ES2586380T3 - Detección del evento de AAD-1 DAS 40278-9 - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la cigosidad de una planta de maíz que comprende un evento de AAD-1 de maíz DAS-40278-9, comprendiendo dicho evento una construcción transgénica que comprende un gen AAD-1, estando dicha construcción transgénica flanqueada por ADN genómico de maíz flanqueante en 5' y por ADN genómico de maíz flanqueante en 3', comprendiendo dicho método: obtener una muestra de ADN de ADN genómico de dicha planta de maíz; producir una muestra de contacto poniendo en contacto dicha muestra de ADN con a. un primer cebador del evento y un segundo cebador del evento, en los que dicho primer cebador del evento se une específicamente a dicha construcción transgénica tal y como se define por los restos 1.874-6.689 de la SEQ ID NO: 29, dicho segundo cebador del evento se une específicamente con dicho ADN genómico de maíz flanqueante en 5' tal y como se define por los restos 1-1.873 de SEQ ID NO: 29 o con dicho ADN genómico de maíz flanqueante en 3' tal y como se define por los restos 6.690-8.557 de SED ID NO: 29, y en donde dicho primer cebador del evento y dicho segundo cebador del evento producen un amplicón del evento cuando se someten a una reacción de PCR b. un cebador directo de referencia y un cebador inverso de referencia que producen un amplicón de referencia a partir de un gen endógeno de referencia de maíz cuando se someten a una reacción de PCR, en donde dicho gen de referencia: i. es un gen Invertasa endógeno de Zea Mays; o ii. comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 o una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, c. una sonda fluorescente del evento que hibrida con dicho amplicón del evento, d. una sonda fluorescente de referencia que hibrida con dicho amplicón de referencia; someter dicha muestra de contacto a un ensayo de sondas de hidrólisis basado en la fluorescencia que libera la fracción fluorescente de la sonda de la fracción inhibidora de la fluorescencia de la sonda; cuantificar dicha sonda fluorescente del evento que ha hibridado con dicho amplicón del evento; cuantificar dicha sonda fluorescente de referencia que ha hibridado con dicho amplicón de referencia; comparar la cantidad de sonda fluorescente hibridada del evento con la de sonda fluorescente hibridada de referencia; y determinar la cigosidad de DAS-40278-9 mediante la comparación de los índices de fluorescencia de la sonda fluorescente hibridada del evento y de la sonda fluorescente hibridada de referencia.

Description

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la habilidad de controlar de forma efectiva o prevenir cambios en la composición de las malas hierbas y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases anteriormente mencionadas.

Respecto a herbicidas adicionales, algunos otros inhibidores de la ALS (también denominados AHAS) preferidos incluyen las triazolopirimidina sulfonanilidas (como cloransulam metil, diclosulam, florasulam, metosulam, y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (como bispiribac y piritiobac), y flucarbazone. Algunos inhibidores de la HPPD preferidos incluyen mesotriona, isoxaflutol, y sulcotriona. Algunos inhibidores de la PPO preferidos incluyen flumiclorac, flumioxazina, flufenpir, piraflufen, flutiacet, butafenacil, carfentrazona, sulfentrazona, y los difeniléteres (como acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno, y oxifuorfeno).

Como se emplea en esta memoria, una “línea” es un grupo de plantas que muestran poca o ninguna variación genética entre individuos para al menos un rasgo. Dichas líneas podrían ser creadas mediante varias generaciones de autofecundación y selección, o propagación vegetativa desde un solo parental utilizando técnicas de cultivo de tejidos o de células.

Como se emplea en esta memoria, los términos “cultivar” y “variedad” son sinónimos y hacen referencia a una línea que es utilizada para la producción comercial.

“Estabilidad” o “estable” significa que, respecto a un componente, dicho componente es mantenido de generación en generación y, preferiblemente, en al menos tres generaciones sustancialmente al mismo nivel, p. ej., preferiblemente al ±15%, más preferiblemente al ±10%, lo más preferible al ±5%. La estabilidad puede ser afectada por la temperatura, la localización, el estrés y el momento de sembrado. La comparación de generaciones subsecuentes bajo condiciones de cultivo debe producir el componente de manera similar.

La “utilidad comercial” se define como tener un buen vigor de planta y una alta fertilidad, de manera tal que el cultivo puede ser producido por granjeros utilizando equipamiento de granja tradicional, y que el aceite con los componentes descritos puede ser extraído de las semillas utilizando equipamientos convencionales de trituración y extracción. Para que el rendimiento, medido como peso de las semillas, contenido en aceite, y producción total de aceite por acre, sea de utilidad comercial debe estar dentro de un rango del 15% del rendimiento promedio de otra variedad comercial de maíz comparable sin los rasgos de valor añadido cultivada en la misma región.

“Élite agronómica” significa que una línea contiene características agronómicas deseables como el rendimiento, la madurez, la resistencia a enfermedades, y similares, además de la resistencia a insectos debida de determinado evento o eventos. Los rasgos agronómicos pueden presentarse individualmente o en cualquier combinación.

Tal y como un experto en la técnica reconocerá a la luz de la descripción, las realizaciones preferidas de los kits de detección, por ejemplo, pueden incluir sondas y/o cebadores. Por ejemplo, esto incluye sondas de polinucleótidos, cebadores y/o amplicones tal y como se indica en la presente memoria.

Un experto en la técnica también reconocerá que los cebadores y las sondas pueden ser diseñadas para hibridar, bajo un rango condiciones de hibridación estándar y/o de PCR, con un segmento de SEQ ID NO: 1 (o la secuencia complementaria), y con sus mismas secuencias complementarias, en donde el cebador o la sonda no son perfectamente complementarias a la secuencia ejemplificada. Por tanto, se puede tolerar cierto grado de discordancia. Por ejemplo, para un cebador de aproximadamente 20 nucleótidos, típicamente un par nucleótidos no necesitan unirse a la cadena opuesta si las bases discordantes están situadas en la parte interna o en el extremo del cebador opuesto al amplicón. Más adelante se proveen varias condiciones de hibridación apropiadas. En las sondas también se pueden utilizar análogos sintéticos de nucleótidos, como la inosina. También se pueden utilizar sondas de ácidos peptidonucleicos (PNA) así como sondas de ADN y ARN. Lo que es importante es que dichas sondas y cebadores sean diagnósticos (capaces de identificar y distinguir inequívocamente) para la presencia de un evento de la presente invención.

Los componentes de cada uno de los “insertos” se ilustran en las Figuras 1 hasta 3. Las secuencias polinucleotídicas de ADN para esos componentes, o sus fragmentos, pueden ser utilizados como cebadores de ADN

o sondas en los métodos de la presente invención.

Las secuencias de ADN que constituyen un fragmento contiguo de las regiones del nuevo transgén/inserción genómica son descritas en la presente memoria. También se incluyen las secuencias de ADN que están constituidas por una cantidad suficiente de polinucleótidos de la secuencia del inserto transgénico y una cantidad suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica del maíz y/o de secuencias que son útiles como cebadores para la producción de un amplicón diagnóstico para una o más de estas plantas de maíz.

Las realizaciones relacionadas pertenecen a secuencias de ADN que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más nucleótidos contiguos de una porción transgénica de una secuencia de ADN identificada en la presente memoria, o su complementaria. Dichas secuencias pueden ser útiles como cebadores de ADN en métodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos utilizando estos cebadores son diagnósticos para el evento de maíz mencionado en la presente memoria. Por lo tanto, la invención también incluye amplicones y los amplicones producidos por dichos cebadores de ADN y sus cebadores homólogos.

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Esta solicitud describe métodos para detectar la presencia de ADN, en una muestra, que se corresponda con el evento de maíz mencionado en la presente memoria. Dichos métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que contiene ADN con el conjunto de cebadores que, cuando son utilizados en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN de al menos uno de estos eventos de maíz, producen un amplicón que es diagnóstico para dicho evento o eventos; (b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ADN, produciendo de esta manera el amplicón; y (c) detectar el amplicón.

Más métodos de detección de la presente describen un método para detectar la presencia de ADN, en una muestra, que corresponde con al menos uno de dichos eventos, en donde dicho método comprende: (a) poner en contacto la muestra que contiene ADN con una sonda que hibrida bajo condiciones de hibridación astringentes con ADN de al menos uno de dicho eventos de maíz y que no hibrida bajo condiciones de hibridación astringentes con una planta de maíz control (ADN no perteneciente al evento de interés); (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación astringentes; y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN.

Esta solicitud describe métodos para detectar la presencia de ADN, en una muestra, de al menos una planta de maíz referida en la presente memoria. Dicho métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que contiene ADN con un conjunto de cebadores que, cuando son utilizados en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, de la presente invención, con ADN de al menos uno de estos eventos de maíz; (b) llevar a cabo reacciones de amplificación mediante PCR TaqMan utilizando un gen de referencia identificado en la presente memoria; y (c) análisis de los resultados.

En todavía más realizaciones, la presente solicitud describe métodos para producir una planta de maíz que incluya el evento AAD-1 de la presente invención, en el que dicho método comprende los pasos de: (a) cruzar la primera línea parental de maíz (que incluye casetes de expresión de la presente invención, que confiere dicho rasgo de resistencia a herbicidas en plantas de dicha línea) con una segunda línea parental de maíz (que carece de este rasgo de tolerancia a herbicidas) produciendo de este modo una multitud de plantas de la progenie; y (b) seleccionar una planta de la progenie mediante el uso de marcadores moleculares. Dichos métodos pueden comprender opcionalmente un paso más de retrocruzamiento de la planta de la progenie con la segunda línea parental de maíz para producir una línea pura de maíz que incluya dicho rasgo de tolerancia a herbicidas.

Según otro aspecto de la invención, se proporcionan los métodos para determinar la cigosidad de la progenie de un cruzamiento que incluya el presente evento. Dichos métodos pueden comprender poner en contacto una muestra, que comprende ADN de maíz, con un conjunto de cebadores de la presente invención. Dichos cebadores, cuando son utilizados en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de al menos uno de dichos eventos de maíz, produce un primer amplicón que es diagnóstico para al menos uno de dichos eventos. Dichos métodos pueden comprender además llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, produciendo de este modo el primer amplicón; detectar el primer amplicón; y poner en contacto la muestra que incluye ADN de maíz con dicho conjunto de cebadores que, cuando son utilizados en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de plantas de maíz, produce un segundo amplicón que incluye ADN genómico de maíz que es homólogo a la región genómica de maíz; y llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, produciendo de este modo el segundo amplicón. Los métodos comprenden además detectar el segundo amplicón, y comparar el primer y segundo amplicones en una muestra, en el que la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigota para la inserción del transgén.

Pueden desarrollarse kits de detección de ADN utilizando las composiciones descritas en la presente memoria y métodos conocidos en la técnica de detección de ADN. Los kits son útiles para la detección del presente evento de ADN de maíz en una muestra y pueden ser aplicados a métodos para la mejora vegetal de plantas de maíz que contengan este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homólogas o complementarias de los amplicones, por ejemplo, descritas en la presente memoria, o de secuencias de ADN homólogas o complementarias del ADN contenido en los elementos genéticos del transgén de los presentes eventos. Estas secuencias de ADN pueden ser utilizadas en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un método de hibridación de ADN. Los kits también pueden contener los reactivos y materiales necesarios para llevar a cabo el método de detección.

Una “sonda” es una molécula aislada de ácido nucleico que está unida a una etiqueta o molécula reportera convencional (como un isótopo radiactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente, o una enzima). Dicha sonda es complementaria a una cadena del ácido nucleico objetivo, en el caso de la presente invención, a una cadena de ADN genómico de uno de dicho eventos de maíz, tanto de una planta de maíz como de una muestra que contenga ADN del evento. De acuerdo de con la presente invención, las sondas no sólo incluyen los ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico sino también poliamidas y otros materiales sonda que se unen específicamente con una secuencia de ADN objetivo y que pueden ser utilizadas para detectar la presencia de esa secuencia de ADN objetivo.

Los “cebadores” son ácidos nucleicos aislados/sintetizados que se alinean con una cadena de ADN complementaria objetivo mediante la hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN objetivo, que es alargada a lo largo de la secuencia de ADN objetivo por una polimerasa, p. ej., una ADN polimerasa. Los pares de cebadores de la presente invención hacen referencia a su uso para la amplificación de una secuencia

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de ácidos nucleicos objetivo, p. ej., mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos convencionales de amplificación de ácidos nucleicos.

Las sondas y los cebadores son tienen normalmente una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 o más nucleótidos. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente con una secuencia objetivo bajo condiciones de hibridación altamente astringentes. Según la presente invención, las sondas y los cebadores tienen una similitud de secuencia completa respecto a la secuencia objetivo, aunque se pueden diseñar mediante métodos convencionales sondas que discrepen de la secuencia objetivo y que retengan la habilidad de hibridar con las secuencias objetivo.

Se han descrito métodos para la preparación y el uso de sondas y cebadores, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Los pares de cebadores de PCR pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, utilizando programas de ordenador para dicho propósito.

Los cebadores y sondas basados en las secuencias de ADN flanqueantes y del inserto que se describen en la presente memoria pueden ser utilizados para confirmar (y, si es necesario, corregir) las secuencias descritas mediante métodos convencionales, p. ej., mediante la repetición de la clonación molecular y la secuenciación de dichas secuencias.

Las sondas y cebadores de ácido nucleico de la presente invención hibridan bajo condiciones astringentes con la secuencia de ADN objetivo. Cualquier método convencional de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos puede ser utilizado para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas o fragmentos de ácido nucleico son así mismo capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico bajo ciertas circunstancias. Tal y como se emplea en la presente memoria, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente la una con la otra si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico antiparalela de doble cadena. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el “complemento” de otra molécula de ácido nucleico si muestran complementariedad completa. Tal y como se emplea en la presente memoria, se dice que unas moléculas muestran “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de las otras. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si pueden hibridar la una con la otra con suficiente estabilidad como para permitir que se mantengan alineadas la una con la otra bajo condiciones convencionales de como mínimo “baja astringencia”. De manera similar, se dice que las moléculas son “complementarias” si pueden hibridar la una con la otra con suficiente estabilidad como para permitir que se mantengan alineadas la una con la otra bajo condiciones convencionales de “alta astringencia”. Las condiciones convencionales de astringencia se describen en Sambrook et al. 1989. Las desviaciones de la complementariedad completa son por tanto permisibles, siempre y cuando dichas desviaciones no descarten completamente la capacidad de las moléculas de formar una estructura de doble cadena. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda sólo necesita ser suficientemente complementaria en su secuencia como para ser capaz de formar una estructura de doble cadena bajo las concentraciones particulares de disolvente y sal empleadas.

Tal y como se emplea en la presente memoria, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de ácido nucleico que hibrida específicamente a la secuencia de ácido nucleico complementaria con la que está siendo comparada bajo condiciones de alta astringencia. El término “condiciones astringentes” se define funcionalmente respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico con un ácido nucleico objetivo (esto es, a una secuencia particular de ácido nucleico de interés) mediante el protocolo de hibridación específico discutido en Sambrook et al. 1989, en 9.52-9.55. Ver también en Sambrook et al. 1989 en 9.47-9.52 y 9.56-9.58. Por lo tanto, las secuencias

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nucleotídicas de la invención pueden ser utilizadas por su habilidad de formar selectivamente moléculas de cadena doble con regiones complementarias de fragmentos de ADN.

Dependiendo de la aplicación concebida, se pueden utilizar condiciones variables de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de la sonda hacia la secuencia objetivo. Para aplicaciones que requieran alta selectividad, se emplean normalmente condiciones relativamente astringentes para formar los híbridos, p. ej., se seleccionarían condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, como las que proporcionan entre 0,02 M a 0,15 M de NaCl y temperaturas de entre 50ºC y 70ºC. Las condiciones astringentes, por ejemplo, pueden suponer lavar el filtro de hibridación al menos dos veces con un tampón de lavado de alta astringencia (0,2X SSC, 0,1% SDS, 65ºC). Los expertos en la técnica conocen las condiciones de astringencia apropiadas que promueven la hibridación de ADN como, por ejemplo, 6,0X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a unos 45ºC, seguido de un lavado de 2,0X SSC a 50ºC. Por ejemplo, se puede elegir la concentración de sal en la etapa de lavado para una baja astringencia con alrededor de 2,0X SSC a 50ºC hasta una alta astringencia con alrededor de 0,2X SSC a 50ºC. Además, la temperatura de la etapa de lavado se puede incrementar desde unas condiciones de baja astringencia a temperatura ambiente, alrededor de 22ºC, hasta condiciones de alta astringencia a alrededor de 65ºC. Tanto la temperatura como la sal se pueden variar, o tanto la temperatura como la concentración de sal se pueden mantener constantes mientras la otra variable se varía. Unas condiciones tan selectivas toleran muy poca, o ninguna, discrepancia entre la sonda y la cadena molde u objetivo. La detección de secuencias de ADN mediante hibridación es conocida por los expertos en la técnica, y las enseñanzas de U.S. Patent Nos. 4.965.188 y 5.176.995 son ejemplares para los métodos de análisis de hibridación.

En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con uno o más de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ejemplificadas o sugeridas en la presente memoria, incluyendo complementos y fragmentos de las mismas, bajo condiciones de alta astringencia. En un aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico de la presente invención tiene la secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NOS: 2-7, o complementos y/o fragmentos de la misma.

En otro aspecto de la presente invención, una molécula marcadora de ácido nucleico de la presente invención comparte entre el 80% y el 100%, o el 90% y el 100% de la identidad de secuencia con dichas secuencias de ácido nucleico. En otro aspecto de la presente invención, una molécula marcadora de ácido nucleico de la presente invención comparte entre el 95% y el 100% de identidad de secuencia con dicha secuencia. Dichas secuencias pueden ser utilizadas como marcadores en métodos de mejora vegetal para identificar la progenie de cruzamientos. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN objetivo puede ser detectada mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, que pueden incluir, pero no se limitan a, etiquetas fluorescentes, radiactivas, basadas en anticuerpos, y quimioluminiscentes.

En relación con la amplificación de la secuencia de ácido nucleico objetivo (p. ej., mediante PCR) utilizando un par de cebadores de amplificación particulares, las “condiciones astringentes” son condiciones que permiten al par de cebadores hibridar únicamente con la secuencia de ácido nucleico objetivo para la que un cebador que tiene la secuencia silvestre correspondiente (o su complementaria) se uniría y produciría preferiblemente un único producto de amplificación, el amplicón.

El término “específico para (una secuencia objetivo)” indica que una sonda o cebador hibrida bajo condiciones astringentes de hibridación solamente con la secuencia objetivo en una muestra que contiene la secuencia objetivo.

Tal y como se emplea en la presente memoria, “ADN amplificado” o “amplicón” se refiere al producto de una amplificación de ácidos nucleicos de una secuencia de ácido nucleico objetivo que forma parte de un molde de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de maíz resultante de un cruzamiento contiene el ADN genómico del evento transgénico de la planta de maíz de la presente invención, el ADN extraído de una muestra de tejido foliar de la planta de maíz puede ser sometido a un método de amplificación de ácidos nucleicos utilizando un par de cebadores que incluya un cebador derivado de la secuencia flanqueante en el genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado para producir un amplicón que es diagnóstico para la presencia del ADN del evento. El amplicón tiene una longitud y una secuencia que son también diagnósticas para el evento. El amplicón puede oscilar en tamaño entre la longitud combinada del par de cebadores más un par de bases nucleotídicas, y/o la longitud combinada del par de cebadores más 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303,

10

15

20

25

30

35

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45

50

304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, o 500, 750, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000 o más pares de bases nucleotídicas (más o menos cualquiera de los incrementos listados anteriormente). Alternativamente, un par de cebadores puede derivar de las secuencias flanqueantes a ambos lados del ADN insertado para producir así un amplicón que incluya la secuencia nucleotídica insertada entera. Un miembro del par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta puede estar localizado a distancia de la secuencia de ADN insertado. Esta distancia puede oscilar entre un par de bases nucleotídicas hasta alrededor de veinte mil pares de bases nucleotídicas. El uso del término “amplicón” excluye específicamente los dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación termal de ADN.

La amplificación de ácidos nucleicos puede ser conseguida mediante cualquiera de los varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conocen en la técnica una variedad de métodos de amplificación y están descritos, entre otros, en U.S. Patent No. 4.683.195 y U.S. Patent No. 4.683.202. Se han desarrollado métodos de amplificación mediante PCR para amplificar hasta 22 Kpb de ADN genómico. Estos métodos así como otros métodos conocidos en la técnica de amplificación de ADN pueden ser utilizados en la práctica de la presente invención. La secuencia del inserto de ADN heterólogo transgénico o la secuencia genómica flanqueante de un evento de maíz puede ser verificada (y corregida si es necesario) mediante la amplificación de dichas secuencias del evento utilizando cebadores derivados de las secuencias provistas en la presente memoria seguida de la secuenciación de ADN estándar del amplicón de PCR o del ADN clonado.

El amplicón producido por estos métodos puede ser detectado mediante una variedad de métodos. Un método común y bien conocido de detección de amplicones de ADN es la electroforesis en gel de agarosa y la tinción con bromuro de etidio. Otro método es el Genetic Bit Analysis en el que un oligonucleótido de ADN se diseña para solapar tanto la secuencia de ADN genómico flanqueante como la secuencia de ADN insertado. El oligonucleótido es inmovilizado en los pocillos de una placa de micropocillos. Después de una PCR de la región de interés (utilizando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), el producto de PCR de cadena simple puede ser hibridado con el oligonucleótido inmovilizado y servir como molde para una reacción de extensión de una sola base utilizando polimerasa de ADN y ddNTP marcados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede estar basada en la fluorescencia o en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia inserto/flanqueante debido al éxito en la amplificación, hibridación y extensión de una sola base.

Se utilizan las siguientes abreviaturas salvo que se indique lo contrario.

AAD-1: ariloxialcanoato dioxigenasa-1

pb: par de bases

ºC: grados Celsius

ADN: ácido desoxirribonucleico

DIG: digoxigenina

EDTA: ácido etilenediaminotetraacético

kpb: kilobase

µg: microgramo

µl: microlitro

ml: mililitro

M: masa molar

OLP: sonda solapante

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

PTU: unidad de transcripción vegetal

5

10

15

20

25

30

SDS: dodecilsulfato sódico

SOP: protocolo de operación estándar

SSC: una disolución tampón que contiene una mezcla de cloruro sódico y citrato sódico, pH 7,0

TBE: una disolución tampón que contiene una mezcla de Tris base, ácido bórico y EDTA, pH 8,3

V: voltios

Ejemplos

Ejemplo 1. Ensayo TaqMan específico de evento

Se desarrolló un ensayo TaqMan específico de evento para detectar la presencia en maíz del evento DAS-40278-9 y para determinar el estado de cigosidad de las plantas en poblaciones de mejora vegetal. Para desarrollar un ensayo específico de evento, se diseñaron cebadores y sondas TaqMan específicas de acuerdo con las secuencias de ADN localizadas en la unión 5’ entre el inserto y la planta. Para la detección específica de DAS-40278-9, se amplificó un fragmento de ADN de 73 pb que abarca la unión 5’ de la integración utilizando dos cebadores específicos. La amplificación de este producto de PCR fue medida mediante una sonda MGB específica para el objetivo sintetizada por Applied Biosystems que contiene el reportero FAM en su extremo 5’. Se analizó la especificidad de este método de detección TaqMan para el evento de AAD-1 de maíz DAS-40278-9 contra 16 eventos de AAD-1 de maíz diferentes y una variedad no transgénica de maíz en formato dúplex con el gen endógeno de referencia específico de maíz, Invertasa.

Ejemplo 1.1. Aislamiento de ADNg

Muestras de ADNg de 15 eventos de AAD-1 de maíz diferentes y variedades no transgénicas de maíz fueron analizados en este estudio. Se extrajo ADNg mediante dos aproximaciones, el kit de Qiagen o CTAB. Para las muestras de ADNg extraídas con el kit de Qiagen, se utilizaron ocho discos foliares frescos de maíz de acuerdo con un protocolo modificado de Qiagen DNeasy 96 Plant Kit. Para las muestras de ADNg extraídas mediante el uso del protocolo CTAB, se utilizaron alrededor de 0,3 g de tejido foliar liofilizado siguiendo el protocolo de Permingeat et al. 1998. El ADNg fue cuantificado mediante el método Pico Green de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). Las muestras de ADNg se diluyeron con agua libre de DNasas hasta una concentración de 10 ng/µl para el propósito de este estudio.

Ejemplo 1.2. Ensayo TaqMan y resultados

Se diseñaron cebadores y sondas TaqMan específicas para el ensayo TaqMan específico del evento DAS-40278-9. Estos reactivos pueden ser utilizados con las condiciones enumeradas más adelante para detectar el evento de AAD-1 de maíz DAS-40278-9. La Tabla 1 enumera las secuencias de cebadores y sondas que fueron desarrolladas específicamente para la detección del evento DAS-40278-9.

Tabla 1. Cebadores de PCR y sondas

Reacción del evento objetivo

Nombre

Descripción Secuencia de 5’ a 3’

Corn278-F

Cebador Directo Seq ID NO: 2: 5’ -ATTCTGGCTTTGCTGTAAATCGT -3’

Corn278-R

Cebador Inverso Seq ID NO: 3 5’ -TTACAATCAACAGCACCGTACCTT -3’

Corn278-Probe

Sonda Seq ID NO: 4: 5’ – FAM -CTAACCTTCATTGTATTCC -MGB -3’

Reacción del sistema de referencia Invertasa

Nombre

Descripción Secuencia de 5’ a 3’

IVF

Cebador Directo Seq ID NO: 5: 5’ – TGGCGGACGACGACTTGT – 3’

IVR

Cebador Inverso Seq ID NO: 6: 5’-AAAGTTTGGAGGCTGCCGT – 3’

Reacción del evento objetivo

Nombre

Descripción Secuencia de 5’ a 3’

IV-Probe

Sonda Seq ID NO: 7: 5’ – HEX CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC BHQ2 – 3’ – –

Las condiciones de PCR multiplex para la amplificación son las siguientes: 1X tampón de PCR, 0,5 – 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 0,2 µM del cebador Corn278-F, 0,2 µM del cebador Corn278-R, 0,2 µM del cebador IVF, 0,2 µM del cebador IVR, 0,08 µM de la sonda Corn278-Probe, 0,08 µM de la sonda IV-Probe, 40 U/ml de HotStart 5 Taq, 0,6 – 2,4 µg/ml de ADN en una reacción final de 25 µl. Se analizaron varias concentraciones de MgCl2 y de ADN. Se utilizaron concentraciones de MgCl2 de 0,5 mM, 1,0 mM, 1,8 mM y 2,5 mM. El cóctel fue amplificado utilizando las siguientes condiciones: i) 95ºC durante 15 min., ii) 95ºC durante 20 s., iii) 60ºC durante 60 s., iv) repetición de los pasos ii-iii durante 50 ciclos, v) espera a 4ºC. La PCR en tiempo real se llevó a cabo en un sistema Bio-rad iCyclerTM. El análisis de datos se basó en la medida del ciclo umbral (CT), que es el número de ciclo de PCR

10 en el que la medida de la fluorescencia alcanza un valor determinado. El valor CT fue calculado automáticamente por el software iCycler.

Las secuencias de los amplicones generados utilizando los cebadores descritos anteriormente fueron las siguientes:

Corn278-F y Corn278-R: ttacaatcaacagcaccgtaccttgaagcggaatacaatgaaggttagctacgatttacagcaaagccagaat (SEQ ID NO: 8).

15 IVF e IVR: tggcggacgacgacttgtccgagcagaccgccgtgtacttctacctgctcaagggcacggacggcagcctccaaacttt (SEQ ID NO: 9).

El método de detección TaqMan para el evento de AAD-1 de maíz DAS-40278-9 fue analizado contra 16 eventos de AAD-1 de maíz diferentes y variedades no transgénicas de maíz en formato dúplex con el gen específico de maíz Invertasa como gen de referencia. Este ensayo detectó específicamente el evento de AAD-1 de maíz DAS-40278-9 y no produjo o amplificó ningún resultado falso positivo en los controles (esto es, los 15 eventos de AAD-1 de maíz

20 diferentes y las variedades no transgénicas de maíz). Los cebadores y sondas específicas del evento pueden ser utilizadas para la detección del evento de AAD-1 de maíz DAS-40278-9 y estas condiciones y reactivos son aplicables en ensayos de cigosidad.

Claims (1)

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