CN109825633A - 转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法。本申请的检测方法，包括同时将油菜品系Ms1外源基因和PEP基因的特异引物和探针加入PCR反应体系中，并加入矿物油，混匀后制成微滴，在微滴中进行双重ddPCR反应，反应结束后，读取每个微滴的扩增信号，计算品系Ms1外源基因和PEP基因的拷贝数；其中，品系外源基因和PEP基因的探针分别用FAM和HEX标记。本申请的检测方法，设计配套使用的内源基因PEP和品系特异性引物探针，采用双通道法，分别定量出两者在油菜基因组中的拷贝数，计算出转基因油菜品系Ms1绝对含量，对油菜转基因成分研究和进出境油菜产品中转基因成分精准定量检测有重要意义。
Description
技术领域
本申请涉及转基因油菜检测领域，特别是涉及一种转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法。
背景技术
随着生物技术产业的迅速发展，全球转基因作物的研发速度和种植面积持续增加。推进转基因技术已经成为了着眼于未来的发展战略和解决粮食短缺、确保国家粮食安全的必然选择。但是转基因生物安全问题也随之成为世界关注的热点。目前世界各国出于经济、卫生、环保等各种目的纷纷对转基因生物及其产品加强管理和检测。包括中国在内的50个左右国家和地区相继颁布并实行了“转基因标识制度”，对转基因生物及其加工产品进行标识和管理。近年来，随着各国有关GMO(GeneticallyModified organism)标签法的建立和不断完善，对食品中的GMO含量下限已有所规定。很多国家不但要求对转基因食品进行定性检测，还需要对食品中的GMO含量进行定量检测，以便标识。其标识的阈值一般在0.9％–5％之间(European Commission,2003；Notification,2000)。建立转基因产品的检测技术标准尤其是精准定量检测技术是实施转基因产品标识的技术前提。因此，转基因成分的精准定量技术将随着全世界标识制度的完善和发展日趋重要。
现阶段应用最广的定量检测方法是实时荧光PCR(qPCR)，但稳定性、准确性差，所以需要更加精准的检测方法进行替代。数字PCR(dPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因定量技术，用于核酸的绝对拷贝数检测。dPCR通过将常规的荧光PCR反应体系等量均分为相互隔离的大数量微反应体系，通常等量均分为10000个以上的微反应体系，使每个模板独立随机分配至微反应体系中，同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应，根据设定的荧光值判断每个微反应体系的检测结果。最后以实验的阳性与阴性结果的比率进行泊松分布分析，获得荧光PCR反应体系中的模板浓度。与传统qPCR相比，dPCR存在有以下优势:(1)qPCR结果判定依赖扩增曲线的Ct值，容易受到外界影响；而dPCR结果判定不依赖于扩增曲线，只需要判定扩增信号的有无，就可以对样品进行判定，稳定性远强于qPCR；(2)qPCR容易受到基质中抑制因子的影响；而dPCR通过将反应体系进行分割，可以弱化PCR抑制因子对反应结果的影响，从而提高结果判定的稳定性和准确性。
目前，数字PCR(dPCR)在科学研究方面已经取得了很大的研究进展，其在临床诊断、拷贝数鉴定、绝对定量等方面取得了很多科研成果。Taly等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)技术检测直肠癌病人环状DNA的KRAS突变基因，最终实现了包括野生型的多重样品检测。在植物源制品的检测研究中，Corbisier等(2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内标准基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR的可靠性。Burns等(2010)评估了数字PCR的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了数字PCR在检测方面的可行性和反应条件，文章表明数字PCR能够对起始模板拷贝数进行绝对定量。Morisset等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)检测转基因玉米MON810含量，获得了和定量PCR一致的结果，该结果也间接证明了dPCR技术对于转基因定量检测的贡献。总体而言，dPCR技术目前更多地应用于医学诊断方面，已成为临床应用方面最具潜力的诊断技术之一，并在其它行业取得了突破性研究进展。但是，在转基因检测的研究方面，数字PCR还处于起始阶段，特别是在我国乃至全球各国的标准层面都暂无涉及，这极大制约了数字PCR在实际检测工作上的应用。
研究显示，按照种植面积统计，全球约30％的油菜都是转基因产品；然而国际、国内对转基因油菜的特异性定性或定量检测方法却相当缺乏，尤其是对转基因油菜品系Ms1的定量检测，尚未有相关的研究或报道。因此，亟需研究一种有效的转基因油菜品系Ms1检测方法。
发明内容
本申请的目的是提供一种转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种转基因油菜品系Ms1的检测方法，包括以下步骤：
PCR扩增体系配制步骤，包括将品系Ms1特异引物组、品系Ms1特异探针、PEP基因特异引物组、PEP基因特异探针和待测样品的DNA加入到PCR反应液中，制成双重PCR反应体系；
微滴生成步骤，包括在双重PCR反应体系中加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；
PCR反应和微滴分析步骤，包括将微滴转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，采用微滴分析仪读取每个微滴的扩增信号；
定量检测步骤，根据读取的扩增信号，采用软件分析品系Ms1的特异扩增拷贝数占内源参考基因PEP基因特异扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系Ms1的含量；
品系Ms1特异引物组的正向引物为Seq ID No.1所示序列，品系Ms1特异引物组的反向引物为Seq ID No.2所示序列，品系Ms1特异探针为Seq ID No.3所示序列，PEP基因特异引物组的正向引物为Seq ID No.4所示序列，PEP基因特异引物组的反向引物为Seq IDNo.5所示序列，PEP基因特异探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG-3’
Seq ID No.2：5’-ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG-3’
Seq ID No.3：5’-TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC-3’
Seq ID No.4：5’-CCCTTGTGAAGCTCGACATC-3’
Seq ID No.5：5’-CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT-3’
Seq ID No.6：5’-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-3’
其中，Seq ID No.3所示序列的品系Ms1特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团；Seq ID No.6所示序列的PEP基因特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团。
优选的，品系Ms1特异探针中，5’末端的荧光基团为FAM，3’末端的淬灭基团为BHQ-1；PEP基因特异探针中，5’末端的荧光基团为HEX，3’末端的淬灭基团为BHQ-1。
需要说明的是，本申请的转基因油菜品系Ms1的检测方法，实际上就是微滴式数字PCR。其原理是，在一个PCR反应管中油水反应体系被微滴发生器制备成近上万个油包水小微滴，当待测DNA模板分子数低于一定的数目，微滴只含有一个分子的DNA模板和足够量的用于荧光PCR反应所需的所有其它组分如dNTP、Taq DNA聚合酶以及探针和引物等。待所有微滴PCR反应结束后，逐一检查每个微滴，只要微滴有荧光信号检出，就被认为有PCR反应发生，记有一个分子的待测模板被检出，统计所有阳性微滴数，就可得出样品中待测DNA模板的分子数或拷贝数。本申请采用双通道法，即分别对油菜品系Ms1特异性探针，以及油菜内源基因特异性探针，采用不同的荧光标记，在同一个PCR反应体系中同时测定内源基因和品系特异序列的拷贝数。其中，本申请检测的内源基因PEP在油菜基因组中的拷贝数是确定的，并且油菜品系Ms1特异性序列在油菜基因组中的拷贝数也是确定的；因此，通过计算样品中品系特异性序列和PEP序列拷贝数的比值就可计算得出转基因油菜品系Ms1的含量。
本申请的一种实现方式中，具体的，包括采用QuantaSoft V1.3.2软件分别计算出转基因油菜品系Ms1的拷贝数和PEP基因拷贝数后，根据转基因油菜品系Ms1拷贝数和PEP基因拷贝数的比值，计算转基因油菜品系Ms1的含量。
本申请的另一面公开了一种转基因油菜品系Ms1定量检测的试剂，该试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，第一引物探针组合用于品系Ms1特异性检测，第二引物探针组合用于PEP基因特异性检测；第一引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.1所示序列，反向引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列，并且探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团；第二引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.4所示序列，反向引物为SeqID No.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列，并且探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团。
需要说明的是，本申请的试剂，实际上就是转基因油菜品系Ms1的定量检测方法中所采用的品系Ms1特异性检测引物探针，和PEP基因特异性检测引物和探针。因此，Seq IDNo.3所示序列的探针中，5’末端的荧光基团为FAM，3’末端的淬灭基团为BHQ-1；Seq IDNo.6所示序列的探针中，5’末端的荧光基团为HEX，3’末端的淬灭基团为BHQ-1。可以理解，本申请的引物和探针是针对微滴式数字PCR而设计的，当然可以单独制备成相应的品系Ms1检测试剂使用。
本申请的另一面公开了本申请的试剂在制备转基因油菜检测试剂盒或检测设备中的应用。
本申请的再一面公开了一种转基因油菜检测试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。
优选的，本申请的试剂盒采用本申请的检测方法对转基因油菜品系Ms1进行定量检测。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的转基因油菜品系Ms1的检测方法，设计了配套使用的内源基因PEP特异性引物探针和品系Ms1特异性引物探针，两者配套使用，采用双通道法，分别定量出两者在油菜基因组中的拷贝数，最终计算出转基因油菜品系Ms1的含量。本申请的检测方法，不同于常规的实时荧光PCR的相对定量，能够对待检样品中转基因油菜品系Ms1成分进行精准定量检测，定量检测低限可达7个拷贝，定性检测低限可达2个拷贝，对油菜转基因成分的研究和我国进出境油菜产品中转基因成分的精准定量检测具有重要意义。
附图说明
图1是本申请实施例中稳定性试验FAM通道的输出结果图；
图2是本申请实施例中稳定性试验HEX通道的输出结果图；
图3是本申请实施例中特异性检测FAM通道的输出结果图；
图4是本申请实施例中特异性检测HEX通道的输出结果图；
图5是本申请实施例中梯度稀释检测的HEX通道数据的拟合标准曲线图；
图6是本申请实施例中梯度稀释检测的FAM通道数据的拟合标准曲线图。
具体实施方式
转基因油菜品系Ms1目前尚没有相应的定性或定量检测方法。本申请率先研究并提出了一种转基因油菜品系Ms1的检测方法，本申请的检测方法不仅可以定性检测品系Ms1，而且可以对其进行准确的绝对定量。
本申请的检测方法与现有的转基因油菜品系检测中常规使用的一般PCR、实时荧光PCR、PCR-DHPLC等方法不同；一般PCR只能定性检测，实时荧光PCR虽然可以通过对梯度稀释的标准品进行检测，建立标准曲线，通过标准曲线进行相对定量；但是也无法做到绝对定量检测。随着转基因农作物越来越普遍，现有的相对定量的检测方法已经不能满足我国口岸转基因检测的使用需求。因此，本申请利用先进的数字PCR检测技术，率先研究并提出了转基因油菜品系Ms1的定量检测方法。并且，在本申请的定量检测方法中，同时设计了内源参考基因和品系基因两套配套使用的引物探针，通过双重数字PCR扩增，用两个荧光通道分别统计分析内源参考基因PEP和品系Ms1特异性序列的拷贝数，根据转基因油菜品系Ms1拷贝数和PEP基因拷贝数的比值，计算转基因油菜品系Ms1的绝对含量。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例和附图仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料和方法
1.供试材料
实验材料：本例供选用实验材料10份，分别为转基因油菜标准物质Ms8、Rf1、Rf2、Rf3、MON88302、T45、Topas19/2、OXY235、DP-073496-4和Ms1，以上材料均来自于美国油脂化学家协会(AOCS)。
试剂与耗材：ddPCR Super Mix、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR DropletReader Oil、Droplet Generator DG8Cartridge、Droplet Generator DG8Gasket均购自美国Bio-Rad公司；DNeasy Plant Mini kit植物基因组DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司。
实验仪器：QX100TM Droplet Digital PCR系统，包括PCR仪、微滴生成仪和微滴读取仪和封膜仪四部分，购自美国Bio-Rad公司；离心机购自美国贝克曼库尔特公司；涡旋震荡仪为德国IKA公司制造；恒温水浴锅购自北京市六一仪器厂，Nanodrop 2000c核酸蛋白分析仪购自美国Thermo Scientific公司。
2.引物和探针设计
本例的品系Ms1特异引物组和品系Ms1特异探针根据外源基因插入位点3’端跨边界序列设计，PEP基因特异引物组和PEP基因特异探针参考SN/T1204-2016。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成与修饰。本例的引物和探针序列详见表1。
表1内源基因和品系Ms1特异性引物和探针
其中，Ms1-P探针5’末端进行FAM荧光基团修饰，3’末端进行BHQ-1淬灭基团修饰；PEP-P探针5’末端进行HEX荧光基团修饰，3’末端进行BHQ-1淬灭基团修饰。
3.双重数字PCR反应体系和条件
本例转基因油菜等供试材料的基因组DNA提取采用DNeasy Plant Mini kit植物基因组DNA提取试剂盒，具体过程参考试剂盒说明书。每个DNA样品检测时设置3个平行PCR反应。
ddPCR反应体系共20μL，包括：2×ddPCR SuperMix 10μL、3.6μmol/L的油菜品系特异性探针Ms1-P 1μL、6μmol/L的油菜品系正向引物Ms1-F 1μL、6μmol/L的油菜品系反向引物Ms1-R 1μL、3.6μmol/L的内源参考基因探针PEP-P1μL、6μmol/L内源参考基因正向引物PEP-F 1μL、6μmol/L内源参考基因反向引物PEP-R 1μL、12.5ng/μL的DNA模板4μL。
分别将配制的20μL反应体系和70μL微滴生成油(droplet generation oil)加在微滴生成卡槽(Droplet Generator DG8Cartridge)相应的小室中，盖上胶垫(DropletGeneration DG8Gasket)后放入微滴生成仪中，由仪器自主震荡生成微滴。待震荡结束后将产生的大约40μL左右的微滴转移到96孔板中，并用热封膜仪对其进行封膜，最后置于PCR仪进行PCR反应。
反应条件为：95℃预变性10min；然后进入40个循环：95℃变性15s、56℃退火1min；循环结束后98℃、10min使酶热失活，4℃待机。
扩增结束后，将96孔板置入微滴分析仪中读取信号，并使用QuantaSoft V1.3.2软件分析实验数据。样品中转基因成分含量以样品基因组DNA中转基因特异序列拷贝数占内源基因拷贝数的百分比表示，即用于拷贝数百分含量表征转基因成分的含量。
具体的，打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入荧光检测仪中，设备自动检测每PCR反应管中所有微滴的荧光情况，即PCR反应情况，最后软件根据珀松分布定律直接给出待测DNA序列拷贝数。本例具体的，根据FAM荧光通道可以得到转基因油菜品系Ms1的拷贝数，根据HEX荧光通道可以得到内源参考基因PEP的拷贝数。根据品系Ms1拷贝数与内源参考基因PEP拷贝数的比值可以计算出转基因油菜品系Ms1的绝对含量。
4.稳定性实验
以0.5ng/μL转基因油菜品系Ms1基因组DNA作为模板DNA的工作浓度，其中转基因成分含量为100％。按照“3.双重数字PCR反应体系和条件”配制反应体系并进行PCR反应。稳定性实验设置3个平行，要求3个重复实验结果的相对标准偏差(Relative StandardDeviation，RSD)不超过25％。
5.特异性实验
选用转基因油菜品系Ms8、Rf1、Rf2、Rf3、MON88302、T45、OXY235、Topas19/2、DP-073496-4和Ms1为实验材料。以这10种转基因样品基因组DNA为模板按照“3.双重数字PCR反应体系和条件”配制ddPCR反应体系，并进行PCR反应，其中Ms1作为阳性对照。
6.定量线性范围测定
本例将转基因油菜品系Ms1基因组DNA分别用纯水稀释至12.5ng/μL、2.5ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL、0.02ng/μL、0.004ng/μL、0.0008ng/μL共7个工作浓度。以4μL上述各稀释DNA作为模板按照本例的“3.双重数字PCR反应体系和条件”进行ddPCR反应，每个浓度重复3个反应，计算各浓度样品3次重复实验结果的RSD值。
7.定量检测限和检测限的测定
在本例的检测方法中，定量检测限(Limit OfQuantitation,LOQ)定义为检测结果RSD值不超过25％的最低样品用量或样品拷贝数，即为取“6.定量线性范围测定”的下限的DNA样品进行十个平行反应，检测结果的RSD值≤25％。
检测低限(Limit OfDetection,LOD)定义为能够检测的样品最低拷贝数或样品用量，即为十个平行反应中，所有阳性检出的拷贝数之和不低于9个。
8.精密度试验测定
精密度是指在重复性的条件下，用相同的方法，相同的测试项目，在同一实验室，由同一人员在很短的时间间隔内，使用相同的仪器设备得到的检测结果的标准差，本例为6个平行数字PCR反应结果RSD值≤25％。
9.准确度试验测定
准确度的定义为检测结果与该组公定值之间的相符程度。
本步骤的实验取LOQ值、LOQ值5倍、LOQ值25倍的3组阳性样品进行准确度的验证，对以上3组DNA样品进行三个平行的数字PCR实验，标准误差≤25％。
二、结果及分析
1.阳性样品扩增稳定性结果
按照本例的反应体系进行数字PCR体系的配制，将0.5ng/μL转基因油菜品系Ms1基因组进行数字PCR实验，实验设置3个平行。数字PCR获得的热点图如图1和图2所示，实验结果的数据分析如表2所示。其中，图1为FAM通道的输出结果图，即品系Ms1的检测结果；图2为HEX通道的输出结果图，即内源参考基因PEP的检测结果；图1和图2中，B02、C02、D02分别为三个平行试验。图1和图2的结果显示，数字PCR所获得的阴性点与阳性点之间有明显的荧光信号差距，拖尾现象不严重，可以通过设置统一的阈值限进行阴性反应点和阳性反应点的区分。
反应最终结果如表2所示，内源参考基因三次扩增重复的实际检测拷贝数分别为16.4个/μL、16.7个/μL和16.7个/μL，平均检测拷贝数为16.6个/μL，RSD为1.00％，处于可接受的范围内，即小于等于25％；外源基因三次扩增重复的实际检测拷贝数分别为33.9个/μL、33.1个/μL和33.8个/μL，平均检测拷贝数为33.6个/μL，RSD为1.30％，处于可接受的范围内，即小于等于25％。可见，本例的检测方法中所用的内参基因和外源基因的引物探针扩增稳定性良好，并且该阳性样品稳定可用。
表2品系Ms1稳定性检测结果
2.特异性检测结果
本例采用数字PCR方法对合成的内外源基因引物探针进行特异性实验，实验结果如图3和图4所示。图3为FAM通道的输出结果图，即品系Ms1的检测结果；图4为HEX通道的输出结果图，即内源参考基因PEP的检测结果；图3和图4中，H12、G12、F12、E12、D12、C12、B12、A12、H11依序为Ms8、Rf1、Rf2、Rf3、MON88302、T45、Topas19/2、OXY235和DP-073496-4的检测结果，G11为Ms1的检测结果，F11为水对照。
图3和图4的结果表明，本例的品系Ms1特异性引物和探针对其它9种转基因油菜品系均没有扩增，而PEP基因在9种其它转基因油菜品系和品系Ms1中均有扩增，并且水对照都没有扩增。说明本例的Ms1特异性引物和探针具有良好的特异性，能够用于转基因油菜品系Ms1的特异性检测。
3.线性范围测定结果
本例采用7个工作浓度进行转基因油菜品系Ms1基因组DNA线性检测，结果如表3所示，线性范围内的数据拟合标准曲线如图5和图6所示。其中，图5为HEX通道数据的拟合标准曲线图，即内源参考基因的拟合标准曲线；图6为FAM通道数据的拟合标准曲线图，即品系Ms1基因的拟合标准曲线图。
表3油菜Ms1数字PCR方法的线性范围验证
表3中，DNA量表示反应体系中含有的DNA量，例如10ng，实际上就是2.5ng/μL转基因油菜品系Ms1基因组添加4μL至反应体系中获得；拷贝数是指反应体系中单位体积的拷贝数，即每微升含有品系Ms1或PEP的拷贝数。图5、图6和表3的结果显示，本例的检测方法在内源参考基因拷贝数位于0.217-700区间内，即对应基因组DNA的量为0.016ng至50ng的区间内，可以呈现出良好的线性，跨过至少三个数量级，符合要求，拟合标准曲线的r2为0.99，符合大于或等于0.98的要求，所有浓度组的RSD值位于0.8％到21.6％之间，符合小于25％的要求；本例检测方法在外源基因拷贝数位于0.38-336的区间内，即对应基因组DNA的量为0.08ng至50ng的区间内，呈现出良好的线性，拟合标准曲线的r2为0.99，所有浓度组的RSD值位于1.8％到13.9％之间，符合要求。因此，本例的检测方法在内源参考基因的单位拷贝数位于0.217-700拷贝/μL，外源基因的单位拷贝数位于0.38-336拷贝/μL时，具有良好的定量能力。
4.标准的定量检测限和检测限结果
取“3.线性范围测定结果”线性范围下限的DNA样品进行LOQ的验证。将该DNA进行十个平行的数字PCR验证，计算每个平行的单位体积的内参基因和外源基因的拷贝数，计算平均值和RSD值。具体的，本例取0.02ng/μL的基因组DNA样品进行试验，反应体系中的基因组DNA为0.08ng，结果如表4所示。表4的结果显示，该组DNA的10个平行的检测结果RSD为21.1％，符合小于25％的要求。这说明本例的检测方法可以对外源基因拷贝数为7的样品进行稳定的定量检测。
本例取“3.线性范围测定结果”中可以扩增的最低DNA浓度组进行LOD的验证时，将该DNA进行10个平行的数字PCR验证；其结果无法满足所有阳性检出拷贝数之和不低于9的要求，不能在相应拷贝数下进行稳定检测。
因此，本例进一步的取LOQ值的一半进行10个平行试验，具体的，取0.01ng/μL的基因组DNA样品进行试验，反应体系中的基因组DNA为0.04ng，结果如表5所示。表5的结果显示，十个平行试验中，所有阳性检出的拷贝数之和为10个，符合LOD质控的不低于9个的要求。这说明，本例的检测方法可以对外源基因拷贝数为1.2的样品进行稳定检测。
表4油菜Ms1数字PCR方法的LOQ验证
表5油菜Ms1数字PCR方法的LOD验证
5.精密度试验测定结果
本例取外源基因LOQ临界值和LOQ临界值10倍浓度的DNA样品进行精密度验证，每个样品做6个平行。具体的，对0.02ng/μL的基因组DNA样品和0.2ng/μL的基因组DNA样品进行试验，结果如表6所示。
表6油菜Ms1数字PCR方法的精密度测定结果
表6的结果显示，综合分析LOQ临界点和临界点10倍的DNA样品的检测结果，两组浓度的DNA样品所得到的组内RSD值分别为10.4％和16.2％，符合整个检测方法对于精密度的要求，即RSD小于25％。
6.准确度试验测定结果
本例取LOQ值、LOQ值5倍、LOQ值25倍的3组阳性进行准确度的验证。具体的，本例对0.02ng/μL的基因组DNA样品、0.1ng/μL的基因组DNA样品和0.5ng/μL的基因组DNA样品进行试验，结果如表7所示。
表7油菜Ms1数字PCR方法的准确度测定结果
表7中，DNA量表示反应体系中含有的DNA量，例如0.08ng，实际上就是0.02ng/μL转基因油菜品系Ms1基因组添加4μL至反应体系中获得；“拷贝数(外源/内参)”是指检测获得的品系Ms1的拷贝数和PEP内源参考基因的拷贝数，两个拷贝数的单位都是“个/μL”；拷贝数百分比即品系Ms1的拷贝数比PEP内源参考基因的拷贝数的比值；理论拷贝数百分比，即理论上品系Ms1的拷贝数比PEP内源参考基因的拷贝数的比值，对于转基因油菜品系Ms1的基因组而言，一个基因组中，对应一个拷贝的Ms1外源基因和两个拷贝的PEP内源参考基因，因此，理论拷贝数百分比为50％；平均拷贝数百分比即三次平行试验的拷贝数百分比的平均值。
表7的结果显示，对于0.02ng/μL、0.1ng/μL、0.5ng/μL浓度的DNA标准样品，在本例的反应体系下检测到的拷贝数百分比的平均值分别为51.241％、47.43％和48.18％，DNA标准样品理论拷贝数百分比为50％，计算得到三种浓度的DNA标准样品的相对误差分别为1.24％、2.57％和1.82％，三组偏差均符合要求，即小于25％。因此本例的检测方法可以比较准确的对转基因油菜品系Ms1进行绝对定量检测。
本申请首次建立了针对我国暂未批准的转基因油菜品系Ms1的特异性定量检测方法。本申请建立的二重ddPCR定量检测方法稳定性好、特异性强、定量范围广、定量检测灵敏度高、准确性高，可以满足当前和今后对转基因油菜品系Ms1精准定量的实际需要，本申请的检测方法非常适用于进出境油菜产品中含转基因油菜品系Ms1的定量检测。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心
<120> 转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法
<130> 19I28032
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgagctttct aatttcaaac tattcgg 27
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atctctggtt aaacattcca tctttg 26
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggataggtt cttcagcatc atcacacc 28
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccttgtgaa gctcgacatc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cttgtcctct gaccattctt tgt 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgaccgtca caccgatgtt ttaga 25
Claims (7)
1.一种转基因油菜品系Ms1的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
PCR扩增体系配制步骤，包括将品系Ms1特异引物组、品系Ms1特异探针、PEP基因特异引物组、PEP基因特异探针和待测样品的DNA加入到PCR反应液中，制成双重PCR反应体系；
微滴生成步骤，包括在双重PCR反应体系中加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；
PCR反应和微滴分析步骤，包括将微滴转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，采用微滴分析仪读取每个微滴的扩增信号；
定量检测步骤，根据读取的扩增信号，采用软件分析品系Ms1的特异扩增拷贝数占内源参考基因PEP基因特异扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系Ms1的含量；
所述品系Ms1特异引物组的正向引物为Seq ID No.1所示序列，品系Ms1特异引物组的反向引物为Seq ID No.2所示序列，所述品系Ms1特异探针为Seq ID No.3所示序列，所述PEP基因特异引物组的正向引物为Seq ID No.4所示序列，PEP基因特异引物组的反向引物为Seq ID No.5所示序列，所述PEP基因特异探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG-3’
Seq ID No.2：5’-ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG-3’
Seq ID No.3：5’-TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC-3’
Seq ID No.4：5’-CCCTTGTGAAGCTCGACATC-3’
Seq ID No.5：5’-CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT-3’
Seq ID No.6：5’-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-3’
其中，Seq ID No.3所示序列的品系Ms1特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团；Seq ID No.6所示序列的PEP基因特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述品系Ms1特异探针中，5’末端的荧光基团为FAM，3’末端的淬灭基团为BHQ-1；所述PEP基因特异探针中，5’末端的荧光基团为HEX，3’末端的淬灭基团为BHQ-1。
3.一种转基因油菜品系Ms1定量检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于转基因油菜品系Ms1特异性检测，所述第二引物探针组合用于PEP基因特异性检测；
所述第一引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.1所示序列，反向引物为Seq IDNo.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列，并且探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团；
所述第二引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.4所示序列，反向引物为Seq IDNo.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列，并且探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：Seq ID No.3所示序列的探针中，5’末端的荧光基团为FAM，3’末端的淬灭基团为BHQ-1；Seq ID No.6所示序列的探针中，5’末端的荧光基团为HEX，3’末端的淬灭基团为BHQ-1。
5.根据权利要求3或4所述的试剂在制备转基因油菜检测试剂盒或检测设备中的应用。
6.一种转基因油菜检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求3或4所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的转基因油菜检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒采用权利要求1或2所述的检测方法对转基因油菜品系Ms1进行定量检测。
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