado a qualquercolheita sensível a 2,4-D (ou outro herbicida de fenóxi auxina) que seriaprotegida pelo gene AAD-12 (v1) caso estavelmente transformado.Igualmente, os únicos atributos de AAD-12 possibilitando degradação detriclopir e fluroxipir aumentam a utilidade possibilitando a substituição oumisturas em tanque de 70 a 1120 ou 35 a 560 g áe/ha de triclopir e fluroxipir,respectivamente, para aumentar o espectro e/ou aumentam a capacidadepara controlar espécies de ervas daninhas perenes ou viney.Exemplo 16 - Uso em-Colheita de Herbicidas de Fenóxi Auxinas em Soja,Algodão, e Outras Colheitas Dicotiledôneas Transformadas Somente comAAD-12 (v1)

AAD-12 (v1) pode possibilitar o uso de herbicidas de fenóxiauxina (por exemplo, 2,4-D e MCPA) e piridilóxi auxinas (triclopir e fluroxipir)para o controle de um amplo espectro de ervas daninhas de folhas largasdiretamente em colheitas normalmente sensíveis a 2,4-D. A aplicação de2,4-D a 280 a 2240 g ae/ha controlaria a maioria das espécies de ervasdaninhas de folhas largas presentes em ambientes agronômicos. Maistipicamente, são usados 560 a 1120 g ae/ha. Para triclopir, os índices deaplicação tipicamente variariam de 70 a 1120 g ae/ha, mais tipicamente de140 a 420 g ae/ha. Para fluroxipir, os índices de aplicação tipicamentevariariam de 35 a 560 g ae/ha, mais tipicamente de 70 a 280 ae/ha.

Uma vantagem desta ferramenta adicional é o custoextremamente baixo do componente herbicida de folhas largas e potencialcontrole de ervas daninhas residuais de vida curta proporcionado pormaiores índices de 2,4-D, triclopir, e fluroxipir quando usados em maioresíndices, ao passo que um herbicida não-residual como glifosato nãoproporcionaria controle de ervas daninhas germinando posteriormente. Estaferramenta também proporciona um mecanismo para combinar modos deação herbicida com a conveniência de HTC como uma estratégia detratamento de resistência herbicida integrada e mudança de ervas daninhas.

Uma vantagem adicional que esta ferramenta proporciona é acapacidade de misturar em tanque herbicidas de controle de ervas daninhasde folhas largas de amplo espectro (por exemplo, 2,4-D, triclopir e fluroxipir)com herbicidas de controle de ervas daninhas residuais comumente usados.Estes herbicidas são tipicamente aplicados antes de ou no plantio, masfreqüentemente são menos eficazes sobre ervas daninhas emergidas,estabelecidas que podem existir no campo antes do plantio. Estendendo autilidade destes herbicidas de arilóxi auxina para incluir aplicações in planta,pré-emergência, ou pré-planta, aumenta a flexibilidade de programas decontrole de ervas daninhas residuais. Uma pessoa versada na técnicareconheceria que programa herbicida residual diferirá com base na colheitade interesse, mas programas típicos incluiriam herbicidas das famílias deherbicidas de cloracetmida e dinitroanilina, mas também incluindo herbicidastais como clomazone, sulfentrazone, e uma variedade de herbicidas ALS-inibidores, PPO-inibidores, e HPPD-inibidores.

Benefícios adicionais incluiriam tolerância a 2,4-D, triclopir oufluroxipir requerida antes do plantio depois da seguinte aplicação deherbicida de auxina de ácido ariloxiacético (vide o exemplo prévio); e menosproblemas de lesão de contaminação para colheitas dicotiledôneasresultantes de tanques de volume limpos incompletamente que continham2,4-D, triclopir ou fluroxipir. Dicamba (e muitos outos herbicidas) ainda podeser usado para o controle subseqüente de colheitas dicotiledôneasvoluntárias transformadas com AAD-12 (v1).

Os versados na técnica também reconhecerão que o exemploacima pode ser aplicado a qualquer colheita sensível a 2,4-D (ou outroherbicida de arilóxi auxina) que seria protegido pelo gene AAD-12 (v1) casoestavelmente transformada. Uma pessoa versada na técnica de controle deervas daninhas reconhecerá agora que o uso de vários herbicidascomerciais de fenóxi ou piridilóxi auxina somente ou em combinação comum herbicida é possibilitado por transformação por AAD-12 (v1). índicesespecíficos de outros herbicidas representativos destas químicas podem serdeterminados pelos rótulos dos herbicida compilados no livro CPR (CropProtection Reference) ou compilação similar ou quaisquer referências de proteção de colheitas comerciais ou acadêmicas tais como o Agriliance CropProieciion Guiae (2005). Caaa herbicida aiternaiivo possibilitado para usoem HTCs por AAD-12 (v1), quer usado somente, misturado em tanque, ouseqüencialmente, é considerado dentro do âmbito desta invenção.Exemplo 17 - Uso em-Colheita em Herbicidas de Fenóxi Auxina e Piridilóxi Auxina em AAD-12 (v1) Somente Milho Transformado. Arroz, e OutrasEspécies Monocotiledôneas

Em um modo análogo, a transformação de espécies degramíneas (tais como, mas não limitadas a, milho, arroz, trigo, cevada, outurfa e gramíneas de pastagem) com AAD-12 (v1) possibilitaria o uso de fenóxi e piridilóxi auxinas altamente eficazes em colheitas onde seletividadenormalmente não é certa. A maioria das espécies de gramíneas tem umatolerância natural a herbicidas auxínicos tais como as fenóxi auxinas (isto é,2,4-D,.). No entanto, um nível relativamente baixo de seletividade da colheitaresultou em diminuição da utilidade nestas colheitas devido a um determinado tempo da janela de aplicação encurtado ou risco de lesãoinaceitável. Colheitas monocotiledôneas transformadas com AAD-12 (vi),portanto, possibilitariam o uso de uma combinação de tratamentos similaresdescritos para colheitas dicotiledôneas tais como a aplicação de 2,4-D a 280a 2240 g ae/ha para controlar a maioria das espécies de ervas daninhas de folhas largas. Mais tipicamente, é usado 560 a 1120 g ae/ha. Para triclopir,índices de aplicação tipicamente variariam de 70 a 1120 g ae/ha, maistipicamente 140 a 420 g ae/ha. Para fluroxipir, índices de aplicaçãotipicamente variariam de 35 a 560 g ae/ha, mais tipicamente de 70 a 280ae/ha.

Uma vantagem desta ferramenta adicional é o custoextremamente baixo do componente herbicida de folhas largas e potencialcontrole de ervas daninhas residuais de vida curta proporiconado pormaiores índices de 2,4-D, triclopir, ou fluroxipir. Em contraste, um herbicidanão-residual como glifosato não proporcionaria controle de ervas daninhasgerminando posteriormente. Esta ferramenta também proporcionaria ummecanismo para rotação dos modos de ação herbicida com a conveniênciade HTC como uma estratégia de combinação de resistência a herbicidaintegrada e tratamento de mudana de erva daninha em uma colheita detolerante a glifosato/AAD-12 (v1) HTC, quer se faça rotação das espécies decolheitas ou não.

Uma vantagem adicional que esta ferramenta proporciona é acapacidade de misturar em tanque herbicidas de controle de ervas daninhasde folhas largas de amplo espectro (por exemplo, 2,4-D, triclopir e fluroxipir)com herbicidas de controle de ervas daninhas residuais usados comumente.Estes herbicidas são aplicados tipicamente antes de ou no plantio, masfreqüentemente são menos eficazes sobre ervas daninhas emergidas,estabelecidas que podem existir no campo antes do plantio. Estendendo autilidade destes herbicidas de arilóxi auxina para incluir aplicações in planta,pré-emergência, ou pré-planta, aumenta a flexibilidade de programas decontrole de ervas daninhas residuais. Uma pessoa versada na técnicareconheceria que programa herbicida residual diferirá com base na colheitade interesse, mas programas típicos incluiriam herbicidas das famílias deherbicidas de cloracetmida e dinitroanilina, mas também incluindo herbicidastais como clomazone, sulfentrazone, e uma variedade de herbicidas ALS-inibidores, PPO-inibidores, e HPPD-inibidores.

O aumento da tolerância de milho, arroz, e outrasmonocotiledôneas às fenóxi ou piridilóxi auxinas possibilitará o uso destesherbicidas na colheita sem restrições de estágio de crescimento ou opotencial para fenômenos de desenvolvimento de propensão de colheita,tais como "rabo de rato", propensão de colheita, fragilidade da hasteinduzida por regulador de crescimento no milho, ou raízes de suportedeformadas. Cada herbicida alternativo possibilitado para uso em HTCs porAAD-12 (v1), quer usado sozinho, misturado em tanque, ouseqüencialmente, é considerado dentro do âmbito desta invenção.

Exemplo 18 - AAD-12 (v1) empilhado Com Traco de Tolerância a Glifosatoem Qualquer Colheita

A vasta maioria de acres de algodão, canola, milho, e sojaplantados na América do Norte contém um traço de tolerância a glifosato(GT), e a adoção de milho GT está em crescimento. Colheitas GT adicionais(por exemplo, trigo, arroz, beterraba sacarina, e iuría) têm estado emdesenvolvimento mas não foram liberadas comercialmente até o momento.Muitas outras espécies resistentes a glifosato estão em estágio experimentalde desenvolvimento (por exemplo, Alfafa, cana-de-açúcar, girassol,beterrabas, ervilhas, cenoura, pepino, alface, cebola, morango, tomate, etabaco; espécies silvícolas como álamo e liquidâmbar; e espécies hortícolascomo cravo-de-defunto, petúnia, e begônias;

isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005 na World Wide Web). GTC's sãoferramentas valiosas para a completa tolerância de ervas daninhascontroladas e conveniência e eficácia de custo proporcionadas por estesistema. No entanto, a utilidade do glifosato como um tratamento básicopadrão atual é a seleção de ervas daninhas resistentes a glifosato. Alémdisso, ervas daninhas sobre as quais glifosato é inerentemente menos eficazestão mudando para as espécies predominantes em campos onde estãosendo praticados programas químicos somente com glifosato. EmpilhamentoAAD-12 (v1) com um traço de GT, quer através de reprodução convencionalou conjuntamente como um novo evento de transformação, a eficácia docontrole de ervas daninhas, flexibilidade, e capacidade de tratar mudançasde ervas daninhas e desenvolvimento de resistência a herbicida podem seraprimorados. Conforme mencionado em exemplos prévios, transformandocolheitas com AAD-12 (v1), colheitas monocotiledôneas terão uma maiormargem de segurança de fenóxi ou piridilóxi auxina, e fenóxi auxinas podemser aplicadas seletivamente em colheitas dicotiledôneas. Podem serimaginados vários cenários para opções aprimoradas de controle de ervasdaninhas onde AAD-12 (v1) e um traço de GT são empilhado em qualquerespécies de colheitas monocotiledôneas ou dicotiledôneas:

a) Glifosato pode ser aplicado em um índice de aplicaçãopós-emergente de rotina (420 a 2160 g ae/ha, preferencialmente 560 a 840 gae/ha) para o controle da maioria das espécies de gramíneas de de ervasdaninhas de folhas largas. Para o controle de ervas daninhas de folhaslargas resistentes a glifosato como Conyza canadensis ou ervas daninhasinerentemente difíceis de controlar com glifosato (por exemplo, Commelinaspp, Spomoea spp, etc.), 280 a 2240 g ae/ha (preferencialmente 580 a 1120g ae/ha) de 2,4-D pode ser aplicado seqüencialmente, misturado em tanque,ou como uma pré-mistura com glifosato para proporcionar controle eficaz.Para triclopir, os índices de aplicação tipicamente variariam de 70 a 1120 gae/ha, mais tipicamente de 140 a 420 g ae/ha. Para fluroxipir, os índices deaplicação tipicamente variariam de 35 a 560 g ae/ha, mais tipicamente de 70a 280 ae/ha.

b) Atualmente, os índices de glifosato aplicado em GTC'sgeralmente variam de 560 a 2240 g ae/ha por momento de aplicação.Glifosato é bem mais eficaz sobre espécies de gramíneas do que espéciesde ervas daninhas de folhas largas. Traços empilhados de AAD-12 (v1) + GTpossibilitariam índices eficazes sobre gramíneas de glifosato (105 a 840 gae/ha, mais preferencialmente 210 a 420 g ae/ha). 2,4-D (em 280 a 2240 gae/ha, mais preferencialmente 560 a 1120 g ae/ha) podem ser entãoaplicados seqüencialmente, misturados em tanque, ou como uma pré-mistura com índices eficazes sobre gramíneas de glifosato para proporcionaro necessário controle de ervas daninhas de folhas largas. Tricopir e fluroxipirnos índices mencionados acima seriam componentes aceitáveis no regimede tratamento. O baixo índice de glifosato também proporcionaria algumbenefício para o controle das ervas daninhas de folhas largas; no entanto, ocontrole primário seria do 2,4-D, triclopir, ou fluroxipir.

Uma pessoa versada na técnica de controle de ervas daninhasreconhecerá que o uso de um ou mais herbicidas de arilóxi auxinacomerciais sozinhos ou em combinação (seqüencialmente ou de modoindependente) é possibilitado por transformação por AAD-12 (v1) emcolheitas. índices específicos de outros herbicidas representativos destasquímicas podem ser determinados pelos rótulos de herbicidas compilados nolivro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótuloscompilados online (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), ou quaisquermanuais de proteção de colheitas comerciais ou acadêmicos tais como oAgriliance Crop Protection Guide (2005). Cada herbicida alternativopossibilitado para uso em HTCs por AAD-12 (v1), quer usado sozinho,misturado em tanque, ou seqüencialmente, e considerado dentro do âmbitodesta invenção.

Exemplo 19 - AAD-12 (v1) empilhado com Traco de Tolerância a Glufosinatoem Qualquer Colheita

A tolerância ao glufosinato (PAT ou όβή está presenteatualmente em uma série de colheitas plantadas na América do Norte quercomo um marcador selecionável para um traço de input como proteínas deresistência a inseto ou especificamente como um traço de HTC. As colheitasincluem, mas não estão limitadas a, canola, milho, e algodão tolerantes aglufosinato. Colheitas tolerantes a glufosinato adicionais (por exemplo, arroz,beterraba sacarina, soja, e turfa) estão em desenvolvimento mas ainda nãoforam liberadas comercialmente até o momento. Glufosinato, como oglifosato, é um herbicida de gramíneas e de folhas largas de amplo espectrorelativamente não seletivo. O modo de ação do glufosinato difere doglifosato. Tem ação mais rápida, resultando em dessecação e "queimadura"das folhas tratadas 24 a 48 horas depois da aplicação do herbicida. Isto évantajoso para o controle de ervas daninhas de aparecimento rápido. Noentanto, isto também limita a translocação do glufosinato para regiõesmeristemáticas de plantas alvo resultando em control mais pobre das ervasdaninhas conforme evidenciado por classificações de desempenho decontrole ervas daninhas relativa dos dois compostos em muitas espécies(Agriliance, 2005).Empilhamento AAD-12 (ν1) com um traço de tolerância aglufosinato, quer através de reprodução convencional ou conjuntamentecomo um novo evento de transformação, podem ser aprimoradas a eficáciado controle de ervas daninhas, flexibilidade, e capacidade para tratarmudanças de ervas daninhas e desenvolvimento de resistência a herbicida.Imaginados vários cenários para opções aprimoradas de controle de ervasdaninhas onde AAD-12 (v1) e um traço de tolerância a glufosinato sãoempilhado em quaisquer espécies de colheitas monocotiledôneas oudicotiledôneas:

a) Glufosinato pode ser aplicado em um índice de aplicação

pós-ernergente padrão (200 a 1700 g ae/ha, preferencialmente 350 a 500 gae/ha) paa o controle de muitas espécies de gramíneas e ervas daninhas defolhas largas. Até o momento, não foram confirmadas ervas daninhasresistentes a glufosinato; no entanto, glufosinato tem um maior número deervas daninhas que são inerentemente mais tolerante do que glifosato.

i) Espécies inerentemente tolerantes de ervas daninhas defolhas largas (por exemplo, Cirsium arvensis, Apocynum cannabinum, eConyza candensis) podem ser controladas por mistura em tanque de 280 a2240 g ae/ha, mais preferencialmente de 560 a 2240 g ae/ha, de 2,4-D paracontrole eficaz destas espécies perenes mais difíceis de controlar e paramelhorar a robustez do controle sobre espécies de ervas daninhas de folhaslargas anuais. Triclopir e fluroxipir seriam componentes aceitáveis paraconsiderar no regime de controle de ervas daninhas. Para triclopir, osíndices de aplicação tipicamente variariam de 70 a 1120 g ae/ha, maistipicamente de 140 a 420 g ae/ha. Para fluroxipir, os índices de aplicaçãotipicamente variariam de 35 a 560 g ae/ha, mais tipicamente de 70 a 280ae/ha.

b) Uma combinação múltipla de glufosinato (200 a 500 gae/ha) +/- 2,4-D (280 a 1120 g ae/ha) +/- triclopir ou fluroxipir (nos índiceslistados acima), por exemplo, pode proporcionar espectro de controle deervas daninhas mais robusto, de sobreposição. Adicionalmente, o espectrode sobreposição proporciona um mecanismo adicional para o tratamento ouatraso de ervas daninhas resistentes a herbicida.

Uma pessoa versada na técnica de controle de ervas daninhasreconhecerá que o uso de um ou mais herbicidas de auxina ariloxiacéticacomerciais sozinhos ou em combinação (seqüencialmente ou de modoindependente) é possibilitado por transformação por AAD-12 (v1) emcolheitas. índices específicos de outros herbicidas representativos destasquímicas podem ser determinados pelos rótulos de herbicidas compilados nolivro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótuloscompilados online (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), ou quaisquermanuais de proteção de colheitas comerciais ou acadêmicos tais como oAgriliance Crop Protection Guide (2005). Cada herbicidal alternativopossibilitado para uso em HTCs por AAD-12 (v1), quer usado sozinho,misturado em tanque, ou seqüencialmente, é considerado dentro do âmbitodesta invenção.

Exemplo 20 - AAD-12 (v1) empilhado com Traco AHAS em QualquerColheita

A tolerância a herbicida de imidazolinona (AHAS, et al.)atualmente está presente em uma série de colheitas plantadas na Américado Norte incluindo, mas não limitadas a, milho, arroz, e trigo. Colheitastolerantes a imidazolinona adicionais (por exemplo, algodão e beterrabasacarina) têm estado sob desenvolvimento mas não foram liberadascomercialmente até o momento. Muitos herbicidas de imidazolinona (porexemplo, imazamox, imazetapir, imazaquin, e imazapic) são atualmenteusados seletivamente em várias colheitas convencionais. O uso deimazetapir, imazamox, e o imazapyr não seletivo tem sido possibilitadoatravés de traços de tolerância a imidazolinona como AHAS et al. Estaclasse química também tem atividade residual no solo significativa, destemodo sendo capaz de proporcionar controle de ervas daninhas prolongadoalém do momento da aplicação, diferentemente de glifosato ou sistemas àbase de glufosinato. No entanto, o espectro de ervas daninhas controladaspor herbicidas de imidazolinona não é tão amplo quanto glifosato (Agriliance,2005). Adicionalmente, herbicidas de imidazolinona têm um modo de ação(inibição da acetolactato sintase, ALS) para o qual muitas ervas daninhasdesenvolveram resistência (Heap, 2005). Empilhamento AAD-12 (v1) comum traço de tolerância a imidazolinona, quer através de reproduçãoconvencional ou conjuntamente como um novo evento de transformação,podem ser aprimoradas a eficácia do controle de ervas daninhas, aflexibilidade, e a capacidade de tratar mudanças de ervas daninhas edesenvolvimento de resistência a herbicida. Conforme mencionado emexemplos prévios, transformando colheitas com AAD-12 (v1), colheitasmonocotiledôneas terão uma maior margem de segurança de fenóxi oupiridilóxi auxina, e estas auxinas podem ser aplicadas seletivamente emcolheitas dícotiledoneas. Podem ser imaginados vários cenários para opçõesaprimoradas de controle de ervas daninhas podem ser onde AAD-12 (v1) eum traço de tolerância a imidazolinona são empilhado em quaisquerespécies de colheitas monocotiledôneas ou dicotiledôneas:

a) Imazetapir pode ser aplicado em um índice de aplicaçãopós-emergente de rotina de (35 a 280 g ae/ha, preferencialmente 70 a 140 gae/ha) para o controle de muitas espécies de graímenas e de ervasdaninhas de folhas largas.

i) Ervas daninhas de folhas largas resistentes a ALS-inibidores como Amaranthus rudis, Ambrosia trifida, Chenopodium álbum(entre outros, Heap, 2005) podem ser controladas misturando em tanque280 a 2240 g ae/ha, mais preferencialmente 560 a 1120 g ae/ha, de 2,4-D.Para triçlopir, os índices de aplicação tipicamente variariam de 70 a 1120 gae/ha, mais tipicamente de 140 a 420 g ae/ha. Para fluroxipir, os índices deaplicação tipicamente variariam de 35 a 560 g ae/ha, mais tipicamente de 70a 280 ae/ha.

ii) Espécies de folhas largas inerentemente mais tolerantes aherbicidas de imidazolinona como Ipomoea spp. também podem sercontroladas por mistura em tanque de 280 a 2240 g ae/ha, maispreferencialmente 560 a 1120 g ae/ha, de 2,4-D. Vide os índices acima paratriçlopir ou fluroxipir.

b) Uma combinação múlitpla de imazetapir (35 a 280 gae/ha, preferencialmente 70 a 140 g ae/ha) +/- 2,4-D (280 a 1120 g ae/ha)+/- triclopir ou fluroxipir (nos índices listados acima), por exemplo, podeproporcionar espectro de controle de ervas daninhas mais robusto, desobreposição. Adicionalmente, o espectro de sobreposição proporciona ummecanismo adicional para o tratamento ou atraso de ervas daninhasresistentes a herbicidas.

Uma pessoa versada na técnica de controle de ervas daninhasreconhecerá que o uso de quaisquer dos vários herbicidas de imidazolinonacomerciais, herbicidas de auxina fenoxiacética ou piridiloxiacética, sozinhos ou em múltiplas combinações, é possibilitado por transformação por AAD-12(vi) e empühamento com qualquer traço de tolerância a imidazolinona querpor reprodução convencional ou engenharia genética. índices específicos deoutros herbicidas representativos destas químicas podem ser determinadospelos rótulos de herbicidas compilados no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados online (por exemplo,cdms.net/manuf/manuf.asp), ou quaisquer manuais de proteção de colheitascomerciais ou acadêmicos tais como o Agriliance Crop Protection Guide(2005). Cada herbicida alternativo possibilitado para uso em HTCs por AAD-12 (v1), quer usado sozinho, misturado em tanque, ou seqüencialmente, é considerado dentro do âmbito desta invenção.Exemplo 21 - AAD-12 (v1) em Arroz21.1 - Descrição dos meios.

Os meios de cultura empregados foram ajustados para pH 5,8com 1 M de KOH e solidificados com 2,5 g/L de Phytagel (Sigma). Calosembriogênicos foram cultivados em 100 χ 20 mm placas de Petri contendo40 ml de meio semi-sólido. Plântulas de arroz foram cultivadas em 50 ml demeio em caixas Magenta. As suspensões celulares foram mantidas emfrascos cônicos de de 125 ml contendo 35 ml de meio líquido e centrifugadasa 125 rpm. Indução e manutenção de culturas embriogênicas ocorreram no escuro em 25 a 26°C, e ocorreram regeneração da planta e cultura de plantasaudável em um fotoperíodo de 16 horas (Zhang et ai. 1996).

Indução e manutenção de calo embriogênico ocorreram sobremeio basal NB conforme descrito previamente (Li etal. 1993), mas adaptadopara conter 500 mg/L de glutamina. Culturas de suspensão foram iniciadas emantidas em meio líquido SZ (Zhang et al. 1998) com a inclusão de 30 g/Lde sacarose ao invés de maltose. Meio osmótico (NBO) consistiu de meio NB com a adição de 0,256 M cada de manitol e sorbitol. Calo resistente ahigromicina B foi selecionado sobre meio NB suplementado com 50 mg/L dehigromicina B por 3 a 4 semanas. Pré-regeneração ocorreu sobre meio(PRH50) consistindo em meio NB sem ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D),mas com a adição de 2 mg/L de 6-benzilaminopurina (BAP), 1 mg/L de ácido α-naftalenoacético (NAA), 5 mg/L de ácido abscísico (ABA) e 50 mg/L dehigromicina B por uma ssmana. A regeneração de plântulas seguiu atravésde cultura sobre meio de regeneração (RNH50) compreendendo meio NBsem 2,4-D, e suplementadas com 3 mg/L de BAP, 0,5 mg/L de NAA,' e 50mg/L de higromicina B até os brotos regenerarem. Os brotos foramtransferidos para meio de enraizamento com sais basais de Murashige eSkoog de meia-potência e vitaminas B5 de Gamborg, suplementadas com1% de sacarose e 50 mg/L de higromicina B (1/2MSH50).21.2 - Desenvolvimento de cultura de tecido

Sementes dessecadas maduras de Oryza sativa L. japonica cv.Taipei 309 foram esterilizadas conforme descrito em Zhang et al. 1996.Tecidos embriogênicos foram induzidos cultivando sementes de arrozmaduras estéreis sobre meio NB no escuro. O calo primário deaproximadamente 1 mm de diâmetro, foi removido do escutelo e usado parainiciar a suspensão celular em meio líquido SZ. Em seguida as suspensões foram mantidas conforme descrito em Zhang 1995. Tecidos embriogênicosderivados de suspensão foram removidos da cultura líquida 3 a 5 diasdepois da subcultura prévia e colocados sobre meio osmótico NBO paraformar um círculo de cerca de 2,5 cm sobre em uma placa de Petri ecultivados por 4 horas antes de bombardeamento. Dezesseis a 20 horasdepois do bombardeamento, os tecidos foram transferidos do meio NBOpara meio de seleção de higromicina B NBH50, assegurando que asuperfície bombardeada estivesse virada para cima, e incubados no escuropor 14 a 17 dias. Calo recém formado foi em seguida separado dosexplantes bombardeados originais e colocados próximos sobre o mesmomeio. Depois de um adicional de 8 a 12 dias, calo opaco relativamentecompacto foi identificado visualmente, e transferido para meio de pré-regeneração PRH50 por 7 dias no escuro. Calo em crescimento, o qual setornou mais compacto e opaco foi em seguida subcultivado sobre meio deregeneração RNH50 por um período de 14 a 21 dias sob um fotoperíodo de16 horas. Os brotos em regeneração foram transferidos para caixas Magentacontendo meio Vfe MSH50. Múltiplas plantas regeneradas de um únicoexplante são consideradas parentes e foram tratadas como uma linhagemvegeta! independente. Uma planta foi classificada como positiva para o genehph se produziu raízes brancas espessase cresceu vigorosamente sobremeio Vfe MSH50. Uma vez que as plântulas tinham atingido o topo das caixasMagenta, foram transferidas para o solo dentro de um pote de 6 cm sob100% de umidade por uma semana, e em seguida movidas para umacâmara de crescimento com um período de 14 horas de luz a 30°C e noescuro a 210C por 2 a 3 semanas antes de transplantar para dentro de potesde 13 cm na estufa. As sementes foram coletadas e secadas a 37°C poruma semana antes do armazenamento.

21.3 - Bombardeamento de microproiéteis

Todos os bombardeamentos foram conduzidos com o sistemaBiolistic PDS-1000/He® (Bio-Rad, Laboratories, Inc.). Três miligramas departículas de ouro de 1,0 mícron de diâmetro foram lavadas uma vez com100% de etanol, duas vezes com água destilada estéril e ressuspensas em50 μl de água em um tubo siliconizado Eppendorf. Cinco microgramas deDNA de plasmídeo representando uma proporção molar de 1:6 depDOW3303 (vetor contendo Hpt) para pDAB4101 (.AAD-12 (v1)+AHAS), 20μΙ de espermidina (0,1 M) e 50 μΙ de cloreto de cálcio (2,5 M) foramadicionados à suspensão de ouro. A mistura foi incubada em temperaturaambiente por 10 min, peletizada a 10000 rpm por 10 segundos, ressuspensaem 60 μl de ouro 100% de etanol e 8 a 9 μΙ foi distribuído sobre cadamacrocarreador. Amostras de tecido foram bombardeadas a 7,58 MPa (1100psi) e 27 em vácuo de Hg conforme descrito por Zhang et ai (1996).

21.4 - Tolerância a herbicida pós-emeraência em Arroz Tn transformadocom AAD-12 (v1)

Plântulas de arroz no estágio de 3 a 5 folhas foram pulverizadascom uma dose letal de solução a 0,16% (v/v) de Pursuit (para confirmar apresença do gene AHAS) contendo 1% de Sunit Il (v/v) e 1,25% de UAN(v/v) usando um pulverizador de trilha calibrado para 187 L/ha. Aclassificação para sensibilidade ou resistência foi realizada em 36 diasdepois do tratamento (DAT). Dez dos 33 eventos enviados para a estufaforam fortemente tolerantes ao Pursuit; outros sofreram níveis variáveis delesão por herbicida. As pianías foram amostradas (de acordo com a seção21.7 abaixo) e foi realizada caracterização molecular conforme previamentedescrito no Exemplo 8 que identificou sete destes 10 eventos comocontendo tanto a região codificante AAD-12 (v1) PTU quanto toda a regiãocodificante AHAS.

21.5 - Hereditariedade de AAD-12 (v1) em arroz T1

Um teste da progênie de 100 plantas foi conduzido sobre cindolinhagens Ti de linhagens AAD-12 (v1) que continham tanto a regiãocodificante AAD-12 (v1) PTU quanto AHAS. As sementes foram plantadascom respeito ao procedimento acima e pulverizadas com 140 g ae/ha deimazetapir usando um pulverizador de trilha conforme previamente descrito.Depois de 14 DAT, foram contadas as plantas resistentes e sensíveis. Duasdas cinco linhagens testadas segregaram como um único locus, traçoMendeliano dominante (3R:1S) conforme determinado por análise Quiquadrada. AAD-12 co-segregou com o marcador selecionável AHASconforme determinado por prova de tolerância a 2,4-D abaixo.

21.6 - Verificação de alta tolerância a 2.4-D em Arroz Ti

As seguintes linhagens de único lócus segregante Ti AAD-12(v1) foram plantadas dentro de potes de 7,62 cm (3 polegadas) contendomeio Metro Mix: pDAB4101 (20)003 e pDAB4101 (27)002. No estágio de duasa 3 folhas foram pulverizadas com 140 g ae/ha de imazetapir. As plantasnulas foram eliminadas e os indivíduos foram pulverizados no estágio V3-V4no pulverizador de trilha ajustado para 187 L/ha a 1120, 2240 ou 4480 gae/ha de 2,4-D DMA (2X, 4X, e 8X índices de uso comercial típico,respectivamente). As plantas foram classificadas em 7 e 14 DAT ecomparadas com cultivar de arroz comercial não transformado, 'Lamont,'como plantas controle negativas.

Dados de lesão (Tabela 27) mostram que as linhagenstransformadas com AAD-12 (v1) são mais tolerantes a altos índices de 2,4-DDMA do que os controles não transformados. A linhagem pDAB4101 (20)003foi mais tolerante a altos níveis de 2,4-D do que a linhagempDAB4101 (27)002. Os dados também demonstram que a tolerância de 2,4-

D é estável por no mínimo duas gerações.

<table>table see original document page 164</column></row><table>

21.7 - Cultura de tecido, isolamento e quantificação de DNA

Tecido fresco foi colocado dentro de tubos e Iiofilizado a 4°C por2 dias. Depois do tecido ser totalmente secado, uma conta de tungstênio(VaIenite) foi colocada dentro do tubo e as amostras foram submetidas a 1minuto de trituração a seco usando um moinho de esferas Kelco.O procedimento de isolamento de DNA DNeasy padrão foi então seguido(Qiagen, Dneasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído foi em seguidacorada com Pico Green (Molecular Probes P7589) e escaneada nofluorômetro (BioTek) com padrões conhecidos para obter a concentração emng/μl.21.8 - Expressão de AAD-12 (v1)

As condições de preparação e análise das amostras foramconforme descrito previamente. Todas as linhagens de arroz transgênico 33Toe 1 controle não transgênico foram analisadas para expressão de AAD-12 usando ELISA blot. AAD-12 foi detectado nos clones de 20 linhagens, masnão na planta controle linhagem Taipai 309. Doze das 20 linhagens quetinham alguns dos clones tolerantes a imazetapir expressavam proteínaAAD-12, foram AAD-12 PCR PTU positivas, e positivas para regiãocodificante AHAS. Os níveis de expressão variaram de 2,3 a 1092,4 ppm de proteína solúvel total.

21.9 - Tolerância de campo de plantas de arroz pDAB4101 a herbicidas de2.4-D e triclopir

Foi conduzido uma prova de tolerância a nível de campo comAAD-12 (v1) evento pDAB4101[20] e um arroz selvagem (Clearfield 131) emWayside, Mississippi (uma variedade resistente a imidazolinona nãotransgênica). O design experimental foi um design em bloco completorandomizado com uma única replicação. Tratamentos de herbicida foramíndices de 2X de 2,4-D (sal de dimetilamina) a 2240 g ae/ha e triclopir a 560g ae/ha mais um controle não tratado. Dentro de cada tratamento herbicida, duas Ieiras da geração Ti pDAB4101[20] e duas Ieiras de arroz Clearfieldforam plantadas usando uma pequena broca de lote com espaçamento deIeira de 20,32 cm (8 polegadas). O arroz pDAB4101[20] continha o geneAHAS como um marcador selecionável para o gene AAD-12(v1). Imazetapirfoi aplicado no estágio de uma folha como agente de seleção para remover quaisquer plantas nulas AAD-12 (v1) dos lotes. Os tratamentos herbicidasforam aplicados quando o arroz atingiu o estágio de duas folhas usandopulverizador portátil de ar comprimido liberando 187 L/ha de carreira volumea 130 a 200 kpa de pressão. Classificações visuais de lesão foram tomadasem 7, 14 e 21 dias depois da aplicação.

Reação do evento AAD-12 (v1) a 2,4-D e triclopir é mostrada na

Tabela 28. A linhagem de arroz não transformada (Clearfield) foi gravementedanificada (30% a 7DAT e 35% a 15DAT ) por 2,4-D a 2240 g ae/ha o qual éconsiderado 4X o índice de uso comercial. O evento AAD-12 (v1)demonstrou excelente tolerância a 2,4-D sem lesão observada em 7 ou15DAT. O arroz não transformado foi significaricamente danificado (15% a7DAT e 25% a 15DAT) por 2X o índice de triclopir (560 g ae/ha). O eventoAAD-12 (v1) demonstrou excelente tolerância a 2X os índices de triclopirsem lesão observada ou a 7 ou a 15DAT.

Estes resultados indicam que o arroz transformado AAD-12 (v1)apresentaram um alto nível de resistência a 2,4-D e triclopir em índices quecausaram grave lesão visual ao arroz Clearfield. Também demonstra acapacidade de empilhamento múltiplos genes de tolerância a herbicida commúltiplas espécies AAD-12 I para proporcionar resistência a um espectromais amplo de químicas eficazes._

Tabela 28. Reação de plantas da geração AAD-12 Ti a 2,4-D e triclopir sob condições de campo.

<table>table see original document page 166</column></row><table>

Exemplo 22 - AAD-12 (v1) em Canola

22.1 - Transformação de Canola

O gene AAD-12 (v1) conferindo resistência a 2,4-D foi usadopara transformar Brassica napus var. Nexera* 710 com transformaçãomediada por Agrobacterium e plasmídeo pDAB3759. O constructo continhagene AAD-12 (v1) orientado por CsVMV promotor e gene Pat orientado porAtUbiIO promotor e o traço de resistência a glifosato EPSPS orientado porAtUbiI0 promotor (vide a seção 2.4).

As sementes foram esterilizadas superficialmente com 10% dealvejante comercial por 10 minutos e enxaguadas 3 vezes com águadestilada estéril. As sementes foram em seguida colocadas sobre meiaconcentração de meio basal MS (Murashige e Skoog, 1962) e mantidas sobregime de crescimento ajustado a 25°C, e um fotoperíodo de 16 horas deluz/8 horas de escuridão.

Segmentos de hipocótilo (3 a 5 mm) foram excisados de mudasde 5 a 7 dias de idade e colocados sobre meio de indução de calo K1D1(meio MS com 1 mg/L de cinetina e 1 mg/L de 2,4-D) por 3 dias como pré-tratamento. Os segmentos foram em seguida transferidos para uma placa depetri, tratados com Agrobacterium cepa Z707S ou LBA4404 contendopDAB3759. O Agrobacterium foi cultivado de um dia para o outro a 285C noescuro em um agitador a 150 rpm e subseqüentemente ressuspenso nomeio de cultura.

Depois de 30 minutos de tratamento dos segmentos dehipocótilo com Agrobacterium, estes foram colocados de volta sobre o meiode indução de calo por 3 dias. Depois de co-cultivo, os segmentos foramcolocados sobre K1D1TC (meio de indução de calo contendo 250 mg/L deCarbenicilina e 300 mg/L de Timentin) por uma semana ou duas semanas derecuperação. Alternativamente, os segmentos foram colocados diretamentesobre meio de seleção K1D1H1 (acima de meio com 1 mg/L de Herbiace).Carbenicilina e Timentin foram os antibióticos usados para matar oAgrobacterium. O agente de seleção Herbiace permitiu o crescimento dascélulas transformadas.

Segmentos de hipocótilo com calos foram em seguida colocadossobre meio de regeneração de broto B3Z1H1 (meio MS1 3 mg/L debenzilamino purina, 1 mg/L de Zeatina, 0,5 gm/L de MES [ácido 2-(N-morfolino) etano sulfônico], 5 mg/L de nitrato de prata, 1 mg/L de Herbiace,Carbenicilina e Timentin). Depois de duas a 3 semanas os brotoscomeçaram a regenerar. Segmentos de hipocótilo junto com os brotos sãotransferidos para meio B3Z1H3 (meio MS, 3 mg/L de benzilamino purina, 1mg/L de Zeatina, 0,5 gm/L de MES [ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico], 5mg/L de nitrato de prata, 3 mg/L de Herbiace, Carbenicilina e Timentin) poroutras 2 a 3 semanas.Os brotos foram excisados dos segmentos de hipocótilo etransferidos para meio de alongamento de broto MESH5 ou MES10 (MS, 0,5gm/L MES, 5 ou 10 mg/L de Herbiace, Carbenicillin, Timentin) por 2 a 4semanas. Os brotos alongados são cultivados para indução de raiz sobreMSI.1 (MS com 0,1 mg/L de ácido Indolbutírico). Uma vez que as plantastenham um sistema de raiz bem estabelecido, estas foram transplantadaspara o solo. As plantas foram aclimatadas sob condições ambientaiscontroladas no Conviron por 1 a 2 semanas antes de transferência para aestufa.

22.2 - Análise molecular: materiais e métodos de canola

22.2.1 - Isolamento e quantificação de DNA de cultura de tecido

Tecido fresco foi colocado dentro de tubos e liofilizados a 4°Cpor 2 dias. Depois do tecido ser totalmente secado, uma conta de tungstênio(VaIenite) foi colocada dentro do tubo e as amostras foram submetidas a 1minuto de trituração a seco usando um moinho de esferas Kelco. Oprocedimento de isolamento de DNA DNeasy padrão foi então seguido(Qiagen, DNeasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído foi em seguidacorado com Pico Green (Molecular Probes P7589) e lida no fluorômetro(BioTek) com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/ul.22.2.2 - Reação de cadeia polimerase

Um total de 100 ng de DNA total foi usado como o modelo. 20mM de cada iniciador foi usado com o kit Takara Ex Taq PCR Polymerase(Mirus TAKRR001A). Iniciadores para Região Codificante PCR AAD-12 (v1)foram (SEQ ID N9: 10) (dianteiro) e (SEQ ID N9: 11) (reverso). A reação dePCR foi realizada no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems),submetendo as amostras a 94°C por 3 minutos e 35 ciclos de 94°C por 30segundos, 65°C por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos seguido por 72°Cpor 10 minutos. Produtos de PCR foram analisados por eletroforese sobreum gel agarose a 1% corado com EtBr. 35 amostras de 35 plantas comeventos AAD-12 (v1) apresentaram resultado positivo. Três amostrascontrole negativas apresentaram resultado negativo.22.2.3 - ELISA

Usando o ELISA estabelecido descrito na seção anterior,proteína AAD-12 foi detectada em 5 eventos vegetais de transformação decanola diferentes. Os níveis de expressão variaram de 14 a mais de 700ppm de proteína solúvel total (TSP). Três amostras de plantas nãotransformadas diferentes foram testadas em paralelo sem sinal detectado,indicando que os anticorpos usados no teste têm mínima reatividadecruzada com a matriz celular de canola. Estas amostras foram tambémconfirmadas positivas por análise Western. Um sumário dos resultados éapresentado na Tabela 29.

<table>table see original document page 169</column></row><table>

22.4 - Tolerância a herbicida pós-emergência em Canola Tn transformadacom AAD-12M)

Quarenta e cinco eventos T0 do transformado com o constructopDAB3759, foram enviados para a estufa durante um período de tempo eforam deixados para aclimatar na estufa. As plantas foram cultivadas atéterem surgido 2 a 4 folhas novas, de aspecto normal (isto é, as plantas terempassado de cultura de tecido para condições de crescimento em estufa). Asplantas foram em seguida tratadas com uma dose letal das formulaçõescomerciais de 2,4-D Amina 4 em um índice de 560 g ae/ha. As aplicações deherbicida foram feitas com um pulverizador de trilha em um volume de sprayde 187 LVha, altura de spray de 50 cm. Uma dose letal é definida como oíndice que causa >95% de lesão para os controles não transformados.

Vinte e quatro dos eventos foram tolerantes à aplicação doherbicida 2,4-D DMA. Alguns eventos incorreram em lesão menor masrecuperaram por 14 DAT. Os eventos progrediram para a geração T1 (e T2)por auto-polinização sob condições controladas, ensacada.

22.5 - Hereditariedade de AAD-12 (v1) em Canola

Um teste de progênie de 100 plantas também foi conduzidosobre 11 linhagens Ti de AAD-12 (vi). As sementes foram semeadas etransplantadas para potes de 7,62 cm (3 polegadas) enchidos com meioMetro Mix. Todas as plantas foram em seguida pulverizadas com 560 gae/ha de 2,4-D DMA conforme previamente descrito. Depois de 14 DAT,plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Sete das 11 linhagenstestadas segregaram como um traço Mendeliano dominante (3R:1S) deúnico lócus conforme determinado por análise Qui-quadrada. AAD-12 éhereditário como um gene de resistência a ariloxialcanoato auxina robustoem múltiplas espécies e pode ser empilhado com um ou mais genes deresistência a herbicida adicionais.

22.6 - Verificação de alta tolerância a 2.4-D em Canola Ti

Para Ti AAD-12 (v1), 5 a 6 mg de semente foram estratificados,semeados, e uma fina camada de meio Sunshine Mix N9 5 foi adicionadocomo uma camada superior de terra. Plantas emergentes foramselecionadas com 560 g ae/ha de 2,4-D em 7 e 13 dias depois do plantio.

As plantas sobreviventes foram transplantadas para dentro depotes de 7,62 cm (3 polegadas) contendo meio Metro Mix. As plantassobreviventes das progênies T1, que foram selecionadas com 560 g ae/hade 2,4-D, também foram transplantadas para dentro de potes de 7,62 cm (3polegadas) enchidos com terra Metro Mix. No estágio de 2-4 folhas asplantas foram pulverizadas com ou 280, ou 560, ou 1120, ou 2240 g ae/hade 2,4-D DMA. As plantas foram classificados em 3 e 14 DAT e comparadascom plantas controle não transformadas. Uma amostragem de 14DAT dedados de lesão do evento T1 pode ser vista na Tabela 30. Os dadossugerem que múltiplos eventos são robustamente resistentes a 2240 g ae/hade 2,4-D, ao passo que outros eventos demonstraram tolerância menosrobusta até 1120 g ae/ha de 2,4-D. As plantas sobreviventes foramtransplantadas para potes de 13,33 cm (5 1/4 polegadas) contendo meioMetro Mix e postas nas mesmas condições de crescimento como antes e

Aplicações de 2,4-D DMA em T1 AAD-12 (vi) e controle não transformado em resposta à taxas variáveis de pós-emergência. <table>table see original document page 171</column></row><table>

22.7 - Tolerância de campo de plantas de canola PDAB3759 aos herbicidas2.4-D. dicloprop. triclopir e fluroxipir

Foi conduzido teste de tolerância de nível de campo sobre doiseventos de AAD-12 (Vf j; 3759(20)018.001 e 3759(18)030.001 e uma canolaselvagem (Nex710) em Fowler, Indiana. O design experimental foi um designde bloco completo randomizado com 3 replicações. Os tratamentosherbicidas foram 2,4-D (sal de dimetilamina) a 280, 560, 1120, 2240 e 4480g ae/ha, triclopir a 840 g ae/ha, fluroxipir a 280 g ae/ha e um controle nãotratado. Dentro de cada tratamento herbicida, única Ieira de 20 pés/eventopara evento 3759(18)030.0011, 3759(18)018.001 e linhagem selvagem(Nex710) foi plantada com uma broca de 4 Ieiras sobre espaçamento de Ieirade 20,32 cm (8 polegadas). Os tratamentos herbicidas foram aplicadosquando a canola atingiu o estágio de 4 a 6 folhas usando pulverizadorportátil de ar comprimido liberando 187 L/ha de volume de carregador a 130-200 kpa de pressão. Foram feitas classificações visuais de lesão em 7, 14 e21 dias depois da aplicação.

A reação da canola a 2,4-D, triclopir, e fluroxipir é mostrada naTabela 31. A canola selvagem (Nex710) foi severamente danificada (72% a14DAT) por 2,4-D a 2240 g ae/ha a qual é considerada o índice de 4X. Oseventos de AAD-12 (v1) todos demonstraram excelente tolerância a 2,4-Dem 14DAT com uma dano médio de 2, 3 e 2% observado nos índices de 1, 2e 4X, respectivamente. A canola selvagem foi severamente danificada (25%a 14DAT) pelo índice de 2X de triclopir (840 g ae/ha). Os eventos de AAD-12(v1) demonstraram tolerância a índices de 2X de triclopir com uma média de6% de lesão a 14DAT através dos dois eventos. Fluroxipir a 280 g ae/hacausou lesão severa (37%) na linhagem não transformada a 14DAA. Oseventos de AAD-12 (v1) demonstraram aumento de tolerância com umamédia de 8% de lesão a 5DAT.

Estes resultados indicam que eventos transformados por AAD-12 (v1) apresentaram um alto nível de resistência a 2,4-D, triclopir e fluroxipirem índices que foram letais ou causaram severas malformações epinásticasem canola não transformada. Foi demonstrado que AAD-12 tem eficáciarelativa de 2,4-D> triclopir > fluroxipir.

<table>table see original document page 172</column></row><table>

Médias com uma coluna com diferentes letras sãosignificativamente diferentes conforme definido por LSD (p = 0,05).Exemplo 23 -- AAD-12 (v1) empilhado Com Resistência a Insetos (IR) ouOutros Traços de Input em Qualquer ColheitaA resistência a inseto em colheitas supridas por um traçotransgênico é prevalente na produção de milho e algodão na América doNorte e através do globo. Produtos comerciais tendo traços de IR e HTcombinados foram desenvolvidos por múltiplas empresas de sementes.Estas incluem traços de Bt IR (por exemplo, toxinas Bt listadas no websitelifesci.sussex.ac.uk, 2006) e qualquer um ou todos os traços de HTCmencionado acima. O valor que este oferta traz é na capacidade de controlarproblemas de múltiplas pragas através de meios genéticos em uma únicaoferta. A conveniência desta oferta será limitada se o controle de ervasdaninhas e o controle de insetos são realizados independente um do outro.AAD-12 (v1) somente ou empilhado com um ou mais traços de HTCadicionais pode ser empilhado com um ou mais traços de entrada adicionais(por exemplo, resistência a insetos, resistência fúngica, ou tolerância astress, et al.) (isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005) ou através dereprodução convencional ou conjuntamente como um novo evento detransformação. Os benefícios incluem a conveniência e a flexibilidadedescritas nos Exemplos 15 a 20 acima, junto com a capacidade de tratarpragas de insetos e/ou outros stresses agronômicos além de aprimoradocontrole de ervas daninhas oferecido por AAD-12 e tolerância a herbicidaassociada. Deste modo, a invenção em questão pode ser usada paraproporcionar um pacote agronômico completo de qualidade de colheitaaprimorada com a capacidade de controlar flexivelmente e de modo comcusto eficaz qualquer número de problemas agronômicos.

Traços combinados de IR e HT têm aplicação na maioria dascolheitas agronômicas e hortícolas/ornamentais e em silvicultura. Acombinação de AAD-12 e sua tolerância a herbicida comensurado eresistência a inseto proporcionada por qualquer do número de genes de IRBt ou não-Bt pode ser aplicada às espécies de colheitas listadas no (masnão limitadas ao) Exemplo 13. Uma pessoa versada na técnica de controlede ervas daninhas reconhecerá que o uso de qualquer um de váriosherbicidas comerciais descritos nos Exemplos 18 a 20, herbicidas de auxinafenoxiacética ou piridiloxiacética, sozinhos ou em múltiplas combinações, épossibilitado por transformação de AAD-12 (v1) e empilhamento com o traçode HT correspondente ou traço de IR quer por reprodução convencional quer por engenharia genética. índices específicos de outros herbicidasrepresentativos destas químicas podem ser determinados pelos rótulos deherbicida compilados no livro CPR ("Crop Protection Reference", Referênciapara Proteção de Colheitas) ou compilação similar, rótulos compilados online(por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), ou quaisquer manuais para proteção de colheitas comerciais ou acadêmicos tais como o Agriliance CropProtection Guide (2005). Cada herbicida alternativo possibilitado para usoem HTCs por AAD-12 (v1), quer usado sozinho, misturado em tanque, ouseqüencialmente, é considerado dentro do âmbito desta invenção.Exemplo 24 — AAD-12 (v1) como um Marcador Selecionável de Dicotiledônea in vitro

A engenharia genética de célula vegetal, tecido, órgão, e plantaou organela tais como plastídeo se inicia com o processo de inserir genes deinteresse em células vegetais usando um método de liberação adequado. Noentanto, quando um gene é liberado em células vegetais, somente uma percentagem extremamente pequena de células integrama o geneheterogêneo em seu genoma. De modo a selecionar as poucas células queincorporaram o gene de interesse, os pesquisadores encadeiam um"marcador genético" selecionável ou triável para o gene de interesse (GOI)no vetor. As células que contêm estes marcadores são identificadas entre toda a população de células/tecido à qual o vetor do plasmídeo de DNA foiliberado. Selecionando as células que expressam o gene marcador, ospesquisadores têm capacidade de identificar as poucas células que podemser incorporado o GOI em seu genoma.

Há uma variedade de marcadores selecionáveis disponíveis para possibilitar este processo de seleção para obter células transgênicas,calo, embriões, brotos e plântulas. Os marcadores selecionáveispreferenciais pela indústria Ag são marcadores de herbicidas quepossibilitam a facilidade de pulverização de compostos no campo paraselecionar as progênies transgênicas corretas durante o processo declassificação de evento na situação de campo. Foi demonstrado que AAD-12(v1) serve de modo eficaz como um marcador selecionável para plantassadias transformadas com o gene na estufa e em câmara de crescimento(Exemplo 7) com 2,4-D como o agente de seleção. A seleção de campo épossível também usando 2,4-D em combinação com o gene AAD-12 (v1)(Exemplo 11, 22), mas o uso in vitro para seleção a nível celular écomplicado pelo fato de que 2,4-D é usado quase ubiquamente como umregulador de crescimento vegetal nos sistemas de cultura de tecido vegetal.A degradação deste importante hormônio por AAD-12 (v1) pode afetar acapacidade de usar este gene como um marcador selecionável in vitro. Osucesso do desenvolvimento de 2,4-D como um gene marcador depende deidentificar o regulador de crescimento vegetal alternativo correto que podesimular o efeito de 2,4-:D no sistema" de cultura respectivo e ao mesmotempo possuir a capacidade de ser estável e não ser degradado pela enzimaAAD-12 quando expressado nas células transgênicas. R-diclorprop é umanálogo próximo a 2,4-D que não é um substrato para AAD-12 (v1) e éusado um substituto de auxina não metabolizável em culturas celulares detabaco possibilitando que 2,4-D seja usado em altos índices como umagente de seleção. Este fato foi usado exemplificando que AAD-12 (v1) podeser usado como um marcador selecionável in vitro.

24.1 — Cultura celular - Auxinas alternativas

AAD-12 (v1) degrada 2,4-D, mas não ácido R-2,4-diclorofenoxipropiônico (R-diclorprop), o qual tem ao mesmo tempo orequisito estrutural de um regulador de crescimento de auxínico. Outrasauxinas vegetais não-metabolizáveis que pode ser usadas em cultura celularincluem NAA (ácido naftaleno acético), IAA (ácido indol acético), dicamba,picloram, e R-mecoprop. Foi investigado se era possível substituir R-diclorprop e manter com sucesso duas suspensões de culturas celulares detabaco diferentes PHL (Petite Havanna) e BY2. De modo oposto, paraexplantes de algodão foram testados R-diclorprop, dicamba, e picloramcomo auxinas alternativas e foi avaliada a reação de indução de caloembriogênico em comparação com o regulador de crescimento de rotina,2,4-D. Cotilédones de tabaco Petite Havana (PHL) e algodão Coker foramusados em seus experimentos.

24.1.1 — Suspensão de células de tabaco — 2.4-D como agente de seleção

Foi conduzido um estudo de dose resposta com tanto as célulasPHL habituadas com R-diclorprop quanto as células BY2 habituadas com R-diclorprop onde R-diclorprop foi substituído diretamente por 2,4-D em meiode cultura. Embora o foco fosse sobre PHL, também foi feito uma doseresposta com BY2 em caso de possíveis estudos futuros, bem como paraajudar a prever a dose resposta para PHL. Para a dose resposta de PHLhabituadas com diclorprop, os níveis de 2,4-D usados (sobre meio LSBY2Ccom R-diclorprop) foram 0 (o controle), 1, 2, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 40,60, 80,10,110,120 mg/L de 2,4-D. Houve quatro replicações porconcentração. Para a dose resposta de BY2 habituadas com R-diclorprop,os níveis de 2,4-D usados (sobre meio LSBY2C) foram 0 (o controle), 1, 2, 3,5, 8, 10, 20, 30,40, mg/L de 2,4-D.

O estudo de dose resposta realizado mostrou que todas asconcentrações de 2,4-D testadas foram letais acima de concentrações de 10mg/ L. No entanto, houve crescimento em todas as concentrações até 10-mg/L de 2,4-D onde foi observado um ligeiro crescimento de suspensão dePHL. O crescimento das colônias de suspensão de concentrações de 1 a 8mg/L de 2,4-D foi comparável com o crescimento em tratamentos controle. Aobservação feita em células da suspensão BY2 foram similares exceto que aconcentração a 10 mg/L foi considerada letal e a concentração sub letal foi 8mg/L de concentração.

24.1.2 — Transformação de células de tabaco com AAD-12 (v1) e seleçãopor 2.4-D

Para experimento de transformação de tabaco, houve 11tratamentos ao todo: uma série controle laminada sobre meio LS-BY2C +diclorprop, e 10 séries de LSBY2C + diclorprop + 2,4-D em níveis variáveisde concentração (1, 2, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20 mg/L). Houve quatroreplicações por tratamento. O vetor de DNA de plasmídeo usado foipDAB724, e o vetor usado para transformação foi cepa EHA101S deAgrobacterium tumefaciens. Quatro ml de suspensão de PHL em 0,6 OD660foram misturados com 100 ul de suspensão de Agrobacterium (quer cepasEHA101 ou LBA4404) em 1,0 OD660 em uma placa de Petri estéril e forammisturados completamente e co-cultivados juntos em uma condição de nãoagitação em uma câmara de crescimento escura por 3 dias a 25°C . Depoisdo período de co-cultivo 1,5 ml da mistura de suspensão de Agro-tobacco foilaminada para a série 11 de lâminas acima. O experimento foi repetido com13 tratamentos: um controle de meio LS-BY2C + diclorprop (sem 2,4-D), eLS-BY2C + diclorprop + 2,4-D (1, 2, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20 mg/L);LSBY2C + 1 mg/L de 2,4-D + B10 (Bialophos); LSBY2C + 10 2,4-D + B10 +R-diclorprop. Novamente, houve quatro replicatas por tratamento, bem comoum controle positivo e negativo. Todos os meios contêm 500 mg/L deCarbenicilina (C) para controle para conter crescimento de Agrobacteriumnos meios de seleção.

O plasmídeo usado nestes experimentos é pDAB724 e tambémtem marcador selecionável PAT. Deste modo, experimentos detransformação controle foram iniciados usando PHL habituadas com R-diclorprop na presença de 10 mg/L de bialofos seguindo o protocolo padrãodescrito acima. Os tratamentos foram feitos junto com 4 replicatas para verse a seleção de bialofos nesta suspensão é normal.

Houve pouco crescimento observado em todas asconcentrações de seleção de 2,4-D testadas acima de 10 mg/L; no entanto,várias colônias de rápido crescimento foram encontradas em 2, 5, umaconcentração de 8 mg/L de 2,4-D e amostra representativa foi transferidapara seleção fresca em 10 mg/L de seleção para avolumar o calo. Alémdisso, várias colônias putativas foram selecionadas em a partir de 12, 15, 18e 20 mg/L de 2,4-D, mas quando comparadas com 10 mg/L houve somentepoucas colônias nesta lâmina de seleção. O tratamento controle conduzidocom seleção de bialofos apresentou desenvolvimento de colônia normal.Parece que 10 mg/L de 2,4-D é a concentração subletal e acima destaconcentração 2,4-D parece ser letal para as células não transformadas.Todas as colônias identificadas foram transferidas para meio fresco com 10mg/L de seleção e foram sondadas para a presença de transgene por PCRconforme descrito no Exemplo 10. As colônias selecionadas e avolumadas tiveram os transgenes conforme determinado por PCR e expressão dosgenes conforme estabelecido pelas análises Western (conforme descrito noexemplo 10). Várias colônias foram identificadas como crescendoativamente e foram transferidas para meio de seleção fresco com 10 mg/Lde 2,4-D para avolumar o calo.

Os calos avolumados foram em seguida transferidos para omaior nível de 2,4-D para testar o nível de tolerância in vitro. Os níveis de2,4-D usados foram 20, 40, 60, 80, 100, e 120 mg/L de 2,4-D. No entanto, ocalo não cresceu além de concentrações de 20 mg/L de 2,4-D indicando quepode existir uma concentração de limiar maior do que 20 mg/L.24.2.1— Explantes de algodão — auxina alternativas

Um estudo de dose resposta foi iniciado para testar múltiplasalternativas de auxina como um substituto para o uso de 2,4-D como umregulador de crescimento em algodão. As alternativas de auxina testadasforam 2,4-diclorprop, dicamba, e picloram. Estes compostos foram testadosem concentrações de 0,2, 2,0, e 20,0 uM respectivamente. 2,4-D foi usadocomo o tratamento controle em concentração de 0,02 uM. O meio usado é omeio de base para indução de calo de algodão (Exemplo 12). Além da faseinicial da cultura, auxina é removida do meio para estimular o tecido para oprocesso de regeneração.

R-diclorprop não foi eficaz na indução de calo em segmentoscotiledonários e parece tóxico para células de algodão na menorconcentração testada (0,02 uM). Dicamba induz de modo eficaz crescimentode calo em todas as concentrações testadas (0,02 a 20 uM) e não temefeitos tóxicos aparentes nesta faixa de concentração. A indução de calo30 com picloram aumentou até um máximo quando explantes foram tratadoscom 0,2 uM a 20 uM. A qualidade do calo foi consistente com o tratamentopadrão com 2,4-D na concentração de picloram de 2 uM. Na maiorconcentração (20 uM) 2,4-D também foi inibidor para produção ecresceminento de calo de algodão.

Algodão apresentou capacidade inicial para responder de modoeficaz a auxinas alternativas (a 2,4-D) em cultura. Em concentraçõessuficientemente elevadas, 2,4-D é tóxica para explantes cotiledonários doalgodão. R-diclorprop é surpreendentemente e significativamente mais tóxicopara o algodão do que 2,4-D ou outras auxinas. 2,4-D pode ser usado comoum agente de seleção e em combinação com AAD-12 (v1) como o genemarcador selecionável. Outros substitutos de auxina não metabolizáveis (porexemplo, dicamba, picloram, R-mecoprop, NAA, ou IAA) permitiriam o usode AAD-12 como um marcador selecionável em dicotiledôneas com 2,4-Dcomo o agente de seleção.Referências

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<110> Wright, Terry R.Lira/ Justin M.Walsh, Terence A.Merlo, Donald J.Jayakumar, Pon SamuelLin, Gaofeng

<120> GENES DE RESISTÊNCIA À HERBICIDA

<130> DAS-129XC1 PCT

<150> OS 60/731,044<151> 2005-10-28

<160> 15

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 879

<212> DNA

<213> Delftia acidovorans

<400> 1

atgcagacga cgctgcagat tacccccaca ggcgccaccc tgggcgccac cgtcaccggc 60gtgcaoctgg ccacgctgga cgacgccggc ttcgccgccc tgcaogcogc ctggctgcag 120catgcgctgc tgatcttccc cggccagcac ctcagcaacg accagcagat cacttttgec 180aaacgcttcg gcgcgatcga gcgcatcggc ggcggcgaca tcgtggccat ctccaatgtc 240aaggccgatg gcacggtgcg ccagcacagc cccgccgagt gggacgacat gatgaaggtc 300atcgtcggca acatggcctg gcatgcogac agcacctaca tgccggtgat ggcgcagggc 360goggtgttct cggccgaagt ggtgccogca Stgggcgggc goaoctgott cgccgaoatg 420cgcgccgcct acgacgcgct ggacgaggcc acccgcgccc tggtgcacca gcgctcggeg 480oggcattcgc tggtgtattc gcagagcaag ctgggccatg tgcagcaggc cggctcggcc 540tacatcggct acggcatgga caccaccgcc acgcccctgc gccegctggt caaggtgcat 600cccgagaccg gccgcccctc gctgctgatc ggccgccatg cccatgccat cccgggcatg 660gacgccgccg aatccgagcg cttcctggaa ggcctggtcg actgggcctg ccaggcgccg 720cgggtgcatg cccaccaatg ggccgccggc gacgtggtgg tgtgggacaa ocgotgcctg 780ctgcaccgcg ccgagccctg ggatttcaag ctgecgcggg tgatgtggca cagcegcctg 840gccggccgcc ccgagaccga gggcgccgcc ctggtgtaa 879

<210> 2<211> 292<212> PRT

<213> Delftia acidovorans<400> 2

Met Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala1 5 10 15

Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly Phe Ala20 25 30

Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe Pro Gly35 40 45

Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys Arg Phe Gly50 55 60

Ala Ile Glu Arg Ile Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn Val65 70 75 80

Lys Ala Asp Gly Thr Val Arg Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp Asp85 90 95

Met Met Lys Val Ile Val Gly Asn Met Ala Trp His Ala Asp Ser Thr100 105 110

Tyr Met Pro Val Met Ala Gln Gly Ala Val Phe Ser Ala Glu Val Val115 120 125

Pro Ala Val Gly Gly Arg Thr Cys Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala Tyr130 135 140

Asp Ala Leu Asp Glu Ala Thr Arg Ala Leu Val His Gln Arg Ser Ala145 150 155 160

Arg His Ser Leu Val Tyr Ser Gln Ser Lys Leu Gly His Val Gln Gln165 170 175

Ala Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Tyr Gly Met Asp Thr Thr Ala Thr Pro180 185 190

Leu Arg Pro Leu Val Lys Val His Pro Glu Thr Gly Arg Pro Ser Leu195 200 205

Leu Ile Gly Arg His Ala His Ala Ile Pro Gly Met Asp Ala Ala Glu210 215 220

Ser Glu Arg Phe Leu Glu Gly Leu Val Asp Trp Ala Cys Gln Ala Pro225 230 235 240

Arg Val His Ala His Gln Trp Ala Ala Gly Asp Val Val Val Trp Asp245 250 255

Asn Arg Cys Leu Leu His Arg Ala Glu Pro Trp Asp Phe Lys Leu Pro260 265 270

Arg Val Met Trp His Ser Arg Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu Gly275 280 285Ala Ala Leu Val290

<210> 3

<2ll> 882

<212> DNA

<213> Delftia acidovorans

<400> 3

atggctcaga ccactctcca aatcacaccc actggtgcca ccttgggtgc cacagtcact 60ggtgttcacc ttgccacact tgacgatgct ggtttcgctg ccctccatgc agcctggctt 120caacatgcac tcttgatctt ccctgggcaa cacctcagca atgaccaaca gattaccttt 180gçtaaacgct ttggageaat tgagaggatt ggcggaggtg acattgttgc catatccaat 240gtcaaggcag atggcacagt gcgccagcac tctcctgctg agtgggatga catgatgaag 300gtcattgtgg gcaacatggc ctggcacgcc gactcaacct acatgccagt catggctcaa 360ggagctgtgt teagegeaga agttgtccca gcagttgggg gcagaacctg ctttgctgac 420atgagggcag cctacgatgc ccttgatgag gcaacccgtg ctcttgttca ccaaaggtct 480gctcgtcact cccttgtgta ttctcagagc aagttgggac atgtccaaca ggccgggtca 540gcctacatag gttatggcat ggacaccact gcaactcctc tcagaccatt ggtcaaggtg 600catcctgaga ctggaaggcc cagcctcttg atcggccgcc atgcccatgc catccctggc 660atggatgcag ctgaatcaga gcgcttcctt gaaggacttg ttgactgggc ctgccaggct 720cccagagtcc atgctcacca atgggctgct ggagatgtgg ttgtgtggga caaccgctgt 780ttgctccacc gtgctgagcc ctgggatttc aagttgccac gtgtgatgtg gcactccaga 840ctcgctggac gcccagaaac tgagggtgct gccttggttt ga 882

<210> 4

<211> 293

<212> PRT

<213> Delftia acidovorans

<400> 4

Met Ala Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Gly15 10 15

Ala Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly Phe20 25 30

Ala Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe Pro35 40 45

Gly Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys Arg Phe50 55 60Gly Ala Ile Glu Arg Xle Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn65 70 75 80

Val Lys Ala Asp Gly Thr Val Arg Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp85 90 95

Asp Met Met Lys Val Ile Val Gly Asn Met Ala Trp His Ala Asp Ser100 105 110

Thr Tyr Met Pro Val Met Ala Gln Gly Ala Val Phe Ser Ala Glu Val115 120 125

Val Pro Ala Val Gly Gly Arg Thr Cys Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala130 135 140

Tyr Asp Ala Leu Asp Glu Ala Thr Arg Ala Leu Val His Gln Arg Ser145 150 155 160

Ala Arg His Ser Leu Val Tyr Ser Gln Ser Lys Leu Gly His Val Gln165 170 175

Gln Ala Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Tyr Gly Met Asp Thr Thr Ala Thr180 185 190

Pro Leu Arg Pro Leu Val Lys Val His Pro Glu Thr Gly Arg Pro Ser195 200 205

Leu Leu Ile Gly Arg His Ala His Ala Ile Pro Gly Met Asp Ala Ala210 215 220

Glu Ser Glu Arg Phe Leu Glu Gly Leu Val Asp Trp Ala Cys Gln Ala225 230 235 240

Pro Arg Val His Ala His Gln Trp Ala Ala Gly Asp Val Val Val Trp245 250 255

Asp Asn Arg Cys Leu Leu His Arg Ala Glu Pro Trp Asp Phe Lys Leu260 265 270

Pro Arg Val Met Trp His Ser Arg Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu275 280 285

Gly Ala Ala Leu Val290

<210> 5<211> 882<212> DNA

<213> Delftia acidovorans<400> 5

atggctcaga ctaccctgca gattaccccg actggtgcga ccctgggtgc aaccgttacc 60ggcgttcacc tggcgactct ggatgacgca ggtttcgctg cgctgcacgc ggcttggctg 120caacatgctc tcctgatttt cccaggtcag cacctgtcca acgaccagca aatcactttt 180gcaaaacgct tcggtgcgat cgaacgtatc ggtggcggtg atattgtggc gatctccaac 240gtaaaagcgg atggtactgt acgtcagoac agcccggcgg agtgggacga tatgatgaag 300gtgatcgtag gcaacatggc atggcatgct gacagcacct acatgccggt tatggcgcag 360ggtgcggttt tctctgctga agtggttccg gcagtgggcg gtcgcacctg cttcgcagac 420atgcgtgcag cttacgacgc gttagacgaa gctacccgcg cactggtaca ccagcgctct 480gcgcgtcact ctctggtgta ttcccagagc aaactgggcc acgttcagca agcgggctcc 540gcatatatcg gctacggtat ggataccact gcgaccccgc tgcgtccgct ggtaaaagtg 600catccggaaa ccggccgtcc gtctctcctg atcggccgtc acgctcatgc gattccgggt 660atggacgcgg cagaatccga gcgtttcctg gaaggtctgg ttgattgggc ttgtcaggcg 720ccgcgtgtgc atgctcacca gtgggcagct ggcgacgtgg ttgtatggga taaccgctgc 780ctgcttcacc gtgcagaacc gtgggacttt aagctgccac gtgttatgtg gcacagccgt 840ctggcaggcc gcccagaaac cgagggcgcg gctctggttt aa 882

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> μ 13 quimicamente sintetizado à frente do iniciador do arranjo

<400> 6

gtaaaacgac ggccag 16

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> M13 quimicamente sintetizado â frente dõ iniciador do arranjo

<400> 7

caggaaacag ctatgac 17

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> AAD-12 (v1) quimicamente sintetizado à frente do iniciador PTU

<400> 8

gaacagttag acatggtcta aagg

24<210> 9<211> 27<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> AAD-12 (ν1) quimicamente sintetizado em reverso ao iniciador PTU

<400> 9gctgcaacac tgataaatgc caactgg 27

<210> 10<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> AAD-12 (v1) quimicamente sintetizado â frente do iniciador PCR codificador

<400> 10atggctcaga ccactctcca aa 22

<210> 11<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> AAD-12 (v1) quimicamente sintetizado em reverso ao iniciador PCR codificador

<400> 11agctgcatcc atgccaggga 20

<210> 12<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> SdpacodF quimicamente sintetizado: AAD-12 (v1) à frente da região do iniciador codificador

<400> 12atggctcatg ctgccctcag cc 22

<210> 13<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> SdpacodF quimicamente sintetizado: AAD-12 (v1) em reverso da região do iniciador codificador

<400> 13cgggcaggcc taactccacc aa 22

<210> 14<211> 32<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> Iniciador "Ncol de Brady" quimicamente sintetizado

<400> 14tataccacat gtcgatcgcc atccggcagc tt 32

<210> 15<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador "Saci de Brady" quimicamente sintetizado

<400> 15

gagctcctat cactccgccg cctgctgctg cac

Claims (27)

1. Método para controlar ervas daninhas em uma área, caracte-rizado pelo fato de que compreende a plantação de sementes no solo daárea, em que as referidas sementes compreendem:um polinucleotídeo que codifica uma proteína que degrada en-zimaticamente uma estrutura química de ariloxialcanoato de um herbicida deariloxialcanoato;o referido método ainda compreendendo aplicar o referido herbi-cida de ariloxialcanoato à referida área;em que uma molécula de ácido nucléico que codifica a referidaproteína hibridiza sob condições severas com o complemento integral deuma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 3 e SEQ ID NO: 5.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a referida proteína é pelo menos 95% idêntica à seqüência sele-cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as referidas sementes compreendem um segundo polinucleotí-deo que codifica uma segunda proteína que degrada enzimaticamente umsegundo herbicida, e o referido método compreende aplicar o referido se-gundo herbicida à referida área.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as referidas sementes compreendem um terceiro polinucleotídeoque codifica uma terceira proteína que degrada enzimaticamente um segun-do herbicida, e o referido método compreende aplicar o referido terceiro her-bicida à referida área.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido herbicida é 2,4-D.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o referido segundo herbicida é glifosato.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o referido herbicida de ariloxialcanoato é 2,4-D e o referido se-gundo herbicida é glifosato.

8. . Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o referido 2,4-D e o referido glifosato são aplicados a partir deum tanque de mistura.

9. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o referido terceiro herbicida é selecionado do grupo consistindoem glufosinato e dicamba.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as referidas sementes são sementes de uma planta de colheita.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que a referida planta é uma dicotiledônea.

12. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codi-fica uma proteína que degrada enzimaticamente uma estrutura química deariloxialcanoato de um herbicida de ariloxialcanoato, em que o referido poli- nucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor que é funcional emuma célula de planta, e em que uma molécula de ácido nucléico que codificaa referida proteína hibridiza sob condições severas com o complemento in-tegral de uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:-1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5.

13. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 12, caracteri-zado pelo fato de que a referida proteína é pelo menos 95% idêntica à se-qüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO:-4.

14. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que o referido polinucleotídeo compreende uma composi-ção de códon não nativa tendo uma tendência em direção ao uso do códonda planta para incrementar a expressão do referido polinucleotídeo em umaplanta.

15. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que a referida composição de códon é tendente em dire-ção ao uso do códon da planta dicotiledônea.

16. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 12, caracteri-zado pelo fato de que o referido promotor é um promotor de planta.

17. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 12, caracteri-zado pelo fato de que o referido promotor é um promotor de vírus de planta.

18. Célula de planta, caracterizada pelo fato de que compreendeum polinucleotídeo como definido na reivindicação 12.

19. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende uma di-versidade de células de planta como definidas na reivindicação 18.

20. Planta de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelofato de que a referida planta é uma dicotiledônea.

21. Planta de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelofato de que a referida planta é uma planta de soja.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido herbicida de ariloxialcanoato é selecionado do grupoque consiste em:(a) um herbicida de fenoxialcanoato;(b) um herbicida de ácido fenoxipropiônico;(c) um herbicida de ácido piridiloxialcanóico;(d) uma forma de ácido, sal, ou éster de um ingrediente ativo doreferido herbicida.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o referido herbicida de fenoxialcanoato é um herbicida de áci-do fenoxiacético, e o referido herbicida de ácido piridiloxialcanóico é um her-bicida de ácido piridiloxiacético.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe-lo fato de que:(a) o referido herbicida de ácido fenoxiacético é selecionado dogrupo que consiste em 2,4-D e MCPA;(b) o referido herbicida de ácido fenoxipropiônico é selecionadodo grupo que consiste em dicloroprop, mecoprop, e um enanciômero domesmos; e(c) o referido herbicida de ácido piridiloxiacético é selecionadodo grupo que consiste em, como por exemplo, triclopir e fluroxipir.

25. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que um herbicida de fenoxiacetato e um herbicida de piridiloxiacetatosão aplicados à referida área.

26. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a referida planta é uma planta de soja.

27. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido método compreende o crescimento de plantas de co-lheita, a partir das referidas sementes, na referida área.