EA024233B1 - Способы, реагенты, материалы и наборы для исследования образца на наличие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к детектированию в образце материала, происходящего от независимых трансформантов растений. В частности, в настоящем изобретении предложены способы, реагенты, наборы и эталонные материалы для детектирования присутствия или отсутствия в образце генетического материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений.

Description

Данное изобретение относится к детектированию материалов, происходящих от независимых трансформантов растений (!гаикдешс р1ап! сусШ). В частности, это изобретение обеспечивает способы, реагенты, наборы и ссылочные материалы для детектирования присутствия или отсутствия в образце генетического материала, происходящего от или могущего быть отнесенным к избранным независимым трансформантам растений.

Сведения о предшествующем уровне техники

Генетически модифицированные организмы (ГМО), в частности, генетически модифицированные растения, приобретают важность в сельском хозяйстве, а также в получении и маркетинге пищевых и кормовых продуктов.

Однако вследствие обеспокоенности в отношении действия ГМО на окружающую среду и здоровье потребителей введение новых ГМО требует обычно регламентирующего санкционирования и, во многих странах, в том числе Европейском Союзе, пищевые и кормовые продукты, содержащие ГМО, подвергаются сами получению разрешения и обязательному маркированию (см., например, Кеди1айоп (ЕС) по. 1829/2003. ΘίΡ 1 Еиг Соттишйек: Ьед1к. 2003, Ь268: 1-23; Кеди1айоп (ЕС) по. 1830/2003. ΘίΡ 1 Еиг СоттишОек: Ьед1к. 2003, Ь268: 24-28).

Таким образом, отслеживание ГМО в среде и на протяжении процесса культивирования и производственной цепи пищевых и кормовых продуктов является фундаментальным для оценки опасности для окружающей среды, а также необходимым для сохранения доверия потребителей и для удовлетворения или подтверждения соблюдения обязательных предписаний, в том числе маркировки продуктов ГМО.

Это требует наличия способов, которые могут определять присутствие, идентичность и/или количество ГМО или материалов, происходящих или полученных из них, например, в пищевых и кормовых источниках, ингредиентах и/или обработанных потребительских товарах. В этом отношении очень применимы способы на основе ДНК, не в последнюю очередь потому, что ДНК часто выдерживает физические и химические технологические обработки лучше, чем другие молекулы, такие как белки. Например, полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР) оказалась специфическим и чувствительным способом для количественного определения нуклеиновых кислот, являющихся показателями присутствия ДНК, происходящей из ГМО.

Доступны анализы для недвусмысленного заключения о присутствии или отсутствии генетического материала, происходящего от независимого трансформанта растения, в образце. Обычно такие анализы могут детектировать присутствие уникальной, специфической для данной трансформации, нуклеотидной последовательности, обнаруживаемой в представляющем интерес независимом трансформанте растения, но отсутствующей в других независимых трансформантах. Например, такие отличительные нуклеотидные последовательности могут присутствовать в местах соединений между эндогенной геномной последовательностью ГМО и последовательностью трансформирующей конструкции гена в геномном сайте инсерции последнего; детектирование может, например, включать в себя ПЦР-амплификацию сквозь указанное место соединения с использованием специфических праймеров, фланкирующих это место соединения (см., например, Негпапйе/ е! а1. 2003. Тгапкдеше Кек 12: 179-189; Негпапйе/ е! а1. 2004. 1 Сегеа1 δοί 39: 99-107; Вегйа1 е! а1. 2001. Еиг Роой Кек ТееЬпо1 213: 432-438; №е1кеп е! а1. 2004. Еиг Роой Кек ТееЬпо1 219: 421-427; или Копшпд е! а1. 2003. Еиг Роой Кек ТееЬпо1 216: 347-354).

Однако эти специфические для трансформантов анализы часто осуществляются с использованием дорогостоящих наборов, позволяющих лишь ограниченное количество тестов, которые ограничены детектированием материала от одного независимого трансформанта, и часто используют очень конкретные условия реакций. Однако, количество создаваемых, разрешенных и продаваемых на рынке ГМО продолжает увеличиваться. Таким образом, недвусмысленное определение состава ГМО образца может, в принципе, требовать применения неуклонно растущей совокупности отдельных специфических для этих независимых трансформантов анализов детектирования на каждом образце, что является как трудоемким, так и дорогостоящим.

Таким образом, хотя все еще является желательным использование специфических для трансформации анализов вследствие недвусмысленного характера их результата, существует потребность в использовании этих анализов более эффективным и нацеленным образом, для улучшения детектирования ГМО, например, в отношении затраты времени, стоимости и трудоемкости.

Сущность изобретения

В разных аспектах данное изобретение обеспечивает способы, реагенты, наборы и ссылочные материалы, которые направлены на одну или несколько из обсуждаемых выше потребностей в данной области.

В общем, это изобретение обеспечивает улучшенные способы, реагенты, наборы и ссылочные материалы для детектирования материала, происходящего из ГМО, и предпочтительно из генетически модифицированных растений, в образцах.

Более конкретно, авторы изобретения выяснили, что посредством тщательного выбора признаков определенных последовательностей, которые должны быть анализированы в этом образце - где эти указанные признаки последовательности не должны быть обязательно специфическими для конкретного

- 1 024233 независимого трансформанта и могут быть фактически общими между двумя или более независимыми трансформантами - можно сделать вывод, содержит ли этот образец потенциально материал, происходящий от одного или нескольких незавимимых трансформантов, или, напротив, что этот образец не содержит материала, происходящего от одного или нескольких таких независимых трансформантов. Анализы этого изобретения могут, следовательно, обеспечивать важное указание на потенциальное содержание ГМО в образце и посредством этого уменьшать количество последующих тестов (таких как специфические для трансформантов анализы), необходимых для подтверждения присутствия материала, происходящего от одного или нескольких конкретных независимых трансформантов, в этом образце; это может, в свою очередь, улучшать эффективность способов детектирования ГМО путем уменьшения стоимости, затрат времени и труда. Например, анализы этого изобретения могут позволить уменьшение количества специфических для независимых трансформантов анализов, необходимых для характеристики состава ГМО этого образца.

Авторы этого изобретения оценили скрупулезно известные, коммерчески значимые и/или разрешенные независимые трансформанты для выбора признаков, подлежащих анализу в образце, для уменьшения количества индивидуальных тест-реакций, требуемых на один образец, но все еще гарантирования достаточной информативности анализа профиля ГМО в соответствии с этим исследованием.

Данное изобретение объединяет вышеописанное соответствующее понимание в его различных аспектах.

Таким образом, в одном особенно предпочтительном аспекте (здесь аспекте А1) это изобретение относится к способу для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, предусматривающему стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих или состоящих из:

a) Ζιη: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Ζοα тау8, предпочтительно Ζοα тау8 88р. тауз;

b) Вп: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Вгаз81са парик;

c) Ст: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона С1усше тах, и одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, выбранных из:

б) р358: нуклеиновой кислоты, происходящей из промотора 358 вируса мозаичной болезни цветной капусты,

е) (N08: нуклеиновой кислоты, происходящей из З'-терминатора гена нопалинсинтетазы АдгоЬас(егшт ЩтеГааепк.

Г) Сгу1АЬ: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Сгу1АЬ кристаллического белка ВасШик (Ьигшд1еп818,

д) РАТ/Ьаг: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Ьаг фосфинотрицинацетилтрансферазы (РАТ) 8(гер(отусе8 Ьудго8сор1си8,

й) РАТ/ра(: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена ра( фосфинотрицинацетилтрансферазы (РАТ) 8(гер(отусе8 ушбосйготодепе8, и

ί) СР4-ЕР8Р8: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена ЕР8Р8 5-енолпирувилшикимат-Зфосфатсинтазы из АдгоЬас(егшт 8р. СР4 и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или более независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей или состоящей из независимых трансформантов, выбранных из независимых трансформантов В(176, В(11, В(10, Μ0Ν810, Μ0Ν863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, СА21, ПА8-59122, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Тора8 19/2, Μ81, КЕ1, РЕ2, КЕ3, Μ88, СТ73, Т45, ЫЬега(ог рНео6/Ас, С840/90рНое6/Ас, их гибридов, включающих в себя Μ81/ΡΕ1, Μ81/ΡΕ2, Μ88/ΚΕ3, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Μ0Ν 40-3-2, Μ0Ν89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

Аспект А1 позволяет исследовать потенциальное присутствие или отсутствие в образце материала от многочисленных независимых трансформантов растений, принадлежащих к нескольким отдельным таксонам растений, с проведением относительно ограниченного количества стадий детектирования. Предпочтительно независимые трансформанты растений, детектируемые по способу аспекта А1, включают в себя большую часть или даже, по существу, наибольшее количество независимых трансформантов растений, разрешенных и/или коммерциализованных в настоящее время, например, в Европе, т.е. независимые трансформанты растений, которые должны встречаться особенно вероятно например, в окружающей среде или коммерческих образцах. Таким образом, в этом аспекте это изобретение обеспечивает не предъявляющий особенно больших требований анализ для испытания значительного спектра релевантных независимых трансформантов растений.

Предпочтительно стадия (1) аспекта А1 может включать в себя детектирование присутствия или от- 2 024233 сутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих все из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-1), определенными выше. Это выгодным образом улучшает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присутствии или отсутствии материала, происходящего, по существу, от большого числа независимых трансформантов растений.

Поскольку на стадии (2) аспекта А1 предусматривается детектирование специально для конкретно существующих независимых трансформантов растений, должно быть понятно, что другие независимые трансформанты, в том числе любые будущие независимые трансформанты, которые будут генерироваться, могут также детектироваться в той степени, в какой они принадлежат к таксонам, определенным под пунктами а)-с), и содержат одну или несколько из нуклеиновых кислот, определенных под пунктами б)ί). Это наблюдение относится тиПбк ти1аиб18 к детектированию независимых трансформантов в любых аспектах этого изобретения, как описано в дальнейшем.

Хотя способ аспекта А1 позволяет одновременно испытывать присутствие или отсутствие в образце независимых трансформантов растений, принадлежащих по меньшей мере к трем различным таксонам, авторы изобретения рассматривают также адаптирование этого способа к индивидуальным таксонам. Это может выгодным образом уменьшать количество стадий детектирования нуклеиновых кислот, если требуется информация только для конкретного таксона.

Таким образом, в следующем аспекте (А2) это изобретение обеспечивает способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктом а), определенным выше, и одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами 6)-ί), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей или состоящей из ВП76, ВШ, ВП0, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, СА21, ΌΑδ-59122, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

Предпочтительно стадия (1) аспекта А2 может включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих все из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-1), определенными выше. Это увеличивает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присутствии или отсутствии материала, происходящего из сравнительно большего числа независимых трансформантов растений кукурузы.

В следующем аспекте (А3) это изобретение представляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений масличного рапса, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктом Ь), определенным выше, и одной более чем одной или всех нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами 6)-ί), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений масличного рапса, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей или состоящей из независимых трансформантов Торак 19/2, Μ81, ΚΡΊ, КТ2, КТ3, Μ88, СТ73, Т45, ЫЬегаЮг рНеоб/Ас, С340/90рНое6/Ас, их гибридов, включающих в себя Μ81/ΚΓ1. Μ31/ΚΡ2, Μ38/ΚΡ3, и родственных им независимых трансформантов.

Предпочтительно стадия (1) аспекта А3 может включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих все из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами Ь) и 6)-ί), определенными выше. Это увеличивает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присутствии или отсутствии материала, происходящего из сравнительно большего числа независимых трансформантов растений масличного рапса.

В другом предпочтительном варианте осуществления стадия (1) аспекта А3 включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами Ь) и б), е) и §)-ί), определенными выше. Отмечается, что многие независимые трансформанты масличного рапса, например независимые трансформанты, особо указанные в стадии (2) аспекта 3, могут не включать в себя нуклеиновую кислоту, указанную под пунктом £), определенным выше. Таким образом, исключение указанной нуклеиновой кислоты, указанной в перечне под пунктом £) из стадии (1) аспекта А3, может уменьшать число тестов без потери информации.

В следующем аспекте (А4) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов

- 3 024233 растений сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктом с), определенным выше, и одну, более чем одну или все нуклеиновые кислоты, выбранные из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами 6)-ί), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений сои, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, состоящей из ΜΟΝ 40-3-2, ΜΟΝ89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

Предпочтительно стадия (1) аспекта А4 может включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами с) и 6)-ί), определенными выше. Это увеличивает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присутствии или отсутствии материала, происходящего из сравнительно большего числа независимых трансформантов растений сои.

В другом предпочтительном варианте осуществления стадия (1) аспекта А4 включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами с) и б), е), й) и ί), определенными выше. Отмечается, что многие независимые трансформанты сои, например независимые трансформанты, особо указанные в стадии (2) аспекта 4, могут не включать в себя нуклеиновых кислот, указанных под пунктами ί) и §), определенными выше. Таким образом, исключение указанных нуклеиновых кислот, указанных в перечне под пунктами ί) и §), из стадии (1) аспекта А4 может уменьшать число тестов без потери информации.

Должно быть также понятно, что дополнительные аспекты могут описывать комбинации любых двух из приведенных выше аспектов А2-А4. Например, это может выгодным образом уменьшать количество проведений тестирования в случаях, когда предполагается детектирование независимых трансформантов из выбранных таксонов.

Таким образом, в следующем аспекте (А5) это изобретение предоставляет способ для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) и й), определенными выше, и одной, более чем одной или всех из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами 6)-ί), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов, выбранных из ВП76, ВП1, ВП0, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, ОА21, ΌΛδ-59122. их гибридов и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов Торах 19/2, Μδ1, КЕ1, КЕ2, КЕ3, Μ88, ОТ73, Т45, ЫЬегаЮг рНеоб/Ас, О840/90рНое6/Ас, их гибридов, включающих в себя Μ81/ΚΕ1, Μ81/ΚΕ2, Μ88/ΚΕ3, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам стадия (1) аспекта А5 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), й) и б)ί), определенными выше.

Еще в одном аспекте (А6) это изобретение представляет способ для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) и с), определенными выше, и одной, более чем одной или всех из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами 6)-ί), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или сои, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов ВП76, ВП1, ВП0, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, ОА21, их гибридов и родственных им независимых трансформантов и независимых трансформантов ΜΟΝ 40-3-2, ΜΟΝ89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам стадия (1) аспекта А6 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), с) и б)- 4 024233

ί), определенными выше.

Еще в одном аспекте (А7) это изобретение предоставляет способ для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов масличного рапса и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) и Ь), определенными выше, и одной, более чем одной или всех из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами й)-1), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений масличного рапса и/или сои, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Торах 19/2, М81, КР1, КЕ2, КР3, М88, СТ73, Т45, ЫЬегаЮг рНео6/Ас, 0840/90рНое6/Ас, их гибридов, включающих в себя М81/КЕ1, М81/КЕ2, М88/КЕ3, и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов МОЫ 40-3-2, МОЫ89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А7 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами Ь), с) и й)ί), определенными выше.

В другом предпочтительном варианте осуществления, стадия (1) аспекта А7 включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящей из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами Ь), с) и й), е) и β)-ί). определенными выше, т.е. без детектирования нуклеиновой кислоты, указанной в перечне под пунктом ί).

Таким образом, в одном аспекте (А8) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), Ь) и с), определенными выше; и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами й)-1), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Б1176, ВП1, ВП0, МОЫ810, МОЫ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, СА21, ПА8-59122, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Торах 19/2, М81, КЕ1, КЕ2, КЕ3, М88, СТ73, Т45, ЫЬегаЮг рНеоб/Ас, С840/90рНоеб/Ас, их гибридов, включающих в себя М81/КР1, М81/КЕ2, М88/КЕ3 и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов МОN 40-3-2, МОЖ9788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам стадия (1) аспекта А8 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами й)-1), определенными выше.

Как объяснялось, способы описанных выше аспектов А1-А8 хорошо подходят для детектирования потенциального присутствия или отсутствия в образце материала, происходящего из независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, которые были разрешены и/или обычно использовались. Однако должно быть понятно, что указанные способы являются также выгодно гибкими и в вариантах осуществления позволяют лучшим образом оценивать присутствие или отсутствие материала, происходящего из дополнительных независимых трансформантов, таких как независимые трансформанты, не описанные особо в стадии 2 описанных выше аспектов А1-А9. Таким образом, это позволяет собирать даже больше информации в отношении состава этого образца.

Таким образом, в вариантах стадия (1) любого из аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно содержать детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты Ц тСгу3А: нуклеиновой кислоты, происходящей из модифицированного гена Сгу3А кристаллического белка ВасШих ЙшгшщегЫх; и группа независимых трансформантов, определенная на стадии (23) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит независимый трансформант кукурузы М1К604, его гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы и независимые трансформанты, родственными М1К604.

В дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1,

- 5 024233

А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце одной или обеих нуклеиновых кислот к) сотйарА: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена сотйарА не чувствительной к лизину дигидродипиколинатсинтазы (εΌΗΌΡδ) СотупеЬаОетшт д1и1аш1сит, и/или 1) О1Ы: нуклеиновой кислоты, происходящей из промотора С1Ы кукурузы; и группа независимых трансформантов, определенных в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит незавимимый трансформант кукурузы ЬУ038, его гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы, и независимые трансформанты, родственные ЬУ038.

В дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты ш) СгуЗВЫ: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена СтуЗВЫ кристаллического белка ВасШик Йшппдкпмх; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит незавимимый трансформант кукурузы ΜΟΝ88017, его гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы и независимые трансформанты, родственные ΜΟΝ88017.

Соответственно, стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами |)-ш). определенными выше; и группа независимых трансформантов, определенных в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, может дополнительно содержать одно, более чем одно или все из независимых трансформантов кукурузы ΜΙΚ604, ЬУ038 и ΜΟΝ88017, их гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы и независимые трансформанты, родственные им. Однако, поскольку детектирование соответствующих нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами |)-ш), определенными выше, может обеспечивать улучшенное детектирование присутствия материала из независимых трансформантов кукурузы ΜΙΚ604, ЬУ038 и/или ΜΟΝ88017 в этом образце, детектирование нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί), определенными выше, позволяет уже сделать выводы относительно потенциального присутствия материала из указанных независимых трансформантов ΜΙΚ604, ЬУ038 и/или ΜΟΝ88017 в образце (см. также табл. 3).

В вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты п) Вхп: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Вхп нитрилазы К1еЬ81е11а рпеишошае 88р. о/аепае; и группа независимых трансформантов, определенных в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит независимый трансформант масличного рапса ΟΧΥ235, его гибриды с другими независимыми трансформантами в масличном рапсе и независимые трансформанты, родственные ΟΧΥ235. Однако, поскольку детектирование нуклеиновой кислоты, указанной под пунктом (п), определенным выше, может обеспечивать улучшенное детектирование присутствия материала из независимых трансформантов масличного рапса ΟΧΥ235 в этом образце, детектирование нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί), определенными выше, позволяет уже сделать выводы относительно потенциального присутствия материала из указанного независимого трансформанта ΟΧΥ235 в образце (см. табл. 3).

Таким образом, в одном аспекте (А9) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), Ь) и с), определенными выше, и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί), определенными выше; и необязательно, одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами |)-п), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов В1176, В111, В110, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, СА21, ПА8-59122, ΜΙΚ604, ΕΥ038 и ΜΟΝ88017, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Торак 19/2, Μ81, КР1, РЕ2, РЕ3, Μ88, СТ73, Т45, ШЬетаЮт рНео6/Ас, С840/90рНое6/Ас, ΟΧΥ235, их гибридов, включающих в себя Μ81/ΡΕ1, Μ81/ΚΕ2, Μ88/ΚΕ3, и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов ΜΟΝ 40-3-2, ΜΟΝ89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А9 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί), опре- 6 024233 деленными выше.

Таким образом, в следующих предпочтительных вариантах осуществления способы вышеописанных аспектов А1-А8 могут дополнительно оценивать также потенциальное присутствие или отсутствие в образцах материала, происходящего из независимых трансформантов, которые относятся к другим таксонам.

Таким образом, в вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантов осуществления указанных аспектов) может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты о) Ог: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Огу/а βαίίνα: и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает один, более одного или всех независимых трансформантов риса ЬЬ62, ЬЬ06 и ЬЬ601, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

В дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантах осуществления указанных аспектов) дополнительно включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты ρ) Βν: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Ве1а габдапе: и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает один, более одного или все независимые трансформанты в сахарной свекле Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибриды и родственные им независимые трансформанты.

В дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантов осуществления указанных аспектов) может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты с|) Οδ: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Ооееуршт; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает один, более одного или все независимые трансформанты хлопчатника ЬЬ соНоп 25, ΜΟΝ 1445, ΜΟΝ 531, ΜΟΝ15985, их гибриды и родственные им независимые трансформанты.

В дополнительном развитии стадия (1) любого из вариантов осуществления предыдущего абзаца может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце одной или обеих из нуклеиновых кислот г) Сгу1Ас: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Сгу1Ас кристаллического белка ВасШие Шитш§1еп81е, и/или δ) Сту2АЪ2: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Сту2АЪ2 кристаллического белка ВасШие 1Ниг1пд1еп818: и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2), может особенно хорошо детектировать одно или оба из независимых трансформантов в хлопчатнике ΜΟΝ 531, ΜΟΝ15985, их гибриды с другими независимыми трансформантами в хлопчатнике и родственные им независимые трансформанты.

В других дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантов осуществления указанных аспектов) может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты ΐ) δί: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона 5о1апит шЬегоент: и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает незавимимую трансформацию в картофеле ЕН92-527-1 и родственные ему независимые трансформанты.

В дополнительном развитии стадия (1) любого из вариантов осуществления предыдущего абзаца может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты и) ΟΒδδ: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена ОЪее связанной с гранулами крахмалсинтазы 5о1апит 1иЪею8ит, что дополнительно улучшает достоверность детектирования материала из указанного независимого трансформанта ЕН92-527-1.

Должно быть понятно, что предыдущие способы могут выполняться в различных подходящих комбинациях, позволяющих детектировать желаемые независимые трансформанты растений и уменьшающих прилагаемые усилия.

Таким образом, в одном аспекте (А10) это изобретение представляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса, и/или сои, и/или риса, и/или сахарной свеклы, и/или хлопчатника, и/или картофеля, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), Ъ), с), о), р), с|). и ί), определенными выше; и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами б)- ί), определенными выше; и необязательно одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами 1)-11)- г), δ) и и) определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного

- 7 024233 или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Б1176, Б111, Б110, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, СЛ21, ΌΆ8-59122, ΜΙΚ604, ЬУ038 и ΜΟΝ88017, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Торак 19/2, Μ31, КЕ1, КЕ2, КЕ3, Μ38, СТ73, Т45, ПЪегаЮг рНео6/Ас, СЗ40/90рНое6/Ас, ΟΧΥ235, их гибридов, включающих в себя Μ31/ΚΕ1, Μ31/ΚΡ2, Μ38/ΚΕ3 и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов ΜΟΝ 40-3-2, ΜΟΝ89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов ЬЬ62, ЬЬ06 и ЬЬ601, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов ЬЬ сойоп 25, ΜΟΝ 1445, ΜΟΝ 531, ΜΟΝ15985, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам стадия (1) аспекта А10 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί), определенными выше.

В одном родственном предпочтительном аспекте (А11) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса, и/или сои, и/или риса, и/или сахарной свеклы, и/или хлопчатника, и/или картофеля, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), Ъ), с), о), р), с|) и ΐ), определенными выше, и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί), определенными выше; определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов В1176, Βΐ11, Βΐ10, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, СА21, ПАЗ-59122, необязательно ΜΙΚ604, ΕΥ038 и ΜΟΝ88017, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Торак 19/2, Μ31, КЕ1, КЕ2, КЕ3, Μ38, СТ73, Т45, ЫЪега1ог рНео6/Ас, СЗ40/90рНое6/Ас, необязательно ΟΧΥ235, их гибридов, включающих в себя Μ31/ΚΕ1, Μ31/ΚΕ2, Μ38/ΚΕ3, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов ΜΟΝ 40-3-2, ΜΟΝ89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов ЬЬ62, ЬЬ06 и ЬЬ601, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов ЬЬ сойои 25, ΜΟΝ 1445, ΜΟΝ 531, ΜΟΝ15985, их гибридов и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам стадия (1) аспекта А11 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί).

Предпочтительно в любом из вышеописанных аспектов А1-А11 или любом варианте осуществления указанных аспектов присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот в образце детектируют с использованием амплификации ампликонов, содержащихся в соответствующих нуклеиновых кислотах, например, предпочтительно с использованием ПЦР и более предпочтительно с использованием ПЦР в реальном времени.

Для возможности эффективного применения ПЦР-амплификации в вышеописанных способах авторы данного изобретения проводили скрупулезный поиск на праймеры и пары праймеров и тестировали праймеры и пары праймеров таким образом, чтобы выбрать праймеры, особенно предпочтительные в указанных способах.

Идентифицированные предпочтительные пары праймеров приведены в списке в табл. 1. Они влекут за собой пйег айа следующие существенные преимущества. Эти праймеры проявляют, по существу, одну и ту же или достаточно сходную температуру отжига, позволяя посредством этого выполнять ПЦРамплификацию на различных нуклеиновых кислотах при одних и тех же температурных условиях циклов и, следовательно, в одном и том же устройстве. Это в значительной степени облегчает достижение высокой производительности этих способов и уменьшает количество прилагаемого труда, расходных материалов и устройств. Эти пары праймеров продуцируют ампликоны приблизительно 100 п.н. и посредством этого позволяют амплифицировать нуклеиновые кислоты-мишени даже из образцов, в которых генетический материал в значительной степени фрагментирован, как это может иметь место в случае обработанных пищевых или кормовых продуктов. Эти праймеры и пары праймеров обнаруживают достаточную специфичность амплификации, а также чувствительность, подходящую для амплификации в

- 8 024233 реальном времени. Кроме того, для гарантии чувствительности и однородности способов и наборов, обеспечиваемых этим изобретением, эти праймеры и пары праймеров были сконструированы таким образом, что они генерируют, при 40 циклах и с использованием 10000 копий матрицы, флуоресценцию по меньшей мере 2500 относительных единиц флуоресценции (КРИ), причем генерированные таким образом величины флуоресценции для различных наборов праймеров лежат приблизительно в 3-кратном пределе. Кроме того, каждая пара праймеров была сконструирована таким образом, что она выполняет амплификацию на соответствующих нуклеиновых кислотах, по существу, из всех представляющих интерес независимых трансформантов, несмотря на существование потенциальных несоответствий последовательности (например, вследствие оптимизированной частоты использования кодонов) в указанных нуклеиновых кислотах между такими независимыми трансформантами.

Таблица 1. Предпочтительные пары праймеров для детектирования нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-т), о), р), с|) и 1), определенными выше, при помощи ПЦР

Нуклеиновая кислота- мишень	Праймеры
Ζιη	Прямой: 5' ТСТСТТССТССТТТАОАОСТАССАСТА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 56) Обратный: 5’ ААТСОАТССАААОСОАОАТОА 3' (5ЕО ГО ΝΟ: 57)
Вп	Прямой: 5' САОСТСААСАСТТТССАААССА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 24) Обратный: 5' ССАССАСССТСАСССТТААС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 25)
Ст	Прямой: 5’ ААССССТАСССТТСССАС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 58) Κβν’: 5' АССССАТСТССААСССТТТ 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 59)
р353	Прямой: 5' АААОСААОТОСАТТСАТСТСАТА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 60) Обратный: 5’ СООТСТТСССААССАТАСТО 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 61)
ΙΝΟ8	Прямой: 5'-САТТАСАСТСССССААТТАТАСАТТТАА-3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 9) Обратный: З'-ТТАТССТАСКТТССОСаСТАТАТТТ-З' (ЗЕО ГО ΝΟ: 10)
Сгу1АЬ	Прямой: 5'-АССССТТАСАСТСССАТССА-3' (ЗЕО ГО N0:11) Обратный: З'-САССАССТСССАССААСТС-З' (ЗЕО ГО ΝΟ: 12)
РАТ/Ьаг	Прямой: б'-СОТСААССАСТАСАТССАСАСАА-З'(ЗЕО ГО ΝΟ: 13) Обратный: З'-ОТССАСТССТОСООТТССТ-З’ (ЗЕО ГО ΝΟ; 14)
РАТ/ра1	Прямой: 5'-ΟΟΟΟΟΟΤΤΤΟΤΟΑΤΑΤΟΟΤΤ-3'(ЗЕО ГО ΝΟ: 15) Обратный: 5'-ТСТТОСААССТСТСТАОАТСАТСАА-3’(ЗЕО ΙΟΝΟ: 16)
’’СР4-ЕР5Р5	Прямой: 5' ОСАТОСТТСАСССТССАА 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 22) Обратный: 5' ССАССТСТСОСАОАТАСАСТТСТС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 23) Κβν 1: 5' ТСААССАССССТСССАСАТ 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 62) Κβν 2: 5’ ТСААСОАССТОТСССАСАТ 3' (ЗЕО ГО N0: 63)
Ог	Ρ\ν4’: 5' ССТТАОСОААСАОООААОТАААСТ 3' (ЗЕО ГО N0:51) Обратный: 5’ СТТАССАТАОТСТОТОССАТССА 3' (ЗЕО ГО N0: 21)
Βν	Прямой: 5' САССТССАТАТТАСТСАААССААС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 64) Обратный: 5’ САОТААТТССТССАТССТОТТСА 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 65)
Οί	Прямой: 5' АОТТТОТАООТТТТОАТОТТАСАТТСАС 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 66) Обратный: 5’ ССАТСТТТОААСССССТАСТа 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 67)
”51	Прямой: 5’ ООАСАТОТОААОАОАССОАОС 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 68) Обратный: 5’ ССТАССТСТАССССТССОС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 69)

Таким образом, это изобретение обеспечивает способы, определенные в любом из вышеописанных аспектов А1-А11 или в любом варианте осуществления указанных аспектов, в которых присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-т), о), р), с|) и 1), определенными выше, в образце детектируют при помощи ПЦР-амплификации с использованием соответствующих пар праймеров, показанных в табл. 1.

Когда табл. 1 приводит более чем один прямой и/или обратный праймер для амплификации на определенной нуклеиновой кислоте (например, для СР4-ЕЧЧ), любой один или любая комбинация указанных прямых праймеров могут быть использованы с любым одним или с любой комбинацией указанных обратных праймеров для получения амплификации.

Следует понимать, что, хотя последовательности праймеров, перечисленных в табл. 1, были усовершенствованы для обеспечения оптимальной амплификации, данные способы могут работать адекватно при использовании вариантных праймеров, которые проявляют определенную ограниченную степень вариации последовательности относительно праймеров в табл. 1.

Таким образом, вышеописанные аспекты и варианты осуществления включают в себя также способы, в которых представляющие интерес нуклеиновые кислоты детектируют ПЦР-амплификацией с использованием вариантных праймеров, которые включают в себя одну или несколько вариаций последовательности относительно соответствующих праймеров, перечисленных в табл. 1, такие как, например, одна или несколько делеций, инсерций и/или замен, пока такие вариантные праймеры/пары праймеров все еще могут приводить к адекватной амплификации их соответствующих ампликонов. Предпочтительно такие вариантные праймеры могут обнаруживать по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и даже еще более предпочтительно по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%

- 9 024233 идентичность последовательности с праймерами, перечисленными в табл. 1. Сопоставления последовательностей и определение идентичности последовательностей может выполняться, например, с использованием Ва81С Ьоса1 ЛПдптсШ §еатсй Тоо1 (ВЬА§Т) первоначально описанного А1йс1ш1 с1 а1. 1990 (1 Мо1 Βίο1 215: 403-10), например, алгоритма В1ах1 2 хецнепсех, описанного ТаШхота апб Маббеп 1999 (РЕМ8 М1СтоЫо1 Ьей 174: 247-250).

Кроме того, должно быть понятно, что праймеры, перечисленные в табл. 1, или их варианты могут быть выгодным образом дериватизованы. Например, указанные праймеры или их варианты могут быть помечены для возможности детектирования амплифицированных продуктов, например, в применениях ПЦР в реальном времени. Таким образом, подобная дериватизация может, например, приводить к введению одной или нескольких меченых частей и одной или нескольких вспомогательных частей молекулы (например, гасящую часть, часть РКЕТ и т.д.), и необязательно, если требуется, модификации последовательности праймера для создания возможности введения и/или правильной работы указанной части или частей молекулы. Квалифицированный в данной области специалист обычно знаком со способами модификации праймеров и пар праймеров для целей мечения. Применение дериватизованных таким образом праймеров и пар праймеров может быть особенно полезным в ПЦР в реальном времени и, в частности, когда в мультиплексных реакциях амплификации должны прослеживаться два или более меченых продукта амплификации.

Таким образом, вышеописанные аспекты и варианты осуществления включают в себя также способы, в которых представляющие интерес нуклеиновые кислоты детектируют при помощи ПЦРамплификации с использованием производных праймеров и пар праймеров, перечисленных в табл. 1, или их вариантов.

В качестве примера в одном предпочтительном аспекте (А12) это изобретение представляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений (в частности, одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса, и/или сои, и/или риса, и/или сахарной свеклы, и/или хлопчатника, и/или картофеля), предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), Ь), с), о), р), с|) и ΐ), определенными выше, и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами б)4), определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Βΐ176, Βΐ11, Βΐ10, МОЫ810, МОЫ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, СА21, ΌΑ8-59122, необязательно М1К604, ЬУ038 и МО№8017, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Торах 19/2, М81, КР1, КР2, КР3, М88, СТ73, Т45, ЫЬегаЮг рНео6/Ас, С840/90рНое6/Ас, необязательно ΟΧΥ235, их гибридов, включающих в себя М81/КР1, М81/КР2, М88/КР3 и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов МΟN 40-3-2, МО№9788, А2704-12, А5547-127, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов РЬ62, ЬЬ06 и РЬ601, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибридов и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов ЬЬ сойоп 25, МΟN 1445, МΟN 531, МОМ5985, их гибридов и родственных им независимых трансформантов, где на стадии (1) присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот в образце детектируют при помощи ПЦР-амплификации с использованием соответствующих праймеров и пар праймеров, показанных в табл. 1, или их вариантов или производных.

По разъясненным выше причинам стадия (1) аспекта А12 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами б)-1), определенными выше. В одном предпочтительном варианте осуществления стадия (1) аспекта А12 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-1), определенными выше.

В одном аспекте это изобретение дополнительно обеспечивает праймеры и пары праймеров и их варианты или производные, подходящие для амплификации ампликонов из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) и), определенными выше. В частности, ввиду значительных усилий, вложенных авторами этого изобретения в идентификацию пар праймеров, перечисленных в табл. 1, это изобретение обеспечивает праймеры и пары праймеров, перечисленные в табл. 1, а также их варианты и производные, необязательно в любой подходящей комбинации указанных праймеров и/или пар праймеров или их вариантов или производных.

- 10 024233

Кроме того, это изобретение обеспечивает также продукты амплификации, получаемые с использованием предпочтительных праймеров и пар праймеров, векторы и плазмиды, содержащие указанные продукты амплификации, и рекомбинантые микроорганизмы, трансформированные указанными векторами и плазмидами и несущие указанные векторы и плазмиды.

Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, это изобретение относится также к рекомбинантной Е. сой, депонированной согласно Будапештскому договору Ве1щап Соогбша1еб Со11есйои8 о£ М1сгоогдап18Ш8 (ВССМ), ЬаЪога1огшт уоог Мо1еси1а1ге Вю1още - Р1а8т1йепсо11есйе (ВССМ/ЬМВР) (Итуегейей Сеп1. ТесЬио1од1ерагк 927, В-9052 Сеп1-2\уупаагйе. Ве1дшт) 10 января 2007 г. под номерами доступа ЬМВР: ЬМВР 5452, ЬМВР 5453, ЬМВР 5454, ЬМВР 5455, ЬМВР 5456, ЬМВР 5457, ЬМВР 5458, ЬМВР 5459 и ЬМВР 5460, 6 марта 2007 года под номером доступа 5451 и 19 апреля 2007 года под номерами доступа ЬМВР: ЬМВР 5587, ЬМВР 5588, ЬМВР 5589 и ЬМВР 5590, а также к выделенным рекомбинантным плазмидам, получаемым из указанной рекомбинантной Е. сой, а также к выделенным вставкам из указанных плазмид, предпочтительно выделенным вставкам ЕсоЫ-ЕсоКГ

Такие плазмиды или векторы или их вставки и их комбинации особенно применимы в качестве положительных контролей, эталонов и/или калибраторов для соответствующих ампликонов в реакциях амплификации вышеописанных способов.

Кроме того, это изобретение относится также к наборам, содержащим один или несколько реагентов, применимых в способах одного или нескольких вышеописанных аспектов и вариантов. Например, такие наборы могут содержать один или несколько из вышеописанных праймеров и/или пар праймеров, в частности, перечисленных в табл. 1, или вариантов или производных указанных праймеров, и/или один или несколько вышеописанных продуктов амплификации, векторов или плазмид, содержащих их, или вставки из указанных векторов или плазмид и/или носитель данных, содержащий инструкции для программируемого устройства для проведения стадии (2) способов этого изобретения (см. ниже). Такие наборы могут предпочтительно дополнительно содержать инструкции для пользователя в отношении выполнения способов этого изобретения и для интерпретации получаемых таким образом данных.

Это изобретение описывает также несложный и прямой способ выполнения стадии (2) вышеописанных аспектов и вариантов, т.е. для заключения о потенциальном присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего из различных представляющих интерес независимых трансформантов растений. В частности, результаты, получаемые для образца в стадии (1) вышеописанных аспектов и вариантов, представлены в виде набора О_ЗАМ, состоящего из нуклеиновых кислот, т.е. представляющего коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) - и) выше, которые были детектированы в указанной стадии (1) как присутствующие в этом образце (стадии ί)).

Кроме того, любой представляющее интерес независимый трансформант растения может быть представлено в виде набора Οχ (где X обозначает представляющее интерес незавимимую трансформацию), состоящего из нуклеиновых кислот, т.е. представляющего коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые были обнаружены в указанном независимом трансформанте, следовательно, могут быть детектированы в стадии (1), если этот образец содержал материал, происходящий из указанного независимого трансформанта, или гибрид, включающий в себя такой или родственный независимый трансформант (стадии (и)).

В конкретном примерном варианте осуществления, набор Ο_χ может предпочтительно быть выбран из наборов, представляющих независимые трансформанты, конкретно описанные выше, например, содержащих наборы: наборы независимых трансформантов в кукурузе О_В1176 ε {2т; р35§; Сгу1ЛЬ; РАТ/Ьаг}, Ο_Βίιι, ε !/т; р358; ίΝΟδ; Сгу1АЬ; РАТ/раЦ, О_Ви0 ε !/т; ρ35δ; ίΝΟδ; Сгу1АЬ; РАТ/ра1}, ^ΟΜΟΝ810 ^ε ί^Ζ11'1^{; р35}§^{; ίΝΟδ;} СЩАЬ}, ^ΟΜΟΝ863 ^ε ί^Ζ11'1^{; р35}§^{; ίΝΟδ} О}ТС1507 ^{ε {}2^{т; р35}§^; Р.АТ^/ра1}, ^ΟΝΚ603 ε {2т; р358; ίΝΟδ; СР4-ЕР8Р8}, Ο_Β25 ε {2т; р358; РАТ/ра1}, Ооа21 ε {2т; ίΝΟδ}, Ο ,.·₇₇ ε {2т; р358; РАТ/Ьаг}, Ο_ΜΙ,₆₀.₄ ε {2т; ίΝΟδ; тСгу3А}, О_Ьу₀₃₈ ε {2т; р358; ίΝΟδ; согбарА; О1Ь1} и Ο_ΜΟΝ88Μ7 ε {2т; ρ35δ; ίΝΟδ; СР4-ЕРδРδ; Сгу3ВЬ1}, наборы независимых трансформантов в масличном рапсе О_Тора8 19/2 ε {Вп; ρ35δ; РАТ/ра1}, Омз1 ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Ο,η ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Ο.,.._; ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Ο_Μδι/κη ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, О_МЯЖВ2 ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Ο_Μδ8 ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Ο.,.._; ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Ο··.^ε {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Оот?э ε {Вп; СР4-ЕРδРδ}, Ο_Β45 ε {Вп; ρ35δ; РАТ/ра1}, Оыъе.аог рНео6/Ас ε {Вп; ρ35δ; РАТ/ра1}, Οοδ4090ρΗое6/Ас ε {Вп; ρ35δ; РАТ/ра1}, Οοχυ235 ε {Вп; ρ35δ; Вхп}; наборы независимых трансформантов в сое Ο_ΜΟΝ40-3-2 ε {От; ρ35δ; ίΝΟδ; СР4-ЕРδРδ}, Ομον89788 ε {От; СР4-ЕРδРδ}, ОА2704-12 ε {От; ρ35δ; РАТ/ра1} и ОА5547-127 ε ^35δ; РА,Т/ра1}, наборы независимых трансформантов в рисе О_ЬЬ62 ε {Ог; ρ35δ; РАТ/Ьаг}, О_ЬЬ06 ε {Ог; ρ35δ; РАТ/Ьаг} и О_ЬЬ601 ε {Ог; ρ35δ; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, наборы независимых трансформантов в сахарной свекле Ο_Τι_20-7 ε {Ву; ρ35δ; РАТ/ра1}, Ο_Η7-ι ε {Ву; ρ35δ; СР4-ЕРδРδ} и О_А5-1₅ ε {Ву; ρ35δ; ίΝΟδ; СР4-ЕРδРδ}, наборы независимых трансформантов в хлопчатнике О_ьь сойоп 25 ε {Οδ; ρ35δ; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг}, Ο_ΜΟΝι₄₄₅ ε {Οδ; ρ35δ; ίΝΟδ; СР4-ЕРδРδ}, Ο_ΜΟΝ53ι ε {Οδ; ρ35δ; ίΝΟδ; Сгу1Ас} и Ο_ΜΟΝ15985 ε {Οδ; ρ35δ; ίΝΟδ; Сгу1Ас; Сгу2АЬ2} и набор независимых трансформантов в картофеле О_ЕН92-527-1 ε {δί; ίΝΟδ; Οϋδδ}; где обозначения между

- 11 024233 скобками {} относятся к нуклеиновым кислотам, перечисленным под пунктами а)-и) выше, которые обнаружены в таких независимых трансформантах и могут быть, следовательно, детектированы в материалах, происходящих из них. Должно быть понятно, что, если стадия детектирования (1) включает в себя дополнительные нуклеиновые кислоты, другие, чем нуклеиновые кислоты, перечисленные под пунктами а)-и) выше, такие нуклеиновые кислоты могут быть предпочтительно включены в вышеописанные наборы.

Должно быть понятно, что, когда вышеописанные способы не тестируют присутствие всех нуклеиновых кислот под пунктами а) - и) выше, этот набор образцов, а также наборы независимых трансформантов могут быть определены на основе нуклеиновых кислот, присутствие которых эффективно тестируется. В качестве примера, но не ограничения, если присутствие нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами _() - п), г) 8) и и), определенными выше, которые соответствуют специфическим признакам, наряду с нуклеиновыми кислотами, определенными под пунктами б) - ί), не тестируется, то наборы, соответствующие нескольким независимым трансформантам, могут быть определены в более узких рамках, в частности, наборы независимых трансформантов в кукурузе Ο_ΜΙΚ604 е ί'Ζιη; ίΝΟδ}, Ο[,_Υ038 е {2т; ρ35δ; ίΝΟδ}, ΟΜΟΝ88017 е {Ζηι; ρ35δ; ίΝΟδ; 0Ρ4-ΕΡδΡδ}; наборы независимых трансформантов в масличном рапсе 0_ΟΧΥ235 = {Вп; ρ35δ}; наборы независимых трансформантов в хлопчатнике 0_ΜΟΝ531 е {Οδ; ρ35δ; ίΝΟδ}, 0_ΜΟΝ15985 {Οδ; ρ35δ; ίΝΟδ} и наборы независимых трансформантов в картофеле ^ΟΕΗ92-527-1 ^{е {δί; ίΝΟδ}}.

Таким образом, присутствие материала, происходящего из представляющего интерес независимого трансформанта X в этом образце, может быть затем определено проведением логических операций для соответствующего представляющего интерес набора Ο_Χ следующим образом (стадии ίίί):

если Ο_Χ равен Ο_δΑΜ (Ο_Χ = Ο_δΑΜ), то материал, происходящий из независимого трансформанта X или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если Ο_Χ является истинным подмножеством Ο_δΑΜ (Ο_Χ с Ο_δΑΜ), то материал, происходящий из независимого трансформанта X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если Ο_Χ не равен Ο_δΑΜ и Ο_Χ не является истинным подмножеством Ο_δΑΜ, (Ο_Χ + Ο_δΑΜ и Ο_Χ <£ Ο_δΑΜ), то материал, происходящий из независимого трансформанта X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

В предпочтительных вариантах осуществления эти логические операции могут предпочтительно проводиться вычислительным устройством.

Должно быть понятно, что поскольку вышеописанный алгоритм для применения на стадии (2) этих способов объяснен здесь в связи с заключением о присутствии материала из определенных независимых трансформантов с использованием детектирования конкретных нуклеиновых кислот, указанный алгоритм в принципе легко применим к способам, которые нацелены на заключение о присутствии любых независимых трансформантов, таких как независимые трансформанты, иные, чем независимые трансформанты, конкретно упомянутые выше, или дополнительные к независимым трансформантам, конкретно упомянутым выше, с использованием детектирования любых нуклеиновых кислот, таких как нуклеиновые кислоты, другие, чем нуклеиновые кислоты, перечисленные под пунктами а)-и), или дополнительные к нуклеиновым кислотам, перечисленным под пунктами а)-и) выше.

Эти и дополнительные аспекты, и предпочтительные варианты осуществления этого изобретения описаны в следующих разделах и в прилагаемой формуле изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 (Α-Р) иллюстрирует выбранные последовательности ампликонов, амплифицированных с использованием праймеров, перечисленных в табл. 4, и присутствующих в клонирующих векторах, в частности, в ρυ018, таких как плазмиды, перечисленные в табл. 5. Как можно видеть, эти последовательности могут включать в себя частичные последовательности из множественных сайтов клонирования, фланкирующих инсертированные ампликоны.

Фиг. 2 (Α) показывает результаты мультиплексного ПЦР-теста на ρ35δ/ίΝΟδ, (В) кривая диссоциации ρ35δ/ίNΟδ-специфического мультиплексного теста.

Фиг. 3 обеспечивает графическое представление данных с использованием +/-8300 копий матриц, перечисленных в табл. 8.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном контексте единственные формы а, ап и Фе включают в себя как единственные, так и множественные понятия, если контекст не диктует явно другого понимания.

Термины содержащий, содержит и состоит из являются в данном контексте синонимами терминов включающий в себя, включает в себя или содержащий в себе, содержит в себе, и являются включающими в себя или не окончательными и не исключают дополнительных, не указанных здесь членов, элементов или стадий способов.

Предполагается, что термин приблизительно, когда он относится к измеряемой величине, такой

- 12 024233 как параметр, количество, продолжительность времени и т.п., включает в себя вариации +/- 20% или менее, предпочтительно +/-10% или менее, более предпочтительно +/-5% или менее, даже более предпочтительно +/-1% или менее и еще более предпочтительно +/-0,1% или менее указанной величины, пока такие вариации являются пригодными для выполнения в описанном изобретении. Должно быть понятно, что величина, к которой относится определение приблизительно, сама также раскрывается конкретно и предпочтительно.

Перечисления числовых диапазонов посредством конечных точек включает в себя все числа и части, находящиеся в пределах такого диапазона, а также указанные конечные точки.

Все документы, цитируемые в данном описании, включены в настоящее описание посредством отсылки в их полном виде. В частности, описания всех документов, на которые даются ссылки здесь, включены посредством отсылки.

Таким образом, в некоторых аспектах, более конкретно аспектах А1-А12, как описано в разделе Выводы, это изобретение относится к способам для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, предусматривающим стадии (1) детектирования присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих одну, более чем одну или все (причем конкретный выбор зависит от цели конкретного анализа) из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и), в разделе Выводы, и (2) заключения о присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, выбранных из группы, включающей один или несколько независимых трансформантов растений или состоящей из одного или нескольких независимых трансформантов растений, выбранных из группы, включающей некоторые или все из независимых трансформантов или состоящей из некоторых или всех независимых трансформантов, подробно описанных в разделе Выводы.

Незавимимая трансформация растения происходит путем независимой трансформации клеток растений гетерологичной нуклеиновой кислотой, обычно конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей один или более представляющих интерес трансгенов; регенерацией популяции растений, полученных в результате инсерции этой конструкции или ее части, включающей в себя указанный (указанные) представляющий интерес (представляющие интерес) трансген (трансгены), в геном этих растений; и отбором конкретного растения, характеризующегося указанной инсерцией, в одном или нескольких, предпочтительно одном конкретном местоположении генома. Таким образом, термин независимый трансформант растения включает в себя исходное отобранное таким образом растение-трансформант, а также его любого последующего потомка, содержащего инсертированную нуклеиновую кислоту, включающую в себя представляющий интерес трансген (представляющие интерес трансгены); например, указанный потомок может быть гемизиготным или гомозиготным в отношении указанной инсерции; указанный потомок может быть получен, например, вегетативным размножением или половым скрещиванием.

Термин растение включает в себя в данном контексте клетки растений; протопласты растений; культуру клеток или ткани растений, из которых может быть регенерирован растительный организм; каллусы или скопления растения; растительные организмы и их части, например, без ограничения, цветки, листочки околоцветника, лепестки, чашелистики, пыльники, пыльцу, семена, плоды, околоплодник (перикарпий), коробочки, листья, черешки, стебли, корни, корневища (ризомы), столоны, клубни, побеги и т.п. Этот термин обычно включает в себя в этом контексте растения любых таксонов, классифицированных в этой области в пределах царства растений (Р1аи1ае). Кроме того, в данном контексте растение может предпочтительно принадлежать к наземным растениям (эмбриофитам), в том числе, без ограничения, бессосудистым растениям (бриофитам) и сосудистым растениям (трахеофитам); более предпочтительно к сосудистым растениям (трахеофитам), включающим в себя, без ограничения, 1усоройюрЬу1а (плауны), есцизеЮрНуЩ. рЮпйоркуШ (папоротникообразные), рзПоЮрНуШ. орЫод1о88орйу1а, и семенные растения (зрегтаЮркуШ); даже более предпочтительно к семенным растениям (8ретта1орйу1а), включающим в себя, без ограничения, семеноносные растения (голосемянные растения), такие как, например, ршорйу1а, сусайорйу1а, дткдоркуЩ и дпеЮрку1а и цветущие растения (покрытосемянные растения), такие как тадио1юрку1а, в том числе однодольные (1Шор81Йа) и двудольные (МадпоПорзЛа). Предпочтительными растениями могут быть растения, обычно применяемые в земледелии и садоводстве. В качестве примера, но не ограничения, предпочтительные сельскохозяйственные культуры могут включать в себя кукурузу, пшеницу, рис, ячмень, сорго, табак, томат, картофель, масличный рапс, сою, сахарную свеклу, горох, подсолнечник, хлопчатник, арахис, цветочные растения (например, гвоздику) и т.д.

Термин материал относится обычно к физическому веществу. Термин материал, происходящий от независимого трансформанта растения, включает в себя независимый трансформант растения как таковой, в том числе, в качестве примера, но не ограничения, организм независимого трансформанта растения; любые части организма независимого трансформанта растения, такие как, например, цветки, листочки околоцветника, лепестки, чашелистики, пыльники, пыльцу, семена, плоды, околоплодник (перикарпий), коробочки, листья, черешки, стебли, корни, корневища (ризомы), столоны, клубни или побеги, или их части; клетки, протопласты, ткани, каллусы или скопления независимых трансформантов растения; или материал, полученный подверганием любых из вышеописанных частей одной или нескольким дальнейшим стадиям обработки. Эти дальнейшие стадии обработки могут включать в себя любые дейст- 13 024233 вия, используемые для обработки конкретных растительных материалов в сельском хозяйстве, садоводстве или в любых последующих отраслях промышленности, например, в пищевой промышленности, включающей в себя производство напитков, комбикормовую промышленность, в текстильной промышленности (например, хлопчатника, льна, бамбука и т.д.), топливной промышленности (например, масличного рапса), производстве смазочных веществ (например, касторового масла), производстве красок (например, льняного масла, тунгового масла), косметической и фармацевтической промышленности, и т.д.

В качестве примера, но не ограничения, такая дальнейшая обработка может включать в себя сбор; удаление нежелательных наружных слоев, например очистку от кожуры или кожицы, обдирание и т.д.; сушку, например атмосферную сушку, воздушно-солнечную сушку, распылительную сушку, лиофилизацию, концентрирование сока и т.д.; измельчение, например дробление, размалывание, рубку, нарезание и т.д.; разжижение, например сбор сока; консервирование, например вакуумный розлив в бутылки, консервирование в жестяных банках, баночное консервирование в герметичной таре, пастеризацию, добавление консервантов и т.д.; прессование, например сбор масла; гидрогенизацию, например сатурацию растительного масла; мацерацию; эмульгирование; тепловую обработку, например, варку, варку под давлением, обработку паром, обработку в печи, копчение, обжаривание, обработку на гриле и т.д.; ферментацию, например, с использованием дрожжей, бактерий и/или грибов; замораживание, и т.п.

Термин образец относится в данном контексте в широком смысле к репрезентативной части или фракции большего материала, представленного в целом для инспекции, например, для контроля качества. Предпочтительно в образце, подлежащем испытанию при помощи способов этого изобретения, может предполагаться потенциальное содержание материала, происходящего от одного или нескольких представляющих интерес независимых трансформантов растений. В качестве примера, такое подозрение может существовать в отношении любого образца, являющегося репрезентативным образцом материала, о котором известно, что он содержит, или предполагается, что он, возможно или вероятно, содержит, растения или их части или материал, происходящий из них, причем указанные растения или их части принадлежат к тому же самому таксону, что и представляющий интерес независимый трансформант, присутствие которого в этом образце подлежит испытанию. Например, образец может быть репрезентативным образцом растений или их частей, например, собранных или убранных растений или их частей (таких как, без ограничения, плодов, семян, коробочек, цветков и т.д.) или репрезентативным образцом промежуточного или конечного материала, полученного с применением к нему одной или нескольких дальнейших стадий обработки, или продуктов, содержащих такой материал, например, обработанных пищевых или кормовых продуктов.

Таким образом, в одном варианте осуществления этот образец содержит растения или их части, включающие в себя цветки, листочки околоцветника, лепестки, чашелистики, пыльники, пыльцу, семена, плоды, околоплодник (перикарпий), коробочки, листья, черешки, стебли, корни, корневища (ризомы), столоны, клубни или побеги, или их части; клетки растений, протопласты растений и/или ткани растений, и/или полученный из растений материал, предпочтительно пищевой или кормовой материал, в том числе обработанный пищевой или кормовой материал.

Способы этого изобретения детектируют присутствие или отсутствие в образце нуклеиновых кислот, т.е. генетического материала и предпочтительно геномной ДНК, происходящих или произведенных из представляющих интерес независимых трансформантов растений. Присутствие или отсутствие таких нуклеиновых кислот является показателем, соответственно, присутствия или отсутствия в этом образце этого и потенциально дополнительного материала, происходящего от соответствующих независимых трансформантов растений; такого как, например, материалы, соочищающиеся или совместно выделяющиеся с указанными нуклеиновыми кислотами во время различных стадий обработки, примененной к этим независимым трансформантам растений.

Известно, что нуклеиновые кислоты и, в частности, геномная ДНК, являются сравнительно стойкими и могут выдерживать различные стадии обработки, применяемые к растительным материалам в сельском хозяйстве и промышленности, например в пищевой и кормовой промышленности, так что молекулы ДНК с длиной, которая позволяет последовательность-специфическое определение их, могут быть обнаружены после таких стадий и даже в конечных продуктах.

Таким образом, предпочтительный образец этого изобретения содержит нуклеиновые кислоты, более предпочтительно геномную ДНК, даже более предпочтительно геномную ДНК, имеющую, по меньшей мере, размеры, которые позволяют их последовательность-специфическое детектирование, такие как, в среднем, по меньшей мере приблизительно 20 п.н., например, по меньшей мере приблизительно 30 п.н., предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50 п.н., по меньшей мере приблизительно 75 п.н., более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100 п.н., например, приблизительно 150 п.н., или даже более предпочтительно приблизительно 200 п.н., или по меньшей мере приблизительно 300 п.н., или по меньшей мере приблизительно 500 п.н., или по меньшей мере приблизительно 1 т.п.н., или более.

Хотя можно предположить, что большинство стадий обработки, которым независимый трансформант растения может быть подвергнут на практике, могло бы сохранять детектируемые нуклеиновые

- 14 024233 кислоты в конечном продукте, и, следовательно, в его подлежащем испытанию образце, авторы этого изобретения предполагают выполнение положительного контроля, нацеленного на проверку, содержит ли указанный образец детектируемые происходящие из растения нуклеиновые кислоты.

В частности, способ данного изобретения может дополнительно предусматривать детектирование присутствия или отсутствия в этом образце характерной для растений нуклеиновой кислоты. В предпочтительном варианте осуществления такая характерная для растений нуклеиновая кислота происходит из гена, присутствующего в различных таксонах растений и предпочтительно высоко консервативного (например, с > 80%, предпочтительно > 90%, более предпочтительно >95%, даже более предпочтительно > 96%, > 97%, > 98% или > 99% идентичностью последовательности) между различными таксонами растений; предпочтительно, по меньшей мере, в пределах семенных растений; или, по меньшей мере, в пределах покрытосемянных растений, например, между однодольными и двудольными растениями и/или в пределах однодольных и двудольных растений; или предпочтительно, по меньшей мере, между таксонами растений, обычно используемыми в сельском хозяйстве и промышленности, например, без ограничения, между кукурузой, пшеницей, рисом, ячменем, сорго, табаком, томатом, масличным рапсом, соей, сахарной свеклой, горохом, подсолнечником, хлопчатником, арахисом и цветковыми растениями (например, гвоздикой); или предпочтительно по меньшей мере между таксонами растений, содержащими независимые трансформанты получения трансгенных растений или состоящими из независимых трансформантов растений, испытуемых в этом образце.

В предпочтительных вариантах осуществления указанная характерная для растений нуклеиновая кислота получена из хлоропластного гена малой субъединицы КиЬ18со (рибулозобисфосфаткарбоксилазы) или из гена СН^-(ΚNА.-синтетазы.

Как упоминалось, способы этого изобретения включают в себя в стадии (1) детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих одну, более чем одну или все из нуклеиновых кислот или состоящих из одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) в разделе Выводы. Термин детектирование или детекция включает в себя в данном контексте любой способ определения присутствия или отсутствия указанной нуклеиновой кислоты в этом образце.

Предпочтительно присутствие конкретной молекулы нуклеиновой кислоты в образце может быть детектировано с использованием одного или нескольких реагентов, специфически гибридизующихся с соответствующей нуклеотидной последовательностью (соответствующими нуклеотидными последовательностями), содержащимися в указанной молекуле нуклеиновой кислоты.

Термины гибридизация и гибридизоваться относятся к процессу, посредством которого одна цепь нуклеиновой кислоты отжигается (гибридизуется) с комплементарной или по существу комплементарной последовательностью (последовательностями), содержащимися в одной и той же или другой полинуклеотидной цепи спариванием оснований, предпочтительно спариванием оснований Уотсона-Крика.

Термины комплементарное и комплементарность относятся к нормальному связыванию полинуклеотидов при пермиссивных солевых (ионной силе) и температурных условиях спариванием оснований, предпочтительно спариванием оснований Уотсона-Крика. В качестве примера, комплементарное спаривание оснований Уотсона-Крика происходит между основаниями А и Т, А или С и С. Например, последовательность А-С-Т (т.е., 5'-А-С-Т-3') является, следовательно, комплементарной последовательности А-С-Т (т.е., 5'-А-С-Т-3').

Степень комплементарности цепи (Т) нуклеиновой кислоты цепи (В) нуклеиновой кислоты может быть выражена в виде доли (процента) нуклеотидов цепи (А), которая, как ожидается, будет соответствовать, т.е. образовывать спаривание Уотсона-Крика, с нуклеотидами цепи (В) нуклеиновой кислоты, при отжиге указанных цепей (А) и (В) нуклеиновых кислот, предпочтительно в условиях высокой строгости.

Таким образом, комплементарные обозначает в данном контексте полную комплементарность, так что все соответствующие нуклеотиды этих цепей нуклеиновых кислот могут связываться при отжиге этих цепей. В качестве примера, относительно более короткая цепь может обнаруживать полную комплементарность относительно более длинной цепи нуклеиновой кислоты, если эта последняя цепь содержала последовательность, полностью комплементарную последовательности первой цепи. Термин по существу комплементарная относится к комплементарной в значительной степени, но не полностью комплементарной, в частности, по меньшей мере комплементарной на 85%, например, комплементарной по меньшей мере на 90%, предпочтительно комплементарной по меньшей мере на 96, 97, 98 или по меньшей мере на 99% нуклеиновой кислоте.

Термины специфически гибридизоваться и специфическая гибридизация отражают ситуацию, когда реагент гибридизуется с конкретной последовательностью более легко, чем он гибридизовался бы со случайной, неродственной последовательностью. Например, реагент специфически гибридизующийся с конкретной нуклеотидной последовательностью (А), предпочтительно обнаруживает малую гибридизацию или отсутствие гибридизации с другими полинуклеотидами и предпочтительно с гомологами или ортологами последовательности нуклеиновой кислоты (А), в условиях, в которых он мог бы специфиче- 15 024233 ски гибридизоваться с указанным полинуклеотидом (А).

Предпочтительно реагентами, которые могут специфически гибридизоваться с соответствующей нуклеотидной последовательностью (соответствующими нуклеотидными последовательностями), содержащимися в молекулах нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, могут быть зонды или праймеры.

Зонд является выделенной нуклеиновой кислотой, к которой предпочтительно присоединена детектируемая метка или репортерная часть молекулы, например, радиоактивный изотоп (например, ³²Р, ³³Р), лиганд, хемилюминесцентный агент, флуорофор (например, флуоресцеин, тетрахлорфлуоресцеин, ТΛΜКА, ΚΌΧ, Су3, Су3.5, Су5, Су5.5, Техах Кеб, и т.д.), витамин (например, биотин), стероид (например, дигоксин), фермент (например, НКР, АР, и т.д.), и т.д. Такой зонд является комплементарным или по существу комплементарным последовательности, содержащейся в цепи нуклеиновой кислотымишени, в случае данного изобретения, нуклеиновой кислоты, предпочтительно геномной ДНК, находящейся в списке под пунктами а)-и) выше. Зондами в соответствии с данным изобретением могут быть дезоксирибонуклеиновые кислоты, рибонуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, содержащие как дезоксирибо-, так и рибонуклеотиды; они могут содержать стандартные пуриновые и/или пиримидиновые основания (А, О, Т, С, и и/или I), но также другие природные, химически или биохимически модифицированные (например, метилированные), неприродные или дериватизованные нуклеотидные основания; могут включать в себя скелет макромолекулы, содержащий сахара и фосфатные группы, которые могут обычно обнаруживаться в РНК или ДНК, а также один или несколько раз модифицированные или замещенные (например, 2'-Ο-алкилированные, например, 2'-Ο-метилированные или 2'-Ο-этилированные; или 2'-Ο,4'-С-алкинилированные, например, 2'-О,4'-С-этилированные) сахара или один или несколько раз модифицированные или замещенные фосфатные группы - например, скелетные аналоги в нуклеиновых кислотах могут включать в себя фосфородиэфирные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные, фосфороамидатные, алкилфосфотриэфирные, сульфаматные, 3'-тиоацетатные, метиленовые (метиламино), 3'-Ы-карбаматные, морфолинокарбаматные и пептиднуклеиновые кислоты (ПНА).

Зонды могут иметь длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, например, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13 или по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидов, например, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов, например, по меньшей мере 21 нуклеотид, по меньшей мере 22 нуклеотида, по меньшей мере 23 или по меньшей мере 24 нуклеотида, даже более предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов, например, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 нуклеотидов.

Праймеры являются выделенными нуклеиновыми кислотами, предпочтительно дезоксирибонуклеиновыми кислотами, или в других предпочтительных примерах, рибонуклеиновыми кислотами или ПНА, комплементарными или по существу комплементарными последовательности, содержащейся в нуклеиновой кислоте-мишени (в случае данного изобретения, последовательности, содержащейся в нуклеиновой кислоте, предпочтительно геномной ДНК, включающей нуклеиновые кислоты или состоящей из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше), которые могут быть подвергнуты отжигу с указанной нуклеиновой кислотой-мишенью и могут действовать в качестве точки инициации синтеза продукта удлинения праймера в присутствии нуклеотидов и агента для полимеризации нуклеиновых кислот, такого как ДНК-зависимая или РНК-зависимая полимераза.

Праймер должен быть достаточно длинным для праймирования синтеза продуктов удлинения в присутствии агента для полимеризации. Таким образом, типичный праймер имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, например, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13 или по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидов, например, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов. Дополнительные предпочтительные праймеры имеют длину между приблизительно 10 и приблизительно 40 нуклеотидами, более предпочтительно между приблизительно 15 и приблизительно 30 нуклеотидами, наиболее предпочтительно между приблизительно 20 и приблизительно 25 нуклеотидами.

Парами праймеров называют комбинации праймеров, которые пригодны для амплификации ампликонов из внутренней части нуклеиновых кислот-мишеней (в случае данного изобретения, из внутренней части нуклеиновых кислот, предпочтительно геномной ДНК, включающей нуклеиновые кислоты или состоящей из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше), при помощи подходящих способов амплификации нуклеиновых кислот. Таким образом, способность амплификации ампликона из внутренней части конкретной нуклеиновой кислоты-мишени с использованием пары праймеров, сконструированных для специфической гибридизации внутри указанной нуклеиновой кислоты-мишени указывает на присутствие (и необязательно количество) указанной нуклеиновой кислоты-мишени в этом образце. Примерные, но не ограничивающие способы приготовления и применения зондов и праймеров описаны, например, в Μο^υ^ι· С1оп1пд: А ЬайогаШгу Μаηиа1, 2пб еб., νοί. 1-3, еб. Затйгоок е1 а1., Со1б 8ргшд Нагйог ЬайогаШгу Ргехх, Со1б 8ргшд Нагйог, Ν. Υ., 1989 (Затйгоок е! а1. 1989); Сиггеп! РгоШсок

- 16 024233 ίη Μο^πΙαΓ Βίοίοβν, еб. АикиЬе1 е1 а1., Огеепе РиЬНкЫпд апб УйеуЧШегкиепсе, №\у Уогк, 1992 (с периодическими обновлениями) (АикиЬе1 е1 а1. 1992); и 1 Ιηηίκ е1 а1., РСК РгоЮсоН: А Ошбе Ю ΜеίЬοб5 апб АррИсаБопк, Асабетк Ргекк: 8ап О1едо, 1990. Пары праймеров ПЦР могут быть произведены из известной последовательности, например, с использованием компьютерных программ, предназначенных для этой цели, таких как Рптег3 (Ро/еп апб 8ка1е1кку. 2000. Рптег3 оп 1ке УУУ Гог депега1 икегк апб Гог Ыо1од151 ргодгаттегк. 1п: Кга\уе1/ 8, Μ^5еηе^ 8 (ебк) ВюшГогтайск ΜеΐЬοб5 апб РгоЮсоЕ: ΜеΐЬοб5 ш Μο1еси1аг Вю1о§у. Нитапа Ргекк, ТоЮ\уа, Νί, рр 365-386) или пакета программ ОСО™ ν. 11.1.2 от Ассе1гук.

Специфическая гибридизация этих зондов, праймеров или пар праймеров этого изобретения с их соответствующими комплементарными последовательностями внутри нуклеиновых кислот-мишеней, например нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше), может быть предпочтительно достигнута в условиях высокой строгости.

Условия высокой строгости включают в себя условия, эквивалентные следующим примерным условиям для связывания или гибридизации при 65°С в растворе, состоящем из 5х88РЕ (43,8 г/л №С1, 6,9 г/л ΝβΗ^ΟψΗ^ и 1,85 г/л ЭДТА, с рН, доведенным до 7,4 при помощи №ЮН), 0,1% ДСН, 5х реагента Денхардта (50х раствор Денхардта содержит на 500 мл: 5 г Фиколла (Туре 400, РНагтааа), 5 г БСА (Фракции V; 8Цта) и 100 мкл/мл денатурированной ДНК спермы лосося), с последующим промыванием в растворе, содержащем 5х88РЕ, 0,1% ДСН, при 65°С при использовании зонда с длиной приблизительно 500 нуклеотидов. Другие примерные условия для гибридизации при высокой строгости для последовательностей нуклеиновых кислот с длиной более приблизительно 20-100 нуклеотидов, предпочтительно с длиной приблизительно 30-100 нуклеотидов, например, с длиной между 30 и 50 нуклеотидами, включают в себя условия, эквивалентные гибридизации в 6х88С при 45°С, с последующими одной или несколькими промывками в 0,2х88С, 0,1% ДСН или даже 0,1х88С, 0,1% ДСН при 65°С. Многочисленные эквивалентные условия могут быть использованы для варьирования условий строгости; рассматриваются такие факторы, как длина и природа (ДНК, РНК, состав оснований) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, состав оснований, присутствующие в растворе или иммобилизованные и т.д.), и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, декстран-сульфата, полиэтиленгликоля), и раствор для гибридизации может варьироваться для генерирования условий гибридизации низкой или высокой строгости, отличающейся от перечисленных выше условий, но эквивалентных им. Кроме того, в данной области известны условия, которые стимулируют гибридизацию при условиях высокой строгости (например, увеличение температуры гибридизации и/или стадий промывок, применение формамида в гибридизационном растворе, и т.д.). Руководство для выполнения реакций гибридизации может быть найдено, например, в СиггеШ РгоЮсо1к ш Μο1еси1а^ Вю1о§у, 1оНп \УПеу & 8опк, Ν.Υ., 6.3.1-6.3.6, 1989, и более недавних обновленных изданиях, все из которых включены в качестве ссылки.

Что касается амплификации ампликонов из внутренней части нуклеиновых кислот-мишеней с использованием пар праймеров, строгие условия или условия высокой строгости являются условиями, которые позволяют паре праймеров гибридизоваться только с ее соответствующей последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени и получать уникальный продукт амплификации, т.е. ампликон, по существу, без получения непредусмотренных, т.е. неспецифических продуктов амплификации. Например, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10%, даже более предпочтительно менее 5%, например, менее 4%, менее 3% или менее 2%, еще более предпочтительно менее 1%, например менее 0,1% или менее 0,01% общего количества (например, массы) продукта амплификации в одной реакции амплификации могли бы быть неспецифическими при проведении такой реакции при строгих условиях (например, при анализе с использованием количественного гель-электрофореза или посредством определения Т_т или т.п.).

Любые общепринятые способы могут быть использованы для детектирования гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью в этом образце. Например, нуклеиновые кислоты, предпочтительно ДНК, из образца могут быть иммобилизованы и денатурированы на твердом носителе и таким образом гибридизованы с соответствующими зондами (например, блоттингом по Саузерну, слот-блоттингом, дотблоггингом и т.д.). Если зонд - и, следовательно, его детектируемая метка - удерживаются на этом твердом носителе, это свидетельствует о том, что нуклеиновая кислота-мишень, в отношении которой является специфическим этот зонд, присутствует в данном образце.

Подобным образом, любой существующий способ амплификации нуклеиновых кислот может быть использован для амплификации ампликонов из внутренней части представляющих интерес последовательностей-мишеней, указывая на присутствие соответствующих последовательностей-мишеней в этом образце: в том числе, но не только полимеразная цепная реакция (ПЦР) (И8 4683202; И8 4965188), амплификация с вытеснением цепи (8БА) (И8 5455166; ЕР 0684315), ЬСК, ТА8, 38К, т8ВА (И8 5409818; ЕР 0329822), КСА и Ц-бета-амплификация.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления способы этого изобретения используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации ампликонов из внутренней части нук- 17 024233 леиновых кислот-мишеней, выбранных из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше. Термины полимеразная цепная реакция и ПЦР в широком смысле включают в себя любой способ, называемый так в данной области, и, в частности, способы для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней, особенно ДНК-последовательностей-мишеней, с использованием термостабильных ДНК-полимераз и двух праймеров, в частности, олигонуклеотидных праймеров, одного, комплементарного (+)-цепи на одном конце амплифицируемой последовательности, и другого, комплементарного (-)-цепи на другом конце. Этот термин включает в себя модификации прототипных ПЦР, таких как, например, ПЦР высокой точности, ПЦР с горячим стартом, 1оис11-бо\уп РСК, гнездовая ПЦР, мультиплексная ПЦР, количественная ПЦР, количественная ПЦР в реальном времени, ПЦР длинных фрагментов, ОТ-ПЦР, и т.д. (см., например, РСК РгоЮсо1е: А Ошбе (о ΜеίЬобδ апб АррПсаПопе, ебе. Ιηηίδ еί а1., Асабетк Ргеее, 8ап О1едо, 1990).

Продукты амплификации, полученные с использованием вышеописанных способов амплификации, и, в частности, с использованием ПЦР, могут оцениваться, например, на их присутствие или отсутствие, на их специфичность и/или количество, любым из способов, обычных в данной области. Например, размер (как показатель специфичности амплификации) и/или количество продукта амплификации могут оцениваться с использованием гель-электрофореза, такого как, например, электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле, где продукты амплификации визуализируют при помощи подходящих ДНКсвязывающих красителей, таких как, например, бромид этидия.

Альтернативно, продукты амплификации могут оцениваться способами, которые используют зонды, гибридизующиеся со специфическими последовательностями внутри продуктов амплификации. Например, продукт амплификации может быть иммобилизован и денатурирован на твердом носителе и затем гибридизован с меченым зондом.

В другом случае, продукт амплификации может быть сам меченым, например, включением детектируемой метки (например, флуорофора) в один или оба праймера и/или посредством субстратных нуклеотидов, включенных в продукт амплификации во время амплификации, и полученный таким образом продукт ПЦР может быть затем денатурирован и гибридизован со специфическими (олигонуклеотидными) зондами, прикрепленными к твердому носителю. Таким образом, присутствие и количество детектируемой метки в выбранных положениях на твердом носителе показывает специфичность и количество, соответственно, продукта амплификации. Например, такая схема пригодна для использования с массивами зондов, например микрочипами.

В дополнительных примерных способах продукты амплификации могут оцениваться с использованием клонирования и секвенирования: прямого секвенирования: опосредованного олигонуклеотидом пиросеквенирования (АЪтаб1ап еί а1. 2000. Апа1 ВюсНет 280: 103-110): хроматографии, например, ОНРЬС, анализов лигирования олигонуклеотидов (Ьапбедгеп еί а1. 1988. §с1епсе 241: 1077: Еддегбшд еί а1. 1995. Нит Μυπί 5: 153-165: №скегеоп еί а1. 1990. РNА§ 87: 8923-8927): КЛАее РгоЮсНоп Аееау: и т.д.

Особенно предпочтительным способом оценки продукта амплификации является амплификация в реальном времени, особенно ПЦР в реальном времени. Термин амплификация в реальном времени обозначает любой способ амплификации, предпочтительно ПЦР (ПЦР в реальном времени), который позволяет проводить мониторинг развития протекающей реакции амплификации (см., например, Кеа1Т1те РСК: Ап Еееепйа1 Ошбе, ебе. Еб\\агбе еί а1., Ноп/оп §скпййс Ргеее, 2004: Μ;·ΐΓπΐδ §АЕ еί а1. 2006. Кеа1-йте аееауе \νίΐ1ι то1еси1аг Ъеасопе апб оШег ПиогеесеШ пискк аиб ПуЬг1е1хаПоп ргоЪее. Сйп Сбит Ас1а 363: 48-60: в отношении обсуждения см. различные платформы ПЦР в реальном времени).

В качестве примера, но не ограничения, амплификация в реальном времени, в частности, ПЦР в реальном времени, включает в себя в данном контексте полностью стандартные системы, такие как, например, система Таскан Ά разработанная Аррйеб В1оеуе(ете, которая основана на высвобождении и детектировании флуоресцентного зонда во время каждого раунда амплификации ДНК (Но11апб еί а1. 1991. Эе1ес11оп оГ ереийс ро1утегаее сНат геасйоп ргобис! Ъу ибП/тд (Не 5'-3' ехопис1еаее асЮку оГ ТНегтие ациайсие ЭКА ро1утегаее. РNА§ 88: 7276-80). Этот способ использует 5'-экзонуклеазную активность полимеразы Тад во время удлинения праймера для расщепления дважды меченого, флуорогенного зонда, гибридизованного с ДНК-мишенью, между праймерами ПЦР. Перед расщеплением, репортерный флуорофор, такой как 6-карбоксифлуоресцеин (6-ΡΆΜ), на 5-конце этого зонда тушат 6карбокситетраметилроданином с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции (РКЕТ). После расщепления высвобождается ΡΆΜ. Полученная флуоресценция, измеренная в реальном времени при приблизительно 518 нм, во время лог-фазы накопления продукта, пропорциональна количеству копий последовательности-мишени.

Дополнительные системы детектирования амплификации в реальном времени, в частности, ПЦР в реальном времени, могут также использовать РКЕТ, например, системы на основе молекулярных маяков. Молекулярные маяки являются одноцепочечными полинуклеотидными зондами, которые имеют структуру шпильки со стеблем и петлей. Петля является последовательностью зонда, комплементарной последовательности внутри подлежащего оценке ампликона, а стебель образован короткими комплементарными последовательностями, расположенными на противоположных концах этого молекулярного

- 18 024233 маяка. Молекулярный маяк метят флуорофором (например, 6-РАМ) на одном конце и гасителем (например, ТАМКА) на другом конце. Будучи свободным в растворе, этот стебель сохраняет флуорофор и тушитель в тесной близости, вызывая тушение флуоресценции этого флуорофора посредством РКЕТ. Однако, при связывании с его комплементарной мишенью этот гибрид зонд-мишень заставляет стебель разворачиваться, отделяя флуорофор от тушителя и восстанавливая флуоресценцию. Таким образом, при увеличении количества ампликона во время амплификации это увеличение может быть подвергнуто мониторингу в виде увеличения флуоресценции соответствующего маяка (см., например, МапдапеШ е! а1. 2001. Кеа1-йте РСК ихшд то1еси1аг Ьеасопх. МеБюйх Мо1 Мей 54: 295-310; Маггах 8АЕ. 2006. 8е1есДоп о£ ДиоторЬоте апй циепсБег райх £ог Пногехсеп! писЫс аай НуЬг1й1хаПоп ргоЬех. МеЫойх Мо1 Вю1 335: 3-16; Маггах 8АЕ е! а1. 2006. Кеа1-Дте аххаух χνίΐΐτ то1еси1аг Ьеасопх апй о!йег Пногехсеп! пис1е1с аай НуЬпЫ/аПоп ргоЬех. СПп СЫт Ас!а 363: 48-60 в отношении дополнительного обсуждения детектирования молекулярных маяков).

Особенно предпочтительной системой ПЦР-амплификации в реальном времени и детектирования для применения в данном изобретении является система ЫдЫ Ироп Е.МепхЮп (ЬИХ™), продаваемая 1пу1!годеп (Саг1хЬай, СА) и описанная подробно в №-1/агепко е! а1. 2002 (ШсЮс Аайх Кехеатсй 30: е37) и Nаζагепко е! а1. 2002 (№с1ек Аайх Кехеатсй 30: 2089-2095). Эта система использует пары праймеров, в которых обычно один из этих праймеров указанной пары праймеров помечен флуорофором (таким как, например, РАМ или ГОЕ или А1еха Р1иог 546). Эта конкретная структура этого свободного праймера гасит сигнал связанного с ним флуорофора, в то время как интенсивность сигнала флуорофора увеличивается, когда этот праймер принимает удлиненную конформацию после включения в амплифицированный продукт. Последовательность этих праймеров данного изобретения, таких как особенно предпочтительные праймеры, перечисленные в табл. 1 и 4, может быть специально приспособлена для выполнения способа ЬИХ™ в соответствии с инструкциями приведенных выше публикаций Nаζа^еико е! а1. 2002 или с использованием инструментов программ, обеспеченных 1пуйгодеп на \у\у\\лпуйгодеп.сот/1их. Этот способ ЬИХ™ особенно пригоден для достижения мультиплексности (множественности) (т.е., выполнения в единой реакции) двух или более амплификации с использованием различных наборов праймеров, так как каждый из этих наборов праймеров может быть маркирован с использованием отличающегося флуорофора.

В отношении описания дополнительных путей для детектирования и оценки продуктов амплификации (например, с использованием смежных зондов; 5'-нуклеазных зондов, таких как зонды Тацтап™; ПдЫ-ир; праймеров Эир1ех хсогрюп; праймеров Атрййиог; и других альтернативных флуоресцентных форматов гибридизационных зондов, см., например, Маггах 8АЕ е! а1. 2006. Кеа1-йте аххаух \νί!ΐι то1еси1аг Ьеасопх апй о!Пег Пногехсеп! пис1ею аай ПуЬпЫ/аПоп ргоЬех. С1ш СЫт Ас!а 363: 48-60, в частности, раздел 6 и ссылки в нем).

В предпочтительных вариантах осуществления амплификация в реальном времени, предпочтительно ПЦР в реальном времени, данного изобретения использует (в основном) не специфические в отношении последовательности реагенты для детектирования и оценки накапливания продуктов амплификации. Эти системы обычно используют флуорохромы (флуоресцентные красители), которые связываются с ДНК (т.е. являются ДНК-связывающими), предпочтительно с двухцепочечной ДНК, по существу, не специфическим в отношении последовательности образом, и после такого связывания достигается или усиливается их флуоресценция. Таким образом, наблюдаемое увеличение флуоресценции указывает на появление и количество накопленного (двухцепочечного) продукта амплификации. Если указанные флуорохромы связываются преимущественно или исключительно с двухцепочечной ДНК и/или если их флуоресценция усиливается преимущественно или исключительно при связывании с двухцепочечной ДНК, то специфичность этого продукта амплификации может быть определена получением его кривой плавления, т.е. графика зависимости флуоресценции от температуры, и определением Т_т этого продукта, т.е. температуры, при которой 50% этого продукта расплавлены и, следовательно, потеряли его усиленную флуоресценцию. Наблюдение единственной ожидаемой Т_т для продукта амплификации (или множественных ожидаемых Т_т во множественной амплификации) подтверждает специфичность амплификации.

Примерные флуорохромы для применения в вышеописанных способах не специфического в отношении последовательности детектирования включают в себя, без ограничения, связывающиеся с большой бороздкой агенты, связывающиеся с малой бороздкой агенты, интеркалирующиеся красители или т.п.; такие как, например, 8УВК Огееп I (2-[ГО(3-диметиламинопропил)-ГОпропиламино]-4-[2,3-дигидро3-метил-(бензо-1,3-тиазол-2-ил)-метилиден]-1-фенилхинолиний; 21ррет е! а1. 2004. ШсГОс Аай Кех 32: е103), бромид этидия, НоесПх! 33258, РюоОтееп™ (Мо1еси1аг РгоЬех), предпочтительно 8УВК Огееп I или РюоОтееп™.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления реакции амплификации в реальном времени в данных способах могут быть множественными, т.е. два или более разных ампликонов могут быть амплифицированы с использованием двух или более соответствующих пар праймеров на одном и том же образце (образцах) в одной и той же реакции. Праймеры, предполагаемые авторами данного изо- 19 024233 бретения, в частности праймеры, перечисленные в любой из табл. 1 или табл. 4, или их варианты или производные, могут быть особенно пригодными для мультиплексирования применений, 1п1сг айа потому, что они работают адекватно, по существу, при одних и тех же или сходных условиях реакции (например, условиях состава реакционной смеси и температурных циклов), а также потому, что они продуцируют продукты сходного размера.

Хорошо понятно, что мультиплексность обычно требует, чтобы различные продукты амплификации, возникающие в этой реакции, могли быть различены. В данном контексте при использовании не специфических в отношении последовательности способов (например, с использованием §УВК Стееи или другого ДНК-связывающего красителя) для детектирования продуктов амплификации, мультиплексность, в частности, может ожидаться, когда продукты амплификации имеют достаточно разные Т_т, для различения построением кривой плавления (например, когда Т_т различаются на приблизительно 5°С или более). Однако при использовании ампликон-специфических способов детектирования (например, различно меченых праймеров или различно меченых зондов для различных ампликонов), в принципе возможным является далеко идущая мультиплексность этих тестов.

Таким образом, мишенью для вышеописанного детектирования с применением зондов и/или матрицы для амплификации с использованием пар праймеров, должна быть нуклеиновая кислота, происходящая из соответствующих независимых трансформантов растений, содержащаяся в этом образце. Предпочтительно эта мишень и/или нуклеиновая кислота-матрица должны быть геномной ДНК, происходящей из указанных трансгенных независимых трансформантов, которая, как ожидается, вследствие ее более высокой стабильности является лучше сохраняемой в этом образце, чем другие типы нуклеиновых кислот, такие как, например, гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) или мРНК. Тем не менее, это изобретение рассматривает также детектирование мРНК или кДНК (например, при помощи соответствующих ОТ-ПЦР-анализов), или происходящей из плазмид ДНК, в подходящих случаях.

Таким образом, данный способ предпочтительно использует амплификацию с применением пар праймеров, сконструированных для специфической гибридизации внутри и амплификации соответствующих ампликонов из внутренней части нуклеиновых кислот, присутствие или отсутствие которых в этом образце должно быть детектировано, таких как предпочтительно нуклеиновые кислоты, включающие нуклеиновые кислоты или состоящие из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, в качестве средства детектирования присутствия или отсутствия указанных нуклеиновых кислот в этом образце.

В этом отношении авторы данного изобретения выяснили, что, если материал независимого трансформанта растения был подвергнут одной или нескольким дальнейшим стадиям обработки, например, как описано выше, нуклеиновые кислоты, такие как их геномная ДНК, могут быть фрагментированы. Таким образом, для увеличения шансов репрезентативной амплификации соответствующих ампликонов из фрагментированной таким образом ДНК это изобретение описывает также выгодное уменьшение размера этих ампликонов.

Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления эти ампликоны меньше приблизительно 300 п.н., меньше приблизительно 280 п.н., меньше приблизительно 260 п.н., меньше приблизительно 240 п.н. или меньше приблизительно 220 п.н., более предпочтительно меньше приблизительно 200 п.н., например, меньше приблизительно 190 п.н., меньше приблизительно 180 п.н., меньше приблизительно 170 п.н. или меньше приблизительно 160 п.н., даже более предпочтительно менее приблизительно 150 п.н., меньше приблизительно 140 п.н., меньше приблизительно 130 п.н., меньше приблизительно 120 п.н. или меньше приблизительно 110 п.н., еще более предпочтительно меньше приблизительно 100 п.н. и еще более предпочтительно меньше приблизительно 90 п.н., например, приблизительно 85 п.н., приблизительно 80 п.н., приблизительно 75 п.н., приблизительно 70 п.н., приблизительно 65 п.н., приблизительно 60 п.н., приблизительно 55 п.н. или приблизительно 50 п.н..

В следующих предпочтительных вариантах осуществления эти ампликоны находятся в диапазонах приблизительно 50 п.н. - приблизительно 150 п.н., приблизительно 50 п.н. - приблизительно 100 п.н., предпочтительно в диапазонах приблизительно 50 п.н. - приблизительно 90 п.н., более предпочтительно в диапазонах приблизительно 60 п.н. - приблизительно 80 п.н. и еще более предпочтительно в диапазоне приблизительно 65 п.н. - приблизительно 75 п.н.

Как объяснялось, приведенные выше способы детектируют конкретные нуклеиновые кислоты, предпочтительно геномную ДНК, в образце. Может быть понятно, что некоторые надежные протоколы детектирования, например некоторые протоколы ПЦР, могут выполняться на образцах без предварительной очистки или обогащения составляющих их нуклеиновых кислот. С другой стороны, детектирования по этому изобретению могут выполняться более надежно, если нуклеиновые кислоты, такие как предпочтительно геномная кислота, сначала обогащают или выделяют из этого образца. Способы выделения нуклеиновых кислот, например, геномной ДНК, из образцов, в частности, из образцов, содержащих растительный материал, являются давно установленными в данной области и включают в себя способы, основанные, например, без ограничения, на экстракции органическим растворителем (например, экстракции смесью фенол-хлороформ) и осаждении этанолом или изопропиловым спиртом; связывании с ионообменными смолами; разделении в градиенте плотности хлорида цезия; хроматографии на колон- 20 024233 ке при центрифугировании, магнитном разделении и т.д. (см., например, ΜΠΗ^-πι 1992. Р1ап1 ΌΝΛ 1ко1аОоп, рр 59-88 ш Ное1/е1, ей. Μо1еси1а^ депейс апа1ук1к о£ рори1айопк: а ргасйса1 арргоасЬ. 1КЬ Ргекк, ΟχΓογΚ ик).

Качество выделенной таким образом ДНК может оцениваться, например, гель-электрофорезом и/или измерением отношения оптической плотности А₂₆₀/А₂₈₀. Предпочтительно это отношение А₂₆₀/А₂₈₀ для нуклеиновых кислот, используемых в способах детектирования этого изобретения, может находиться между 1,6 и 2,3, более предпочтительно между 1,6 и 2,0, даже более предпочтительно между 1,7 и 1,9, еще более предпочтительно между 1,75 и 1,85 и наиболее предпочтительно равно приблизительно 1,8. Количество выделенной таким образом ДНК может оцениваться, например, измерением оптической плотности А260 (8ашЬгоок 1989) или предпочтительно с использованием флуорохромов РкоСгееп™ или 8УВК Сгееп I (АЬп е! а1. 1996. №с1ек Аийк Кек 24: 2623-5; 8сЬпееЬегдег е! а1. 1995. РСК ΜеΐЬойк Арр1 4: 234-8).

В предпочтительном варианте осуществления получение материала нуклеиновых кислот, в частности геномной ДНК, для применения в способах этого изобретения может также вызывать фрагментацию с получением более низких средних размеров фрагментов нуклеиновых кислот, например, с использованием ферментативного расщепления или обработки ультразвуком, известных в данной области. Предпочтительная средняя длина фрагментированных таким образом нуклеиновых кислот может находиться между 200 и 2000 п.н., более предпочтительно между 300 и 1500 п.н., даже более предпочтительно между 500 и 1000 п.н., например, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900 или приблизительно 1000 п.н.

Таким образом, вышеописанные способы детектируют присутствие или отсутствие выбранных нуклеиновых кислот в образце, предпочтительно с использованием систем и протоколов детектирования, описанных здесь ранее. В данном контексте, заключение о присутствии конкретной нуклеиновой кислоты в образце делают, когда величина интенсивности сигнала (количество сигнала), полученная для этой нуклеиновой кислоты при помощи подходящего способа анализа (например, флуоресцентного сигнала, хемилюминесцентного сигнала, сигнала ферментной реакции и т.д.) в образце является большей, предпочтительно статистически значимо большей, чем величина этого сигнала в отрицательном контроле.

Отрицательный контроль не содержит анализируемой нуклеиновой кислоты, но может быть предпочтительно сравнимым с этим образцом в других отношениях, предпочтительно в большинстве других отношений, например в типе и количестве содержащегося в нем растительного материала, в дальнейших стадиях обработки, которым был подвергнут этот материал, и т.д.

Предпочтительно способы детектирования этого изобретения могут выполняться на нуклеиновых кислотах, более предпочтительно на геномной ДНК, выделенных из этого образца (см. выше). В таком случае отрицательный контроль может состоять в основном из выделенных нуклеиновых кислот, не содержащих детектируемых нуклеиновых кислот. Предпочтительно этот способ детектирования мог бы тогда использовать одно и то же или приблизительно одно и то же количество выделенных нуклеиновых кислот как из этого образца, так и для ссылки, отрицательного контроля. Предпочтительно также чистота и/или количество нуклеиновых кислот, выделенных из этого образца и из отрицательного контроля, может быть также одинаковым или приблизительно одинаковым; предпочтительно также, чтобы мог быть использован один и тот же способ выделения для выделения нуклеиновых кислот как из образца, так и из отрицательного контроля.

В вышеописанных ситуациях заключение о присутствии конкретной нуклеиновой кислоты в образце может быть предпочтительно сделано, когда величина интенсивности сигнала (количество сигнала), полученного для этой нуклеиновой кислоты в образце, является по меньшей мере в 2 раза большей, чем величина интенсивности сигнала в отрицательном контроле, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 4 раза большей, более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз большей, например, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз большей, по меньшей мере в 8 раз или по меньшей мере в 9 раз большей, даже более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз большей, например, по меньшей мере в 15 раз большей, еще более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз большей, например, по меньшей мере в 30 раз большей или по меньшей мере в 40 раз большей, еще более предпочтительно по меньшей мере в 50 раз большей, например, по меньшей мере в 100 раз большей по меньшей мере в 200 раз большей, по меньшей мере в 300 раз большей, по меньшей мере в 400 раз большей, по меньшей мере в 500 раз большей, по меньшей мере в 1000 раз или даже в большее число раз большей, чем сигнал в отрицательном контроле.

Таким образом, когда величина сигнала (количество сигнала), полученного для анализируемой нуклеиновой кислоты в образце, является не большей (например, одинаковой, приблизительно одинаковой или меньшей), чем величина сигнала, полученного для анализируемой нуклеиновой кислоты в отрицательном контроле, или предпочтительно не большей в указанное предпочтительное число раз, обычно можно сделать заключение об отсутствии указанной нуклеиновой кислоты в этом образце.

В предпочтительных вариантах осуществления присутствие или отсутствие в этом образце представляющей интерес нуклеиновой кислоты оценивают амплификацией в реальном времени, предпочти- 21 024233 тельно ПЦР в реальном времени. В этих системах общей мерой, используемой для выражения количества матрицы для конкретной нуклеиновой кислоты в образце, является величина С,. Вкратце, величина С, обозначает количество циклов, при котором флуоресценция, приписываемая накапливающемуся продукту амплификации (ДК_п), переходит через условную (произвольно выбранную) величину флуоресценции, установленную выше фоновой флуоресценции, но в пределах экспоненциальной фазы амплификации (т.е. в пределах части, которая казалась бы линейной на 1од 2-графике зависимости флуоресценции от числа циклов).

Таким образом, в амплификации в реальном времени обычно можно сделать заключение о присутствии конкретной нуклеиновой кислоты в образце, когда О этого образца (δΑΜ С,) является более низким, чем С! отрицательного контроля (Νϋ С,); и можно сделать предпочтительно, когда δΑΜ С! < (Νϋ с, - 1), например, δΑΜ С, < (Νϋ С_г - 2), δΑΜ С_г < (Νϋ С! - 3) или δΑΜ С, < (Νϋ С, - 4), более предпочтительно, когда δΑΜ С, < (Νϋ С_г - 5), например, δΑΜ С! < (Νϋ С, - 6), δΑΜ С! < (Νϋ С, - 7), δΑΜ С! < (Νϋ с, - 8) или δΑΜ с, < (Νϋ с, - 9), даже более предпочтительно, когда δΑΜ С, < (Νϋ С, - 10), например δΑΜ С, < (Νϋ С, -11), δΑΜ С, < (Νϋ С, - 12), δΑΜ С, < (Νϋ С, - 13), δΑΜ С, < (Νϋ С, -13) ог δΑΜ С, < (Νϋ С, - 14), еще более предпочтительно, когда δΑΜ С, < (Νϋ С, - 15), е.д., δΑΜ С, < (Νϋ С, - 16), δΑΜ С, < (Νϋ С, - 17), δΑΜ С, < (Νϋ С, - 18) или δΑΜ С, < (Νϋ С, - 19), еще более предпочтительно, когда δΑΜ С, < (Νϋ С, - 20), например δΑΜ С, < (Νϋ С, - 25), δΑΜ С, < (Νϋ С, - 30) или δΑΜ С, < (Νϋ С, - 35).

Таким образом, в амплификации в реальном времени, когда δΑΜ С, является не меньшей (например одинаковой, почти одинаковой или большей), чем Νϋ С,, или предпочтительно является не меньшей на предпочтительные перепады, указанные выше, обычно может быть сделано заключение об отсутствии указанной нуклеиновой кислоты в этом образце.

Как отмечалось выше, в системах амплификации в реальном времени, которые не используют последовательно-специфические зонды (например, когда продукт амплификации детектируют с использованием не специфических в отношении последовательности красителей ДНК, таких как, например, δΥΒΚ Ο^ееη I), специфичность продукта амплификации может быть подтверждена выполнением анализа кривой плавления и определением Т_т. О присутствии специфического продукта амплификации можно заключить, когда наблюдаемая Т_т является идентичной или, по существу, идентичной (предпочтительно в интервале ± 3°С, более предпочтительно ± 2°С, еще более предпочтительно ± 1°С, даже более предпочтительно ± 0,5°С, и еще более предпочтительно ± 0,2°С или ± 0,1°С) рассчитанной и/или экспериментально определенной температуре плавления ожидаемого ампликона.

Кроме того, заключение о специфической амплификации может быть предпочтительно сделано, когда анализ кривой плавления обнаруживает единственную Т_т. Альтернативно или дополнительно, заключение о специфической амплификации может быть предпочтительно сделано, когда продукт амплификации обнаруживает единственный, ожидаемый размер после гель-электрофореза. Однако, появление продукта (продуктов) неспецифической амплификации может быть до некоторой степени переносимым на практике, предпочтительно, если такой продукт (такие продукты) неспецифической амплификации составляют менее 50%, более предпочтительно менее 40%, даже более предпочтительно менее 30%, еще более предпочтительно менее 20%, даже еще более предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5%, даже более предпочтительно менее 2% и наиболее предпочтительно менее 1%, например, менее 0,5% или менее 0,1%, общего количества (масса/масса) продукта амплификации. Такие продукт (продукты) неспецифической амплификации могут наблюдаться, например, в виде одного или нескольких дополнительных размеров продуктов после гель-электрофореза.

В дополнительном развитии этого изобретения отмечается, что ампликоны, амплифицированные с использованием одного и того же набора праймеров на нуклеиновых кислотах, происходящих из различных независимых трансформантов, могут обнаруживать различающиеся величины Т_т, предположительно вследствие некоторых различий в последовательности между этими ампликонами. В качестве примера, но не ограничения ампликоны, амплифицированные с использованием набора праймеров δΕΟ ГО ΝΟ: 11 и 12 (табл. 4) на Βί11 и Βί176, обнаруживают такое различие в их Т_т. Таким образом, наблюдаемая величина Тт может служить в качестве дополнительной отличающей информации для использования в способе этого изобретения, так что получают даже более детальное указание на присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот из таких конкретных независимых трансформантов.

Альтернативно или дополнительно, в следующей вариации конкретная нуклеиновая кислота может быть амплифицирована с использованием конкретного набора праймеров для одного или более независимых трансформантов, хотя тот же самый праймер не мог бы амплифицировать соответствующую нуклеиновую кислоту в одном или нескольких других независимых трансформантах, предположительно вследствие некоторых различий последовательности в сайтах связывания праймера. Хотя такая ситуация может делать необходимым применение двух или более наборов праймеров для амплификации соответствующей нуклеиновой кислоты из различных независимых трансформантов (и может в этом отношении быть менее выгодной, чем выбор набора праймеров, который амплифицирует эту нуклеиновую кислоту из всех представляющих интерес независимых трансформантов в растении), это может давать преимущество обеспечения дополнительной информации о присутствии или отсутствии нуклеиновых кислот из

- 22 024233 конкретных независимых трансформантов в данном образце. Например, нуклеиновая кислота Сгу1АЪ может быть преимущественно детектирована из ΜΟΝ810 с использованием набора праймеров ЗЕЦ ГО ΝΟ: 30 и 31 и из Βΐ11 и Βΐ176 с использованием набора праймеров ЗЕЦ ГО ΝΟ: 11 и 12 (табл. 4).

Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что реакции амплификации, например ПЦР, могут вызывать появление неспецифического, побочного продукта - димера праймера. Такие продукты, димеры праймера, могут обычно быть легко отличимыми от продукта (продуктов) специфической амплификации по их отличающемуся, наиболее часто меньшему размеру и/или Т_т. Таким образом, квалифицированный в данной области специалист был бы способен распознать и минимизировать влияние таких артефактов на анализ реакции амплификации. Предпочтительные праймеры этого изобретения, такие как перечисленные в табл. 1 и 4, были сконструированы для минимизации действия димера праймера.

Следующим предметом обсуждения является чувствительность способов детектирования, используемых в данном изобретении, которая может быть выражена как их предел детектирования (ΕΟΌ), обозначающий здесь самое низкое количество или самую низкую концентрацию аналита (здесь конкретной подлежащей детектированию нуклеиновой кислоты) в образце, которые могут быть достоверно детестированы, хотя и необязательно в количественном выражении. Выражение достоверно детектированы, обозначает здесь, что образцы, содержащие количество или концентрацию ΕΟΌ анализируемого вещества, будут давать положительный результат в >50% повторных детектирований, предпочтительно в >60%, более предпочтительно в >70%, даже более предпочтительно в >80%, еще более предпочтительно в >90% и наиболее предпочтительно в >95% или даже в >99% повторных детектирований.

Предпочтительно ΕΟΌ способов детектирования, подходящих для применения в этом изобретении, выражаемый в виде копийности ΕΟΌ конкретной представляющей интерес нуклеиновой кислоты в образце, подвергаемой детектированию, может быть равен 10000 или менее, например, 9000 или менее, 8000 или менее, 7000 или менее или 6000 или менее, более предпочтительно 1000 или менее, например, 900 или менее, 800 или менее, 700 или менее или 600 или менее, еще более предпочтительно 500 или менее, например, 400 или менее, 300 или менее или 200 или менее, еще более предпочтительно 100 или менее, например, 90 или менее, 80 или менее, 70 или менее или 60 или менее, и наиболее предпочтительно 50 или менее, с примерными предпочтительными вариантами, включающими в себя 40 или менее, 30 или менее, 20 или менее или даже 10 или менее, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. Предпочтительные праймеры этого изобретения, такие как праймеры, перечисленные в табл. 1 и 4, были сконструированы для достижения особенно высокой чувствительности (низкого ΕΟΌ).

В данном контексте, термин кукуруза относится к 2еа таук, предпочтительно 2еа таук ккр. таук, и включает в себя все сорта растения, которые были выведены с кукурузой, в том числе дикие виды кукурузы; термины рапс, масличный рапс или канола относятся взаимозаменяемо к Вгаккюа парик и включают в себя все сорта, которые были выведены с рапсом, в том числе дикие виды рапса; термины соя (коу, коуа Ъеап или коуЪеап) относятся взаимозаменяемо к С1усше тах и включают в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с соей, в том числе дикие виды сои; термин рис относится к Ογυζη кайуа, в том числе, без ограничения, ккр. шЛса и _)аротса, и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с рисом, в том числе дикие виды риса; термин сахарная свекла относится к Ве1а унЦапк и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с сахарной свеклой, в том числе дикие виды сахарной свеклы; термин хлопчатник относится к Соккуршт крешек, предпочтительно Соккуршт ЫгкиШт, и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с хлопчатником, в том числе дикие виды хлопчатника; термин картофель относится к Зо1агшт 1нЬегокит и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с картофелем, в том числе дикие виды картофеля.

Независимые трансформанты растений называются здесь их обозначениями, обычно используемыми в данной области и известными квалифицированному в данной области специалисту. Тем не менее, в качестве дополнительной помощи, табл. 2 ниже суммирует дополнительную информацию, достаточную для специфической идентификации указанных независимых трансформантов.

- 23 024233

Незавимимый трансформант	Компания	Таксон хозяина	Уникальный идентификатор (Ш)
В1176	Зуп£еп1а	Ζεα тауз	3ΥΝ-Εν 176-9
ВШ	Зупвепй	Ζεα тауз	8ΥΝ-ΒΤ011-1
ΜΟΝ810	МопзапЮ	Ζεα тауз	ΜΟΝ-00810-6
ΜΟΝ863	Мопзапю	Ζεα тауз	ΜΟΝ-00863-5
ТС 1507	Рюпеег НьВгед / Ώο\ν А§го8пепсе	Ζεα тауз	ЦА8-01507-1
ΝΚ603	Мопзапю	Ζεα тауз	ΜΟΝ-00603-6
Т25	Вауег СгорЗиепсе	7,еа тауз	Αϋ3-ΖΜ003-2
ОА21	Мопзапю	Ζεα тауз	ΜΟΝ-00Θ21-9
ОЛХ-59122	ϋο\ν АёгоЗпепсез / Рюпеег Ηϊ-Вгес!	Ζεα тауз	ОАЗ-ЙА8-59122-7
ΜΙΚ604	Купаема ХееХ	Ζεα тауз	8ΥΝ-1Κ.6Θ4-5
ΕΥΟ38	Кепеззеп ЬЬС / МопзаШо	Ζεα тауз	ΕΕΝ-00038-3
ΜΟΝ88017	МспзапЮ	Ζεα тауз	ΜΟΝ88017-3
Тораз 19/2	Вауег СгорЗиепсе	Вгаззгса париз	Λ0Χ-ΒΝΟ07-1
М81	Вауег Сгор8с1епсе	Вгаззка париз	Λ0Χ-ΒΝ0Θ4-7
КР1	Вауег СгорЗиепсе	Вгаззгса париз	Λ0Χ-ΒΝ00Ι-4
КР2	Вауег СгорЗиепсе	Вгазз&а париз	ΑΟ8-ΒΝ002-5
ЕРЗ	Вауег СгорЗиепсе	Вгазз&а париз	ΑΟ8-ΒΝ003-6
М38	Вауег СгорЗиепсе	Вгаззка париз	ΑΟ8-ΒΝΘΘ5-8
ОТ73	МопзапЮ	Вгаззию	ΜΟΝ-00073-7
		париз
Т45	Вауег Сгор5с1епсе	Вгаззгса париз	АСХ-ВК008-2
ЫЬегаЮг рНоеб/Ас	Вауег Сгор8с1епсе	Вгаззгса париз	АСХ-ΒΝΟΚΜ
Сг540/90рНое6/Ас	Вауег СгорЗиепсе	Вгаззиж париз	АСХ-ΒΝΟΚΜ
М31/ЕР1	Вауег СгорЗиепсе	Вгаззжа париз	ΑΟ3-ΒΝ004-7 х АСХ-ВК001-4
М31/КР2	Вауег СгорЗиепсе	Вгазз&а париз	АС5-ВМ0О4-7 х АСЗ-В14002-5
Μ38/ΚΡ3	Вауег СгорЗиепсе	Вгазз1са париз	Α0Χ-ΒΝ005-Χ х ΑΟδ-ΒΝ003-6
ΟΧΥ235	Вауег СгорЗиепсе	Вгаззгса париз	ΑΟ8~ΒΝΘ11-5
ΜΟΝ 40-3-2	МопзапГо	СИусме тах	ΜΟΝ-04032-6
ΜΟΝ89788	МопзапЮ	О1усте тах	ΜΟΝ-89788-1
А2704-12	Вауег СгорЗиепсе	С1ус1пе тах	АС8-ОМ005-3
А5547-127	Вауег СгорЗиепсе	Скуете тах	АС8-ОМ006-4
ЬЬ62	Вауег СгорЗиепсе	Огуга заИха	АС8-О8002-5
1X06	Вауег СгорЗиепсе	Огуга χαύνα	АС8-О3001-4
Т120-7	Вауег СгорЗиепсе	Βεία νιιΐζατίί	АС8-ВУ001-3
Н7-1	Κ\ν5 8ААТ АО / МопзапЮ	Ве(а νΐίΙ§ατΐ5	ΚΜ-000Η71-4
А5-15	ЭАРПЗСО ЗееЛ; ОЬР ТпРоНшп А/8; МопзапЮ	Βεία ναί§αη3	ШХ-0А515-7
ЬЬ сойоп 25	Вауег СгорЗиепсе	Соззуршт кюзшим	АС8-ОН001-3
ΜΟΝ 1445	МопзапЮ	Соззуршт Мгзи/ит	ΜΟΝ-01445-2
ΜΟΝ531	МопзапЮ	Соззуршт ктзиГит	ΜΟΝ-00531-6
ΜΟΝ 15985	Мопзапю	Соззуршт кггзи(ит	ΜΟΝ-15985-7
ЕН-92-527-1	Ату1о§еп НВ (ВАЗ? Р1ат Знепсе	5о1апит ГиЬегозит	ΒΡ8-25271-9

Перечисленные выше уникальные идентификаторы (υί) представляют систему уникальной классификации независимых трансформантов растений, установленную вместо прежней классификации Огдатхайои Гог Есопопис Со-орегабои апб Оеуе1ортеп1 (ОЕСЭ) и описанную в ее публикациях ЕNV/^М/МΟNΟ(2002)7: ОЕСЭ Сшбапсе Гог Фе Оех1дпабоп оГ а итдие Иепббег Гог Тгапздетс Р1ап1х, оГ ОсФЬег 20, 2004, и ЕNV/^М/МΟNΟ(2002)7/ΚЕV1 оГ ШуетЬег 7, 2006. Эти указанные уникальные идентификаторы используются, признаются и приписываются в международном масштабе, в том числе в Европе (см., например, Сотпиххюп Кеди1абоп (ЕС) № 65/2004 оГ 1апиагу 14, 2004, где устанавливается система для развития и приписывания уникальных идентификаторов генетически модифицированным организмам).

Подробная информация в отношении вышеописанных и последующих представляющих интерес независимых трансформантов растений, такая как, например, информация о таксонах хозяев, трансформирующих конструкциях, инсертированных последовательностях, и т.д., может быть доступна через публично доступные порталы различных регламентирующих органов власти, в том числе, например, ОЕСЭ ВюТгаск Ргобис! Эа1аЬахе (Ьйр://тетете2.оесб.ог§/Ью1есЬ/беГаиЙ.ахрх), υδ ЕЭА

- 24 024233 (1Шр://\у\у\у.сГкап.Гйа.доу/). Еигореап СоттипЪу КедШег оГ СМ Роой апй Реей (1Шр://ес.еигора.еи/Гоой/йупа/дт_гед1к1ег/тйе.\_еп.сГт). ЛдЫок йа!аЬаке (\у\у\у.адЫок.сот), или !1е ЕС ГМО Сотракк йа!аЬаке (Ьйр://ууу.дто-сотракк.огд/), а также в научной литературе, и т.д. Квалифицированный в данной области специалист хорошо знает об этом и может использовать такие источники баз данных.

Кроме того, специфические в отношении независимых трансформантов способы детектирования и специфические в отношении конструкций способы детектирования (например, см. Сойе\ ЛПтеШапит) являются доступными и позволяют недвусмысленно различать приведенные выше и последующие независимые трансформанты. Например, Еигореап Соштипйу КеГегепсе ЬаЬога!огу (СКЬ) (ййр://дтосгЦгс.й/; Ьйр://дшо-с^1.^^с.й/к!а!икоίйокк.Ь!ш) предоставляет список надежных способов для специфического в отношении независимых трансформантов детектирования, обеспечиваемых изготовителями, описанных в научной литературе или разработанных самой СКЬ.

Как отмечалось выше, это изобретение позволяет делать вывод о присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего из выбранных независимых трансформантов, их гибридов, или родственных им независимых трансформантов.

Термин их гибриды в этом контексте относится к потомству, полученному одним или несколькими скрещиваниями двух или более совместимых независимых трансформантов (т.е. независимых трансформантов, способных скрещиваться, в частности, независимых трансформантов, принадлежащих к одному и тому же таксону), так что указанное полученное потомство содержит трансгенные вставки из двух или более родительских скрещиваемых независимых трансформантов.

Термин родственные им независимые трансформанты в этом контексте относится к независимым трансформантам, которые были получены введением в одни и те же таксоны тех же самых трансформирующих конструкций, что и в соответствующих указанных независимых трансформантов, но, несмотря на это отличаются от указанных независимых трансформантов, например, могут обычно отличаться в количестве и/или сайте геномных интеграции этой трансформирующей конструкции. Часто такие независимые трансформанты могут сами быть предметом для получения разрешения. В других случаях такие родственные независимые трансформанты могут присутствовать в виде нежелательных примесей. Таким образом, посредством детектирования генетических элементов из внутренней части трансформирующих конструкций способ данного изобретения позволит выгодным образом детектировать такие независимые трансформанты.

Как отмечалось выше, способы этого изобретения включают в себя детектирование присутствия или отсутствия в образцах одной или нескольких нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновых кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и), определенными выше.

В этом отношении, выражение нуклеиновая кислота, происходящая из конкретного таксона или специфическая для конкретного таксона, такая как нуклеиновые кислоты, перечисленные под пунктом а) 2ш, Ь) Вп, с) Сш, о) Ог, р) Βν, с.]) Ск и !) δ!, означает, что указанная нуклеиновая кислота в этом образце происходит из генетического материала, предпочтительно геномной ДНК, указанного конкретного таксона и не присутствует - и, следовательно, не могла бы быть детектирована с использованием выбранного способа детектирования - в генетическом материале, происходящем из других таксонов, таких как остальные таксоны, перечисленные выше. В качестве примера, но не для ограничения указанная нуклеиновая кислота, происходящая из этого конкретного таксона, может либо не иметь гомологов в других таксонах, либо ее гомологи в других таксонах могут иметь достаточно отличающиеся последовательности, так что они не могли бы быть детектированы выбранным способом детектирования. Например, в одном сайте детектирования, например в сайте детектировании, с которым мог бы гибридизоваться зонд или один или несколько праймеров амплификации, внутри этой конкретной нуклеиновой кислоты, такие гомологи могут обнаруживать меньшую чем 100% идентичность последовательности, предпочтительно меньшую чем 95%, даже более предпочтительно меньшую чем 90%, еще более предпочтительно меньшую чем 85%, еще более предпочтительно меньшую чем 80% и наиболее предпочтительно меньшую чем 75%, в предпочтительных примерных вариантах меньшую чем 70%, меньшую чем 65%, меньшую чем 60%, меньшую чем 55% или меньшую чем 50% идентичность последовательности с рассматриваемой нуклеиновой кислотой.

Кроме того, термин нуклеиновая кислота, происходящая из, используемый, в частности, в а)-и), означает, что указанные нуклеиновые кислоты происходят из их соответствующих таксонов, генетических элементов, генов, открытой рамки считывания и т.д., хотя они, как обнаружено в этом образце, могут структурно отчасти отличаться от них.

Например, последующая обработка растительного материала может вызывать изменения в структуре нуклеиновой кислоты (например, ДНК), и, возможно, что наиболее важно, может вызывать ее фрагментацию. Кроме того, иногда функциональные фрагменты или варианты полноразмерных элементов могут быть использованы в трансгенных растениях. Таким образом, нуклеиновые кислоты, происходящие из нуклеиновых кислот, указанных под пунктами а)-и) выше, могут быть, например, их фрагментами, пока такие фрагменты позволяют их специфическое отнесение к исходным нуклеиновым кислотам. Например, такие фрагменты могут включать в себя по меньшей мере 15 непрерывных п.н. последова- 25 024233 тельности, из которой они произведены, предпочтительно по меньшей мере 20 непрерывных п.н., например по меньшей мере 30 или по меньшей мере 40 непрерывных п.н., более предпочтительно по меньшей мере 50 непрерывных п.н., например, по меньшей мере 60 или по меньшей мере 70 непрерывных п.н., даже более предпочтительно по меньшей мере 80 непрерывных п.н., например по меньшей мере 90 непрерывных п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 200 непрерывных п.н., например, по меньшей мере 300 непрерывных п.н., по меньшей мере 400 непрерывных п.н. или по меньшей мере 500 непрерывных п.н. или более, и могут даже включать в себя полноразмерные элементы.

Другие модификации нуклеиновых кислот, ожидаемые из последующей обработки растительного материала, например, частичное дезаминирование и т.д., также обсуждаются под термином происходящие из.

В предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота а) Ζιη происходит из эндогенного гена (абй-1) алкогольдегидрогеназы Ζеа тау8. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена абй-1 Ζеа тау8 найдена под номером доступа ΆΡΊ23535.1 в базе данных СепВапк (й((р: //игеге. псЫ. п1т.тй. доу/).

В следующем предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота Ь) Вп происходит из эндогенного гена (асс) ацетил-СоА-карбоксилазы или эндогенного гена круциферина Вга88юа пари8. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена асс Вга88юа пари8 найдена под номером доступа Х77576.1 в базе данных СепВапк; примерная последовательность гена круциферина найдена под номером доступа ΧΙ4555.1 в базе данных СепВапк.

В следующем предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота с) Ст происходит из эндогенного гена (1ес) лектина С1усше тах. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена 1ес С1усше тах найдена под номером доступа К00821.1 в базе данных СепВапк.

В следующем предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота о) 0г происходит из эндогенного гена (р1б) фосфолипазы Ό 0гу/а 8а(1уа. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена р1б 0гу/а 8аЧуа. найдена под номером доступа АВ001919.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота р) Ву происходит из эндогенного гена глутаминсинтазы (С1иА3) Ве(а уи1дап8. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена С1иА3 Ве(а уи1дап8 найдена под номером доступа АУ026353.1 в базе данных СепВапк.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота с|) С8 происходит из эндогенного гена (8ай-7) гомолога 7 8шор818 агаЫбор818 Со88уршт. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена 8ай-7 Со88уршт найдена под номером доступа АУ117067 (авторы: §еисЫиа е( а1. 2003. Μо1 Вю1 Еуо1 20 (4): 633-643) в базе данных СепВапк.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота () 8( происходит из эндогенного гена УДФ-глюкозофосфорилазы (ИСРа8е) 8о1агшт (иЬего8ит. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена ИСРа8е 8о1агшт (иЬего8ит найдена под номером доступа И20345 в базе данных СепВапк.

В следующем предпочтительном варианте осуществления характерная для растений нуклеиновая кислота происходит из эндогенного хлоропластного гена КВСЬ (гЬс1) Ζеа тау8. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена гЬс1 Ζеа тау8 найдена под номером доступа Ζ11973.1 в базе данных СепВапк.

Квалифицированный в данной области специалист способен конструировать и подтверждать специфические зонды или пары праймеров из вышеописанных последовательностей для использования в стадиях детектирования данного способа.

Ссылки на элементы последовательностей и гены, упоминаемые в этом описании для нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами б)-п), г), 8) и и), известны квалифицированному специалисту в области генетической модификации растений. Таким образом, квалифицированный специалист понимает, к каким последовательностям относятся эти обозначения, и может вполне понять уровень изменений в отношении этих последовательностей, который является общим в генерировании трансгенных растений.

В одном варианте осуществления, нуклеиновая кислота, присутствующая в независимом трансформанте, может включать в себя открытую рамку считывания или ее функциональную часть (т.е. часть, успешно выполняющую желаемое действие в трансгенном растении) упоминаемых здесь генов, в частности генов, перечисленных под пунктами Г)-п), г), 8) и и), выше.

Тем не менее, посредством дополнительного объяснения, но не ограничения, авторы данного изобретения приводят здесь список примерных последовательностей для конкретных генов и элементов, упоминаемых под пунктами б)-п), г), 8) и и), и примерную происходящую из исходного растения нуклеиновую кислоту:

- 26 024233

Элемент последовательности/ген промотор СМУ р358 терминатор N08

ОКБ Сгу1АЬ

ОКБ гена Ьаг

ОКБ гена раг

ОКБ гена ЕР8Р8

ОКБ модифицированного гена СгуЗА промотор СНЫ

ОКБ гена СгуЗВЫ

ОКБ гена Вхп

ОКБ генаСгу1Ас

ОКБ гена Сту2АЬ2

ОКБ гена ОЬза хлоропластный ген гЬсТ, 2еа тауз

Номер доступа ОепВапк У00140 (весь геном САМУ) У00087.1

АБ465640

ΑΥ346130.1 ϋ<3156557.1

ΑΥ125353.1

АК836206.1

С8155614.1

С8410008.1

Е01313.1

ЕБ094884.1

О<>361266.1 ОКБ Х58453,1 Ζ11973.1

Должно быть понятно, что нуклеиновые кислоты, фактически присутствующие в независимых трансформантах растений, могут содержать последовательности, которые могут отличаться до некоторой степени от приведенных выше примерных последовательностей. Например, такие различия могут включать в себя делеции, добавления и/или замены оснований, укорочения (например, включение функциональных фрагментов), слияния с другими элементами (например, слияние с сигналами мембранного транспорта или сортинга органелл) и т.д.

Фактические последовательности приведенных выше и других элементов, обнаруживаемые в независимых трансформантах, были во многих случаях определены и доступны через ОепВапк и другие базы данных последовательностей. Таким образом, должны выполняться сопоставления последовательностей для идентификации районов в вышеуказанных нуклеиновых кислотах, наиболее подходящих для получения из них зондов или ампликонов.

Таким образом, может быть выгодным образом произведен зонд или ампликон (и соответствующий набор праймеров) из частей каждой из вышеупомянутых нуклеиновых кислот, который обнаруживается в большинстве независимых трансформантов и/или который обнаруживает наивысшую идентичность между различными независимыми трансформантами. Такие зонды или пара праймеров будут увеличивать шанс детектирования этой конкретной нуклеиновой кислоты из различных независимых трансформантов. Квалифицированный специалист может следовать этой инструкции для выполнения необходимых сопоставлений последовательностей.

Как указано в разделе Выводы, это изобретение обеспечивает также предпочтительный способ заключения в отношении потенциального присутствия или отсутствия материала от одного или нескольких представляющих интерес независимых трансформантов растений для использования в стадии (2) вышеописанных способов. В частности, результаты, полученные для образца в стадии (1) представлены в виде набора Од_Ам, символизирующего коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые были детектированы как присутствующие в этом образце; и сравнении указанного набора О_ЗАМ с одним или несколькими наборами представляющих интерес О_х, представляющих подлежащие оценке индивидуальные независимые трансформанты. Эти наборы представляющих интерес О_х состоят из нуклеиновых кислот, т.е. представляют коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновой кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые обнаруживаются в соответствующих независимых трансформантах и, следовательно, могут быть детектированы в стадии (1) (в той степени, до которой указанная стадия (1) детектирует присутствие указанных нуклеиновых кислот), если этот образец содержал материал, происходящий из соответствующих независимых трансформантов, или гибрида, включающего в себя этот материал, или родственного независимого трансформанта.

Следующая табл. 3 перечисляет, какие нуклеиновые кислоты из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, присутствуют в конкретных представляющих интерес независимых трансформантах.

- 27 024233

Таблица 3. Признаки независимых трансформантов

Как уже объяснялось:

если О_х равен Оз_Ам (О_х = О_8Ам), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Χ, или его гибрида, или родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если О_х является истинным подмножеством О_з^ (О_х с Оз^), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Χ, или его гибрида, или родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если О_х не равен и О_х не является истинным подмножеством (О_х Ψ и О_х <£ Оз^), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения х, или его гибрида, или родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, если О_х равен О^м и если ни один набор или ни одна сумма двух или нескольких наборов, представляющих независимые трансформанты (в частности, наборов, представляющих независимые трансформанты, выбранные из группы, содержащей или состоящей из:

Овн7б> Овц]. Овио;

ΟμΟΝ810, Ο.ΜΟΝ863· ОтС1507> θΝΚ603, θΤ25. ΟθΑ21, Оца5-59122, θΜΙΚ604, Οί Υ038, ΟμΟΝ88017, θΤορϋί 19/2,

Ом81, θΚΡΙ, θΚΓ2> ОМ51/КР1. θΜ51/ΚΡ2, Ом58, ОргЗ И ΟεΗ92-527-|)₅ другие, чем Ох, не равны Ох, то материал, произведенный из независимого трансформанта растения х или из его гибрида, или из родственного им независимого трансформанта, присутствует в этом образце.

В дополнительном развитии этого способа оценки нуклеиновым кислотам, включающим нуклеиновые кислоты или состоящим из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, приписываются соответствующие уникальные значения. Таким образом, набору О_зΛΜ приписано в этом случае значение VО_зΛΜ, являющееся множеством уникальных значений, приписанных нуклеиновым кислотам, детектированным на стадии (1) в качестве присутствующих в этом образце; и набору представляющих интерес О_х приписано значение УО_х, являющееся множеством уникальных значений, приписанных нуклеиновым кислотам, выбранным из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты

- 28 024233 или состоящих их нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые обнаруживаются в указанной событии и, следовательно, могут быть детектированы на стадии (1).

Таким образом, в предпочтительном примере, нуклеиновым кислотам

Ζιη”, Вп”,

Ош”, “р353’, ‘4ΝΟ3, “Сгу1АЬ”, “РАТ/Ьаг”, “РАТ/раО, “СР4-ЕР8РЗ”, “тСгуЗА”, “сог<1ар

А”, “О1Ы”, “СгуЗВЫ)”, “Вхп”, Ог”, “Βν”, “Ов”, “Сгу1Ас”, “Сгу2аЬ2”, “3(” и “ОЬзз” приписаны соответствующие уникальные значения

У_г„«, У_в„, У_Си, У_рз_}я, Уята, т и ιι\7 υ нт/ м и\7 п «ν н птг η ιιν н ιπτ υ п\7 п

У&у/АЬ , V РАТ/Ьаг , У ΡΑΤ/ραί , * СР4-ЕР5Р5 , У тСуЗА , У с&к1ар А > У СНЫ , УОуЗВЫ , У Вхп , ''VОт, Уз/', У&, У_с^,ас, Уаузм, Ул и У_о^;

и каждому набору представляющих интерес Οχ приписано соответствующее значение УО_Х, выбранное из значений из группы, содержащей значения или состоящей из значений

УС_в,_/76, УС_Й/Л УС«,,«, УСл/одая, УОлошз, УО_га50Д УО_ж60з,

УО_та, 'УОояЭ', УОыыпзг”, УОлй^Л УОдтол, ΎΟ^,Λ УС_Гчда у,/Л УО^Л УО^Д УО_№2, УОмя/кя, УО^/лга, УОл«Д УОдгЛ УСл/зми, ''УСДт-Д УОуЗз, УОдйетайг рНоеб/Лс, V ОсМО/ЮрНоеб/Ас”, УОоЛТЗЗз > ''УОлЮЛВД-зД)

УС._1ЮУ397.м, УОА270А.12, УО_Л5547-,2₇, УОдш, УОдД<и, УОдДДОУ, УОт,20-/, УС^.у,

УОяЗ-Уз, УОдд^зД УСлОЛ«Л УОш«я, УС^ЛЛЖз ИЛИ УО_Ен92-527-, в которых

- УОе,/7й = Угт ^х Ур355 ^х УсгуМЪ ^х У РАТ/Ьаг,

- УОв,11 ⁼ Угт ^х Ур355 ^х У|N05 ^х УоуУЯД ^х У ΡΑΤ/ραι,

- νΟ_βί/0 = \’ζη, ^х УрЗЗЗ ^х УуМК ^х Усп‘У-« ^х У РАТ/ра!,

- УОмО/Д/О = Уъп ^х УрЗЗЗ ^х У(.вд.7 ^х УоуУЯД.

- УОалмйя = Уг™ ^х Ур.м?^х Углюз,

- УОгсУ507 - Уйп ^х УрЗЗЗ ^х VΡΑΤ/ραι,

- УОхкыз ⁼ Уг™ ^х У_Рззз ^х У»люз ^х Уср4-ерзр&

- УОт25 = Уъп ^х УрЗЗЗ ^х VРАТ/ра1,

- УОсА21 = Угт^х У1X03, • УО,31_:;.>9,22 = У/т ^х Ур353 ^х УрЯГЛаг,

- УОдтгбо/ ⁼ У/_т ^х Уяоз ^х Угаляя.

- УОДГЙЗЗ ⁼ Уйп ^х УрЗЗЗ ^х Ул’ОГ ^х Дога'ярЛ ^х Уош,

- V О МО >,880 Г = Угт ^х УрЗЗЗ ^х У,ХОЗ ^х УсР4-ЕРЗР ^х У&г.Шя,

- УС Тора! ,9/2 ~ VВп ^х Ур353 ^х Уряг/раь

- У Одет = Уа„ ^х Улто * Уряглап

- УОрн = Υ_β„ > ν,ΛΟί' ^х Уй477£ип

- УОягз = Уап ^х У/даз ^х Утята«г,

- УО,ий· = Увп ^х У|«?з ^х Удяг/Воп

- УОдрз = Уйп ^х У/МЭЗ ^х У РАТ/Ьаг,

- УОм51/КР1 ⁼ У_Вп ^х ν<ΛΌ3 ^х У РАТ/Ьаг,

- УОм51/РР2 = Увп ^х У, ХОЗ ^х У РАТ/Ьаг,

- νθ,.Ι58 Ρ.’ ί ~ V Вп ^х У1X03 ^х VРАТ/Ьаг,

- УО₀Т73 ⁼ Увп^х V СР4-ЕРЗРЗ,

- νθτ45 = У_Вп ^х Ур353 ^х У РАТ/ра!, ~ УОиЬега,ог рНоеб/Ас ~УВп ^х Ур353 ^х У РАТ/ра1,

- УОсыоМрНмб/Ас ⁼ У Вп ^х УрЗЗЗ ^х У РАТ/раг,

- УОохГ235 ⁼ Увп ^х УрЗЗЗ ^х У Вхп,

- N0^0X40-3-2 ⁼ У От ^х Ур35В ^х У,//08 ^х УсР4-ЕР!,РВ,

- У О.МО//8,)783 = У От ^х УсР4-ЕР5РВ,

- УОа2704-12 ⁼ Уат^х Ур355 ^х УΡΑΤ/ραι,

- УОа5547-,27 ⁼ У От ^х Ур355 ^х V РАТ/ра,,

- У0ри2 ⁼ Уог^х Ур353 ^х У РАТ/Ьаг,

- 29 024233

УСщ„« = У» ^χ У_р355 X У РАТ/Ьаг, νΟί/,αυ — \ог^х Крззз ^χ ν,Ν03 ^χ '/рлт/ьап

УОт!20-7 ⁼ ν^ν ^χ ν_ρ;5$ ^χ УрАТ/ра,

У 0/77-ϊ = Νβν ^χ Ур55Я X VСР4-ЕРЗРЗ,

ΊΟα5-Ι1 = Ίβν ^χ Α’,,35:: ^χ ν,Λί₀5 ^χ КСР4-£.'‘5!С,

УОц соПоц 25 - ν& ^χ Ур35$ ^χ ν,ΜΧ ^χ УрлИгаг, УСтл/о;,;^! = У_а X Урззг ^χ У,ΝΟί ^χ УСР4-ЕРЗРЗ, Α’ΰ.ίίονπι = Уса χ Урззз х У(ХО$ ^χ Уоу/Лл УОмОМ5!»5 ⁼ У& ^χ УрЗЗЗ ^χ УлУИ' X УсОт/Лс ^χ Уау!Ло ИЛИ УОднух.с;?., = Vу, х У ,N03 ^х УОЬл·

Обратите внимание на то, что поскольку эти способы не тестируют присутствие всех нуклеиновых кислот под пунктами а)-и), приведенные выше значения будут определены в терминах нуклеиновых кислот, присутствие которых эффективно тестируется. В качестве примера, но не ограничения, когда присутствие нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами |)-п), г) к) и и), определенными выше, которые соответствуют специфическим признакам, наряду с нуклеиновыми кислотами, определенными под пунктами ά)-ί), не тестируется, то значения, соответствующие нескольким независимым трансформантам, могут быть определены более узким образом: в частности, значения независимых трансформантов ^{кукурузы} У^СМ1_К604 ^ν/.ΐϊΐ^/νΓ',Ο3· ^УС| .У038=^У/.т ^{х У}Р35З^{х У}1Ν'·^ ^VСΜΟN88017=^VΖт^хУр35З^хУОЭЗ^хVсρ4-ЕΡЗΡ^{, значение} независимых трансформантов масличного рапса УС₍._ХУ23,₅=У_В|1 ^хУ_|)3,_5З; значения независимых трансформантов хлопчатника ν^_ΟΝ53ι = У_СзхУ_Р35_ЗхУ(ло& УС^н^д^У^хУ^хУоэЗ и значение независимых трансформантов картофеля УС^г^-стУ^Уя^

Таким образом, стадия (ίίί) этого варианта осуществления могла бы включать в себя выполнение для каждого набора представляющих интерес С_Х логических операций:

если УСаш/УЩ равно 1, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или от родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если УС^/УЩ равно одному значению или кратному двух или более значений, выбранных из группы, состоящей из значений

У₂т, У Ви- Уош, Ур35£, ^УПКОК, Усгу1АВ, УрАЕ/Ьаг,

УрАК/раЪ νοΡ-ΕΡ8Ρ5, УщСгуЗА, Усогйар А, \⁷(г1Ы. УсгуЗВЫ, ^’ Г{_ЧГ|1 Уо_г, Увхп, Уо₅, Ус|у1Ас, Усгу2аЬ2> У, И У<И>в>

то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, из его гибрида, или от родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если УС_ЗА^УС_Х не равно 1 и не равно одному значению или кратному из двух или более значений, выбранных из группы, состоящей из значений

Угль Увп> Уога> Ур355>

УйМОК, ν&ΥΙΑΒ, УрАК/Ьаг. УрАТУраЬ УсР-ЕРЯР5» УщСгуЗА, У_Соп)ар А, Углы, УсгуЗВЫ, Увхп, Уог. Увхп, ^УО5, Усгу1Ай Усгу2аЬ2> ^УЛ И Уоь₅₅, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, из его гибрида или от родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, если У^^/УЩ равно 1 и если ни одно значение или кратное двух или более значений наборов, представляющих независимые трансформанты (в частности, значений, выбранных из группы, состоящей из или содержащей:

У О вн 7«, Убвш, νΟρ,ιο, УОмомю, УОмо/жз, УОгада, УОжли, УОто.

УОсЛ2Л УОщ5-5Р;22, УС,и/лбО7, УОгущ^, УСгоргк 1972, УСд/;;;, УО/гГ7, УС/гГ2, νθΛ/57/ΛΛ·;, УСм317КГ2, УОлТУЯ, УСяГЗ) УСл/З&ЯГ,!, νθΟΓ73, νθ77ί, УСл,бега,ог рНоеб/Ас,

УСоЗтОрНоеб/Ас, ^^0X3235, Άθ>740-3-2, У&ΜΟΝ89788, 4(-432704-12, У®Α5ί47-127> Ύθϋό2· У&1.Ш,

УСлЛ60Л УСп^Я-7, УОн7-1, 40л5-15, 4(Д[А.со11оп23, 4&ΜΟΝΙ445, УОмСМЗЗ!, УСΜΟΝ13985 ап<1 УОея92- 527-/) другие, чем УС_Х, не равны УС_Х, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, присутствует в данном образце.

В следующем предпочтительном варианте осуществления уникальные значения, приписанные нуклеиновым кислотам, включающим нуклеиновые кислоты или состоящим из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и), т.е. значения, выбранные из группы, состоящей из

Угль Увп, Уот- УрЭЗК, VПКОК, Усгу1АВ, УрАК/Ьаг, УрАК/раь ^УСР-ЕР5Р&

У|[|С|уЗА, Усогаар А, У<3|Ы, УсгуЗВЫ, Увхп, Уст, Увхп, У<3з, Уссу1Ас, Усгу2аЬ2, ^У51 И Уо(,₅₃,

- 30 024233 являются уникальными простыми числами, и эта стадия (ίίί) включает в себя выполнение для каждого набора представляющих интерес ΟΧ логических операций, если νΟ_δΑ_Μ/νΟ_Χ равно 1, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если VΟ_δΑΜ/VΟ_X является целым числом, большим, чем 1, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если VΟ_δΑΜ/VΟ_X не является целым числом, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

Авторы этого изобретения выявили, что применение простых чисел для представления индивидуальных анализируемых признаков (нуклеиновых кислот), как описано в предыдущем абзаце, является особенно простым и упорядочивает и облегчает анализ этих данных.

Ввиду этого авторы данного изобретения обсуждают также общую применимость описанного здесь анализа данных с использованием простых чисел в других применениях, например, в области молекулярной биологии или молекулярной медицины, и т.д. Таким образом, в одном применении, этот способ может быть обычно использован для определения состава образца, где указанный образец может содержать два или более различных независимых трансформантов (слово незавимимый трансформант в этом абзаце имеет общее значение, не ограниченное независимыми трансформантами растений) или их материалов, где каждое независимый трансформант характеризуется одним или несколькими признаками или характерными чертами (слова признаки и характерные черты в контексте этого абзаца несут общее значение, не ограничиваемое нуклеиновыми кислотами, хотя и включающими в себя предпочтительно нуклеиновые кислоты). Таким образом, этот образец, а также каждый независимый трансформант могут быть представлены в виде произведения (т.е. операции х) уникальных простых чисел, приписанных каждому из тестируемых признаков или каждой из тестируемых характерных черт, и (потенциальное) присутствие или отсутствие в указанном образце может быть тестировано делением (т.е. операцией / величины, полученной для этого образца, на величину, рассчитанную и приписанную каждому индивидуальному событию, и рассмотрением результата указанного деления, как описано выше, тиίаί^δ ти1апάίδ.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанные стадии вычисления стадии (2) этого способа проводят при помощи вычислительного устройства, например калькулятора или компьютера; и в дополнительных аспектах это изобретение обсуждает также вычислительное устройство, выполняющее вышеуказанные вычисления, носитель данных (например, дискету, СО-КОМ, и т.д.), содержащий инструкции для программируемого вычислительного устройства для проведения стадии (2) способа этого изобретения, в том числе вышеуказанных вычислений, набор, содержащий такой носитель данных, вместе с одним или несколькими реагентами, также применимыми в способах этого изобретения. Данное изобретение рассматривает также прикладную программу на основе тееЬ, позволяющую выполнять алгоритм стадии (2), где, необязательно, информация о независимые трансформантых, потенциально присутствующих в образце, может непосредственно оцениваться в подсоединенной базе данных посредством встроенной (загруженной) текстовой гиперссылки.

Должно быть понятно, что идентификаторы '^^, Οχ¹, VΟ_δΑΜ, νΟχ' и т.д., используемые в предыдущем описании, были выбраны здесь произвольно для обозначения лежащих в основе концепций ш1ег аПа наборов и значений, соответственно, и что другие идентификаторы (например, другие буквы, слова или выражения) могут использоваться для представления указанных наборов и значений.

Как упоминалось, способ данного изобретения может предпочтительно оценивать присутствие или отсутствие представляющих интерес нуклеиновых кислот, в частности, нуклеиновых кислот, выбранных из группы, включающей нуклеиновые кислоты или состоящей из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, с использованием амплификации и, в частности, ПЦР-амплификации ампликонов из них.

Понятно, что квалифицированный специалист обычно может быть способен конструировать наборы индивидуальных праймеров для специфической амплификации из известных последовательностей нуклеиновых кислот.

Тем не менее, как уже описывалось, табл. 1 дает список особенно предпочтительных пар праймеров, которые были скрупулезно сконструированы авторами изобретения для обеспечения многочисленных преимуществ при использовании в данной методологии. Кроме того, табл. 4 перечисляет праймеры табл. 1 и дополнительно включает в себя дополнительные праймеры и пары праймеров, которые также работают очень удовлетворительно в данном способе, хотя праймеры табл. 1 остаются предпочтительным выбором авторов этого изобретения. Эти наборы праймеров могут выгодным образом достигать амплификации из соответствующих нуклеиновых кислот, присутствующих в релевантных независимых трансформантах растений, и из различно обработанного растительного материала и влечет за собой различные преимущества, описанные в другом месте в этом описании.

- 31 024233

Таблица 4. Последовательности праймеров

Нуклеиновая кислота	Праймеры
Ζιιι (асШ-1)	Прямой: 5' СеТСбТТТСССАТСТСТТССТСС 3' (8Е<2 ГО N0: 1) Обратный: 5' ССАСТССйАйАСССТСАйТС 3' (8ЕО ГО ΝΟ: 2)
Ζηι (асШ-1)	Прямой: 5' ТСТСТТССТССТТТАСАССТАССАСТА 3' (ЗЕГ) ГО ΝΟ: 56) Обратный: 5’ ААТСОАТССАААСССАСАТОА 3' (ЗЕТ) ГО N0: 57)
Вп (АСС)	Прямой 1: 5' САОААТОАООАОСАССААОСТС 3' (8ЕЦ Π3ΝΟ: 4) Прямой2: 5’0СТСАССТСТАТААТС0АСССА 3’ (8Е<2 ГО N0: 79) Обратный: 5’ ООСОСАОСАТСООСТ 3’ (8ЕО ГО ΝΟ: 3)
Вп (круциферин)	Прямой: 5' САССТСААСАОТТТССАААСОА 3’ (8ЕЦ ГО N0: 24) Обратный: 5’ СОАССАОССТСАСССТТААО 3' (8Е0 ГО ΝΟ: 25)
От (лектин)	Прямой: 5' САТТАССТАТеАТ6ССТССАСС 3' (ЗЕ<3 ГО ΝΟ: 5) Обратный: 5' ЛЛзСАСеТСАТрСеЛТТС 3' (5Е0 ГО N0: 6) Обратный': 5' ААкСАСйТСАТдСйАТТСС 3' (8Е0 ГО N0: 49)
Ош (лектин) (8ЬТМ)	Прямой: 5’ ААССООТАОСОТТОССАО 3’ (8Е0 ΓΟΝΟ: 58) Обратный’: 5' АССССАТСТОСААОССТТТ 3' (ЗЕО ГО N0: 59)
р358 (более длинный)	Прямой: 5'-ОАСАОТСОТСССАААОАТОО-3' (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 7) Обратный: 5'-ОТСТТОСОААООАТАатаОО-3' (5Е<Э ГО N0: 8)
“р358” (более короткий)	Прямой; 5’ АААССААОТООАТТОАТОТОАТА 3’ (ЗЕО ГО N0: 60) Обратный: 5’ ОООТСТТОСОААООАТАОТО 3’ (5Е(? ГО ΝΟ: 61)
ΙΝΟ8 (ΤΝΟ8-Ο)	Прямой: 5'-ОАТТАОАОТСССОСААТТАТАСАТТТАА-3' (ЗЕТ) ГО ΝΟ: 9) Обратный: 5'-ТТАТССТАОКТТССОСССТАТАТТТ-3'(ЗЕО ΙϋΝΟ: 10)
’ΤΝΟδ (ΤΝΟ3-Ε)	Прямой: 5’ СОТТСАААСАТГТООСААТАААО 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 28) Обратный: 5' АААТОТАТААТТОСОООАСТСТААТС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 29)
Сгу1АЬ	Прямой: 5'-АССООТТАСАСТСССАТСОА-3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 11) Обратный: 5'-САОСАССТООСАСОААСТС-3' С8Е0 ГО ΝΟ: 12)
СоЗЛЬ	Прямой: 5' ОАСАТСАТСТООООУАТСТГ 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 30) Обратный: 5’ ОСОСТОТТСАТОТСОТТСАА 3’ (8Е0 ГО ΝΟ: 31)
Сгу1АЬ	Прямой: 5' АСОССТТССТООТОСААА 3' (ЗЕО ГО N0; 47) Обратный: 5' ССТООТТССТОССОААСТС 3’ (8Е0 ГО N0: 48)
РАТ/Ьаг	Прямой: 5’-СОТСААССАСТАСАТСОАОАСАА-3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 13) Обратный; 5'-ОТССАСТССТОСООТТССТ-3’ ( ЗЕО ΙΟ КО: 14)
РАТ/раС	Прямой: 5'-ССОСООТТТОТСАТАТСОТТ-3' (ЗЕО ΙΟΝΟ: 15) Обратный: 5'-ТСТТОСААССТСТСТАОАТСАТСАА-3'(ЗЕО 10 N0: 16)
СР4-ЕРЗР5	Прямой 1: 5'-ООСТСТОАССТТССТССТССТААОС-3' (ЗЕО10 N0: 17) Прямой!': 5'-СОСТСТОАОСТТСОТССТСТГААОО-3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 50) Прямой2: 5'-АТСАСТСОСТАСАСССТССАТ-3' (КЕО ГО ΝΟ: 18) Обратный: З’-ОААТОСООАСООТТССООАААО-З’ (8Е0 ΙΟ ΝΟ. 19)
СР4-ЕРЗРЗ	Прямой: 5’ ОСАТОСТТСАСООТОСАА 3' (ЗЕО ГО N0: 22) Обратный; 5’ ООАССТОТОООАОАТАОАСТТОТС 3’ (8Е<) ГО N0: 23) Обратный!; 5' ТОААООАССООТОООАСАТ 3' (ЗЕО ГО N0: 62) Обратный2: 5' ТОААООАССТСТОООАОАТ 3' (ЗЕО ГО N0: 63)
От	Прямой: 5’ ОСТТАОООААСАОООААОТАААОТТ 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 20) Прямой': 5’ ОСТТАОООААСАОООААОТАААОТ 3' (ЯЕ<) ГО ΝΟ: 51) Обратный: 5' СТТАОСАТАОТСТОТОССАТССА 3' (ЗЕО ГО N0: 21)
Βν (О1иАЗ)	Прямой: 5’ ОАССТССАТАТТАСТОАААОСААО 3' (ЗЕО ГО N0: 64) Обратный: 5' ОАОТААТТОСТССАТССТОТТСА 3' (ЗЕО ГО N0: 65)
Ов	Прямой: 5' АСТТТОТАООТТТТСАТСТТАСАТТСАС 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 66) Обратный: 5' ССАТСТТТОААССОССТАСТО 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 67)
81” (иОРаве)	Прямой: 5' ООАСАТОТОААОАОАСОСАОС 3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 68) Обратный: 5’ ССТАССТСТАССССТССОС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 69)
Общий праймер растений (КЬс!)	Прямой: 5’ АООТСТАА1ХЗОКТААОСТАС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 26) Обратный: 5' АОУСТТОАТСОТТАСАААОО 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 27)

В случаях, где табл. 4 включает в себя более одной строки, причем эти строки относятся к амплификации определенной нуклеиновой кислоты (такие как, например, несколько строк для Сгу1АЬ и СР4-ЕР8Р§) различными наборами отличающихся праймеров, любые один или несколько из указанных наборов праймеров указанных различных строк табл. 4 могут быть использованы для амплификации. Когда табл. 4 перечисляет в пределах единственной строки более одного прямого и/или обратного праймеров для амплификации определенной нуклеиновой кислоты (например, для Вп (АСС), Сш (лектин) или СР4-ЕЧЧ), любой один или любая комбинация указанного прямого праймера (прямых праймеров) могут быть использованы вместе с любым одним или с любой комбинацией указанного обратного праймера (обратных праймеров) для получения амплификации.

Кроме того, это изобретение обеспечивает также вариантные праймеры, которые включают в себя одну или несколько вариаций последовательности относительно праймеров, перечисленных в табл. 4, таких как, например, делеция, инсерция и/или замена, пока такие праймеры/пары праймеров могут все еще достигать адекватной амплификации их соответствующих ампликонов. Предпочтительно такие вариантные праймеры будут обнаруживать по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и еще более предпочтительно по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности относительно праймеров, перечисленных в табл. 4. Выравнивание последовательностей и определение идентичности последовательности может выполняться, например, с использованием Вакю Ьоса1 АНдпшей §еагсй Тоо1 (ВЬА8Т) первоначально описанного АНксНЫ е! а1. 1990 (1 Μο1 Вю1 215: 40310), например, алгоритма В1ак! 2 кециепсек, описанного ТаШкоуа апй Μаййеи 1999 (ΡΕΜδ ΜκγοΜο1 Ьей 174: 247-250).

- 32 024233

Кроме того, это изобретение рассматривает также вмонтированные праймеры и пары праймеров, подходящие для амплификации ампликонов из внутренней части ампликонов, амплифицированных из соответствующих нуклеиновых кислот с использованием пар праймеров, перечисленных в любой из табл. 1 или 4.

Это изобретение обсуждает также производные, описанные в другом месте в этом описании, праймеров и пар праймеров, перечисленных в любой из табл. 1 или 4.

Таким образом, это изобретение обеспечивает праймеры и пары праймеров, перечисленные в любой из табл. 1 или 4, а также их варианты и производные, необязательно в любой подходящей комбинации указанных праймеров и/или пар праймеров или их вариантов или производных.

В следующем аспекте, это изобретение обеспечивает продукты амплификации, получаемые из соответствующих нуклеиновых кислот с использованием вышеописанных праймеров и пар праймеров, и в частности, с использованием пар праймеров, представленных в любой из табл. 1 или 4, или их вариантов или производных. Указанные продукты амплификации могут быть дополнительно обработаны, например выделены, клонированы в подходящие векторы или плазмиды, трансформированы в рекомбинантных хозяев, например, подходящих бактериальных хозяев, таких как Е.сок размножены ими и выделены из них, секвенированы и т.д.

Предпочтительно указанные продукты амплификации, предпочтительно клонированные и повторно изолированные, и, возможно, содержащиеся в подходящих плазмидах или векторах, могут быть использованы в качестве положительных контролей для подтверждения работы стадий детектирования способов этого изобретения, направленных на детектирование соответствующей нуклеиновой кислоты в образце. Альтернативно или в дополнение, такие продукты амплификации (клонированные или изолированные) могут быть использованы в качестве калибрующих агентов для определения количества конкретных матриц в образце, например, ПЦР в реальном времени.

Таким образом, в следующем аспекте, это изобретение обеспечивает рекомбинантную Е.сок, депонированную согласно Будапештскому договору Ве1д1ап СоогбикНеб СоБескопе оГ Μ^с^оо^даη^ете (ВССМ), 10 января 2007 года под номерами доступа ΕΜΒΓ: ΕΜΒΓ 5452, ΕΜΒΓ 5453, ΕΜΒΓ 5454, ΕΜΒΓ 5455, ΕΜΒΓ 5456, ΕΜΒΓ 5457, ΕΜΒΓ 5458, ΕΜΒΓ 5459 и ΕΜΒΓ 5460, 6 марта 2007 г. под номером доступа 5451 и 19 апреля 2007 г. под номерами доступа ΕΜΒΓ: ΕΜΒΓ 5587, ΕΜΒΓ 5588, ΕΜΒΓ 5589 и 1,\1ВР 5590.

Указанные рекомбинантные Е.сок содержат продукты амплификации, полученные на матрицахнезависимых трансформантах с использованием наборов праймеров, перечисленных в табл. 5, клонированные в сайтах ЕсоК1 клонирующего вектора рИС18 ΜСδ.

Таблица 5

№ доступа ЬМВР	Пара праймеров	А мпл и φ ицирова иные при событии	Секвенированная вставка (фиг. 1)
ЬМВР 5460	ЗЕО ГО ΝΟ: 7 ЗЕО Ю ΝΟ: 8	ВТ11	8Е0 ГО ΝΟ: 34
ЬМВР 5456	ЗЕО ГО ΝΟ: 9 ЗЕО ГО ΝΟ: 10	40-3-2	5Е0 ΙΟΝΟ: 35
ЬМВР 5452	ЗЕО ГО ΝΟ: 47 ЗЕО ГО ΝΟ: 48	ΜΟΝ810	δΕΟ Ιθ ΝΟ: 36
ЬМВР 5453	ЗЕО ГО ΝΟ: 11 ЗЕО ГО ΝΟ: 12	В(176	8Е0 ГО ΝΟ: 37
ЬМВР 5454	ЗЕО ГО ΝΟ: 11 8Е0 ГО ΝΟ: 12	ВИ 1	ЗЕО ГО ΝΟ: 38
ЬМВР 5457	ЗЕО ГО ΝΟ: 13 δΕΟ ГО ΝΟ: 14	ВТ176	ЗЕО ГО ΝΟ: 39
ЬМВР 5455	ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 15 δΕΟ ГО ΝΟ: 16	ВТ11	ЗЕО ГО ΝΟ: 40
ЬМВР 5458	5Ε0 ΙΟ ΝΟ: 26 δΕΟ Ю ΝΟ: 27	Βϊ 11 кукурузы	8Е0 ГО N0:41
ЬМВР 5459	δΕΟ ГО ΝΟ: 26 3Ε0 ГО ΝΟ: 27	О5К (масляничный рапс) дикого типа	δΕΟ ГО N0:42
ЬМВР 5451	δΕΟ ГО ΝΟ: 28 8Ε0 Ю ΝΟ: 29	В«11	ЗЕО ГО N0:43
ЬМВР 5587	δΕΟ ΙΟΝΟ: 22 δΕΟ ГО ΝΟ: 23	ИКЗ сои	δΕΟ ГО ΝΟ: 53
ЬМВР 5588	δΕΟ Ю ΝΟ: 22 5ΕΟΙϋΝΟ:23	ОТ 73	δΕΟ П> ΝΟ: 54
ЬМВР 5589	5Ε0 ГО ΝΟ: 24 δΕΟΙϋΝΟ: 25	ОТ 73	δΕΟ ГО N0: 55
ЬМВР 5590	δΕΟ ГО N0:51 δΕΟ ГО N0:21	Рис дикого типа	ЗЕО ГОЖ): 52

Кроме депонированных плазмид и Е.сок, перечисленных в табл. 5, это изобретение обеспечивает также дополнительные примерные плазмиды, такие как, например, рИС18, содержащие вставки, амплифицированные с использованием, например пары праймеров 5ЕО ΙΌ ΝΟ: 3 и 4 для гена асс Втаеека (примерной последовательности вставки 5ЕО ГО ΝΟ: 44 на фиг. 1, амплифицированной на ΟδК дикого типа):

пары праймеров СР4-ЕРδР 8ЕО ГО ΝΟ: 18 и 19 и 5ЕО ГО ΝΟ: 50 и 19 (примерных вставок, ампли- 33 024233 фицированных, соответственно, на событии 40-3-2 и событии ΝΚ603, для получения соответствующих примерных последовательностей вставок, показанных в виде 8ЕЦ ГО ΝΟ: 45 и 46 на фиг. 1) (праймер 8ЕЦ ГО ΝΟ: 17 может быть также использован вместе с праймером 8ЕЦ ГО ΝΟ: 19; однако, праймер 8ЕЦ ГО ΝΟ: 17 содержит несоответствие последовательности при нуклеотиде 20 в сравнении с последовательностью 50, которая, следовательно, является более предпочтительной);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 и 2 для гена абй-1 кукурузы (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 32 на фиг. 1, амплифицированной на кукурузе дикого типа);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 5 и 49 для гена лектина сои (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 33 на фиг. 1, амплифицированной на сое дикого типа);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 56 и 57 для более короткого ампликона внутри гена абй-1 2еа таук (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 70 на фиг. 1);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 58 и 59 (8^Μ) для ампликона лектина О1усше тах (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 71 на фиг. 1);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 60 и 61 для более короткого ампликона внутри элемента р358 (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 72 на фиг. 1);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 64 и 65 для ампликона внутри гена О1иА3 Ве1а νи1да^^к (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 76 на фиг. 1);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 66 и 67 для ампликона внутри гена кай-7 Ооккуршт (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 77 на фиг. 1);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 68 и 69 для ампликона внутри гена ИОР-азы картофеля (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 78 на фиг. 1);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 11 и 12 для ампликона внутри признака Сгу1АЬ (примерной последовательности вставки 8ЕЦ ГО ΝΟ: 73 на фиг. 1, амплифицированной на материале ΜΟΝ 810);

пары праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 22 и 62 (КК8) или 22 и 63 (ОТ 73) для ампликона внутри признака СР4-ЕР8Р8 (примерной последовательности вставки на фиг. 1: 8ЕЦ ГО ΝΟ: 74, амплифицированной на ОТ73, и 8ЕЦ ГО ΝΟ: 75, амплифицированной на КК8).

Отмечается, что вследствие более короткого размера соответствующего ампликона, пара праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 22 и 23 или 8ЕЦ ГО ΝΟ: 22 вместе с любыми одним или обоими праймерами 8ЕЦ ГО ΝΟ: 62 и 63, может быть предпочтительно использована для амплификации СР4-ЕР8Р8 как из необработанного растительного материала (например, ткани или семян растения), так и из обработанного материала (например, кормового или пищевого продукта), тогда как пара праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 18 и 19 или 50 и 19, которая определяет более длинный ампликон, может быть предпочтительно использована на необработанном материале. Таким образом, пара праймеров 8ЕЦ ГО ΝΟ: 22 и 23 или 8ЕЦ ГО ΝΟ: 22 вместе с любыми одним или обоими праймерами 8ЕЦ ГО ΝΟ: 62 и 63 может быть более предпочтительной в данных способах и наборах.

Кроме того, это изобретение обеспечивает выделенные рекомбинантные плазмиды, получаемые из рекомбинантных бактерий Е.сой, перечисленных в табл. 5, а также их выделенные вставки, предпочтительно вставки ЕсоК1. Это изобретение обеспечивает также любой другой рекомбинантный микроорганизм, трансформированный выделенными таким образом плазмидами.

Квалифицированному специалисту может быть также понятно, что это изобретение может обеспечивать комбинации указанных плазмид или вставок, причем указанные комбинации являются репрезентативными для тех нуклеиновых кислот, которые подлежат детектированию в образце.

Кроме того, это изобретение обеспечивает использование рекомбинантных плазмид и вставок, обнаруженных в бактериях табл. 5 и получаемых из бактерий табл. 5, или других, объясненных выше, для использования в качестве положительных контролей и/или калибраторов в способах данного изобретения. Например, такие плазмиды или их вставки могут быть включены в способах и наборах этого изобретения в подходящих количествах для облегчения также принятия решения, присутствует ли нуклеиновая кислота одного или нескольких независимых трансформантов в количестве, которое оправдывает дополнительное количественное определение, или присутствует в количестве ниже приемлемого порога.

В дальнейшем развитии этого изобретения обсуждается также, что любой из праймеров этого изобретения, в частности такой как праймеры, перечисленные в любой из табл. 1 или 4, или их варианты или производные, может быть использован в стратегии прогулки по геному для идентификации последовательностей, смежных с указанным праймером в геномной ДНК независимого трансформанта. Подобным образом обсуждается, что любой праймер, сконструированный на основе последовательности любого ампликона данного изобретения, в частности такой, как любой праймер, расположенный внутри или перекрывающийся с любой из последовательностей ампликонов 8ЕЦ ГО ΝΟ: 34 - 8ЕЦ ГО ΝΟ: 78, или вариант или производное такого праймера, может быть использован в стратегии прогулки по геному для идентификации последовательностей, смежных с указанным ампликоном в геномной ДНК независимого трансформанта.

Этот аспект может быть, в частности, применим, когда данные способы амплификации продуцируют ампликон, имеющий характеристики (например, длину, Т_т или последовательность), которые не могут быть недвусмысленно отнесены к конкретному независимому трансформанту. В такой ситуации про- 34 024233 гулка по геному вне этого рассматриваемого ампликона может обеспечить дополнительную информацию о последовательности этого независимого трансформанта и посредством этого способствовать идентификации указанного независимого трансформанта. В особенно предпочтительных вариантах осуществления этот специфический праймер может быть получен из ампликонов р35 или ίΝΟδ.

В общем, стратегии прогулки по геному хорошо известны в данной области. Примеры включают в себя ш!ег аПа способ векторетты КПеу е! а1. 1990 (Ыис1е1с Αοίάδ Кек 18: 2887-90), доступный коммерчески в виде итуег8а1 УесЮгеПе™ δу8ίет ^щта), а также более поздних упрощений этой системы (см., например, Κίϊδίπιρ & Кг18Йап8еп 2000. Ыис1е1с Ααάδ Кек 28: е55).

В одном конкретном варианте осуществления авторы этого изобретения обсуждают двухстадийный способ прогулки по геному. В первой стадии амплификации меченый ^υX™ (или другим образом) праймер этого изобретения используют вместе со смесью произвольных (случайным образом выбранных) праймеров (обычно с длиной приблизительно 8-15 п.н.) и предпочтительно используют условия градиентной ПЦР увеличивающейся строгости. Метка на этом праймере позволяет следить, имеет ли место амплификация, использующая меченый праймер. Во второй стадии амплификации выполняют гнездовую ПЦР с использованием другого вложенного праймера из этого ампликона, предпочтительно также меченого ^υX™ или другим образом, вместе с указанными случайным образом выбранными праймерами, и предпочтительно при условиях ПЦР высокой строгости. Метка на этом праймере позволяет следить, имеет ли место амплификация, использующая меченый праймер. В конечном счете, полученный таким образом продукт секвенируют, идентифицируя посредством этого последовательности, смежные с этим ампликоном.

В следующих аспектах это изобретение обеспечивает наборы компонентов для выполнения способов данного изобретения, т.е. для испытания образца на потенциальное присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений.

В одном варианте осуществления набор согласно этому изобретению может содержать зонды, подходящие для детектирования одной или нескольких или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше.

В одном варианте осуществления набор согласно этому изобретению может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации ампликонов из внутренней части одной или нескольких или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и), определенными выше.

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной и предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)ч) выше.

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной и предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)ч), о), ρ), с|) и ί) выше.

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной и предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-с) выше, и одной, более чем одной или предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί) выше.

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-с), о), ρ), с|). ί) выше, и одной, более чем одной или предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами ά)-ί) выше.

Кроме того, этот набор может также содержать праймеры или пары праймеров для амплификации характерной для растений последовательности, как описано в другом месте в этом описании.

Должно быть понятно, что праймеры и пары праймеров для амплификации различных нуклеиновых кислот, описанных здесь, могут быть включены в различным образом спроектированные наборы, в соответствии с предпочтением в отношении того, какие независимые трансформанты желательно детектировать.

В одном предпочтительном варианте осуществления с учетом различных выборов нуклеиновых кислот, подлежащих амплификации, как было определено в предыдущих абзацах, этот набор может содержать один или несколько праймеров или все праймеры, предпочтительно одну, более чем одну или все пары праймеров, определенные в любой из табл. 1 или 4, или их варианты или производные.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления один или оба из пары любых праймеров, включенных в этот набор, могут быть мечеными.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления любая пара праймеров, включенная в этот набор, может содержать по меньшей мере один, и обычно один праймер, меченный подходящим флуорофором и сконструированный для возможности детектирования в реальном времени с использованием вышеописанной системы детектирования ^υX™.

В одном дополнительном варианте осуществления этот набор содержит также продукты амплифи- 35 024233 кации, например, клонированные и повторно выделенные и, возможно, содержащиеся в подходящих плазмидах и векторах, которые могут быть использованы в качестве положительных контролей и/или калибраторов в способах этого изобретения, как объяснено выше. Например, для таких целей могут быть обеспечены точно измеренные количества или разведения таких продуктов амплификации, например, клонированных и повторно выделенных и, возможно, содержащихся в подходящих плазмидах или векторах. Как объяснялось выше, могут также ожидаться различные комбинации таких реагентов.

В одном конкретном варианте осуществления этот набор может содержать один, более одного или все организмы Е. сой, перечисленные в табл. 5, и/или плазмиды, получаемые из них, и/или выделенные вставки, предпочтительно вставки ЕсоК1, указанных плазмид, или их комбинации.

В одном дополнительном варианте осуществления, как уже объяснялось, этот набор может также содержать носитель данных, содержащий инструкции для программируемого вычислительного устройства для выполнения действий стадии (2) способов этого изобретения.

Понятно, что такие наборы могут содержать дополнительные компоненты, такие как компоненты, применимые для гибридизации, ПЦР, детектирования и т.д. Квалифицированному специалисту будет понятно потенциальное применение таких компонентов.

В предпочтительном варианте осуществления этот набор может содержать один или несколько реакционных компартментов, например реакционных компартментов, обеспеченных многолуночной полоской или планшетом (многолуночного формата), причем каждый компартмент содержит композицию всех компонентов, необходимых для реакции ПЦР-амплификации (например, нуклеотидов, солей, термостабильной полимеразы и т.д.) и включает в себя желаемые одну или несколько (в случае множества независимых трансформантов) пар праймеров, определенных выше, но не содержит ДНК-матрицы. Таким образом, реакция ПЦР может начинаться, как только пользователь вводит ДНК анализируемого образца в указанную композицию. Необязательно, для гарантии стабильности, полимераза Тад или другая термостабильная полимераза может быть также исключена из этой композиции (но может быть отдельно включена в этот набор), и может быть необходимо добавление ее пользователем. Обычно эта композиция может быть жидкой, хотя, в частности, для транспортировки и хранения, она может быть заморожена. Однако предусматриваются также лиофилизированные композиции.

Примеры

Пример 1. Условия амплификации для выбранных пар праймеров, перечисленных в табл. 1 и 4.

ПЦР-детектирование в реальном времени с применением §УВК Огееи оптимизировали для амплификации ампликонов из нуклеиновых кислот р35§, ίΝΟδ, Сгу1АЪ, РАТ/Ваг, РАТ/ра1 и СР4ЕР8Р8 с использованием соответствующих пар праймеров, перечисленных в табл. 1 и 4.

ДНК выделяли из независимых трансформантов, содержащих (положительный контроль) или не содержащих (отрицательный контроль) эти нуклеиновые кислоты, в том числе из независимых трансформантов В111, В1176, ΜΟΝ810, ΜΟΝ40-3-2, ТС1507, ΝΚ603, М88/КР3 (см. табл. 5), с использованием СТАВ-выделения из материала тканей листьев.

ПЦР-реакции содержали §УВК Огееи РСК Ма§1ег Μίχ (О|адепойе, ге£: 0М0-082Х-А300) 1х, прямой праймер 250 нМ, обратный праймер 250 нМ, матричную ДНК 50 нг в общем объеме 20 мкл. Схема циклов ПЦР включала в себя Стадию 1: 1х[50°С, 120 с]; Стадию 2: 1х[95°С, 600 с] и Стадию 3: 40х[95°С, 15 с, 60°С, 60 с] с получением флуоресценции. Использовали АррйеД ВюууЧепъ Ргып 7700. Анализ с использованием кривой плавления выполняли при градиенте от 50 до 95°С на протяжении 1200 с.

Для всех пар праймеров, получали специфические продукты амплификации, как показано единственной специфической Т_т и единственной полосой при электрофорезе на агарозном геле. Эти анализы имели низкие ЬОИ:

КВСЬ: праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 26 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 27; Т_т = 76,5°С; размер = 95 п.н.; ЬОИ = ± 0,039 нг ДНК-мишени

ΛΌΗ 2еа тау8 (более длинный ампликон): праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 1 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 2; Т_т = 79,5°С; размер = 138 п.н.; ΤΟΌ = ± 0,016 нг ДНК-мишени (± 6 гаплоидных геномов)

АЭН 2еа тау8 (более короткий ампликон): праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 56 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 57; Т_т = 75,5°С; размер = 83 п.н.; ΤΟΌ = ± 0,016 нг ДНК-мишени (± 6 гаплоидных геномов)

АСС масличного рапса: праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 79 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 3; Т_т = 79°С; размер =103 п.н.; ΤΟΌ = ± 0,05 нг ДНК-мишени (± 20 гаплоидных геномов)

Круциферин масличного рапса: праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 24 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 25; Т_т = 80°С; размер = 85 п.н.; ΤΟΌ = ± 0,015 нг ДНК-мишени (± 12 гаплоидных геномов)

Лектин сои (более длинный ампликон): праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 5 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 49; Т_т = 81,5°С; размер = 178 п.н.; ΤΟΌ = ± 0,016 нг ДНК-мишени (± 13 гаплоидных геномов)

Соя (лектин): праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 58 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 59; Т_т = 79,5°С; размер = 81 п.н.; ΤΟΌ = ± 0,063 нг ДНК-мишени (± 50 гаплоидных геномов)

РЬИ риса: праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 20 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 21; Т_т = 76,5°С; размер = 80 п.н.; ΤΟΌ = ± 0,01 нг ДНК-мишени (± 20 гаплоидных геномов)

О1иА3 сахарной свеклы: праймеры §ЕЦ ГО ΝΟ: 64 и §ЕЦ ГО ΝΟ: 65; Т_т = 77°С; размер =118 п.н.;

- 36 024233

ЬОО = ± 0,01 нг ДНК-мишени (± 13 гаплоидных геномов)

8АН7 хлопчатника: праймеры 8ЕЦ ГО N0: 66 и 8ЕЦ ГО N0: 67; Т_т = 75,5°С; размер =115 п.н.; БОЭ = ± 0,02 нг ДНК-мишени (± 9 гаплоидных геномов) иОР-аза картофеля: праймеры 8ЕЦ ГО N0: 68 и 8ЕЦ ГО N0: 69; Т_т = 81°С; размер = 87 п.н.; ЬОО = ± 0,0002 нг ДНК-мишени р358 (более длинный ампликон): праймеры 8ЕЦ ГО N0: 7 и 8ЕЦ ГО N0: 8; Т_т = 80,5°С; размер = 147 п.н.; Б0Э = ± 0,016 нг ДНК-мишени (± 6 гаплоидных геномов) р358 (более короткий ампликон): праймеры 8ЕЦ ГО N0: 60 и 8ЕЦ ГО N0: 61; Т_т = 76°С; размер = 75 п.н.; Ь0О = КК8 100% ± 0,032 нг ДНК-мишени (± 25 гаплоидных геномов); МК603 5% ± 6,25 ДНКмишени (± 62,5 гаплоидных генома)

Ш08-Ь: праймеры 8ЕЦ ГО N0: 28 и 8ЕЦ ГО N0: 29; Т_т = 72°С; размер = 172 п.н.; Ь0О = ± 0,03 нг ДНК-мишени (± 25 гаплоидных геномов)

Ш08ГО: праймеры 8ЕЦ ГО N0: 9 и 8ЕЦ ГО N0: 10; Т_т = 72°С; размер = 69 п.н.; Ь0О = ± 0,03 нг ДНК-мишени (± 20 гаплоидных геномов)

Сгу1АЬ: праймеры 8ЕЦ ГО N0: 11 и 8ЕЦ ГО N0: 12; Т_т = 78,5°С; размер = 73 п.н.; Ь0О = ± 0,06 нг ДНК-мишени (±12 гаплоидных геномов)

РАТ/Ваг: праймеры 8ЕЦ ГО N0: 13 и 8ЕЦ ГО N0: 14; Т_т = 80°С; размер = 69 п.н.; Ь0О = ± 0,125 нг ДНК-мишени (± 50 гаплоидных геномов)

РАТ/раГ праймеры 8ЕЦ ГО N0: 15 и 8ЕЦ ГО N0: 16; Т_т = 77°С; размер = 109 п.н.; Ь0О = ± 0,03 нг ДНК-мишени (±12 гаплоидных геномов)

СР4-ЕР8Р: праймеры 8ЕО ГО N0: 22, 8ЕО ГО N0: 62 и 8ЕО ГО N0: 63; Т_т = 80,5 или 84,5°С; размер = 108 п.н.; Ь0О = ЫК603 5% ± 3,12505 нг (± 31 гаплоидный геном), РК8 100% ± 0,032 нг (±25 гаплоидных геномов), ОТ73 100% ±0,016 нг (±12 гаплоидных геномов)

СР4-ЕР8Р: праймеры 8ЕГ) ГО N0: 17, 8ЕГ) ГО N0: 18 и 8ЕГ) ГО N0: 19; Т_т = 85°С; размеры = 94 п.н. или 124 п.н.; Ь0О = ± 0,03 нг (± 25 гаплоидных геномов).

Пример 2. Примерный упрощенный способ в соответствии с этим изобретением.

Гипотетический образец готовили добавлением ДНК В(176 к неродственному ДНК-носителю. Этот образец подвергали скринингу на присутствие или отсутствие р358, (N08, Сгу1АЬ, РАТ/Ваг, РАТ/раГ и СР4-ЕР8Р8 с использованием ПЦР-способов в реальном времени примера 1.

Этот упрощенный способ предназначен для заключения о потенциальном присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего из В(176, ВИ 1 и МК603.

После тестирования, этот образец является положительным в отношении р358, Сгу1АЬ и РаРВат, но не в отношении других тестированных нуклеиновых кислот. Таким образом, этот образец может быть представлен как набор О_8АМ е {р358; Сгу1АЬ; РаРЬат}. В этом примерном анализе (где не испытывали присутствие нуклеиновых кислот 2еа тауз), независимый трансформант В(176 представлен набором О_В1176 е {р358; Сгу1АЬ; РаРЬат}, независимый трансформант В(11- набором О_В11 е {р358; (N08; Сгу1АЬ; РаРраЦ и независимый трансформант МК603 - набором О_Ж603 е {р358; (N08; СР4-ЕР8Р}.

Таким образом, поскольку О_ВЯ76 = О_8АМ, материал из независимого трансформанта В(176 может присутствовать в этом образце. С другой стороны, поскольку О_В11 О_8АМ и О_В11 <£ О_8АМ, материал из независимого трансформанта В(11 не присутствует в этом образце. Подобным образом, поскольку О_Ж603 О_8АМ и О_Ж603 О_8АМ, материал из независимого трансформанта МК603 не присутствует в этом образце.

В альтернативном представлении, р358, (N08, Сгу1АЬ, РАТ/Ваг, РАТ/раГ и СР4-ЕР8Р8 имеют приписанные им соответствующие простые числа У_р358 = 3, ^N08= 5, У_Сгу1АЬ = 7, У_{РАТ/Ьаг} = 11, ^УРАТ/ра₃ = ^{13 и У}СР4-ЕР8Р8 = ¹⁷.

Таким образом, набору О_8АМ приписана величина УО_8АМ, являющаяся множеством соответствующих величин, приписанных нуклеиновым кислотам, детектируемым в нем, т.е., УО_8АМ=У_р35₈хУ_Сгу1_АЬхУ_РАт_/Ьаг=231. Кроме того, набору О_В1176 приписана величина УО_ВЯ76, являющаяся кратным величин, приписанных тем из тестированных нуклеиновых кислот, которые обнаруживаются в событии В(176, т.е., УО_ВЯ76 = У_1р35зх У_Сгу1_АЬхРАТ/Ваг = 231. Аналогично, набору О_ВШ приписана величина УОВИ1=Ур358* У(М08хУСгу1АЬхУРАТ/ра₃ = 1365; и набору О_Ж603 приписана величина УО_Ж603 = ^Ур358^хУМ08^хУСР4-ЕР8Р = ²⁵⁵.

Таким образом, поскольку УО_8АМ/УО_ВЯ76 = 1, материал из независимого трансформанта В(176 может присутствовать в этом образце. С другой стороны, поскольку УО_8АМ/УО_Вщ = 0,169, т.е. не является единицей и не является целым числом, большим, чем 1, материал из независимого трансформанта В(11 не присутствует в этом образце. Подобным образом, поскольку УО_8АМ/УО_Ж603 = 0,906, т.е. не является 1 и не является целым числом, большим, чем 1, материал из независимого трансформанта МК603 не присутствует в этом образце.

Пример 3. Примерное описание набора по этому изобретению (формат 96-луночного планшета).

Подлежащие скринингу нуклеиновые кислоты: 2т, Вп, От, р358, (N08, СР4-ЕР8Р8, Сгу1АЬ, РАТ/Ьаг, РАТ/раГ, определенные выше с использованием пар праймеров, определенных в

- 37 024233 табл. 1 выше, а также общий ген растений амплифицировали с использованием пары праймеров §ЕЦ ГО N0: 26 и 27 (табл. 4). Необязательно, например, по запросу, этот набор может также включать в себя маркеры таксона для риса (Ог), хлопчатника (Ск), сахарной свеклы (Βν) и/или картофеля (δ!), с использованием пар праймеров, определенных в табл. 1.

Рабочие условия для способов количественного ПЦР с использованием δΥΒК Сгееп.

Реагенты: Смесь δΥΒК Сгееп РСК Мак!ег Μί\, включающая в себя Тац-роКтегаке Ηδ; праймеры 20 мкМ; не содержащую нуклеаз воду.

Оборудование: система детектирования последовательности ΑΒΙ ΡΡΙδΜ® 7700, Система ПЦР в реальном времени 7300, ламинарный бокс, пипетки 20, 200 и 1000 мкл, стерильные, устойчивые к аэрозолю наконечники, оптические 96-луночные реакционные планшеты, оптические крышки.

Протокол: ПЦР проводят в системе детектирования последовательностей ΑΒΙ ΡΡΙδΜ 7700 или в системе ПЦР в реальном времени 7300 в соответствии с инструкциями изготовителя. Используют одну общую программу.

Приготовление ПЦР-смеси: Эта ПЦР-смесь содержит все компоненты реакции ПЦР, за исключением ДНК-матрицы. Эту операцию проводят в ламинарном боксе, который используется только для операций этого типа.

Таблица 6. Реакционная смесь для Ц-РСК-скрининга

Получение ДНК: Матричную ДНК экстрагируют с использованием стандартного способа экстракции ДНК СТАВ, и концентрацию ДНК измеряют по определению флуоресценции РюоСгееи.

Подготовка к проведению ПЦР: Подготовку к проведению ПЦР проводят в ламинарном боксе. ДНК-матрицы и смесь для ПЦР объединяют в других помещениях.

Проведение ПЦР: ПЦР должна проводиться в соответствии с инструкциями изготовителя, как описано в Руководстве пользователя.

Условия термоциклера перечислены ниже в табл. 7.

Таблица 7. Условия работы термоциклера

Стадия	Ступень	т°с	Время (сек)	Обнаружение	Циклы
	УНГ	50°С	120”	нет	1х
2	Активация Тац	95°С	600”	нет	1х
3	Амплификация Денатурация Отжиг и удлинение	95°С 60°С	15” 60”	нет измерение	40х
4	Плавление	50°С Ю 95°С	1200	измерение	1х

Затем выполняли анализ кривой плавления с использованием стандартной программы (например, постепенного плавления от 50 до 95°С и мониторинга уменьшения флуоресценции).

Схема ГМО-скрининга на 96-луночном планшете для пищевых/кормовых продуктов.

Ниже описана схема, включающая в себя все обычные пищевые/кормовые маркеры, маркер риса (детектирование несанкционированных независимых трансформантов риса) и маркер обратной транскриптазы САМУ (отсутствие контроля СаМУ).

Схема 96-луночного планшета:

Расте- ние	От	Ζηι	Вп	Ог	р35$	ΙΝοδ	СР4	Сгу1АЬ	РАТ/ра1	РАТ/Ьаг	ОКТ
+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
	-		-		-	•			-	-
ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ	ΝΤΟ
Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А
Образец 1 В	Образец 1 В	Образец I В	Образец 1 б	Образец I В	Образец 1 В	Образец I В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец I В	Образец 1 В	Образец 1 В
Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2А	Образец 2А	Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2А	Образец 2 А	Образец 2 А
Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2 В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В

Положительными контролями (+) могли бы быть соответствующие ампликоны (плазмиды и вставки), описанные здесь, в частности, в табл. 5, ампликоны при определенном числе копий (например, 100 копий на одну лунку).

Технически должно быть предусмотрено, что лунки с образцами могут открываться последовательно (например, сначала положительные контроли, затем образцы и в последнюю очередь NТС и отрицательные контроли).

С-величины и Т_т-величины для каждой лунки регистрируют и используют в анализе принятия решения для определения СМ-набора, присутствующего в соответствующих образцах.

Обратите внимание на то, что, в принципе, каждый ряд мог бы быть получен по отдельности в аль- 38 024233 тернативной схеме (посредством чего достигается увеличенная эксплуатационная гибкость для потребителя).

Пример 4. Мультиплексная ПЦР р358, (N08.

Данный пример показывает примерную мультиплексную (множественную) ПЦР-амплификацию ампликонов р358 и (N08, в которой детектирование выполняют при помощи 8УВР Сгееп и продукты амплификации различают на основе различий в их температурах плавления (Тт).

Использованные праймеры (20 мкМ): р358:8Ер Ιϋ N0:60 и 61 (N08: 8Ες Ιϋ N0: 9 и 10

Матрица (50 нг): Устойчивая к Раундап соя (Роипбир Реабу 8оуЬеап (РР8)) 100% (двойной положительный контроль)

Программа ПЦР: 95°С 10', (95°С 15, 60°С 1')х40 циклов

Программа плавления: 50-95°С в течение 20'

Мультиплексность ПЦР-способов в отношении р358 и (N08 в 8УВР Сгееп возможна, так как оба ампликона являются различаемыми благодаря разной Тт в этом способе (см. фиг. 2). Таким образом, можно получить информацию с использованием одной ПЦР о присутствии двух различных мишеней, которыми являются р358 и (N08.

Пример 5. Дополнительные возможности мультиплексности при использовании 8УВР Сгееп.

Эксперименты, аналогичные экспериментам примера 4, дополнительно определяли возможность следующих мультиплексных комбинаций:

1. Абй-1 кукурузы (8Ες Ιϋ N0: 56 и 57) с 8ΕΪΜ сои (8Ες Ιϋ N0: 58 и 59)

2. Абй-1 кукурузы (8Ер Ιϋ N0: 56 и 57) с круциферином масличного рапса (8Ер Ιϋ N0: 24 и 25)

3. 8^Μ сои (8Ες Ιϋ N0: 58 и 59) с 8ай-7 хлопчатника (8Ες Ιϋ N0: 66 и 67)

4. 8ай-7 хлопчатника (8Ер Ιϋ N0: 66 и 67) с круциферином масличного рапса (8Ер Ιϋ N0: 24 и 25)

Пример 6. Параметры ПЦР в реальном времени с использованием праймеров этого изобретения.

Реакции, использующие условия и праймеры, определенные в примере 1, выполняли на определенной копийности ссылочных плазмид, содержащих соответствующие вставки ампликонов, и определяли относительную флуоресценцию (РТИ) после 40 циклов (т.е. приближающуюся к плато или достигшую плато). Результаты в табл. 8 (результаты, использующие +/- 8300 копий матрицы, изображены также графически на фиг. 3) показывают, что данные способы и праймеры способны генерировать величины РТИ при плат, по меньшей мере 2500, которые лежат в рамках 3-кратного предела.

Таблица 8

	Мишень ПЦР (использованные праймеры: 3Εζ)ΙβΝ0: прямой + обратный)	Плазменная матрица	Средняя ΚΡϋ 40 циклов с 1000 копий плазмид в качестве матрицы	Средняя КРи после 40 циклов с +/- 8300 копий плазмид в качестве матрицы	Размер ампликона
1	КЬсЬ (26 + 27)	КЬсЬ О8К АГ	2581,58	4369,51	95
2	ΑΌΗ более длинный (1+2)	ΑΌΗ длинный	4248,58	5447,4	135
3	ΑΌΗ более короткий (56 + 57)	ΑΌΗ ай	2434,16	4210,28	84
4	Лектин более длинный (5 + 49)	Ьес Ьоп§	3854,97	5969,65	178
5	Ьесйп δίΤΜ (58 + 59)	8ЬТМ	5943,98	6713,95	74
6	Сги770 (24 + 25)	Сги770	4614,59	6768,95	85
7	р358 более длинный (7 + 8)	р358 1оп§	3490,22	4792,49	147
8	р353 более короткий (60+61)	р353 «ЬогГ	3963,27	6173,37	75
9	ΙΝΟ5-Ό (9+10)	ίΝΟδ-Ό	2339,11	3731,95	69
10	СгуГАЬ (11 + 12)	Сгу1АЬ ВП 1	4299,47	6973,77	73
11	Сгу1АЬ (11 +12)	Сгу1АЬ ΜΟΝ810	3957,05	6759,2	73
12	Сгу1АЬ (11 + 12)	Сгу1АЬ ВП 1 и Сгу1АЬ ΜΘΝ810	4028,97	6641,04	73
13	СР4 (22 + 62 + 63)	СР4-ККЗ	3235,24	5098,82	108
14	СР4 (22 + 62 + 63)	СР4-ОТ73	2641,86	4968,28	108
15	СР4 (22 + 62 + 63)	СР4-ККЗ и СР4СТ73	3157,24	5034,91	108
16	Ра(-Ра( (15 + 16)	Ра(-Ра(	2299,71	4875,61	109
17	Раг-Ваг (13 + 14)	Раг-Ваг	4839,79	7370,7	69
		Среднее:	3642,93	5641,17
		Стандартное отклонение:	1011,93	1106,76
		Медиана:	3854,97	5447,40
		Минимум:	2299,71	3731,95
		Максимум:	5943,98	7370,7

- 39 024233

Список последовательностей <110> ЗстепТтСтс ШзТтТиТе οί РиЫтс НеаТтК (ΙΡΗ) <120> тгапэдептс р1апт еуепт йетесттоп <1зо> 1рн-оо1-рст <140> РСТ/ЕР2008/051059 <141> 2008-01-29 <150> ЕР 07447008.9 <151> 2007-01-29 <15 0> ЕР 07108343.0 <151> 2007-05-16 <160> 79 <170> Ратепип уегзтоп 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> ϋΝΑ <213> АгТтТтста1 Зедиепсе <22О>

<223> ргттег: геа Мауз (айК-1) <400> 1 сдТсдТТТсс саТсТсТТсс Тсс 23 <210> 2 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> ΑΓΐιίισίβΙ зедиепсе <220>

<223> ргттег: геа мау 5 (айН-1) <400> 2 ссасТссдад асссТсадтс 20 <210> 3 <211> 15 <212> ϋΝΑ <213> АгТтРтста! Зедиепсе <220>

<223> ргттег: Вгаззтса париэ (АСС) <400> 3 ддсдсадсаТ сддсТ 15 <210> 4 <211> 22 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓΐτίτετβΙ зедиепсе <220>

<223> ргттег: вгазтсса париэ (АСС) <400> 4 дадаатдадд аддассаадс тс 22

- 40 024233 <210> 5 <211> 22 <212> ΡΝΑ <213> АгЛЛста! Бедиепсе <220>

<223> ргтгаег: йТустпе шах (ТесЛп) <400> 5 саххассхаг дахдссгсса сс 22 <210> 6 <211> 18 <212> ΟΝΑ <213> АгП'Лс1а1 Бедиепсе <220>

<223> рп'тег: б!ус1пе шах (Тесхтп) <400> 6 аадсасдхса хдсдаххс <210> 7 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> АггИтстаТ Бедиепсе <220>

<223> рп'тег: 355 рготохег οί Саи Ή Л оме г мозатс У1гиз <400> 7 дасадхддхс ссааадахдд 20 <210> 8 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> АгХтЛста! Бечиепсе <220>

<223> ргтшег: 355 рготогег οί СаиНЛомег мозатс Утгиз <400> 8 дхсххдсдаа ддахадхддд <210> 9 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> АгЛЛс1а1 Бедиепсе <220>

<223> рп'тег: 3' хеггт'пахог οί ΐήβ АдгоЬасхен'ит хитеГаслепз пораНпе зупхКехазе депе (ΤΝΟ5-Ρ) <400> 9 даХХададХс ссдсааХХаХ асаХХХаа <210> 10 <211> 25 <212> ϋΝΑ <213> АгЛЛоа! Бедиепсе

- 41 024233 <220>

<223> рптег: 3' тегпппатог οί гНе АдгоЬасГепит ГитеШстепБ пораНпе 5упкЬе1азе депе <400> 10 «агссгадк гтдсдсдсеа ±а«± 25 <210> 11 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓΐι'ίι ста! зециепсе <220>

<223> рптег: Сгу1АЬ οί ВастПи5 сНиппдтепзтз <400> 11 ассддТ1аса сГсссаТсда 20 <210> 12 <211> 19 <212> ϋΝΑ <213> АгсИтста! 5еяиепсе <220>

<223> рптег: сгу1АЬ οί вастПиз т1гигтпдтеп5Т5 <400> 12 садсасстдд сасдаасгс 19 <210> 13 <211> 23 <212> ϋΝΑ <213> АггтТтста1 Беяиепсе <220>

<223> рптег: рНозрНтпоТНпстп асесу1тгапз€егазе (РАТ) депе 51гер1отусез Кудгозсортсиз <400> 13 сдгсаассас гасагсдада саа	Ьаг	οί	23
<210> 14 <211> 19 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓϊι'ίισίβΙ Зеяиепсе <22О> <223> рптег: рНозрНтпоТНпстп 3€βΐγ1ΐΓ3η5ίβΓΗ5θ (РАТ) депе	Ьаг	οί
51герТотусез Нудгозсор1сиз <400> 14 дгссассссг дсддпссг <210> 15 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> АгстЛс1а! 5едиепсе <220> <223> рптег: рКозрИтпоеКпстп Η0θίν1ΐΓ3η5ίβΓ33β (РАТ) депе	раТ	οί	19

5Сгер1отусез ντ пбосНготодепез <400> 15

- 42 024233 есдсддСССд СдаСаСсдСС 20 <210> 16 <211> 25 <212> ΡΝΑ <213> ΑгсίΓίста1 зециепсе <220>

<22 3> ргттег: рЬозрНтпосНгтстп асеСуЗегапз'Регазе (рат) депе рас о£ 5СгерСотусез ντ гтбосЬготодепез <400> 16

СсССдсаасс СсСсСадаСс ассаа 25 <210> 17 <211> 25 <212> 0ΝΑ <213> АгСтСтста! Зециепсе <220>

<223> ргттег: 5-Епо!-ругиуу1зКткттаСе-3-р1го5рЬасе зупсКазе ЕР5Р5 депе Сгот АдгоЬасСегтит зр. СР4 <400> 17 ддсСсСдадс ССсдСссСсс Саадд 25 <210> 18 <211> 21 <212> ϋΝΑ <213> АгСтСтста1 Зециепсе <220>

<223> ргттег: 5-Епо!-ругиуу!5(пкттасе-3-рЬо5рНасе зупсКазе ЕР5Р5 депе Сгот АдгоЬасСегтит зр. СР4 <400> 18 аСсадСддсС асадссСдса ΐ 21 <210> 19 <211> 22 <212> ΡΝΑ <213> АгСт'Гтста1 Зециепсе <220>

<223> ргттег: 5-Епо1-ругиуу!зЬткттасе-3-р1то5рЬасе зупсКазе ЕР5Р5 депе Ггот АдгоЬасСегтит зр. СР4 <400> 19 дааСдсддас ддССссддаа ад 22 <210> 20 <211> 25 <212> ΡΝΑ <213> Агп'-Ртста! Зециепсе <22О>

<22 3> ргттег: огуга застуа <400> 20 дсссадддаа садддаадСа аадСС 25 <210> 21

- 43 024233 <211> 23 <212> ΡΝΑ <213> АГП'Ттста1 зециепсе <220>

<223> ргттег: Огуга заХтуа <400> 21 сххадсахад гсхдхдссах сса 23 <210> 22 <211> 18 <212> ϋΝΑ <213> АгХт6тста1 5едиепсе <22О>

<223> ргттег: 5-Епо1-ругиуу1зКткттахе-3-рНозр1таХе зупхНазе ЕР5Р5 депе Тгот АдгоЬасХегтит зр. СР4 <400> 22 дсаХдсХХса сддХдсаа 18

<210>	23
<211>	24
<212>	ϋΝΑ
<213>	АгхтЯста! зедиепсе
<220>
<223>	ргттег: 5-Епо1-ругиуу15НткттаХе-3-рКо5р1таХе зупхКазе ЕР5Р5 депе ΐΓΟιη АдгоЬасхегтиш зр. СР4

<400> 23 ддассхдхдд дадахадасх хдхс 24

<210>	24
<211>	22
<212>	ΡΝΑ
<213>	АгхтЯста! зедиепсе
<22О>
<223>	ргттег: Вгаззтса париз (сгистТегти)

<400> 24 садсхсааса дхххссааас да 22

<210>	25
<211>	20
<212>	ΡΝΑ
<213>	АгхтТтста! зециепсе
<22О> <223>	ргттег: вгаззтса париз СсгистТегтп)
<400>	25

сдассадссх садссххаад <210> 26 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> агхт Я ст а! зедиепсе <220>

<223> ргттег: депегтс рТапх («Ье!)

- 44 024233

<400>	26
аддХсХаабд дгХаадсХас	20
<210>	27
<211>	20
<212>	ϋΝΑ
<213>	АгХтб1С1а1 Бедиепсе
<220>
<223>	рптег: депегтс р1апх (кЬс!)
<400>	27
адусххдахс дххасааадд	20
<210>	28
<211>	23
<212>	ϋΝΑ
<213>	Αηΐι6ιοΪ3ΐ Бедиепсе
<220>
<223>	рптег: 3' ХеггглпаХог об хКе АдгоЬасХепит хитебаспепз	пораНпе
	зупхПехазе депе (ΤΝ05-ί)
<400>	28

сдхгсаааса хххддсааха аад 23 <210> 29 <211> 26 <212> ϋΝΑ <213> Агхт£1ста1 Бедиепсе <220>

<223> рптег: 3' хегштпахог о£ Хйе АдгоЬасхеп'иш хише£ас1епз пораНпе зупхКеХазе депе (ΤΝ05-Ι.) <400> 29 ааахдХаХаа ХХдсдддасХ сХааХс 26 <210> 30 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> АгХт^тста! Бедиепсе <220>

<223> ргтшег: Сгу1АЬ об ВастПиз хЬигтпдтепзтз <400> 30 дасахсахсх ддддуахсхх 20 <210> 31 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> лгхтбтста! Бедиепсе <220>

<223> рптег: Сгу1лЬ об ВастПиз хНип’пдтепзтз <400> 31 дсдсхдххса хдхсдххдаа 20 <210> 32

- 45 024233 <211> 166 <212> ϋΝΑ <213> АгХтГтста! зедиепсе <220>

<223> АтрИсоп оГ нт геа мауз <400> 32 дааххсдадс хсддхасссд дддхахссдх сдхххсссат схсххссхсс хххадхадсх 60 ассасхахах ааахсадддс ХсаХХХХсХс дсХссхсаса ддсХсаХсХс дсхххддахс 120 даххддхххс дхаасхддхд адддасхдад ддхсхсддад хдддхс 166 <210> 33 <211> 216 <212> ΡΝΑ <213> АгхтГтста! гедиепсе <220>

<223> АтрТтсоп оГ ИТ сТустпе гаах <400> 33 дааххдсдсс сххсаххасс хахдахдссх ссассаассх сххдхдххдс ххсхххддхх 60 сахссххсдс ададаадсад схахахссхс ХссддаХдХд дхсдахххда адасххсхсх 120 хсссдадххд дддддххдад дахаддддхх схсдхдсдхд ссасдхддда схсдасахад 180 ссхддддаах сдсаХдасдх дсххаадддс дааххс 216

<210>	34
<211>	179
<212>	ϋΝΑ
<213>	АгНЯа'а! Беяиепсе
<220> <223>	АтрЪсоп оГ ВТ 11 геа тауз, атр1 ϊΓΐей изтпд рптегз Ггот 355 рготохег оГ саиЪ'Ломег мозахс Утгиз
<400>	34

дсхсдааххс дсссххдаса дхддхсссаа адахддассс ссасссасда ддаасахсдх 60 ддаадаадаа дасдххссаа ссасдхсххс ааадсаадхд даххдахдхд ахахсхссас 120 ХдасдХаадд даХдасдсас аахсссасха хссххсдсаа дасаадддсд ааххсдхаа 179 <210> 35 <211> 100 <212> ϋΝΑ <213> АгХтПста! Бедиепсе <220>

<223> АтрСсоп оГ 40-3-2 сЗусапе шах, атрИГлей изтпд ргттегз Ггот 3' хегттпахог оГ хКе АдгоЬасХегтит хитеГаспепв пораппе зупхЬехаэе депе <400> 35 дсхсдааххс дсссхххахс схаддххдсд сдсхахаххх хдххххсхах сдсдхаххаа 60 ахдхахаахх дсдддасхсх аахсаадддс дааххсдхаа 100 <210> 36 <211> 98

- 46 024233 <212> ϋΝΑ <213> АгЛЛс1а1 Зедиепсе <22О>

<223> АтрЛсоп οί ΜΟΝ 810 геа Мауэ, атрЛЛей изтпд ргттегз Лот Сгу1лЬ οί васШиз тКиг1пдтеп515 <400> 36 дсхсдаалс дсссбгасдс сгсссгддгд сааатсдадс адс1са1саа ссададдатс 60 даддадпсд ссаддаасса ддаадддсда аИсдТаа 98 <210> 37 <211> 105 <212> ϋΝΑ <213> Агп'Лс4а1 зедиепсе <22О>

<223> АтрЛсоп οί Βΐ176 геа Мауз, атрЛЛей из1пд рЛтегз Лот сгу1АЬ οί ВастНиз тНигтпдтепзтз <400> 37 дсТсдааИс дссснассд днасастсс сабсдасагс нссГИссс ТсасдсадИ 60 сстдстсадс даднсдтдс саддгдсгда адддсдаатс сдсаа 105 <210> 38 <211> 105 <212> ΟΝΑ <213> АгЛЛс1а1 Бедиепсе <220>

<223> АтрЛсоп οί Βΐΐΐ геа Мауз, атрЛ'Лей изч'пд ргттегз ίτοη» Сгу1лЬ οί ВастНиз гНиипдтепзтз <400> 38 дсГсдааГТс дсссНсадс ассгддсасд аасгсдсгда дсадааасГд гдгсааддас 60 ааддадасд! сдабдддад! дгаассддга адддсдаан сдгаа 105 <210> 39 <211> 101 <212> ϋΝΑ <213> АгЛ Л οί а1 Зедиепсе <220>

<223> АтрЛсоп οί ΒΤ176 геа мау5, атрЛЛей и51пд рп'тегБ Лот ρΙιοΒρΙιιηοΐΙΐΓίοιπ асеΐу^ΐгаη5ίега5е (РАТ) депе Ьаг οί зггерготусез пудгозсортсиз <400> 39 дсгсдааггс дсссИсдГс аассасгаса Тсдадасаад сасддТсаас Нссдгассд 60 адссдсадда ассдсаддад гддасааддд сдааГГсдХа а 101 <210> 40 <211> 140 <212> ϋΝΑ <213> АгЛЛс1а1 зедиепсе <220>

<223> АтрЛсоп οί ВТ11 геа Мау5, атрЛЛей из1пд ргттегз Лот рНозрМ погЬгл ст п асеΐу1ΐгаη5ίега5е (РАТ) депе раг οί 5ТгерЮтусе5 νί п'йосНготодепез

- 47 024233

<400> 40 дсгсдааггс дсссггссдс ддгггдгдаг аГсдГГаасс аггасаггда дасдгсгаса	60 120 140
дгдаасггга ддасададсс асааасасса саададгдда саадаадддс дааггсдгаа	ГГдагдаГсГ адададдггд
<210> 41 <211> 127 <212> ϋΝΑ <213> АгГтГзста! Зедиепсе <220>
<223> АтрНсоп оГ ВТ11 геа Мауз, атрПГтей р1апГ (КЬс!) <400> 41	изтпд ргттегз Ггот депегтс

дсгсдааггс дсссггаддг сгааддддга адсгасагаа садагагагг дагсгдддгс 60 сссаддаасд ддсгсдагдг дагадсагсд ГссГГГдГаа сдагсааддс Гаадддсдаа 120 ГГсдГаа 127 <210> 42 <211> 127 <212> ΟΝΑ <213> αγπΎιοηΊ эедиепсе <22О>

<223> АтрНсоп оГ озк иг, атрНГтей изтпд ргттегз Ггот депеглс рТапг (кЬс!) <400> 42 дсгсдааггс дсссггаддг сгааддддга адсгасагас дсаагааагг дадгггсггс 60 гссгддаасд ддсгсдагдг ддгадсагсд гссгггдгаа сдагеааддс Гаадддсдаа 120

ГГсдГаа 127 <210> 43 <211> 205 <212> ϋΝΑ <213> Агп’Гтста! зедиепсе <22О>

<223> АтрНсоп оГ вт11 геа мауз, атрНГтес! изтпд рп'тегз Ггот 3’

ГегттпаГог оГ гНе АдгоЬасГепит ГитеГастепз пораНпе зупгпегазе депе <400> 43 дсгсдааггс дсссдггааа гдгагааггд сдддасгсга агсагааааа сссагсгсаг 60 ааагаасдгс агдсаггаса гдггааггаг гасагдсгга асдгааггса асадааагга 120 гаГдаГааГс аГсдсаадас сддсаасадд аГГсааГсГГ аадааасГГГ аГГдссаааГ 180 дгггдаасда адддсдаагг сдгаа 205 <210> 44 <211> 228 <212> ΟΝΑ <213> АгГтГтста! зедиепсе

- 48 024233 <220>

<223> Агарисоп οί вгаззтса париз <400> 44 дсхсдааххс дсссххддсд садсахсддс хсххсхдсах адхассдххх схссахсдас 60 саахддаасд аахдхсхаах аддхдххсдх ссххсахсхс дсхсдаххах асадсхсасс 120 асасссасас сХдсддааса саддсХсдаа сХаасХХсХХ ссХсХХхдад ааХХХХсХсс 180 асХсХХХсХХ дадсХХддХс сХссХсаХХс Хсаадддсда аХХсдХаа 228

<21О>	45
<211>	123
<212>	ΡΝΑ
<213>	АГХ^тстаТ Зедиепсе
<220>
<223>	АтрНсоп οί 40-3-2 геа тауз, βηιρίιίϊβό изтпд ргттегз 1гот СР4-ЕР5Р
<400>	45

схсдааххсд сссХХдаахд сддасддХХс сддаааддсс ададдахххд сдддсддххд 60 СЕКЖсддсх дсххдсассд ХдаадсаХдс аддсхдхадс сасхдахаад ддсдааххсд 120 хаа 123 <210> 46 <211> 156 <212> ΡΝΑ <213> АгХтЯста1 Бедиепсе <220>

<22 3> АгарИ соп οί νκ.603 геа тауз, атрШпеб излпд рНтегг (гот СР4-ЕР5Р <400> 46 дсХсдааХХс дсссххддсх схдадсххсд хссхссхаад дхсахдхсхх схдхххссас 60 ддсдхдсахд сххсасддхд саадсадссд дсссдсаасс дсссдсааах ссхсхддссх 120

ХХссддаасс дХссдсаХХс аадддсдаах ХсдХаа 156 <210> 47 <211> 18 <212> ΟΝΑ <213> АгХтЛста! Зедиепсе <220>

<223> ргттег: Сгу1АЬ οί вас1'Пи5 хКип'пдлепзтз <400> 47 асдссХХссХ ддхдсааа 18 <210> 48 <211> 19 <212> РИА <213> дт'Нста! зедиепсе <220>

<223> ргзтег: Сгу1лЬ οί васч’ПиБ хНигтпдтепззз <400> 48 ссхддххссх ддсдаасхс 19

- 49 024233 <210> 49 <211> 19 <212> ϋΝΑ <213> АгЛЛс1'а1 Бечиепсе <220>

<22 3> ргттег: б1ус1пе тах (Тесхтп) <400> 49 аадсасдхса хдсдаххсс 19 <210> 50 <211> 25 <212> ϋΝΑ <213> АгХ1Лста1 Бечиепсе <22О>

<223> рнтег: 5-Епо1-ругиАу1зйткттахе-3-рНозрКахе зупхйазе ЕР5Р5 депе Аот АдгоЬасХегтит зр СР4 <400> 50 ддсХсХдадс ХХсдхссХсХ Хаадд 25 <210> 51 <211> 24 <212> ϋΝΑ <213> АгХтАста1 Бедиепсе <22О>

<223> рп’тег: огуга заХАа <400> 51 дсххадддаа садддаадха аадх 24 <210> 52 <211> 112 <212> 0ΝΑ <213> АгХтХтста! Бедиепсе <22О>

<223> АтрНсоп οί т1б-хуре псе, атрПЛеб из1пд рптегз ίΓοηι рНозрКоПразе О депе <400> 52 дсхсдааххс дсссххдсхх адддаасадд даадХааадх хдаахддхда дхахдаассх 60 дсаддхсдсс схххддахдд сасадасхах дсхаадаадд дсдааххсдх аа 112 <210> 53 <211> 136 <212> ϋΝΑ <213> АгхтЛста! Бедиепсе <22О>

<223> АтрЛсоп οί коипбир-кеабу Боу, атрЛЛеб изтпд рп’тегэ Лот СР4-ЕР5Р <400> 53 дсхсдааххс дсссххддас схдхдддада хадасххдхс дссдддаахд сддасддххс 60 сддаааддсс ададдахххд сдддсддххд сдддссддсх дсХХдсассд ХдаадсаХдс 120

- 50 024233 аадддсдааг гсдгаа 136 <210> 54 <211> 136 <212> ϋΝΑ <213> АИл'Ή σι а1 зеяиепсе <220>

<223> Атр1тсоп оГ СТ73 Вгазэтса париз, атр!ΐΉеб изппд рп'тегз Ггот СР4-ЕР5Р <400> 54 дсьсдааггс дссс«ддас сгдгдддада гадасИдгс ассгддаага сддасддмс 60 садааадасс ададдасГГа сдадсадГГд сГддасддсГ дсГГдсассд ГдаадсаГдс 120 аадддсдааГ ГсдГаа 136 <210> 55 <211> 117 <212> 0ΝΑ <213> АгГтГтсла! Зеяиепсе <220>

<223> АтрИсоп оГ СТ73 Вгаззтса париз, атрИГтеб изтпд рптегз Ггот сгистГепп <400> 55 дсгсдааМс дсссГГсадс гсаасадггг ссааасдадг дссаасгада ссадсгсааг 60 дсдсгддадс сдгсасасдг асггааддсг даддсгддгс даадддсдаа сгсдгаа 117 <210> 56 <211> 27 <212> ϋΝΑ <213> агГ1Г1с1а1 зечиепсе <220>

<223> рптег: геа Мауз (абН-1) <400> 56 гсгсгессгс сигададсг ассасга 27 <210> 57 <211> 21 <212> ϋΝΑ <213> агпТтста! зедиепсе <220>

<223> рптег: геа мауз (абН-1) <400> 57 аагсдагсса аадсдадагд а 21 <210> 58 <211> 18 <212> ΡΝΑ <213> агМ Γιс1а1 зедиепсе <220>

<223> рптег: с1усдпе тах (1ессдп) <400> 58

- 51 024233 аассддгадс дпдссад 18 <210> 59 <211> 19 <212> ϋΝΑ <213> агг-Итоа! зечиепсе <22О>

<223> рптег: сТустпе тах С1есГтп) <400> 59 адсссаГсГд саадссГГГ 19 <210> 60 <211> 23 <212> ΡΝΑ <213> агЕтГтста! зеяиепсе <22О>

<223> рптег: 355 рготогег оГ Саи 1ΐ Поме г мобэтс Утгиз <400> 60 ааадсаадгд даггдагдгд ага 23 <210> 61 <211> 20 <212> ΡΝΑ <213> агп'ПстаЗ зедиепсе <220>

<223> рп'тег: 355 рготогег оГ саи11Г1о«ег мозалс Ул'гиз <400> 61 дддгсггдсд ааддагадгд 20 <210> 62 <211> 19 <212> ΟΝΑ <213> аг-стГтс1а1 Бечиепсе <220>

<223> рптег: 5-Епо1-ругиуу1зН1кттаГе-3-рНо5рНаГе зупГНазе ЕР5Р5 депе Ггот АдгоЬасгеглит эр. СР4 <400> 62 гдааддассд дгдддадаг 19 <210> 63 <211> 19 <212> ΟΝΑ <213> агИТлста! Бециепсе <220>

<223> рптег: 5-Епо1-ругиуу15Ык1таге-3-р11О5рпаГе эупГНазе ЕР5Р5 депе Ггот АдгоЬасгепит зр. СР4 <400> 63 гдааддассг дгдддадаг 19 <210> 64 <211> 24 <212> ΟΝΑ

- 52 024233 <213>

апт^ста! зедиепсе <22О>

<223>

<223> ргттег: Вега уиТдагтз (сТиАЗ) <400> 64 дасссссаса ССасСдааад даад <210> 65 <211> 23 <212> ΡΝΑ <213> агстНста! зедиепсе <220>

<223> рптег: веса уиТдагтз «ЛиАЗ) <400> 65 дадСааССдс сссассссдс сса 23 <210> 66 <211> 28 <212> ΡΝΑ <213> агСтЧпста! зедиепсе <220>

<223> рптег: Соззуртит <400> 66 адсссдсадд ССССдаСдСС асаССдад 28 <210> 67 <211> 21 <212> ϋΝΑ <213> агстЛс1а1 зедиепсе <220>

<223> ргтгаег: Соззуртит <400>

<400> 67 дсасссссда ассдсссасс д <210> 68 <211> 21 <212> ϋΝΑ <213> агСтШста! зедиепсе <220>

<223> рптег: 5о1апит СиЬегозит (исразе) <400> 68 ддасасдсда ададасддад с 21 <210> 69 <211> 19 <212> ΟΝΑ <213> агсПЧстаТ зедиепсе <220>

<223> рптег: 5о1апит сиЬегозит (исразе) <400> 69 ссСассСсСа ссссСссдс

- 53 024233 <210> 70 <211> 108 <212> ΡΝΑ <213> агхтбтста! 5едиепсе <22О>

<223> АтрНсоп об МТ Иеа Мауз <400> 70 дааххсдссс ххаахсдахс сааадсдада хдадссхдхд аддадсдада ааахдадссс 60 ХдаХХХаХаХ адХддХадсХ сХаааддадд аададааадд дсдааххс 108 <210> 71 <211> 105 <212> ΡΝΑ <213> агхтбтс1а1 зедиепсе <220>

<223> АтрНсоп об мт СТустпе шах <400> 71 дааххсдссс ххаассддха дсдххдссад сххсдссдсх хссххсаасх хсассххсха 60 хдссссхдас асаааааддс ххдсадахдд дсхаадддсд ааххс 105 <210> 72 <211> 99 <212> ΡΝΑ <213> агп'бтста! зедиепсе <22О>

<223> АтрНсоп, атрНбтеб изтпд ргдтегз бгот 355 рготохег об СаиНбЧомег Мозахс Ухгиз <400> 72 дааххсдссс ИдддХсХХд сдааддаХад хдддаХХдХд сдХсаХсссх ХасдХсадХд 60 дадахахсас ахсаахссас ххдсхххаад ддсдааХХс 99

<210>	73
<211>	97
<212>	ϋΝΑ
<213>	агхтбтста! зедиепсе
<22О>
<223>	АтрНсоп об ΜΟΝ810 геа Мауз, атрНбтеб изтпд ргхтегз бгот Сгу1АЬ об вастПиз хНиппдтепзтз
<400>	73

дааххсдссс ххсадсассх ддсасдаасх сдсхдадсад даасхдсдхд адддададдд 60 адахдхсдах дддадхдхаа ссддхааддд сдааххс 97 <210> 74 <211> 132 <212> ΡΝΑ <213> агхЗбтстаТ зедиепсе <22О>

<223> АтрНсоп об СТ73 геа тауз, атрПбпеб изхпд рп'тегз бгот СР4-ЕР5Р <400> 74

- 54 024233

даасссдссс сссдааддас ссдсдддада садасССдсс асссддааса сддасддссс	60
садааадасс ададдасССа сдадсадССд ссддасддсс дсССдсассд сдаадсасдс	120
аадддсдаас Сс <210> 75 <211> 132 <212> ΡΝΑ <213> агСтСтста! зециепсе <220> <223> Ашр1тсоп οί коипйир-кеайу 5оу, атрТИтес! изтпд ргттегз ίι-οπι СР4-ЕР5Р <400> 75	132

даасссдссс сссдааддас сддсдддада ссдасссдсс дссдддаасд сддасддссс 60 сддаааддсс ададдасссд сдддсддССд сдддссддсС дсССдсассд Сдаадсасдс 120 аадддсдаас Сс 132 <210> 76 <211> 142 <212> ΟΝΑ <213> агСтОста! зедиепсе <220>

<223> АтрНсоп οί веса уиТдапз, атрННеб изт'пд ргттегБ Сгот СТиАЗ <400> 76 даасссдссс ссдасссеса сассассдаа аддаадссаа аадддассаа ссаадсдсСс 60 сасдаадссс ааадсасдсд ссдсСсСсаа дасСдаасаС ддсасСдСда асаддаСдда 120 дсааССасСС аадддсдаас Сс 142 <210> 77 <211> 139 <212> ΟΝΑ <213> агСтОста! зедиепсе <220>

<223> АтрИсоп οί соззуртит атрПСтес) изтпд ргттегз Сгот заН-7 <400> 77 даасссдссс ссадсссдса ддссссдасд ссасассдад СдасадСдаа СдааадддСд 60 сдсааасаса ааасаасддд аасаассаСд асаСдССдда сСддаСсадС аддсддССса 120 аадаСдсаад ддсдааССс 139

<210>	78
<211>	111
<212>	ΟΝΑ
<213>	агстίτста1 зедиепсе
<22О> <223>	АшрНсоп οί ЗоТапит ТиЬегозиш, атрННес! изтпд ргттегз ίΓοπι исРаэе
<400>	78

даасссдссс ССддасаСдс даададасдд адсдсадасс ссссадсаад даддсдсдад 60 дддссадссд СададддСас деддаддддс ададдсадда адддсдааСС с 111 <210> 79 <211> 22 <212> ΟΝΑ <213> агСтОста! зедиепсе <22О>

<223> ргттег: вгаззтса париз (асс) <400> 79 ддсдадссдс асаассдадс да 22

Claims (31)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ анализа образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, включающий стадии:

   (1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих одну, более чем одну или все из нуклеиновых кислот, выбранных из:

   а) Ζιη: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Ζοη тауз, предпочтительно Ζοα тауз ззр. тауз,

   - 55 024233

   b) Вп: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Вгаккюа паρυκ,

   c) Οιη: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Οίναικ тах,

   о) Ογ: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Ογυ83 кайуа, ρ) Βν: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Ве!а уи1даг18, с|) Ο8: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Οо88^ρ^ит, и ί) δί: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона δо1аηит !иЬего8ит; и всех нуклеиновых кислот, указанных в ά)-ί):

   ά) ρ35δ: нуклеиновой кислоты, происходящей из промотора 35δ вируса мозаичной болезни цветной капусты,

   е) ίΝΟδ: нуклеиновой кислоты, происходящей из 3'-терминатора гена нопалинсинтетазы ЛдгоЬас1епит 1итеГас1еп8,

   Г) Сгу 1Αό: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Сгу^Ь кристаллического белка ВасШи8 Шигшд1еп818,

   д) ΡЛТ/Ьа^: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Ьаг фосфинотрицинацетилтрансферазы (ΡΑφ δί^еρίотусе8 Ьуд^о8соρ^си8,

   1ι) ΡЛТ/ρаί: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена ρаί фосфинотрицинацетилтрансферазы (ΡΑΗ δί^еρίотусе8 \зпбос11готодепе8 и

   ί) ϋΡ4-ΕΡδΡδ: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена ΕΡδΡδ 5-енолпирувилшикимат-3фосфатсинтазы из Лд^оЬасίе^^ит 8ρ. ϋΡ4;

   где на стадии (1) присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот в образце детектируют при помощи ПЦР-амплификации, где ПЦР-амплификацию нуклеиновых кислот проводят одновременно в одинаковых температурных условиях цикла, с использованием соответствующих пар праймеров из следующей таблицы, или их вариантов, последовательность которых по меньшей мере на 85% идентична последовательности указанных пар праймеров, и где праймеры или пары праймеров при необходимости могут быть помечены для возможности их детекции:

   Ζηι

   Вп

   Ст р358 (ΝΟ8

   Сгу1АЬ

   РАТ/Ьаг

   РАТ/раГ

   СР4-ЕР8Р8

   Ог

   Βν

   Ся

   Прямой: 5’ ТСТСТТССТССТТТАСАССТАССАСТА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 56) Обратный: 5’ ААТСОАТССАААОСОАОАТОА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 57) Прямой: 5’ САССТСААСАСТТТССАААССА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 24) Обратный: 5' СОАССАСССТСАОССТТААС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 25)

   Прямой: 5' ААССОСТАСССТТОССАС 3' (ЗЕО ГО N0: 58)

   Κεν’: 5' АОСССАТСТОСААОССТТТ 3’ (ЗЕО ГО N0: 59)

   Прямой: 5' АААОСААОТООАТТОАТОТОАТА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 60) Обратный: 5’ ОССТСТТСССААОСАТАаТО 3' (ЗЕО ГО КО: 61)

   Прямой: Э'-ОАТТАОАОТСССОСААТТАТАСАТТТАА-З¹ (ЗЕО ГО N0: 9) Обратный: 5'-ТТАТССТАСКТТОСССОСТАТАТТТ-3' (ЗЕО ГО N0: 10) Прямой: 5'-АССОСТТАСАСТСССАТСОА-3' (ЗЕО ГО N0:11)

   Обратный: 5'-САССАССТСССАСОААСТС-3' (ЗЕО ΙΟΝΟ: 12)

   Прямой: 5'-СОТСААССАСТАСАТСОАОАСАА-3'(8Е<2 ГО ΝΟ: 13) Обратный: 5’-ОТССАСГССТОСССТТССТ-3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 14)

   Прямой; 5'-ССОСОаТТТОТОАТАТСОТТ-3' (ЗЕО ГО ΝΟ; 15)

   Обратный: 5’-ТСТТаСААССТСТСТАОАТСАТСАА-3' (ЗЕ(,> ГО N0: 16) Прямой: 5' СЗСАТОСТТСАСООТОСАА 3' (ЗЕ<3 ГО ΝΟ: 22)

   Обратный: 5’ ОСАССТСТССОАОАТАОАСТТСТС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 23) Κεν 1: 5' ТОААСОАСССОТСООАОАТ 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 62)

   Κεν 2: 5’ ТСААСОАССТОТООСАСАТ 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 63)

   Е»сГ: 5' ССТТАСООААСАСООААОТАААОТ 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 51) Обратный: 5’ СТТАОСАТАОТСТСТСССАТССА 3' (ЗЕО ГО N0:21) Прямой: 5' САССТССАТАТТАСТСАААССААС 3' (ЗЕО ГО N0: 64) Обратный: 5' ОАСТААТТССТССАТССТОТТСА 3’ (ЗЕО ГО N0: 65) Прямой: 5' АОТТТСТАССТТГТОАТОТТАСАТТСАС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 66) Обратный: 5’ ОСАТСТТТОААССОССТАСТО 3' (ЗЕО ГО N0; 67)

   Прямой: 5' ООАСАТОТОААОАСАСООАОС 3' (ЗЕО ГО N0: 68) Обратный: 5’ ССТАССТСТАССССТСССС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 69) и (2) заключения о присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, выбранных из группы, включающей независимые трансформанты В!176, В!11, В!10, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ТС1507, ΝΚ603, Т25, ΟΑ21, ΌΑδ-59122, ΜΙΚ604, ΕΥ038, ΜΟΝ88017, их гибриды и родственные им независимые трансформанты; независимые трансформанты Тоρа8 19/2, Μδ1, КР1, КР2, КР3, Μδ8, ΟТ73, Т45, ЫЬегаГОг ρΗое6/Лс, Οδ40/90ρΗое6/Лс, ΟXΥ235, их гибриды, включая Μδ1/ΚΡ1, Μδ1/ΚΡ2, Μδ8/ΚΡ3 и родственные им независимые трансформанты; независимые трансформанты ΜΟΝ 40-3-2, ΜΟΝ89788, Α2704-12, Α5547-127, их гибриды и родственные им независимые трансформанты, независимые трансформанты ЬЬ62, ЬЬ06 и ЬЬ601, их гибриды и родственные им независимые трансформанты; независимые трансформанты Т120-7, Η7-1 и Α5-15, их гибриды и родственные им независимые трансформанты; независимые трансформанты ЬЬ соПоп 25, ΜΟΝ 1445, ΜΟΝ 531, ΜΟΝ15985, их гибриды и родственные им независимые трансформанты; и незави- 56 024233 симый трансформант ЕН92-527-1 и родственные ему независимые трансформанты, где указанные родственные независимые трансформанты являются растениями того же таксона, что и независимые трансформанты, и которые трансформированы теми же конструкциями, как и соответствующие независимые трансформанты, которым они родственны, где стадия (2) включает в себя этапы:

   (ί) присвоения набору нуклеиновых кислот, состоящего из нуклеиновых кислот, детектированных на стадии (1) как присутствующих в образце, обозначения С^_АМ;

   (ίί) присвоения одному или нескольким наборам нуклеиновых кислот, соответствующих одному или нескольким представляющим интерес независимым трансформантам растений (X), выбранным из группы, включающей или состоящей из независимых трансформантов В!176, В!11, В!10, МОЖ10, МОЖ63, ТС1507, ΝΚ603, Т25, А21, ΌΑδ-59122, М1К604, ΌΥ038, МОГО8017, Торак 19/2, М81, КР1, КР2, М81/КР1, Μδ81/КР2, Μδ8, КР3, Μδ8/КР3, СТ73, Т45, ПЬега!ог рНое6/Ас, Сδ40/90рΗое6/Αс, ОХУ235, ΜОN 40-3-2, МОГО9788, А2704-12, А5547-127, ЬЬ62, ЬЬ06, ЬЬ601, Т120-7, Н7-1, А5-15, ЬЬ со!!оп 25, МОШ445, МО№31, МОШ5985 и ТН92-527-1, обозначения С_Х, выбранного из группы, включающей к#! н «у-ч η н/· <4 и*·'* ίί «ζ·» ίί ^Βΐί?6 ? ивп/ , , ^μθΝΒ/0 > ,

   11/“’ II ΙΙ/-1 II II/- II 11/-, II »/-« II ΙΙ/-« я 11/-, II И/Ί II ||/Ί и

   ТС 1507 , {1ΝΚ603 » ^Г25 » » <ΤΰΑ5-59ΐ22 ·, , С’ДУОЗЙ > ^ΜΟ!4$$017 ♦ ^Торав 19/2 ι

   Од®/, Окт/, Оди. Омдд.дл, ΆινΆ'·. Ол/дл. Оддд, О.дгаддд, Оето, Ош, Льегшогриоеб/Ас, Лз40/90рНое6/Ас:, θΟΑ723ί; θΛ/Ο,'^β-ί-ί”, 'ΌμΟ№97μ, 'Άπι-Ι-ί/', 'Όΐ5ί47-Ι27,

   Оце”, Одиб, Олли, Οτΐ20-7, О#?./, Од Ол _со„_оя 2з, Омои/Л, ОмсжзЛ <ЗмОМ5985 И Оен92-527·, где

   - Ов<17<> е {Ζηι; р358; Сгу1АЬ; РАТ/Ьаг},

   - Ов,и е {Ζηι; р358; (N08; Сгу1АЬ; РАТ/ра(},

   - Свио е {Ζηι; р358; (N08; Сгу1АЬ; РАТ/ра(},

   - Ояоад/о « {Ζηι; р358; (N08; Сгу1АЬ},

   - &МОМ63 е {Ζηι; р358; (N08},

   - 57 024233 Стс1507 ε {Ζηι; р358; РАТ/ра(},

   - Снкюз е {Ζπι; р358; (N03; СР4-ЕРЗР8},

   - Ста ε {Ζηι; р358; РАТ/ра(},

   - Сали е {Ζπι; (N08},

   - Огш-от» е {Ζιη; р358; РАТ/Ьаг},

   - Смит ε {Ζηι; ΙΝΟδ }

   - <3ггоз« 6 {Ζηι; р353; (N03 },

   - (Эмо№8017 ε {Ζηι; ρ35δ; (N08; СР4-ЕР8Р8},

   - Ογφμγρ/2 е {Вп; ρ353; РАТ/ра(},

   - Ода е {Вп; ΙΝΟδ; РАТ/Ьаг},

   - Сип е {Вп; (N08; РАТ/Ьаг},

   - С дда е {Вп; ίΝΟδ; РАТ/Ьаг},

   - Сгмя/яи ε {Вп; (N08; РАТ/Ьаг}, Омм/ккг ε {Вп; (N08; РАТ/Ьаг},

   - Ода е {Вп; (N08; РАТ/Ьаг},

   - Одда е {Вп; (N08; РАТ/Ьаг},

   - Ода/ятз ε {Вп; (N08; РАТ/Ьаг},

   -0_0ГО€ {Вп; СР4-ЕР8Р8},

   - Ош ε {Вп; р358; РАТ/ра(},

   - Опъгпмгрнжхлс е {Вп; рЗ58; РАТ/ра(},

   - Оо5,р/рорйоеб/₄с ε {Вп; р353; РАТ/ра(},

   - Оолу?35 е {Вп; р353};

   - Омом0-3-2 ε {От; р353; (N08; СР4-ЕРЗР8},

   - Омош978И ε {От; СР4-ЕРЗРЗ}

   - О>А2704-12 ε {От; р355; РАТ/ра(}, Оазз47-/27 ε {От; р358; РАТ/ра(},

   - Ош? ε {Ог; р358; РАТ/Ьаг},

   - (щл е {Ог; рЗ 58; РАТ/Ьаг}

   - Ош» е {Ог; р353; (N08; РАТ/Ьаг},

   - Ог/2о-7 ε {Βν; р358; РАТ/ра(},

   - Ода.; ε {Βν; р353; СР4-ЕРЗРЗ},

   - (Зя-15 ε {Βν; р358; (N08; СР4-ЕРЗРЗ},

   - Οϋ«,„_ο„2ί е {Оз; ρ35δ; (N08; РАТ/Ьаг},

   - Омс>№445 ε {Оз; р358; (N08; СР4-ЕР8Р8),

   - Ол/олзд; е {Оз; р353; (N08)

   - О*/ои;мг е {Оз; р358; (N08}, и -Οεη92-527-ι ε {3(; (N08};

   (ίίί) выполнения для каждого набора О_Х следующих логических операций:

   если О_Х равен О_8АМ (О_Х = О_8АМ), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Х или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в образце;

   если О_Х является истинным подмножеством О_ЗАМ (О_Х с О_ЗАМ), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Х, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта потенциально присутствует в образце;

   если О_Х не равен О_8АМ и О_Х не является истинным подмножеством Одам, (О_Х Ψ О_8АМ и О_Х 7 О_8АМ), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Х, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в образце.
2. 2. Способ по п.1, где стадия (1) включает детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты, перечисленные под пунктами а)-с) и ά)-ί).

   - 58 024233
3. 3. Способ по любому из пп.1, 2, где на стадии (1) наличие или отсутствие нуклеиновой кислоты в образце детектируется с помощью ПЦР-амплификации в режиме реального времени.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где осуществляют множественную ПЦР-амплификацию двух или большего числа нуклеиновых кислот.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где стадия (1) дополнительно включает детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты Ц тСгу3А: нуклеиновой кислоты, происходящей из модифицированного гена Сгу3А кристаллического белка ВасШих !1шгшд1епх1х; и/или детектирование присутствия или отсутствия в образце одной или обеих нуклеиновых кислот к) согйарА: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена согйарА не чувствительной к лизину дигидродипиколинатсинтазы (сЭНЭР8) СогупеЬас!епит дШатюит, и/или ί) О1Ь1: нуклеиновой кислоты, происходящей из промотора О1Ь1 кукурузы; и/или детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты т) Сгу3ВЬ1: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Сгу3ВЬ1 кристаллического белка ВасШих Шитшд1епх1х; и/или детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты п) Вхп: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Вхп нитрилазы К1еЬх1е11а рпеишотае ххр. о/аепае; и/или детектирование присутствия или отсутствия в образце одной или обеих из нуклеиновых кислот г) Сгу1Ас: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Сгу1Ас кристаллического белка ВасШих !1шгшд1епх1х, и/или х) Сгу2АЬ2: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Сгу2АЬ2 кристаллического белка ВасШих !1шппд1епх1х; и/или детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты и) ОВ88: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена ОЬхх связанной с гранулами крахмалсинтазы 8о1апит !иЬегохит, где если стадия (1) включает определение присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты Д то - О_М1К604 е {2т; ШО8; тСгу3А};

   если стадия (1) включает определение присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты к) и 1), то - О_Ъуоз₈ е {2т; р358; ШО8; согйарА; О1Ь1};

   если стадия (1) включает определение присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты т), то - Омож8017 е {гт; р358; ΙΝΌ8; СР4-ЕР8Р8; Сгу3ВЬ1};

   если стадия (1) включает определение присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты п), то - О_ОХУ235 е {Вп; р358; Вхп};

   если стадия (1) включает определение присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты г), то - О_МО^5₃! е {Ох; р358; ΐNО8; Сгу1Ас};

   если стадия (1) включает определение присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты г) и х), то - О_МО^!5₉₈5 е {Ох; р358; ШО8; Сгу1Ас; Сгу2АЬ2};

   если стадия (1) включает определение присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты и), то - Оен92_-527_-1 е {8ΐ; 1ΝΌ8; ОЬхх};

   где дополнительная детекция одной или нескольких указанных нуклеиновых кислот на стадии (1) способа позволяет более точно определить наличие или отсутствие материала, полученного из одного или нескольких независимых трансформантов растений М1К604, ЬУ038, МОЖ8017, ОХУ235, МО№31, МОШ5985 и/или ЕН92-527-1.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где стадия (1) дополнительно включает детектирование присутствия или отсутствия в образце характерной для растений нуклеиновой кислоты, предпочтительно происходящей из гена малой субъединицы КиЫхсо (рибулозобисфосфаткарбоксилазы хлоропластов) или из гена СНЬУ^А-синтазы.
7. 7. Способ по п.6, где присутствие или отсутствие указанной характерной для растений нуклеиновой кислоты детектируют при помощи ПЦР-амплификации, предпочтительно ПЦР-амплификации в реальном времени, с использованием пары праймеров 5' АООТСТААОООКТААОСТАС 3' (8ЕЦ ГО NО: 26) и 5' АОУСТТОАТСОТТАСАААОО 3' (8ЕЦ ГО NО: 27) или их вариантов, последовательность которых по меньшей мере на 85% идентична последовательности указанных пар праймеров, и где праймеры или пары праймеров, при необходимости, могут быть помечены для возможности их детекции.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, где используют ДНК-связывающий реагент, который, по существу, неспецифично связывается с последовательностью продукта ПЦР-амплификации, полученного из соответствующих нуклеиновых кислот с использованием пар праймеров, указанных в п.1, для детекции накопления продуктов амплификации предпочтительно используют ДНК-связывающий флуоресцентный краситель, более предпочтительно используют 8УВК Огееп или РюоОтееп.
9. 9. Способ по любому из пп.1-8, где специфичность продуктов амплификации дополнительно подтверждают предпочтительно с использованием анализа кривой плавления (Тт) и/или определения размера при помощи гель-электрофореза.
10. 10. Способ по любому из пп.1-7, где продукты амплификации детектируют посредством флуорофорной метки, присутствующей по меньшей мере в одном праймере из пары праймеров, например, с

    - 59 024233 использованием технологии ЫдЬ( Ироп Ех1еп81оп (ЪИХ™).
11. 11. Способ по любому из пп.1-10, где образец включает растения или их части, в том числе цветки, листочки околоцветника, лепестки, чашелистики, пыльники, пыльцу, семена, плод, околоплодник (перикарпий), коробочки, листья, черешки, стебли, корни, корневища, столоны, клубни или побеги, или их части, клетки растений, протопласты растений и/или ткани растений и/или происходящий из растений материал, предпочтительно пищевой или кормовой материал.
12. 12. Способ по любому из пп.1-11, где на стадии (1) присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот в образце детектируют при помощи ПЦР-амплификации, дополнительно используя соответствующие пары праймеров из приведенной ниже таблицы, или их варианты, последовательность которых по меньшей мере на 85% идентична последовательности указанных пар праймеров, и где праймеры или пары праймеров при необходимости могут быть помечены для возможности их детекции

    Ζηι

    Вп

    От р358 (ΝΟ8

    Сгу1АЬ

    Сгу1АЬ

    СР4-ЕР8Р8

    Ог

    Прямой: 5' СёТС§ТТТСССАТСТСТТССТСС 3' (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 1) Обратный: 5' ССАСТСС₈А₈АСССТСАёТС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 2) Прямой: 5' ОАОААТОАСОАООАССААОСТС 3' (ЗЕО Ю ΝΟ: 4) Прямой: 5’ОСТОАОСТОТАТААТССАОСОА 3’ (ЗЕО П> ΝΟ: 79) Обратный: 5' ООСОСАОСАТСООСТ 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 3)

    Прямой: 5' САТТАССТАТеАТёССТССАСС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 5)

    Обратный: 5' АА₈САС₈ТСАТ₈СеАТТС 3' (ЗЕО ПЗ ΝΟ: 6)

    Обратный': У АЛ§СЛС₈ТСАТ_еС₈АТТСС 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 49)

    Прямой: 5'-ОАСАОТСОТСССАААСАТОС-3’ (ЗЕО Π3ΝΟ: 7)

    Обратный: 5'-СТСТТОСОААООАТАОТООО-3' (ЗЕО ГО N0: 8)

    Прямой: 5' ССТТСАААСАТТТООСААТАААО 3' (ЗЕО Ю ΝΟ: 28) Обратный: 5' АААТОТАТААТТОСОООАСТСТААТС 3' (ЗЕО НЗ ΝΟ: 29) Прямой: 5' ОАСАТСАТСТООООУАТСТТ 3' (ЗЕО ГО N0: 30)

    Обратный: 5' ОСССТОТТСАТСТСОТТСАА 3’ (ЗЕО ГО N0: 31)

    Прямой: 5' АСОССТТССТССТОСААА 3' (ЗЕО ПЗ ΝΟ: 47)

    Обратный: 5' ССТООТТССТООСОААСТС 3’ (ЗЕО ПЗ ΝΟ: 48)

    Прямой: 5'-ОССТСТОАОСТТСОТССТССТААОО-3' (ЗЕО ПЗ ΝΟ: 17) ЕмгсП': 5'-ОССТСТОА(тСТТСОТССТСТТ А АОО-3' (ЗЕО ПЗ ΝΟ: 50) Прямой: З'-АТСЛОТСОСТЛСЛОССЗ ОСЛТ-З’ (ЗЕО ®ΝΟ: 18) Обратный: 5'-СААТОСООАССОТТССООАААО-3' (ЗЕО ПЗ ΝΟ: 19) Прямой: 5' ОСТТАОСОААСАОООААОТАААОТТ 3' (ЗЕО ПЗ ΝΟ: 20) Обратный: 5' СТТАССАТАОТСТОТОССАТССА 3' (ЗЕО ГО ΝΟ: 21)
13. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором, если С_Х равен 0_8Ам и если ни один набор или ни одна сумма двух или более наборов, выбранных из группы, включающей или состоящей из

    ΟβΙ176, Саш, ΟβιΙΟ, О МОМ 1(1, ОмОМбЗ, ОтС1507, ΟνΚ603, 6τ2ί,

    Οθ421, 9,42-59/22, 9/11(604- Бц'ОЗЗ- &ΜΟΙ488017, 9орш: 19/2, 9/51, 9(1'1, 9/‘(, 9/211(1'/, 9/2/К/М

    9/88-, ΟχΒ3, Смг&'ЯГ'З, Сото, 9/5- 9,/кга/а·рНоеб/Ас, 9540/»0рНое6/Ас, 9χΥ235’, 9,<084(!-ί-2·. §ΜΟΝ89788,

    92704-12, 9(5547-127, 9/.62, ΟϋίΜ, О//.60А Ог/20-7, О//7-/, О.45-/5, Οϋ соиоп 25, 9ΐΟ(·/,'445, 9,ΙΟΝ531-, &Μ0ΝΙ5985, иная, чем С_Х, не равна С_8Ам- то материал, происходящий из независимого трансформанта растения

    Х или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, присутствует в образце.
14. 14. Способ по любому из пп.1-12, в котором нуклеиновым кислотам, выбранным из группы, включающей ’^т, Вп, Ст, р358, (N08, Сгу1АЬ, РАТ/Ьаг, РАТ/ра(, СР4-ЕР8Р8, тСгу3А, согбар А, С1Ь1, Сгу3ВЬ1, Вхп, 0г, Ву, С8, Сгу1Ас, Сгу2аЬ2, 8( и СЬ88 присвоены соответствующие уникальные числовые значения /а,, ν_5η

    Ι»ν 11 «1/ II »17 »1 111/ II «17 II «17 « «17 Η «17 « «17 « «17 « * ΡΑΤ/ραί ? ν СР4-ЕР5Р5 , V мСгиЗЛ , * согАар Α , V С1Ы ? VСгуЗВЫ , V Βχη , V Ог > , V Οί , ν,,,Μ,. νί, апб ν_σ4„, каждому набору С_Х присвоено числовое значение УС_Х, выбранное из группы, включающей числовые значения νθί,_;7ί, У0_л„,. νθ»/ο, УОл/ом/о, VΟ_ΜΟί№63”,

    И17 II III/ Μ 1117 II 111/ И «1/ 11 1»1/ Π «1/ II ν Ζμ , Υβ„ , \Ст , Ур358 , V ιΝ05 , *Сгу!АЬ > V РАТ/Ьаг , νΟτ-οίΰΛ νο, '8/6603

    УС™,

    Ч<9юы8017, νθτ^ ι9, νο_Μ5Λ νο_№/, να_№2, νο_№7/№7, νο_Αί5/._№,, νο_Λβ5, να_Α„, УС_ОТ„, УО_ТО, ^0340/9^9, νθοη·335,

    УОмОИ40-3-2^П, ^9/088978./, V Οα2704-12, УОа3547-127, УО/,ш> УСт/,£,₇₄. УОцдм, УОгдаЛ У0_Я7./, 'ΎΟ^,/ί, νθ_£ί соНоп 25 ι УОлю.\'/445, 'А0л«ЖЗ/> νθΛ/ΟΎ/5985 И

    УОЕН92-127-, в которых

    - 60 024233

    - νθ₅,776 = Угт * Ур355 ^х ^Сгу/АЬ ^х V РАТ/Ьаг,

    - ~ У Ζιη ^х УрЗЛУ X Уг,\П$ X Усгу1АЬ ^х УрлГ/рлЬ

    - νθΛ2ΰ ~ У2« * Ур335 ^х ^ΐΝΟΣ ^х УсгуЗАЬ ^х VРАТ/ра,

    - УОмОМЗМ ⁼ Угш ^х УрЗЛ5 ^х ^ΙΝΟΣ ^х У<>у1АЬ>

    - УОл/отз⁼ У^и ^х Урззз ^х У/шл

    - У<ЗтС1507~ УΖιη ^х Ур355 ^х УРАТ/раь

    - У^НКбОЗ ⁼ У^т ^х УрЗЛУ ^х У/ШУ ^х ^СРХЕРЗРЗ,

    - УСш ⁼ У?ш ^х Ур355 ^х УрАГ/раг,

    - УСслл⁼ Угт ^х Умо&>

    - У6р>Л5-59122 ~ ^Ζη ^х Ур358 ^х УрАТ/Ьаг,

    - УСлякйМ ^ш Уг/я ^х ^ΙΝΟΣ * УтСгуЛЬ ИЛИ ν&ΜΙΜ04 ⁼ У^т ^х У/ШУ»

    - УОгУОЗЙ “ У?№ ^х Ур355 ^х VιΝΟΣ ^х УсогАгрА ^х Ус1Ы, ИЛИ УОщцз = У/ш ^х УрЗЛУ ^х У/Ш5,

    - УОмо№8017⁼ Угт * Ур.л'5 ^х У/шу χ Уср4-ерзр * Услгзвл/, или УОллш«У7⁼ Угт ^х Урзя ^х У/ШУ ^х УсР4-ЕРЗР, • У О Горл? 79/2 = Уйл ^х Ур355 ^х УрАТ/реа, • УОш; ⁼ У Ви ^х ^ΙΝΟΣ ^х УрАТ/Ьап

    - УОкГУ = Уй« ^х У/ШУ ^х Урятфлъ

    - УСаЛ? ~ Удя ^х У/ШУ ^х УрАТ/Ьаъ

    - УСм53 *= Увл ^х У/КОЗ ^х Урлт/Ьаг,

    - УО/иЧ = У»п ^х УШУ ^х УрАТ/Ьаг,

    - УОл/5//ДЕ/ ⁼ Урп ^х VιΝΟΣ ^х УрАТ/Ьаг, ~ УСзМ57/ЙГ2 ⁼ Уйи ^х УгНОЗ * УРАТ/Ьаъ

    - УСм$8ЯУ\? ⁼ УВи X У,ХОЗ ^х УллгуМг,

    - УОог73 ⁼ УВи ^х УсР4-ЕР8РЗ>

    - УОга - Увя ^х УрЗЗЗ ^х У РА т/раг, ^^ЗЦлЬега/ог рНое&Ас - Уйп ^х УрЗ$5 х УрАТ/ραΙ,

    - УСсЫО/РОрНоеб/Ас ⁼ /Цч ' УрЗЯ ^х У РАТ/рл,

    - ν<3<?ΛΤ?55 ⁼ Ув. ^х Ур555 х 'Ή„, ИЛИ = Увп ^х У_Р355,

    - У СмОГ14<1-3-2 -Уот* УрЗЯ ^х УΙΝ05 * УсРА-ЕРЗРР,

    - У0а/О№Ю>7.М ⁼ Vо„ X У СР4-ЕРРР5,

    - УОа2704-12 ⁼ '/>1 ^х УрЗЗР ^х VРАТ/раЬ УО₄И#7-/27 = У От ^х УрЗ!5 ^х УРАР/ραι,

    - УО.7//2 = У о, ^х 'з'рзз::^х Урлт/Ьаг,

    - УСшМ ~ У_Ог* УрЗЗЗ ^х VРАТ/Ьап

    - УСщй); = Уо X У ,,33-: X ν_;ι;ο5 х УрлГЛап

    - νθπ2Ι>-7⁼ ν^ν ^х УрЖ X УрАТ/ра,

    - УОя--/ “ Увг χ Урж χ У си-ирзр::·

    - У 6-13-13 - Увг ^х УрЖ ^х У/ΝΟΕ X УсРЗ-ЕР№3,

    - νθΙΙ аия 2! ⁼ νΟι^χ Ур355 X V_ιΝοί ^х У РАТЛаг,

    - V О МОК 1443 “ У_С, X УрЗЗЗ X У(Л>05 ^х УсР4.ЕР$Р$,

    - УОмОН531 - Уйу ^х Ур35$ X У/АВД ^х VСгр1Ас, ИЛИ УОддада,/ = Уо_г X УрЗЗЕ X Ί,ΧΟΕ,

    - УОмгЖЗЗЖ - Уо! ^х УрЗК ^х ν,Λ/05 X ’ЧсгрЗАс ^х Усгу2И42, ИЛИ УСмОН15М5 ~ У(;.1 ^х УрЛ5 ^х VιΛΌί, - И ЧОеН92-52?.1 ⁼ Уя ^х ν,.Α',3.5 ^х У СЬп, ИЛИ УСзЕН92-327-1 ⁼ У^1 * УΙΝΟ3, и где набору О_зΛΜ присвоено числовое значение VО_зΛΜ, которое является произведением уникальных числовых значений, присвоенных нуклеиновым кислотам, детектированным на стадии (1) в качестве присутствующих в образце;

    и где этап (ίίί) включает выполнение для каждого набора О_х следующих логических операций: если VО_зΛΜ/VО_Χ равно 1, то материал, происходящий из независимого трансформанта растения х, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в образце;

    если VО_зΛΜ/VО_Χ равно одному числовому значению или произведению двух или более числовых значений, выбранных из группы, включающей или состоящей из числовых значений У_гт, У_Вп, У_От, У_р353, V_ίNΌЗ^, Vсгу1Ай^, VρАТ/Ьаг^, 'У'РАТ/раЬ VсР4-ΕРЗРЗ^, УтСр.·.’,.',· УсοгбарА^, 'УоИЯ, 'УСгуЖйЬ 'У'вхш У^ Vο5^, 'Ус^Ас Vс^у2ай2^, ν₃ и У_Ойхх, то материал, происходящий из независимого трансформанта растения х, из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в образце;

    если VО_ЗАΜ/VО_Χ не равно 1 и не равно одному числовому значению или произведению двух или

    - 61 024233 более числовых значений, выбранных из группы, включающей или состоящей из числовых значений Υ/.η- Увп ^УСт, ^Ур358^{, У}М^О8, ^С_гу1АЬ,· УрАТ^;1мг· ^УРАТ/раЬ ^УСР4-ЕР8Р8^, Υιη'.'ι·;.·.’,.';· ^УсοгбарΑ^, 'Ус1ЬЪ ν'.ϊ,Α,ΒΜ· Vвχη^{, У}От, ν_Βν, У_Сх, У_Сгу1_Ас, У_Сгу2аЬ2, ^у, и У_СЬхх, то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Χ, из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в образце.
15. 15. Способ по п.14, в котором, если УС_8АМ/УС_Х равно 1 и если ни одно числовое значение или произведение двух или более числовых значений, выбранных из группы, включающей или состоящей из числовых значений νθ^ί/7ί, νθΒί/л νθβ,;ο, УОл/ом/о,

    УС.ЧОЛ’ЙЗ, ^УОгс/507, УОд/ООЗ, νϋπί, νΟϋ/ίί/, УОш5-5Р722, ^УО*«ддаь νΟίΓΟΜ, ^уОцОЛ®?077,

    УОгрраа 19/2, 90,,/8/, УОкГЦ 9Сдг2, УСмидац» 9С^1/КР2, ^УСлСТ- ^УСу/'Х УОлйЗ/ДГЗ, ^У<ЛС775,

    УОт75, 9С5ьЬепяог рНосб/Ас, 9Ос840/90рПое6/Ас, 9ΟΰΧΪ235> 9ОмоН40-3-2, 90^01189788, 9Оа2704-12,

    90,15547-127, 90цб2, 90цоб, 9(3ιΐ601, 90/120-7, 90//7-1, 90^5-15, УОи сопок 25, 9<3μΟΝ!445, 9ΟμΟΝ531, 90 >101,4 5983 И 90 £//92-527-1, иное, чем УС_Х, не равно УС_Х, то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Χ, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, присутствует в образце.
16. 16. Способ по любому из пп.14 или 15, в котором числовое значения Уг_т, У^, У^, У_рз58, Ул, ^УС^у1ΑЬ^{, У}РΑТ/Ьа^^{, У}РАТ/раЬ ^УСР4-ЕР8Р8^{, У}тС^у3Α^{, У}сοгбарΑ^{, У}С1Ъ1, ^УС^у3ΒЬ1^, ^хп, ^УОг, ^УΒУ^{, У}С8^{, У}Сгу1Ас ^УС^у2аЬ2^{, У}81 ^и У_СЬхх, являются уникальными простыми числами и где этап (ίίί) включает выполнение для каждого представляющего интерес набора С_Х следующих логических операций:

    если УС_8АМ/УС_Х равно 1, то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Х, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в образце;

    если УС_8АМ/УС_Х является целым числом, большим чем 1, то материал, происходящий из независимого трансформанта растения Х, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в образце;

    если УС_8АМ/УС_Х не является целым числом, то материал, происходящий независимого трансформанта растения Х, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в образце.
17. 17. Способ по любому из пп.1-16, где стадию (2) проводят при помощи вычислительного устройства.
18. 18. Компьютер или калькулятор, запрограммированные для осуществления стадии (2) способа по любому из пп.1-16, или носитель данных, содержащий инструкции для вычислительного устройства, запрограммированного для осуществления стадии (2) способа по любому из пп.1-16.
19. 19. Комбинация пар праймеров, включающая пары праймеров для амплификации одной или более чем одной нуклеиновых кислот, выбранных из а), Ь), с), о), р), ср и ΐ), указанных в п.1, и пары праймеров для амплификации всех нуклеиновых кислот б)-1), указанных в п.1, где структуры праймеров определены в п.1.
20. 20. Комбинация пар праймеров по п.19, дополнительно содержащая одну или несколько пар праймеров, определенных в п.12.
21. 21. Комбинация пар праймеров по п.19 или 20, дополнительно содержащая пару праймеров для амплификации, характерной для растений нуклеиновой кислоты, определенной в п.7
22. 22. Комбинация продуктов амплификации, используемая в качестве положительного контроля и/или калибратора в способе по любому из пп.1-17, содержащая продукты амплификации одной или более чем одной нуклеиновых кислот, выбранных из а), Ь), с), о), р), ср и ΐ), указанных в п.1, и продукты амплификации всех нуклеиновых кислот б)-р, указанных в п.1, где указанные продукты амплификации получены с использованием пар праймеров, определенных в п.1, где указанные продукты амплификации выбраны из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:35, 8ЕЦ ГО N0:37, 8ЕО ГО Ш:38, 8ЕО ГО Ш:39, 8ЕО ГО Ш:40, 8ЕО ГО Ш:53, 8ЕО ГО ^:54, 8ЕО ГО Ш:55, 8ЕО ГО Ш:52, 8ЕО ГО Ш:70, 8ЕО ГО Ш:71, 8ЕО ГО Ш:72, 8ЕО ГО Ш:76, 8ЕО ГО Ш:77, 8ЕО ГО Ш:78, 8ЕО ГО Ш:73, 8ЕО ГО Ш:74 и 8ЕО ГО Ш:75.
23. 23. Комбинация продуктов амплификации по п.22, дополнительно содержащая продукты амплификации, полученные с использованием пар праймеров, определенных в п.12, где указанные продукты амплификации выбраны из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО NΟ:34, 8ЕЦ ГО NΟ:36, 8ЕЦ ГО NΟ:43, 8ЕЦ ГО Ш:44, 8ЕО ГО Ш:45, 8ЕО ГО Ш:46, 8ЕО ГО Ш:32 и 8ЕО ГО Ш:33.
24. 24. Комбинация продуктов амплификации по любому из пп.22 или 23, дополнительно содержащая продукт амиплификации, характерной для растений нуклеиновой кислоты, полученный с использованием пары праймеров, определенной в п.7, где указанные продукты амплификации выбраны из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:41 из 8ЕЦ ГО NΟ:42.

    - 62 024233
25. 25. Комбинация рекомбинантных векторов и плазмид, содержащих комбинацию продуктов амплификации по п.20, используемая в качестве положительного контроля и/или калибратора в способе по любому из пп.1-17.
26. 26. Комбинация рекомбинантных микроорганизмов, трансформированных комбинацией векторов и/или плазмид по п.25, используемая в качестве положительного контроля и/или калибратора в способе по любому из пп.1-17.
27. 27. Комбинация рекомбинантных микроорганизмов по п.26, включающая рекомбинантные Е. соН, выбранные из группы, включающей ΒССΜ/^ΜΒР 5452, ΒССΜ/^ΜΒР 5453, ΒССΜ/^ΜΒР 5454, ΒССΜ/^ΜΒР 5455, ΒССΜ/^ΜΒР 5456, ΒССΜ/^ΜΒР 5457, ΒССΜ/^ΜΒР 5458, ΒССΜ/^ΜΒР 5459, ΒССΜ/^ΜΒР 5460, ΒССΜ/^ΜΒР 5451, ΒССΜ/^ΜΒР 5587, ΒССΜ/^ΜΒР 5588, ΒССΜ/^ΜΒР 5589 и ΒССΜ/^ΜΒР 5590.
28. 28. Комбинация рекомбинантных плазмид по п.25, включающая выделенные рекомбинантные плазмиды, полученные из рекомбинантных бактерий Е. соН по п.27.
29. 29. Набор для осуществления способа по п.1, содержащий комбинацию пар праймеров согласно п.19 и носитель данных, содержащий инструкции для вычислительного устройства, запрограммированного для осуществления стадии (2) способа по п.1.
30. 30. Набор по п.29, дополнительно содержащий одну или несколько пар праймеров или их вариантов, определенных в п. 12: или пару праймеров или их вариант для амплификации, характерной для растений нуклеиновой кислоты, как определено в п.7: или одну или более нуклеиновых кислот, подходящих в качестве положительного контроля для амплификации нуклеиновых кислот в соответствии с п.1: или комбинацию рекомбинантных бактерий Е. сой, определенную в п.27, комбинацию рекомбинантных микроорганизмов, определенную в п.26, комбинацию выделенных рекомбинантных плазмид по п.28 или их комбинацию.
31. 31. Набор для осуществления способа по п.1, содержащий комбинацию пар праймеров согласно п.19 и одну или более нуклеиновых кислот, подходящих в качестве положительного контроля для амплификации нуклеиновых кислот в соответствии с п.1.