JP6635916B2 - ダイズトランスジェニックイベントｍｏｎ８７７５１、その検出方法及びその使用方法 - Google Patents

ダイズトランスジェニックイベントｍｏｎ８７７５１、その検出方法及びその使用方法 Download PDF

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Description

本出願は、２０１３年６月１４日に出願の米国仮出願第６１／８３４,８９９号の優先権の利益を主張し、その全体が、参照として本明細書に包含される。
ＭＯＮＳ３５７ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられたファイルに含まれ、２０１４年６月１２日に作成されたシーケンスリスト（４３キロバイトである）（サイズはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）を、電子提出により本願と共に出願し、参照として本明細書に包含される。
本発明は、ＭＯＮ８７７５１と呼ばれるトランスジェニックダイズ（ダイズ：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）イベントに関する。このイベントは、以前はダイズ植物には利用できなかった殺虫毒素タンパクの独自の組み合わせを提供することにより、ダイズに鱗翅類の寄生に対し耐性をもたせる２つの別々の作用様式を提供する。これらの殺虫毒素タンパクの組み合わせは、ダイズ植物に対する鱗翅類種の寄生特性を制御するのに、非常に有効である。また、本発明は、ダイズ植物、植物パーツ、植物の種、植物細胞、子孫植物、農産品及びイベントＭＯＮ８７７５１に関する方法に関し、ダイズ（ダイズ）細胞のゲノムへの遺伝形質転換ＤＮＡの挿入に関連して作成され、かつ、ダイズ核酸を含む生体サンプルにおけるこのイベントの存在を検出するために有用な、上記イベントに固有のヌクレオチド分子を提供する。
ダイズ（ダイズ）は、世界中の多くの地域で重要な作物であり、望ましい形質を有するダイズの種類を生産する目的で、この作物には生物工学的方法が適用されてきた。この望ましい形質の一つに、虫害抵抗性が挙げられる。虫害抵抗性導入遺伝子の植物における発現は、望ましい虫害抵抗性の形質を植物に与えることができるものの、導入遺伝子の発現は、植物染色体から移動する個々の遺伝子の発現を誘導するカセットの配向及び組成、染色体の位置及び導入遺伝子挿入のゲノムの結果を含む、多くの様々な因子により影響され得る。例えば、植物では、異なる個々のイベント間では、導入遺伝子の染色体挿入部位における導入遺伝子発現のレベル及びパターンには、変動があるものの、それ以外では同一であったことが観測されていた。また、イベント間で、望ましくない及び／または望ましい表現型のあるいは農学上の差も存在する。したがって、望ましい形質及び商業的な成功のために適切な最適表現型特性及び農業特性の両方を有するイベントを選択するため、多数の個々の植物細胞形質転換イベントを生産及び分析することが、しばしば必要となる。好ましい遺伝形質転換イベントの選択には、大規模な分子キャラクタリゼーション、ならびに、複数年間、複数の場所で、及び様々な条件下での多くのイベントを含む温室及び野外試験が、必要となる。膨大な量の有効性、表現型及び分子データを収集し、そして、１つ以上の商業的に適切なイベントを選択することを目的として、得られたデータ及び観察を、科学者及び農学者のチームにより、その後分析する。このようなイベントは、一旦選択されれば、それを用いて、所望の遺伝形質転換形質を、植物育種法を用いて他の遺伝的背景に遺伝子移入し、したがって、所望の形質を含む及び特定の地域の農学の条件に適した、様々な種類の作物を多数産出することができる。
昆虫寄生に対して殺虫による制御を行うための、発現毒素が一つしかないトランスジェニックダイズでは、害虫が毒素に対する耐性を発現する可能性が高いため、永続性が制限されるというリスクがあり得る。同様に、固有の作用形態を複数提供しない毒物を含んだトランスジェニックダイズは、永続性が制限されるリスクがあり得る。鱗翅類に有毒なタンパクを生成する第１の利用可能なダイズが含む毒素タンパクは、一つ（Ｃｒｙ１Ａｃ）である。近年、Ｃｒｙ１Ａｃ及びＣｒｙ１Ｆ毒素タンパクを含むダイズ遺伝形質転換イベントが、開示された。Ｃｒｙ１Ａｃへの耐性が生じれば、Ｃｒｙ１Ａｃ及びＣｒｙ１Ｆ遺伝形質転換イベントは、その有効性の源としては、Ｃｒｙ１Ｆ毒素のみが残っているだけである。したがって、Ｃｒｙ１Ａｃにより制御された、害虫を制御する２以上の毒物を有し、それら毒物はいずれも、Ｃｒｙ１Ａｃが結合するターゲットの昆虫中腸内では同じまたは実質的に同じ受容体を結合しないような、ダイズ植物を提供することが必要である。本明細書に記載される発明は、ダイズの鱗翅類の害虫を制御するためのターゲティングの目的ではダイズ植物には以前は含まれていなかった、鱗翅類の害虫種に有毒な２以上の薬剤を提供することにより、先行技術に記載されたトランスジェニックダイズイベントに対して上述した永続性の問題を克服する、トランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１を提供する。
単一の形質転換イベントを含む遺伝子導入植物を作製するため、組換えＤＮＡ構築物の一部を、細胞ダイズのゲノムに移植し、続いて、細胞ダイズを植物に成長させる。イベントを最初に移植したダイズ細胞を再生させて、Ｒ０世代を産生させる。Ｒ０植物及びＲ０植物からの子孫植物に対して、いずれかの所望の形質の試験を行うことができるが、このイベントの効果は、形質転換イベントの組込み部位に対するシス及び／またはトランス因子により影響され得る。イベントにもたらされるフェノタイプは、ＤＮＡ構築物の大きさ及びデザインにより影響され得るとともに、その影響は、発現カセットの遺伝因子の組み合わせ、導入遺伝子の数、発現カセットの数及びこれら要素及びこれらカセットの設定によって、変化し得る。所望の形質を有するイベントを特定することは、例えば、導入遺伝子発現の、植物発育パターン、日周パターン、一時的パターンまたは空間的パターン等の因子により、または環境植物成長条件、水有効性、有効態窒素、熱またはストレス等の外因子により、さらに複雑化され得る。したがって、表現型形質の所望のセットをもたらすイベントを得る能力は、容易に予測できるものではない。
本発明は、既存のトランスジェニックダイズ植物及び並列に構成される新イベントと比較して、優れた特性及び性能を示す、イベントＭＯＮ８７７５１を含む、トランスジェニックダイズ植物を提供する。ダイズイベントＭＯＮ８７７５１は、独立して鱗翅類の害虫に抵抗の形質をもたらす２つのリンク発現カセットを、ダイズゲノムへの挿入の単一の座位に含む。２つのリンク発現カセットをダイズイベントＭＯＮ８７７５１に組み込むことにより、鱗翅類の害虫種に対して２つの作用形態を提供するものであり、この鱗翅類には、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ種、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ種、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種、Ｃｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ種、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ種、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ種、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ種及びＰｌａｔｈｙｐｅｎａ種が含まれる。二元的作用形態により、殺虫制御の重複性を鱗翅類の害虫種に対して提供するとともに、害虫制御形質への耐性の発現の可能性を有意に低減する。
イベントＭＯＮ８７７５１は、サンプル中のイベントの存在を検出する際に有用な、特定の固有のＤＮＡセグメントにより特徴づけられる。サンプルとは、実質的に純粋なダイズＤＮＡまたはダイズＤＮＡを含む組成物のいずれかの組成物を指すことを意図する。いずれの場合においても、サンプルは生体サンプル、すなわち生物物質を含み、その非限定的な例として、イベントＭＯＮ８７７５１を含んでいるダイズのゲノムから直接または間接的に得られるまたは由来するＤＮＡが挙げられる。「直接的に」とは、ダイズ細胞を破壊して（または分裂したダイズ細胞を含むダイズのサンプルを得て）、検出のためにゲノムＤＮＡを露出することにより、当業者が直接ダイズゲノムからＤＮＡを得る能力のことをいう。「間接的に」とは、ダイズ細胞を破壊すること、または破壊されたダイズ細胞を含むダイズのサンプルを得ることを通した直接的手段以外の手段により、ターゲットまたは特異的な参照ＤＮＡを得る、すなわち、特定のサンプル中のイベントＭＯＮ８７７５１の存在に対して特徴を与えると本明細書に記載された、新規かつ独特な接合部のセグメントを得る、当業者の能力のことをいう。このような間接的な手段は、ターゲットシーケンスに特異性と結合するようにデザインされた特定のプローブによる、ターゲットのＤＮＡの塩基配列を含むＤＮＡセグメントの増幅、または測定及びキャラクタリゼーション、すなわち、アガロースまたはアクリルアミドゲル等の有効なマトリックスによりＤＮＡの他のセグメントから分離しての測定、またはアンプリコンの直接のシーケンス分析による、またはアンプリコンのベクターへのクローン化及びこのベクター中に存在する間挿アンプリコンの直接配列決定によるキャラクタリゼーション、が可能なＤＮＡセグメントの増幅を非限定的に含む。代替的に、イベントＭＯＮ８７７５１を定義するために使用可能な、ダイズ染色体中の移植遺伝子のＤＮＡがダイズ染色体に挿入された位置、に対応するＤＮＡのセグメントを、様々な手段によりクローン化して、その後、特定のサンプル中または特定のダイズゲノム中にその存在が特定及びキャラクタリゼーションすることができる。このようなＤＮＡセグメントは、接合部部分またはシーケンスと呼ばれ、間挿ＤＮＡとダイズゲノムとの間の接合点が、このセグメントに含まれる限りにおいて、間挿ＤＮＡ及び隣接（側面）ダイズ染色体ＤＮＡのいずれかの長さとすることができる。配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８及び配列番号：１０及びこれらの各々の逆補完体は、このセグメントを代表する。
本明細書に特定される特異的なシーケンスは、イベントＭＯＮ８７７５１またはその中に含まれる構築物中に固有に存在してもよく、また、直接のシーケンス分析による、このシーケンスに結合されるプローブを検出することによる、または特定のダイズ生殖質またはゲノムに存在し及び／またはダイズＤＮＡを含有する特定の生体サンプル中に存在する場合に本明細書に記載される特定のアンプリコンのサイズ及びおそらく組成を観測することによる、これらのシーケンスの同定は、そのサンプル中のイベントＭＯＮ８７７５１またはその中に含まれる構築物の存在に特徴的である。フランキングゲノムセグメント（すなわち、間挿形質転換ＤＮＡに隣接したＤＮＡの塩基配列のダイズゲノムセグメント）は、わずかな変異性を受けることが知られており、そしてこのように、個々のダイズゲノムの間のこの異形または多型性に関連して、少なくとも９９％以上の同一性に対しての制限となる。本明細書に参照される特定の特徴的シーケンスと比較して、その長さ全体にわたって完全に相補的であるヌクレオチドセグメントが、本発明の範囲内に入ることを意図するものである。
本発明のヌクレオチドセグメントの相互に相対的なダイズゲノムの範囲内の位置は、図１に例示されており、また、それぞれのヌクレオチド配列は、配列番号：１０に例示されている。サンプル中において、イベントＭＯＮ８７７５１のキャラクタリゼーションを行いかつイベントＭＯＮ８７７５１の存在に特徴的なヌクレオチドセグメントまたはそこに含まれる構築物は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６を含む。サンプル中のこれらのヌクレオチド配列が１個または２個、またはそれ以上の存在は、このようなサンプルがダイズ組織を含み、したがってダイズＤＮＡを含む場合は、イベントＭＯＮ８７７５１またはそこに含まれる構築物の存在に特徴的である。
「由来する」という語の使用は、特定のＤＮＡ分子が、ダイズ植物ゲノム中に存在する、またはダイズ植物ＤＮＡ中で検出可能であるということを意図するものである。「検出可能である」とは、特定のＤＮＡセグメントが増幅される能力及びＤＮＡシーケンス分析によりキャラクタリゼーションされまたは解明されるそのサイズ及びまたはシーケンスのことをいい、また、特異的に特定のＤＮＡセグメント、すなわちターゲットＤＮＡセグメントに結合するプローブの能力、及びつづくプローブのターゲットへの結合を検出する能力のことをいうこともできる。本発明の特定のＤＮＡセグメントまたはターゲットＤＮＡセグメントは、間挿イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ中に存在する。
ダイズへの言及に関し、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡの存在に対して特徴的であると本明細書に記載されたセグメントのいずれか１つ、２またはそれ以上に対応して、それぞれの実施形態が検出可能な量のＤＮＡを含む限りにおいて、ダイズ細胞、ダイズ種子、ダイズ植物の一部及びダイズ植物は、本発明の範囲内であることが意図されている。ダイズ植物部分は、以下の細胞を含む；花粉；胚珠；花；さや；種；塊根組織；茎組織；及び葉組織。検出可能な量のＤＮＡのセグメントが、イベントＭＯＮ８７７５１の存在に対して特徴的であると本明細書に記載されたような、ダイズから作製される商品生産物は、本発明の範囲内である。このような商品生産物は、全粒または加工ダイズ種、ダイズ油、ダイズタンパク、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズ破片、ダイズふすま、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス及びダイズ植物及びダイズ植物部分を用いて生産される燃料製品を含んでいてもよい。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１のＤＮＡは、それぞれの細胞及びダイズ植物、ダイズ種、並びに、イベントを含むダイズ組織の１つの染色体のそれぞれのゲノムに、存在してもよい。ダイズゲノムがメンデル形態で後代に伝えられる際、ダイズ植物がイベントＭＯＮ８７７５１間挿に対してホモ接合している場合は、それぞれの後代ダイズ植物及び細胞は、イベントＭＯＮ８７７５１間挿を含みかつ親から後代に受け継がれたペアレンタル染色体のそれぞれの対立遺伝子上に、イベントＤＮＡを含んでいる。しかしながら、イベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含むダイズゲノムが、ヘテロ接合ペアレントまたはハイブリッドペアレントである場合は、ハイブリッドペアレントから交配される花粉の約５０パーセント及び胚珠の約５０パーセントは、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含むことになり、その結果、後代の混合個体群がイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含むようになり、また、このようなハイブリッドによる交配から生じる後代のパーセンテージは、約５０〜約７５パーセントのいずれかのパーセンテージで、この後代に伝えられたイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを有し得る。
本発明のＤＮＡ分子は、間挿形質転換イベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡの両末端上の２つの別々の接合部及びＭＯＮ８７７５１間挿ＤＮＡのそれぞれの末端に隣接、すなわち側面にあるダイズゲノムＤＮＡに特有となり得るものであり、またはダイズイベントＭＯＮ８７７５１間挿ＤＮＡに特有となり得るものである。これらの分子は、プローブ、プライマーを用い、また一部の場合ではＤＮＡシーケンス分析を用いて、本明細書に記載される方法により分析される特定のサンプル中に存在する場合は、そのサンプル中、一定量のイベントＭＯＮ８７７５１ダイズの存在に対して特徴的となり得る。ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡに特有のこのようなＤＮＡ分子は、特有のＤＮＡ分子に特異的に結合するようにデザインされたプローブ核酸分子を使用した後このプローブの特有のＤＮＡへの結合を検出することによる方法及びプローブとして作用する少なくとも２つの別々のＤＮＡ分子を使用した熱増幅法による方法を含む、多数の方法で、同定及びキャラクタリゼーションが可能であるが、この分子のシーケンスは、上記のプローブに比べてさほど特異的でなくてもよい。適切なハイブリダイゼーション条件下で、特定のターゲットＤＮＡを、プローブまたはプライマーに接触させることにより、プローブまたはプライマーが、ターゲットＤＮＡセグメントに結合するようになることを、当業者は理解する。
本発明のＤＮＡ分子は、増幅可能なＤＮＡのターゲットセグメントでもよく、また、特定のサンプルの増幅法により得られた代表長さの１つ以上のアンプリコンとして検出される場合は、このサンプル中に含まれるイベントＭＯＮ８７７５１またはそこに含まれる構築物の存在に対して特徴的となってもよい。このＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドセグメントは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、及び配列番号：２６の、それぞれに記載のヌクレオチド配列を有してもよく、また、本明細書及び下記の実施例で、さらに定義される。プライマー分子及び／またはプローブは、制御を含む必要な試薬に加えてキット形態で提供されてもよく、また、使用のための説明書と共にパッケージ化されてもよい。
本発明の組換え型ＤＮＡ分子は、微生物中または微生物に由来して、存在してもよい。微生物は、原核生物または真核生物、あるいはプラスミドまたはベクターと一般に呼ばれる、ゲノムまたは染色体または染色体外細胞質ＤＮＡ構造を含むいずれかの微細な細胞を含むことを意図するものである。一実施形態では、微生物は、バクテリア（原核生物）及びより高い生物形態に対応する細胞（真核生物）を含んでもよく、これらはヒトの平均的な視覚範囲よりも小さく、典型的に５０立方ミクロン以下、より一般に１０立方ミクロン以下である。バクテリアは、配列番号：９に記載の発現カセットのそれぞれを含む１以上または全ての本発明の新規なＤＮＡセグメントを含む、ベクターまたはプラスミドを含み得る共通の微細な微生物である。本発明の植物細胞及び特にダイズ植物細胞は、１つ、２つ、またはそれ以上の本発明の新規なＤＮＡセグメントのいずれかまたは全てを含んでいてもよい。
本明細書での使用のためのプローブは、特定のターゲットＤＮＡセグメント、すなわち、サンプル中のイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡ内に存在し、かつ、このイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡの存在に対して特徴的な、ＤＮＡに特有のセグメントと、本明細書に定義されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合するように機能するのに十分な長さのＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドセグメントを備えていてもよい。このプローブは、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡにのみ存在する単一の接合部または他の新規なシーケンスにのみ結合するように、または、２以上のこの単一の接合部セグメントに結合するように、デザインすることができる。ダイズＤＮＡを含むと推測される特定のサンプル中で、このプローブのＤＮＡ分子への結合を検出することは、サンプル中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１の存在に対して特徴的である。
プライマーは、特定のＤＮＡターゲットセグメントを増幅する熱増幅反応に使用するために、異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセグメントのペアを備えていてもよい。ペアの各々のプライマーは、増幅のため着目したＤＮＡのセグメント中でまたはその近傍で、ＤＮＡの特異的なセグメントに結合するようにデザインされている。プライマーは、その後これらが核酸配列ポリメリゼーションの局在性領域として作用して、１つ以上のアンプリコン（ＤＮＡの増幅ターゲットセグメント）を生成するような方法で、結合する。本発明では、特定の生体サンプル中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡの特有のセグメントに結合するようにデザインされ、かつ、本明細書に記載される接合部セグメントの一つ以上を含む特定のアンプリコンを増幅する、プライマーの使用及びポリメラーゼ反応の完了または終了におけるこのアンプリコンの検出及び／またはキャラクタリゼーションは、特定のサンプルでダイズイベントＭＯＮ８７７５１の存在に対して特徴的である。当業者は、この増幅方法にかなり精通しており、増幅の詳細の引用は、ここでは必要ではない。
本発明のダイズ植物、ダイズ植物細胞、ダイズ植物組織及びダイズ種子は、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ種、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ種、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種、Ｃｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ種、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ種、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ種、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ種及びＰｌａｔｈｙｐｅｎａ種を非限定的に含む鱗翅類の害虫による寄生に対する耐性を示し得る。鱗翅類種による寄生に対する耐性は、２つの異なる殺虫タンパク毒素をコードする２つの異なるＤＮＡセグメントの発現に関連して発生し、これら２つのＤＮＡセグメントは、間挿形質転換ＤＮＡの範囲内で操作可能にかつ共有結合的に結合し、これら２つの殺虫タンパク毒素は、配列番号：１０に記載及び図２に例示される間挿形質転換ＤＮＡの５'近末端で、発現カセットから発現されるＣｒｙ２Ａｂタンパク；及び配列番号：１０に記載及び図２に例示される間挿形質転換ＤＮＡの３'末端で発現カセットから発現されるＣｒｙ１Ａ．１０５タンパクである。Ｃｒｙ２Ａｂタンパクは、Ａｔ．Ａｃｔ２プロモータから発現され、Ｃｒｙ１Ａ．１０５タンパクは、Ａｔ．ＲｂｃＳ４プロモータから発現される。Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパクは、鱗翅類の害虫種に有毒な薬剤である。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を生成するために用いられる構築物は、各Ｃｒｙタンパクの各プロモータからの発現が同じ方向で進むがそれぞれは別々の各プロモータからであるように、転写の相対的縦方向に並んだ配向で配置されるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパクの発現を誘導するプロモータを有する（図２を参照）。評価された他の構築物は、発現要素の使用の組み合わせにより異なっており、すなわち、エンハンサ（Ｅ）、プロモータ（Ｐ）、リーダー（Ｌ）、イントロン（Ｉ）、クロロプラストターゲッティングペプチド（ＣＴＰ）及び３'ＵＴＲ（Ｔ）である。また、構築物は、両方のＣｒｙタンパクのベクタースタック（Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５）を含むか、または単一のＣｒｙタンパク、すなわちＣｒｙ２ＡｂまたはＣｒｙ１Ａ．１０５を含んでいた。発現構築物では更に、ベクタースタック構築物中のＣｒｙタンパクに対する２つのカセットの相対的な配向が異なっていた。具体的に、２つのカセットは、転写の縦に並んだ配向にあったか、または２つのカセットは、拡散する配向のいずれかであったため、２つのＣｒｙタンパクの各プロモータからの発現が、２つのプロモータ間の中心点から離れるようになる、すなわち、各発現カセットの転写は、逆方向で進み、かつ、収束しないようになる。Ｃｒｙ１Ａ．１０５をコードするＤＮＡシーケンスは、イベントＭＯＮ８７７５１に間挿される導入遺伝子のシーケンスに対して、構築物中に多様化されるシーケンスであった。最後に、転写と逆の配向に指向される、２つのＣｒｙ発現カセットを有する構築物の２つにおいて、転写エンハンサは、発散プロモータの間に配置された（図２を参照）。
イベントＭＯＮ８７７５１は、図２で例示されるように、それぞれがＴ−ＤＮＡセグメントを含む構築物の１つで変換される何千もの異なる独立形質転換イベントとの比較及びイベントＭＯＮ８７７０１及び／またはイベントＧＭ＿Ａ１９４７８（ＭＯＮ８７７０１として同時に発生し共にＣｒｙ１Ａｃを発現）との比較、形質転換イベント４０−３−２（除草剤グリフォセートに耐性をもたらす）との比較及び非移植遺伝子の制御ダイズ（Ａ３５５５またはＡ５５４７）との比較に基づき選択された。下に示す実施例の結果は、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパクを発現しているため、イベントＭＯＮ８７７５１は、優れた特性を示したことを示す。イベントＭＯＮ８７７５１の発生に用いた構築物を用いて生成した複数の形質転換イベントの方が、他の構築物で生成される他のイベントよりも、鱗翅類の害虫に対する有効な制御を示す可能性が高かった。
各イベントＭＯＮ８７７５１に対応するＤＮＡを含む、種子を含むダイズ植物及びその部分のそれぞれが、本発明の範囲内である。種子を含むその植物及び部分は、鱗翅類の寄生に対する耐性を示す。特定の実施形態では、この植物及び種子は、ハイブリッド及び近交系、並びに、１つのイベントＭＯＮ８７７５１対立遺伝子のみ、すなわち、イベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡに対応する座位に関してヘテロ接合としてキャラクタリゼーションされたゲノムのみ、を含む植物及び種子を含む。商業的な生長過程の一部としての所望の生殖質及びダイズの他の農業上所望の特性を有するイベントＭＯＮ８７７５１を含む植物を交配することにより、このハイブリッドを生産することができる。ハイブリッドは、多くの方法により生産されてもよいが、好ましい方法は、イベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡが間挿される座位での両方の染色体上にあるイベントＭＯＮ８７７５１特性対立遺伝子を含む、第１の近交系（同種接合）ペアレントの利点を利用し、ＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含まない第２の近交系と第１の近交系を交配する。両方のペアレンタル近交系種類は、後代の種子、すなわちハイブリッド種子で所望の１つ以上の有利な特性を有し、そして、これらのハイブリッド種子は、イベントＭＯＮ８７７５１対立遺伝子に対してヘテロ接合である。
イベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含んでいる植物に追加の形質をもたらす移植遺伝子の特性または対立遺伝子が望まれる場合もある。他の形質転換対立遺伝子のもたらす所望の形質としては、除草剤耐性：ＧＴＳ ４０−３−２、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８９７８８、Ａ２７０４−１２、Ａ２７０４−２１、Ａ５５４７−３５、Ａ５５４７−１２７、ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、ＤＰ３５６０４３、ＧＵ２６２、Ｗ６２、Ｗ９８、ＤＡＳ−４４４０６−６、ＤＡＳ−６８４１６−４、ＦＧ７２、ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、ＳＹＨＴ０４Ｒ、ＳＹＨＴ０Ｈ２、３５６０. ４．３．５、ＥＥ−ＧＭ３、ｐＤＡＢ４４７２−１６０６、ｐＤＡＢ４４６８−０４１６、ｐＤＡＢ８２９１．４５．３６、１２７、ＡＡＤ−１２；虫害抵抗性：ＭＯＮ８７７０１、ＤＡＳ−８１４１９−２；強化油組成物の増強：ＤＰ−３０５４２３、Ｇ９４−１、Ｇ９４−１９、Ｇ１６８、ＯＴ９６−１５、ＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８７７６９；産出高の増加：ＭＯＮ８７７１２、または窒素固定形質、水使用調節形質、菌類寄生耐性、ネマトーダ寄生耐性等が挙げられる。非移植遺伝子の特性（例えば、ＱＴＬまたは成熟グループ）は、所望の形質をもたらし得るとともに、当業者は、この非形質転換形質及びイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含むようにダイズを交配する方法を知っている。
本発明の前述及びその他の態様は、以下の詳細な説明からさらに明らかになる。
各水平線により例示される、異種の形質転換ＤＮＡのセグメント、フランキングゲノムＤＮＡ、任意に表わされた５'及び３'ゲノム／間挿ＤＮＡ接合部の相対的な位置及びダイズイベントＭＯＮ８７７５１を同定するために使用可能な異種の形質転換ＤＮＡ内のイベントＭＯＮ８７７５１に特有のシーケンスの相対的な位置線図である。〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕、〔５〕、〔６〕、〔７〕、〔８〕、〔９〕〔１０〕、〔１７〕、〔１８〕、〔１９〕、〔２０〕、〔２１〕、〔２２〕、〔２３〕、〔２４〕、〔２５〕及び〔２６〕で標識された水平線は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５及び配列番号：２６にそれぞれ対応する。太線による水平線は、イベントＭＯＮ８７７５１で間挿される異種の形質転換ＤＮＡの複合体（配列番号：９）及び５'及び３'フランキングゲノムＤＮＡの両方を代表し、また、配列番号：７、配列番号：９及び配列番号：８を含む配列番号：１０を表示する。太い水平矢印は、配列番号：１５、配列番号：１１、配列番号：１２及び配列番号：１４にそれぞれに対応するＳＱ２６９０１、ＳＱ２０２６７、ＳＱ２５８２６及びＳＱ２７１１５を表わす。細い水平矢印は、イベントＭＯＮ８７７５１の異種の形質転換間挿ＤＮＡの２つの別々の発現カセットの相対的な構成を表し、Ｐはプロモータ要素を表し、Ｌはリーダーを表し、Ｐ−Ｌは、プロモータ及びリーダーを表し、Ｉはイントロンを表し、ＣＴＰはクロロプラスト輸送ペプチドを表し、Ｃｒｙ２ＡｂはＣｒｙ２Ａｂタンパク、Ｔ＝３’転写終了及びポリアデニル化要素（３' ＵＴＲ）のためのコード領域を表し、Ｃｒｙ１Ａ．１０５は、Ｃｒｙ１Ａ．１０５タンパクのコード領域を表す。 ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の選択中に評価されるトランスジェニックダイズイベントを生成するために用いられる１１の形質転換構築物中でＣｒｙタンパク発現カセットをコードするＴ−ＤＮＡセグメント及び各構築物中の各Ｃｒｙタンパク発現カセットの組成物を例示する図である。 非トランスジェニックダイズ株（Ａ３５５５）と比較した、構築物１、構築物２及び構築物３で発生するイベント中の、Ｃｒｙタンパク発現のＥＬＩＳＡ分析の結果のグラフ図である。パネルＡは、植物成長のＲ１及びＲ３段階で収集される葉組織中のＣｒｙ２Ａｂタンパク質レベルを示す。パネルＢは、植物成長のＲ１及びＲ３段階で収集される葉組織中のＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質レベルを示す。 非トランスジェニックダイズ株（Ａ３５５５）と比較した、構築物１、構築物５、構築物６及び構築物４で発生するイベント中の、Ｃｒｙタンパク発現のＥＬＩＳＡ分析の結果のグラフ図である。パネルＡは、２つの別々のスクリーンハウス試験で成長させた植物から植物成長のＲ３段階で収集した葉組織中のＣｒｙ２Ａｂタンパク質レベルを示す。パネルＢは、２つの別々のスクリーンハウス試験で成長させた植物から植物成長のＲ３段階で収集した葉組織中のＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質レベルを示す。 植物成長のＲ３及びＲ５段階で収集した葉サンプルに対して、構築物１、構築物２、構築物３、構築物、４、構築物５、構築物６、構築物９、構築物７及び構築物１１で発生させたイベント中のＣｒｙ２Ａｂタンパク発現のＥＬＩＳＡ分析の結果のグラフ図である。 植物成長のＲ３及びＲ５段階で収集された葉サンプルに対して、構築物１、構築物２、構築物３、構築物、４、構築物５、構築物６、構築物９、構築物７及び構築物１１で発生させたイベント中の、Ｃｒｙ２１Ａ．１０５タンパク発現のＥＬＩＳＡ分析の結果のグラフ図である。パネルＡは、Ｙ軸０〜５０００ｐｐｍの乾燥重量をプロットし、パネルＢは、Ｙ軸０〜５００ｐｐｍの乾燥重量をプロットし、Ｒ３段階のためのデータは、パネルＢによりよく示される。 シーケンスの簡単な説明
配列番号：１は、ダイズゲノムＤＮＡ及び一体型の形質転換発現カセットの５'接合部領域を表す２０のヌクレオチド配列である。
配列番号：１は、ヌクレオチド位置１３２５〜１３４４で配列番号：１０中に配置される。
配列番号：２は、ダイズゲノムＤＮＡ及び一体型の形質転換発現カセットの３'接合部領域を表す２０のヌクレオチド配列である。
配列番号：２は、ヌクレオチド位置１１４４４〜１１４６３で配列番号：１０中に配置される。
配列番号：３は、ダイズゲノムＤＮＡ及び一体型の形質転換発現カセットの５'接合部領域を表する６０のヌクレオチド配列である。
配列番号：３は、でヌクレオチド位置１３０５〜１３６４で配列番号：１０中に配置される。
配列番号：４は、ダイズゲノムＤＮＡ及び一体型の形質転換発現カセットの３'接合部領域を表す６０のヌクレオチド配列である。
配列番号：４は、ヌクレオチド位置１１４２４〜１１４８３で配列番号：１０中に配置される。
配列番号：５は、ダイズゲノムＤＮＡ及び一体型の形質転換発現カセットの５'接合部領域を表す１００のヌクレオチド配列である。
配列番号：５は、ヌクレオチド位置１２８５〜１３８４で配列番号：１０中に配置される。
配列番号：６は、ダイズゲノムＤＮＡ及び一体型の形質転換発現カセットの３'接合部領域を表す１００のヌクレオチド配列である。
配列番号：６は、ヌクレオチド位置１１４０４〜１１５０３で配列番号：１０中に配置される。
配列番号：７は、ゲノムＤＮＡ及び移植遺伝子の間挿ＤＮＡの接合部まで及びそれを含む、５'フランキングダイズゲノム配列を表す１６２６のヌクレオチド配列であり、フランキングゲノムＤＮＡの（５'〜３'）１３３４及び間挿形質転換ＤＮＡの任意に指定された５’末端の２９２のヌクレオチドを含む。
配列番号：８は、ゲノムＤＮＡ及び移植遺伝子の間挿ＤＮＡの接合部まで及びそれを含む、フランキングダイズゲノム配列を表す１４５２のヌクレオチド配列であり、間挿形質転換ＤＮＡの任意に指定された３’末端の（５'〜３'）２６５のヌクレオチド及び３'フランキングゲノムＤＮＡの１１８７のヌクレオチドを含む。
配列番号：９は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１のゲノムに間挿される移植遺伝子のＤＮＡに対応し１０１１９のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は、イベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ゲノムＤＮＡの複合ヌクレオチド配列及び５'フランキングゲノムＤＮＡヌクレオチド配列及び３'フランキングゲノムＤＮＡヌクレオチド配列に対応する１２６４０のヌクレオチド配列であり、配列番号：７及び配列番号：９及び配列番号：８を含む。
配列番号：１１は、サンプル中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを同定するために用いられるＳＱ２０２６７と呼ばれる熱増幅プライマーに対応した２７のヌクレオチド配列であり、配列番号：１０の位置１１４００〜１１４２６に対応するヌクレオチド配列と同一である。
配列番号：１２は、サンプル中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを同定するために用いられるＳＱ２５８２６と呼ばれる熱増幅プライマーに対応した２６のヌクレオチド配列であり、配列番号：１０の位置１１４５４〜１１４７９に対応するヌクレオチド配列の逆補完体と同一である。
配列番号：１３は、サンプル中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを同定するために用いられるＰＢ１０２６３と呼ばれるプローブに対応した１９のヌクレオチド配列であり、配列番号：１０の位置１１４２８〜１１４４６に対応するヌクレオチド配列と同一である。
配列番号：１４は、サンプル中のダイズ野生型対立遺伝子ＤＮＡ及び／またはダイズイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡの存在を同定するために用いられるＳＱ２７１１５と呼ばれる熱増幅プライマーに対応した２４のヌクレオチド配列であり、配列番号：１０の位置１１４５８〜１１４８１に対応するヌクレオチド配列の逆の逆補完体と同一である。
配列番号：１５は、ダイズから誘導されるサンプル中の野生型対立遺伝子ＤＮＡの存在を同定するために接合子性アッセイで用いられるＳＱ２６９０１と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する３０のヌクレオチド配列であり、配列番号：１０の位置１２８８〜１３１７に対応するヌクレオチド配列と同一である。
配列番号：１６は、ＰＢ１１２５４と呼ばれるプローブに対応する１８のヌクレオチド配列であり、ダイズから誘導されるサンプル中の野生型対立遺伝子ＤＮＡの存在を同定するために、接合子性アッセイで用いられる。
配列番号：１７は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する１１２のヌクレオチド配列であり、配列番号：９の３６〜１４７の位置と同一であり、かつ配列番号：１０の１３７０〜１４８１の位置と同一である。
配列番号：１８は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する５２のヌクレオチド配列であり、配列番号：９の１３０５〜１３５６で位置と同一であり、かつ配列番号：１０の１６３９〜１６９０位置と同一である。
配列番号：１９は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する２８３のヌクレオチド配列であり、配列番号：９の位置１５６１〜１８４３と同一であり、かつ配列番号：１０の位置２８９５〜３１７７と同一である。
配列番号：２０は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する４８６ヌクレオチド配列であり、配列番号：９の２３４０〜２８２５の位置と同一であり、かつ配列番号：１０の３６７４〜４１５９の位置と同一である。
配列番号：２１は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する１７９のヌクレオチド配列であり、配列番号：９の３３２６〜３５０４の位置と同一であり、かつ配列番号：１０の位置４６６０〜４８３８と同一である。
配列番号：２２は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する１０６のヌクレオチド配列であり、サンプル中のイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを同定するために有用であり、配列番号：９の３７４９〜３８５４の位置と同一であり、かつ配列番号：１０の位置５０８３〜５１８８と同一である。
配列番号：２３は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する６０のヌクレオチド配列であり、サンプル中のイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを同定するために有用であり、配列番号：９の位置９３２０〜９３７９と同一であり、かつ配列番号：１０の位置１０６５４〜１０７１３と同一である。
配列番号：２４は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応する６６のヌクレオチド配列であり、サンプル中のイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを同定するために有用であり、配列番号：９の位置９６２０〜９６８５と同一であり、かつ配列番号：１０の位置１０９５４〜１１０１９と同一である。
配列番号：２５は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に間挿される形質転換ＤＮＡ（配列番号：９）中の特有のヌクレオチド配列に対応し、サンプルでイベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを同定するために有用な、１５６のヌクレオチド配列であり、配列番号：９の位置９７２０〜９８７５と同一であり、かつ配列番号：１０の位置１１０５４−１１２０９と同一である。
配列番号：２６は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１中に発現されるＣｒｙ２Ａｂタンパクをコードするオープンなリーディングフレームに対応した、１９０５のヌクレオチド配列である。
本発明者らは、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ），ＦＡＷ）、スポドプテラ・エリダニア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）（サウザンアーミーワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｒｍｙｗｏｒｍ），ＳＡＷ）、スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）（ビートアーミーワーム（ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ），ＢＡＷ）、スポドプテラ・オルニトガリイ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｏｒｎｉｔｈｏｇａｌｌｉ）（イエローストライプドアーミーワーム（ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ），ＹＳＡＷ）、クロシドセマ・アポレマ（Ｃｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ ａｐｏｒｅｍａ）（ビーンシュートモス（ｂｅａｎ ｓｈｏｏｔ ｍｏｔｈ），ＢＳＭ）、ラキプルシア・ヌ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）（サンフラワールーパー（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｌｏｏｐｅｒ），ＳＦＬ）、アンチカルシア・ゲマタリス（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）（ベルベットビーンキャタピラー（ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ），ＶＢＣ）、クリソデイキス・インクルデンス（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）（ソイビーンルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ），ＳＢＬ）、ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）（ソイビーンポッドウォーム（ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｄｗｏｒｍ），ＳＰＷ）、ヘリコベルパ・ゲロトぺオン（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｇｅｌｏｔｏｐｅｏｎ）（サウスアメリカンボールワーム（Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）（レッサーコーンストークボーラー（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ））、エスチグマン・アクレア（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ）（ソルトマーシュキャタピラー（ｓａｌｔｍａｒｓｈ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）及びプラチペナ・スカブラ（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）（グリーンクローバーワーム（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）などの鱗翅目における農業上重要な害虫に対し、商業的に許容可能な耐性を示すトランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１を同定した。当該イベントは、２つの異なる操作可能に連結した発現カセットを有し、１つはＣｒｙ２Ａｂ殺虫タンパク質をコードし、他方はＣｒｙ１Ａ．１０５殺虫タンパク質をコードし、ダイズが鱗翅目の寄生に対し耐性を示すための２種の異なる作用様式を示す。他のトランスジェニックダイズイベントも当該技術分野で公知であり、即ち、Ｃｒｙ１Ａｃバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）毒素タンパク質を発現するＭＯＮ８８７０１がある（ＭａｃＲａｅ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ ＆ Ｐｅｒｌａｋ １９９５）。ＭＯＮ８８７０１は、スポドプテラ種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）に対する有効性は不十分であるが、ダイズの主な鱗翅目の害虫に耐性を示す単一の作用様式を示す。ダイズの主要害虫に有効性を示し、スポドプテラ種の制御に関与する２種以上の異なる殺虫タンパク質を発現するトランスジェニックダイズを提供することが好ましい。本発明者らは、上記課題に対する少なくとも１つの解決策をダイズイベントＭＯＮ８７７５１の形態で提供するが、このＭＯＮ８７７５１はダイズゲノム内の１遺伝子座において２つの共有結合した発現カセットを結合し、これらのカセットは鱗翅目種に対する耐性特性を拡張し、更には、ダイズ細胞、ダイズ組織、ダイズ葉、ダイズさや、ダイズ種子及びダイズ植物に、鱗翅目種間の耐性進化を阻害または遅延させる２以上の作用様式を提供する。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１は、プラスミド構築物１を用いるダイズ分裂組織のアグロバクテリウム媒介形質転換法により作製された。このプラスミド構築物は２つの領域を含み、各々がアグロバクテリウムの境界セグメント（Ｔ−ＤＮＡセグメント）に挟まれている。第１のＴ−ＤＮＡセグメントは、２つの連結した植物発現カセットを含み、１つの発現カセットは選択マーカーをコードし、もう１つの発現カセットはスコア化可能マーカーをコードする。第２のＴ−ＤＮＡセグメントは、２つの異なる殺虫タンパク質Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５がダイズ植物細胞中で発現するのに必要な調節遺伝因子を有する２つの連結した植物発現カセットを含む。プラスミド構築物１中の２つのＴ−ＤＮＡセグメントにより、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の発現カセットを含むＴ−ＤＮＡセグメントの組込み部位から離れた部位に、選択／スコア化可能マーカー遺伝子を含むＴ−ＤＮＡセグメントがダイズゲノムに無作為に挿入され、その結果自家受粉及び／または戻し交配、例えば、Ｒ１及びこれより高い世代のトランスジェニック植物のスクリーニングのプロセスの間に、形質転換されたダイズ植物ゲノム内の２つのＴ−ＤＮＡセグメントの隔離が可能となる。形質転換したダイズ細胞は無傷のダイズ植物に再生し、個々の植物をＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質をコードする第２のＴ−ＤＮＡセグメントの完全性を示す植物固体群から選択した。Ｒ１とその次の世代では、イベントは、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質をコードする第２のＴ−ＤＮＡセグメントの完全性に基づき、また選択／スコア化可能マーカーカセットをコードする第１のＴ−ＤＮＡセグメントの不在（即ち、隔離）に基づいて選択され、プラスミドのいかなるバックボーン配列も含まない植物用として選択される。イベントＭＯＮ８７７５１のダイズ細胞が昆虫の餌中に供される場合には、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の細胞中に発現されたＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５殺虫性毒性タンパク質が、鱗翅目害虫に対する耐性を与える。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１のゲノムに挿入されたプラスミドＤＮＡは、詳細な分子分析により特徴付けられる。これらの分析は以下を含む：挿入数（ダイズゲノム内の組込み部位数）、ゲノム挿入位置（挿入が生じたダイズゲノム中の特定部位）、コピー数（１遺伝子座内のＴ−ＤＮＡのコピー数）、及びトランスジェニック挿入ＤＮＡの完全性。当該イベントＭＯＮ８７７５１を生じるダイズゲノムに挿入された２つの連結した発現カセットを含むプラスミド構築物は、ダイズゲノムにも、その他のベクターまたはダイズ若しくはトランスジェニックイベントにも天然に存在することは知られていない複数のセグメント（いくつかの発現カセットを作製または構築するのに使用される要素間の結合配列）を含む（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６に示される配列）。更に、イベントＭＯＮ８７７５１に挿入されたトランスジェニックＤＮＡを生じさせた形質転換イベントは、本明細書では、ダイズゲノム内の単一遺伝子座に対する挿入物として特徴付けられ、結果的に挿入ＤＮＡとダイズゲノムＤＮＡの間の２つの新たな遺伝子座、即ち結合配列をもたらす。また、本明細書で特徴付けられるのは、イベントＭＯＮ８７７５１のダイズゲノムに挿入された異種ＤＮＡ内の更なるユニーク配列であり、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含むダイズゲノムに対してのみユニークとなるのに十分な長さを有する配列である。これらの結合配列は、ダイズ細胞、ダイズ組織、ダイズ種子及びダイズ植物またはダイズ植物生産物（ダイズ商品生産物）中のイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡの存在を検出するのに有用である。ＤＮＡ分子のプローブ及びプライマー対は、本明細書には、イベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含有するダイズ細胞、ダイズ種子、ダイズ植物部分またはダイズ植物組織を含む、または含むことが疑われる生体試料中のこれらの様々な結合セグメントの存在の同定に使用するために開発されたことが記載されている。データは、イベントＭＯＮ８７７５１が、挿入されたトランスジェニックＤＮＡの１コピーと共に、単一のＴ−ＤＮＡ挿入物を含有することを示している。イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡには、植物形質転換プラスミドからダイズゲノムへのトランスジェニックＤＮＡの転移に使用される、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの左及び右境界領域部分以外の形質転換構築物１からの更なる要素は同定されなかった。最後に、試料中のかかるイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡが存在する診断となる特定のアンプリコンを作製する熱増幅と、ＤＮＡ配列分析を行い、任意に特定した５’及び３’挿入物と植物ゲノムの結合部を決定し、挿入物の中の要素の構成を確認し、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１中に挿入された導入遺伝子ＤＮＡ（配列番号９）の完全ＤＮＡ配列を決定した。
多くのトランスジェニックイベントが、トランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１の作製に使用される形質転換構築物１を用いて作製され、１０個の更なる形質転換構築物が生成され使用されて、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１及びこれに類似するダイズイベントと比較される他の多くのトランスジェニックダイズイベントが作製された。これらのイベントについては、２種類の殺虫タンパク質Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の葉組織における発現を、ＥＬＩＳＡアッセイにより試験した。各々の形質転換により作製されたイベントのサブセットと、前記構築物の大部分について、スモールプロットスクリーンハウス試験（ｓｍａｌｌ−ｐｌｏｔ ｓｃｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｔｒｉａｌｓ）における鱗翅目害虫の制御能力を試験した。植物の発現要素、及び形質転換構築物１中のＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の発現カセットの相対的位置（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が、試験される最も広い範囲の鱗翅目害虫に対する最も優れた効力をイベントに与えることが確認された。
本明細書中で特記しない限り、用語は、関連技術分野の当業者の通常の使用法に従い理解すべきである。分子生物学における一般用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；及びＬｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４においても見出すことができる。本明細書で使用する「ダイズ」という用語は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）を意味し、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含有するダイズ植物を用いて育種できる全ての植物種を包含し、ダイズ野生種と、種間の育種が可能なダイズ属に属する植物も包含する。本明細書で使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、これに限定されない」ことを意味する。
本発明は、少なくとも２つの発現カセットを含むＤＮＡ構築物により形質転換されたトランスジェニック植物を提供し、第１の発現カセットは毒性量の殺虫タンパク質Ｃｒｙ２Ａｂを発現し、第２の発現カセットは毒性量の殺虫タンパク質Ｃｒｙ１Ａ．１０５を発現する。毒性量の意味は、有効量、殺虫量、有効殺虫量（ａｎ ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｍｏｕｎｔ）、殺虫有効量、標的昆虫抑制量、有効殺虫量（ａｎ ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ａｍｏｕｎｔ）、鱗翅目昆虫の餌中の殺虫量、及び当該関連技術分野の当業者による従来の使用法に従い理解されるその他の類似語である。前記方法に従い、本明細書に開示されたＤＮＡ構築物を用いて形質転換されたダイズ植物は、鱗翅目害虫に耐性を有する。農業的な形質を組み合わせることにより、育種集団においてこれらの特性を共に維持することが容易となり、鱗翅目害虫に対する耐性を与える単一遺伝子のみ（即ち、Ｃｒｙ１Ａｃ）を含む植物よりも、広範囲の鱗翅目害虫に対する耐性を示す。
トランスジェニック「植物」は、異種ＤＮＡ、即ち、注目する複数の有効形質（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｆｅａｔｕｒｅｓ）を含むポリ核酸構築物による植物細胞の形質転換；導入遺伝子を植物細胞のゲノムに挿入して得られた植物の再生；及び特定のゲノム位置への挿入と、再生されたトランスジェニック植物の有効形質数により特徴付けられる特定植物の選択、により作製される。「イベント」という用語は、挿入ＤＮＡ、及び挿入ＤＮＡに直接隣接するフランキングゲノム配列を含む元来の形質転換体からのＤＮＡをいう。かかるＤＮＡはユニークであり、挿入ＤＮＡを含む１つの親系（例えば、自家受粉により生じる元来の形質転換体及び子孫）と、挿入ＤＮＡを含まない親系との性的交配の結果、注目される導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る子孫に伝達されることが期待されるであろう。本発明は、異種ＤＮＡを含む元来の形質転換植物及びその形質転換体の子孫も提供する。かかる子孫は、当該イベントを含む植物と別の植物との性的異種交配により作製することができ、その子孫は異種ＤＮＡを含む。反復親への戻し交配の反復後であっても、当該イベントは、同一の染色体位置での交配による子孫に存在する。本発明は、トランスジェニックイベント、ＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物、その子孫及びそこに含まれるＤＮＡ組成物に関する。
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射活性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素が結合し得る単離された核酸である。かかるプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合には、ＭＯＮ８７７５１を含有する植物に由来するか、またはＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含む試料に由来するかにかかわらず、ＭＯＮ８７７５１からのＤＮＡ鎖に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のみならず、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミド及び他のプローブ材料をも包含し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができる。
ＤＮＡプライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールし、プライマーと標的ＤＮＡ鎖間のハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される単離されたポリ核酸である。本発明のＤＮＡプライマー対またはＤＮＡプライマーセットとは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来のポリ核酸増幅方法によって、標的核酸配列の増幅のために有用な２つのＤＮＡプライマーをいう。
ＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーは、１１個以上の長さのポリヌクレオチドであってよく、１８個以上のポリヌクレオチド、２４個以上のポリヌクレオチド、または３０個以上のポリヌクレオチドであってもよい。かかるプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンジーなハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さを有するよう選択される。好ましくは、本発明によるプローブ及びプライマーは、標的配列との完全な配列類似性を有するが、標的配列にハイブリダイズする能力を保持する、その標的配列とは異なるプローブは従来の方法により設計し得る。
本明細書に開示されたフランキングゲノムＤＮＡ及び挿入配列に基づくプライマー及びプローブを用いて、従来の方法、例えば、かかるＤＮＡ分子を再クローニングし配列決定することにより、開示されたＤＮＡ配列を確認（及び必要ならば修正）することができる。
本発明の核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェント条件下で標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズする。あらゆる従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を用いて、試料中のトランスジェニック植物由来のＤＮＡの存在を同定することができる。核酸セグメントまたはそのフラグメントとも称されるポリ核酸分子は、ある種の状況下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に用いた２つのポリ核酸分子は、その２つの分子が逆平行二本鎖の核酸構造を形成できる場合、相互に特異的にハイブリダイズできると言われる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書に用いた分子は、その分子の１つのすべてのヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合に「完全な相補性」を示すと言われる。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、それらが相互にアニーリングされた状態を維持可能とするのに十分な安定性を持って相互にハイブリダイズできる場合、「最小に相補的である」と言われる。同様に、それらの分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、それらが相互にアニーリングされた状態を維持可能とするのに十分な安定性を持って相互にハイブリダイズできるならば、「相補的」であると言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．により１９８９年に、及びＨａｙｍｅｓ ｅｔ ａｌ．により、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ（１９８５）において記載されている。従って、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に除外しない限りは、許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、使用した特定の溶媒及び塩濃度下で、配列が安定な二本鎖構造を形成できるのに十分相補性であることだけが必要である。
本明細書に用いた、実質的に相同性の配列は、高ストリンジェンシー条件下で、それが比較される核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続く、５０℃の２．０×ＳＳＣによる洗浄は、当業者に公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ． （１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃の約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上げることができる。温度及び塩の双方は変更でき、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持しつつ、他方の変数を変化させることができる。好ましい実施形態では、本発明のポリ核酸は、中程度のストリンジェント条件下、例えば、約２．０×ＳＳＣ及び約６５℃で、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４に記載された１以上の核酸分子またはその相補体またはそのいずれかのフラグメントに特異的にハイブリダイズするであろう。特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４に記載された１以上の核酸分子またはそのいずれかの相補体もしくはフラグメントに特異的にハイブリダイズするであろう。本発明の１つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７または配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１７または配列番号１８または配列番号１９または配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２または配列番号２３に記載された核酸配列、またはその相補体またはそのいずれかのフラグメントを有する。標的ＤＮＡ分子に対するプローブのハイブリダイゼーションは当業者に公知の多くの方法により検出することができ、これらの方法としては蛍光性タグ、放射活性タグ、抗体ベースのタグ及び化学発光タグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
特定の増幅プライマー対を用いる（例えば、ＰＣＲによる）標的核酸配列の増幅に関し、「ストリンジェント条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが結合する標的核酸配列にだけハイブリダイズするのを可能とし、好ましくは、ＤＮＡの熱増幅反応において、ユニークな増幅生産物であるアンプリコンを生成する条件である。
「（標的配列）に特異的な」という用語は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列にだけハイブリダイズすることを示す。
本明細書で用いた「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、ポリ核酸鋳型の一部である標的ポリ核酸分子に対するポリ核酸増幅法の生産物をいう。例えば、性的交配により得られたダイズ植物が、本発明のイベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物からのトランスジェニック植物ゲノミックＤＮＡを含むか否かを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したＤＮＡを、イベントＭＯＮ８７７５１の異種挿入ＤＮＡに隣接する領域のゲノミックＤＮＡ配列に由来する第１のプライマーを含むプライマー対を用いるポリ核酸増幅法に供してもよく、ポリメラーゼにより挿入ＤＮＡの５’から３’の方向に伸長される。第２のプライマーは、ポリメラーゼにより、第１のプライマーが由来するフランキングゲノミックＤＮＡの５’から３’の方向に伸長される異種挿入ＤＮＡ分子に由来する。アンプリコンの長さは、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対、または＋約５０ヌクレオチド塩基対、または＋約２５０ヌクレオチド塩基対、または＋約４５０ヌクレオチド塩基対以上を組み合わせた長さの範囲に及ぶ。あるいは、プライマー対は、全挿入ポリヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するように、挿入異種ＤＮＡの両端のゲノム配列から得ることができる（例えば、配列番号１０の５’末端のゲノム位置から単離されたフォーワードプライマー、及びイベントＭＯＮ８７７５１を含有するゲノムにおいて本明細書で同定された、挿入異種ＤＮＡ配列（配列番号９）を含むＤＮＡ分子を増幅する配列番号１０の３’末端のゲノム位置から単離されたリバースプライマー）。挿入されたトランスジェニックＤＮＡに隣接する植物ゲノム配列から誘導されたプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列からある距離を置いて位置し、この距離は１ヌクレオチド塩基対から約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲に及ぶ。「アンプリコン」という用語の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成し得るプライマー二量体を明確に除外する。
実用的な目的のためには、限定されたサイズ範囲、例えば１００〜１０００塩基のアンプリコンを生成させるプライマーを設計すべきである。一般に、より小さい（より短いポリヌクレオチド長）サイズのアンプリコンは、熱増幅反応においてより確実に生成させることができ、より短いサイクル時間を可能とし、アガロースゲル上で容易に分離され視覚化され、またはエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）様アッセイの使用に適合させることができる。より小さいアンプリコンは、ＤＮＡアンプリコン検出の技術分野で公知の方法により作製し検出することができる。更に、プライマー対を用いて作製したアンプリコンをベクターにクローニングし、増殖させて単離し、配列決定するか、または当該分野で十分確立された方法で直接配列決定することができる。ＭＯＮ８７７５１またはその子孫を含む植物が存在する診断となるアンプリコンを作製するためのＤＮＡ増幅法に有用な、配列番号７と配列番号９の組み合わせ、または配列番号８と配列番号９の組み合わせに由来するあらゆるプライマー対が本発明の態様である。ＭＯＮ８７７５１またはその子孫を含む植物が存在する診断となるアンプリコンを作成するためのＤＮＡ増幅法に有用な、配列番号７で示される少なくとも１５の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含むあらゆる単一の単離ＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子が本発明の態様である。ＭＯＮ８７７５１またはその子孫を含む植物が存在する診断となるアンプリコンを作製するためのＤＮＡ増幅法に有用な、配列番号８で示される少なくとも１５の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含む、あらゆる単一の単離ＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子が本発明の態様である。ＭＯＮ８７７５１またはその子孫を含む植物が存在する診断となるアンプリコンを作成するためのＤＮＡ増幅法に有用な、配列番号９で示される少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含む、あらゆる単一の単離ＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子が本発明の態様である。
ポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた、当該技術分野で公知の様々なポリ核酸増幅法により達成できる。増幅法は当該技術分野で公知であり、特に、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２、並びにＰＣＲプロトコル：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｄ． Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０に記載されている。ＰＣＲ増幅法は、２２ｋｂ（キロベース）以下のゲノミックＤＮＡ及び４２ｋｂ以下のバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発されてきた（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：５６９５−５６９９，１９９４）。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の分野で公知の他の方法を、本発明の実施に用いてもよい。ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来する異種ＤＮＡ挿入物の配列またはフランキングゲノミックＤＮＡ配列は、本明細書で提供された前記配列から得られたプライマーを用いて、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含むダイズ種子、またはＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２０１６６で寄託されたイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含むダイズ種子から育成されたダイズ植物からのＤＮＡ分子を増幅させ、次いでＰＣＲアンプリコンまたはそのクローニングしたＤＮＡフラグメントについて標準的なＤＮＡ配列決定を行うことにより確認できる（必要ならば、修正できる）。
これらの方法により作製された診断となるアンプリコンは、複数の技術により検出することができる。かかる方法の１つは、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ分析法（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ、ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２２：４１６７−４１７５、１９９４）であり、この方法では、隣接するフランキングゲノミックＤＮＡ配列と挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドはマイクロタイタープレートのウェルに固定化される。（挿入配列における１つのプライマーと隣接するフランキングゲノミック配列における１つを用いる）注目する領域のＰＣＲの後には、一本鎖ＰＣＲ生産物は、固定化したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼと、予想される隣の塩基に特異的な標識ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）を用いる単一塩基伸長反応のための鋳型として機能し得る。読み出しは蛍光またはＥＬＩＳＡに基づくものであってよい。増幅、ハイブリダイゼーション及び単一塩基伸長反応の成功により、シグナルが導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
もう一つの方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ． Ｐｈａｒｍａ． Ｔｅｃｈ．００：１８−２４，２０００）によって記載されたピロシーケンス（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術である。この方法では、隣接するゲノミックＤＮＡと挿入ＤＮＡの結合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計されている。このオリゴヌクレオチドは、注目する領域からの一本鎖ＰＣＲ生産物にハイブリダイズし（挿入された配列における１つのプライマー及びフランキングゲノム配列における１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルファート及びルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰは個々に添加され、その組み込みの結果、光シグナルが生じ、これが測定される。増幅、ハイブリダイゼーション及び単一または多重の塩基伸長の成功により、光シグナルが導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４９２−４９８，１９９９）によって記載された蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンを検出するために使用できる方法である。この方法を用いて、ゲノムフランキングと挿入ＤＮＡの結合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドは注目する領域からの一本鎖ＰＣＲ生産物にハイブリダイズし（挿入ＤＮＡにおける１つのプライマー及びフランキングゲノミックＤＮＡ配列における１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの組み込みが起こる。組み込みは、蛍光測定器を用いて偏光の変化として測定できる。増幅、ハイブリダイゼーション及び単一塩基伸長の成功により、偏光の変化が導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
ＴａｑＭａｎ（商標登録）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）は、ＤＮＡ配列の存在を検出及び定量する方法として記載され、製造者が提供する説明書において十分に理解される。簡潔に言えば、ゲノムフランキングと挿入ＤＮＡの結合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列における１つのプライマー及びフランキングゲノム配列における１つ）が熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で循環する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光性部分がＦＲＥＴプローブ上の消光部分から離れて切断及び遊離する。増幅及びハイブリダイゼーションの成功により、蛍光シグナルが導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
分子標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）は、Ｔｙａｎｇｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６）に記載されるように、配列検出における使用が記載されてきた。簡潔に言うと、フランキングゲノムと挿入ＤＮＡの結合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブは、そのユニークな構造に起因して、蛍光性部分と消光部分とを隣接に保つ二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列における１つのプライマー及びフランキングゲノム配列における１つ）が、熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で循環する。ＰＣＲ増幅の成功に続いて、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイゼーションする結果、プローブ二次構造が除去され、蛍光性部分と消光部分の空間的分離が起こる。蛍光シグナルが生じる。増幅及びハイブリダイゼーションの成功により、蛍光シグナルがフランキング／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
ＤＮＡ増幅法に基づくＤＮＡ検出キットは、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、適切な反応条件下で診断となるアンプリコンを増幅させるＤＮＡプライマー分子を含む。当該キットは、アガロースゲルベースの検出方法、または当該技術分野で公知の診断となるアンプリコンを検出するあらゆる数の方法を提供し得る。ＤＮＡ検出キットは本明細書に開示される組成物を用いて開発することができ、試料中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡの同定に有用であり、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含むダイズ植物を育種する方法に適用できる。配列番号１０に記載されたダイズゲノム領域のいかなる部分、及び配列番号１０に記載された挿入トランスジェニックＤＮＡのいかなる部分に対し、相同的または相補的であるＤＮＡプライマーを含むキットは、本発明の対象物である。当該ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ）において、またはポリ核酸ハイブリダイゼーション法、即ちサザン分析法、ノーザン分析法におけるプローブとして使用することができる。
結合配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６から成る群からの配列により表すことができる。例えば、当該結合配列は、配列番号１及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列により任意に表すことができる。あるいは、当該結合配列は、配列番号３及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列により任意に表すことができる。あるいは、当該結合配列は、配列番号５及び配列番号６で示されるヌクレオチド配列により任意に表すことができる。これらのヌクレオチドは、フォスフォジエステル結合により結合され、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１中に組換え植物の細胞ゲノムの一部として存在する。ダイズ植物、ダイズ種子またはダイズ植物部分に由来する試料において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１以上が同定されることは、そのＤＮＡがダイズイベントＭＯＮ８７７５１から得られたことを決定する要因であり、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来するＤＮＡを含有する試料におけるその存在の診断となるものである。従って、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６として示されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含有するＤＮＡ分子を提供する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６として示される配列のうちの少なくとも１つを含むのに十分なトランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来するＤＮＡのいかなるセグメントも本発明の範囲内である。
本発明は、試料中における、イベントＭＯＮ８７７５１ＤＮＡを含むダイズ植物に由来するＤＮＡの存在を検出するための、プライマーまたはプローブのいずれかとして使用できる典型的なＤＮＡ分子を提供する。かかるプライマーまたはプローブは標的核酸配列に特異的であり、それ自体が、本明細書に記載された本発明の方法により、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の核酸配列の同定に有用である。
「プライマー」は、熱増幅を含む特定のアニーリング法またはハイブリダイゼーション法に用いられるように設計された、高純度に精製され単離されたポリヌクレオチドでもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような熱増幅において、ダイズゲノミックＤＮＡ試料のような鋳型ＤＮＡとともに一対のプライマーを用いてアンプリコンを生成してもよく、このような反応から生成されるアンプリコンであれば、プライマーと鋳型とがハイブリダイズした２つの部位の間に位置する鋳型ＤＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有するものと考えられる。本明細書で使用する「アンプリコン」とは、増幅技術を用いて合成した一片のＤＮＡ断片の複製のことである。本発明のアンプリコンは、配列番号１１または配列番号１２として提供されるように提供される配列の少なくとも１つを含んでもよい。プライマーは典型的に、相補的ターゲットＤＮＡ鎖とハイブリダイズしてプライマーとターゲットＤＮＡ鎖の間にハイブリッドを形成するように設計され、プライマーの存在は、鋳型としてターゲットＤＮＡ鎖を用いてプライマーの伸長（即ち、伸ばすヌクレオチド分子の中への追加的ヌクレオチドのポリメリゼーション）を開始しようとポリメラーゼが認識する点である。本発明で用いるプライマー対は、典型的には熱増幅または他の従来式核酸増幅法において、プライマー対の個々の構成要素によって結合のターゲットとされる位置の間にポリヌクレオチドセグメントを直鎖状に増幅することを目的とした、二本鎖ヌクレオチドセグメントの相対する鎖を結合させる２つのプライマーの使用に関連することを意図する。プライマーとして有用な例示的なＤＮＡ分子は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１５として提供される。配列番号１１及び配列番号１２として提供されるプライマー対は、第１のＤＮＡ分子及び第１のＤＮＡ分子とは異なる第２のＤＮＡ分子として有用であり、両方ともそれぞれ、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来する鋳型ＤＮＡとの熱増幅反応において共に用いられた場合に、試料中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡが存在する診断となるアンプリコンを生成するようＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの、配列番号１０の連続ヌクレオチドである。
「プローブ」とは、ターゲット核酸の鎖に相補的な、単離された核酸である。本発明によるプローブとしては、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ポリアミドと、ターゲットＤＮＡ配列に特異的に結合する他のプローブ材料も挙げられ、このような結合の検出は、特定の試料中にそのターゲットＤＮＡ配列の存在を診断、判別、決定、または確認するのに有用であり得る。プローブは、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば放射性同位体、リガンド、化学発光剤、または酵素に付加してもよい。プローブとして有用な例示的なＤＮＡ分子は、配列番号１３及び配列番号１６として提供される。
本発明によるプローブ及びプライマーは、ターゲット配列との完全な配列相同性を有してもよいが、ターゲット配列と優先的にハイブリダイズすることのできる能力を保持する、ターゲット配列とは異なるプライマー及びプローブを従来の方法によって設計してもよい。核酸分子がプライマーまたはプローブとして働くためには、用いる特定の溶媒及び塩の濃度の下で安定した二本鎖構造が形成できるよう配列が十分相補的でありさえすればよい。従来のいずれの核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、試料中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１からトランスジェニックＤＮＡの存在を同定することができる。プローブ及びプライマーは、概して、長さが少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、または少なくとも約３０ヌクレオチド以上である。このようなプローブ及びプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でターゲットＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズする。従来のストリンジェント条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，及びＨａｙｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）に記載される。
熱増幅方法を含め、当業者に周知のいずれの方法を用いても、本発明に開示されるＤＮＡ分子またはその断片を単離し、操作することができる。ＤＮＡ分子またはその断片はまた、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いることによって一般的に実践されているように、化学的手段によって直接断片を合成するなど、他の技術によって得ることもできる。
したがって、本明細書で提供されるＤＮＡ分子及び対応するヌクレオチド配列は、とりわけ、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を同定し、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む植物種またはハイブリッドを選定し、トランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来するＤＮＡの存在を試料中に検出し、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１か、またはイベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物に由来する植物部分のいずれかの存在及び／または不存在について試料を調べるのに有用である。
本発明は、ダイズ植物、ダイズ植物細胞、ダイズ種子、ダイズ植物部分（花粉、胚珠、さや、花組織、根組織、茎組織、及び葉組織など）、ダイズ子孫植物、ダイズ油、ダイズワイン、豆乳、ダイズタンパク質、及びダイズ商品生産物を提供する。これらのダイズ植物、ダイズ植物細胞、ダイズ種子、ダイズ植物部分、ダイズ子孫植物、ダイズ油、ダイズワイン、豆乳、ダイズタンパク質、及びダイズ商品生産物は、本発明の検出可能な量のポリヌクレオチド、即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号２６として提供される配列の少なくとも１つを有するポリヌクレオチドなど、を含有する。本発明のダイズ植物、植物細胞、種子、植物部分、及び子孫植物はまた、１つまたは複数の追加的な導入遺伝子を含有してもよい。このような追加的導入遺伝子は、向上した虫害抵抗性、向上した水利用効率、向上した収量性、向上した耐乾燥性、向上した種子品質、改善した栄養価、及び／または向上した除草剤耐性を含め、しかしそれらに限定されない望ましい形質を与えるタンパク質またはＲＮＡ分子をコードするいずれのヌクレオチド配列でもよく、尚、それらの望ましい形質は、このような追加的導入遺伝子を欠くダイズ植物と比較して評価された場合のものである。
本発明は、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含有するトランスジェニックダイズ植物に由来するダイズ植物、ダイズ植物細胞、ダイズ種子、ダイズ植物部分（花粉、胚珠、さや、花組織、根組織、茎組織、及び葉組織など）、ダイズ子孫植物を提供する。イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含有するダイズ種子の代表試料が、ブダペスト条約に従って、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託されている。ＡＴＣＣ貯蔵所は、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含有する種子に特許寄託番号ＰＴＡ−１２０１６６を割り当てている。
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子の存在をゲノムに含む微生物を提供する。このような微生物の例としては、トランスジェニック植物細胞が挙げられる。本発明の植物細胞のような微生物は、（ｉ）科学的調査または産業研究のための研究用手段としての使用；（ｉｉ）後続科学研究のため、あるいは産業生産物として用いることのできる、内在性もしくは組換えの炭水化物、脂質、核酸、またはタンパク質の生成物もしくは小分子を生成するための培養物における使用；及び（ｉｉｉ）後に農業における研究または生産に用いることのできるトランスジェニック植物または植物組織培養物を作成するための、近代的な植物組織培養技術との併用、を含み、しかしそれらに限定されない多くの産業用途において有用である。トランスジェニック植物細胞のような微生物の作成と使用においては、近代的な微生物学的技術及び人的介入を利用して、人造のユニークな微生物を作成する。この方法では、組換えＤＮＡが植物細胞のゲノムの中に挿入され、天然の植物細胞とは別個でユニークなトランスジェニック植物細胞を作出する。このトランスジェニック植物細胞は、次いで近代的な微生物学的技術を用いて、細菌及び酵母菌細胞とほぼ同様に培養することができ、未分化の単細胞状態で存在することができる。トランスジェニック植物細胞の新規遺伝子組成物及び表現型は、異種性ＤＮＡを細胞のゲノムの中に組み込むことによって創出された技術的効果である。本発明の他の態様は、本発明の微生物を用いる方法である。トランスジェニック植物細胞など、本発明の微生物を用いる方法は、（ｉ）組換えＤＮＡを細胞のゲノムの中に組み込み、次いで、この細胞を用いて、同じ異種性ＤＮＡを保有する追加的細胞を誘導することによって、トランスジェニック細胞を生成する方法と；（ｉｉ）組換えＤＮＡを含有する細胞を、近代的な微生物学的技術を用いて培養する方法と；（ｉｉｉ）培養された細胞から、内在性もしくは組換えの炭水化物、脂質、核酸、またはタンパク質の生成物を生成し精製する方法と；（ｉｖ）近代的植物組織培養技術をトランスジェニック植物細胞と併用してトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物組織培養を生成する方法と、を含む。
本発明の植物は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の中に挿入された導入遺伝子を含め、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを子孫に伝えることができる。本明細書で使用する「子孫」は、祖先植物に由来するイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡ、及び／または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６から成る群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子、を含むいかなる植物、種子、植物細胞、及び／または再生可能な植物部分をも含む。植物、子孫、及び種子は、導入遺伝子がホモ接合でもヘテロ接合でもよい。子孫は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含有する植物によって作った種子、及び／またはダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含有する植物の花粉で受精させた植物によって作った種子より育成することができる。
子孫植物は、自家受粉（「自家受粉（ｓｅｌｆｉｎｇ）」ともいう）させて、純粋種系統の植物、即ち、導入遺伝子がホモ接合の植物を生じさせることができる。適切な子孫の自家授粉は、付加された外来遺伝子の両方がホモ接合である植物を生じさせることができる。
あるいは、子孫植物は、異系交配して、例えば、無関係な別の植物と交配して、変種またはハイブリッドの種子または植物を生じさせることができる。その無関係な別の植物はトランスジェニックのものでも非トランスジェニックのものでもよい。このようにして、本発明の変種またはハイブリッドの種子または植物は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の特異的でユニークなＤＮＡを欠く第１の親と、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む第２の親とを性的に交配することによって誘導することができ、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の特異的でユニークなＤＮＡを含むハイブリッドにすることができる。各親は、交配または育種が、本発明の植物または種子、即ち、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１のＤＮＡ及び／または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子、を含有する少なくとも１つのアレルを有する種子を生じさせる限り、ハイブリッドまたは近交系／変種であり得る。このようにして、２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、２つの互いに独立して分離している付加された外来遺伝子を含有するハイブリッド子孫を作製することができる。例えば、二重作用様式虫害抵抗性をダイズに与えるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を含有するＭＯＮ８７７５１を別のトランスジェニックダイズ植物と交配して、両方のトランスジェニック親の特性を有する植物を生じさせることができる。これの一例として考えられるのは、二重作用様式虫害抵抗性をダイズに与えるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を含有するＭＯＮ８７７５１と、除草剤耐性（例えば、ダイズイベントＭＯＮ８９７８８またはダイズイベントＭＯＮ８７７０８）及び／または昆虫制御（例えば、ダイズイベントＭＯＮ８８７０１）など、１つまたは複数の追加的形質を有する植物との交配種であり、鱗翅目害虫に対する二重作用様式抵抗性を有し、少なくとも１つまたは複数の追加的形質を有する子孫植物または種子を生じさせるものである。親植物への戻し交配、及び非トランスジェニック植物との異系交配もまた、栄養繁殖と同様に、企図される。異なる形質及び作物に一般的に用いられる他の育種方法に関する記載が、いくつかの参考文献のひとつ、例えば、Ｆｅｈｒ，ｉｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ（１９８７）に見出せる。
本発明は、イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物に由来する植物部分を提供する。本明細書で使用される「植物部分」とは、イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物に由来する材料から成る植物のいずれの部分をも指す。植物部分としては、花粉、胚珠、さや、花、根組織または茎組織、繊維、及び葉が挙げられ、但しそれらに限定されない。植物部分は、成育可能、生育不能、再生可能、及び／または再生不能であってもよい。
本発明は、イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物に由来し、イベントＭＯＮ８７７５１に特異的な核酸を検出可能な量含有する商品生産物を提供する。本明細書で使用される「商品生産物」とは、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含有するダイズ植物、全粒または加工ダイズ種子、１つまたは複数の植物細胞及び／または植物部分に由来する材料から成るいずれの組成物または生成物をも指す。商品生産物は、消費者に販売してもよく、成育可能でも生育不能でもよい。生育不能商品生産物としては、生育不能種子；全粒または加工種子、種子部分、及び植物部分；ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズ糠、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズ含有動物餌、ダイズ含有紙、ダイズ含有クリーム、ダイズバイオマス、並びにダイズ植物及びダイズ植物部分を用いて製造された燃料生産物が挙げられ、但しそれらに限定されない。成育可能商品生産物としては、種子、植物、及び植物細胞が挙げられ、但しそれらに限定されない。イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物は、このようにして、ダイズから典型的に得られるいずれの商品生産物をも生産するのに用いることができる。イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物に由来するいずれのこのような商品生産物も、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に対応する特異的でユニークなＤＮＡを少なくとも検出可能な量含有してもよく、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む検出可能な量のポリヌクレオチドを含有してもよい。本明細書に開示される検出方法を含め、ヌクレオチド分子を検出するいずれの標準的な方法を用いてもよい。商品生産物は、その商品生産物の中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６より選択される少なくとも１つの配列を有する、検出可能な量のＤＮＡ分子があれば、本発明の範囲に入る。
したがって、本発明の植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、さや、花、根組織または茎組織、及び葉など）、ならびに商品生産物は、とりわけ、農業目的にダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む種子及び／または植物部分を生産する目的で植物を育成すること、植物の育種及び研究を目的にダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む子孫を生産すること、工業用途及び研究用途に微生物学的技術と併用すること、及び消費者に販売することに有用である。
本発明のイベントＭＯＮ８７７５１に特異的でユニークなＤＮＡ配列を含む耐昆虫性のダイズ植物を生産する方法が提供される。これらの方法で用いるトランスジェニック植物は、導入遺伝子がホモ接合またはヘテロ接合でもよい。これらの方法によって生産される子孫植物は、変種植物でもハイブリッド植物でもよく；ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含有する植物によって生産した種子及び／またはダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含有する植物の花粉で受精させた植物によって生産した種子から育成してもよく；導入遺伝子がホモ接合でもヘテロ接合でもよい。子孫植物は、引き続き自家受粉させて、純粋種系統の植物、即ち、導入遺伝子がホモ接合の植物を生じさせることができ、あるいは、異系交配して、例えば、無関係な別の植物と交配して、変種またはハイブリッドの種子または植物を生じさせることができる。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ細胞、ダイズ組織、ダイズ種子、またはダイズ植物に由来するＤＮＡの存在を試料中に検出する方法が提供される。一方法は、（ｉ）少なくとも１つのダイズ細胞、ダイズ組織、ダイズ種子、またはダイズ植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）ＤＮＡ配列決定に適切な条件下で、上記ＤＮＡ試料と、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡに特異的なＤＮＡ配列を生成することのできる少なくとも１つのプライマーとを接触させること、（ｉｉｉ）ＤＮＡ配列決定反応を行うこと、次に、（ｉｖ）そのヌクレオチド配列が、イベントＭＯＮ８７７５１に特異的なヌクレオチド配列、またはそこに含まれる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６から成る群より選択される１つなど、構築物を含むことを確認すること、から成る。別の一方法は、（ｉ）少なくとも１つのダイズ細胞、ダイズ組織、ダイズ種子、またはダイズ植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）ＤＮＡ増幅に適切な条件下で、そのＤＮＡ試料と、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡからアンプリコンを生成することのできるプライマー対とを接触させること、（ｉｉｉ）ＤＮＡ増幅反応を行うこと、及び次に、（ｉｖ）アンプリコン分子を検出すること、及び／または、そのアンプリコンのヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６から成る群より選択される１つなど、イベントＭＯＮ８７７５１に特異的なヌクレオチド配列を含むことを確認すること、から成る。アンプリコンは、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６を含むアンプリコンなど、イベントＭＯＮ８７７５１に特異的なものとなる。アンプリコン中におけるイベントＭＯＮ８７７５１に特異的なヌクレオチド配列の検出は、試料中におけるダイズイベントＭＯＮ８７７５１特異的ＤＮＡの存在の決定及び／または診断となる。ＤＮＡ増幅に適切な条件下でイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡからアンプリコンを生成することのできるプライマー対の例は、配列番号１１及び配列番号１２として提供される。他のプライマー対は、当業者が容易に設計することができ、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６を含むアンプリコンを生成すると考えられ、このようなプライマー対は、挿入断片に隣接するゲノム領域の中の少なくとも１つのプライマー、及び挿入断片の中の第２のプライマーを含む。ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ細胞、ダイズ組織、ダイズ種子、またはダイズ植物に由来するＤＮＡの存在を試料中に検出する他の一方法は、（ｉ）少なくとも１つのダイズ細胞、ダイズ組織、ダイズ種子、またはダイズ植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）そのＤＮＡ試料と、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡに特異的なＤＮＡプローブとを接触させること、（ｉｉｉ）そのプローブ及びＤＮＡ試料がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできるようにすること、次に、（ｉｖ）プローブとターゲットＤＮＡ試料との間にハイブリダイゼーションを検出すること、から成る。イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡに特異的なＤＮＡプローブの配列の一例が配列番号１３または配列番号１６として提供される。他のプローブも、当業者は容易に設計することができ、挿入断片に隣接するゲノミックＤＮＡの少なくとも１つの断片と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０において提供され、但しそれらに限定されない配列など、少なくとも１断片の挿入断片ＤＮＡと、を含むものとなる。ＤＮＡ試料とのプローブハイブリダイゼーションを検出することは、試料中におけるダイズイベントＭＯＮ８７７５１特異的ＤＮＡが存在する診断となる。あるいはまた、ハイブリダイゼーションの不在は、試料中におけるダイズイベントＭＯＮ８７７５１特異的ＤＮＡが存在しない診断となる。
試料中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡの同定に有用であり、また、適切なイベントＤＮＡを含有するダイズ植物を育種する方法にも適用することができる、ＤＮＡ検出キットが提供される。このようなキットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６の断片を含むＤＮＡプライマー及び／またはプローブを含有する。このようなキットの一例は、イベントＭＯＮ８７７５１を含むトランスジェニックダイズ植物に由来するＤＮＡの存在及び／または不在を試料中に検出するのに有用なＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さの、配列番号１０中の連続ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。イベントＭＯＮ８７７５１を含むトランスジェニックダイズ植物に由来するＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むと考えられる。試料中におけるダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡの存在及び／または不在を決定、検出、または診断するために有用なＤＮＡプローブが提供される通りに用いられるのに十分なＤＮＡ分子が配列番号１３として提供される。他のプローブも、当業者によって容易に設計することができ、配列番号１０の少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０の連続ヌクレオチドを含むものとなり、イベントに由来するＤＮＡを同定するために、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡに十分ユニークなものとなる。また別の種類のキットは、トランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来するＤＮＡの存在及び／または不在を試料中に検出するのに有用なアンプリコンを生成するために有用なプライマー対を含む。このようなキットは、ターゲットＤＮＡ試料と、本明細書に記載のプライマー対とを接触させることと、次いで、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を行うことと、次いで、アンプリコンの存在及び／または不在を検出すること、を含む方法を用いることになる。このような方法はまた、ターゲットＤＮＡ試料中におけるダイズイベントＭＯＮ８７７５１特異的ＤＮＡの存在の決定、即ち診断となると考えられるアンプリコンまたはその断片の配列決定を含んでもよい。他のプライマー対は、当業者が容易に設計することができ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６で提供され、但しそられに限定されない配列の、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０の連続ヌクレオチドを含むべきものであり、イベントに由来するＤＮＡを同定するために、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡに十分ユニークであるべきものである。
本発明のキット及び検出方法は、とりわけ、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を同定すること、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む植物の異種またはハイブリッドを選定すること、イベントＭＯＮ８７７５１を含むトランスジェニックダイズ植物に由来するＤＮＡの存在を試料中に検出すること、及びイベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物またはイベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物に由来する植物部分の存在及び／または不在について試料を調べること、に有用である。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来する異種性ＤＮＡ挿入断片、結合配列、またはフランキング配列の配列は、本明細書で提供される配列に由来するプライマーを用いてイベント由来のこのような配列を増幅することと、それに続くアンプリコンまたはクローン化ＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定をすることによって検証する（そして必要な場合、修正する）ことができる。
本発明の所定の好適な実施形態の例を実証するために、下の実施例が含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することを発明者らが見出した方法を表し、従って、その実施のための好適な形態の例を構成すると考えることができる、ということが当業者には理解される。しかしながら、当業者は、開示される具体的な実施形態には多くの変更を行うことができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなお得ることができる、ということを本開示に照らして理解する。
寄託情報
イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含有するダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）種子の代表試料は、ブダペスト条約に従って、２０１３年２月２８日に、米国、郵便番号２０１１０、バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８０１に住所を有する米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０１６６を割り当てられている。本願の係属中、特許商標庁長官及び長官が権限を有すると決定した者は、請求により、本寄託物を利用することが可能である。特許の発行後は直ちに、公衆に対する利用可能性に関する全ての制約が、取消不能に取り除かれるであろう。寄託物は、３０年間、または最後の請求後５年間、または特許の有効期間のうちいずれか長いほうの期間、受託機関に維持され、その期間中は必要に応じて補充されるであろう。
実施例１
本実施例はダイズイベントＭＯＮ８７７５１の形質転換と選択について記載する。植物における外来遺伝子の発現は、クロマチン構築物（例えば、異質染色質）または組込み部位（Ｗｅｉｓｉｎｇ，１９８８）に近い転写制御要素の近接（例えば、エンハンサ）によってか、それらの染色体位置により影響を受けることで知られる。その為、目的の導入遺伝子の最適な発現により特徴付けられるイベントを識別するために、多数のイベントをスクリーニングする必要がしばしばある。例えば、イベントの間の導入遺伝子の発現のレベルにおいて広範な変動が存在し得ることが、植物及び他の生物において観察された。発現の空間的または時間的なパターンにおける差異、例えば、導入遺伝子構築物に存在する転写制御要素から予想されるパターンに対応しないかもしれない、様々な植物組織における導入遺伝子の相対的発現における差異もまた存在し得る。これらの理由のために、１１の異なる発現ベクターをイベントＭＯＮ８７７５１の選択の間に形質転換されたダイズにおいて生成し、試験した。
１１の異なる発現構築物を植物において形質転換し、試験した。個々の発現構築物発現要素の使用の組み合わせにより異なっており、すなわち、エンハンサ（Ｅ）、プロモータ（Ｐ）、リーダー（Ｌ）、イントロン（Ｉ）、クロロプラストターゲッティングペプチド（ＣＴＰ）、及び３’転写終了及びポリアデニル化シグナル（Ｔ）である。また、Ｔ−ＤＮＡセグメントは両方のＣｒｙタンパク質（Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５）をエンコードする２つの発現カセットを含有したか、または単一のＣｒｙタンパク質をエンコードする１つの発現カセットをエンコードする１つの発現カセット、すなわち、Ｃｒｙ２ＡｂまたはＣｒｙ１Ａ．１０５を含有した。Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５発現カセットの両方を含有するＴ−ＤＮＡセグメントを伴う発現構築物では更に、Ｃｒｙタンパク質をエンコードする２つのカセットの相対的な配向が異なっていた。具体的に、２つのＣｒｙタンパク質発現カセットは、各Ｃｒｙタンパクの各プロモータからの発現が同じ方向で進むがそれぞれは別々の各プロモータからであるように、転写の相対的縦方向に並んだ配向で配置されていたか（図２を参照されたい）、または２つのＣｒｙタンパク質発現カセットは、逆の配向のいずれかであったため、２つのＣｒｙタンパク質の各プロモータからの発現が、２つのプロモータ間の中心点から離れるようになる、すなわち、各Ｃｒｙタンパク質発現カセットの転写は、逆方向で進み、かつ、収束しないようになる（図２を参照されたい）。Ｃｒｙ１Ａ．１０５をコードするＤＮＡ配列は、構築物１及び３と比較して、構築物４、６、７、８、及び９中に多様化される配列であった。さらなるバリエーションでは、転写と逆の配向に指向される、２つのＣｒｙ発現カセットを有する構築物の２つにおいて、転写エンハンサは、発散プロモータの間に配置された（図２を参照）。
１１の発現構築物をダイズ分裂組織のアグロバクテリウム媒介形質転換により３回に分けて形質転換した。この方法はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，０３０，５４４に記載されたが、カルスを利用することなく、形質転換植物の生成を可能にする。簡潔に言うと、分裂組織を発芽したＡ３５５５ダイズ種子（Ａｓｇｒｏｗ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の胚から切り出した。構築物１は２つの別々のＴ−ＤＮＡセグメントを含み、各々がアグロバクテリウム境界配列（Ｔ−ＤＮＡセグメント）に挟まれている。形質転換構築物の第１のＴ−ＤＮＡセグメントセグメントはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（スペクチノマイシン及びストレプトマイシン抵抗性を与える；ａａｄＡ−ＳＰＲ）からのＴｎ７アデニルトランスフェラーゼ遺伝子の領域をエンコードし、選択のために使用した第１発現カセット；及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス鎖Ｃ５８（スクロース及びフルクトース及びグルコース−１−リン酸への変換を触媒する；ＳＴＲ＋ＯｒｉＲｉ）からのスクロースホスホリラーゼ遺伝子の領域の領域をエンコードし、スコア化可能マーカーとして使用した第２発現カセットの２つの発現カセットを含んだ。異なる形質転換構築物の第２Ｔ−ＤＮＡセグメントは、１つのＣｒｙ２Ａｂ（構築物２、５、１０または１１）のみをエンコードする発現カセットもしくはＣｒｙ１Ａ．１０５（構築物３または６）のみをエンコードする発現カセットのいずれか；またはＣｒｙ１Ａ．１０５（構築物１、４、７、８、または９）（図２に示される）をエンコードするＣｒｙ２Ａｂ及び１つの発現カセットをエンコードする１つの発現カセットを含む異なる形質転換構築物の第２Ｔ−ＤＮＡセグメントを含んだ。形質転換構築物の各Ｔ−ＤＮＡセグメントは別々のアグロバクテリウム境界配列により制限されるので、選択及びスコア化可能マーカーカセットを含むＴ−ＤＮＡセグメントはＣｒｙ２Ａｂ及び／またはＣｒｙ１Ａ．１０５発現カセットをエンコードするＴ−ＤＮＡセグメントの組込み部位と異なる部位のダイズ細胞ゲノムに組み込まれ得る。したがって、イベントを分離及び選択の損失及びスコア化可能マーカー配列についてスクリーニングすることができる。全てのイベントをバックボーンの不在及び選択／スコア化可能マーカーカセット配列の不在について選択した。形質転換構築物を運ぶアグロバクテリウムで共培養した後、分裂組織スペクチノマイシン、カルベニシリン２ナトリウム塩、セフォタキシムナトリウム塩、及びチカルシリン２ナトリウム塩／クラブラン酸カリウム混合物を含有する選択培地に置き、非形質転換植物細胞及び過剰なアグロバクテリウムの増殖を阻害した。次いで分裂組織を、発達を放ち定着させるのを促す媒体に置いた。正常表現型特性を伴う根付き植物（Ｒ０）を選択し、成長及びさらなる評価のために土壌に移動した。
イベントＭＯＮ８７７５１を生成するために使用される発現構築物１は、植物発現要素の５‘から３’相対順序において２つの異なるＣｒｙタンパク質をエンコードするＴ−ＤＮＡセグメントを含有した（介在配列を有するまたは有さない）：プロモータ、リーダー及びシロイヌナズナアクチン２遺伝子（Ｐ−Ａｔ．Ａｃｔ２）由来の第１イントロン、植物発現のために修飾されたヌクレオチド（ＣＴＰ２−Ｃｒｙ２Ａｂ）を伴うＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）からのＣｒｙ２Ａｂをエンコードする遺伝子（虫害抵抗性を付与するタンパク質をコードする）への構造の中で融合されたシロイヌナズナ５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素 （ＥＰＳＰＳ）遺伝子由来の配列をコードするＮ−末端葉緑体トランジットペプチドから成るキメラコード配列、イネメタロチオネイン−様タンパク質遺伝子（Ｔ．ＯｓＭｔｈ）由来の３’転写終了及びポリアデニル化要素（３’ＵＴＲ）、第１Ｃｒｙタンパク質発現カセット及び第２Ｃｒｙタンパク質発現カセットの間の介在配列；シロイヌナズナリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット１Ａ遺伝子（Ｐ−Ａｔ．ＲｂｃＳ４）由来のプロモータ−リーダー、このプロモータ−リーダーはトランジットペプチド切断部位の反復をエンコードするコード配列及びＣｒｙ１Ａ．１０５をエンコードする遺伝子（虫害抵抗性を付与するタンパク質をコードする）を有する構造中で融合される成熟タンパク質からの３アミノ酸も含むシロイヌナズナリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット１Ａタンパク質遺伝子（ＣＴＰ１）由来の配列をコードする葉緑体トランジットペプチドから成るキメラコード配列に結合し、植物発現について修飾したヌクレオチドを伴うＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ （Ｂｔ）からのＣｒｙ１Ａｂ１（ドメインＩ＆ＩＩ）、Ｃｒｙ１Ｆａ１（ドメインＩＩＩ）、及びＣｒｙ１Ａｃ１（プロトキシンドメイン）をエンコードする遺伝子のセグメントから成り、タルウマゴヤシリン酸輸送体１遺伝子由来の３’ＵＴＲ（Ｔ−Ｍｔ．Ｐｔ１）である。構築物１発現カセットにおいて、２つの別々のＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５発現カセットを含有するＴ−ＤＮＡカセットは、Ｃｒｙ２Ａｂカセットへの５’である任意に表された５’末端上のアグロバクテリウムライトボーダー；Ｃｒｙ１Ａ．１０５カセットへの３’である任意に表された３’末端上のアグロバクテリウムレフトボーダーを有する。Ｃｒｙ２Ａｂカセット（ターミネータを経たプロモータ）は配列番号：９中の位置１２３〜３７８５に位置し、Ｃｒｙ１Ａ．１０５カセット（ターミネータを経たプロモータ）は配列番号：９中の位置３８３１〜９７５４に位置する。
構築物２（Ｃｒｙ２Ａｂ）及び構築物３（Ｃｒｙ１Ａ．１０５）についてのＴ−ＤＮＡ カセットは構築物１で使用された遺伝子をエンコードする、それぞれのＣｒｙタンパク質について同じ要素を有するカセットをエンコードする単一Ｃｒｙタンパク質を含む、図２を参照されたい。
構築物４、５及び６はそれぞれ、構成する要素の向きにおいて構築物１、２、及び３と同一であったが、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５カセットの両方について、プロモータ−リーダー−イントロン及び葉緑体トランジットペプチドは異なった。対応するＣｒｙタンパク質カセット（Ｔ−Ｏｓ．Ｍｔｈを伴うＣｒｙ２Ａｂ、またはＴ−Ｍｔ．Ｐｔ１を伴うＣｒｙ１Ａ．１０５）についてのターミネータは発現構築物１から１１の全てにおいて同一であった（図２を参照されたい）。
プロモータリーダー−イントロン及び葉緑体トランジットペプチド、配列をエンコードするＣｒｙタンパク質及び構築物７〜１１のそれぞれにおけるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５カセットの両方に用いたターミネータは、構築物４、５、及び６において用いられたそれらと同一であった。しかしながら、構築物７、８、及び９について、Ｃｒｙ２Ａｂカセット及びＣｒｙ１Ａ．１０５カセットの向きを反転または互いに対して逆転させ、転写の向きは各々それぞれのプロモータから反対方向であった、図２を参照されたい。構築物７、８、及び９は２つのカセットの間のエンハンサの不在（構築物７）、またはエンハンサの存在において異なった；エンハンサ１（Ｅ１）を有する構築物８、またはエンハンサ２（Ｅ２）を有する構築物９、図２を参照されたい。構築物１０及び構築物１１はＥ１（構築物１０）またはＥ２（構築物１１）のいずれかを有する単一Ｃｒｙ２Ａｂカセットであった。
形質転換及び土壌への（Ｒ０）イベントへの転写に続き、大規模な分子、農学的、及び表現型解析をさらなる試験についてイベントを選択するために行った。加えて、イベントは自家受粉であり、選択したイベントから得られた種をフィールド及び分子検査のために使用した。
分子検査には以下が含まれる：コピー数を決定するためのアッセイ、両方の発現カセット（構築物１、４、７、８、及び９）を含むＣｒｙタンパク質の完全性、Ｃｒｙタンパク質の存在をエンコードするＴ−ＤＮＡカセット（単一Ｃｒｙタンパク質発現カセット（構築物２、３、６、１０、または１１）または２つのＣｒｙタンパク質発現カセット（構築物１、４、７、８、または９））の存在を決定するためのアッセイ；ＥＬＩＳＡにより測定されるタンパク質発現を決定するためのアッセイ、及びＴ−ＤＮＡ発現カセットの分離比（１：２：１または１：３）を決定するためのアッセイ。農学的アッセイは（構築物１、２、及び３から生成されるＲ０イベントのための、２つの害虫種（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ （ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ， ＶＢＣ）及びＣｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ， ＳＢＬ）についてのリーフディスクバイオアッセイによる昆虫有効性）を含む。Ｒ０植物は成熟に成長し、イベントは自家受粉であり、各イベントについてセットした種を決定した。
１１の個々の構築物を伴う形質転換により生成され、有効な土壌に移動され、４２０イベントから５０００イベントを超える範囲であった、Ｒ０イベントの数（表１を参照されたい）。イベントＭＯＮ８７７５１が生成された構築物１を伴う形質転換について、土壌に根ざす合計１１０２のＲ０植物があり、これらから、２８１のイベントのみが最初の分子解析を通過した。構築物１を伴う転換により生成されたこれらの２８１のイベントの追加の分子、農学的、及び表現型解析は、追加の温室解析のために評価された２９のＲ１イベントのみに帰着した。
表１．土壌に移動されたイベント数を示す１１の形質転換構築物から生成されるＲ０イベント及びコピー数アッセイを通過したイベント数．
Figure 0006635916
構築物１を伴う形質転換から生成され、さらなる解析のために評価される２９のＲ１イベントについて、Ｒ１種子を、以下のアッセイを伴うＲ１イベントの解析のために温室に植えた：（ａ）Ｒ１発芽（１００％発芽）；（ｂ）ホモ接合植物の同定；（ｃ）ホモ接合植物がもはや選択／スコア化可能マーカー配列を含有しないことを確認するＰＣＲ解析（それは独立して分離した）；（ｄ）Ｃ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ＳＢＬ）についてのリーフディスクバイオアッセイにより決定されるような昆虫有効性；及び（ｅ）Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ、ＦＡＷ）についてのリーフディスクバイオアッセイにより決定されるような昆虫有効性、（ｆ）、４ｐｐｍを超えるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質レベルを伴うイベントを前進させる、Ｖ７ステージ葉組織におけるＥＬＩＳＡ解析によるタンパク質発現。分子解析及び昆虫リーフディスクバイオアッセイの結果に加え、４つの選択／イベントからセットされた農学的表現型の観察及びシードを収集した。これらのデータの合計に基づき、構築物１を伴う形質転換により生成された２１のＲ１イベントからのＲ２種子を農学野外試験及び有効性スクリーンハウス試験において評価した。
実施例２
農学野外試験を対照、Ａ３５５５（親の背景）と比較されたＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を発現するダイズイベントの表現型特性及び収率を評価するようにデザインした。これらの農学野外試験において、対照及びイベントはダイズ品種Ａ３５５５のものであり、相対的な成熟群３（ＲＭ３）を伴った。試験を四季及び２つの地理的位置で、完全乱塊法（ＲＣＢＤ）下で植えた。第１の地理的位置において、農学野外試験を各季節において２５の現場で行い、第２の地理的位置において農学野外試験を各季節において１４の現場で行った。標準的な農業的慣行は、全ての試験のための植栽やデータ収集に続いた。収集されたデータは出現の評価、苗の活力、開花日、花の色の観察、表現型の観察、軟毛の色、成熟、倒伏、植物の高さ、粉砕スコア、収穫日、種子重量／プロット、種子水分／プロット、及びエーカーあたりのブッシェル（ｂｕ／ａｃ）で得られる収率を含む。
データ解析について、いくつかの位置は収穫前の品質問題（すなわち、溜り水、不適切な土壌水分、貧弱な出現、降雹による季節の後半のポッド粉砕）のために削除され、またはいくつかの位置は１５％を超える変動係数（ＣＶ）及び／または高い位置品質指標（ＬＱＩ）のために削除された。
試験した全ての位置にわたり、取られた表現型手段は、イベントについての農学的格付けは対照、Ａ３５５５の正常な範囲内であったことを示した。全ての観測が全ての位置で取られたわけではなく、いくつかのデータは、例えば出現のために収集された可能性があるが、早期表現型データの収集後に起こった問題のために位置が削除されたので、収率は決定されなかった。
農学野外試験について、構築物１、２、３、４、５、または６により生成され、各野外試験で試験されたイベントの数及び試験されたダイズイベント（つまり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７）の生成を表２に示す。
表２．農学野外試験の２つの季節及び２つの地理的位置の間の構築物について試験したイベント数（及びダイズイベント生成）（ｎ．ｔ．は試験しなかったことを意味する）。
Figure 0006635916
各季節、各地理的位置、及び平均収率（ｂｕ／エーカー）を試験する各野外試験にわたり試験したイベントについての農学野外試験のメタアナリシス試験は、対照Ａ３５５５（表２）と比較したイベントＭＯＮ８７７５１についての収率において統計的に有意な増加があったことを示した。Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現するイベントには対照Ａ３５５５と比較した収率において、有意な差はなかった、表３を参照されたい。Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現するイベントには対照Ａ３５５５と比較した収率において、有意な減少があった、表３を参照されたい。
表３．非トランスジェニックダイズ系統Ａ３５５５と比較した場合の、各季節、各地理的位置、及び収率を試験する各野外試験にわたり試験したイベントについての農学野外試験のメタアナリシス。
Figure 0006635916
実施例３
２つの発現カセット（すなわち、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の両方）を伴う単一構築物からのＴ−ＤＮＡセグメントの挿入からの両方のＣｒｙタンパク質またはスクリーンハウスエンクロージャに含有される鱗翅目害虫個体群の人工感染に対する単一Ｃｒｙタンパク質（すなわち、Ｃｒｙ２Ａｂのみ、またはＣｒｙ１Ａ．１０５のみ）を発現する実験的ダイズイベントの有効性を評価するために、有効性スクリーンハウス試験を行った。単一遺伝子と二重遺伝子イベントとの比較を、二重遺伝子発現構築物イベントにおいて観察される有効性に対する各単一Ｃｒｙタンパク質の相対的寄与を決定するために用いた。スクリーンハウス試験を２つの地理的位置において複数の季節に行った。第１の地理的位置において、５つの対象害虫種を試験した：Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ， ＶＢＣ），Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ， ＳＢＬ），Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｒｍｙｗｏｒｍ， ＳＡＷ），Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ，ＦＡＷ）、及びＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｄｗｏｒｍ， ＳＰＷ）。第２の地理的位置において、３つの対象害虫種を試験した：Ｃｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ ａｐｏｒｅｍａ（ｂｅａｎ ｓｈｏｏｔ ｍｏｔｈ， ＢＳＭ），Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｌｏｏｐｅｒ， ＳＦＬ）、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ， ＦＡＷ）。
これらのスクリーンハウス試験において試験したイベント（すなわち、エントリー）は、別々の形質転換構築物の各々を伴う形質転換から生成された。構築物１、２、または３から生成される形質転換イベントをスクリーンハウス試験においてＲ２世代において評価し、両方のタンパク質（構築物１を用いた形質転換から生成されたイベント）を発現する２０のイベント、Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する６のイベント（構築物２を用いた形質転換から生成されたイベント）、及びＣｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する６のイベント（構築物３を用いた形質転換から生成されたイベント）を含んでいた。これらのうち、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５（構築物１）の両方を伴う１２のイベント、Ｃｒｙ２Ａｂのみ（構築物２）を伴う２のイベント、及びＣｒｙ１Ａ．１０５のみ（構築物３）を伴う３のイベントをスクリーンハウス試験でＲ３世代において評価した。Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５（構築物１）の両方を伴う１１のイベントをさらにＲ４世代スクリーンハウス試験で評価した。Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５（構築物１）の両方を伴う３つのイベント、Ｃｒｙ２Ａｂのみ（構築物２）を伴う１つのイベント、及びＣｒｙ１Ａ．１０５のみ（構築物３）を伴う１つのイベントをＲ５、Ｒ６、及びＲ７スクリーンハウス試験で評価した。Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５（構築物４を用いた形質転換から生成されたイベント）を発現する１０のイベント、Ｃｒｙ２Ａｂ−のみの３つのイベント（構築物５を用いた形質転換から生成されたイベント）、及びＣｒｙ１Ａ．１０５のみの３つのイベント（構築物６を用いた形質転換から生成されたイベント）をスクリーンハウス試験へのＲ３世代において評価した。Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の両方を伴う２つのイベント、Ｃｒｙ２Ａｂのみの１つのイベント、及びＣｒｙ１Ａ．１０５のみの１つのイベントをＲ４スクリーンハウス試験で評価し、１イベント毎をＲ５スクリーンハウス試験で評価した。エンハンサを伴う反対の５’から３’の向きにおけるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の両方を発現する３つのイベント（構築物８を用いた形質転換から生成されたイベント）、エンハンサを伴わない反対の５’から３’の向きにおけるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の両方を発現する３つのスタック化イベント（構築物７を用いた形質転換から生成されたイベント）、及び２つのＣｒｙ２Ａｂのみのイベント（構築物１０を用いた形質転換から生成されたイベント）をＲ２世代において評価し、スクリーンハウス試験で評価した。ポジティブトランスジェニックダイズ対照はＭＯＮ８７７０１またはイベントＧＭ＿Ａ１９４７８（ＭＯＮ８７７０１と同時に生成）、及び両方を発現するＣｒｙ１Ａｃを含む。非トランスジェニックダイズ系統Ａ３５５５（イベントについての親の背景、相対的に成熟な３（ＲＭ３））及びＡ５５４７（ＭＯＮ８７７０１及びＧＭ＿Ａ１９４７８についての親の背景、ＲＭ５）は、ネガティブ対照として全てのスクリーンハウス及び野外試験に含まれた。非トランスジェニックダイズ系統ＡＧ３７０５はいくつかの試験において、白い花のチェックとして含まれていた。
露地有効性試験を設定し実施した後、スクリーンハウス試験を実施した。プロットをネガティブチェックへの最大の損傷時の寄生後に１度評価した（通常、蛹後３〜４週間はスクリーンハウス内に置いた）。各評価で、以下の農学的観察を記録した：植物の成長の日付及びステージ。加えて、昆虫を落葉させるために、各プロットにおける落葉推定％を記録した。Ｃ．ａｐｏｒｅｍａについて、１０の植物を無作為に各プロットに選択し、損傷のある植物の数を記録した。場合によっては生きた幼虫の数も記録した。
落葉データを、ＡＮＯＶＡに付し、系統及び複製間の、各位置の各昆虫に関する、０．０５の確立水準（Ｐ）での変動の有意な源を決定した。テューキー−クレーマー試験（クレーマー１９５６）をＰ＝０．０５で用い、平均間の有意差を決定した。
寄生のためのＲ．ｎｕ及びＣ．ａｐｏｒｅｍａを使用し、１つの季節の間に、３つのスモールプロットスクリーンハウス試験を第２の地理的位置において行った。試験デザインはイベントまたは対照につき、３つの複製を伴う完全乱塊法（ＲＣＢＤ）テストブロックを含み、表４に示す試験したイベントを伴った。ダイズの成長の中期栄養段階、及び再びダイズの成長の初期の生殖段階の間に、１つの試験をＣ．ａｐｏｒｅｍａに寄生させた。ダイズの成長中期栄養段階の間に、２つの試験をＲ．ｎｕに寄生させた。
Ｃ．ａｐｏｒｅｍａ試験については、非常に重い圧力が達成された。複製は損傷の重要な原因ではなかったが（Ｆ＝０．８７９４；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．４１９６）、イベントはきわめて有意であった（Ｆ＝１１．９３９８；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１）。損傷を受けた植物の最大パーセント（表４）をネガティブチェックでの８３〜１００％に平均したが、Ｃｒｙ１Ａｃポジティブ対照においては存在しなかった。形質転換構築物１から生成され、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を発現するイベントは０〜１３％を示した一方で、Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現したイベント及びＣｒｙ１Ａ．１０５のみを発現したイベントは、それぞれ１０〜１７％及び１０〜１３％を示した。重要ではあるが少数であるこの試験において損傷を受けたと記録された植物は、損傷の評価を記録する際に個人によって使用される基準に起因する可能性がある。
Ｃ．ａｐｏｒｅｍａ試験については、重い圧力が１つのスクリーンハウス試験で達成された。複製は落葉の変動の重要な原因ではなかったが（Ｆ＝０．２０３；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．８１６７）、イベントはきわめて有意であった（Ｆ＝２０．２４６１；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１）。ネガティブチェックにおいて最大落葉（表４）は平均して６０〜６３％であったが、Ｃｒｙ１Ａｃポジティブ対照及びＣｒｙ２Ａｂ＋Ｃｒｙ１Ａ．１０５を発現する形質転換構築物１から生成されるイベントまたはＣｒｙ２Ａｂのみを発現する形質転換構築物２から生成されるイベントにおいては存在しなかった。Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する形質転換構築物３から生成されるイベントはわずかに高い落葉（４〜１０％）を示した。Ｒ．ｎｕを評価する第２のスクリーンハウス試験において、適度な重圧を達成した。落葉において、いずれかの試験において複製は変動の重要な原因ではなかったが（Ｆ＝０．２５４２；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．７７６３）、イベントはきわめて有意であった（Ｆ＝１６．１７９３； ｄｆ＝２３，４８； Ｐ ＜ ０．０００１）。最大落葉（表４）は平均して３８〜４０％であったが、Ｃｒｙ１Ａｃポジティブ対照においてはごくわずか（４％）であり、構築物１で生成されＣｒｙ２Ａｂ＋Ｃｒｙ１Ａ．１０５を発現するイベントまたは構築物２で生成されＣｒｙ２Ａｂのみを発現するイベントにおいては存在しなかった。構築物３で生成され、Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現するイベントはわずかに高い落葉（２〜７％）を示した。
これらのスクリーンハウス試験において、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１は、害虫、Ｃ．ａｐｏｒｅｍａまたはＲ．ｎｕの寄生による損傷を示さず、それは同じ試験における対照の損傷及び／または落葉と比較して有意であった（表４）。
表４．構築物１、２、または３を使用して生成し、人工的に寄生させたスクリーンハウスにおいて評価したイベントへのＣ．ａｐｏｒｅｍａによる損傷及びＲ．ｎｕ幼虫による落葉。
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第２の地理的位置において行ったスモールプロットスクリーンハウス試験の次の季節において、Ｒ．ｎｕ、Ｃ．ａｐｏｒｅｍａ及びＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの地元の研究室集団を寄生に使用した。上記のように試験を実施するためのプロトコルは本質的であり、表５に示す試験したイベント及び対照を伴った。
Ｃ．ａｐｏｒｅｍａを寄生させた試験について、重圧を達成した。複製は、損傷の変動の重要な原因ではなかったが（Ｆ＝０．２７４２；ｄｆ＝２，３３；Ｐ＝０．７６１９）、イベントはきわめて有意であった（Ｆ＝８．２３１３；ｄＦ＝１１，２４；Ｐ＜０．０００１）。最大損傷はネガティブチェックにおける植物あたり平均して４．２〜５．５損傷点であり、８０〜１００％の植物が損傷を示したが、ポジティブ対照及び全ての試験イベントにおいてごくわずかであった（表５）。
Ｒ．ｎｕに寄生させた試験について、適度な重圧を達成した。複製は、損傷の変動の重要な原因ではなかったが（Ｆ＝０．０４１；ｄｆ＝２，３３；Ｐ＝０．９５９９）、イベントはきわめて有意であった（Ｆ＝１４３．５５２６；ｄＦ＝１１，２４；Ｐ＜０．０００１）。最大損傷はネガティブチェックにおいて平均して３３．３〜４０．０％であった（経済的許容限界より更に高い）が、ポジティブ対照及びＴＩＣ１０５のみを発現する構築物６（表５）を伴う形質転換により生成されるイベントを除く全ての試験イベントにおいて存在しなかった、またはごくわずかであった。
Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに寄生させた試験について、軽圧を達成した。複製は、損傷の変動の重要な原因ではなかったが（Ｆ＝０．１１８７；ｄｆ＝２，３３；Ｐ＝０．８８８４）、イベントはきわめて有意であった（Ｆ＝１２．８６０２；ｄＦ＝１１，２４；Ｐ＜０．０００１）。最大損傷はネガティブチェックにおいて、平均して７．５〜１５．０％の落葉であった−経済的許容限界に丁度到達した。構築物２または構築物５を伴う転換により生成されたＣｒｙ２Ａｂのみを発現するイベントにおいて、一部の損傷もまた言及されたが、ポジティブ対照及び全ての他の試験イベントにおいて存在しなかったまたはごくわずかであった（表５）。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１は、害虫、Ｃ．ａｐｏｒｅｍａ、Ｒ．ｎｕ、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの寄生による損傷を示さず、それは同じ試験におけるネガティブ対照の損傷と比較して有意であった（表５）。Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する構築物６を伴う形質転換により生成されたトランスジェニックダイズイベントと比較した場合に、構築物６を伴う形質転換により生成されたイベントにおいてＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質の低い発現があったことが言及されるが、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１はＲ．ｎｕから有意に少ない損傷を有していた（表５）。これらの結果はまた、害虫Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの対照の拡大したスペクトルを初めて示す。
表５．構築物１、２、３、４、５、または６で生成され、ポジティブ及びネガティブ対照と比較されるイベントを評価する人工的に寄生させたスクリーンハウスにおけるＣ．ａｐｏｒｅｍａによる最大損傷、及びＲ．ｎｕ及びＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫による平均落葉の％
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Ｈ．ｚｅａの研究室の寄生を用い、第１の地理的位置において１つのスモールプロットスクリーンハウス試験を行った。試験デザインはイベントにつき、３つの複製を伴う完全乱塊法（ＲＣＢＤ）テストブロックを含み、表６に示す試験したイベント及び対照を伴った。Ｈ．ｚｅａの２つの寄生があり、寄生の１９〜２７日後（ダイズの成長のＲ２〜Ｒ３段階）に初めの寄生について、及び寄生の２５〜２８日後（ダイズの成長のＲ５段階）に第２の寄生について、落葉を評価した。Ｈ．ｚｅａを試験するスクリーンハウス試験からの結果は以下の通りであった：適度な重圧を達成した。落葉において、複製は変動の重要な原因ではなかったが（Ｆ＝０．３２６；ｄｆ＝２，１０５；Ｐ＝０．７２２５）、イベントはきわめて有意であった（Ｆ＝１３．８８６４；ｄｆ＝３５，７２；Ｐ＜０．０００１）。ネガティブチェックにおいて、最大落葉（表６）は平均して３２〜３３％であったが、Ｃｒｙ１Ａｃポジティブ対照（１％）及び構築物１で生成され、Ｃｒｙ２Ａｂ＋Ｃｒｙ１Ａ．１０５（２〜４％）を発現するイベントにおいてごくわずかであった。Ｃｒｙ２Ａｂ＋Ｃｒｙ１Ａ．１０５（５〜１２％）を発現する構築物４で生成されるイベント、Ｃｒｙ２Ａｂ（１３〜１７％）のみを発現する構築物５で生成されるイベントまたはＣｒｙ１Ａ．１０５（８〜１２％）を発現する構築物６で生成するイベントにおいて、やや高い落葉が観察された。
ダイズイベントＭＯＮ８７７５１はこの試験において、同じ試験におけるネガティブ対象への損傷と比較した場合に、Ｈ．ｚｅａによる有意に少ない損傷を示した。Ｈ．ｚｅａによる対照のこのレベルは、このダイズ害虫種の許容可能な商業的水準の範囲内である。加えて、このスクリーンハウス試験において、Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する構築物５で生成されるトランスジェニックダイズイベントと比較した場合に（表６）、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１は有意に少ない損傷を有し、拡大した対照のレベルを示した。しかしながら、Ｃｒｙ２Ａｂの発現は構築物２で生成されるイベントにおいてよりも構築物５で生成されるイベントにおいての方が低く、Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する構築物５で生成されるイベントの有意な落葉は構築物５で生成されるＣｒｙ２Ａｂによる、Ｈ．ｚｅａに対する減少した有効性が有り得ることを示しうる。
表６．ポジティブ及びネガティブ対照と比較した場合の、人工的に寄生させたスクリーンハウス試験においてＨ．ｚｅａ幼虫により構築物１、４、５、または６で生成されたイベントへの最大季節落葉。
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第１の地理的位置において行ったスモールプロットスクリーンハウス試験のもう一方の季節において、害虫Ｓ．ｅｒｉｄａｎｉａ（第一齢または第三齢）、Ａ．ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（第一齢）、及びＣ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（第一齢）の研究室集団からの寄生に対する抵抗性を試験した。これらの試験からの結果は以下の通りであった：極圧を第一齢Ｓ．ｅｒｉｄａｎｉａで達成し、適度な圧力をＡ．ｇｅｍｍａｔａｌｉｓで達成した。Ａ．ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（第一齢）及びＳ．ｅｒｉｄａｎｉａ （第一齢）幼虫による最大パーセント落葉（平均±Ｓ．Ｅ．）を表７に報告する。
表７．構築物１、２、３、４、５、６、７、８、及び１０で生成され、ポジティブ及びネガティブ対照で比較されるイベントを評価する人工的に寄生させたスクリーンハウスにおける、Ａ．ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（第一齢）及びＳ．ｅｒｉｄａｎｉａ（第一齢）幼虫による最大パーセント落葉
Figure 0006635916
Ｃ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（第一齢）及びＳ．ｅｒｉｄａｎｉａ（第三齢）を試験する試験については、極圧は両方の害虫について達成された。これらの人工的に寄生されたスクリーンハウスにおけるＣ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（第一齢）幼虫及びＳ．ｅｒｉｄａｎｉａ（第三齢）幼虫による最大パーセント落葉（平均±Ｓ．Ｅ．）を表８に報告する。
表８．構築物１、２、３、４、５、６、７、８、及び１０で生成され、ポジティブ及びネガティブ対照と比較されるイベントを評価する、人工的に寄生させたスクリーンハウスにおけるＣ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（第一齢）及びＳ．ｅｒｉｄａｎｉａ（第三齢）幼虫による最大パーセント落葉
Figure 0006635916
これらのスクリーンハウス試験についての結果は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１が、同じ試験（表７及び表８）におけるネガティブ対照への損傷と比較した場合、Ｓ． ｅｒｉｄａｎｉａ （第一齢または第三齢）、Ａ． ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ （第一齢）、またはＣ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ （第一齢）による有意に少ない損傷を示すことを示した。加えて、これらのスクリーンハウス試験において、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１は、Ｃｒｙ１Ａｃ を発現するトランスジェニックダイズイベント（表７及び表８）と比較した場合に、Ｓ． ｅｒｉｄａｎｉａ（第一齢及び第三齢）による有意に少ない損傷を有し、鱗翅目害虫防除のために現在使用可能なトランスジェニックダイズイベントへのイベントＭＯＮ８７７５１の拡大された性能を実証した。さらに、これらのスクリーンハウス試験において、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１は、［１］構築物４、５、または６（第三齢）で生成されるイベント、またはＣｒｙ１Ａ．１０５イベント（第一齢）のみを発現する構築物６で生成されるイベント、またはＣｒｙ１Ａ．１０５イベント（第一齢及び第三齢）のみを発現する構築物３で生成されるイベントのいずれかと比較した場合、及び［２］エンハンサなしでＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を発現する構築物７で生成されるイベントと比較した場合、Ｓ． ｅｒｉｄａｎｉａ幼虫による有意に少ないダメージを有し、構築物４、５、６、または７で生成されるイベント（表７及び表８）へのイベントＭＯＮ８７７５１の優れた性能を実証した。
実施例４
露地有効性試験を、実験的ダイズイベントＭＯＮ８７７５１、並びに異なる形質転換構築物１、２、３、４、５、及び６を使用して作製されたイベントの、鱗翅目害虫集団の自然界での寄生に対する有効性を評価するために実施した。構築物２、若しくは５で生成されたイベント（Ｃｒｙ２Ａｂのみの発現）、及び構築物３、若しくは６（Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみの発現）で生成されたイベントと、構築物１、若しくは４（Ｃｒｙ１Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の両方の発現）で生成されたイベントの比較を、各単一のＣｒｙタンパク質（すなわち、Ｃｒｙ２Ａｂのみ、若しくはＣｒｙ１Ａ．１０５のみ）の、単一の構築物からの両方のＣｒｙタンパク質（すなわち、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５）を発現するイベントにおいて観察される有効性に対する相対的寄与を決定するために使用した。地域性ダイズ害虫の自然集団の有効性野外試験を、複数の季節に亘って、複数の野外試験施設で、３つの地理的位置で実施した。
１つの地理的位置で実施した最初の有効性野外試験において、評価されたイベント（すなわち、エントリー）は、構築物１により生成されて、両方のＣｒｙタンパク質、Ｃｒｙ２Ａｂ、及びＣｒｙ１Ａ．１０５を発現する（かつ、イベントＭＯＮ８７７５１を含む）１２のイベント、構築物２より生成されて、Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する２つのイベント、並びに構築物３により生成されて、Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する３つのイベントを含んだ。第２の地理的位置で実施した最初の有効性野外試験において、構築物１、２、及び３により生成されたイベントが評価され、前記イベントは、（構築物１を用いた形質転換から生成され、イベントＭＯＮ８７７５１を含む）両方のＣｒｙタンパク質、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を発現する１１のイベント、Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する２つのイベント（構築物２を用いた形質転換から生成されたイベント）、並びにＣｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する３つのイベント（構築物３を用いた形質転換から生成されたイベント）を含んだ。３つの地理的位置で実施した有効性野外試験の第２の季節において、評価されたイベント（すなわち、エントリー）は、両方のＣｒｙタンパク質、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を発現する３つのイベント（構築物１を用いた形質転換から生成され、イベントＭＯＮ８７７５１を含むイベント）、Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する１つのイベント（構築物２を用いた形質転換から生成されたイベント）、並びにＣｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する１つのイベント（構築物３を用いた形質転換から生成されたイベント）を含んだ。露地有効性試験で評価したイベントは、Ｒ３からＲ７までの世代を含んだ。
各有効性野外試験施設に関して、テストブロックを植え、標的の鱗翅目の昆虫の在来害虫集団による自然寄生が起こるようにした。テストブロックには、標的の害虫（鱗翅目）に対する殺虫剤を用いた処置を施さずにおいた。しかしながら、テストブロックは、非標的害虫による重大な被害を防ぐために、噴霧を受けた場合がある。全ての実験的イベントは、ダイズの生殖質の背景Ａ３５５５における、相対的に成熟なグループ３（ＲＭ３）についてのものであった。試験でのその他のエントリーは、（Ｃｒｙ１Ａｃを発現する）ポジティブ対照ＭＯＮ８７７０１、若しくはＧＭ＿Ａ１９４５９（ＲＭ５）；ネガティブ親チェックＡ３５５５（紫花、ＲＭ３）；及びネガティブ市販チェックＡ５５４７（白花、ＭＧ５）、若しくはＣＭＡ５８０５（白花、ＲＭ５）を含んだ。
露地有効性試験を設定し実施した後、標準的処置を実施した。鱗翅目害虫の幼虫発生率、落葉、及び植物成長ステージを、標的鱗翅目の活動の開始から始め、標的鱗翅目の活動が停止したとき、または植物が成長のＲ７ステージに到達したときに終了させて、定期的（すなわち、５〜１４日おき）に記録した。害虫発生率データを、収量データ用に収穫された、作条２及び３における植物被害を回避するために、作条１及び４のみから収集した。害虫発生率データのモニタリング及び記録は、以下のように実施した：食葉鱗翅目（すなわち、Ａ． ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｃ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｒ． ｎｕ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）を、ドロップクロス、若しくは垂直ビーティングシート（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｂｅａｔｉｎｇ ｓｈｅｅｔ）を使用して、プロット当り少なくとも２つのドロップクロス、若しくは４つの垂直ビーティングシートのサンプリングをしてモニタリングした。遭遇した各標的種に関して幼虫の総数、及び各プロット内のサンプリング数を、ｍ作条当りの幼虫の平均数（幼虫の総数÷サンプリング数÷クロス／シートの長さ（ｍ））として記録した。次のサンプリングは、各プロットの同じ領域で繰り返されるサンプリングを回避するような方法で実施した。１つの地理的位置で実施した有効性野外試験において、データを、２つの試験施設で、日和見的に、Ｈ．ｚｅａによる被害に関して、２０若しくは３３植物／位置をランダムに選択することによっても記録し、幼虫の食害を伴う数を記録した。第２の地理的位置で、１つの試験を、日和見的に、Ｈ． ｚｅａに関して、プロット当り１０植物をランダムに選択することにより評価し、鞘の総数、及び植物当りの被害を受けた鞘の数を記録した。
モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）による寄生に関するデータを、幼虫の摂食に起因する被害（しおれ、瀕死、枯死）を伴っている各プロットにおける植物の総数を数えることにより記録した。この昆虫に関する被害データを、最大被害を記録した単一時点で採った。
標的害虫に加えて、非標的害虫、特に、経済的許容限界を超える潜在性を有する害虫（例えば、カメムシ）を、捕虫網、改良された捕虫網、若しくはグラウンドクロスにより、テストブロック中のランダムに選択された位置で、定期的にモニタリングし、経済的被害許容水準に到達したのか、または近づいていたのかを決定するために評価した。
最終試験で、各プロットの作条２及び３の全長を収穫し、各プロットに関して、全重量及び水分の％を記録した。収穫の間、収穫された作条における著しいギャップ（互いに接触しない植物）に注目し、これらのギャップの全長を記録した。収量を、種子重量を１３％の水分に補正した後に計算した。幼虫発生率、落葉、及び収量データを、ＡＮＯＶＡに付し、系統及び複製間の、各位置に関する、０．０５の確立水準（Ｐ）での変動の有意な源を決定した。平均間の有意差を、テューキー−クレーマー検定（Ｋｒａｍｅｒ １９５６）を使用してＰ＝０．０５で決定した。
野外試験施設１で実施した露地試験において、食葉イモムシは、最初に、成長のＲ３ステージで遭遇され、成長のＲ６ステージまでに中等度の被害レベルにまで増殖した。遭遇した種は、Ａ． ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（９８％）、Ｒ． ｎｕ（２％）、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．（１％）を含んだ。複製は、幼虫発生（Ｆ＝０．０４３５；ｄｆ＝２，５７；Ｐ＝０．９５７５）、落葉（Ｆ＝０．０８０７；ｄｆ＝２，５７；Ｐ＝０．９２２６）、または収量（Ｆ＝０．０２１３；ｄｆ＝２，５７；Ｐ＝０．９７９）における変動の有意な源ではなかったが、イベントは、３つ全てに関して非常に有意であった（幼虫発生：Ｆ＝６９．６９５６；ｄｆ＝１９，３８；Ｐ＜０．０００１；落葉：Ｆ＝２５．９９１８；ｄｆ＝１９，４０；Ｐ＜０．０００１；収量：Ｆ＝３．３５７；ｄｆ＝１９，３８；Ｐ＝０．０００７）。累積幼虫発生率（表９）は、ネガティブ対照において、ｍ作条当り１３９〜１８９幼虫に達し、一方で、トランスジェニックエントリーのいずれにおいても、実質的に全く幼虫は遭遇されなかった。最大落葉（表９）は、ネガティブチェックにおいて、平均２１〜２７％であり、全てのトランスジェニックエントリーにおいて存在しなかった。収量（表９）は、全てのトランスジェニックエントリーに比べて、両方のネガティブチェックにおいて減少したが、収量における変動は、これらの減少の有意性を減少させた。
イベントＭＯＮ８７７５１は、非トランスジェニック対照と比べた場合、食葉鱗翅目の幼虫の有意に低い発生率（季節累積）、及び落葉の有意に低いパーセント（季節最大）を有した。
表９．野外試験施設１で実施され、自然に来襲させた露地有効性試験における、構築物１、２、または３で生成されたイベントの食葉鱗翅目の幼虫発生率（季節累積）、及び落葉（季節最大）
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野外試験施設２で実施された別の露地試験で、食葉イモムシは、最初に、成長の後期増殖ステージで遭遇され、成長のＲ３ステージまでに、高い被害レベルにまで増殖した。遭遇した種は、Ａ． ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（５３％）、「シャクトリムシ」（おそらく、Ｃ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓであるが、Ｒ． ｎｕの可能性もある）（４４％）、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．（３％）を含んだ。複製は、幼虫発生率（Ｆ＝０．００８５；ｄｆ＝２，５７；Ｐ＝０．９９１５）、または落葉（Ｆ＝０．００２７；ｄｆ＝２，５７；Ｐ＝０．９９７３）における変動の有意な源ではなかったが、イベントは、両方に関して非常に有意であった（幼虫発生率：Ｆ＝１９．６４４；ｄｆ＝１９，４０；Ｐ＜０．０００１；落葉：Ｆ＝６７１．３１４７；ｄｆ＝１９，４０；Ｐ＜０．０００１）。累積幼虫発生率（表１０）は、ネガティブチェックにおいて、ｍ作条当り４３〜５０幼虫に達し、一方で、トランスジェニックエントリーにおいて、遭遇されたのは無視できる数であった。最大落葉（表１０）は、ネガティブチェックにおいて、平均８７〜９０％であり、一方で、全てのトランスジェニックエントリーにおいて、痕跡程度しか観察されなかった。
イベントＭＯＮ８７７５１は、非トランスジェニック対照と比べた場合、食葉鱗翅目の幼虫の有意に低い発生率（季節累積）、及び落葉の有意に低いパーセント（季節最大）を有した。
表１０．野外試験施設２で実施され、自然に寄生させた露地有効性試験における、構築物１、２、または３で生成されたイベントの食葉鱗翅目の幼虫発生率（季節累積）、及び落葉（季節最大）
Figure 0006635916
野外試験施設３で実施された別の露地試験において、複製は、植物当りの全鞘（Ｆ＝０．３１２；ｄｆ＝２，２４；Ｐ＝０．７３４９）、若しくは被害を受けた鞘（Ｆ＝０．０４３８；ｄｆ＝２，２４；Ｐ＝０．９５７２）、または収量（Ｆ＝０．２２２１；ｄｆ＝２，２４；Ｐ＝０．８０２５）における変動の有意な源ではなかった。しかしながら、イベントは、植物当りの全鞘（Ｆ＝４．３６４３；ｄｆ＝８，１８；Ｐ＝０．００４５）、及び被害を受けた鞘（Ｆ＝３４．５２８８；ｄｆ＝８，１８；Ｐ＜０．０００１）における変動の有意な源であったが、収量（Ｆ＝０．６２３７，ｄｆ＝８，１８，Ｐ＝０．７４７５）おける変動の有意な源ではなかった。ネガティブチェックは、植物当り平均２５．０〜２６．０の鞘があり、被害を受けた鞘は３０．８〜３１．０％であったが、イベントＭＯＮ８７７５１を含むテストイベントは、植物当り平均２８．９〜３８．９の鞘があり、被害を受けた鞘は＜２％であった（表１１）。ネガティブチェックにおける植物の下の土の上に、多数の被害を受けた鞘があるのが観察された（テストイベントでは観察されなかった）ので、ネガティブチェックにおける植物当りの鞘の数の減少は、サヤムシガの被害により起こった未熟な鞘の離脱の結果である可能性が高い（表１１）。
表１１．野外試験施設３で実施され、構築物１、２、または３で生成されたイベントを評価するサヤムシガに寄生された露地有効性試験における、植物当りの全鞘及び被害を受けた鞘
Figure 0006635916
野外試験施設４で実施された露地試験において、食葉イモムシは、成長のＲ３ステージで遭遇され、成長のＲ６-Ｒ７ステージまでに、高い被害レベルにまで増殖した。遭遇した種は、Ａ． ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（７７％）、Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）（１７％）、及びＣ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（６％）を含んだ。複製は、幼虫発生率（Ｆ＝０．０２１９；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．９７８３）、落葉（Ｆ＝０．０００７；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．９９９３）、または収量（Ｆ＝１．１４７７；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．３２３３）における変動の有意な源ではなかった。イベントは、有意であり、３つ全てに関して、高度に有意であった（幼虫発生率：Ｆ＝９６．９６７３；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１；落葉：Ｆ＝３６３．８８５４；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１；収量：Ｆ＝１．７８１４；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＝０．０４６）。累積幼虫発生率（表１２）は、ネガティブチェックにおいて、ｍ作条当り１１７〜１２３幼虫に到達したが、一方で、トランスジェニックエントリーのいずれにおいても、実質的に全く幼虫は遭遇されなかった。最大落葉（表１２）は、ネガティブチェックにおいて、平均６８〜８３％であり、イベントＭＯＮ８７７５１を含む全てのトランスジェニックエントリーにおいて存在しなかった。
表１２．野外試験施設４で実施された、自然に寄生させた露地試験における、構築物１、２、または３で生成されたイベントからの食葉鱗翅目の幼虫発生率（季節累積）、及び落葉の％（季節最大）
Figure 0006635916
野外試験施設５で実施された別の露地試験において、食葉イモムシは、最初に、成長のＲ２ステージで遭遇され、成長のＲ５-Ｒ６ステージの間、高い被害レベルにまで増殖した。遭遇した種は、Ａ． ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（９３％）、Ｃ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（５％）、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｏｒｎｉｔｈｏｇａｌｌｉ（２％）を含んだ。複製は、幼虫発生率（Ｆ＝０．０２０６；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．９７９６）、落葉（Ｆ＝０．００５４；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．９９４６）、または収量（Ｆ＝０．２３７９；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．７８８９）における変動の有意な源ではなかった。イベントは、３つ全てに関して、高度に有意であった（幼虫発生率：Ｆ＝１２２．４６；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１；落葉：Ｆ＝６２３．０２１７；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１；収量：Ｆ＝２．９３６６；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＝０．０００８）。累積幼虫発生率（表１３）は、ネガティブチェックにおいて、ｍ作条当り７６〜１３７幼虫に達したが、一方で、トランスジェニックエントリーのいずれにおいても、実質的に全く幼虫は遭遇されなかった。最大落葉（表１３）は、ネガティブチェックにおいて、平均８２〜８８％であり、イベントＭＯＮ８７７５１を含む全てのトランスジェニックエントリーにおいて存在しなかった。
表１３．野外試験施設５で実施された、自然に寄生させた露地試験における、構築物１、２、または３で生成されたイベントからの食葉鱗翅目の幼虫発生率（季節累積）、及び落葉（季節最大）
Figure 0006635916
野外試験施設６で実施された別の露地試験において、食葉イモムシ（主に、Ｈ． ｚｅａ及びＣ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）は、成長のＲ６ステージの間に遭遇されたが、非常に有意な数にまでは達しなかった。しかしながら、境界、緩衝、及びネガティブチェックにおけるＥ． ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓによる植物への実質的な被害は、季節の始まりに発生し、成長のＲ５-Ｒ６ステージまでにしおれた、瀕死の、及び枯死した植物を生じさせ、この時点で被害データを記録した。複製は、Ｅ． ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓにより被害を受けた植物の有意な源ではなかった（Ｆ＝０．３４３１；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．７１）。イベントは、Ｅ． ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓにより被害を受けた植物に関して非常に有意であった：Ｆ＝１６．７５５５；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１）。Ｅ． ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓにより被害を受けた植物のパーセント（表１４）は、ネガティブチェックにおいて、平均１０〜２８％であったが、一方で、イベントＭＯＮ８７７５１を含む、トランスジェニックエントリーのいずれにおいても、被害を呈した植物は存在しなかった。
表１４．野外試験施設６で実施され、構築物１、２、または３で生成されたイベントを評価する、ＬＣＳＢの自然に寄生させた露地有効試験における、Ｅ． ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓによる食葉被害の発生率
Figure 0006635916
野外試験施設７で実施された別の露地試験において、食葉イモムシは、最初に、成長のＲ１-Ｒ２ステージで遭遇され、成長のＲ４-Ｒ６ステージまでに高い被害レベルにまで増殖した。遭遇した種は、Ｃ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（５４％）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ（４３％）、及びＥｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ（２％）を含んだ。複製は、幼虫発生率（Ｆ＝０．０８６６；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．９１７２）、または落葉（Ｆ＝０．１１２９；ｄｆ＝２，６９；Ｐ＝０．８９３４）における変動の有意な源ではなかった。イベントは、両方に関して非常に有意であった（幼虫発生率：Ｆ＝６９．９１８；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１；落葉：Ｆ＝２１．６６０３；ｄｆ＝２３，４８；Ｐ＜０．０００１）。累積幼虫発生率（表１５）は、ネガティブチェックにおいて、ｍ作条当り１５２〜１６６に達したが、一方、Ｃｒｙ１Ａｃポジティブ対照、またはＣｒｙ２Ａｂ及び／またはＣｒｙ１Ａ．１０５を発現する構築物１、２、または３で生成されたイベントにおいて、実質的に全く幼虫は遭遇されなかった。最大落葉（表１５）は、ネガティブチェックにおいて、平均２４％であったが、イベントＭＯＮ８７７５１若しくはＣｒｙ１Ａｃポジティブ対照を含む、Ｃｒｙ２Ａｂ及び／またはＣｒｙ１Ａ．１０５を発現する構築物１、２、または３で生成されたイベントにおいて、痕跡レベルを超えなかった。
表１５．野外試験施設７で実施された、自然に寄生させた露地試験における構築物１、２、または３で生成されたイベントからの、食葉鱗翅目の幼虫発生率（季節累積）、落葉（季節最大）、及び収量
Figure 0006635916
野外試験施設８で実施された別の露地試験において、食葉イモムシ、Ｃ． ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（４１％）、Ａ． ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（３８％）、Ｓ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（１３％）、及びＳ． ｏｒｎｉｔｈｏｇａｌｌｉ（８％）による中等度の淘汰圧は、成長のＲ４-Ｒ６ステージの間発生した。複製は、幼虫発生率（Ｆ＝０．０９２４；ｄｆ＝３，５２；Ｐ＝０．９６３９）、または落葉（Ｆ＝０．３７２；ｄｆ＝３，５２；Ｐ＝０．７７３５）における変動の有意な源ではなかった。イベントは、幼虫発生率（Ｆ＝４０．００８，ｄｆ＝１３，４２，Ｐ＜０．０００１）及び落葉（Ｆ＝１１．９３５６，ｄｆ＝１３，４２，Ｐ＜０．０００１）における変動の有意な源であった。累積幼虫発生率、及び最大落葉は、ネガティブチェックにおいて、それぞれ、ｍ作条当り平均９．１〜１３．９幼虫、及び平均３１〜３５％（後者は、経済的許容限界よりやや高い）であったが、ポジティブ対照、及びイベントＭＯＮ８７７５１を含む全てのテストイベントにおいて痕跡を越えなかった（表１６）。試験において、非標的害虫の有意な発生は、認められなかった。
表１６．野外試験施設８で実施された、自然に寄生させた露地有効性試験における、食葉鱗翅目の幼虫累積発生率、落葉の最大パーセント、及び収量
Figure 0006635916
野外試験施設６で実施された露地試験の第２季節の間、Ｈ．ｚｅａによる非常に高い淘汰圧が、成長のＲ３-Ｒ５ステージの間、発生した。複製は、被害を受けた鞘における変動の有意な源ではなかった（Ｆ＝０．０２８０；ｄｆ＝３，５２；Ｐ＝０．９９３６）。イベントは、被害を受けた鞘における変動の有意な源であった（Ｆ＝１５．４７５８，ｄｆ＝１３，４２，Ｐ＜０．０００１）。ネガティブチェックは、平均６４〜７８％が被害を受けた鞘であったが、一方、イベントＭＯＮ８７７５１を含むテストイベントのいずれにおいても、実質的な被害は発生しなかった（表１７）。
表１７．第２季節の間に野外試験施設６で実施された、自然に寄生させた露地有効性試験における、食葉鱗翅目の幼虫累積発生率、落葉の最大パーセント、鞘生産量、タバコガの（ｈｅｌｉｏｔｈｉｎｅ）幼虫により被害を受けた鞘のパーセント、及び収量
Figure 0006635916
本実施例において説明されている複数の露地試験の結果は、（実施例３で説明されている）複数のスクリーンハウス（ｓｃｒｅｅｎｈｏｕｓｅ）試験の結果と合わされて、構築物１、２、または３により生成されたトランスジェニックダイズイベントによって、５つの植物世代（Ｒ２からＲ７まで）に亘って、遭遇される全ての鱗翅目ダイズ害虫の幼虫集団の有効で、季節の長い抑制をさらに確証し、世代内、及び世代間での安定した導入遺伝子の発現を示唆した。
合わされた結果は、４つの主要な標的害虫（１つの地理的位置において、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ及びＣｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、並びに第２の地理的位置において、前記と同じ標的害虫に加えてＲａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ及びＣｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ ａｐｏｒｅｍａ）全てによる閾値を越えた淘汰圧の条件下において、イベントＭＯＮ８７７５１を含む、構築物１、２、または３で生成されたトランスジェニックイベントによる有効性が、Ｃｒｙ１Ａｃを発現し、鱗翅目昆虫のダイズ害虫を抑制することを事前に証明されているトランスジェニックイベントと等しかったことを示す。構築物２または３で生成され、それぞれ、Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質のみ、またはＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質のみを発現するイベントもまた、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質を発現するトランスジェニックイベントと同等の有効性を示し、イベントＭＯＮ８７７５１におけるＣｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質の両方の発現が、耐昆虫性管理を改善することを通して、Ｃｒｙ１Ａｃトランスジェニックイベントを超えて耐性を改善させた可能性があることを示唆した。
イベントＭＯＮ８７７５１を含む構築物１で生成されたイベント間での同等な有効性は、アワヨトウの３種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｓ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、及びＳ． ｅｒｉｄａｎｉａ）、２つのタバコガ類の（ｈｅｌｉｏｔｈｉｎｅ）サヤムシガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ及びＨ． ｇｅｌｏｔｏｐｅｏｎ）、１つのｓｔａｌｋｂｏｒｉｎｇ昆虫（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、並びに１つの食葉害虫（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）を含む、多数の第２の標的害虫に対しても示されている。
実施例５
本実施例は、タンパク質発現、及び広範な分子キャラクタリゼーションを含む、イベントＭＯＮ８７７５１の分子キャラクタリゼーションを説明する。この分子キャラクタリゼーションを、農学野外試験、有効性スクリーンハウス（ｓｃｒｅｅｎｈｏｕｓｅ）試験、及び有効性野外試験において試験されていたイベントと同時に完成させた。
イベントＭＯＮ８７７５１の分子キャラクタリゼーションに関して、導入遺伝子挿入配列（Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５カセットの両方、配列番号：９を含む)のコピー数を、サザン解析、及びエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイの組み合わせを使用して決定した。分子解析によって、ベクターの主鎖の検出がなく、かつ、選択／スコア化可能マーカー配列を含むＴ−ＤＮＡカセットの検出がなく、単一の挿入（Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質の両方に関する発現カセットを含み、配列番号：９により表されるＴ−ＤＮＡ発現カセット)のみ存在することが確認された。イベントＭＯＮ８７７５１のゲノミックＤＮＡにおける単一の挿入（配列番号：９）の完全な配列によって、配列が、形質転換構築物の配列と同一であることが確認された。
タンパク質発現に関して、イベントＭＯＮ８７７５１アレルに関してホモ接合の植物と、凍結乾燥された試料から調製された抽出物とから葉の試料を採取し、Ｃｒｙ２ＡｂまたはＣｒｙ１Ａ．１０５に特異的な抗体をそれぞれ用いてＣｒｙ２ＡｂまたはＣｒｙ１Ａ．１０５のタンパク質レベルを測定する標準的なプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡを実施し、乾燥重量の百万分率（ｐｐｍ）として結果を表した。葉の試料を、構築物１、２、または３を用いた形質転換により生成されたイベント、及び非−トランスジェニック対照Ａ３５５５に関して、植物成長のＲ１及びＲ３ステージで採取した。ＥＬＩＳＡの結果は、構築物１及び構築物２から生成されたイベントに関するＣｒｙ２Ａｂレベルが、イベント８（イベント８は、選択／スコア化可能マーカーのＴ−ＤＮＡから、連鎖したウィルス性プロモータを有しているが、他の配列を含まないことが決定され、イベント８をさらに評価はしなかった）を除いて、約２０ｐｐｍから約５０ｐｐｍの乾燥重量の範囲に亘ったこと、及び、（Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する）構築物３から生成されたイベント、または非トランスジェニック対照からＣｒｙ２Ａｂの発現がなかったことを示した（図３Ａ）。さらに、Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質の発現レベルは、Ｒ１及びＲ３成長ステージの両方に関して、ほぼ等しかった。ＥＬＩＳＡの結果は、構築物１及び構築物３から生成されたイベントに関するＣｒｙ１Ａ．１０５レベルが、約１５０ｐｐｍから約８００ｐｐｍの乾燥重量の範囲に亘ったこと、及び、（Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する）構築物２で生成されたイベントからも、非トランスジェニック対照からもＣｒｙ１Ａ．１０５の発現がなかったことを示した（図３Ｂ）。さらに、Ｃｒｙ１Ａ．１０５タンパク質の発現レベルは、Ｒ１成長ステージと比べて、Ｒ３成長ステージでの葉のサンプルに関してより高い範囲に亘っていた。
別のＥＬＩＳＡの結果は、構築物１で生成されたイベントからのＣｒｙ２Ａｂタンパク質のレベルが、構築物５または構築物４のいずれかで生成されたイベントと比べて高かったこと、及び、予想したように、非−トランスジェニック対照、または（Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する）構築物６で生成されたイベントのどちらに関しても、Ｃｒｙ２Ａｂが全く検出されなかったことを示す（図４Ａ）。葉の試料の同じセットにおいて、ＥＬＩＳＡの結果は、構築物６または構築物４のいずれかで生成されたイベントと比べた場合に、構築物１で生成されたイベントに関して、２倍以上高いレベルで、ＭＯＮ８７７５１に関して、約４倍高いレベルで、Ｃｒｙ１Ａ．１０５の発現があること、及び、予想していたように、非トランスジェニック対照、または（Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する）構築物５で生成されたイベントのいずれに関しても、Ｃｒｙ１Ａ．１０５の発現が全く検出されなかったことを示す（図４Ｂ）。これらのＥＬＩＳＡに関して、葉の試料を、有効性スクリーンハウス（ｓｃｒｅｅｎｈｏｕｓｅ）試験の２つの隔てられた場所の各々で成長した植物から、成長のＲ３ステージから採取した。
さらに、ＥＬＩＳＡの結果は、構築物１で生成されたイベント、及び構築物２で生成されたイベントからの抽出物におけるＣｒｙ２Ａｂタンパク質のレベルが、ａ）構築物４、構築物５、または構築物７のいずれかで生成されたイベントに比べて高かった；ｂ）構築物９、若しくは構築物１１のいずれかで生成されたイベントに比べてほぼ同じ、またはいくらか低かった；及びｃ）予想したように、（示されていない）非−トランスジェニック対照、または（Ｃｒｙ１Ａ．１０５のみを発現する）構築物３若しくは構築物６のいずれかで生成されたイベントのどちらに関してもＣｒｙ２Ａｂが全く検出されなかったことを示す（図５）。これらのＥＬＩＳＡに関して、葉の試料が、成長のＲ３及びＲ５ステージで採取され、Ｃｒｙ２Ａｂレベルは、構築物１及び構築物２で生成されたイベントに関して、Ｒ５成長ステージでより高く、Ｃｒｙ２Ａｂレベルは、構築物９、及び構築物１１で生成されたイベントでより高かった（図５）。葉の試料の同じセットにおいて、ＥＬＩＳＡの結果は、構築物１及び構築物３で生成されたイベントからの抽出物におけるＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質のレベルが、構築物４、構築物６、構築物９、または構築物７で生成されたイベントに比べて、優位に高かったこと、及び、予想したように、（示されていない）非−トランスジェニック対照、または（Ｃｒｙ２Ａｂのみを発現する）構築物２若しくは構築物５のいずれかで生成されたイベントのどちらに関してもＣｒｙ１Ａ．１０５が全く検出されなかったことを示す（図６）。これらのＥＬＩＳＡに関して、葉の試料が、成長のＲ３及びＲ５ステージで採取され、Ｃｒｙ１Ａ．１０５のレベルは、構築物１及び構築物３で生成されたイベントに関して、構築物４、構築物６、構築物９、または構築物７で生成されたイベントに比べて、Ｒ５の成長ステージで数十倍高かった。０〜５０００ｐｐｍの乾燥重量でプロットされた図６ＡのＹ−軸、及び０〜５００ｐｐｍの乾燥重量でプロットされた図６ＢのＹ−軸を参照されたい。ＥＬＩＳＡデータは、２つのＣｒｙタンパク質発現カセット-Ｃｒｙ２Ａｂをコードしている１つの発現カセット、及びＣｒｙ１Ａ．１０５をコードしている１つの発現カセットを全てが含んでいる、構築物４、構築物７、または構築物９で生成されるイベントに比べて、構築物１で生成されるイベントにおいて、Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５の両方のより高い発現があることを示す。また、（イベントＭＯＮ８７７５１を含む）構築物１、構築物２、及び構築物３で生成されたイベントにおける相対的に高いタンパク質の発現が、ダイズの少なくとも４世代（Ｒ０、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３）に亘って安定していたこと、及びＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質のレベルが、ホモ接合のイベントから成長のＲ３からＲ５ステージで採取された葉組織で増加したことが示された。
実施例６
本実施例は、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡの存在をダイズ試料において同定するのに有用な方法について説明する。１対のＰＣＲプライマー、及びプローブは、ゲノミックＤＮＡと、イベントＭＯＮ８７７５１の挿入されるＤＮＡの任意に割り当てられた３’末端（すなわち、３’ジャンクション）との間に形成されたユニークなジャンクションを同定する目的で設計され、配列番号：１０、配列番号：８、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６を含んだ。
オリゴヌクレオチドフォーワードプライマーＳＱ２０２６７の配列（配列番号：１１）は、配列番号：１０の位置１１４００〜１１４２６、及び配列番号：８の位置２１２〜２３８、及び配列番号：９の位置１００６６〜１００９２に対応する塩基配列と同一である。オリゴヌクレオチドリバースプライマーＳＱ２５８２６（配列番号：１２）の配列は、配列番号：１０の位置１１４５４〜１１４７９、及び配列番号：８の位置２６６〜２９１、及び配列番号：６の位置５１〜７６、及び配列番号：４の位置３１〜５６に対応する塩基配列の逆相補体と同一である。オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１０２６３（配列番号：１３）の配列は、配列番号：１０の位置１１４２８〜１１４４６、及び配列番号：９の位置１００９４〜１０１１２、及び配列番号：８の２４０〜２５８、及び配列番号：６の位置２５〜４３、及び配列番号：４の位置５〜２３に対応する塩基配列と同一である。ＰＣＲプライマーＳＱ２０２６７（配列番号：１１）及びＳＱ２５８２６（配列番号：１２）は、イベントＭＯＮ８７７５１の右側ジャンクションでのユニークなゲノミック／挿入ＤＮＡの８０ヌクレオチドのアンプリコンを増幅する。蛍光標識（例えば、６ＦＡＭ（商標）蛍光標識）される場合がある、この同じプライマーペアーとプローブＰＢ１０２６３（配列番号：１３）は、イベントＭＯＮ８７７５１由来のＤＮＡの試料中での存在を同定するために、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイにおいて使用され得る。
ＳＱ２０２６７（配列番号：１１）、ＳＱ２５８２６（配列番号：１２）及びＰＢ１０２６３（配列番号：１３）に加えて、イベントＭＯＮ８７７５１由来のＤＮＡの試料中での存在を検出するために、ユニークであり、かつ有用である配列番号：１０内の配列を、増幅するため、及び／またはハイブリダイズするためのいずれかのために、他のプライマー及び／またはプローブが設計され得ることが当業者にとって明らかであるべきである。
標準的な分子生物学の試験所基準に従い、イベントの同定のためのＰＣＲアッセイを、試料中のイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを検出するために開発した。標準的なＰＣＲアッセイ、またはＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイのいずれかのパラメーターを、イベントＭＯＮ８７７５１由来のＤＮＡの試料中での存在を検出するために使用される、プライマーペアー及びプローブ（すなわち、６ＦＡＭ（商標）などの蛍光タグで標識されたプローブ）、ＳＱ２０２６７（配列番号：１１）、ＳＱ２５８２６（配列番号：１２）、及びＰＢ１０２６３（配列番号：１３）の各セットと共に最適化した。ＰＣＲ反応の対照は、ダイズゲノム中の単一コピー遺伝子に特異的な対照プライマー、及び、（例えば、ＶＩＣ（商標）-標識された）内部対照プローブを含む。当業者は、ダイズゲノム中の単一コピー遺伝子に特異的なプライマーを設計する方法を知っているだろう。一般的に、試料中のイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡの検出に最適化されたパラメーターは、プライマー及びプローブ濃度、鋳型ＤＮＡ量、並びにＰＣＲ増幅サイクルのパラメーターを含んだ。鋳型ＤＮＡ試料及び対照は、以下のようであった：［１］分析するために、葉試料、または単一種子試料のいずれかから抽出したＤＮＡ；［２］ネガティブ対照ＤＮＡ（非−トランスジェニックダイズＤＮＡ）；［３］ネガティブ水対照（鋳型なし）；及び［４］ポジティブ対照ＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡ。試料中のイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを同定するアンプリコンを作製する、当業者に既知の他の方法が、当技術分野の技術に含まれる。
接合状態アッセイは、イベントを含む植物が、イベントＤＮＡに関してホモ接合であるかどうか、；染色体ペアーの各染色体上の同じ位置に外来性ＤＮＡを含んでいる；または、イベントＤＮＡに関してヘテロ接合であり、染色体ペアーのうち１つの染色体上のみに外来性ＤＮＡを含んでいる；または、イベントＤＮＡに関してヌルであり、野生型である、を決定するのに有用である。エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅方法を、イベントＭＯＮ８７７５１に関する接合状態アッセイを開発するために使用した。このアッセイに関して、３つのプライマー、及び２つのプローブを、アッセイのために試料と共に混合した。３つのプライマーは、挿入された外来性ＤＮＡの３’領域から特異的に、ハイブリダイズし伸張するＳＱ２０２６７（配列番号：１１）；挿入された外来性ＤＮＡの３’側に隣接するダイズゲノミックＤＮＡから特異的に、ハイブリダイズし伸張するプライマーＳＱ２７１１５（配列番号：１４）；及び、挿入された外来性ＤＮＡの５’側に隣接するダイズゲノミックＤＮＡから特異的に、ハイブリダイズし伸張するプライマーＳＱ２６９０１（配列番号：１５）であった。プライマー、ＳＱ２０２６７及びＳＱ２７１１５、並びに、（６−ＦＡＭ（商標）−標識された）プローブ、ＰＢ１０２６３（配列番号：１３）は、鋳型ＤＮＡに存在する挿入された外来性ＤＮＡのコピーがあるときに、すなわち、イベントＭＯＮ８７７５１の診断となる。プライマー、ＳＱ２６９０１及びＳＱ２７１１５、並びに（ＶＩＣ（商標）-標識された）プローブ、ＰＢ１１２５４（配列番号：１６）は、ゲノミックＤＮＡに存在する挿入された外来性ＤＮＡのコピーがないとき、すなわち、野生型であるときに、診断となる。３つのプライマー、及び２つのプローブが、ＰＣＲ反応で、イベントＭＯＮ８７７５１に関してホモ接合である植物から抽出されたＤＮＡと共に混合されるとき、イベントＭＯＮ８７７５１に関してホモ接合の植物の指標、及び診断となる６−ＦＡＭ（商標）-標識されたプローブ、ＰＢ１０２６３のみからの蛍光シグナルがある。３つのプライマー、及び２つのプローブが、ＰＣＲ反応で、イベントＭＯＮ８７７５１に関してヘテロ接合である植物から抽出されたＤＮＡと共に混合されるとき、イベントＭＯＮ８７７５１に関してヘテロ接合の植物の指標、及び診断となる６−ＦＡＭ（商標）-標識されたプローブ、ＰＢ１０２６３、及びＶＩＣ（商標）-標識されたプローブ、ＰＢ１１２５４の両方からの蛍光シグナルがある。３つのプライマー、及び２つのプローブが、ＰＣＲ反応で、イベントＭＯＮ８７７５１に関してヌルである（すなわち、野生型）植物から抽出されたＤＮＡと共に混合されるとき、イベントＭＯＮ８７７５１に関してヌルである（すなわち、野生型）植物の指標、及び診断となるＶＩＣ（商標）-標識されたプローブ、ＰＢ１１２５４のみからの蛍光シグナルがある。鋳型ＤＮＡ試料、及び対照は、以下のようであった：［１］分析するために、葉試料、または単一種子試料のいずれかから抽出したＤＮＡ；［２］ネガティブ対照ＤＮＡ（非−トランスジェニックＤＮＡ）；［３］ネガティブ水対照（鋳型なし）；及び［４］既知のヘテロ接合試料からのポジティブ対照ＭＯＮ８７７５１ゲノミックＤＮＡ、及び；［５］既知のホモ接合試料からのポジティブ対照ＭＯＮ８７７５１ゲノミックＤＮＡ。
実施例７
以下の実施例は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を使用する任意の繁殖活動の子孫に含まれるＭＯＮ８７７５１イベントを同定する場合がある方法を説明する。
ＤＮＡイベントプライマーペアーを、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の診断となるＰＣＲアンプリコンを作製するために使用した。ＭＯＮ８７７５１の診断となるアンプリコンは、配列番号：１、または配列番号：２、または配列番号：３、または配列番号：４、または配列番号：５、または配列番号：６として与えられる、少なくとも１つのジャンクション配列を含む。ＭＯＮ８７７５１の診断となるアンプリコンを作製し得るプライマーペアーは、隣接配列、及び挿入された発現カセット（配列番号：９）に基づくプライマーペアーを含む。配列番号：１、または配列番号：３、または配列番号：５がその中に見られる、診断となるアンプリコンを得るために、配列番号：７の塩基１〜１３３４に基づくフォーワードプライマー分子、及び挿入された発現カセットＤＮＡ配列（配列番号：９の位置１〜１０１１９）に基づくリバースプライマー分子が設計されるであろう。これらのプライマー分子は、配列番号：７及び配列番号：９に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの隣接するヌクレオチドである。配列番号：２、または配列番号：４、または配列番号：６がその中に見られる、診断となるアンプリコンを得るために、挿入された発現カセットＤＮＡ配列（配列番号：９の位置１〜１０１１９）に基づくフォーワードプライマー分子、及び３’隣接配列（配列番号：８の位置２６６〜１４５２）に基づくリバースプライマー分子が設計されるであろう。これらのプライマー分子は、配列番号：８及び配列番号：９に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの隣接するヌクレオチドである。
本分析のための増幅条件の実施例が、実施例４で示される。しかしながら、これらの方法、または、配列番号：７若しくは配列番号：８と相同な、若しくは相補的なＤＮＡプライマー、若しくは、ＭＯＮ８７７５１の診断となるアンプリコンを作製する、ＭＯＮ８７７５１の導入遺伝子挿入（配列番号：９）に含まれる遺伝因子のＤＮＡ配列の使用に対するあらゆる変更は、当技術分野内に含まれる。診断となるアンプリコンは、少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノミックジャンクションＤＮＡ（配列番号：１、若しくは配列番号：２、若しくは配列番号：３、若しくは配列番号：４、若しくは配列番号：５、若しくは配列番号：６）と相同な、若しくは相補的なＤＮＡ分子、または前記ＤＮＡ分子のかなりの部分を含む。あるいは、診断となるアンプリコンは、少なくとも１つのユニークな導入遺伝子配列（配列番号：１７、若しくは配列番号：１８、若しくは配列番号：１９、若しくは配列番号：２０、若しくは配列番号：２１、若しくは配列番号：２２、若しくは配列番号：２３）と相同な、または相補的なＤＮＡ分子を含む。
イベントＭＯＮ８７７５１の植物組織試料に関する分析は、イベントＭＯＮ８７７５１からのポジティブ組織対照、イベントＭＯＮ８７７５１ではないダイズ植物からのネガティブ対照（例えば、Ａ３５５５であるが、これに限定はされない）、及びダイズゲノミックＤＮＡを含まないネガティブ対照を含む。外来性ダイズＤＮＡ分子を増幅し得るプライマーペアーは、ＤＮＡ増幅条件に関して内部対照として機能するであろう。別のプライマー配列は、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９から、ＤＮＡ増幅法の技術分野における当業者によって選択され得る。実施例４で示される方法によるアンプリコンの作製のために選択される条件は、異なってもよいが、結果として、イベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡの診断となるアンプリコンをもたらす。実施例４の方法に修正を加えた、これらのＤＮＡプライマー配列の使用は、本発明の範囲内にある。ＭＯＮ８７７５１の診断となる、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９由来の少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列により作製されるアンプリコンは、本発明の１つの態様である。
ＤＮＡ検出キットは、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９由来の十分な長さの隣接ヌクレオチドから成る少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含み、前記ＤＮＡプライマーは、ＤＮＡ増幅法において使用される場合、本発明の１つの態様である、ＭＯＮ８７７５１、またはその子孫の診断となるアンプリコンを作製する。ＤＮＡ増幅法で試験された場合に、ＭＯＮ８７７５１の診断となるアンプリコンを作製し得るＭＯＮ８７７５１ダイズ植物、植物部位、植物細胞、種子、または商品生産物は、本発明の１つの態様である。ＭＯＮ８７７５１アンプリコンに関するアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲシステム９７００（最大速度で作動）、またはＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ ＰＴＣ−２２５サーマルサイクラー、または実施例４に示されているようにＭＯＮ８７７５１の診断となるアプリコンを作製するために使用し得る、任意の他の増幅システムを使用することによって実施され得る。
実施例８
増強された農業特性、殺虫特性、若しくは除草特性を有するダイズ植物、またはその植物部位を作製するために、イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物を、任意の他のダイズイベント、またはそれらの組み合わせを潜在的に含むダイズ植物と交配し、子孫植物の得られた特性を決定するために、表現型を評価した。このような植物繁殖から得られる子孫植物に与えられた特性は、イベントＭＯＮ８７７５１の鱗翅目抵抗性を超えて拡張することができ、地上部の害虫防除、除草剤耐性、殺線虫作用、耐乾燥性、ウィルス抵抗性、抗真菌防除、細菌抵抗性、雄性不稔性、耐寒性、耐塩性、収量増大、油成分の増強、油分の増加、養分利用効率の増強、またはアミノ酸含有量の変化を含むが、これらに限定はされない。改良された農業形質を伴うトランスジェニックイベントの実施例は、当技術分野においてよく知られている。以下は、ダイズ植物、植物部位、種子、または商品生産物において増強された特性を与えるために、イベントＭＯＮ８７７５１との繁殖で使用され得る、可能なトランスジェニックダイズ系統の非限定的なリストである。繁殖は、以下のうちの任意の、及び全ての組み合わせを含んでもよい：除草剤耐性：ダイズＧＴＳ４０−３−２、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８９７８８、Ａ２７０４−１２、Ａ２７０４−２１、Ａ５５４７−３５、Ａ５５４７−１２７、ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、ＤＰ３５６０４３、ＧＵ２６２、Ｗ６２、Ｗ９８、ＤＡＳ−４４４０６−６、ＤＡＳ−６８４１６−４、ＦＧ７２、ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、ＳＹＨＴ０４Ｒ、ＳＹＨＴ０Ｈ２、３５６０．４．３．５、ＥＥ−ＧＭ３、ｐＤＡＢ４４７２−１６０６、ｐＤＡＢ４４６８−０４１６、ｐＤＡＢ８２９１．４５．３６．、１２７、ＡＡＤ−１２；虫害抵抗性：ＭＯＮ８７７０１、ＤＡＳ−８１４１９−２；油成分の増強：ＤＰ−３０５４２３、Ｇ９４−１、Ｇ９４−１９、Ｇ１６８、ＯＴ９６−１５、ＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８７７６９；収量増大：ＭＯＮ８７７１２。
本明細書で引用され、本発明の資料である、全ての文献、及び公開された特許資料は、個々の文献または特許出願が参照により取り込まれることが、具体的かつ個々に示される場合と同程度に本明細書に参照により組み込まれる。

Claims (25)

  1. ダイズＤＮＡを含む試料中の検出可能な組換えＤＮＡ分子であって、前記分子のヌクレオチド配列が、
    ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群より選ばれ；または
    ｂ）（ａ）に対して完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
    このようなＤＮＡ分子の存在は、前記試料中にダイズイベントＭＯＮ８７７５１が存在する診断となる、前記組換えＤＮＡ分子。
  2. 前記組換えＤＮＡ分子は、ＰＴＡ−１２０１６６のＡＴＣＣ受託番号で寄託されている、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む種子の代表試料である、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１に由来する、請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
  3. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試料中のダイズイベントＭＯＮ８７７５１と特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能する十分な長さのポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、ここに前記ＤＮＡ分子は配列番号：１および配列番号：２を含み、前記ハイブリダイゼーション条件下で前記ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションを検出することは、前記試料中におけるダイズイベントＭＯＮ８７７５１が存在する診断となる、前記ＤＮＡ分子。
  4. 前記試料が、ダイズ植物、ダイズ植物細胞、ダイズ種子、ダイズ植物部分、ダイズ子孫植物、ダイズ油、ダイズタンパク質、またはダイズ商品生産物を含む、請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
  5. 一対のＤＮＡ分子であって、第１のＤＮＡ分子と、前記第１のＤＮＡ分子と異なる第２のＤＮＡ分子とを含み、前記第１及び第２のＤＮＡ分子は、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ 鋳型を含む試料と共に増幅反応に用いた場合に、前記試料中の前記ダイズイベントＭＯＮ８７７５１が存在する診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡプライマーとして機能し、前記アンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１０から成る群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、前記一対のＤＮＡ分子。
  6. 試料中にダイズイベントＭＯＮ８７７５１が存在することの診断となるＤＮＡセグメントの存在の検出方法であって、
    ａ）前記試料と請求項３記載のＤＮＡプローブとを接触させること；
    ｂ）前記試料と前記ＤＮＡプローブとをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に供すること；及び
    ｃ）前記ＤＮＡプローブの、前記試料とのハイブリダイゼーションを検出することを含み、
    前記検出工程は、前記試料中の前記ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の存在の診断となる、検出方法。
  7. 試料中にダイズイベントＭＯＮ８７７５１が存在することの診断となるＤＮＡセグメントの存在の検出方法であって、
    ａ）前記試料と請求項５記載のＤＮＡ分子とを接触させること；
    ｂ）ＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を行うこと；及び
    ｃ）前記反応物中の前記ＤＮＡアンプリコンを検出することを含み、
    前記ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６から成る群より選ばれるヌクレオチド配列を含み、前記アンプリコンの存在の前記検出は、前記試料中にダイズイベントＭＯＮ８７７５１が存在することの診断となる、前記検出方法。
  8. ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む組換えポリヌクレオチド分子を含む、ダイズ植物、ダイズ植物部分またはそのダイズ細胞。
  9. 前記ダイズ植物、ダイズ植物部分またはそのダイズ細胞は、鱗翅目害虫の餌中に提供されると殺虫性である請求項８記載のダイズ植物、ダイズ植物部分またはそのダイズ細胞。
  10. 前記鱗翅目害虫は、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｓｐｐ．、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｓｐｐ．、Ｃｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ ｓｐｐ．、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｓｐｐ．、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｓｐｐ．、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｓｐｐ．及びＰｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｐｐから成る群より選ばれる請求項９記載のダイズ植物、ダイズ植物部分またはそのダイズ細胞。
  11. 前記ダイズ植物は、前記ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物のいずれかの世代の子孫であるとさらに定義される、請求項８記載のダイズ植物、ダイズ植物部分またはそのダイズ細胞。
  12. 昆虫の寄生からダイズ植物を保護する方法であって、ダイズの鱗翅目害虫の餌中に、イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物の細胞または組織の殺虫有効量を提供することを含む、前記方法。
  13. 前記鱗翅目害虫は、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｓｐｐ．、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｓｐｐ．、Ｃｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ ｓｐｐ．、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｓｐｐ．、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｓｐｐ．、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｓｐｐ．及びＰｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｐｐから成る群より選ばれる請求項１２記載の方法。
  14. 耐昆虫性ダイズ植物の製造方法であって、
    ａ）２つの異なるダイズ植物であってそのうちの少なくとも１つがトランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む、２つの異なるダイズ植物を性的に交配すること；
    ｂ）前記交配の子孫から種子または組織をサンプリングすること：
    ｃ）工程ｂ）からの試料中に、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１の存在の診断となるＤＮＡセグメントを検出して、ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む子孫を同定すること；及び
    ｄ） ダイズイベントＭＯＮ８７７５１ ＤＮＡを含む前記子孫を選択することを含み、前記子孫は、トランスジェニックダイズイベントＭＯＮ８７７５１を含む耐昆虫性ダイズ植物である、前記方法。
  15. ダイズイベントＭＯＮ８７７５１を、検出可能な量含むダイズ種子。
  16. 請求項１記載の組換えＤＮＡ分子を検出可能な量含む非生存ダイズ植物材料。
  17. 請求項１記載の組換えＤＮＡ分子を検出可能な量含む微生物。
  18. 前記微生物が植物細胞である、請求項１７記載の微生物。
  19. イベントＭＯＮ８７７５１を検出可能な量含むダイズ商品生産物であって、前記分子が請求項１記載の組換えＤＮＡ分子を含む、前記ダイズ商品生産物。
  20. 全体または加工ダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズ糠、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズ含有動物餌、ダイズ含有紙、ダイズ含有クリーム、ダイズバイオマス並びにダイズ植物及びダイズ植物部分を用いて製造された燃料生産物から成る群より選ばれる商品生産物としてさらに定義される請求項１９記載のダイズ商品生産物。
  21. イベントＭＯＮ８７７５１の存在の診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法において試験する際に鋳型として機能するＤＮＡを含む、ダイズ植物、ダイズ植物部分またはそのダイズ種子。
  22. イベントＭＯＮ８７７５１を含むダイズ植物またはダイズ種子の接合状態を決定する方法であって、
    ａ）ダイズＤＮＡを含む試料と、イベントＭＯＮ８７７５１の存在の診断となる第１のアンプリコン及びイベントＭＯＮ８７７５１を含まないネイティブのダイズゲノミックＤＮＡの存在の診断となる第２のアンプリコンを生成することができるプライマーセットとを接触させること；
    ｉ）前記試料と前記プライマーセットとで核酸増幅反応を行うこと；及び
    ｉｉ）前記核酸増幅反応物中の、イベントＭＯＮ８７７５１の存在の診断となる前記第１のアンプリコン、またはイベントＭＯＮ８７７５１を含まないネイティブなダイズゲノミックＤＮＡの存在の診断となる前記第２のアンプリコンを検出することを含み、
    前記第１のアンプリコンのみが存在することは、前記試料中、イベントＭＯＮ８７７５１がホモ接合であることの診断となり、前記第１のアンプリコンと前記第２のアンプリコンの両方が存在することは、ダイズ植物がイベントＭＯＮ８７７５１アレルのヘテロ接合であることの診断となる；または
    ｂ）ダイズＤＮＡを含む試料と、少なくとも、イベントＭＯＮ８７７５１と特異的にハイブリダイズする第１のプローブ及び少なくとも、イベントＭＯＮ８７７５１である異種性のＤＮＡの挿入により破壊されたダイズゲノミックＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、イベントＭＯＮ８７７５１とハイブリダイズしない第２のプローブを含むプローブセットとを接触させること、
    ｉ）前記プローブセットと前記試料とをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせることを含み、
    前記ハイブリダイゼーション条件下において前記第１のプローブのみのハイブリダイゼーションが検出されることは、前記試料中のイベントＭＯＮ８７７５１のアレルがホモ接合である診断となり、前記ハイブリダイゼーション条件下において前記第１のプローブ及び前記第２のプローブが検出されることは、前記試料中のイベントＭＯＮ８７７５１のアレルがヘテロ接合である診断となる、前記方法。
  23. 前記プライマーセットは、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５を含む、請求項２２記載の方法。
  24. 前記プローブセットは、配列番号１３及び配列番号１６を含む、請求項２２記載の方法。
  25. 前記ダイズ植物は、ＭＯＮ８７７５１、ＭＯＮ８９７８８、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８７７０１、ＭＯＮ８７７１２、ＭＯＮ８７７６９、ＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８７７５４、ＧＴＳ ４０−３−２、Ａ２７０４−１２、Ａ２７０４−２１、Ａ５５４７−３５、Ａ５５４７−１２７、ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、ＤＰ−３０５４２３、ＤＰ３５６０４３、Ｇ９４−１、Ｇ９４−１９、Ｇ１６８、ＧＵ２６２、ＯＴ９６−１５、Ｗ６２、Ｗ９８、ＤＡＳ−４４４０６−６、ＤＡＳ−６８４１６−４、ＦＧ７２、ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９ Ｓｏｙｂｅａｎ、ＳＹＨＴ０４Ｒ、ｐＤＡＢ４４７２−１６０６、ｐＤＡＢ４４６８−０４１６、ｐＤＡＢ８２９１．４５．３６．２、ｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１、ＳＹＨＴ０Ｈ２、３５６０．４．３．５、ＥＥ−ＧＭ３及びイベント １２７から成る群より選ばれるトランスジェニックイベントをさらに含む、請求項１０記載のダイズ植物またはそのダイズ植物部分。
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