BRPI0806600B1 - Métodos para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica e para determinar a presença ou ausência de dois ou mais eventos, dispositivo de computação, e kit - Google Patents

Abstract

detecção de evento de planta transgênica. a presente invenção refere-se à detecção de materiais derivados de eventos de planta transgênica. em particular, a invenção fornece métodos, reagentes, kits e materiais de referência para detectar a presença ou ausência em uma amostra de material genético derivado e atribuível a eventos de planta transgênica seletos.

Description

(54) Título: MÉTODOS PARA EXAMINAR UMA AMOSTRA PARA A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE MATERIAL DERIVADO DE UM OU MAIS EVENTOS DE PLANTA TRANSGÊNICA E PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DOIS OU MAIS EVENTOS, DISPOSITIVO DE COMPUTAÇÃO, E KIT (51) lnt.CI.: C12Q 1/68 (30) Prioridade Unionista: 16/05/2007 EP 07108343.0, 29/01/2007 EP 07447008.9 (73) Titular(es): SCIENTIFIC INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH (IPH) (72) Inventor(es): MARC HENRI GERMAIN VAN DEN BULCKE; ANTOON PIET NELLY RAOUL LIEVENS; AMAYA LEUNDA; ETONDOH GUILLAUME MBONGOLO MBELLA; ELODIE BARBAUPIEDNOIR; MYRIAM JACQUELINE SYLVIANE SNEYERS

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA EXAMINAR UMA AMOSTRA PARA A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE MATERIAL DERIVADO DE UM OU MAIS EVENTOS DE PLANTA TRANSGÊNICA E PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU

AUSÊNCIA DE DOIS OU MAIS EVENTOS, DISPOSITIVO DE COMPUTAÇÃO, E KIT.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à detecção de materiais derivados de eventos de planta transgênica. Em particular, a invenção fornece métodos, reagentes, kits e materiais de referência para detectar a presença ou ausência em uma amostra de material genético derivado e atribuível para selecionar eventos de planta transgênica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Organismos geneticamente modificados (GMOs), em particular plantas geneticamente modificadas, estão ganhando importância na agricultura como também na produção e comercialização de alimentos e ração.

Porém, devido às preocupações existentes com relação ao impacto dos GMOs no ambiente e na saúde dos consumidores, a introdução de GMOs novos comumente requer aprovação regulatória e, em muitos países incluindo a União Européia, produtos alimentícios e de ração contendo ou produzidos de GMOs são submetidos à autorização e rotulagem compulsória (vide, por exemplo, Regulation (EC) n° 1829/2003. Off J Eur Communities: Legis. 2003, L268: 1-23;

Regulation (EC) n° 1830/2003. Off J Eur Communities: Legis. 2003, L268: 24-28).

Por conseguinte, rastreio de GMOs no ambiente e pelo processo de cultivo e cadeia de produção de alimento ou ração é fundamental para avaliação do risco ambiental, como também necessário para preservar a confiança dos consumidores e satisfazer ou verificar a observância das regulações obrigatórias, incluindo rotulagem dos produtos de GMO.

Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 13/35 cadeia da polimerase de tempo real (PCR) provou ser uma técnica específica e sensível para a quantificação de ácidos nucléicos indicativos da presença de DNA originando de GMOs.

Ensaios estão disponíveis para de forma não-ambígua concluir a 5 presença ou ausência de material genético derivado de um evento de transformação de planta seleto em uma amostra. Comumente, tais ensaios podem detectar a presença de uma única sequência de nucleotídeo eventoespecífica encontrada no evento de transformação da planta de interesse mas ausente de outros eventos. Por exemplo, tais sequências de nucleotí10 deo distintivas podem estar presentes nas junções entre a sequência genômica endógena dos GMO e a sequência da construção do gene transformante no sítio de inserção genômico do último; detecção pode envolver amplificação por PCR, por exemplo, ao longo da dita junção usando iniciadores específicos flanqueando a junção (vide, por exemplo, Hernandez et al. 2003.

Transgenic Res 12: 179-189; Hernandez et al. 2004. J Cereal Sei 39: 99107; Berdal et al. 2001. Eur Food Res Technol 213: 432-438; Nielsen et al. 2004. Eur Food Res Technol 219: 421-427; ou Ronning et al. 2003. Eur Food Res Technol 216: 347-354).

Porém, estes ensaios evento-específicos podem ser frequente20 mente obtidos apenas como kits de custo alto permitindo um número limitado de testes, são confinados à detecção de material de um evento simples, e comumente empregam condições de reação muito particulares. Ainda, o número de GMOs gerados, autorizados e comercializados continua aumentando. Consequentemente, uma determinação não-ambígua da composição de GMO de uma amostra poderia em princípio requerer aplicar uma bateria cada vez mais crescente de ensaios de detecção evento-específicos separados em cada amostra, que é tanto laborioso quanto dispendioso.

Portanto, embora continue ser desejável empregar ensaios evento-específicos devido à natureza não-ambígua de seu resultado, existe uma necessidade de usar estes ensaios em uma maneira mais eficaz e alvejada, tal como melhorar a detecção da detecção de GMOs, por exemplo, em termos de gasto de tempo, custo e intensidade de trabalho.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em aspectos, a presente invenção fornece métodos, reagentes, kits e materiais de referência que tratam uma ou mais das necessidades acima debatidas da técnica.

Em geral, a invenção consequentemente fornece métodos, reagentes, kits e materiais de referência melhorados para detectar material derivado de GMOs, e preferivelmente de plantas geneticamente modificadas, em amostras.

Mais particularmente, os inventores constataram que selecio10 nando cuidadosamente certas características da sequência a serem ensaiadas na amostra - em que as ditas características da sequência não necessitam ser evento-específicas e podem de fato ser compartilhadas entre dois ou mais eventos - pode-se concluir se a amostra potencialmente contém material derivado de um ou mais eventos de transformação ou, inversamente, se a amostra não contém material derivado de um ou mais de tais eventos de transformação. Os ensaios da invenção podem desse modo fornecer uma indicação valiosa dos conteúdos dos GMOs potenciais da amostra e assim vantajosamente reduzir o número de testes subsequentes (tais como, por exemplo, ensaios evento-específicos), necessários para verificar a presença de material derivado de um ou mais eventos de transformação particulares na amostra; isto pode por sua vez melhorar a eficácia de custo, tempo e/ou trabalho dos métodos de detecção de GMOs. Por exemplo, os ensaios da invenção podem permitir reduzir consideravelmente o número de ensaios evento-específicos necessários para caracterizar a composição de GMOs da amostra.

Os inventores também meticulosamente avaliaram os eventos de transformação conhecidos, comercialmente significativos e/ou autorizados para selecionar características de sequência por serem ensaiadas em uma amostra, tal como reduzir o número de reações de teste individuais ne30 cessárias por amostra embora assegurando informatividade adequada do perfilamento de GMO de acordo com a invenção.

A presente invenção integra a realização relevante acima em seus aspectos diversos.

Consequentemente, em um aspecto particularmente preferido (aqui aspecto A1) a invenção diz respeito a um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em:

a) Zm: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Zea mays, preferivelmente Zea mays ssp. mays,

b) Bn: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Brassica napus,

c) Gm: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Glycine max, e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados de:

d) p35S: um ácido nucleico derivado do promotor 35S do Vírus do Mosaico de Couve-flor,

e) tNOS: um ácido nucleico derivado do terminador de 3' do gene de nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens,

f) CrylAb: um ácido nucleico derivado do gene de proteína de 20 cristais CrylAb de Bacillus thuringiensis,

g) PAT/bar: um ácido nucleico derivado do gene de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) barde Streptomyces hygroscopicus,

h) PAT/pat: um ácido nucleico derivado do gene de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) pat de Streptomyces viridochromogenes, e

i) CP4-EPSPS: um ácido nucleico derivado do gene de 5-Enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11,

Bt10, ΜΘΝ810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas

19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac,

GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 403-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.

Aspecto A1 permite investigar a presença ou ausência potencial em uma amostra de material de numerosos eventos de planta transgênica pertencendo a várias taxonomias de planta distintas, embora executando um número relativamente limitado de etapas de detecção. Vantajosamente, os eventos de planta transgênica detectados pelo método do aspecto A1 a10 brangem uma fração grande, ou ainda substancialmente maior, de eventos de planta transgênica presentemente autorizados e/ou comercializados, por exemplo, na Europa, isto é, eventos de planta transgênica que são particularmente prováveis de serem encontrados, por exemplo, em amostras ambientais ou comerciais. Consequentemente, neste aspecto a invenção fornece um ensaio relativamente pouco exigente para inspecionar um espectro considerável de eventos de planta transgênica relevantes.

Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A1 pode envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todo o ácido nucleico listado sob a) - i) como definido a20 cima. Isto vantajosamente melhora a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material derivado de um número substancialmente alto de eventos de planta transgênica.

Enquanto na etapa (2) do aspecto A1 a detecção é particular25 mente prevista para eventos de planta transgênica particulares existentes, será apreciado que outros eventos, incluindo qualquer evento transgênico futuro a ser gerado, podem ser também detectados desde que pertençam às taxonomias como definidas sob a) - c) e compreendam um ou mais dos ácidos nucleicos como definidos sob d) - i). Esta observação se aplica mutatis mutandis à detecção de eventos em qualquer aspecto da invenção como descrita no seguinte.

Embora o método do aspecto A1 permita examinar simultânea6 mente a presença ou ausência na amostra de eventos de planta transgênica que pertencem pelo menos a três taxonomias diferentes, os inventores também visam adaptar o método a taxonomias individuais. Isto pode de modo útil reduzir o número de etapas de detecção de ácido nucléico se a informa5 ção for apenas requerida para uma taxonomia particular.

Consequentemente, em um outro aspecto (A2) a invenção fornece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucléico listado sob a) como definido acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri15 vado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS59122, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.

Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A2 pode envolver detec20 tar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todo o ácido nucléico listado sob a) e d) - i) como definido acima. Isto aumenta a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material derivado de um número comparavelmente mais alto de eventos de planta transgênica de milho.

Em um outro aspecto (A3) a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucléico listado sob b) como definido acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos seleciona7 dos daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consis5 tindo em eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3 e eventos relacionados dos mesmos.

Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A3 pode envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob b) e d) - i) como definidos acima. Isto aumenta a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material derivado de um número comparavelmente mais alto de eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza.

Em outra modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A3 envolve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob b) e d), e), e g) - i) como definidos acima. É observado que muitos eventos de óleo de semente de colza, por exemplo, aquelas especificamente citadas na etapa (2) do as20 pecto A3, podem não incluir ácido nucleico listado sob f) como definido acima. Portanto, omissão do dito ácido nucleico listado sob f) da etapa (1) do aspecto A3 pode reduzir o número de testes sem perda de informação.

Em um outro aspecto (A4), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de soja compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob c) como definido acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos seleciona30 dos daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de soja, tais como even8 tos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.

Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A4 pode envolver detec5 tar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob c) e d) - i) como definidos acima. Isto aumenta a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material derivado de um número comparavelmente mais alto de eventos de planta transgênica de soja.

Em outra modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A4 envolve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob c) e d), e), h) e i) como definidos acima. É observado que muitos eventos de soja, por exem15 pio, aqueles especificamente citados na etapa (2) do aspecto A4, podem não incluir os ácidos nucleicos listados sob f) e g) como definidos acima. Portanto, omissão dos ditos ácidos nucleicos listados sob f) e g) da etapa (1) do aspecto A4 pode reduzir o número de testes sem perda de informação.

Será também apreciado que outros aspectos podem ensinar combinações de quaisquer dois dos aspectos acima A2 - A4. Por exemplo, isto pode vantajosamente reduzir o número de ações de testagem em casos onde a detecção de eventos transgênicos de taxonomias seletas for intencionada.

Consequentemente, em um outro aspecto (A5), a invenção o25 ferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de milho e/ou de óleo de semente de colza de planta transgênica compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos listados sob a) e

b) como definidos acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri9 vado de um ou mais eventos de milho e/ou de óleo de semente de colza de planta transgênica, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt1O, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, cruzamentos dos mesmos, e e5 ventos relacionados dos mesmos; e eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3 e eventos relacionados dos mesmos.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A5 pode 10 preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob a), b) e d) - i) como definidos acima.

Em ainda um outro aspecto (A6), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de milho e/ou de planta transgênica de soja compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos listados sob a) e c) como definidos acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos sele20 cionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de milho e/ou de planta transgênica de soja, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21,

DAS-59122, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A6 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob a), c) e d) - i) como definidos acima.

Em ainda um outro aspecto (A7), a invenção oferece um méto10 do para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza e/ou de soja compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu5 cleicos compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos listados sob b) e

c) como definidos acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza e/ou de soja, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3 e eventos relacionados dos mesmos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cru15 zamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A7 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob b), c) e d) - i) como definidos acima.

Em outra modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A7 envolve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob b), c) e d), e) e g) - i) como definidos acima, isto é, sem detectar o ácido nucleico listado sob f).

Consequentemente, em um aspecto (A8), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou de óleo de semente de colza e/ou de soja compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em:

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da11 queles listados sob a), b) e c) como definidos acima, e

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/ 90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A8 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo todos os ácidos nucleicos listados sob d) i) como definidos acima.

Como explicado, métodos dos aspectos acima A1 a A8 são bem apropriados para detectar a presença ou ausência potencial em uma amostra de material derivado de eventos de planta transgênica relevantes, tais como os que foram autorizados e/ou são comumente usados. Porém, será apreciado que os ditos métodos são também vantajosamente flexíveis e, nas modalidades, permitem avaliar melhor a presença ou ausência de material derivado de outros eventos transgênicos, tais como eventos não especificamente citados na etapa (2) dos aspectos acima A1 a A8. Isto desse modo permite colher até mesmo mais informação acerca da composição da amostra.

Consequentemente, nas modalidades, a etapa (1) de qualquer dosiãspêctõsãcirha ÃT,A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico j) mCry3A: um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais modificado Cry3A de Bacillus thuringiensis-, e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende evento de milho MIR604, cruzamentos do mesmo com outros eventos de milho, e eventos relacionados a MIR604.

Em outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos 5 acima A1, A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de um ou ambos ácidos nucleicos k) cordapA: um ácido nucleico derivado do gene de di-hidrodipicolinato sintase insensível à lisina (cDHDPS) cordapA de Corynebacterium glutamicum e/ou I) Gibi: um ácido nucleico derivado do promotor Glb1 de milho; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende evento de milho LY038, cruzamentos do mesmo com outros eventos de milho, e eventos relacionados a LY038.

Em ainda outras modalidades, a etapa (1) de qualquer um dos aspectos acima A1, A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico m) Cry3Bb1: um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais Cry3Bb1 de Bacillus thuríngiensis; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende evento de milho MON88017, cruzamentos do mesmo com outros eventos de milho, e eventos relaciona20 dos a MON88017.

Consequentemente, nas modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1, A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de um, mais que um, ou todos ácidos nucleicos listados sob j) - m) como definidos acima; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos aspectos pode também compreender um, mais que um, ou todos os eventos de milho MIR604, LY038 e MON88017, cruzamentos dos mesmos com outros eventos de milho, e eventos relacionados a estes. Porém, embora a detecção dos respectivos ácidos nucleicos listados sob j) - m) como definidos acima possa prover detecção melhorada da presença de material dos eventos de milho

MIR604, LY038 e/ou ΜΘΝ88017 na amostra, a detecção dos ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima já permite tirar conclusões com relação à presença potencial de material dos ditos eventos MIR604, LY038 e/ou ΜΘΝ88017 em uma amostra (vide também Tabela 3).

Nas modalidades, a etapa (1) de qualquer um dos aspectos acima A1, A3, A5, A7 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico n) Bxn: um ácido nucleico derivado do gene de nitrilase Bxn de Klebsiella pneumoniae spp. ozaenae; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende evento de óleo de semente de colza OXY235, cruzamentos do mesmo com outros eventos de óleo de semente de colza, e eventos relacionados a OXY235. Porém, embora a detecção do ácido nucleico listado sob n) como definido acima possa prover detecção melhorada da presença de material do evento de óleo de semente de colza OXY235 na amostra, a detecção dos ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima já permite tirar conclusões relativas à presença poten15 ciai de material do dito evento OXY235 em uma amostra (vide Tabela 3).

Desse modo, em um aspecto (A9), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou de óleo de semente de colza e/ou de soja compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em:

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob a), b) e c) como definidos acima, e

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da25 queles listados sob d) - i) como definidos acima, e

- opcionalmente, um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob j) - n) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivãdo dèum ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele30 cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, ΜΘΝ810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038 e MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacio14 nados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73,

T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A9 pode preferivelmente envolve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos que compreendem todos os ácidos nucleicos listados sob d) i) como definidos acima.

Em outras modalidades vantajosas, os métodos dos aspectos acima A1 a A8 podem desse modo adicionalmente também avaliar a presença ou ausência potencial em amostras de material derivado de eventos transgênicos pertencendo a outras taxonomias.

Consequentemente, nas modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico o) Or: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Oryza sativa; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende um, mais que um, ou todos os eventos de arroz LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes.

Em outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico

p) Bv: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Beta vulgaris; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende um, mais que um, ou todos os eventos de açúcar de beterraba T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos,ê évêhtõs reTãcíõnãdõs a estes.

Em ainda outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nu15 cleico q) Gs: um ácido nucléico derivado e específico para taxonomia de Gossypium; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende um, mais que um, ou todos os eventos de algodão LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes.

Em um outro desenvolvimento, a etapa (1) de quaisquer das modalidades do parágrafo precedente pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de um ou ambos ácidos nucleicos r) CrylAc: um ácido nucléico derivado do gene de proteína de cristais CrylAc de Bacillus thuringiensis e/ou s) Cry2Ab2: um ácido nucléico derivado do gene de proteína de cristais Cry2Ab2 de Bacillus thuringiensis; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) pode particularmente melhor detectar um ou ambos eventos de algodão MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos com outros eventos de algodão, e eventos relacionados a estes.

Em ainda outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico t) St: um ácido nucléico derivado e específico para taxonomia de Solanum tuberosum; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende o evento de batata EH92-527-1 e eventos relacionados a este.

Em um outro desenvolvimento, a etapa (1) de quaisquer das modalidades do parágrafo precedente pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucléico u) GBSS: um ácido nucléico derivado do gene de amido sintase ligada ao grânulo Gbss de Solanum tuberosum, melhorando também a confiança de detecção do material do dito evento EH92-527-1.

Será apreciado que os métodos precedentes podem ser executados errrvãriãscdmbiriãçõésadequadas, permitindo detectar eventos dese30 jados e reduzindo o esforço.

Desse modo, em um aspecto (A10), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de mate16 rial derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou óleo de semente de colza e/ou soja e/ou arroz e/ou açúcar de beterraba e/ou algodão e/ou batata compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu5 cleicos compreendendo ou consistindo em:

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob a), b), c), o), p) q) e t) como definidos acima, e

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima, e

- opcionalmente, um mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob j) - n), r) s) e u) como definidos acima, e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11,

Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122,

MIR604, LY038, MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; eventos T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; eventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531,

MON 15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; e evento EH92-527-1 e eventos relacionados a este.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A10 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos que compreendem todos õs ácidos nucleicos listados sob

d) - i) como definidos acima.

Em um aspecto preferido relacionado (A11), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou óleo de semente de colza e/ou soja e/ou arroz e/ou açúcar de beterraba e/ou algodão e/ou batata compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu5 cleicos compreendendo ou consistindo em:

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob a), b), c), o), p) q) e t) como definidos acima, e

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604 opcionalmente, LY038 e MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235 opcionalmente, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos;

eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; eventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; e evento EH92-527-1 e eventos relacionados a este.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A11 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos que compreendem todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima.

Prefèrivelmênté, êm quaisquer dos métodos dos aspectos acima

A1 a A11 ou de qualquer modalidade dos ditos aspectos, a presença ou ausência de ácidos nucleicos em uma amostra é detectada usando amplificação de amplicons compreendida nos respectivos ácidos nucleicos, tais co18 mo, preferivelmente usando PCR e, mais preferivelmente usando PCR de tempo real.

Para permitir uso eficiente de amplificação de PCR nos métodos acima, os presentes inventores meticulosamente procuraram e testaram ini5 ciadores e pares de iniciadores para selecionar os particularmente vantajosos nos ditos métodos.

Os pares de iniciadores preferidos identificados estão listados na Tabela 1. Eles requerem inter alia as vantagens significativas a seguir. Os iniciadores substancialmente exibem a mesma temperatura de anelamento ou satisfatoriamente similar, desse modo permitindo a amplificação de PCR nos ácidos nucléicos diferentes a ser executada nas mesmas condições de ciclagem de temperatura e consequentemente no mesmo aparelho. Isto facilita grandemente o processamento dos métodos e reduz a quantidade de trabalho, disponibilidades e aparelho necessários. Os pares de iniciadores produzem amplicons de cerca de 100 pb, e assim permitem amplificar os ácidos nucléicos alvos ainda das amostras em que o material genético está, em grande parte, fragmentado, como pode ser o caso para alimento ou ração processados. Os iniciadores e pares de iniciadores mostram especificidade adequada de amplificação, como também sensibilidade adequada para amplificação de tempo real. Além disso, para assegurar sensibilidade e uniformidade dos métodos e kits fornecidos pela invenção, os iniciadores e pares de iniciadores foram assim projetados para gerar, a 40 ciclos e usando 10000 cópias de um modelo, fluorescência de pelo menos 2500 unidades de fluorescência relativa (RFU) e em que os valores de fluorescência assim ge25 rados para os conjuntos de iniciador diferentes preferivelmente ficam dentro de uma margem de 3 vezes. Além disso, cada par de iniciadores foi assim projetado para amplificar nos respectivos ácidos nucléicos de substancialmente todos os eventos de interesse, apesar da existência de disparidades dê sequênciai põtéricTais (por exemplo, devido ao uso dê códori otimizado) nos ditos ácidos nucléicos entre tais eventos.

Tabela 1. Pares de iniciador vantajosos para detecção de ácidos nucleicos listados sob a) - i), o), p), q) e t) como definidos acima, por PCR.

Ácido Nucleico-Alvo	Iniciadores
Zm	Dir: 5' TCTCTTCCTCCTTTAGAGCTACCACTA 3’ (SEQ ID NO: 56) Rev: 5' AATCGATCCAAAGCGAGATGA 3' (SEQ ID NO: 57)
Bn	Dir: 5’ CAGCTCAACAGTTTCCAAACGA 3’ (SEQ ID NO: 24) Rev: 5' CGACCAGCCTCAGCCTTAAG 3' (SEQ ID NO: 25)
Gm	Dir: 5' AACCGGTAGCGTTGCCAG 3' (SEQ ID NO: 58) Rev': 5' AGCCCATCTGCAAGCCTTT 3' (SEQ ID NO: 59)
p35S	Dir: 5' AAAGCAAGTGGATTGATGTGATA 3' (SEQ ID NO: 60) Rev: 5' GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3’ (SEQ ID NO: 61)
tNOS	Dir: 5'-GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA-3' (SEQ ID NO: 9) Rev: 5-TTATCCTAGKTTGCGCGCTATATTT-3' (SEQ ID NO: 10)
CrylAb	Dir: 5-ACCGGTTACACTCCCATCGA-3' (SEQ ID NO: 11) Rev: 5'-CAGCACCTGGCACGAACTC-3' (SEQ ID NO: 12)
PAT/bar	Dir: 5'-CGTCAACCACTACATCGAGACAA-3' (SEQ ID NO: 13) Rev: 5-GTCCACTCCTGCGGTTCCT-3' (SEQ ID NO: 14)
PAT/pat	Dir: 5-CCGCGGTTTGTGATATCGTT-3' (SEQ ID NO: 15) Rev: 5-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3' (SEQ ID NO: 16)
CP4-EPSPS	Dir: 5' GCATGCTTCACGGTGCAA 3' (SEQ ID NO: 22) Rev: 5' GGACCTGTGGGAGATAGACTTGTC 3' (SEQ ID NO: 23) Rev 1: 5' TGAAGGACCGGTGGGAGAT 3’ (SEQ ID NO: 62) Rev 2: 5' TGAAGGACCTGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 63)
Or	Dir': 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGT 3' (SEQ ID NO: 51) Rev: 5' CTTAGCATAGTCTGTGCCATCCA 3' (SEQ ID NO: 21)
Bv	Dir: 5' GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG 3' (SEQ ID NO: 64) Rev: 5' GAGTAATTGCTCCATCCTGTTCA 3' (SEQ ID NO: 65)
Gs	Dir: 5' AGTTTGTAGGTTTTGATGTTACATTGAG 3' (SEQ ID NO: 66) Rev: 5' GCATCTTTGAACCGCCTACTG 3' (SEQ ID NO: 67)
St	Dir: 5' GGACATGTGAAGAGACGGAGC 3' (SEQ ID NO: 68) Rev: 5' CCTACCTCTACCCCTCCGC 3' (SEQ ID NO: 69)

Consequentemente, a invenção fornece métodos como definidos em qualquer um dos aspectos acima A1 a A11 ou em qualquer modali5 dade dos ditos aspectos, em que a presença ou ausência dos ácidos nuclei20 cos dentre aqueles listados sob a) - i), o), p), q) e t) como definidos acima em uma amostra é detectada usando amplificação de PCR usando os respectivos pares de iniciadores como mostrados na Tabela 1.

Onde a Tabela 1 listas mais que um iniciador direto e/ou reverso 5 para amplificação em um certo ácido nucléico (tal como, por exemplo, para CP4-EPSPS), qualquer um ou qualquer combinação do(s) dito(s) iniciador(es) direto(s) pode ser usada junto com qualquer um ou com qualquer combinação do(s) dito(s) iniciador(es) reverso(s) para obter amplificação.

Deve-se apreciar que embora as sequências de iniciadores lis10 tados na Tabela 1 tenha sido aperfeiçoada para prover amplificação ótima, os métodos presentes podem desempenhar-se adequadamente quando usar os iniciadores variantes que exibem um certo grau restrito de variação de sequência vis-à-vis os iniciadores na Tabela 1.

Consequentemente, os aspectos acima e outras modalidades 15 abrangem métodos em que os ácidos nucleicos de interesse são detectados por amplificação de PCR usando iniciadores variantes que incluem uma ou mais das variações de sequência vis-à-vis os iniciadores correspondentes listados na Tabela 1, tais como, por exemplo, uma ou mais deleção, inserção e/ou substituição, desde que tais iniciadores variantes/pares de iniciadores ainda possam alcançar amplificação adequada de seus respectivos amplicons. Preferivelmente, tais iniciadores variantes mostrariam pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequên25 cia aos iniciadores listados na Tabela 1. Alinhamentos de sequência e determinação de identidade de sequência podem ser feitos, por exemplo, usando a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) originalmente descrito por Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10), tal como o algoritmo de sequências de BÍast 2 descrito por Tatusova e Madden 1999 (FÉMS Mí30 crobiol Lett 174: 247-250).

Deve-se também apreciar que os iniciadores listados na Tabela ou variantes dos mesmos podem ser vantajosamente derivatizados. Por exemplo, os ditos iniciadores ou variantes dos mesmos podem ser marcados para permitir a detecção dos produtos amplificados, tais como, por exemplo, em aplicações de PCR de tempo real. Consequentemente, tal derivatização pode, por exemplo, requerer introduzir uma ou mais metade de marcação e/ou uma ou mais metade auxiliar (por exemplo, uma metade de extinção, uma metade FRET etc), e opcionalmente onde requerido modificar a sequência de iniciador para permitir a introdução e/ou funcionamento apropriado da dita proção ou porções. Uma pessoa versada na técnica é em geral instruída acerca dos modos para modificar os iniciadores e pares de inicia10 dores para propósitos de marcação. O uso de iniciadores e pares de iniciadores assim derivatizados pode ser particularmente útil em PCR de tempo real, e particularmente onde dois ou mais produtos de amplificação diferentemente marcados serão seguidos nas reações de amplificação multiplexadas.

Consequentemente, os aspectos acima e outras modalidades abrangem métodos onde os ácidos nucleicos de interesse são detectados por amplificação de PCR usando derivados dos iniciadores e pares de iniciadores listados na Tabela 1 ou de variantes dos mesmos.

Por meio de um exemplo, em um aspecto preferido (A12), a in20 venção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica (em particular um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou óleo de semente de colza e/ou soja e/ou arroz e/ou açúcar de beterraba e/ou algodão e/ou batata) compreendendo as etapas de:

(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em:

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados daqueles listados sob a), b), c), o), p) q) e t) como definidos acima, e

- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados cía30 queles listados sob d) - i) como definidos acima; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele22 cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt1O, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604 opcionalmente, LY038 e MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8,

GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235 opcionalmente, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacio10 nados dos mesmos; eventos T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; eventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; e evento EH92-527-1 e eventos relacionados a este, em que na etapa (1) a presença ou ausência de ácidos nuclei15 cos em uma amostra é detectada usando amplificação de PCR usando os respectivos iniciadores e pares de iniciadores como mostrados na Tabela 1, ou variantes ou derivados dos mesmos.

Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A12 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos que compreendem todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima. Em uma modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A12 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo pelo menos ácidos nucleicos listados sob a) - i) como definidos acima.

Em um aspecto, a invenção também fornece iniciadores e pares de iniciadores e variantes ou derivados dos mesmos adequados para amplificação de amplicons de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima. Em particular, em vista do esforço signifícãtivõ investido peíos presentes inventores para a identificação dos pares de iniciadores listados na Tabela 1, a invenção fornece os iniciadores e pares de iniciadores listados na Tabela 1, como também variantes e derivados dos mesmos, opcionalmente em qualquer combinação adequada dos ditos iniciadores e/ou pares de iniciadores ou variantes ou derivados dos mesmos.

Adicionalmente, a invenção também fornece produtos de amplificação obteníveis usando os iniciadores preferidos e pares de iniciadores, vetores e plasmídeos compreendendo os ditos produtos de amplificação, e micro-organismos recombinantes transformados e abrigados pelos ditos vetores e plasmídeos.

Por conseguinte, nas modalidades preferidas, a invenção também refere-se a E. coli recombinante como depositado sob o Tratado de Budapeste com a Belgian Coordinated Coilections of Micro-organisms (BCCM),

Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie (BCCM/LMBP) (Universiteit Gent, Technologiepark 927, B-9052 Gent-Zwijnaarde, Bélgica) em 10 de janeiro de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP 5458, LMBP 5459 e LMBP 5460, em 6 de março de 2007 sob o número de acesso de LMBP LMBP 5451, e em 19 de abril de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 e LMBP 5590, como também a plasmídeos recombinantes isolados obteníveis do dito E. coli recombinante, como também a inserções isoladas dos ditos plasmídeos, preferivelmente inserções de EcoRI-EcoRI isoladas dos mesmos.

Tais plasmídeos ou vetores ou inserções dos mesmos, e suas combinações, são particularmente úteis como controles positivos, referências e/ou calibradores para os respectivos amplicons nas reações de amplificação dos métodos acima.

Além disso, a invenção também abrange kits compreendendo um ou mais reagentes úteis nos métodos de um ou mais dos aspectos e modalidades acima. Por exemplo, tais kits podem compreender um ou mais dos iniciadores e/ou pares de iniciadores acima, particularmente como listados na Tabela 1, ou variantes ou derivados dos ditos iniciadores, e/ou um ou mãisrdõsprõdütos de amplificação, vetores ou plasmídeos acima compreen30 dendo tais, ou inserções dos ditos vetores ou plasmídeos, e/ou um portador de dados compreendendo instruções para um dispositivo de computação programável para realizar a etapa (2) dos métodos da invenção (vide abai24 xo). Tais kits podem também convenientemente conter instruções para o usuário executar os métodos da invenção e interpretar os dados assim obtidos.

A invenção também ensina um modo descomplicado e direto pa5 ra executar a etapa (2) dos aspectos e modalidades acima, isto é, concluir a presença ou ausência potencial na amostra de material derivado dos vários eventos de planta transgênica de interesse. Em particular, os resultados adquiridos para uma amostra na etapa (1) dos aspectos e modalidades acima são representadas como um conjunto Gsam consistindo em, isto é, repre10 sentando uma coletânea de, aqueles ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima que foram detectados na dita etapa (1) como estando presente na amostra (etapa (0).

Além disso, qualquer evento de planta transgênica de interesse pode ser representado como um conjunto Gx (onde X designa o evento de interesse), consistindo em, isto é, representando uma coletânea de, aqueles ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima que são encontrados no dito evento e desse modo seriam detectados na etapa (1) se a amostra contivesse o material derivado do dito evento, ou um cruzamento envolvendo tal, ou um evento relacionado (etapa (ii)).

Em modalidades exemplares particulares, o conjunto Gx pode ser preferivelmente selecionado de conjuntos que especificamente representam os eventos citados acima, por exemplo, conjuntos compreendendo: con25 juntos de evento de milho Gsh76 € {Zm; p35S; CrylAb; PAT/bar}, Getn e {Zm; p35S; tNOS; CrylAb; PAT/pat}, G_Kio e {Zm; p35S; tNOS; CrylAb; PAT/pat}, Gmon8io e {Zm; p35S; tNOS; CrylAb}, Gmon863 <= {Zm; p35S; tNOS}, Gtci507 ^g {Zm; p35S; PAT/pat}, Gnk603 ε {Zm; p35S; tNOS; CP4EPSPS}, G_T25 e {Zm; p35S; PAT/pat}, G_GA2i e {Zm; tNOS}, G_Das-59122 e {Zm;

p35S; PAT/bar}, G_Mir₆04 € {Zm; tNOS; mCry3A}, Glyoss € {Zm; p35S; tNOS;

cordapA; Glb1}, e Gmon88017 £ {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS, Cry3Bb1}, conjuntos de evento de óleo de semente de colza Gropas 19/2 e {Bn; p35S;

PAT/pat}, Gmsi e {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_RFi e {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_RF2 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, Gmsi/rfi g {Bn; tNOS; PAT/bar}, Gmsi/rf₂ e {Bn; tNOS;

PAT/bar}, Gmss e {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_RF3 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, Gms8/rf3 g {Bn; tNOS; PAT/bar}, Gqtts e {Bn; CP4-EPSPS}, G_T45 e {Bn; p35S;

PAT/pat}, GuberatorpHoe6/Ac e {Bn; p35S; PAT/pat}, GGS40/90pHoe6/Ac £ {Bn; p35S; PAT/pat}, G0XY235 e {Bn; p35S; Bxn}; conjuntos de evento de soja Gmon40-3-2 e {Gm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, Gmon89788 e {Grn; CP4-EPSPS}, GA2704-12 g {Gm; p35S; PAT/pat}, e GA5547-127 e {Gm; p35S; PAT/pat}, conjunto de evento de arroz G_Li_62 e {Or; p35S; PAT/bar}, G_Llo6 e {Or; p35S; PAT/bar} e

G_Li_6oi e {Or; p35S; tNOS; PAT/bar}, conjunto de evento de açúcar de beterraba GT120-7 e {Bv; p35S; PAT/pat}, G_H7-1 e {Bv; p35S; CP4-EPSPS}, e G_A5-is g {Bv; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, conjunto de evento de algodão Gll cotton 25 G {Gs; p35S; tNOS; PAT/bar}, G_MOni445 e {Gs; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, Gmon53i e {Gs; p35S; tNOS; crylAc} e G_Moni5985 e {Gs; p35S; tNOS; crylAc;

cry2Ab2}, e conjunto de evento de batata Geh92-527-i e {St; tNOS; Gbss}; em que as designações entre chaves {} referem-se àqueles ácidos nucleicos como listados sob a) - u) acima que são encontrados em tais eventos e podem ser desse modo detectados nos materiais derivados dos mesmos. Será entendido que se a etapa de detecção (1) envolver ácidos nucleicos adicio20 nais diferentes daqueles listados sob a) - u) acima, tais ácidos nucleicos podem ser vantajosamente inclusos nos conjuntos acima.

Será entendido que onde os métodos acima não testam a presença de todos os ácidos nucleicos sob a) - u) acima, os conjuntos de amostra como também os conjuntos de evento podem ser definidos em termos daqueles ácidos nucleicos a presença destes é eficazmente testada. Por meio de exemplo e não-limitação, onde a presença dos ácidos nucleicos listados sob j) - n), r) s) e u) como definidos acima, que correspondem aos traços específicos além daqueles definidos sob d) - i), não for testada, então os conjuntos que correspondem aos vários eventos podem ser definidos de uma maneira mais estreita, em particular: conjuntos de evento de milho

Gmir604 ε {Zm; tNOS}, Glyo38 θ {Zm; p35S; tNOS}, Gmonssoi? e {Zm, p35S, tNOS; CP4-EPSPS}; conjuntos de evento de óleo de semente de colza

Goxy235 e {Βη; p35S}; conjuntos de evento de algodão Gmonõ3i e {Gs; p35S;

tNOS}, Gmoni5985 e {Gs; p35S; tNOS}; e conjuntos de evento de batata

Geh92-527-i e {St; tNOS}.

Consequentemente, a presença de material derivado de um e5 vento X de interesse na amostra pode ser depois determinada executando o respectivo conjunto de operações lógicas de interesse Gx como segue (iii da etapa):

- se Gx for igual a Gsam (Gx = Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se Gx for um subconjunto apropriado de Gsam (Gx <= (Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se Gx não for igual a Gsam e Gx não for um subconjunto apropriado de Gsam, (Gx Gsam e Gx <z Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.

Em modalidades preferidas, estas operações lógicas podem ser vantajosamente realizadas por um dispositivo de computação.

Será apreciado que embora o algoritmo acima para uso na etapa (2) dos métodos presentes seja aqui explicado com relação a concluir a presença de material de certos eventos usando detecção de ácidos nucleicos particulares, o dito algoritmo é em princípio facilmente aplicável a méto25 dos que visam concluir a presença de qualquer evento, tal como eventos diferente ou adicionais àqueles especificamente mencionados acima, usando detecção de qualquer ácido nucleico, tal como ácidos nucleicos diferentes ou adicionais àqueles listados sob a) - u) acima.

Estes e outros aspectos e modalidades preferidas da invenção são descritos nas seções a seguir e nas reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 (A-F) ilustra sequências de amplicons amplificados se27 lecionados usando os conjuntos de iniciadores listados na Tabela 4 e presentes nos vetores de clonagem, particularmente em pUC18, tais como os plasmídeos listados na Tabela 5. Como pode ser apreciado, as sequências podem incluir sequências parciais de sítios de clonagem múltiplos flanque5 ando os amplicons inseridos.

Figura 2 (A) resulta do teste de PCR de multiplexação para p35S/tNOS, (B) Curva de dissociação do teste de multiplexação específico para p35S/tNOS.

Figura 3 fornece representação gráfica dos dados usando có10 pias de modelo +/- 8300 como listadas na Tabela 8.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como aqui usado, as formas singulares um, uma, e o/a incluem referentes singulares e plurais a menos que o contexto claramente declare do contrário.

Os termos compreendendo, compreende e compreendido de, como aqui usado, são sinônimos com incluindo, inclui ou contendo, contém, e são inclusivos ou ilimitados e não excluem membros, elementos ou etapas de método não-citados adicionais.

O termo cerca de, como aqui usado, quando referir-se a um valor mensurável tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal, e similares, é significado abranger variações de +/-20% ou menos, preferivelmente +/-10% ou menos, mais preferivelmente +/-5% ou menos, até mesmo mais preferivelmente +/-1% ou menos, e ainda mais preferivelmente +/-0,1% ou menos de e a partir do valor especificado, desde que tais variações sejam apropriadas para executarem-se na invenção descrita. É para ser entendido que o valor ao qual o modificador cerca de refere-se é também especificamente, e de preferência, descrito.

A citação de faixas numéricas através de pontos finais inclui todos bs números e frações subsomadas dentro daquela faixa, como também os pontos finais citados.

Todos os documentos citados no presente relatório descritivo são por este meio incorporados por referência em sua totalidade. Em parti28 cular, os ensinamentos de todos os documentos aqui especificamente referidos são incorporados por referência.

Consequentemente, em alguns aspectos, mais particularmente aspectos A1 - A12 como descritos na seção Sumário, a invenção diz respei5 to aos métodos para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica compreendendo as etapas de (1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em um, mais que um ou tudo (a escolha particular dependendo da meta de um ensaio dado) de ácidos nucleicos listados sob a) - u) na seção Sumário, e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em alguns ou todos daqueles detalhados na seção Sumário.

Um evento de planta transgênica ocorre com uma transforma15 ção independente das células da planta com ácido nucléico heterólogo, tipicamente uma construção de ácido nucléico compreendendo um ou mais transgenes de interesse; regeneração de uma população de plantas resultantes de uma inserção da construção ou uma parte da mesma incluindo o(s) dito(s) transgene(s) de interesse no genoma das plantas; e seleção de uma planta particular caracterizada pela dita inserção em uma ou mais, preferivelmente uma, localização de genoma particular. O termo evento de planta transgênica desse modo abrange a planta transformante assim selecionada original, como também qualquer progênie sucessiva da mesma compreendendo o ácido nucléico inserido incluindo o(s) transgene(s) de inte25 resse; por exemplo, a dita progênie pode ser hemizigota ou homozigota para a dita inserção; a dita progênie pode ser obtida, por exemplo, através de propagação vegetativa ou através de cruzamento sexual.

O termo planta, como aqui usado, em geral abrange células da planta; protoplastos dã planta; tecidos da píanta; células da planta ou cultura de tecido da qual um organismo de planta pode ser regenerado; caules ou aglomerações da planta; organismos da planta e partes da mesma, tal como, sem limitação, flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, fruta, pericarpo, vagens, folhas, petíolos, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos, brotos, e similares. O termo como aqui usado em geral abrange plantas de quaisquer taxonomias classificadas na técnica dentro do reino Plantae. Além disso, planta como entendido aqui pode preferivelmente per5 tencer às plantas terrestres (embriófitos) incluindo, sem limitação, plantas não-vasculares (briófitos) e plantas vasculares (traqueófitos); mais preferivelmente, às plantas vasculares (traqueófitos) incluindo, sem limitação, licopodiófita, equisetófita, pteridófita, psilotófita, ofioglossófita, e plantas de semente (espermatófitos); até mesmo mais preferivelmente às plantas de se10 mente (espermatófitos) incluindo, sem limitação, plantas portando sementes (gimnospermas) tais como, por exemplo, pinófita, cicadófita, ginkgófita e gnetófita e plantas florescentes (angiospermas) tais como magnoliófita, incluindo monocotiledônea (Liliopsida) e dicotiledônea (Magnoliopsida). Plantas preferidas podem ser as comumente aplicadas em agricultura ou horticultu15 ra. Por meio de exemplo e não-limitação, plantas de plantação preferidas podem incluir milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, tabaco, tomate, batata, óleo de semente de colza (semente colza), soja, açúcar de beterraba, ervilha, girassol, algodão, amendoim, flores (por exemplo, cravo) etc.

O termo material em geral refere-se à substância física. O ter20 mo material derivado de um evento de planta transgênica abrange o evento de planta transgênica como tal, incluindo, por meio de exemplo e nãolimitação, o organismo do evento de planta transgênica; qualquer parte do organismo do evento de planta transgênica, tal como, por exemplo, flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, frutas, pericarpo, va25 gens, folhas, petíolos, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos ou brotos, ou porções dos mesmos; células, protoplastos, tecidos, caules ou aglomerações do evento de planta transgênica; ou material obtido submetendo qualquer do acima a uma ou mais etapas de processamento a jusante. Estas _etap_asde.processamento a jusante podem compreender qualquer ação u30 sada para processar os materiais de planta particulares em agricultura, horticultura ou em quaisquer indústrias a jusante, por exemplo, indústria alimentícia incluindo indústria de bebida, indústria de ração, indústria têxtil (por e30 xemplo, algodão, linho, bambu etc), indústria de combustível (por exemplo, óleo de semente de colza), indústria de lubrificante (por exemplo, óleo de rícino), indústria de tinta (por exemplo, óleo de linhaça, óleo de tung), indústria de cosméticos e farmacêutica etc.

Por meio de exemplo e não-limitação, tal processamento a jusante pode incluir colheita; remoção das camadas externas indesejadas, por exemplo, descascamento, retirada da pele etc; secagem, por exemplo, secagem ao ar, secagem ao sol, secagem por pulverização, secagem por congelação, concentração de suco etc; diminuição, por exemplo, moagem, tritu10 ração, corte, fatiamento etc; liquefação, por exemplo, coleta de suco; preservação, por exemplo, engarrafamento a vácuo, estanhagem, enlatamento, pasteurização, adição de conservantes etc; pressão, por exemplo, coleta de óleo; hidrogenação, por exemplo, saturação do óleo vegetal; maceração; emulsificação; tratamento térmico, por exemplo, cozimento, cozimento por pressão, cozimento a vapor, assadura em forno, defumação, fritura, grelhar etc; fermentação, por exemplo, através de levedura, bactérias e/ou fungos; congelação; e similares.

O termo amostra, como aqui usado, refere-se amplamente a uma parte representativa ou fração de um material maior todo sendo apre20 sentado para inspeção, tal como, por exemplo, para controle de qualidade. Preferivelmente, uma amostra a ser examinada pelos métodos da invenção pode ser suspeita de potencialmente compreender material derivado de um ou mais eventos transgênicos de interesse. Por meio de exemplo, tal suspeita pode existir para qualquer amostra representativa de material que é co25 nhecido como compreendendo, ou suspeito de provável ou possivelmente compreender, plantas ou partes das mesmas ou material derivado delas. Em um exemplo preferido, a amostra pode ser representativa de material que é conhecido como compreendendo, ou suspeito de provável ou possivelmente compreender, plantas ou partes das mesmas ou material derivado delas, em que as ditas plantas ou partes das mesmas pertencem à mesma taxonomia como um evento transgênico de interesse cuja presença na amostra é para ser examinada. Por exemplo, uma amostra pode ser representativa de plan31 tas ou partes das mesmas, por exemplo, plantas colhidas ou ceifadas ou partes das mesmas (tais como, sem limitação, frutas, sementes, vagens, flores etc), ou representativa de um material intermediário ou final obtido aplicando um ou mais etapas de processamento a jusante a este, ou de pro5 dutos compreendendo tal material, por exemplo, de produtos processados de alimento ou ração.

Consequentemente, em uma modalidade a amostra pode compreender plantas ou partes das mesmas, incluindo flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, frutas, pericarpo, vagens, folhas, petío10 los, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos ou brotos, ou porções das mesmas, células da planta, protoplastos da planta e/ou tecidos da planta, e/ou material derivado da planta, preferivelmente material de alimento ou ração, incluindo material processado de alimento ou ração.

Os métodos da invenção detectam a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos, isto é, de material genético e preferivelmente DNA genômico, originando ou derivado dos eventos de planta transgênica de interesse. A presença ou ausência de tais ácidos nucleicos são indicativas, respectivamente, da presença ou ausência na amostra deste material e potencialmente outro derivado dos respectivos eventos de planta transgêni20 ca; tal como, por exemplo, materiais copurificadores ou cosseparadores com os ditos ácidos nucleicos durante as várias etapas de processamento aplicadas aos eventos de planta transgênica.

É conhecido que os ácidos nucleicos, e particularmente DNA genômico, são comparavelmente duráveis e podem tolerar uma variedade de etapas de processamento aplicadas aos materiais de planta na agricultura e indústria, por exemplo, em indústria de alimentos ou ração, de modo que as moléculas de DNA de comprimentos que permitem detecção sequência-específica dos mesmos podem ser encontradas seguindo tais etapas e até mesmo nos produtos finais.

Consequentemente, uma amostra preferida da invenção compreende ácidos nucleicos, mais preferivelmente DNA genômico, até mesmo mais preferivelmente DNA genômico tendo pelo menos tamanhos que permi32 tem detecção específica para sequência do mesmo, tal como, por exemplo, em média, pelo menos cerca de 20 pb, por exemplo, pelo menos cerca de 30 pb, preferivelmente pelo menos cerca de 50 pb, por exemplo, pelo menos cerca de 75 pb, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 pb, por e5 xemplo cerca de 150 pb, ou até mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 200 pb, ou pelo menos cerca de 300 pb, ou pelo menos cerca de 500 pb, ou pelo menos cerca de 1 kb, ou mais.

Embora possa ser assumido que a maioria das etapas de processamento às quais um evento de planta transgênica seria comumente exΊΟ posto na prática manteriam os ácidos nucleicos detectáveis como acima no produto eventual, e desse modo na amostra dos mesmos a ser examinada, os inventores também tencionam um controle positivo visado para verificar se a dita amostra compreende os ácidos nucleicos detectáveis derivados de planta.

Em particular, o método da invenção pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de um ácido nucleico derivado de planta genérica. Em uma modalidade preferida, tal ácido nucleico derivado de planta genérica é derivado de um gene presente e preferivelmente altamente conservado (por exemplo, > 80%, preferivelmente > 90%, mais preferivelmente > 95%, até mesmo mais preferivelmente > 96%, > 97%, > 98% ou > 99% de identidade de sequência) entre várias taxonomias de planta; preferivelmente pelo menos dentro dos espermatófitos; ou pelo menos dentro dos angiospermas, tais como entre e/ou dentro da monocotiledônea e dicotiledônea; ou preferivelmente pelo menos entre taxonomias de planta comumente usadas na agricultura e indústria, tal como, sem limitação, entre milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, tabaco, tomate, batata, óleo de semente de colza (colza), soja, açúcar de beterraba, ervilha, girassol, algodão, amendoim e flores (por exemplo, cravo); ou preferivelmente pelo menos entre as taxonomias de planta compreendendo ou consistindo naqueles even30 tos em planta transgênica testados na amostra.

Em modalidades preferidas, o dito ácido nucleico derivado de planta genérica é derivado da subunidade pequena cloroplástica de gene

Rubisco ou do gene CHL-tRNA sintetase.

Como mencionado, os métodos da invenção incluem na etapa (1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em um, mais que um ou todos daqueles listados sob a) - u) na seção Sumário. O termo detectar ou detecção, como aqui usado, abrange quaisquer meios de determinar a presença ou ausência de um ácido nucleico dado na amostra.

Preferivelmente, a presença de uma molécula de ácido nucleico particular em uma amostra pode ser detectada usando um ou mais reagen10 tes especificamente hibridando com a(s) respectiva(s) sequência(s) de nucleotídeo compreendida(s) dentro da dita molécula de ácido nucleico.

Os termos hibridação e hibridar com referem-se a um processo pelo qual um filamento de ácido nucleico anela-se com a(s) sequenciais) complementar(es) ou substancialmente complementar(es) compreen15 dida(s) no mesmo filamento de polinucleotídeo ou outro através pareamento de base, preferivelmente pareamento de base de Watson-Crick.

Os termos complementar e complementaridade referem-se à ligação normal dos polinucleotídeos sob condições salinas permissivas (resistência iônica) e de temperatura através de pareamento de base, preferi20 velmente pareamento de base de Watson-Crick. Por meio de exemplo, pareamento de base de Watson-Crick complementar ocorre entre as bases A e T, A e U ou G e C. Por exemplo, a sequência A-G-T (isto é, 5'-A-G-T-3') é desse modo sequência complementar A-C-T (isto é, 5'-A-C-T-3').

O grau de complementaridade de um filamento de ácido nucle25 ico (A) para um filamento de ácido nucleico (B) pode ser expressado como a proporção (porcentagem) dos nucleotídeos do filamento de ácido nucleico (A) que seriam esperados parear, isto é, formar pareamento de base de Watson-Crick, com nucleotídeos do filamento de ácido nucleico (B), quando os ditos filamentos de ácido nucleico (A) e (B) forem anelados, preferivel30 mente em condições de severidade alta.

Complementar, como aqui usado, desse modo refere-se a completamente complementar, de modo que todos respectivos nucleotídeos dos filamentos de ácido nucleico se ligariam quando os filamentos anelassem. Por meio de exemplo, um filamento de ácido nucleico relativamente mais curto mostraria complementaridade total para um filamento de ácido nucleico relativamente mais longo, se o filamento posterior compreendesse uma sequência completamente complementar à sequência do filamento anterior. Substancialmente complementar refere-se a em grande parte mas não completamente complementar, em particular, para pelo menos 85% complementar, por exemplo, pelo menos 90% complementar, preferivelmente pelo menos 95% complementar, por exemplo, pelo menos 96%, 97%,

98% ou pelo menos 99% complementar.

Especificamente híbrida com e hibridação específica reflete uma situação quando um reagente hibrida com a uma sequência dada mais facilmente que hibridaria com uma sequência não-relacionada aleatória. Por exemplo, um reagente especificamente hibridando com uma sequência de nucleotídeo dada (A) preferivelmente exibe pouca ou nenhuma hibridação com outros polinucleotídeos, e preferivelmente com homólogos ou ortólogos da sequência de ácidos nucleicos (A), sob condições onde especificamente hibridaria com o dito polinucleotídeo (A).

Preferivelmente, reagentes que podem especificamente hibridar com a(s) respectiva(s) sequência(s) de nucleotídeo compreendida(s) dentro das moléculas de ácido nucleico listadas sob a) - u) acima podem ser sondas ou iniciadores.

Uma sonda é um ácido nucleico isolado ao qual é desejavelmente ligado uma marcação detectável ou porção repórter, por exemplo, um isótopo radioativo (por exemplo, ³²P, ³³P), ligante, agente quimiluminescente, fluoroforo (por exemplo, fluoresceína, tetracloro-fluoresceína, TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Texas Red etc), vitamina (por exemplo, biotina), esteróide (por exemplo, digoxina), enzima (por exemplo, HRP, AP etc) etc. Uma tal sonda é complementar ou substancialmente complementar a uma sequência compreendida em um filamento de um ácido nucleico-alvo, no caso da presente invenção, de um ácido nucleico, preferivelmente DNA genômico, listado sob a) - u) acima. Sondas de acordo com a presente inven35 ção podem ser ácidos desoxirribonucleicos, ácidos ribonucleicos, ou ácidos nucleicos compreendendo tanto deoxirribo como ribonucleotídeo; podem compreender bases-padrão de purina e/ou pirimidina (A, G, T, C, U e/ou I), mas também outras bases de nucleotídeo naturais, química ou bioquimica5 mente modificadas (por exemplo, metiladas), não-naturais, ou derivatizadas; podem incluir cadeia principal compreendendo açúcares e grupos fosfato, como podem tipicamente ser encontrados no RNA ou DNA, como também um ou mais açúcares modificados ou substituídos (tais como, 2'-O-alquilado, por exemplo, 2'-O-metilado ou 2'-O-etilado; ou 2'-O,4'-C-alquinelado, por e10 xemplo, 2'-O,4'-C-etilado) ou um ou mais grupos fosfato modificados ou substituídos - por exemplo, análogos de cadeia principal nos ácidos nucleicos podem incluir fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alquila, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno (metilimino), 3'-N-carbamato, carbamato de morfolino, e ácidos nucleicos de pep15 tídeo (PNAs).

Sondas podem ser pelo menos 10 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 14 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente pelo menos 15 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18 ou pelo menos 19 nucleotídeos em comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, ou pelo menos 24 nucleotídeos em comprimento, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100 ou pelo menos 200 ou mais nucleotídeos em comprimento.

Iniciadores são ácidos nucleicos isolados, preferivelmente ácidos desoxirribonucleicos ou, em outros exemplos preferidos, ácidos ribonucleicos ou PNAS, complementares ou substancialmente complementares a uma sequência compreendida em um ácido nucleico-alvo (no caso da presente invenção, para uma sequência compreendida em um ácido nucléico, preferivelmente DNA genômico, compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima), que podem ser anelados ao dito ácido nucleicoalvo e podem agir como um ponto de iniciação da síntese de um produto de extensão de iniciador na presença dos nucleotídeos e um agente para polimerização de ácido nucleico, tal como polimerase DNA-dependente ou RNA5 dependente.

Um iniciador necessita ser suficientemente longo para preparar a síntese de uns produtos de extensão na presença de um agente para polimerização. Um iniciador típico pode ser desse modo pelo menos 10 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 14 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente pelo menos 15 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18 ou pelo menos 19 nucleotídeos em comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos em comprimento. Outros iniciadores preferidos são entre cerca de 10 e cerca de 40 nucleotí15 deos em comprimento, mais preferivelmente entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, o mais preferivelmente entre cerca de 20 e cerca de 25 nucleotídeos muito tempo.

Pares de iniciador referem-se às combinações de iniciadores que são adequadas para amplificação de amplicons de dentro dos ácidos nucleicos alvos (no caso da presente invenção, de dentro dos ácidos nucleicos, preferivelmente DNA genômico, compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima) através dos métodos de amplificação de ácido nucleico adequados. Consequentemente, a habilidade para amplificar um amplicon de dentro de um ácido nucleico-alvo dado usando um par de inici25 adores projetado para especificamente hibridar dentro do dito ácido nucleicoalvo indica a presença (e quantidade opcionalmente) do dito ácido nucleicoalvo na amostra.

Métodos exemplares mas não-limitativos para preparar e usar sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em MõTéculãr Cloning: A

Laboratory Manual, 2^a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook el al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 (Sambrook etal. 1989); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing e Wiley-lnterscience, Nova Iorque, 1992 (com atualizações periódicas) (Ausubel et al. 1992); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pares de iniciador de PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, usando programas de computação intencionados para aquele propósito tal como Iniciador 3 (Rozen e Skaletsky. 2000. Iniciador 3 na WWW para usuários gerais e para programadores biólogos. Em: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 365-386) ou o pacote GCG® v. 11.1.2 de Accel10 rys.

Hibridização específica das sondas, iniciadores ou pares de iniciadores da invenção para suas respectivas sequências complementares dentro dos ácidos nucleicos alvos, por exemplo, aqueles compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima, pode ser preferivelmente alcançada sob condições de hibridação de severidade alta.

Condições de severidade alta incluem condições equivalentes às condições exemplares a seguir para ligar ou hibridar a 65°C em uma solução que consiste em 5 x SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH₂PO4.H₂O e 1,85 g/l EDTA, pH ajustado em 7,4 com NaOH), 0,1% SDS, 5 x reagente de De20 nhardfs (50 x Denhardfs contêm por 500 ml: 5 g Ficoll (Tipo 400, Pharmacia), 5 g BSA (Fração V; Sigma) e 100 pg/ml DNA de esperma de salmão desnaturado), seguido lavando em uma solução compreendendo 5 x SSPE, 0,1% SDS a 65°C quando uma sonda de cerca de 500 nucleotídeos em comprimento for empregada. Outras condições exemplares para hibridação em severidade alta para as sequências de ácido nucleico em aproximadamente 20 a 100 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente aproximadamente 30 a 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, entre 30 a 50 nucleotídeos em comprimento, incluem condições equivalentes à hibridação em 6 x SSC a 45°C, seguido por um ou mais lavagens êm 0,2 x SSC, 0,1 %

SDS ou mesmo 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 65°C. Numerosas condições equivalentes podem ser empregadas para variar as condições de severidade;

fatores tais como o comprimento e natureza (DNA, RNA, composição de ba38 se) da sonda e natureza do alvo (DNA, RNA, composição de base, presentes na solução ou imobilizados etc) e a concentração dos sais e outros componentes (por exemplo, a presença ou ausência de formamida, sulfato de dextrana, polietileno glicol) são considerados e a solução de hibridação pode ser variada para gerar condições de hibridação de severidade baixa ou alta diferentes mas equivalentes às condições acima listadas. Além disso, a técnica sabe as condições que promovem hibridação sob condições de severidade alta (por exemplo, aumentando a temperatura das etapas de hibridação e/ou lavagem, o uso de formamida na solução de hibridação etc.). Orien10 tação para executar reações de hibridação pode ser encontrada, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1989, e edições atualizadas mais recentes, todos destas são incorporadas por referência.

Com relação à amplificação de amplicons de dentro dos ácidos nucleicos alvos usando pares de iniciadores, condições rigorosas ou condições de severidade alta são condições que permitem um par de iniciadores hibridar com apenas sua respectiva sequência de ácido nucleico-alvo e produzir um único produto de amplificação, isto é, o amplicon, substancialmente sem produzir produtos de amplificação não-intencionados, isto é, não20 específicos. Por exemplo, preferivelmente menos que 20%, mais preferivelmente menos que 10%, até mesmo mais preferivelmente menos que 5%, por exemplo, menos que 4%, menos que 3%, ou menos que 2%, ainda mais preferivelmente menos que 1%, por exemplo, menos que 0,1% ou menos que 0,01% da quantidade total (por exemplo, peso) do produto de amplifica25 ção em uma reação de amplificação seria não-específico quando tal reação for executada em condições rigorosas (por exemplo, como analisada por eletroforese em gel quantitativa, ou por determinação da Tm, ou similares).

Qualquer método convencional pode ser usado para detectar hibridação específica de uma sonda com um ácido nucleico-alvo na amostra.

Por exemplo, ácidos nucleicos, preferivelmente DNA, de uma amostra pode ser imobilizado e desnaturado em um suporte sólido e assim hibridado com as respectivas sondas (por exemplo, Southern blotting, slot blotting, dot blotting etc.). Se uma sonda - e por conseguinte sua marcação detectável for retida no suporte sólido, isto indica que o alvo nucléico para o qual a sonda é específica está presente na amostra.

Similarmente, qualquer método de amplificação de ácido nuclei5 co existente pode ser usado para amplificar amplicons de dentro das sequências-alvo de interesse, assim indicando a presença das sequências-alvo correspondentes na amostra: incluindo mas não-limitados à reação em cadeia de polimerase (PCR) (US 4.683.202; US 4.965.188), amplificação de deslocamento de filamento (SDA) (US 5.455.166; EP 0684315), LCR, TAS,

3SR, NASBA (US 5.409.818; EP 0329822), RCA e amplificação Q-beta.

Em uma modalidade particularmente preferida, os métodos da invenção empregam reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar os amplicons de dentro dos ácidos nucleicos alvos selecionados compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima. Os termos reação em cadeia da polimerase e PCR amplamente abrangem qualquer método referido como tal na técnica e em particular métodos para amplificação de sequências de ácido nucleico-alvo, especialmente sequências de DNA-alvo, usando polimerase(s) de DNA estável(is) ao calor e dois iniciadores, especialmente iniciadores de oligonucleotídeo, um complementar ao (+)-filamento em uma extremidade da sequência a ser amplificada e o outro complementar ao (-)-filamento na outra extremidade. O termo abrange modificações da PCR prototípica, tal como, por exemplo, PCR de alta fidelidade, PCR hotstart, PCR touch-down, PCRnested, PCR do tipo multiplex, PCR quantitativa, PCR quantitativa de tempo real, PCR long-range, RT-PCR etc. (Vi25 de, por exemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis etal., Academic Press, San Diego, 1990).

Produtos de amplificação obtidos usando os métodos de amplificação acima, e em particular usando PCR, podem ser avaliados, por exemplo, para sua presença ou ausência, para sua especificidade é/õü quantida30 de, por quaisquer dos modos comuns na técnica. Por exemplo, o tamanho (como uma indicação de especificidade de amplificação) e/ou quantidade de um produto de amplificação podem ser avaliados usando eletroforese em gel, tal como, por exemplo, eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, onde os produtos de amplificação são visualizados usando tinturas de ligação de DNA adequadas, tais como, por exemplo, brometo de etídio.

Altemativamente, os produtos de amplificação podem ser avali5 ados por métodos que empregam hibridação de sondas com sequências específicas dentro dos produtos de amplificação. Por exemplo, um produto de amplificação pode ser imobilizado e desnaturado em um suporte sólido e subsequentemente hibridado com uma sonda marcada.

Do contrário, o produto de amplificação pode ser marcado, por 10 exemplo, incluindo uma marcação detectável (por exemplo, um fluoroforo) em um ou ambos iniciadores e/ou em virtude dos nucleotídeos de substrato incorporados no produto de amplificação durante a amplificação, e o produto de PCR assim obtido pode ser subsequentemente desnaturado e hibridado com sondas específicas (oligonucleotídeo) prendidas a um suporte sólido. A presença e quantidade da marcação detectável nas posições seletas no suporte sólido desse modo indicam a especificidade e quantidade, respectivamente, do produto de amplificação. Por exemplo, tal configuração é adequada para o uso com arranjos de sonda, por exemplo, microarranjos.

Em outros modos exemplares, produtos de amplificação podem ser avaliados usando clonagem e sequenciação; sequenciação direta; pirossequenciação mediada por oligonucleotídeo (Ahmadian et al. 2000. Anal Biochem 280: 103-110); cromatografia, por exemplo, DHPLC, ensaios de ligação de oligonucleotídeo (Landegren et al. 1988. Science 241: 1077; Eggerding et al. 1995. Hum Mutat 5: 153-165; Nickerson et al. 1990. PNAS 87:

8923-8927); Ensaio de Proteção de RNAse; etc.

Uma maneira particularmente vantajosa de avaliar o produto de amplificação é amplificação de tempo real, especialmente PCR de tempo real. O termo amplificação de tempo real é intencionado significar qualquer técnica de amplificação, preferivelmente PCR (PCR de tempo real) que torna possível monitorar a evolução de uma reação de amplificação contínua (vide, por exemplo, Real-Time PCR: An Essential Guide, eds. Edwards et al.,

Horizon Scientific Press, 2004; Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60; para debate de várias plataformas de PCR de tempo real).

Por meio de exemplo e não-limitação, amplificação de tempo re5 al, especialmente PCR de tempo real, como intencionada aqui abrange sistemas completamente convencionais, tais como, por exemplo, o sistema de TaqMan® desenvolvido por Applied Biosystems, que conta com a liberação e detecção de uma sonda fluorogênica durante cada rodada de amplificação de DNA (Holanda et al. 1991. Detection of specific polymerase Chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. PNAS 88: 7276-80). O método usa a atividade da exonuclease de 5' da Taq polimerase durante a extensão do iniciador para clivar uma sonda fluorogênica dual-marcada hibridada com o DNA-alvo entre os iniciadores de PCR. Antes da divagem, um fluoroforo repórter, tal como 615 carboxifluoresceína (6-FAM) na extremidade 5' da sonda é extinguido por 6carbóxi-tetrametilrodaniina (TAMRA) através de transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET). Seguindo a digestão, FAM é liberado. A fluorescência resultante medida em tempo real por volta de 518 nm durante a fase de registro de acumulação de produto é proporcional ao número de cópias da sequência-alvo.

Outros sistemas de detecção por amplificação de tempo real, especialmente PCR de tempo real, podem também utilizar FRET, tal como, por exemplo, sistemas com base em balizas moleculares. Balizas moleculares são sondas de polinucleotídeo unifilamentares que possuem uma estru25 tura de grampo de cabelo. A porção da alça é uma sequência de sonda complementar a uma sequência dentro de um amplicon a ser avaliado, e o talo é formado por sequências complementares curtas localizadas nas extremidades opostas da baliza molecular. A baliza molecular é marcada com um fluoroforo (por exemplo, 6-FAM) em uma extremidade e um extintor (por exemplo, TAMRA) na outra extremidade. Quando livre na solução, o talo mantém o fluoroforo e o extintor em proximidade íntima, causando a fluorescência do fluoroforo a ser extinguido através de FRET. Porém, quando liga42 do a seu alvo complementar, o híbrido de sonda-alvo força o talo a desenrolar-se, separar o fluoroforo do extintor, e restabelecer a fluorescência. Consequentemente, quando a quantidade de um amplicon aumenta durante a amplificação, esta pode ser monitorada como um aumento na fluorescência da baliza correspondente (vide, por exemplo, Manganelli et al. 2001. Realtime PCR using molecular beacons. Methods Mol Med 54: 295-310; Marras SAE. 2006. Selection of fluorophore and extintor pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes. Methods Mol Biol 335: 3-16; Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60 para mais debate de detecção das balizas moleculares).

Um sistema de detecção e amplificação de PCR de tempo real particularmente vantajoso para o uso na presente invenção é o sistema de Light Upon Extension (LUX®) comercializado por Invitrogen (Carlsbad, CA) e descrito em detalhes em Nazarenko et al. 2002 (Nucleic Acids Research 30: e37) e Nazarenko et al. 2002 (Nucleic Acids Research 30: 2089-2095). Este sistema emprega pares de iniciadores em que usualmente um dos iniciadores do dito par de iniciadores é marcado por um fluoroforo (tal como, por exemplo, FAM ou JOE ou Alexa Fluor 546). A estrutura particular do iniciador livre extingue o sinal do fluoroforo ligado a este, enquanto que a intensidade de sinal do fluoroforo aumenta quando o iniciador assumir uma conformação estendida uma vez incorporado no produto de amplificação. A sequência dos iniciadores da presente invenção, tal como dos iniciadores preferidos particularmente como listados nas Tabelas 1 e 4, pode ser trabalhada para executar com a tecnologia de LUX®, seguindo as instruções das publicações acima de Nazarenko et al. 2002 ou usando ferramentas de software fornecidas por Invitrogen em www.invitrogen.com/lux. A tecnologia de LUX® é particularmente bem adaptada para multiplexação (isto é, executar em uma reação simples) de duas ou mais amplificações usando conjuntos de iniciadores diferentes, uma vez que cada um dos conjuntos de iniciadores pode ser marcado usando um fluoroforo diferente.

Para descrição dos modos adicionais para detectar e avaliar os produtos de amplificação em tempo real (por exemplo, usando sondas adjacentes; sondas de 5-nuclease tais como Taqman®; sonda Light-up; iniciadores Scorpion Duplex; iniciadores Amplifluor; e outros formatos de sonda de hibridação fluorescente alternativos, vide, por exemplo, Marras SAE et al.

2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60, esp. seção 6 e referências dentro deste).

Em modalidades preferidas, a amplificação de tempo real, preferivelmente PCR de tempo real, da invenção usa (substancialmente) reagen10 tes não-específicos para sequência para detectar e avaliar a acumulação dos produtos de amplificação. Estes sistemas usualmente empregam fluorocromos (tinturas fluorescentes) que se ligam ao DNA (isto é, ligação de DNA), preferivelmente ao DNA bifilamentar, em um modo substancialmente não-específico para sequência, e em tal ligação sua fluorescência é alcan15 çada ou melhorada. Consequentemente, o aumento observado na fluorescência é indicativo da aparência e quantidade do produto de amplificação acumulado (bifilamentar). Se os ditos fluorocromos ligam preferencial ou exclusivamente ao DNA bifilamentar e/ou se sua fluorescência é preferencial ou exclusivamente melhorada quando ligados ao DNA bifilamentar, então a especificidade do produto de amplificação pode ser determinada executando sua curva de fundição, isto é, diagrama de fluorescência vs. temperatura, e determinando a Tm do produto, isto é, temperatura na qual 50% do produto são fundidos e tidos desse modo perdeu sua fluorescência melhorada. A observação de uma Tm esperada simples para um produto de amplificação (ou Tm múltipla esperada na amplificação de multiplexação) confirma a especificidade da amplificação.

Fluorocromos exemplares para o uso nos métodos de detecção não-específicos para sequência acima incluem, sem limitação, aglutinantes de sulco principal, aglutinantes de sulco secundário, tinturas intercaladas, ou similares; tais como, por exemplo, SYBR Green I (2-[N-(3-dimetilaminopropil)-N-propilamino]-4-[2,3-di-hidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metilideno]-1fenil-quinolínio; Zipper et al. 2004. Nucleic Acid Res 32: e103), brometo de etídio, Hoechst 33258, PicoGreen® (Molecular Probes), preferivelmente SYBR Green i ou PicoGreen®.

Em uma outra modalidade preferida, as reações de amplificação de tempo real dos métodos presentes podem ser multiplexadas, isto é, dois ou mais amplicons diferentes podem ser amplificados usando dois ou mais pares de iniciadores correspondentes na(s) mesma(s) amostra(s) na mesma reação. Os iniciadores visados pelos presentes inventores, em particular os iniciadores listados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4 ou variantes ou derivados dos mesmos, podem ser particularmente adaptados para mul10 tiplexar aplicações inter alia porque eles desempenham-se adequadamente em condições de reação substancialmente iguais ou similares (por exemplo, composição de reação e condições de ciclagem da temperatura), como também porque eles produzem produtos similarmente dimensionados.

É bem entendido que multiplexação em geral requer que produ15 tos de amplificação diferentes que surgem na reação podem ser distinguidos. No contexto presente, se os métodos não-específicos para sequência (por exemplo, SYBR Green ou outra tintura de ligação de DNA) forem usados para detectar os produtos de amplificação, multiplexação pode ser particularmente prevista onde os produtos de amplificação tiverem Tm suficien20 temente dissimilar a ser distinguida executando uma curva de fundição (por exemplo, Tm diferindo em cerca de 5°C ou mais). Porém, onde os métodos de detecção específicos para amplicon forem usados (por exemplo, iniciadores diferentemente marcados ou sondas diferentemente marcadas para amplicons diferentes), multiplexação longa dos testes presentes é em princípio possível.

Consequentemente, alvo para a detecção acima descrita usando sondas e/ou modelo para a amplificação usando pares de iniciadores, seria ácido nucleico que origina dos respectivos eventos de planta transgênica compreendidos na amostra. Preferivelmente, este ácido nucleico-alvo e/ou modelo seria DNA genômico que origina dos ditos eventos transgênicos que, devido à sua estabilidade maior, é esperado que seja melhor preservado na amostra que outros tipos de ácido nucleico, tais como, por exemplo, hnRNA ou mRNA. Não obstante, a invenção também contempla a detecção de mRNA ou cDNA (por exemplo, ensaios de RT-PCT correspondentes), ou DNA derivado de plasmídeo onde aplicável.

O presente método desse modo preferivelmente emprega ampli5 ficação usando pares de iniciadores projetados especificamente para hibridar dentro e amplificar os amplicons correspondentes de dentro dos ácidos nucleicos a presença ou ausência destes na amostra necessita ser detectada, tal como, preferivelmente, ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima, como um meio para detectar a presença ou ausência dos ditos ácidos nucleicos na amostra.

Neste respeito, os presentes inventores perceberam que se o material de um evento de planta transgênica foi exposto a uma ou mais etapas de processamento a jusante, por exemplo, como descritas acima, os ácidos nucleicos, tais como DNA genômico dos mesmos, podem ser frag15 mentados. Portanto, para aumentar as chances dos respectivos amplicons serem representativamente amplificados do DNA assim fragmentado, a invenção também ensina vantajosamente reduzir o tamanho dos amplicons.

Consequentemente, nas modalidades preferidas, os amplicons são menos que cerca de 300 pb, por exemplo, menos de 280 pb, menos de

260 pb, menos de 240 pb, ou menos de 220 pb, mais preferivelmente menos que cerca de 200 pb, por exemplo, menos de 190 pb, menos de 180 pb, menos de 170 pb ou menos de 160 pb, até mesmo mais preferivelmente menos que cerca de 150 pb, por exemplo, menos de 140 pb, menos de 130 pb, menos de 120 pb ou menos de 110 pb, ainda mais preferivelmente menos que cerca de 100 pb, e ainda mais preferivelmente menos que cerca de 90 pb, por exemplo cerca de 85 pb, cerca de 80 pb, cerca de 75 pb, cerca de 70 pb, cerca de 65 pb, cerca de 60 pb, cerca de 55 pb ou cerca de 50 pb.

Em outras modalidades preferidas, os amplicons são entre cerca de 50 pb e cerca de 150 pb, entre cerca de 50 pb e cerca de 100 pb, preferi30 velmente entre cerca de 50 pb e cerca de 90 pb, mais preferivelmente entre cerca de 60 pb e cerca de 80 pb, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 65 pb e cerca de 75 pb.

Como explicado, os métodos acima detectam ácidos nucleicos particulares, preferivelmente DNA genômico, em uma amostra. Pode ser apreciado que alguns protocolos de detecção robustos, por exemplo, alguns protocolos de PCR, poderíam ser executados nas amostras sem purificação anterior ou enriquecimento de seus ácidos nucleicos constituintes. Por outro lado, as detecções da invenção podem ser executadas mais consistentemente se os ácidos nucleicos, tais como preferivelmente DNA genômico, forem enriquecidos primeiro ou isolados da amostra. Métodos para isolamento dos ácidos nucleicos, tais como DNA genômico, das amostras, parti10 cularmente amostras compreendendo material de planta, são a muito estabelecidos na técnica e incluem métodos com base em, através de exemplo e não-limitação, extração de solvente orgânico (por exemplo, extração de fenol-clorofórmio) e precipitação de etanol ou álcool isopropílico; ligação às resinas de troca iônica; separação de densidade de cloreto de césio; croma15 tografia de coluna giratória, separação magnética etc (vide, por exemplo, Milligan 1992. Plant DNA isolation. págs 59-88 em Hoelzel, ed. Molecular genetic analysis of populations: a practical approach. IRL Press, Oxford, UK).

Qualidade de DNA assim isolado pode ser avaliada, por exemplo, através de eletroforese em gel e/ou medindo a razão de absorbância de

A₂6o/A₂8o· Preferivelmente, a razão de A₂₆o/A₂so para ácidos nucleicos usados nos métodos de detecção da invenção pode ser entre 1,6 e 2,3, mais preferivelmente entre 1,6 e 2,0, até mesmo mais preferivelmente entre 1,7 e 1,9, ainda mais preferivelmente entre 1,75 e 1,85 e o mais preferivelmente cerca de 1,8. Quantidade de DNA assim isolado pode ser avaliada, por exemplo, medindo a absorbância A₂₆o (Sambrook 1989), ou preferivelmente usando fluorocromos PicoGreen® ou SYBR Green I (Ahn et al. 1996. Nucleic Acids Res 24: 2623-5; Schneeberger et al. 1995. PCR Methods Appl 4: 234-8).

Em uma modalidade preferida, a preparação de material de ácido nucléico, particularmente DNA genômico, para uso nos métodos da in30 venção pode também requerer fragmentação para obter tamanhos médios inferiores dos fragmentos de ácido nucléico, tais como, por exemplo, usando digestão enzimática ou sonicação como conhecido na técnica. Comprimento médio preferível dos ácidos nucleicos assim fragmentados pode ser entre 200 e 2000 pb, mais preferivelmente entre 300 e 1500 pb, até mesmo mais preferivelmente entre 500 e 1000 pb, por exemplo, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 700, cerca de 800 cerca de 900 ou cerca de 1000 pb.

Os métodos acima desse modo detectam a presença ou ausência de ácidos nucleicos seletos em uma amostra, preferivelmente usando sistemas de detecção e protocolos como descritos antes. Como aqui usado, a presença de um ácido nucleico dado em uma amostra é em geral concluída quando o valor de intensidade do sinal (quantidade de sinal) obtido para aquele ácido nucleico usando um ensaio de detecção adequado (por exemplo, sinal fluorescente, sinal quimiluminescente, sinal de reação enzimática etc) na amostra for maior, de preferência estatisticamente de modo significativo maior, que o em um controle negativo.

Um controle negativo não contém o ácido nucleico que é ensai15 ado, mas pode ser vantajosamente comparável à amostra em outros respeitos, preferivelmente a maioria dos outros respeitos, por exemplo, no tipo e quantidade de material de planta contido nele, etapas de processamento às quais o material foi exposto a jusante etc.

Preferivelmente, os métodos de detecção da invenção podem ser executados em ácidos nucleicos, mais preferivelmente em DNA genômico, isolado da amostra (vide acima). Em tal circunstância, o controle negativo pode consistir essencialmente de ácidos nucleicos isolados, não compreendendo o ácido nucleico sujeito à detecção. Preferivelmente, o método de detecção depois empregará a mesma ou aproximadamente a mesma quan25 tidade de ácidos nucleicos isolados da amostra e, para referência, o controle negativo. Também preferivelmente, a pureza e/ou qualidade dos ácidos nucleicos isolados da amostra e do controle negativo podem também ser as mesmas ou aproximadamente as mesmas; também preferivelmente, o mesmo método de isolamento pode ser usado para isolar ácidos nucleicos da amostra e o controle negativo.

Nas situações acima, a presença de um ácido nucleico dado em uma amostra pode ser preferivelmente concluída quando o valor de intensi48 dade do sinal (quantidade de sinal) obtido para aquele ácido nucleico na amostra for pelo menos 2 x maior que no controle negativo, por exemplo, pelo menos 3 x ou pelo menos 4 x maior, mais preferivelmente pelo menos 5 x maior, por exemplo, pelo menos 6 x maior, pelo menos 7 x maior, pelo me5 nos 8 x maior ou pelo menos 9 x maior, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 10 x maior, por exemplo, pelo menos 15 x maior, ainda mais preferivelmente pelo menos 20 x maior, por exemplo, pelo menos 30 x maior ou pelo menos 40 x maior, ainda mais preferivelmente pelo menos 50 x maior, por exemplo, pelo menos 100 x maior, pelo menos 200 x maior, pelo me10 nos 300 x maior, pelo menos 400 x maior, pelo menos 500 x maior, pelo menos 1000 x maior ou até maior que o sinal no controle negativo.

Consequentemente, quando o valor de sinal (quantidade de sinal) obtido para o ácido nucleico ensaiado na amostra não for maior (por exemplo, for o mesmo, aproximadamente o mesmo ou inferior) que o valor de sinal obtido para o ácido nucleico ensaiado no controle negativo, ou preferivelmente não for maior pelos múltiplos preferidos citados acima, a ausência do dito ácido nucleico na amostra pode ser em geral concluída.

Em modalidades preferidas, a presença ou ausência na amostra de um ácido nucleico de interesse é avaliada por amplificação de tempo real, preferivelmente PCR de tempo real. Nestes sistemas, uma medida comum usada para expressar a quantidade do modelo por um ácido nucleico dado em uma amostra é o valor Ct. Brevemente, o valor C_t estabelece o número de ciclo no qual a fluorescência atribuível ao produto de amplificação provindo (AR_n) passar de um valor de fluorescência de limiar arbitrário, o conjunto fica acima da fluorescência de linha base mas dentro da fase exponencial de amplificação (isto é, dentro da porção que parecería linear em um diagrama de log 2 de fluorescência vs. N° de ciclo de dados).

Consequentemente, em amplificação de tempo real, a presença de um ácido nucleico dado em uma amostra pode ser em geral concluída quando C_t da amostra (Cf de SAM) for inferior que o C_t de um controle negativo (C_f de NC); e pode ser preferivelmente concluída quando C_t de SAM < (Cf de NC - 1), por exemplo, Cf de SAM < (Cf de NC - 2), Cf de SAM < (Cf de NC - 3) ou Ct de SAM < (C_f de NC - 4), mais preferivelmente quando C_t de SAM < (Ct de NC - 5), por exemplo, Ct de SAM < (Ct de NC - 6), Ct de SAM < (Cf de NC - 7), C_t de SAM < (Cf de NC - 8) ou Ct de SAM < (C_f de NC - 9), até mesmo mais preferivelmente quando C_t de SAM < (Cf de NC - 10), por exemplo, C_t de SAM < (C_t de NC -11), C_t de SAM < (C_t de NC -12), C_f de SAM < (Cf de NC - 13), C_t de SAM < (C_t de NC -13) ou C_t de SAM < (C_t de NC - 14), ainda mais preferivelmente quando Cf de SAM < (Cf de NC 15), por exemplo, Cf de SAM < (C_f de NC -16), C_f de SAM < (C_f de NC -17), Cf de SAM < (Cf de NC -18) ou Cf de SAM < (Cf de NC -19), ainda mais pre10 ferivelmente quando C_f de SAM < (Cf de NC - 20), por exemplo, C_t de SAM < (Cf de NC - 25), C_t de SAM < (Cf de NC - 30) ou Cf de SAM < (C_f de NC - 35).

Consequentemente, em amplificação de tempo real, quando C_t de SAM não for inferior (por exemplo, for o mesmo, aproximadamente o mesmo ou maior) que o Cf de NC, ou preferivelmente não for inferior pelos diferenciais preferidos citados acima, a ausência do dito ácido nucleico na amostra pode ser em geral concluída.

Como observado acima, em sistemas de amplificação de tempo real que não empregam sondas específicas para sequência (por exemplo, quando produto de amplificação for detectado usando tinturas de DNA não20 específicas para sequência tais como, por exemplo, SYBR Green I), a especificidade do produto de amplificação pode ser verificada executando uma análise da curva de fundição e determinando a Tm. Presença do produto de amplificação específico pode ser concluída quando a Tm observada for idêntica ou substancialmente idêntica (preferivelmente dentro de um intervalo de ± 3°C, mais preferivelmente ± 2°C, ainda mais preferivelmente ± 1°C, até mesmo mais preferivelmente ± 0,5°C, e ainda mais preferivelmente ± 0,2°C ou ± 0,1 °C) para a temperatura de fundição calculada e/ou experimentalmente determinada do amplicon esperado.

Além disso, amplificação específica pode ser preferivelmente concluída quando a análise da curva de fundição do produto de amplificação exibir uma Tm só. Altemativamente ou além disso, amplificação específica pode ser preferivelmente concluída quando o produto de amplificação exibir um tamanho simples, esperado em eletroforese em gel. Porém, a aparência do(s) produto(s) de amplificação não-específico(s) poderia ser até certo ponto tolerável na prática, preferivelmente se tais produto(s) de amplificação não-específico(s) constituíssem menos que 50%, mais preferivelmente me5 nos que 40%, até mesmo mais preferivelmente menos que 30%, ainda mais preferivelmente menos que 20%, ainda mais preferivelmente menos que 10%, também mais preferivelmente menos que 5%, até mesmo mais preferivelmente menos que 2% e o mais preferivelmente menos que 1%, por exemplo, menos que 0,5% ou menos que 0,1%, da quantidade total (p/p) do produto de amplificação. Tal(is) produto(s) de amplificação não-específico(s) pode(m) ser observado(s), por exemplo, pelo surgimento de um ou mais picos de Tm adicionais na análise da curva de fundição e/ou aparência de um ou mais tamanhos de produto adicionais na eletroforese em gel.

Em um outro desenvolvimento da invenção, é observado que amplicons amplificados usando o mesmo conjunto de iniciador nos ácidos nucleicos que originam de eventos diferentes podem apresentar valores de Tm distintos, presumivelmente devido a algumas diferenças na sequência entre tais amplicons. Por meio de exemplo e não-limitação, os amplicons amplificados usando conjunto de iniciador SEQ ID NO: 11 e 12 (Tabela 4) em Bt11 e Bt176 mostram uma tal diferença em sua Tm. Consequentemente, o valor de Tm observado pode servir como uma outra informação distintiva para usar no método da invenção, de modo que uma indicação até mesmo mais detalhada da presença ou ausência de ácidos nucleicos de tais eventos particulares é obtida.

Alternativamente ou além disso, em uma outra variação, um ácido nucleico particular pode ser amplificável usando um conjunto de iniciador particular de um ou mais eventos, enquanto o mesmo iniciador não amplificaria o ácido nucleico correspondente em um ou mais outros eventos, presumivelmente devido a algumas diferenças de sequência nos sítios de liga30 ção do iniciador. Embora tal situação necessitasse que o uso de dois ou mais conjuntos de iniciador para amplificar o ácido nucleico correspondente de eventos diferentes (e pode neste respeito ser menos vantajoso que sele51 cionar um conjunto de iniciador que amplifica o ácido nucleico de todos os eventos de planta de interesse), pode dar a vantagem de fornecer informação adicional acerca da presença ou ausência de ácidos nucleicos de eventos particulares na amostra. Por exemplo, o ácido nucleico de CrylAb pode ser vantajosamente detectado de MON810 usando o conjunto de iniciador SEQ ID NO: 30 e 31 e de Bt11 e Bt176 usando o conjunto de iniciador SEQ ID NO: 11 e 12 (Tabela 4).

Uma pessoa versada pode apreciar que as reações de amplificação, por exemplo, PCR, podem dar origem a um subproduto de iniciador10 dímero não-específico. Tais produtos de iniciador-dímero podem ser tipicamente de modo fácil distinguidos do(s) produto(s) de amplificação específico(s) por seu tamanho diferente, o mais frequentemente menor, e/ou Tm. Consequentemente, uma pessoa versada poderia reconhecer e minimizar o efeito de tais artefatos na análise da reação de amplificação. Os iniciadores preferidos da invenção, tais como aqueles listados nas Tabelas 1 e 4, foram projetados para minimizar o efeito de iniciador dímero.

Uma outra questão é a sensibilidade dos métodos de detecção usados na presente invenção que pode ser vantajosamente expressa como limite de detecção (LOD) dos mesmos, referindo-se aqui à quantidade de concentração mais baixa de um analito (aqui de um ácido nucleico dado a ser detectado) em uma amostra que pode ser confiantemente detectada, embora não necessariamente quantificada. Confiantemente detectada, como aqui usado, significa que as amostras contendo a quantidade de LOD ou concentração do analito darão um resultado positivo > 50% de detecções repetidas, preferivelmente > 60%, mais preferivelmente > 70%, até mesmo mais preferivelmente > 80%, ainda mais preferivelmente > 90%, e o mais preferivelmente > 95% ou até mesmo > 99% de detecções repetidas.

Preferivelmente, LOD dos métodos de detecção adequado para o uso na invenção, expresso aqui como o número de cópia de LOD de um ácido nucleico dado de interesse em uma amostra submetida à detecção, pode ser 10.000 ou menos, por exemplo, 9.000 ou menos, 8.000 ou menos, 7.000 ou menos ou 6.000 ou menos, mais preferivelmente 5.000 ou menos, por exemplo, 4.000 ou menos, 3.000 ou menos ou 2.000 ou menos, até mesmo mais preferivelmente 1.000 ou menos, por exemplo, 900 ou menos, 800 ou menos, 700 ou menos ou 600 ou menos, ainda mais preferivelmente 500 ou menos, por exemplo, 400 ou menos, 300 ou menos ou 200 ou me5 nos, ainda mais preferivelmente 100 ou menos, por exemplo, 90 ou menos, 80 ou menos, 70 ou menos ou 60 ou menos, e o mais preferivelmente 50 ou menos, com modalidades preferidas exemplares incluindo 40 ou menos, 30 ou menos, 20 ou menos ou até mesmo 10 ou menos, tal como, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Os iniciadores preferidos da invenção, tais como aqueles listados nas Tabelas 1 e 4, foram projetados para alcançar sensibilidade particularmente alta (LOD baixo).

Como aqui usado, o termo milho refere-se a Zea mays, preferivelmente Zea mays spp. mays, e inclui todas as variedades de planta que podem ser criadas com milho, incluindo espécies de milho selvagens; os termos colza, óleo de semente de colza ou óleo de canola referem-se alternadamente a Brassica napus, e incluem todas as variedades de planta que podem ser criadas com colza, incluindo espécies de colza selvagens; os termos soja ou feijão-soja referem-se alternadamente a Glycine max, e incluem todas as variedades de planta que podem ser criadas com soja, in20 cluindo espécies de soja selvagens; o termo arroz refere-se a Oryza sativa, incluindo, sem limitação, ssp. indica e japonica, e inclui todas as variedades de planta que podem ser criadas com arroz, incluindo espécies de arroz selvagens; o termo açúcar de beterraba refere-se a Beta vulgaris, e inclui todas as variedades de planta que podem ser criadas com açúcar de beterra25 ba, incluindo espécies de açúcar de beterraba selvagens; o termo algodão refere-se a espécies de Gossypium, preferivelmente Gossypium hirsutum, e inclui todas as variedades de planta que podem ser criadas com algodão, incluindo espécies de algodão selvagens; o termo batata refere-se a Solanum tuberosum, e inclui todas as variedades de planta que podem ser cria30 das com batata, incluindo espécies de batata selvagens.

Eventos de planta transgênica são referidos aqui por suas designações como comumente empregadas na técnica e familiares a uma pes53 soa versada. Não obstante, por meio de ajuda também, a Tabela 2 abaixo resume mais informação suficiente para identificação específica dos eventos citados.

Tabela 2. Identificação dos eventos de planta transgênica.

Evento	Companhia	Taxonomia de hospedeiro	ID Único (UI)
Bt176	Syngenta	Zea mays	SYN-EV176-9
Bt11	Syngenta	Zea mays	SYN-BT011-1
MON810	Monsanto	Zea mays	MON-00810-6
MON863	Monsanto	Zea mays	MON-00863-5
TC 1507	Pioneer Hi-Bred/Dow AgroScience	Zea mays	DAS-01507-1
NK603	Monsanto	Zea mays	MON-00603-6
T25	Bayer CropScience	Zea mays	ACS-ZM003-2
GA21	Monsanto	Zea mays	MON-00021-9
DAS-59122	Dow AgroSciences/Pioneer Hi-Bred	Zea mays	DAS-DAS-59122- 7
MIR604	Syngenta Seeds	Zea mays	SYN-IR604-5
LY038	Renessen LLC/ Monsanto	Zea mays	REN-00038-3
MON88017	Monsanto	Zea mays	MON88017-3
Topas 19/2	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN007-1
MS1	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN004-7
RF1	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN001-4
RF2	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN002-5
RF3	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN003-6
MS8	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN005-8
GT73	Monsanto	Brassica napus	MON-00073-7
T45	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN008-2
Liberator pHoe6/Ac	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN010-4
GS40/90 pHoe6/Ac	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN010-4
MS1/RF1	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN004-7 x ACS-BN001-4

Evento	Companhia	Taxonomia de hospedeiro	ID Único (UI)
MS1/RF2	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN004-7 x ACS-BN002-5
MS8/RF3	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN005-8 x ACS-BN003-6
OXY235	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN011-5
MON 40-3-2	Monsanto	Glycine max	MON-04032-6
MON89788	Monsanto	Glycine max	MON-89788-1
A2704-12	Bayer CropScience	Glycine max	ACS-GM005-3
A5547-127	Bayer CropScience	Glycine max	ACS-GM006-4
LL62	Bayer CropScience	Oryza sativa	ACS-OS002-5
LL06	Bayer CropScience	Oryza sativa	ACS-OS001-4
T120-7	Bayer CropScience	Beta vulgaris	ACS-BV001-3
H7-1	KWS SAAT AG/Monsanto	Beta vulgaris	KM-000H71-4
A5-15	DANISCO Seed; DLF Trifolium A/S; Monsanto	Beta vulgaris	DLF-0A515-7
LL algodão 25	Bayer CropScience	Gossypium hirsutum	ACS-GH001-3
MON 1445	Monsanto	Gossypium hirsutum	MON-01445-2
MON 531	Monsanto	Gossypium hirsutum	MON-00531-6
MON 15985	Monsanto	Gossypium hirsutum	MON-15985-7
EH-92-527-1	Amylogen HB (BASF Plant Science)	Solanum tube- rosum	BPS-25271-9

Os identificadores únicos (UI) listados acima representam um sistema para classificação única dos eventos de planta transgênica começada estabelecida pela Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) e descrita em suas publicações ENV/JM/MONO(2002)7: O5 ECD Guidance for the Designation of a Unique Identifier for Transgenic Plants, de 20 de outubro de 2004, e ENV/JM/MONO(2002)7/REV1 de 7 de novembro de 2006. Os ditos identificadores únicos são usados, reconhecí55 dos e atribuídos internacionalmente, incluindo na Europa (vide, por exemplo, Commission Regulation (EC) N° 65/2004 de 14 de janeiro de 2004 que estabelece um sistema para o desenvolvimento e atribuição de identificadores únicos para organismos geneticamente modificados).

Informação detalhada com relação aos eventos de planta transgênica de interesse acima e outros, tal como, por exemplo, informação sobre taxonomias de hospedeiro, construções de transformação, sequências inseridas etc pode ser acessada pelos portais publicamente disponíveis de várias autoridades reguladoras incluindo, por exemplo, OECD BioTrack Pro10 duct Database (http://www2.oecd.org/biotech/default.aspx), a US FDA (http://www.cfsan.fda.gov/), o European Community Register of GM Food and Feed (http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm), a base de dados de Agbios (www.agbios.com), ou a base de dados de EC GMO Compass (http://www.gmo-compass.org/), como também na literatura cientí15 fica etc. Uma pessoa versada está bem ciente e pode usar tais fontes de base de dados.

Além disso, os métodos de detecção evento-específicos e métodos de detecção construção-específicos (por exemplo, vide Codex Alimentarium) estão disponíveis e permitem de forma não-ambígua distinguir os eventos acima e outros. Por exemplo, o European Community Reference Laboratory (CRL) (http://gmo-crl.jrc.it/; http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htrn) lista dos métodos validados para detecção evento-específica, como fornecido pelos fabricantes, descritos na literatura científica ou desenvolvidos pelo próprio CRL.

Como observado acima, a invenção permite concluir a presença ou ausência em uma amostra de material derivado de eventos seletos, cruzamentos dos mesmos, ou eventos relacionados dos mesmos.

O termo cruzamentos dos mesmos neste contexto refere-se à progênie obtida por um ou mais cruzamentos subsequentes de dois ou mais eventos compatíveis (isto é, eventos capazes de serem cruzados, particularmente eventos que pertencem à mesma taxonomia), de modo que a dita progênie resultante compreenda inserções transgênicas dos dois ou mais eventos parentais sendo cruzados.

O termo eventos relacionados dos mesmos neste contexto refere-se aos eventos que foram gerados introduzindo nas mesmas taxonomias as mesmas construções transformantes como que dos respectivos even5 tos citados, mas não obstante são distintos dos eventos citados, por exemplo, podem tipicamente diferirem no número e/ou sítio de integrações genômicas da construção transformante. Frequentemente, tais eventos podem estar sujeitos à autorização. Em outras circunstâncias, tais eventos relacionados podem estar presentes como contaminantes indesejados. Conse10 quentemente, detectar os elementos genéticos de dentro das construções transformantes, o método da invenção vantajosamente permite detectar tais eventos.

Como observado acima, os métodos da invenção envolvem detecção da presença ou ausência em amostras de um ou mais ácidos nuclei15 cos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) como definidos acima.

Neste respeito, a citação de um ácido nucleico derivado e específico para uma taxonomia dada, tal como definido para os ácidos nucleicos listados sob a) Zm, b) Bn, c) Gm, o) Or, p) Bv, q) Gs, e t) St, significa que o dito ácido nucleico na amostra origina do material genético, preferivelmente DNA genômico, da dita taxonomia dada e não está presente - e desse modo não seria detectável usando o método de detecção escolhido - no material genético que origina de outras taxonomias, tais como as taxonomias restantes listadas acima. Por meio de exemplo e não-limitação, o dito ácido nucleico ou derivado da taxonomia dada não pode ter nenhum homólogo em outras taxonomias ou seus homólogos em outras taxonomias podem ter sequências suficientemente distintas de modo que eles não sejam detectados pelo método de detecção escolhido. Por exemplo, em um sítio de detecção, por exemplo, em um sítio ao qual uma sonda ou um ou mais inici30 adores de amplificação hibridaria dentro do ácido nucleico dado, tais homólogos podem apresentar menos de 100% de identidade de sequência, preferivelmente menos que 95%, até mesmo mais preferivelmente menos que

90%, ainda mais preferivelmente menos que 85%, ainda mais preferivelmente menos que 80%, e o mais preferivelmente menos que 75%, em modalidades exemplares preferidas menos que 70%, menos que 65%, menos que 60%, menos que 55% ou menos de 50% de identidade de sequência com o ácido nucléico dado.

Também, o termo ácido nucléico derivado de como especialmente usado em a) - u) significa que os ditos ácidos nucleicos originam de suas respectivas taxonomias, elementos genéticos, genes, estrutura de leitura aberta etc, embora eles - quando encontrados na amostra - possam em parte diferir estruturalmente dos mesmos.

Por exemplo, processamento a jusante do material de planta pode causar alterações na estrutura de ácido nucléico (por exemplo, DNA), e talvez notavelmente pode causar fragmentação do mesmo. Além disso, às vezes fragmentos ou variantes funcionais de elementos de comprimento to15 tal podem ser usados em plantas transgênicas. Consequentemente, ácidos nucleicos derivados de aqueles citados sob a) - u) acima podem ser, por exemplo, fragmentos dos mesmos, desde que tais fragmentos permitam sua atribuição específica aos ácidos nucleicos originais. Por exemplo, tais fragmentos podem incluir pelo menos 15 pb contínuos da sequência da qual eles são derivados, preferivelmente pelo menos 20 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 30 ou pelo menos 40 pb contínuos, mais preferivelmente pelo menos 50 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 60 ou pelo menos 70 pb contínuos, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 80 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 90 pb contínuos, ainda mais preferivelmente pelo me25 nos 100 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 150 pb contínuos, ainda mais preferivelmente pelo menos 200 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 300 pb contínuos, pelo menos 400 pb contínuos ou pelo menos 500 pb contínuos ou mais e podem até mesmo incluir elementos de comprimento total.

Outras modificações de ácidos nucleicos esperados do processamento a jusante do material de planta, por exemplo, desaminação parcial etc, são também contempladas sob o termo derivado de.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico a) Zm é derivado do gene de álcool desidrogenase I endógeno (adh-1) de Zea mays. Uma sequência exemplar mas não-limitativa do gene adh-1 de Zea mays é encontrada sob o número de acesso AF123535.1 na base de dados de

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucléico b) Bn é derivado do gene de acetil-CoA carboxilase endógena (acc) ou o gene de cruciferina endógena de Brassica napus. Uma sequência exemplar mas nãolimitativa do gene acc de Brassica napus é encontrada sob o número de ΒΙΟ cesso X77576.1 na base de dados de GenBank; uma sequência exemplar do gene de cruciferina de Brassica napus é encontrada sob o número de acesso X14555.1 na base de dados de GenBank.

Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucléico c) Gm é derivado do gene de lectina endógena (lec) de Glycine max. Uma sequência exemplar mas não-limitativa do gene lec de Glycine max é encontrada sob o número de acesso K00821.1 na base de dados de GenBank.

Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucléico o) Or é derivado do gene de fosfolipase D endógena (p/d) de Oryza sativa. Uma sequência exemplar mas não-limitativa do gene pld de Oryza sativa é encon20 trada sob o número de acesso AB001919.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico p) Bv é derivado do gene de Glutamina sintetase endógena (GluA3) de Beta vulgarís. Uma sequência exemplar mas não-limitativa do gene GluA3 de Beta vulgarís é encontrada sob o número de acesso AY026353.1 na base de dados de

GenBank.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico q) Gs é derivado do gene do homólogo de sinopse de Arabidopsis endógena 7 (sah-7) de Gossypium. Uma sequência exemplar mas não-limitativa do gene sah-7 de Gossypium é encontrada sob o número de acesso AY117067 (Autores:

Senchina et al. 2003. Mol Biol Evol 20 (4): 633-643) na base de dados de

GenBank.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico t) St é deriva59 do do gene de UDP-glicose pirofosforilase endógena (UGPase) de Solanum tuberosum. Uma sequência exemplar mas não-limitativa do gene UGPase de Solanum tuberosum é encontrada sob o número de acesso U20345 na base de dados de GenBank.

Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucléico derivado de planta genérica é derivado do gene RBCL cloroplástico endógeno (rbcl) de Zea mays. Uma sequência exemplar mas não-limitativa do gene rbcl de Zea mays é encontrada sob o número de acesso Z11973.1 na base de dados no GenBank.

Uma pessoa versada seria capaz de projetar e verificar sondas ou pares de iniciadores específicos das sequências acima citadas para uso nas etapas de detecção do presente método.

As referências aos elementos de sequência e genes citados neste relatório descritivo para os ácidos nucleicos listados sob d) - n), r), s) e u) são conhecidas a uma pessoa versada no campo de modificação genética de plantas. Consequentemente, uma pessoa versada entende que estas sequências de designações referem-se e também apreciaria o nível de alterações para estas sequências que são comuns na geração de plantas transgênicas.

Em uma modalidade, o presente ácido nucléico em um evento transgênico pode incluir a estrutura de leitura aberta ou uma parte funcional da mesma (isto é, uma parte que alcança o efeito desejado na planta transgênica) dos genes citados aqui, esp. os genes listados sob f) - n), r), s) e u) acima.

Não obstante, por meio de mais esclarecimento e não-limitação, nós aqui abaixo listamos as sequências exemplares para os genes particulares e elementos referidos sob d) - n), r), s) e u), e um ácido nucléico derivado de planta genérica exemplar:

Elemento de sequência/gene Número de acesso no GenBank

Ppromotor 35S de CMV VO0140 (genoma de CAMV inteiro)

Terminador de NOS V00087.1

ORF de CrylAb AF465640

ORF do gene bar	AY346130,1
ORF do gene pat	DQ156557.1
ORF do gene EPSPS	AY125353.1
ORF do gene Cry3A modificado	AR836206.1
Promotor Glb1	CS155614.1
ORF do gene Cry3Bb1	CS410008.1
ORF do gene Bxn	E01313.1
ORF do gene CrylAc	EF094884.1
ORF do gene Cry2Ab2	DQ361266.1
ORF do gene Gbss	X58453.1
Gene rbcL de cloroplasto de Zea mays	Z11973.1

Será apreciado que os ácidos nucleicos na verdade presentes nos eventos de planta transgênica podem compreender sequências que podem diferir até certo ponto das sequências exemplares acima. Por exemplo, tais diferenças podem incluir deleções, adições e/ou substituições, mutilações de base (por exemplo, inclusão de fragmentos funcionais), fusões a outros elementos (por exemplo, fusão para transporte de membrana ou sinais de classificação de organela) etc.

As sequências atuais dos elementos acima e outros encontra20 dos nos eventos transgênicos têm sido em muitas circunstâncias determinadas e acessíveis por meio de GenBank e outras bases de dados de sequência. Consequentemente, alinhamentos de sequência serão executados para identificar regiões dentro dos ácidos nucleicos mais adequadas para derivação de sondas ou amplicons dos mesmos.

Consequentemente, uma sonda ou um amplicon (e conjunto de iniciador correspondente) pode ser vantajosamente derivado de umas porções de cada um dos ácidos nucleicos acima que são encontrados na maioria dos eventos transgênicos e/ou mostrando a identidade de sequência mais alta entre os vários eventos transgênicos. Tal sonda ou par de iniciado30 res aumentará a chance de detecção daquele ácido nucleico particular de vários eventos transgênicos. Uma pessoa versada pode seguir esta instrução para executar os alinhamentos de sequência necessários.

Como exposto na seção Sumário, a invenção também fornece uma maneira vantajosa de concluir a presença ou ausência potencial de material de um ou mais eventos de planta transgênica de interesse a serem usados na etapa (2) dos métodos acima. Em particular, os resultados obti5 dos para a amostra na etapa (1) são representados como um conjunto Gsam simbolizando uma coletânea daqueles ácidos nucleicos, escolhidos daqueles compreendendo ou consistindo nos listados sob a) - u) acima, que foram detectados como presentes na amostra; e comparando o dito conjunto Gsam com um ou mais conjuntos de interesse G% representando os eventos indivi10 duais a serem avaliados. Os conjuntos de interesse Gx consistem, isto é, representam uma coletânea daqueles ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima que são encontrados nos respectivos eventos e desse modo seriam detectados na etapa (1) (na proporção que a dita etapa (1) detecte a presença dos ditos ácidos nucleicos) se a amostra contivesse material derivado dos respectivos eventos, ou um envolvendo tal cruzamento, ou um evento relacionado.

A Tabela 3 a seguir lista que ácidos nucleicos daqueles listados sob a) - u) acima estão presentes nos eventos de interesse particulares: Tabela 3. Características dos eventos.

Evento

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

I

m

n

0

P

q

r

s

t

u

Bt176

+

-

-

+

-

+

+

Bt11

+

-

-

+

+

+

-

+

Bt10

+

-

-

+

+

+

-

+

MON810

+

-

-

+

+

+

MON863

+

-

-

+

+

TC1507

+

+

+

NK603

+

-

-

+

+

+

T25

+

+

+

GA21

+

+

DAS-59122

+

+

+

MIR604

+

+

+

LY038

+

-

-

+

+

+

+

MON88017

+

-

-

+

+

+

+

- se G_x for igual a G_Sam (Gx = Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se Gxfor um subconjunto apropriado de Gsam (Gx <= Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se Gx não for igual a Gsam θ Gx não for um subconjunto apropriado de Gsam, (Gx * Gsam θ Gx <z Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.

Em uma outra modalidade preferida, se Gxfor igual a Gsam, e se nenhum conjunto ou a soma de dois ou mais conjuntos representando os eventos (em particular, conjuntos representando os eventos selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em: Getm, Getn, Getio, Gmons-io, GMON863, GtC1507, Gnk603, Gt25, GgA21, GdAS-59122, GmiR604, G/_Y038, GmON88017,

Giopas 19/2, GmS1, Grf1, Grf2, GmS1/RF1, GmS1/RF2, GmS8, Grf3, GmS8/RF3, GgT73, Gt45, GLiberatorpHoe6/Ac, GGS40/90pHoe6/Ac, GoXY235, GmON40-3-2, GmON89788, Ga2704-12, Ga5547-127, GlL62, Gu_06, GlL601, Gt120-7, Gr7-1, Ga5-15, Gll cotton 25, GmON1445, Gmon53i, Gmoni5985 © Geh92-527-i) diferente de Gxfor igual a Gx, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está presente na amostra.

Em um outro desenvolvimento desta maneira de avaliação, ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima são atribuídos os respectivos valores únicos. Consequentemente, o conjunto Gsam é depois atribuído a um valor VGsam sendo um múltiplo dos valores únicos atribuídos àqueles ácidos nucleicos detectados na etapa (1) como estando presentes na amostra; e um conjunto de interesse Gx é atribuído a um valor VGx sendo um múltiplo dos valores únicos atribuídos àqueles ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima que são encontrados no dito evento e des30 se modo seriam detectados na etapa (1).

Consequentemente, em um exemplo preferido, ácidos nucleicos

Zm, Bn, Gm, p35S, tNOS, CrylAb, PAT/bar, PAT/pat, CP464

EPSPS, mCry3A, cordap A, Glb1, Cry3Bb1, Bxn, Or, Bv, Gs, CrylAc, Cry2ab2, St e Gbss seriam atribuídos os respectivos valores únicos V_zm, V_Bn, V_Gm, Vp₃₅s, V_tNos, V_Cry1Ab, VpAT/har, VpAT/pa, ll\/ II n\/ U ll\/ II ll\ / II ll\ / II H\ Z II 1l\/ II H\ / \ /1» ll\ , »1

VCP4-EPSPS , VmCry3A , Vcordap A , VQIbl , VCry3Bb1 . V Bxn , vor , Vbv , Vqs , 5 V_Cly1A_C, VcryZabz, V_St Θ V_Gbss;

e a cada conjunto de interesse Gx seria atribuído um respectivo valor VGx escolhido dos valores do grupo compreendendo ou consistindo em valores VGefyze, VGs/π, VGsíío, VGmonõio, VGmon863. VGtcíso/', VGnk.603, V'Gt25^U, VGGA2i, VGdaS-59122, VGMlp60f, VGLY038¹, VGMON88017, VGTopas

19/2, VG/wSí, VGrf-i, VGrf2, 'VGmS1/RFi, VGmS1/RF2, VG/WSs, VGrf3, 'VGmS8/RF3, VGgT73, VG7-45, VGuberator pHoe6/Ac, VGGS4Q/90pHoe6/Ac ,

VGoxV235 , VGmON40-3-2 , VGMON89788 , 'VG_A2704-12 , 'VGa5547-127 , VGlL62, VG_lz._O6, VG_LL60í, VGT120-7, VGhaí, VGas-is, VG_ll cotton 25 i VG/woa/í445 , VGmon53i, VGmoni5985 ou VGeh92-527-i, em que:

- Vgbí176 ⁼ Vzm ^x Vp35S ^x VCrylAb ^x VPAT/bar, ~ Vgbí11 - Vzm ^x Vp35S ^x Vf/vOS ^x V CrylAb ^x VPAT/pat, ~ VcBtlO ⁼ Vzm ^x V_P35S ^x VtNOS ^x V CrylAb ^x V PAT/pat, ~ VqmON810 ~ Vzm ^x V_p3ss * VtNOS ^x VCrylAb, ~ VGMON863 ⁼ Vzm * Vp35S ^x VtNOS,

- VGTC1507 = V_Zm ^x Vp3ss ^x VPAT/pat, ~ V GNK603 ⁼ Vzm ^x V_p35S ^x VtNOS ^x VCP4-EPSPS,

- VgT25 ⁼ Vzm ^x Vp35S ^x VPAT/pat,

- VGGA21 ⁼ Vzm ^x VtNOS, ~ VGDAS-59122 ⁼ V_Zm ^x Vp35S ^x VPAT/bar,

- VgmIR604 ⁼ Vzm ^x VtNos ^x VmCry3A,

- V GLY038 ⁼ Vzm ^x V_p35s ^x VtNOS ^x VcordapA ^x ^Glbl, ~ V GMON88017 ⁼ V_Zm ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VCP4-EPSP ^x V Cry3Bb1,

- VGyopas 19/2 ⁼ Vsn ^x Vp35S ^x VPAT/pat, ~ VgmS1 = Vsn ^x VtNOS ^x VPAT/bar,

- Vgrf1 ⁼ Ven ^x VfA/OS ^x vPAT/bar,

- VgrF2 ^{= x} VtNOS ^x VPAT/bar, ~ VgmS8 ~ Vpn ^x VfNOS ^x VPAT/bar,

- VgRF3 - ^Bn ^x V//VOS ^x VPAT/bar, ~ VGMS1/RF1 = Vfin X VtNOS ^x VPAT/bar, ~ Nqmsi/rf2 = Vs_n X VtNOS ^x VPAT/bar, ~ VGMS8/RF3 ⁼ Vs„ X Vf/V0S ^x VpAT/bar,

- VGGT73 ⁼ Vbii ^x V CP4-EPSPS, ~ VGT45 = Vs_n X Vp35S X VPAT/pat, ~ V GLiberator pHoe6/Ac ~ ^Bn ^x Vp35S ^x VPAT/pat, ~ VGGS40/90pHoe6/Ac = ^Βη ^x V_p35S ^x VPAT/pat, ~ V GOXY235 = Vsn X \/p35S ^x Vβχη,

- VGMON40-3-2 ~VGm^x Vp35S ^x VtNOS ^x VCP4-EPSPS, ~ ^GMON89788 = Vem ^X VCP4-EPSPS, ~ VGA2704-12 ⁼ ^ΰπΊ^Χ Vp35S ^x VPAT/pat, ~ ^GA5547-127 = Vg/n ^x Vp35S ^x VPAT/pat, ~ VGLL62 = Vor ^x Vp35S ^x VPAT/bar,

- VGLL06 = Vor^x Vp35S ^x VPAT/bar, ~ VGLL601 ⁼ Vor^x Np35S ^x Vt/\/OS ^x VPA T/bar, ~ VGT120-7 = Vb_v X V_P35S ^x VPAT/pat, ~ ^GH7-1 ~ Vbv ^x Vp35S ^x VCP4-EPSPS, ~ ^GA5-15 ~ ^Bv ^x Vp35S ^x NtNOS ^x V CP4-EPSPS,

-Vqll cotton 25 ~ Vgs ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VPAT/bar, ~ VGMON1445 = Vq_S ^xVp35S ^x VtNOS ^x V CP4-EPSPS, ~ VGMON53 7 = V_Gs ^x V_p35S ^x VtNOS ^x VCrylAc, ~ VGMON15985 = Vqs ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VCrylAc ^x VCrylAc,

- OU VGEH92-527-1 = Vsf ^x VtNOS ^x ^Gbss25 Observe que mesmo que os métodos não testem a presença de todos os ácidos nucléicos a) - u), os acima valores devem ser definidos em termos daqueles ácidos nucléicos a presença do qual é testada eficazmente. Por meio de exemplo e não-limitação, onde a presença dos ácidos nucléicos listados sob j) - n), r) s) e u) como definidos acima, que correspondem a tra30 ços específicos além daqueles definidos sob d) - i), não for testada, então os valores que correspondem aos vários eventos podem ser definidos de uma maneira mais estreita, em particular: valores do evento de milho VGmir604 =

Vzm ^x Vf/vos, VGlY038 ⁼ Vzm ^x Vp35S ^x Vf/vos, VGmON88017 ~ Vzm ^x Vp35S ^x VtNOS x Vcp4-epsp, valor do evento óleo de semente de colza VGoxy235 = Vbp ^x VP35s, valores do evento de algodão VGMon53i = VGS ^x Vp35s ^x Vínos, VGMON15985 ⁼ VG_S ^x Vp3ss ^x VtNos', θ valor do evento de batata VGeh92-527-i ⁼ Vs/ ^x Vwos·

Por conseguinte, a etapa (iii) desta modalidade compreendería executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógicas:

- se VGsamNGx for igual a 1, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um even10 to relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se VGsamNGx for igual a um valor ou um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em valores Vzm, ^Bn, Vem, Vp35S, VfNOS, V CrylAb, VPAT/bar, VPAT/pat, VCP4-EPSPS, V_m. Cry3A, Vcordap A, Veibl, Vcry3Bb1, VBxn, Vor, VBv, Vgs, VcrylAc, Vcry2ab2, Vst and

Vgpss, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se VGsamNGx não for igual a 1 e não for igual a um valor ou um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreen20 dendo ou consistindo em valores V_Zm, V_Sn, V_Gm, V_p35s, Vf/vos, VcyiAb, VpAT/bar, VPAT/pat, VcP4-EPSPS, VmCry3A, VcordapA, ^Glbl, Vcry3Bb1, VBxn, Vor, Vsv, V_Gs, VcrylAc, Vcry2ab2, Vst θ V_GÍ)SS, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.

Em uma outra variante preferida da modalidade acima, se VGsamNGx for igual a 1, e se nenhum valor ou o múltiplo de dois ou mais valores dos conjuntos que representam os eventos (em particular, valores selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em: \IGbíi76, VGetn, VGbUO, VGmON810, VGm0N863, VGtC1SQ7, VGnk603, VGt25, VQgA21, VGdaS-59122,

VG/W/R604, VG/.yo₃8, VGmON88017, VGyopas 19/2, VG/vjsí, VGrrí, VGrf2, VGmS1/RF1,

VQmS1/RF2, VGmS8, VGrf3, VGmS8/RF3, VGgT73, VG7-45, VG Liberator pHoe6/Ac, VGGS40/90pHoe6/Ac, VGqXY235, VGmON40-3-2, VGmON89788, VGa2704-12, VGa5547-127,

VGtt62, VG/.L06, VGu.60í, VG7-Í20-7, VGh7-7, VG/15-75. VG/_í cotton 25, JGm0N1445, VGmon&i, ^G_MOni5985 θ JGeh92-527-i) diferente de VG_X igual a VG_X, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está presente na amostra.

Em uma outra modalidade preferida, os valores únicos atribuídos aos ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u), isto é, valores selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em Vzm, Vs_n, Vem, \/p35S, VtNOS, VcrylAb, V PAT/bar, VPAT/pat, VCP4-EPSPS, VmCry3A, Jcordap A, ^Glbl, Jcry3Bb1, ^Bxn, ^Or, Vbv, Vgs, J CrylAc, Vcry2ab2, Vst θ Vgí>ss, são números únicos primos, e a etapa (iii) compreende executar para cada conjunto de interesse G_x operações lógicas,

- se VG_SA/wA/G_xfor igual a 1, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se VG_Sa/w/VG_x for um número inteiro maior que 1, então 0 material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

- se VGsamNGx não for um número inteiro, então o material de20 rivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.

Os inventores perceberam que o uso de números primos para representar os traços individuais ensaiados (ácidos nucleicos), como descritos no parágrafo anterior, é particularmente direto e vantajosamente agiliza e facilita a análise dos dados.

Em vista disso, os inventores também contemplam a aplicabilidade geral do método de análise de dados aqui explicado usando números primos em outras aplicações, tais como, por exemplo, no campo de biologia molecular ou medicina molecular etc. Consequentemente, em uma aplica30 ção, o método pode ser em geral usado para determinar a composição de uma amostra, em que a dita amostra pode conter dois ou mais eventos diferentes (a palavra evento como usada neste parágrafo tem um significado geral não-limitado a eventos de planta transgênica) ou material dos mesmos, em que cada evento é caracterizado por uma ou mais características ou traços (as palavras características e traços como usadas neste parágrafo carregam um significado geral não-limitado, embora preferivelmente incluindo, ácidos nucleicos). Consequentemente, a amostra como também cada evento pode ser representada como um produto (isto é, operação x) de valores únicos principais atribuídos a cada uma das características ou traços testados, e a presença ou a ausência (potencial) do dito evento ou material do mesmo na dita amostra pode ser testada dividindo (isto é, operação /) o valor obtido para a amostra pelo valor calculado e atribuído a cada evento individual, e considerando o resultado da dita divisão como descrito acima mutatis mutandis.

Em uma modalidade preferida, as etapas de cálculo acima da etapa de método (2) são realizadas por um dispositivo de computação, por exemplo, uma calculadora ou um computador; e em outros aspectos a invenção também contempla um dispositivo de computação que executa os cálculos acima, um portador de dados (por exemplo, um disquete, CD-ROM etc) compreendendo instruções para um dispositivo de computação programável para realizar a etapa (2) do método da invenção, incluindo os cálculos acima, um kit compreendendo tal portador de dados ao lado de um ou mais reagentes também úteis nos métodos da invenção. Também, a invenção contempla uma aplicação baseada em rede que permite executar o algoritmo da etapa (2), opcionalmente em que a informação acerca dos eventos potencialmente presentes na amostra pode ser acessada diretamente em uma base de dados associada por meio de um hipervínculo embutido.

Será apreciado que os identificadores Gsam, Gx, VGsam,

VGx etc usados na descrição acima são arbitrariamente escolhidos aqui para representar os conceitos subjacentes de inter alia conjuntos e valores, respectivamente, e que outros identificadores (por exemplo, outras letras, palavras ou expressões) podem ser substituídos para representar os ditos conjuntos e valores.

Como mencionado, o método da invenção pode preferivelmente avaliar a presença ou ausência de ácidos nucleicos de interesse, especialmente ácidos nucleicos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima, usando amplificação e particularmente amplificação de PCR de amplicons.

Pode ser apreciado que uma pessoa versada pode ser em geral capaz de designar os conjuntos de iniciadores individuais para amplificação específica das sequências de ácido nucléico conhecidas.

Não obstante, como já descrito, a Tabela 1 lista pares de iniciadores particularmente vantajosos que foram projetados cuidadosamente pe10 los inventores para fornecer numerosos benefícios quando usados na metodologia presente. Além disso, a Tabela 4 lista os iniciadores da Tabela 1 e também inclui iniciadores adicionais e pares de iniciadores que também desempenham-se muito satisfatoriamente no presente método, embora os iniciadores da Tabela 1 permanecendo a escolha principal dos inventores. Es15 tes conjuntos de iniciador podem vantajosamente alcançar amplificação dos respectivos ácidos nucleicos quando presentes nos eventos de planta relevantes e de material variadamente processado de planta, e requer várias vantagens como descritas em outro lugar neste relatório descritivo.

Tabela 4. Sequências de iniciador.

Ácido nucléico	Iniciadores
Zm	Dir: 5' CgTCgTTTCCCATCTCTTCCTCC 3' (SEQ ID NO: 1)
(adh-1)	Rev: 5’ CCACTCCgAgACCCTCAgTC 3' (SEQ ID NO: 2)
Zm	Dir: 5' TCTCTTCCTCCTTTAGAGCTACCACTA 3' (SEQ ID NO: 56)
(adh-1)	Rev: 5' AATCGATCCAAAGCGAGATGA 3' (SEQ ID NO: 57)
Bn (ACC)	Dir1: 5’ GAGAATGAGGAGGACCAAGCTC 3' (SEQ ID NO: 4) Dir2: 5'GGTGAGCTGTATAATCGAGCGA 3' (SEQ ID NO: 79) Rev: 5' GGCGCAGCATCGGCT 3' (SEQ ID NO: 3)
Bn	Dir: 5' CAGCTCAACAGTTTCCAAACGA 3' (SEQ ID NO: 24)
(cruciferina)	Rev: 5' CGACCAGCCTCAGCCTTAAG 3' (SEQ ID NO: 25)
Gm (lectina)	Dir: 5' CATTACCTATgATgCCTCCACC 3' (SEQ ID NO: 5) Rev: 5' AAgCACgTCATgCgATTC 3' (SEQ ID NO: 6) Rev': 5' AAgCACgTCATgCgATTCC 3' (SEQ ID NO: 49)

Ácido nucleico	Iniciadores
Gm (lectina) (SLTM)	Dir: 5' AACCGGTAGCGTTGCCAG 3' (SEQ ID NO: 58) Rev': 5' AGCCCATCTGCAAGCCTTT 3' (SEQ ID NO: 59)
p35S (mais longo)	Dir: 5'-GACAGTGGTCCCAAAGATGG-3' (SEQ ID NO: 7) Rev: 5'-GTCTTGCGAAGGATAGTGGG-3' (SEQ ID NO: 8)
p35S (mais curto)	Dir: 5' AAAGCAAGTGGATTGATGTGATA 3' (SEQ ID NO: 60) Rev: 5' GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3' (SEQ ID NO: 61)
tNOS (TNOS-D)	Dir: 5'-GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA-3' (SEQ ID NO: 9) Rev: 5'-TTATCCTAGKTTGCGCGCTATATTT-3' (SEQ ID NO: 10)
tNOS (TNOS-L)	Dir: 5' CGTTCAAACATTTGGCAATAAAG 3' (SEQ ID NO: 28) Rev: 5’ AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC 3' (SEQ ID NO: 29)
CrylAb	Dir: 5'-ACCGGTTACACTCCCATCGA-3' (SEQ ID NO: 11) Rev: 5'-CAGCACCTGGCACGAACTC-3' (SEQ ID NO: 12)
CrylAb	Dir: 5' GACATCATCTGGGGYATCTT 3' (SEQ ID NO: 30) Rev: 5' GCGCTGTTCATGTCGTTGAA 3' (SEQ ID NO: 31)
CrylAb	Dir: 5' ACGCCTTCCTGGTGCAAA 3' (SEQ ID NO: 47) Rev: 5' CCTGGTTCCTGGCGAACTC 3' (SEQ ID NO: 48)
PAT/bar	Dir: 5'-CGTCAACCACTACATCGAGACAA-3' (SEQ ID NO: 13) Rev: 5'-GTCCACTCCTGCGGTTCCT-3' (SEQ ID NO: 14)
PAT/pat	Dir: 5'-CCGCGGTTTGTGATATCGTT-3' (SEQ ID NO: 15) Rev: 5'-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3' (SEQ ID NO: 16)
CP4-EPSPS	Dir1: 5'-GGCTCTGAGCTTCGTCCTCCTAAGG-3' (SEQ ID NO: 17) Dir1': 5'-GGCTCTGAGCTTCGTCCTCTTAAGG-3' (SEQ ID NO: 50) Dir2: 5'-ATCAGTGGCTACAGCCTGCAT-3' (SEQ ID NO: 18) Rev: 5'-GAATGCGGACGGTTCCGGAAAG-3' (SEQ ID NO: 19)
CP4-EPSPS	Dir: 5' GCATGCTTCACGGTGCAA 3’ (SEQ ID NO: 22) Rev: 5' GGACCTGTGGGAGATAGACTTGTC 3' (SEQ ID NO: 23) Rev 1: 5' TGAAGGACCGGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 62) Rev 2: 5' TGAAGGACCTGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 63)
Or	Dir: 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGTT 3' (SEQ ID NO: 20) Dir': 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGT 3' (SEQ ID NO: 51) Rev: 5' CTTAGCATAGTCTGTGCCATCCA 3' (SEQ ID NO: 21)
Bv (GluA3)	Dir: 5’ GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG 3' (SEQ ID NO: 64) Rev: 5' GAGTAATTGCTCCATCCTGTTCA 3' (SEQ ID NO: 65)

Ácido nucleico	Iniciadores
Gs	Dir: 5' AG Π IGI AGGI I ITGATGTTACATTGAG 3' (SEQ ID NO: 66) Rev: 5' GCATCTTTGAACCGCCTACTG 3' (SEQ ID NO: 67)
St (UGPase)	Dir: 5' GGACATGTGAAGAGACGGAGC 3' (SEQ ID NO: 68) Rev: 5' CCTACCTCTACCCCTCCGC 3’ (SEQ ID NO: 69)
planta genérica (Rbcl)	Dir: 5' AGGTCTAADGGRTAAGCTAC 3' (SEQ ID NO: 26) Rev: 5' AGYCTTGATCGTTACAAAGG 3' (SEQ ID NO: 27)

Onde a Tabela 4 incluir mais de uma fileira que concerne amplificação em um certo ácido nucleico (tal como, por exemplo, várias fileiras para CrylAb e CP4-EPSPS) por conjuntos de iniciador diferentes, qualquer um ou mais dos ditos conjuntos de iniciador das ditas fileiras diferentes da Tabela 4 podem ser usados para amplificação. Onde a Tabela 4 lista, dentro de uma fileira só, mais que um iniciador direto e/ou reverso para amplificação em um certo ácido nucleico (tal como, por exemplo, para Bn (ACC), Gm (lectin) ou CP4-EPSPS), qualquer um ou qualquer combinação do(s) dito(s) iniciador(es) direto(s) podem ser usados junto com qualquer um ou com qualquer combinação do(s) dito(s) iniciador(es) reverso(s) para obter amplificação.

Além disso, a invenção também fornece iniciadores variantes que incluem uma ou mais de variações de sequência vis-a-vis os iniciadores listados na Tabela 4, tais como, por exemplo, uma ou mais deleção, inserção e/ou substituição, desde que tais iniciadores/pares de iniciadores ainda possam alcançar amplificação adequada de seus respectivos amplicons. Preferivelmente, tais iniciadores variantes mostrariam pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos iniciadores listados na Tabela 4. Alinhamentos de sequência e determinação de identidade de sequência podem ser feitas, por exemplo, usando a Basic Local Alignament Search Tool (BLAST) originalmente descrita por Altschul et al. 1990 (J Moi Biol 215: 403-10), tal como o algoritmo das sequências de Blast

2 descrito por Tatusova e Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 24772

250).

Além disso, a invenção também contempla iniciadores e pares de iniciadores nested adequados para amplificação de amplicons dentro daqueles amplificados dos respectivos ácidos nucleicos usando os pares de iniciadores listados em quaisquer da Tabela 1 ou Tabela 4.

A invenção também contempla derivados, como descrito em outro lugar neste relatório descritivo, dos iniciadores e pares de iniciadores listados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4.

Consequentemente, a invenção fornece os iniciadores e pares 10 de iniciadores listados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4, como também variantes e derivados dos mesmos, opcionalmente em qualquer combinação adequada dos ditos iniciadores e/ou pares de iniciadores ou variantes ou derivados dos mesmos.

Em um outro aspecto, a invenção fornece produtos de amplifica15 ção obtenível dos respectivos ácidos nucleicos usando os iniciadores e pares de iniciadores acima, e particuíarmente usando pares de iniciadores expostos em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4 ou variantes ou derivados dos mesmos. Os ditos produtos de amplificação podem ser também processados, tais como, por exemplo, isolados, clonados em vetores ou plasmí20 deos adequados, transformados em hospedeiros recombinantes, por exemplo, hospedeiros bacterianos adequados tais como E. coli, propagados com os mesmos e isolados dos mesmos, sequenciados etc.

Vantajosamente, os ditos produtos de amplificação, preferivelmente clonados e reisolados, e possivelmente compreendidos em plasmí25 deos ou vetores adequados, podem ser usados como controles positivos para verificar o funcionamento das etapas de detecção dos métodos da invenção visados para a detecção do respectivo ácido nucleico em uma amostra. Alternativamente ou além disso, tais produtos de amplificação (clonados ou isolados) podem ser usados como calibradores para determinar a quanti30 dade de modelos particulares em uma amostra, por exemplo, em PCR de tempo real.

Consequentemente, em um outro aspecto, a invenção fornece

E. coli recombinante como depositado sob o Tratado de Budapeste com as Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) no dia 10 de janeiro de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP 5458,

LMBP 5459 e LMBP 5460, no dia 6 de março de 2007 sob o número de acesso de LMBP LMBP 5451, e no dia 19 de abril de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 e LMBP 5590.

O dito E. coli recombinante compreende os produtos de amplificação obtidos em eventos de modelo usando conjuntos de iniciador como listados na Tabela 5, clonados nos sítios de EcoRI do vetor de clonagem pUC18 MCS:

Tabela 5

N° de acesso de LMBP	Par de iniciadores	Amplificado no evento	Inserção sequenciada (Figura 1)
LMBP 5460	SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8	BT11	SEQ ID NO: 34
LMBP 5456	SEQ ID NO: 9 SEQ IDNO: 10	40-3-2	SEQ ID NO: 35
LMBP 5452	SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48	MON810	SEQ ID NO: 36
LMBP 5453	SEQ IDNO: 11 SEQ IDNO: 12	Bt176	SEQ ID NO: 37
LMBP 5454	SEQ IDNO: 11 SEQ IDNO: 12	Bt11	SEQ ID NO: 38
LMBP 5457	SEQ IDNO: 13 SEQ ID NO: 14	BT176	SEQ ID NO: 39
LMBP 5455	SEQ IDNO: 15 SEQ IDNO: 16	BT11	SEQ ID NO: 40
LMBP 5458	SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27	Maize Bt 11	SEQ ID NO:41
LMBP 5459	SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27	OSR (óleo de semente de colza) wt	SEQ ID NO:42
LMBP 5451	SEQ ID NO: 28	Bt11	SEQ ID NO:43

N° de acesso de LMBP	Par de iniciadores	Amplificado no evento	Inserção sequenciada (Figura 1)
	SEQ ID NO: 29
LMBP 5587	SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23	RRS soja	SEQ ID NO: 53
LMBP 5588	SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23	GT 73	SEQ ID NO: 54
LMBP 5589	SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25	GT 73	SEQ ID NO: 55
LMBP 5590	SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 21	WT arroz	SEQ ID NO: 52

Além dos plasmídeos e E. coli depositados como listados na

Tabela 5, a invenção também fornece outros plasmídeos exemplares, tais como, por exemplo, pUC18, contendo inserções amplificadas usando, por exemplo:

o par de iniciadores SEQ ID NO: 3 e 4 para o gene Brassica acc (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 44 na Figura 1 amplificada em OSR wt);

pares de iniciadores de CP4-EPSP SEQ ID NO: 18 e 19, e SEQ ID NO: 50 e 19 (inserções exemplares amplificadas, respectivamente, no evento 40-3-2 e evento NK603, para obter as respectivas sequências inseridas exemplares mostradas como SEQ ID NO: 45 e 46 na Figura 1) (iniciador SEQ ID NO: 17 pode também ser usado junto com o iniciador SEQ ID NO: 19; porém, iniciador SEQ ID NO: 17 contêm uma disparidade de sequência no nucleotídeo 20 comparado à SEQ ID NO: 50, a última sendo, portanto, mais preferida);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 1 e 2 para o gene adh-1 de milho (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 32 na Figura 1 amplificada em milho do tipo selvagem);

os pares de iniciadores SEQ ID NO: 5 e 49 para o gene de lec20 tina de soja (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 33 na Figura 1 amplificada em soja do tipo selvagem);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 56 e 57 para um amplicon mais curto dentro do gene de adh-1 de Zea mays (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 70 na Figura 1);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 58 e 59 (SLTM) para um amplicon de lectina de Glycine max (sequência inserida exemplar SEQ ID NO:

71 na Figura 1);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 60 e 61 para um amplicon mais curto dentro do elemento p35S (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 72 na Figura 1);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 64 e 65 para um amplicon 10 dentro do gene de GluA3 de Beta vulgaris (sequência inserida exemplar

SEQ ID NO: 76 na Figura 1);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 66 e 67 para um amplicon dentro do gene sah-7 de Gossypium (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 77 na Figura 1);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 68 e 69 para um amplicon dentro do gene UGPase de batata (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 78 na Figura 1);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 11 e 12 para um amplicon dentro do traço de CrylAb (sequência inserida exemplar SEQ ID NO: 73 na

Figura 1 amplificada em material MON 810);

o par de iniciadores SEQ ID NO: 22 e 62 (RRS) ou 22 e 63 (GT

73) para um amplicon dentro do traço de CP4-EPSPS (sequência inserida exemplar na Figura 1: SEQ ID NO: 74 amplificada em GT73 e SEQ ID NO: 75 amplificada em RRS).

É observado que devido ao tamanho mais curto do amplicon correspondente, o par de iniciadores SEQ ID NO: 22 e 23 ou SEQ ID NO: 22 junto com qualquer um ou ambos iniciadores SEQ ID NO: 62 e 63, pode ser preferivelmente usado para amplificar CP4-EPSPS tanto de material de planta não processado (por exemplo, tecido de planta ou sementes) como tam30 bém material processado (por exemplo, alimento ou ração), enquanto que os pares de iniciadores SEQ ID NO: 18 e 19 ou 50 e 19 que definem um amplicon mais longo podem ser preferivelmente usados em material não proces76 sado. Consequentemente, o par de iniciadores SEQ ID NO: 22 e 23 ou SEQ ID NO: 22 junto com qualquer um ou ambos iniciadores SEQ ID NO: 62 e 63, pode ser mais preferido nos métodos e kits presentes.

A invenção também fornece plasmídeos recombinantes isolados 5 obteníveis das bactérias de E. coli recombinantes listadas na Tabela 5, como também inserções isoladas, preferivelmente inserções de EcoRI, dos mesmos. A invenção também fornece qualquer outro micro-organismo recombinante transformado com os plasmídeos assim isolados.

Uma pessoa versada pode também apreciar que a invenção po10 de também fornecer combinações dos ditos plasmídeos ou inserções dos mesmos, em que as ditas combinações são representativas daqueles ácidos nucleicos que os intencionados a detectar em uma amostra.

Além disso, a invenção também fornece o uso de plasmídeos recombinantes ou inserções como encontrados e obteníveis das bactérias da Tabela 5 ou outras explicadas acima para o uso como controles positivos e/ou calibradores nos métodos da presente invenção. Por exemplo, tais plasmídeos ou inserções dos mesmos podem ser incluídos nos métodos e kits da invenção em quantidades adequadas para também facilitar a tomar uma decisão se o ácido nucleico de um ou mais eventos estiver presente em uma quantidade que justifique quantificação também, ou estiver presente sob um limiar aceitável.

Em um outro desenvolvimento da invenção, é também contemplado que quaisquer dos iniciadores da invenção, tais como em particular os iniciadores listados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4 ou variantes ou derivados dos mesmos, possam ser usados em uma estratégia de caminhada de genoma para identificar sequências adjacentes ao dito iniciador no DNA genômico de um evento. Similarmente, é contemplado que qualquer iniciador projetado em base da sequência de qualquer amplicon da presente invenção, tal como em particular qualquer iniciador localizado dentro ou so30 brepondo com quaisquer das sequências de amplicon SEQ ID NO: 34 a

SEQ ID NO: 78, ou uma variante ou derivado de tal iniciador, pode ser usado em uma estratégia de caminhada de genoma para identificar sequências adjacentes ao dito amplicon no DNA genômico de um evento.

Este aspecto pode ser particularmente útil onde os métodos de amplificação presentes produzem um amplicon tendo características (por exemplo, comprimento, Tm ou sequência) que não pode ser de forma não5 ambígua atribuído a um evento particular. Em tal situação, a caminhada de genoma do amplicon em questão fornecería a informação de sequência adicional acerca do evento e assim ajudaria a identificar o dito evento. Em modalidades particularmente preferidas, o iniciador específico pode ser derivado dos amplicons p35 ou tNOS.

Em geral, estratégias de caminhada de genoma são bemconhecidas na técnica. Exemplos incluem inter alia PCR reversa ou o método de vectorette de Riley et al. 1990 (Nucleic Acids Res 18: 2887-90) comercializado como Universal Vectorette® System (Sigma), como também simplificações posteriores do mesmo (vide, por exemplo, Kilstrup & Kristiansen

2000. Nucleic Acids Res 28: e55).

Em uma modalidade particular, os inventores contemplam um método de caminhada de genoma de duas etapas. Em uma primeira etapa de amplificação, um iniciador marcado LUX® (ou diferente) da invenção é usado junto com uma mistura de iniciadores aleatórios (em geral cerca de 8 a 15 pb de comprimento), e preferivelmente condições de PCR de gradiente de severidade crescente são usadas. A marcação no iniciador permite seguir se a amplificação envolvendo o iniciador marcado está acontecendo. Em uma segunda etapa de amplificação, uma PCR nested é executada usando outro iniciador nested do amplicon, preferivelmente outro LUX® ou do con25 trário marcado, junto com os ditos iniciadores aleatórios, e preferivelmente em condições de PCR de severidade alta. A marcação no iniciador permite seguir se a amplificação envolvendo o iniciador marcado está acontecendo. Eventualmente, o produto assim obtido é sequenciado, assim identificando as sequências adjacentes ao amplicon.

Em outros aspectos, a invenção fornece kits de partes para executar os métodos da presente invenção, isto é, para examinar uma amostra para a presença ou ausência potencial de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica.

Em uma modalidade, um kit de acordo com a invenção pode compreender sondas adequadas para detecção de um ou mais ou todos os ácidos nucleicos listados sob a) - u) acima.

Em uma modalidade, um kit de acordo com a invenção pode compreender iniciadores, preferivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de amplicons de dentro de um ou mais ou todos os ácidos nucleicos listados sob a) - u) como definidos acima.

Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, prefe10 rivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, e preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob a) - i) acima.

Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, preferivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, e preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob a) - i), o), p),

q) et) acima.

Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, preferivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, ou todos ácidos nucleicos listados sob a) - c) acima e um, mais que um ou preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob d) - i) acima.

Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, preferivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, ou todos ácidos nucleicos listados sob a) - c), o), p), q), t) acima e um, mais que um ou preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob d) i) acima.

Além disso, o kit pode também compreender iniciadores ou pares de iniciadores para amplificação de uma sequência de planta genérica, como descrito em outro lugar neste relatório descritivo.

Será apreciado que os iniciadores e pares de iniciadores para amplificação em vários ácidos nucleicos ensinados aqui podem ser incluídos em kits variadamente projetados, de acordo com a preferência sobre que eventos transgênicos deseja-se detectar.

Em uma modalidade preferida, e levando em conta as várias se79 leções de ácidos nucleicos a ser amplificados como debatidos nos parágrafos precedente, o kit pode compreender um ou mais, ou todos os iniciadores, preferivelmente um, mais que um ou todos os pares de iniciadores, como definido em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4, ou variantes ou deriva5 dos dos mesmos.

Em uma modalidade particularmente preferida, um ou ambos iniciadores de qualquer par de iniciadores incluídos no kit podem ser marcados.

Em outra modalidade particularmente preferida, qualquer par de 10 iniciadores incluído no kit pode conter pelo menos um, e usualmente um, iniciador marcado com um fluoroforo adequado e projetado para permitir a detecção de tempo real usando o sistema de detecção LUX® acima descrito.

Em uma outra modalidade, o kit pode também compreender produtos de amplificação, por exemplo, cionados e reisolados e possivel15 mente compreendidos em plasmídeos ou vetores adequados que podem ser usados como controles positivos e/ou calibradores nos métodos da invenção, como explicado acima. Por exemplo, quantidades ou diluições precisamente medidas de tais produtos de amplificação, por exemplo, cionados e reisolados e possivelmente compreendidos em plasmídeos ou vetores ade20 quados, podem ser providas para tais propósitos. Como explicado acima, várias combinações de tais reagentes podem ser também visadas.

Em uma modalidade particular, o kit pode compreender um, mais que um ou todos os organismos de E. coli como listados na Tabela 5, e/ou plasmídeos obteníveis deles, e/ou inserções isoladas, preferivelmente inserções de EcoRI, dos ditos plasmídeos, ou combinações dos mesmos.

Em uma outra modalidade, como já explicado, o kit pode também compreender um portador de dados contendo instruções para um dispositivo de computação programável executar as ações da etapa (2) dos métodos da invenção.

Compreensivelmente, tais kits podem compreender outros componentes, tais como componentes de hibridação úteis, PCR, detecção etc.

Uma pessoa versada apreciará o uso potencial de tais componentes.

Em uma modalidade preferida, o kit pode compreender um ou mais compartimentos de reação, por exemplo compartimentos de reação fornecidos dentro de uma tira ou placa de multipoços (formato de multipoços), cada compartimento compreendendo uma composição de todos os componentes necessários para uma reação de amplificação de PCR (por exemplo, nucleotídeos, sais, polimerase termoestável etc), e incluindo os pares de iniciadores desejados ou mais (onde multiplexados) como definidos acima, mas não incluindo DNA modelo. Consequentemente, a reação de PCR poderia ser iniciada uma vez o usuário introduzisse um DNA de amos10 tra a ser analisado para a dita composição. Opcionalmente, para assegurar estabilidade, Taq ou outra polimerase termoestável pode também ser excluída da composição (mas pode ser incluída separadamente no kit), e pode necessitar ser adicionada pelo usuário. Em geral, a composição pode ser líquida, enquanto especialmente para o propósito de remessa e armazena15 mento ela pode ser congelada. Porém, as composições liofilizadas são também visadas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Condições de amplificação para pares de iniciadores seletos listados nas Tabelas 1 e 4

PCR de tempo real com detecção de SYBR Green foi otimizada para amplificação dos amplicons de ácidos nucleicos p35S, tNOS, CrylAb, PAT/Bar, PAT/pat e CP4-EPSPS usando os respectivos pares de iniciadores listados nas Tabelas 1 e 4.

DNA foi isolado dos eventos contendo (controle positivo) ou não contendo (controle negativo) estes ácidos nucleicos, incluindo eventos Bt11, Bt176, MON810, MON40-3-2, TC 1507, NK603, MS8/RF3 (vide Tabela 5), usando isolamento de CTAB de material de tecido de folha.

Reações de PCR continham SYBR Green Master Mix (Diagenode, ref: GMO-GS2X-A300) 1 x, iniciador direto 250 nM, iniciador reverso 250 nM, DNA Modelo 50 ng em volume total de 20 pl. Ciclagem de PCR envolveu Etapa 1: 1 x [50°C, 120 sj; Etapa 2: 1 x [95°C, 600 sj; e Etapa 3: 40 x [95°C, 15 s, 60°C, 60 s] com aquisição de fluorescência. Applied Biosystems

Prism 7700 foi usado. Análise da curva de fundição foi feita em gradiente de 50°C a 95°C por 1200 s.

Para todos os pares de iniciadores, produtos de amplificação específicos foram obtidos como mostrados por uma Tm específica simples e banda simples em eletroforese em gel de agarose. Os ensaios tiveram LOD baixo:

RBCL: iniciadores SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27; Tm = 76,5°C; tamanho = 95 pb; LOD = ± 0,039 ng DNA-alvo

ADH de Zea mays (amplicon mais longo): iniciadores SEQ ID

NO: 1 e SEQ ID NO: 2; Tm = 79,5°C; tamanho = 138 pb; LOD = ± 0,016 ng DNA-alvo (± 6 genomas haplóides)

ADH de Zea mays (amplicon mais curto): iniciadores SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57; Tm = 75,5°C; tamanho = 83 pb; LOD = ± 0,016 ng DNA-alvo (± 6 genomas haplóides)

ACC de óleo de semente de colza: iniciadores SEQ ID NO: 79 e

SEQ ID NO: 3; Tm = 79°C; tamanho = 103 pb; LOD = ± 0,05 ng DNA-alvo (± 20 genomas haplóides)

Cruciferina de óleo de semente de colza: iniciadores SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25; Tm = 80°C; tamanho = 85 pb; LOD = ± 0,015 ng

DNA-alvo (±12 genomas haplóides)

Lectina de soja (amplicon mais longo): iniciadores SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 49; Tm = 81,5°C; tamanho = 178 pb; LOD = ± 0,016 ng DNAalvo (±13 genomas haplóides)

Soja (lectina): iniciadores SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59 (S25 LTM); Tm = 79,5°C; tamanho = 81 pb; LOD = ± 0,063 ng DNA-alvo (± 50 genomas haplóides)

PLD de arroz: iniciadores SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21; Tm = 76,5°C; tamanho = 80 pb; LOD = ± 0,01 ng DNA-alvo (± 20 genomas haplóides)

GluA3 de açúcar de beterraba: iniciadores SEQ ID NO: 64 e

SEQ ID NO: 65; Tm = 77°C; tamanho = 118 pb; LOD = ± 0,01 ng DNA-alvo (±13 genomas haplóides)

SAH7 de algodão: iniciadores SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 67; Tm = 75,5°C; tamanho = 115 pb; LOD = ± 0,02 ng DNA-alvo (± 9 genomas haplóides)

UGPase de batata: iniciadores SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 5 69; Tm = 81°C; tamanho = 87 pb; LOD = ± 0,0002 ng DNA-alvo p35S (amplicon mais longo): iniciadores SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; Tm = 80,5°C; tamanho = 147 pb; LOD = ± 0,016 ng DNA-alvo (± 6 genomas haplóides) p35S (amplicon mais curto): iniciadores SEQ ID NO: 60 e SEQ 10 ID NO: 61; Tm = 76°C; tamanho = 75 pb; LOD: RRS 100% ± 0,032 ng DNAalvo (± 25 genomas haplóides); NK603 5% ± 6,25 ng DNA-alvo (± 62,5 genomas haplóides) tNOS-L: iniciadores SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29; Tm = 72°C; tamanho = 172 pb; LOD = + 0,03 ng DNA-alvo (± 25 genomas haplói15 des) tNOS-D: iniciadores SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10; Tm = 72°C; tamanho = 69 pb; LOD = ± 0,03 ng DNA-alvo (± 25 genomas haplóides)

CrylAb: iniciadores SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; Tm = 20 78,5°C; tamanho = 73 pb; LOD = ± 0,06 ng (+-12 genomas haplóides)

PAT/Bar: iniciadores SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; Tm = 80°C; tamanho = 69bp; LOD = ± 0,125 ng (± 50 genomas haplóides)

PAT/pat: iniciadores SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16; Tm = 77°C; tamanho = 109 pb; LOD = ± 0,03 ng (± 12 genomas haplóides)

CP4-EPSP: iniciadores SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 62 e SEQ

ID NO: 63; Tm = 80,5 ou 84,5°C; tamanhos = 108 pb; LOD: NK603 5% ± 3,125 ng (± 31 genomas haplóides), RRS 100% ± 0,032 ng (± 25 genomas haplóides), GT73 100% ± 0,016 ng (± 12 genomas haplóides)

CP4-EPSP: iniciadores SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ

ID NO: 19; Tm = 85°C; tamanhos = 94 pb ou 124 pb; LOD = ± 0,03 ng (± 25 genomas haplóides).

Exemplo 2: Método simplificado exemplar de acordo com a invenção

Uma amostra hipotética foi feita acrescentando DNA de Bt176 ao DNA veículo não-relacionado. A amostra foi filtrada para a presença ou ausência de p35S, tNOS”, CrylAb, PAT/Bar, PAT/pat e CP45 EPSPS usando os métodos de PCR de tempo real do Exemplo 1.

O presente método simplificado pretende concluir a presença ou ausência potencial na amostra de material derivado de Bt176, Bt11 e NK603.

Após testar, a amostra foi positiva para p35S, CrylAb e Pat/Bar, mas não para os outros ácidos nucleicos testados. Consequentemente, a amostra pode ser representada como conjunto Gsam e {p35S; CrylAb; Pat/bar}. Neste ensaio exemplar (onde a presença de ácidos nucleicos de Zea mays não é examinada), o evento Bt176 é representado pelo conjunto Gbu76 e {p35S; CrylAb; Pat/bar}, evento Bt11 pelo conjunto G_Btu e {p35S; tNOS; CrylAb; Pat/pat} e evento NK603 pelo conjunto Gnk603 e {p35S;

tNOS; CP4-EPSP}.

Consequentemente, uma vez que G_Bti76 = Gsam, o material do evento Bt176 pode estar presente na amostra. Por outro lado, porque G_Btn * Gsam θ Getn <2 G_Sam, o material de evento Bt11 não está presente na amostra. Similarmente, porque G_NK603 * Gsam θ Gnk603 <2 Gsam, o material do even20 to NK603 não está presente na amostra.

Em uma representação alternativa, p35S, tNOS, CrylAb, PAT/Bar, PAT/pat e CP4-EPSPS são atribuídos os respectivos valores principais V_p35S = 3, VtNOS ⁼ 5, V CrylAb - 7VpAT/Bar =11, VpAT/pat = 13 e VcP4EPSPS =17.

Por conseguinte, o conjunto G_Sam θ atribuído a um valor VGsam que é um múltiplo dos respectivos valores atribuídos aos ácidos nucleicos detectados nele, isto é, VGsam = V_p35S x de VcryiAb x VpAT/Bar = 231. Além disso, o conjunto G_Bti76 é atribuído um valor VG_Bti76 que é um múltiplo dos valores atribuídos àqueles dos ácidos nucleicos testados que são encontrados no evento Bt176, isto é, VG_Bti76 “ V_p35s x de VcryiAb x VpAT/Bar = 231. Analogamente, o conjunto G_Btn é atribuído a um valor VG_Btn = V_p35S x V_fW0S x VcryiAb x VpAT/Pat = 1365; e o conjunto G_Nk603 é atribuído a um valor VG_Nk603 =

Vp35S X 'JfNOS X 'JcP4-EPSP = 255.

Consequentemente, porque VGsAM/VG_Bti76 = 1, o material do evento Bt176 pode estar presente na amostra. Por outro lado, porque VGsam/VGbui = 0,169, isto é, não é 1 e não é um número inteiro maior que 1, o material do evento Bt11 não está presente na amostra. Similarmente, porque VGsam/VGnk603 = 0,906, isto é, não é 1 e não é um número inteiro maior que 1, o material do evento NK603 não está presente na amostra.

Exemplo 3: Descrição exemplar de um kit de acordo com a invenção (arranjo de placa de 96 poços)

Ácidos nucléicos a serem filtrados: Zm, Bn, Gm, p35S, tNOS, CP4-EPSPS, CrylAb, PAT/bar, PAT/pat como definidos acima usando pares de iniciadores como definidos na Tabela 1 acima, como também gene de planta genérica amplificado usando par de iniciadores SEQ ID NO: 26 e 27 (Tabela 4).

Opcionalmente, tal como na solicitação, o kit pode também incluir marcadores de taxonomia para arroz (Or), algodão (Gs), açúcar de beterraba (Bv) e/ou batata (St), usando os pares de iniciadores correspondentes como definidos na Tabela 1.

Condições operacionais dos métodos de Q-PCR de SYBR Green

Reagentes: SYBR Green PCR Master Mix incluindo a HS Taqpolimerase; iniciadores 20 μΜ; água livre de nuclease

Equipamento: ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Sistema de PCR de Tempo Real 7300, fluxo Laminar, Pipetas 20, 200 et 1000 μΙ, Pontas das pipetas estéreis, resistentes a aerossol, placas de rea25 ção de 96 poços ópticas, tampas ópticas

Protocolo: A PCR é conduzida em um ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System ou o Sistema de PCR de Tempo Real 7300 seguindo as instruções do fabricante. Um programa de PCR geral é usado.

Preparação da Mistura de PCR: A Mistura de PCR contém todos 30 os componentes de uma reação de PCR exceto o DNA modelo. Esta operação é realizada em um fluxo laminar que é apenas usado para este tipo de operação.

Tabela 6: Mistura de reação para filtragem de Q-PCR

Componente	Concentração final	μΙ/reação	Reações X
SYBR Green PCR Master Mix (2X)	1 X	12,5 μΙ
Iniciador direto (20 μΜ)	250 nM	0,312 μΙ
Iniciador reverso (20 μΜ)	250 nM	0,312 μΙ
Água livre de nuclease		6,876 μΙ
Volume total:		20 μΙ

Preparação do DNA: O DNA modelo é extraído usando um método de extração de DNA de CTAB padrão e a concentração de DNA é medida por determinação de fluorescência de picogreen.

Arranjo de PCR: O arranjo de PCR é realizado em um fluxo laminar. Os modelos de DNA e a Mistura de PCR são combinados em compartimentos diferentes.

Operação de PCR: A PCR será conduzido seguindo as instruções do fabricante como descritas no Manual do Usuário.

As Condições do Ciclizador Térmico são listadas abaixo na Tabela 7.

Tabela 7: Condições Operacionais do Termociclizador

Etapa	Estágio	T°C	Tempo (s)	Aquisição	Ciclos
1	UNG	50°C	120	nenhuma	1x
2	Ativação de Taq	95°C	600	nenhuma	1x
3	Amplificação Desnaturação Anelamento & Extensão	95°C 60°C	15 60	nenhuma Medida	40x
4	Fundição	50°C a 95°C	1200	Medida	1x

Subsequentemente uma análise da curva de fundição é executada usando um programa-padrão (por exemplo, fundição gradual 50°C a

95°C e monitoramento para diminuição da fluorescência)

Configuração da Placa de 96 poços com filtragem de GMO para produtos de alimentos/ração

Abaixo é descrito o arranjo incluindo todos os marcadores de alimentos/ração gerais, o marcador de arroz (detecção de eventos de arroz sem autorização) e o marcador de Transcriptase Reversa de CAMV (ausência de controle de CaMV).

Arranjo da placa-96:

Planta	Gm	Zm	Bn	Or	p35S	tNos	CP4	CiylAb	PAT/ pat	PAT/ bar	CRT
+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC
Amostra 1 A	Amostra 1 A	Amostra 1 A	Amostra 1A	Amostra 1 A	Amostra 1A	Amostra 1A	Amostra 1 A	Amostra 1 A	Amostra 1 A	Amostra 1 A	Amostra 1 A
Amostra 1 B	Amostra 1B	Amostra 1 B	Amostra 1 B	Amostra 1 B	Amostra 1 B	Amostra 1 B	Amostra 1 B	Amostra 1B	Amostra 1B	Amostra 1 B	Amostra 1 B
Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amos- tra2A	Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amostra 2 A	Amostra 2 A
Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B	Amostra 2 B

Controles positivos (+) seriam os amplicons correspondentes (plasmídeos ou inserções) como descritos aqui em particular nos ampli10 cons da Tabela 5 em um certo número de cópias (por exemplo 100 cópias/poço)

Seria tecnicamente previsto que os poços de amostra pudessem ser abertos sequencialmente (por exemplo primeiro os controles positivos, depois as amostras, e último os controles NTC e negativos).

Os valores Ct e valores Tm para cada poço são registrados e usados na análise de decisão para determinação do conjunto Gm presente nas respectivas amostras.

Note que em princípio também cada fileira poderia ser produzida separadamente em um arranjo alternativo (por meio do qual flexibilidade aumentada pelo cliente é alcançada).

Exemplo 4: Multiplex PCR de p35S, tNOS

O presente exemplo mostra amplificação de multiplex PCR exemplar dos amplicons p35S e tNOS, em que a detecção é feita por SYBR «

Green e os produtos de amplificação são distinguidos em base de uma diferença em suas temperaturas de fundição (Tm).

Pares de iniciador usados (20 μΜ): p35S: SEQ ID NO: 60 e 61 tNOS: SEQ IDNO:9e10

Modelo (50 ng): Roundup Ready Soybean (RRS) 100% (controle positivo duplo)

Programa de PCR: 95°C 10', (95°C 15, 60°C 1') x 40 ciclos

Programa de fundição: 50°C a 95°C em 20'

Multiplexação dos métodos de PCR p35S e tNOS em SYBR Green é possível uma vez que ambos os amplicons são distinguíveis graças à Tm diferente (vide Figura 2). Assim é possível adquirir informação com uma PCR na presença de dois alvos diferentes que são p35S e tNOS. Exemplo 5: Possibilidades de multiplexação adicionais ao usar SYBR Green

Experimentos análogos àqueles do exemplo 4 também definiram a viabilidade das combinações de multiplexação a seguir:

1. Adh-1 de milho (SEQ ID NO: 56 e 57) com SLTM de soja (SEQ ID NO: 58 e 59)

2. Adh-1 de milho (SEQ ID NO: 56 e 57) com cruciferina de óleo de semente de colza (SEQ ID NO: 24 e 25)

3. SLTM de soja (SEQ ID NO: 58 e 59) com sah-7 de algodão (SEQ ID NO: 66 e 67)

4. sah-7 de algodão (SEQ ID NO: 66 e 67) com cruciferina de óleo de semente de colza (SEQ ID NO: 24 e 25)

Exemplo 6: Parâmetros de PCR de tempo real usando os iniciadores da invenção

Reações usando condições e iniciadores como definidos no exemplo 1 foram executadas em um número de cópia definido de plasmídeos de referência contendo as respectivas inserções de amplicon, e fluorescência relativa (RFU) seguindo 40 ciclos (isto é, próximo ou tendo alcançado o planalto) foi determinada. Os resultados na Tabela 8 (os resultados usando +/- 8300 cópias modelos são também graficamente representados na Figura

3) mostram que os presentes métodos e iniciadores são capazes de gerar valores de RFU em planalto de pelo menos 2500, que fica dentro de uma margem de 3 vezes.

Tabela 8

	Alvo de PCR (Iniciadores usados: SEQ ID NO Dir + Rev)	Modelo de plasmideo	RFU médio 40 ciclos com 1000 cópias de modelo de plasmídeos	RFU médio 40 ciclos com +/- 8300 cópias de modelo de plasmídeos	Tamanho do amplicon
1	RbcL (26 + 27)	OSR de RbcL Wt	2581,58	4369,51	95
2	ADH mais longo (1+2)	ADH longo	4248,58	5447,4	135
3	ADH mais curto (56 + 57)	ADH alt	2434,16	4210,28	84
4	Lectina mais longa (5 + 49)	Lee longo	3854,97	5969,65	178
5	SLTM de lectina (58 + 59)	SLTM	5943,98	6713,95	74
6	Cru770 (24 + 25)	Cru770	4614,59	6768,95	85
7	p35S mais longo (7 + 8)	p35S longo	3490,22	4792,49	147
8	p35S mais curto (60 + 61)	p35S curto	3963,27	6173,37	75
9	tNOS-D (9 + 10)	tNOS-D	2339,11	3731,95	69
10	CrylAb (11 + 12)	CrylAb Bt11	4299,47	6973,77	73
11	CrylAb (11 + 12)	CrylAb MON810	3957,05	6759,2	73
12	CrylAb (11 + 12)	CrylAb Bt11 e CrylAb MON810	4028,97	6641,04	73
13	CP4 (22 + 62 + 63)	CP4-RRS	3235,24	5098,82	108

	Alvo de PCR (Iniciadores usados: SEQ ID NO Dir + Rev)	Modelo de plasmideo	RFU médio 40 ciclos com 1000 cópias de modelo de plasmídeos	RFU médio 40 ciclos com +/- 8300 cópias de modelo de plasmídeos	Tamanho do amplicon
14	CP4 (22 + 62 + 63)	CP4-GT73	2641,86	4968,28	108
15	CP4 (22 + 62 + 63)	CP4-RRS e P4-GT73	3157,24	5034,91	108
16	Pat-Pat (15+16)	Pat-Pat	2299,71	4875,61	109
17	Pat-Bar (13 + 14)	Pat-Bar	4839,79	7370,7	69
	Média:	3642,93	5641,17
	Des. Padrão:	1011,93	1106,76
	Média:	3854,97	5447,40
	Mínimo:	2299,71	3731,95
	Máximo:	5943,98	7370,7

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   5 (1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo:

   - um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados de: a) Zm: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Zea mays, preferivelmente Zea mays ssp. mays,

   10 b) Bn: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Brassica napus,

   c) Gm: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Glycine max,

   o) Or: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia 15 de Oryza sativa,

   p) Bv: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Beta vulgaris,

   q) Gs: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Gossypium, e

   20 t) St: um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Solanum tuberosum; e

   - todos ácidos nucleicos de d) a i):

   d) p35S: um ácido nucleico derivado do promotor 35S do Vírus do Mosaico de Couve-flor,

   25 e) tNOS: um ácido nucleico derivado do terminador de 3' do gene de nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens,

   f) CrylAb: um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristal CrylAb de Bacillus thuringiensis,

   g) PAT/bar: um ácido nucleico derivado do gene de

   30 fosfinotricina acetiltransferase (PAT) bar de Streptomyces hygroscopicus,

   h) PAT/pat: um ácido nucleico derivado do gene de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) pat de Streptomyces

   Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 14/35 viridochromogenes,

   i) CP4-EPSPS: um ácido nucleico derivado do gene de 5-Enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material

   5 derivado de um ou mais eventos de planta transgênica selecionados do grupo compreendendo: eventos Bt176, Bt11, Bt1O, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038, MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac,

   10 GS40/ 90pHoe6/Ac, OXY235, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1,

   MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 403-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos, eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos

   15 T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; e evento EH92-527-1 e eventos relacionados dos mesmos, em que na etapa (1) a presença ou ausência dos ácidos

   20 nucleicos em uma amostra é detectada usando amplificação por PCR, preferivelmente amplificação por PCR em tempo real, usando os respectivos pares de iniciadores da tabela a seguir, ou variantes apresentando pelo menos 85% de identidade de sequência com os ditos pares de iniciadores, em que os iniciadores ou pares de iniciadores podem ser opcionalmente

   25 marcados para permitir a detecção:

   Zm Dir: 5' TCTCTTCCTCCTTTAGAGCTACCACTA 3' (SEQ ID NO: 56) Rev: 5' AATCGATCCAAAGCGAGATGA 3' (SEQ ID NO: 57) Bn Dir: 5' CAGCTCAACAGTTTCCAAACGA 3' (SEQ ID NO: 24) Rev: 5' CGACCAGCCTCAGCCTTAAG 3' (SEQ ID NO: 25)

   Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 15/35

   Gm Dir: 5' AACCGGTAGCGTTGCCAG 3' (SEQ ID NO: 58) Rev': 5' AGCCCATCTGCAAGCCTTT 3' (SEQ ID NO: 59) p35S Dir: 5' AAAGCAAGTGGATTGATGTGATA 3' (SEQ ID NO: 60) Rev: 5' GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3' (SEQ ID NO: 61) tNOS Dir: 5'-GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA-3' (SEQ ID NO: 9) Rev: 5'-TTATCCTAGKTTGCGCGCTATATTT-3' (SEQ ID NO: 10) CrylAb Dir: 5'-ACCGGTTACACTCCCATCGA-3' (SEQ ID NO: 11) Rev: 5'-CAGCACCTGGCACGAACTC-3' (SEQ ID NO: 12) PAT/bar Dir: 5'-CGTCAACCACTACATCGAGACAA-3' (SEQ ID NO: 13) Rev: 5'-GTCCACTCCTGCGGTTCCT-3' (SEQ ID NO: 14) PAT/pat Dir: 5'-CCGCGGTTTGTGATATCGTT-3' (SEQ ID NO: 15) Rev: 5'-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3' (SEQ ID NO: 16) CP4- EPSPS Dir: 5' GCATGCTTCACGGTGCAA 3' (SEQ ID NO: 22) Rev: 5' GGACCTGTGGGAGATAGACTTGTC 3' (SEQ ID NO: 23) Rev 1: 5' TGAAGGACCGGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 62) Rev 2: 5' TGAAGGACCTGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 63) Or Dir¹: 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGT 3' (SEQ ID NO: 51) Rev: 5' CTTAGCATAGTCTGTGCCATCCA 3' (SEQ ID NO: 21) Bv Dir: 5' GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG 3' (SEQ ID NO: 64) Rev: 5' GAGTAATTGCTCCATCCTGTTCA 3' (SEQ ID NO: 65) Gs Dir: 5' AGTTTGTAGGTTTTGATGTTACATTGAG 3' (SEQ ID NO: 66) Rev: 5' GCATCTTTGAACCGCCTACTG 3' (SEQ ID NO: 67) St Dir: 5' GGACATGTGAAGAGACGGAGC 3' (SEQ ID NO: 68) Rev: 5' CCTACCTCTACCCCTCCGC 3' (SEQ ID NO: 69)
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (1) envolve detectar a presença ou ausência na amostra

   Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 16/35 de ácidos nucleicos compreendendo todos os ácidos nucleicos listados sob a) - c) e d) - i).
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que
4. 5 - a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucléico j) mCry3A: um ácido nucléico derivado do gene de proteína de cristais modificado Cry3A de Bacillus thuringiensis; e/ou

   - a etapa (1) também compreende detectar a presença ou

   10 ausência na amostra de um ou ambos ácidos nucleicos k) cordapA: um ácido nucléico derivado do gene de di-hidrodipicolinato sintase insensível à lisina (cDHDPS) cordapA de Corynebacteríum glutamicum e/ou I) Glb1: um ácido nucléico derivado do promotor Glb1 de milho; e/ou

   - a etapa (1) também compreende detectar a presença ou

   15 ausência na amostra de ácido nucléico m) Cry3Bb1: um ácido nucléico derivado do gene de proteína de cristais Cry3Bb1 de Bacillus thuringiensis; e/ou

   - a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucléico n) Bxn: um ácido nucléico derivado

   20 do gene de nitrilase Bxn de Klebsiella pneumoniae spp. ozaenae; e/ou

   - a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de um ou ambos dos ácidos nucleicos r) CrylAc: um ácido nucléico derivado do gene de proteína de cristais CrylAc de Bacillus thuringiensis e/ou s) Cry2Ab2: um ácido nucléico derivado do gene de

   25 proteína de cristais Cry2Ab2 de Bacillus thuringiensis; e/ou

   - a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucléico u) GBSS: um ácido nucléico derivado do gene amido sintase ligada ao grânulo Gbss de Solanum tuberosum.

   30 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   3, caracterizado pelo fato de que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de um ácido nucléico genérico derivado

   Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 17/35 de planta, preferivelmente derivado da subunidade pequena cloroplástica do gene Rubisco ou do gene CHL-tRNA sintetase.

   5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a presença ou ausência do dito ácido nucleico genérico derivado

   5 de planta é detectada usando amplificação por PCR, preferivelmente amplificação por PCR em tempo real, usando o par de iniciadores 5' AGGTCTAADGGRTAAGCTAC 3' (SEQ ID NO: 26) e 5' AGYCTTGATCGTTACAAAGG 3' (SEQ ID NO: 27), ou variante apresentando pelo menos 85% de identidade de sequência com o dito par

   10 de iniciadores, opcionalmente em que o iniciador ou par de iniciadores é marcado para permitir a detecção.
5. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   5, caracterizado pelo fato de que a amplificação por PCR dos ácidos nucléicos é realizada simultaneamente nas mesmas condições de ciclagem

   15 de temperatura.
6. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   6, caracterizado pelo fato de que a amplificação por PCR de dois ou mais ácidos nucléicos é multiplexada.
7. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   20 7, caracterizado pelo fato de que os produtos de amplificação são detectados usando um método de detecção que é substancial mente sequência não-específico, preferencialmente usando um corante fluorescente de ligação a DNA, mais preferencialmente usando SYBR Green ou PicoGreen.

   25
8. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   8, caracterizado pelo fato de que a especificidade dos produtos de amplificação é também verificada, preferencialmente usando análise de curva de dissociação (Tm) e/ou determinação de tamanho através de eletroforese em gel.

   30 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   7, caracterizado pelo fato de que os produtos de amplificação são detectados por meio de uma marcação de fluoroforo presente em pelo

   Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 18/35 menos um iniciador do par de iniciadores, tal como usando tecnologia de Light Upon Extention (LUX®).

   11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
9. 10, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende plantas ou partes

   5 das mesmas, incluindo flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, frutas, pericarpo, vagens, folhas, petíolos, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos ou brotos, ou porções dos mesmos, células de planta, protoplastos de planta e/ou tecidos de planta, e/ou material derivado de planta, preferivelmente material de alimento ou ração, incluindo material

   10 processado de alimento ou ração.

   12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
10. 11, caracterizado pelo fato de que na etapa (1) a presença ou ausência dos ácidos nucleicos em uma amostra é detectada usando amplificação por PCR, preferencialmente amplificação por PCR em tempo real, usando os

    15 respectivos pares de iniciadores da tabela a seguir, ou variantes apresentando pelo menos 85% de identidade de sequência com os ditos pares de iniciadores, em que os iniciadores ou pares de iniciadores podem ser opcionalmente marcados para permitir a detecção:

    Zm Dir: 5' CgTCgTTTCCCATCTCTTCCTCC 3' (SEQ ID NO: 1) Rev: 5' CCACTCCgAgACCCTCAgTC 3' (SEQ ID NO: 2) Zm Dir: 5' TCTCTTCCTCCTTTAGAGCTACCACTA 3' (SEQ ID NO: 56) Rev: 5' AATCGATCCAAAGCGAGATGA 3' (SEQ ID NO: 57) Bn Dir1: 5' GAGAATGAGGAGGACCAAGCTC 3' (SEQ ID NO: 4) Dir2: 5'GGTGAGCTGTATAATCGAGCGA 3' (SEQ ID NO: 79) Rev: 5' GGCGCAGCATCGGCT 3' (SEQ ID NO: 3) Bn Dir: 5' CAGCTCAACAGTTTCCAAACGA 3' (SEQ ID NO: 24) Rev: 5' CGACCAGCCTCAGCCTTAAG 3' (SEQ ID NO: 25) Gm Dir: 5' CATTACCTATgATgCCTCCACC 3' (SEQ ID NO: 5) Rev: 5' AAgCACgTCATgCgATTC 3' (SEQ ID NO: 6)

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 19/35

    Rev': 5' AAgCACgTCATgCgATTCC 3' (SEQ ID NO: 49) Gm Dir: 5' AACCGGTAGCGTTGCCAG 3' (SEQ ID NO: 58) Rev': 5' AGCCCATCTGCAAGCCTTT 3' (SEQ ID NO: 59) p35S Dir: 5'-GACAGTGGTCCCAAAGATGG-3' (SEQ ID NO: 7) Rev: 5'-GTCTTGCGAAGGATAGTGGG-3' (SEQ ID NO: 8) p35S Dir: 5' AAAGCAAGTGGATTGATGTGATA 3' (SEQ ID NO: 60) Rev: 5' GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3' (SEQ ID NO: 61) tNOS Dir: 5'-GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA-3' (SEQ ID NO: 9) Rev: 5'-TTATCCTAGKTTGCGCGCTATATTT-3' (SEQ ID NO: 10) tNOS Dir: 5' CGTTCAAACATTTGGCAATAAAG 3' (SEQ ID NO: 28) Rev: 5' AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC 3' (SEQ ID NO: 29) CrylAb Dir: 5'-ACCGGTTACACTCCCATCGA-3' (SEQ ID NO: 11) Rev: 5'-CAGCACCTGGCACGAACTC-3' (SEQ ID NO: 12) CrylAb Dir: 5' GACATCATCTGGGGYATCTT 3' (SEQ ID NO: 30) Rev: 5' GCGCTGTTCATGTCGTTGAA 3' (SEQ ID NO: 31) CrylAb Dir: 5' ACGCCTTCCTGGTGCAAA 3' (SEQ ID NO: 47) Rev: 5' CCTGGTTCCTGGCGAACTC 3' (SEQ ID NO: 48) PAT/bar Dir: 5'-CGTCAACCACTACATCGAGACAA-3' (SEQ ID NO: 13) Rev: 5'-GTCCACTCCTGCGGTTCCT-3' (SEQ ID NO: 14) PAT/pat Dir: 5'-CCGCGGTTTGTGATATCGTT-3' (SEQ ID NO: 15) Rev: 5'-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3' (SEQ ID NO: 16) CP4- EPSPS Dir1: 5'-GGCTCTGAGCTTCGTCCTCCTAAGG-3' (SEQ ID NO: 17) DirT: 5'-GGCTCTGAGCTTCGTCCTCTTAAGG-3' (SEQ ID NO: 50) Dir2: 5'-ATCAGTGGCTACAGCCTGCAT-3' (SEQ ID NO: 18) Rev: 5'-GAATGCGGACGGTTCCGGAAAG-3' (SEQ ID NO: 19)

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 20/35

    CP4- EPSPS Dir: 5' GCATGCTTCACGGTGCAA 3' (SEQ ID NO: 22) Rev: 5' GGACCTGTGGGAGATAGACTTGTC 3' (SEQ ID NO: 23) Rev 1: 5' TGAAGGACCGGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 62) Rev 2: 5' TGAAGGACCTGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 63) Or Dir: 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGTT 3' (SEQ ID NO: 20) Dir¹: 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGT 3' (SEQ ID NO: 51) Rev: 5' CTTAGCATAGTCTGTGCCATCCA 3' (SEQ ID NO: 21) Bv Dir: 5' GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG 3' (SEQ ID NO: 64) Rev: 5' GAGTAATTGCTCCATCCTGTTCA 3' (SEQ ID NO: 65) Gs Dir: 5' AGTTTGTAGGTTTTGATGTTACATTGAG 3' (SEQ ID NO: 66) Rev: 5' GCATCTTTGAACCGCCTACTG 3' (SEQ ID NO: 67) St Dir: 5' GGACATGTGAAGAGACGGAGC 3' (SEQ ID NO: 68) Rev: 5' CCTACCTCTACCCCTCCGC 3' (SEQ ID NO: 69) Generic plant Dir: 5' AGGTCTAADGGRTAAGCTAC 3' (SEQ ID NO: 26) Rev: 5' AGYCTTGATCGTTACAAAGG 3' (SEQ ID NO: 27)

    13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
11. 12, caracterizado pelo fato de que a etapa (2) compreende as etapas de:

    (i) definir um conjunto Gsam consistindo em ácidos nucleicos detectados na etapa (1) como estando presentes na amostra;

    (ii) definir um ou mais conjuntos de interesse (Gx) escolhidos do grupo de conjuntos compreendendo ou consistindo em conjuntos Θβ^ζβ, ii ii/* n ii/* n ii/* n ii/* n ii/* n ii/* n ii/* n > \2Bt10 > \JMON810 > ^MON863 > ^TC1507 , ^NK603 , ^T25 , ^GA21 ,

    II/* II II/* II II/* II H/* II II/* II ’/* II ’/* II ’/* II

    DAS-59122 , ^MIR604 , ^LY038 > ^MON88017 , Topas 19/2 , <JMS1 > ^RF1 , ^RF2 , „/* II II/* II II/* II II/* II II/* II II/* II II/* II ll/* <3MS1/RF1 , {3MS1/RF2 > ^MS8 > ^RF3 > ^MS8/RF3 > ^GT73 > ^T45 > ^Liberator pHoe6/Ac, GGS40/90pHoe6/Ac. GqxY235', GmON40-3-2 , GmON89788 . Ga2704-12,

    II/* II II/* II H/* II II/* II ’/* II ’/* II ’/* II ’/* II {3A5547-127 , ^>LL62 , ^>LL06 , ^>LL601 , ^>T120-7 , ^>H7-1 , ^>A5-15 , ^>LL cotton 25 ,

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 21/35

    Gmoni445, Gmon53i, Gmoni5985 θ Geh92-527-i; correspondendo aos respectivos um ou mais eventos de planta transgênica de interesse (X) escolhidos do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt1O, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, A21, DAS-59122,

    5 MIR604, LY038, MON88017, Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, MS1/RF1,

    MS1/RF2, MS8, RF3, MS8/RF3, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235; MON40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547127, LL62, LL06, LL601, T120-7, H7-1, A5-15, LL algodão 25, MON 1445, MON531, MON15985 e EH92-527-1, em que:

    10 - Geti76 e {Zm; p35S; CrylAb; PAT/bar},

    - Gsfíí e {Zm; p35S; tNOS; CrylAb; PAT/pat},

    - Gsfío e {Zm; p35S; tNOS; CrylAb; PAT/pat},

    - Gmon8io e {Zm; p35S; tNOS; CrylAb},

    - Gmon863 e {Zm; p35S; tNOS},

    GtC1507 é {Zm; p35S; PAT/pat},

    - Gnk603 e {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS},

    - Gt25 e {Zm; p35S; PAT/pat},

    - Gga2i ^e {Zm; tNOS},

    - Gdas-59122 e {Zm; p35S; PAT/bar},

    - Gmir604 e {Zm; tNOS; mCry3A}, ou Gmir604 e {Zm; tNOS}

    - Gl.yo38 e {Zm; p35S; tNOS; cordapA; Glb1}, ou Glyo38 e {Zm; p35S; tNOS}, Gmon88017 ε {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS; Cry3Bb1}, ou Gmon88017 e {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, G Topas 19/2 e {Bn; p35S; PAT/pat},

    - Gmsi e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    - Grfi e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    - Grf2 e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    - Gmsi/rfi e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    - Gmsi/rf2 e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    - Gms8 e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    - Gr_F3 e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 22/35

    - Gms8/rf3 e {Bn; tNOS; PAT/bar},

    - G_Gt73 e {Bn; CP4-EPSPS},

    - Gt45 e {Bn; p35S; PAT/pat}, ^- GuberatorpHoe6/Ac e {Bn; p35S; PAT/pat},

    5 - GGS40/90pHoe6/Ac e {Bn; p35S; PAT/pat},

    - G0XY235 e {Bn; p35S; Bxn}, ou G0XY235 e {Bn; p35S};

    Gmon4o-3-2 e {Gm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS},

    - Gmon89788 e {Gm; CP4-EPSPS}

    - GA2704-12 e {Gm; p35S; PAT/pat},

    10 - GA5547-127 e {Gm; p35S; PAT/pat},

    - Gll62 e {Or; p35S; PAT/bar},

    - Gllo6 e {Or; p35S; PAT/bar}

    - Gll6oi e {Or; p35S; tNOS; PAT/bar},

    - Gt120-7 £ {Bv; p35S; PAT/pat},

    15 - G_H7-i e {Bv; p35S; CP4-EPSPS},

    - Gas-is e {Bv; p35S; tNOS; CP4-EPSPS},

    - Gu.cotton25 e {Gs; p35S; tNOS; PAT/bar}, Gmoni445 e {Gs; p35S; tNOS; CP4-EPSPS},

    - Gmon53i e {Gs; p35S; tNOS; crylAc}, ou Gmons3i e {Gs; p35S;

    20 tNOS}

    - Gmoni5985 e {Gs; p35S; tNOS; crylAc; cry2Ab2} ou Gmonis985 e {Gs; p35S; tNOS}, e

    - Geh92-527-i e {St; tNOS; Gbss} ou GEH92-527-1 e {St; tNOS};

    (iii) executar para cada conjunto de interesse Gx operações

    25 lógicas:

    - se Gx for igual a Gsam (Gx = Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

    - se Gx for um subconjunto apropriado de Gsam (Gx cz Gsam), 30 então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 23/35

    - se Gx não for igual a Gsam θ Gx não for um subconjunto apropriado de Gsam, (Gx * Gsam e Gx Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
12. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que se Gxfor igual a Gsam, θ se nenhum conjunto ou a soma de dois ou mais conjuntos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em Gbh78, Getn, Getio, Gmonsio, Gmon863, Gtciso7, Gnk603, Gt25, GgA21, GdAS-59122, GmIR604, GlY038, GmON88017,Gtopss 19/2, GmS1, Grfi, Grf2, GmS1/RF1, GmS1/RF2, GmS8, Grf3, GmS8/RF3, GgT73, Gt45, GLiberator pHoe6/Ac, GGS40/90pHoe6/Ac, GoXY235, GmON40-3-2, GmON89788, Ga2704-12, Ga5547-127, GlL62,

    GlL06, GlL601, Gt120-7, Gh7-1, Ga5-15, Gll cotton 25, GmON1445, GmON531, GmON15985 diferente de Gxfor igual a Gx, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, estará presente na amostra.
13. 15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em Zm, Bn, Gm, p35S, tNOS, CrylAb, PAT/bar, PAT/pat, CP4-EPSPS, mCry3A, cordap A, Glb1, Cry3Bb1, Bxn, Or, Bv, Gs, CrylAc, Cry2ab2, St e Gbss são atribuídos os respectivos valores únicos V_Zm, V_s„, V_Gm, V_p35S, V_tN0S, VcryiAb, ll\ / II ll\ / II ll\ / II ll\ / II ll\ / II ll\ / II ll\ / II ll\ / II

    V PAT/bar , V PAT/pat , VCP4-EPSPS > V_mCry3A , Vcordap A , VGIbl , VCry3Bb1 , V Bxn ,

    V_Or, Vbv, Vgs, VcryiAc, Vcry2ab₂, Vst e V_Gi)SS; em que cada conjunto de interesse Gx é atribuído um valor VGx escolhido do grupo compreendendo, consistindo em valores VGsfí76, VGsfn, VGsfío, VV3MON810 , v1jmON863 , v(jtC1507 , ν^ΝΚ603 , V V3T25 , vtjQA21 , VUdASΙΙ\ //* II ΙΙ\ //* II ΙΙ\ //* II ΙΙ\ //* II ΙΙ\ //* II ΙΙ\ //* II ΙΙ\ //* II

    VLJRF2 , VV3MS1/RF1 , VV3MS1/RF2 , V^MS8 , V(jrf3 , VV3MS8/RF3 , V\JQT73 , V1JT45 , Liberator pHoe6/Ac , V^GS40/90pHoe6/Ac , ν^ΟΧΥ235 , ν^ΜΟΝ40-3-2 , ”VGmON89788 , VGa2704-12 , VGa5547-127 , VGlL62, VGi_L06, VGlL60i, VGt120II ll\ //* II ll\ //* II ll\ //* II ll\ //* II ll\ //* II ll\ //* II —

    7 , v\JH7-1 , v1ja5-15 , V^LL cotton 25 , ν^ΜΟΝ1445 , ν^ΜΟΝ531 , ν^ΜΟΝ15985 &

    VGeh92-527-i, ©m que:

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 24/35

    - VGfifí76 ⁼ Vz_m ^x Vp35S * V QrylAb * VPAT/bar,

    - VGfifíí = Vz_m ^x V_P35S ^x VfNOS ^x VcrylAb ^x VPAT/pat,

    - VGfifío ⁼ Vzm ^x Vp35S ^x VfNOS ^x VcrylAb ^x VPAT/pat, ~ VGmON810 ⁼ V Zm ^x Vp35S ^x VfNOS ^x VcrylAb,

    5 - VGmON863 ⁼ Vzm ^x Vp35S * VfNOS,

    - VGtC1507 ⁼ VZm ^x Vp35S * VPAT/pat,

    - VGnK603 ⁼ VZm ^x Vp35S ^x VfNOS ^x VCP4-EPSPS,

    - \/Gt25 ⁼ VZm ^x Vp35S ^x VPAT/pat,

    - VGgA21 = Vzm * VfNOS,

    10 - VGdaS-59122 ⁼ Vzm ^x V_P35S * VPAT/bar,

    - VGmIR604 ⁼ VZm ^x VfNOS ^x V_mCry3A, OU VGmIR604 ⁼ Vzm * VfNOS,

    - VGf_Y038 ⁼ VZm ^x Vp35S ^x VfNOS ^x VcordapA ^x Vg/óí, OU VGf_Y038 ⁼ VZm ^x Vp35S * VfNOS,

    - VGmON88017 ⁼ Vzm ^x V_P3SS ^x VfNOS * VqP4-EPSP ^x Vcry3Bb1, OU VGmON88017 ⁼ VZm 15 ^x Vp35S ^x VfNOS * VCP4-EPSP,

    - VG Topas 19/2 = VBn ^x V_p35S ^x VPAT/pat, ~ VGmS1 ⁼ VBn ^x VfNOS ^x VPAT/bar,

    - VGrfi = V Bn ^x VfNOS ^x VpAT/bar,

    - VGrf2 ⁼ VBn ^x VfNOS ^x VpAT/bar,

    20 - VGmS8 ⁼ V Bn ^x VfNOS ^x VpAT/bar,

    - VGrf3 ⁼ VBn ^x VfNOS ^x VpAT/bar, ~ VGmS1/RF1 ⁼ VBn ^x VfNOS ^x VpAT/bar, ~ VGmS1/RF2 ⁼ VBn ^x VfNOS ^x VpAT/bar, ~ VGmS8/RF3 ⁼ VBn ^x VfNOS ^x VpAT/bar,

    25 - VGgT73 ⁼ V Bn ^x VCP4-EPSPS,

    - VGt45 ⁼ VBn ^x V_P3SS ^x VPAT/pat, ~ VGfJberatorpHoe6/Ac ~ VBn ^x Vp35S ^x VPAT/pat,

    - VGGS40/90pHoe6/Ac ⁼ VBn ^x V_p35S * VPAT/pat, ~ VGOXY235 ⁼ VBn ^x Vp3SS ^x VBxn, OU VGoXY235 ⁼ VBn ^x Vp3SS,

    30 - VGMON40-3-2 ⁼ V Gm * Vp35S * VfNOS * VqP4-EPSPS,

    - VGmON89788 ⁼ Vom * VqP4-EPSPS,

    - VGa2704-12 ⁼ VGm * V_p3ss * VPAT/pat,

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 25/35

    - VGa5547-127 ⁼ Vem ^x Vp35S ^x V PAT/pat,

    - VGlL62 = Vor ^x Vp35S ^x ^PAT/bar,

    - \/Gu_06 = Vor ^x Vp35S ^x V PAT/bar, ~ VGll.601 ⁼ Vor ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VpAT/bar,

    5 - VG-T120-7 = Vb_v X Vp35S ^x vPAT/pat,

    - VGh7-í = Vfiv X Vp35S ^x VCP4-EPSPS,

    - \/Ga5-15 ⁼ V Bv ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VcP4-EPSPS,

    -VGll cotton 25 ~ V_Gs ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VPAT/bar, ~ VGmON1445 ⁼ VGs ^x Vp35S ^x VtNOS ^x V_GP4-EPSPS,

    10 - VGmON531 ⁼ Vgs ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VGry1Ac, OU VGmON531 ⁼ Vqs ^x Vp35S ^x VtNOS,

    - VGMON15985 = Vgs ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VGry1Ac ^x VGry2Ab2, OU VGmON15985 ⁼ Vgs ^x Vp35S ^x VtNOS,

    - Θ VGeH92-527-1 = Vst ^x VtNOS ^x Vobss, OU VGeH92-527-1 = Vst ^x VtNOS, e em que o conjunto Gsam é atribuído um valor VGsam que é

    15 um múltiplo dos valores únicos atribuídos aos ácidos nucleicos detectados na etapa (1) como estando presente na amostra;

    e em que a etapa (iii) compreende executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógicas:

    - se VGsam/VGx for igual a 1, então o material derivado do

    20 evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencial mente presente na amostra;

    - se VGsam/VGx for igual a um ou um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em valores V_Zm, Vs„, Vem, Vp35S, VtNOS, V CrylAb, VpAT/bar, VPAT/pat, VcP4-EPSPS,

    25 V_mCry3A, Jcordap A, Vcibl, V_Gry3Bb1, VBxn, V_Gr, VBv, V_Gs, V_Gry1Ac, VCry2ab2, Vst θ Vgóss, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencial mente presente na amostra;

    - se VGsam/VGx não for igual a 1 e não for igual a um valor ou

    30 um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em valores V_Zm, V_Bn, V_Gm, V_p35s, Vínos,

    VCrylAb, VPAT/bar, VPAT/pat, VCP4-EPSPS, VmCry3A, VcordapA, Vcibl, Vcry3Bb1, VBxn, V_Gr,

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 26/35

    Vsv, V_Gs, McryiAc, VCry2ab2, Vst θ V_Gbss, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
14. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado

    5 pelo fato de que se VGsWVGxfor igual a 1, e se nenhum valor ou o múltiplo de dois ou mais valores de conjuntos selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em: VGeti76, VGetu, VGsmo, VGmonsío, VGmON863, VGtC1507, VGnk603, VGr25, VGgA2í. VGdAS-59122, VGmIR604, VGlY038, VGmON88017, VG Topas 19/2, VGmS1, VGrf1, VGrf2, VGmS1/RF1, VGmS1/RF2, VGmS8,

    10 VGrf3. VGmS8/RF3, VGgT73, MGt45, VGuberator pHoe6/Ac, VGGS40/90pHoe6/Ac, VGoXY235, '4GmON40-3-2, VGmON89788, VGa2704-12, VGa5547-127, VGu_62> VGlz.06. VGu_60í> VGt120-7, MGh7-1, VGa5-í5. VG/j. cotton 25, VGmON1445, VGmON531, VGmoni5985 θ VGeh92-527-i diferente de VGx for igual a VGx, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do

    15 mesmo, ou de um evento relacionado a este, está presente na amostra.
15. 17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que valores V_Zm, V_Sn, V_Gm, V_P3ss, Vínos, VcryiAb, VPAT/bar, V PAT/pat, V CP4-EPSPS, VmCry3A, ^cordap A, ^Glb1, ^Cry3Bb1, VBxn, Vor, VBv, V_Gs, VcryiAc, Vc/y2ab2, Vst θ V_Góss são números primos únicos, e em que a

    20 etapa (iii) compreende executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógicas,

    - se VGsam/VGx for igual a 1, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencial mente presente na amostra;

    25 - se VGsam/VGx for um número inteiro maior que 1, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencial mente presente na amostra;

    - se VGsam/VGx não for um número inteiro, então o material

    30 derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
16. 18. Método para determinar a presença ou ausência de dois ou

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 27/35 mais eventos, preferencialmente eventos de planta transgênica ou seus materiais em uma amostra, em que cada evento é definido por um ou mais traços, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    (1) detectar a presença ou ausência na amostra do referido um ou mais 5 traços, (2) concluir a presença ou ausência na amostra do referido um ou mais eventos, compreendendo:

    (a) conferir um valor de número primo único para cada traço, (b) representar cada evento como um produto dos valores de número 10 primo conferido aos traços do referido evento, (c) representar a amostra como um produto dos valores de número primo conferido aos traços detectados como presentes na amostra, e (d) dividir o produto representando a amostra como definido em (c) pelo produto representando um evento como definido em (b), segundo o

    15 qual:

    - se o valor obtido pela referida divisão for igual a 1, então o referido evento ou material do mesmo está potencial mente presente na amostra;

    - se o valor obtido pela referida divisão for um número inteiro maior que 1 então o referido evento ou material está potencial mente presente na

    20 amostra;

    - se o valor obtido pela referida divisão não for inteiro então o referido evento ou material está ausente da amostra.
17. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

    18, caracterizado pelo fato de que a etapa (2) é realizada por um dispositivo 25 de computação.
18. 20. Dispositivo de computação, caracterizado pelo fato de que é programado para realizar a etapa (2) do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; ou um portador de dados compreendendo instruções para um dispositivo de computação programável para realizar a

    30 etapa (2) do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

    19.
19. 21. Kit para examinar uma amostra para a presença ou ausência

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 28/35 potencial de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende os seguintes pares de iniciadores ou variantes apresentando pelo menos 85% de identidade de sequência com os referidos pares de iniciadores, opcionalmente em que os

    5 iniciadores ou pares de iniciadores são marcados para permitir a detecção:

    - um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico d) como definido na reivindicação 1,

    - um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico e) como definido na reivindicação 1,

    10 - um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico f) como definido na reivindicação 1,

    - um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico g) como definido na reivindicação 1,

    - um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico h)

    15 como definido na reivindicação 1,

    - um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico i) como definido na reivindicação 1, e

    - um, mais de um ou todos os pares de iniciadores selecionados de: um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico a) como

    20 definido na reivindicação 1, um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico b) como definido na reivindicação 1, um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico c) como definido na reivindicação 1, um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico o) como definido na reivindicação 1, um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico p)

    25 como definido na reivindicação 1, um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico q) como definido na reivindicação 1, e um par de iniciadores para amplificação do ácido nucléico t) como definido na reivindicação 1, em que os pares de iniciadores ou variantes dos mesmos são como definidos nas reivindicações 1 ou 12,

    30 opcionalmente, em que o kit compreende ainda um par de iniciadores para amplificação de um ácido nucléico genérico derivado de uma planta como definido na reivindicação 4 ou 5.

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20. 22. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais ácidos nucleicos adequados como um controle positivo para amplificação, usando pares de iniciadores ou variantes dos mesmos como definidos na reivindicação 1 ou 12, de um, mais

    5 de um ou todos dos seguintes ácidos nucléicos:

    ácido nucleico a) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico b) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico c) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico d) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico e) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico f) como definido

    10 na reivindicação 1, ácido nucleico g) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico h) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico i) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico o) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico p) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico q) como definido na reivindicação 1, ácido nucleico t) como definido na reivindicação 1;

    15 opcionalmente, em que o kit compreende ainda um ou mais ácidos nucleicos adequados como um controle positivo para amplificação, utilizando um par de iniciadores ou variante do mesmo como definidos na reivindicação 5, de um ácido nucleico genérico derivado de uma planta como definido na reivindicação 4 ou 5.

    20 23. Kit de acordo com a reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um portador de dados compreendendo instruções para um dispositivo de computação programável para realizar a etapa (2) do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

    Petição 870170046809, de 05/07/2017, pág. 30/35

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