CN103173551A - 转基因油菜ms1品系pcr-dhplc检测引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测引物及检测方法，该引物具有较强的特异性，能够用于PCR，并特异性的扩增出转基因油菜MS1品系的DNA片段，并且其扩增产物能够适合于后续的DHPLC分析。该检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、特异性强的转基因油菜MS1品系的检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本申请的引物和检测方法为转基因油菜MS1品系的检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。

Description

转基因油菜MS1品系PCR-DHPLC检测引物及检测方法

技术领域

本申请涉及转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测引物及检测方法。

背景技术

目前对转基因油菜的检测方法主要采用常规PCR，实时荧光PCR、PCR-基因芯片等检测方法。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展，并且检测成本高。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术（Denaturing High-performance Liquid Chromatography，DHPLC）是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有分辨率好、扩展性强、灵敏度高等优点。该方法在50℃条件分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定，样品的碱基对数量不同洗脱顺序也不同，从而产生不同的样品峰。具体的，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与DNA marker比较确定分子量大小，从而判定样品中是否含有目标检测基因。PCR-DHPLC，是将PCR与DHPLC相结合的技术，即先采用PCR扩增出靶标序列，然后再对扩增产物进行DHPLC分析，从而提高检测的灵敏度和特异性。目前，尚没有转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC的检测方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测的引物，基于该引物的转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测方法。

为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种用于转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测的引物，该引物的上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.1：5’-GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3’

Seq ID No.2：5’-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3’。

需要说明的是，本申请的引物是针对转基因油菜MS1品系而设计的特异性引物，能够对转基因油菜MS1品系进行特异性扩增，因此，可以理解，该引物除了用于本申请的PCR-DHPLC检测以外，同样适用于常规的PCR检测，以及其它的基于PCR扩增的检测，如实时荧光PCR、基因芯片等等。

本申请的另一面还公开了一种转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测方法，该检测方法包括采用本申请设计的引物，以待检测样品的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。

需要说明的是，本申请设计的引物是针对转基因油菜MS1品系的特异性引物，因此，可以理解，如果待检测样品中含有足量的转基因油菜MS1品系成分，即可扩增出相应的靶标片段，并在DHPLC分析时产生相应的洗脱峰。

进一步的，本申请的检测方法还包括以DNA marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。

优选的本申请的检测方法包括如下步骤：

（A）采用本申请的引物，以待检测样品的DNA为模板，进行PCR扩增；

（B）以步骤（A）的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以DNAmarker为参考标准进行DHPLC分析；

（C）将步骤（B）中PCR扩增产物的DHPLC分析结果与DNA marker的DHPLC分析结果进行比较，确定PCR扩增产物的分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。

需要说明的是，理论上，本申请的引物是根据转基因油菜MS1品系设计的特异性引物，能够对待检测样品中的转基因油菜MS1品系成分扩增出约307bp的片段，因此，能够通过DHPLC分析出307bp的洗脱峰；而对其它成分不会有扩增，即不会有其它洗脱峰出现。本申请中，判断是否含有转基因油菜MS1品系的靶标序列的依据即，是否有307bp的洗脱峰。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的转基因油菜MS1品系检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的多重PCR扩增以及DHPLC分析。本申请针对传统的电泳分析PCR扩增结果不理想的问题，将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、分辨率高的转基因油菜MS1品系检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，甚至能够区分出1个碱基大小差异的片段。本申请的引物和检测方法为转基因油菜MS1品系的检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。

附图说明

图1：是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；

图2：是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；

图3：是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；

图4：是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；

图1中自上而下的曲线分别代表a1为转基因油菜品系MS1、b1为DNAmarker、c1水对照、d1为转基因油菜品系RF1、e1为转基因油菜品系RF2、f1为转基因油菜品系RF3、g1为转基因油菜品系RT73、h1为转基因油菜品系MS8，图2中自上而下的曲线分别代表a2为转基因油菜品系T45、b2为转基因油菜品系Topas19/2、c2为非转基因油菜、d2为转基因玉米品系3272、e2为转基因玉米品系59122、f2为转基因玉米品系Bt11、g2为转基因玉米品系Bt176、h2为转基因玉米品系GA21、i2为转基因玉米品系MIR604、j2为转基因玉米品系MON810、k2为转基因玉米品系MON863，图3中自上而下的曲线分别代表a3为转基因玉米品系MON88017、b3为转基因玉米品系MON89034、c3为转基因玉米品系NK603、d3为转基因玉米品系TC1507、e3为转基因玉米品系T25、f3为非转基因玉米、g3为非转基因玉米、h3为转基因大豆品系A2704-12、i3为转基因大豆品系A5547-127、j3为转基因大豆品系GTS40-3-2、k3为转基因大豆品系MON89788，图4中自上而下的曲线分别代表a4为非转基因大豆、b4为大豆盲样、c4为转基因棉花品系GHB614、d4为转基因棉花品系LLCotton25、e4为非转基因棉花、f4为转基因水稻品系LL Rice62、g4为非转基因水稻、h4为转基因马铃薯品系EH92-527-1、i4为木瓜。marker的各峰值从左至右依次为80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。

具体实施方式

本申请提供了用于转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测的引物，该引物针对转基因油菜MS1品系的特异序列进行设计，能够用于转基因油菜MS1品系的特异性扩增检测。在此基础上本申请还提供了基于本申请的引物的转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测方法。

需要说明的是，本申请的引物是针对转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测而设计的，但是，可以理解，该引物本身也是作为PCR扩增使用的，因此，同样可以用于常规的PCR扩增、实时荧光PCR扩增、与基因芯片结合的PCR扩增等。

下面通过具体实验例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实验例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例1DNA提取

（1）DNA提取：参照植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN,Cat.No.69104）所提供的方法稍作改进提取DNA，具体操作步骤如下：

①65℃预热的AP1溶液和Buffer AE；

②液氮研磨样品至粉末状后，取适量样品入1.5mL的离心管中；

③向离心管中加入400μL预热的AP1溶液和4μL100mg/mL的RNA酶，充分混匀后，65℃水浴10min-15min，期间振荡混匀2-3次；

④水浴完成后，直接加入130μL AP2溶液，充分振荡混匀后冰浴5min冰浴时不可震荡，然后14000r/min离心5min；

⑤吸取上清加入到QIA shredder Mini spin column柱子中，即试剂盒中的紫色柱子，14000rpm/min离心2min，记录吸取的上清液的体积数；

⑥弃上面的柱子，向过滤后的溶液中加入1.5倍体积的Buffer AP3/E溶液，用移液枪轻轻混匀；

⑦每次取650μL步骤⑥的混匀的溶液转移到DNeasy Mini spin column柱子内，即试剂盒中白色的柱子，14000rpm/min离心1min，弃滤液，直至步骤⑥的混匀的溶液完全过滤完；需要说明的是，进行过滤时DNeasy Mini spin column柱所能容纳的体积约为650μL，而步骤⑥的溶液一般都是大于650μL的，因此，每次只能取650μL溶液，过滤、弃滤液后才能再加入剩余的溶液；

⑧弃下面的收集管，将spin column柱放入一个新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW溶液，14000rpm/min离心1min洗脱杂质，重复洗脱杂质的操作一次，弃滤液，12000rpm/min空管离心1min；

⑨弃下面的收集管，换一新的1.5mL离心管，加入100μL预热后的Buffer AE溶解DNA，室温静置5min沉淀DNA，12000rpm/min离心1min，收集的溶液即DNA溶液；需要说明的是100μL预热后的Buffer AE可以分两次或多次加入；

⑩弃上面的柱子，-20℃保存DNA溶液。

（2）DNA纯化：当DNA中含蛋白质等杂质的量较高时，其纯度不能满足实验要求，需要对其进行纯化，具体纯化步骤如下：

①将提取的DNA溶液稀释到500μL-700μL后，加入等体积的酚和氯仿，充分混匀；

②14000rpm/min离心10min，取上清液；

③在上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃静置30min以上；

④在4℃条件下14000rpm/min离心10min，弃上清；

⑤向步骤④中弃上清液的沉淀中加入1mL4℃预冷的70%的乙醇，14000rpm/min离心10min，弃上清，重复操作一次；

⑥将经过步骤⑤的乙醇洗涤的沉淀在无菌条件下风干，加适量AE Buffer溶解DNA，即获得纯度较高的DNA溶液。需要说明的是，AE Buffer的加入量根据具体实验要求而定，如果希望获得DNA溶液的浓度较高，则可以加入较少量的AE Buffer，如10μL-50μL，也可以直接再加入100μL Buffer AE，则DNA浓度与纯化前相当，或者加入更多量的Buffer AE以获得较低浓度的DNA溶液。

实施例2DNA浓度测定

对提取的样品DNA进行浓度和纯度测定；采用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：

DNA纯度=OD260/OD280

DNA浓度=50×OD260mg/mL

DNA的纯度比值在1.7～1.9之间，浓度大于10ng/μL。

实施例3PCR扩增

根据转基因油菜MS1品系的DNA序列设计引物（表1），并提取以下样品的DNA进行特异性检测：转基因油菜品系MS1、转基因油菜品系RF1、转基因油菜品系RF2、转基因油菜品系RF3、转基因油菜品系RT73、转基因油菜品系MS8、转基因油菜品系T45、转基因油菜品系Topas19/2、非转基因油菜、转基因玉米品系3272、转基因玉米品系59122、转基因玉米品系Bt11、转基因玉米品系Bt176、转基因玉米品系GA21、转基因玉米品系MIR604、转基因玉米品系MON810、转基因玉米品系MON863、转基因玉米品系MON88017、转基因玉米品系MON89034、转基因玉米品系NK603、转基因玉米品系TC1507、转基因玉米品系T25、非转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆品系A2704-12、转基因大豆品系A5547-127、转基因大豆品系GTS40-3-2、转基因大豆品系MON89788、非转基因大豆、大豆盲样、转基因棉花品系GHB614、转基因棉花品系LLCotton25、非转基因棉花、转基因水稻品系LL Rice62、非转基因水稻、转基因马铃薯品系EH92-527-1、木瓜。

表1转基因油菜MS1品系的检测引物

名称	序列5’-3’	Seq ID No.
			MS1-F	GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT	1
MS1-R	ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG	2

PCR反应体系总体积为50μL，各成分分别为：PCR反应液10×Buffer5μL，2.5mmol/L dNTP5μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，5U/μL Taqpolymerase0.3μL，DNA溶液1μL，然后用灭菌双蒸水补足为50μL。

PCR反应条件：94℃变性1min；然后进入35个循环：94℃30s，58℃90s，72℃90s；循环结束后72℃延伸10min。

实施例4DHPLC检测

将PCR产物置于DHPLC的自动进样平台上；打开DHPLC控制软件Navigator，在检测方法中选择Multiplex，即多片段分析，同时设定检测上限为600bp，下限为70bp；运行两个blank，即空针，平衡色谱柱；运行一个marker，用于参考对照，检测样品的核酸片段大小；依次对待测样本进行分析，部分结果见图1-图4。本申请所采用的DNA marker为SSR(pUC18/MspI)DNA Marker，可通过市售购买获得。

需要说明的是图1-图4是一次检测的结果，由于DHPLC分析仪输出结果时不能在一个屏幕显示完所有样品的峰图，因此分为四个图显示。图1中由上到下的曲线，第一条曲线为转基因油菜品系MS1的DNA经过PCR扩增后进行的DHPLC分析曲线，第二条曲线为DNA marker进行DHPLC分析的曲线，第三条曲线是采用水作为空白对照进行DHPLC分析的曲线，往下分别为转基因油菜品系RF1、转基因油菜品系RF2、转基因油菜品系RF3、转基因油菜品系RT73和转基因油菜品系MS8的DNA分别经过PCR扩增后进行的DHPLC分析曲线。图2中由上到下的曲线分别为转基因油菜品系T45、转基因油菜品系Topas19/2、非转基因油菜、转基因玉米品系3272、转基因玉米品系59122、转基因玉米品系Bt11、转基因玉米品系Bt176、转基因玉米品系GA21、转基因玉米品系MIR604、转基因玉米品系MON810和转基因玉米品系MON863的DNA分别经过PCR扩增后进行的DHPLC分析曲线。图3中由上到下的曲线分别为转基因玉米品系MON88017、转基因玉米品系MON89034、转基因玉米品系NK603、转基因玉米品系TC1507、转基因玉米品系T25、第一份非转基因玉米、第二份非转基因玉米、转基因大豆品系A2704-12、转基因大豆品系A5547-127、转基因大豆品系GTS40-3-2和转基因大豆品系MON89788的DNA分别经过PCR扩增后进行的DHPLC分析曲线。图4中由上到下的曲线分别为非转基因大豆、大豆盲样、转基因棉花品系GHB614、转基因棉花品系LLCotton25、非转基因棉花、转基因水稻品系LL Rice62、非转基因水稻、转基因马铃薯品系EH92-527-1和木瓜的DNA分别经过PCR扩增后进行的DHPLC分析曲线。其中大豆盲样为从非转基因大豆和转基因大豆中随意抽检的样品。

结果判断：观察DHPLC得到的洗脱峰，通过与marker比对及WAVE4500自动分析确定洗脱峰位置的DNA片段大小，据此进行判断。

对以转基因油菜品系MS1的DNA为模板的PCR扩增产物为样本的DHPLC分析，其分析结果显示，该样本含有307bp的洗脱峰；以其它样品的DNA为模板的PCR扩增产物为样本的DHPLC分析均没有洗脱峰。可见，本例提供的引物具有良好的特异性，能够从众多样品中特异性的检测出转基因油菜MS1品系。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有Seq ID No.1所示序列，所述下游引物含有Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.1：5’-GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3’

Seq ID No.2：5’-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3’。

2.一种转基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：所述检测方法包括采用权利要求1中的引物，以待检测样品的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括以DNA marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。

Images