CN103468804B - 米或米制品中是否含转基因水稻llrice62检测法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，以米或米制品为待测样品，以转基因稻米LLRICE62为阳性对照，以非转基因稻米或者非LLRICE62的转基因稻米为阴性对照；包括以下步骤：1）、设计耐除草剂转基因水稻LLRICE62的对应引物组；2）、提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；3）、将步骤2）所得的待测样品的DNA、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA分别利用步骤1）所得的引物组设置PCR反应体系进行扩增；4）、利用步骤3）所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液进行比对，从而判定米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62。

Description

米或米制品中是否含转基因水稻LLRICE62检测法

技术领域

本发明属于耐除草剂转基因水稻LLRICE62的检测技术，尤其涉及耐除草剂转基因水稻LLRICE62的现场定性检测技术，具体为米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法。

背景技术

近年来，世界上转基因生物研发工作进展非常迅速，2012年全球转基因作物种植面积达到1.703亿公顷，比2011年的1.6亿公顷增长了6%，较1996年增长了100倍。随着转基因作物已被快速、持续地用于商业化生产，无论在发达国家还是发展中国家都产生了巨大的经济、能源、卫生及社会效益。但同时，转基因作物及其产品可能带来的环境、健康等问题也已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。为此，许多国家相继制定了对转基因生物的管理法规，对进口转基因食品进行严格管理，要求出具转基因成分的检测报告，对转基因食品采用标识制度。挪威是第一个要求对转基因产品进行含量标识的国家，他的标识低限为2％；欧盟的限量标识低限为1％。我国于2001年5月23日颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，2001年9月5日开始实施《出入境转基因产品检验检疫管理办法》，2002年3月20日开始贯彻实行《农业转基因生物标识管理办法》。

随着各个国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度管理的加强，转基因检测的对象已经从原来的大豆、小麦、大米、土豆等农产品扩展到许多深加工的产品，如食用油脂、米制品、酱油、豆奶、酒、饲料等等，而这其中米制品一直是欧盟和其他一些国家关注的重点。2006年9月以来，已有法国、德国、意大利、奥地利和日本等7个国家因为转基因大米污染对我国出口米制品采取了拒绝入境或撤架、召回等措施。欧盟在2008年4月15日起对中国出口的大米及其米制品采取保障性措施，要求由中方认可的实验室对出口产品实施检测，并出具统一的卫生证书才能出口。而另一方面，我国对转基因作物培育的投入也逐年增加，近年来具有良好生长性能的转基因新品种不断涌现，2009年农业部审放了转基因耐除草剂水稻“Bt汕优63”等三个转基因农作物的生产应用安全证书，这标志着我国极有可能成为世界上第一个商业化种植转基因水稻的国家。如何快速便捷的检测转基因大米成分已成为了当前热门的研究课题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种便捷的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，采用该方法无需复杂的仪器，甚至用肉眼即可辨识检测结果，从而准确判断待测样品是否被转基因水稻LLRICE62污染。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，以米或米制品为待测样品，以转基因稻米LLRICE62为阳性对照，以非转基因稻米（较佳）或者非LLRICE62的转基因稻米为阴性对照；包括以下步骤：

1）、设计引物：

设计耐除草剂转基因水稻LLRICE62的对应引物组；每套引物组中由4条引物组成；4条引物中2条为内引物，另2条为外引物；

2）、提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA：

3）、核酸的恒温扩增：

将步骤2）所得的待测样品的DNA、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA分别利用步骤1）所得的每套引物组进行以下操作：

①、步骤1）所得的每套引物组中的4条引物用DEPC处理水进行溶解稀释；然后用于下述的PCR反应体系；

②、设置扩增反应体系：

PCR反应体系

所述每条内引物在PCR反应体系中的浓度为7.5~8.5μmol/L （较佳为8μmol/L）；

所述每条外引物在PCR反应体系中的浓度为0.8~1.2μmol/L （较佳为1μmol/L）；

从而分别得待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系；

③、所述待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系分别进行以下操作：

于60~65℃扩增反应30~60分钟；

从而分别得待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液；

4）、结果的判读：

步骤3）所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液分别按照以下任一方式进行操作：

方式①、

一）、将步骤3）所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液在可见光下直接用肉眼观察，比较待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液的混浊程度；

当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液为白色混浊时，进入步骤二）；否则进入步骤三）；

二）、进行样品的判定：

当待测样品反应液为澄清透明时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因水稻LLRICE62成分；

当待测样品反应液为白色混浊时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因水稻LLRICE62成分；

三）、检测失败，重新返回至步骤一）；

方式②、

一）、将步骤3）所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液在紫外灯照射的状态下用肉眼观察，比较待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液的混浊程度；

当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液出现肉眼可见（明显可见）的荧光时，进入步骤二），否则进入步骤三）；

二）、进行样品的判定：

当待测样品反应液为澄清透明时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因水稻LLRICE62成分；

当待测样品反应液出现肉眼可见（明显可见）的荧光时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因水稻LLRICE62成分；

三）、检测失败，重新返回至步骤一）；

方式③、

一）、将步骤3）中的②所得的待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系直接置于恒温扩增仪（例如为GENIE Ⅱ或等同效果不同品牌型号仪器）中于60~65℃（较佳为62℃）进行扩增反应， 观察实时PCR结果，即，实时比较扩增反应所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照液的荧光（浊度）信号强度；

当同时满足阴性对照反应液未出现荧光（浊度）信号、且阳性对照反应液出现荧光（浊度）信号，进入步骤二），否则进入步骤三）；

二）、进行样品的判定：

当待测样品反应液未出现荧光（浊度）信号时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因大米LLRICE62成分；

当待测样品反应液出现荧光（浊度）信号时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因大米LLRICE62成分；

三）、检测失败，重新返回至步骤一）。

备注说明：一般5~8分钟后，即可开始实时观测PCR结果。整个扩增反应的时间设定为30分钟，即，30分钟后步骤一）的条件仍然无法满足时，就进入步骤三），即判定为检测失败。

备注说明：在本发明中，阴性对照以选择非转基因稻米为较佳，非转基因大米例如为秀水11、明恢86、明恢63、籼优63等等。

作为本发明的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法的改进：

耐除草剂转基因水稻LLRICE62引物组中的4条引物为：

LLRICE62- FIP：AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGGGTGCATCGTCTATCAAT

LLRICE62- BIP：GGATGTGCTGCAAGGCGATTTACAACGTCGTGACTGG

LLRICE62-F3： TGTAACACGCACACTCAC

LLRICE62-B3：CTCCATGGGAATTCACTGG；

LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP为内引物，所述LLRICE62-F3、LLRICE62-B3为外引物。

作为本发明的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法的进一步改进：

步骤3）的①中：所述4条引物用DEPC处理水进行溶解稀释至浓度为20μmol/L~200μmol/L。

作为本发明的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法的进一步改进：

步骤3）的②中：

引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP在PCR反应体系中的浓度均为8μmol/L；

引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度成均为1μmol/L。

作为本发明的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法的进一步改进：步骤3）的③中：于62℃扩增反应30min。

作为本发明的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法的进一步改进：

步骤2）中选用CTAB分步离心法或者DNA提取试剂盒进行DNA的提取。

在本发明中，提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA为常规技术。例如可使用CTAB分步离心法进行DNA提取（例如已经公开发表于中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《SN/T 2584-2010 水稻及其产品中转基因成分检测实时荧光PCR法》），或使用性能等同或超过本方法的DNA提取试剂盒（如Promega DNA提取试剂盒等），当采用商业试剂盒时，则操作步骤参照试剂盒说明书进行。

鉴于目前食品安全领域对食品安全检测技术和产品的迫切需求，本发明人基于核酸恒温扩增技术，开发了一款可用于耐除草剂转基因水稻LLRICE62的快速、便捷的检测方法。本发明属于基于核酸的食品安全检测领域，不同于传统的核酸扩增，检测效率高，并且具有无须复杂仪器，肉眼即可辨识结果，可以适合在普通家庭使用的优点；该方法还具有很强的前瞻性，可以方便的增加所需要检测的其他转基因品种。

本发明所述的引物可委托英俊公司制备，HPLC纯化。

本发明的步骤3）中，扩增反应可在PCR仪中进行，也可以直接在水浴锅，甚至是保温效果较好的保温杯中进行，因此适合普通消费者进行操作。

本发明的步骤3）的设置扩增反应体系（PCR反应体系）中：2×缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光染料均可通过市购的方式获得，例如可从北京蓝谱生物科技有限公司购得，货号：LMP221（包括了2×缓冲液和Bst DNA聚合酶） 与LMP204（荧光染料）。

在本发明的步骤4）的方式①中：当阴性对照反应液不是澄清透明（即阴性对照有扩增产物），或者阳性对照反应液不是白色混浊（即，阳性对照无扩增产物）时，说明检测失败，需要重新进行检测。

在本发明的步骤4）的方式②中：当阴性对照反应液不是澄清透明（即阴性对照有扩增产物），或者阳性对照的反应液没有出现肉眼可见的荧光（即，阳性对照无扩增产物）时，说明检测失败，需要重新进行检测。

本发明的方法是一种基于核酸恒温扩增的转基因检测方法，该检测方法具有步骤简洁、无须复杂的仪器、易于操作、可利用肉眼辨识实验结果的优点，非常具有开发成普通产品的潜力，能让普通消费者定性检测大米及米制品是否含有转基因水稻LLRICE62成分。

综上所述，本发明具有以下的优点：

1、检测时间短，包括样品前处理，总计1~2小时即可完成。

2、可适合普通消费者在家庭中使用，无须复杂的仪器，只要一个恒温的水杯，用肉眼即可辨识实验结果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是利用本方法检测8种不同的大米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62成分，用肉眼直接观察的示意图；

图2是利用本方法检测8种不同的大米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62成分，在紫外灯照射下再用肉眼观察的示意图；

图3是GENIE II 实时荧光反应扩增结果图；

图中：N代表阴性对照，P代表阳性对照，1代表转基因大米Bt63，2代表转基因大米科峰6号，3代表转基因大米克螟稻，4代表转基因大米LLRICE601，5代表市购的米粉，6代表转基因大米LLRICE62。

具体实施方式

以下实施例1中所用到的6份样品，预先按照传统的荧光定量PCR方法进行检测（检测方法参考SN/T 2584-2010），具体检测结果如表1所示。

表1、荧光定量PCR方法检测结果

备注说明：

1、阳性对照（positive）为LLRICE62转基因水稻标准品；

2、阴性对照为非转基因稻米秀水11。

实施例1、一种米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，以上述样品1~6作为待测样品，以LLRICE62转基因水稻标准品为阳性对照，以非转基因稻米秀水11为阴性对照；依次进行以下步骤：

1）、设计引物：

设计耐除草剂转基因水稻LLRICE62的对应引物组一套；该套引物组中含有4条引物；

具体为：

LLRICE62- FIP：AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGGGTGCATCGTCTATCAAT，

LLRICE62- BIP：GGATGTGCTGCAAGGCGATTTACAACGTCGTGACTGG，

LLRICE62-F3： TGTAACACGCACACTCAC，

LLRICE62-B3：CTCCATGGGAATTCACTGG。

备注说明： LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP为内引物， LLRICE62-F3、LLRICE62-B3为外引物。

2）、待测大米或米制品的前处理，依次进行以下步骤：

使用CTAB分步离心法进行DNA提取，

从而提取获得待测样品（即样品1~6）的DNA、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA。

3）、核酸的恒温扩增：

将步骤2）所得的待测样品的DNA（即，样品1~6的DNA）、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA分别利用步骤1）的引物组进行以下操作：

①、引物的溶解稀释：

引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP用DEPC处理水稀释至浓度成100μmol/L；

引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3用DEPC处理水稀释至浓度成50μmol/L。

以上述稀释后的引物用于下述步骤的设置扩增反应体系。

②、设置扩增反应体系：

表2、 PCR反应体系

即，引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP在PCR反应体系中的浓度均为8μM；

引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度成均为1μM。

③、所述待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系分别进行以下操作：

于62℃扩增反应30min。

从而分别得待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液。

4）、结果的判读：

步骤3）所得的待测样品反应液（即样品1~6的反应液）、阳性对照反应液、阴性对照反应液分别按照以下任一方式进行操作：

方式①、

一）、将步骤3）所得的待测样品反应液、阴性对照反应液和阳性对照反应液在可见光下直接用肉眼观察，比较待测样品反应液、阴性对照反应液和阳性对照反应液的混浊程度；

当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液为白色混浊时，进入步骤二），否则进入步骤三）；

二）、进行样品的判定：

当待测样品反应液为澄清透明时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测大米或米制品中不含有转基因水稻LLRICE62成分；

当待测样品反应液为白色混浊时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因水稻LLRICE62成分；

三）、检测失败，需要重新进行检测；即，重新返回至步骤一）。

具体结果如表3所示。

表3 可见光下检测结果

	检测结果
		阳性对照（positive）	白色混浊
阴性对照(negative)	透明澄清
		转基因大米Bt63（1）	透明澄清
转基因大米科峰6号（2）	透明澄清
		转基因大米克螟稻（3）	透明澄清
转基因大米LLRICE601（4）	透明澄清
		米粉（5）	透明澄清
转基因大米LLRICE62（6）	白色混浊

注：对检测结果进行拍照，如图1所述。

从表3中我们可以得知：在可见光下，结果显示如下：

阴性对照透明且澄清，阳性对照混浊；待测样品的检测结果同表3。

方式②、

一）、将步骤3）所得的待测样品反应体系、阴性对照反应液、阳性对照反应液在紫外灯照射的状态下用肉眼观察，比较待测样品反应液、阴性对照反应液和阳性对照反应液的混浊程度；

当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液出现肉眼明显可见的荧光时，进入步骤二），否则进入步骤三）；

二）、进行样品的判定：

当待测样品反应液为澄清透明时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因水稻LLRICE62成分；

当待测样品反应液出现肉眼明显可见的荧光时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因水稻LLRICE62成分；

三）、检测失败，需要重新进行检测；即，重新返回至步骤一）。

具体结果如表4所示。

表4 紫外光下检测结果

注：对检测结果进行拍照，如图2所述。

从表4中我们可以得知：在紫外灯下拍照，结果显示如下：

阴性对照透明且澄清，阳性对照有肉眼明显可见的荧光；待测样品的检测结果同表4。

方式③、

一）、将步骤3）中的②所得的待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系直接置于恒温扩增仪（为GENIE Ⅱ）中于62℃进行扩增反应， 观察实时PCR结果，即，6分钟后就能开始实时比较扩增反应所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照液的荧光（浊度）信号强度；

当同时满足阴性对照反应液未出现荧光（浊度）信号、且阳性对照反应液出现荧光（浊度）信号，进入步骤二），否则进入步骤三）；

二）、进行样品的判定：

当待测样品反应液未出现荧光（浊度）信号时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因大米LLRICE62成分；

当待测样品反应液出现荧光（浊度）信号时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因大米LLRICE62成分；

三）、检测失败，需要重新进行检测，即，重新返回至步骤一）。

备注说明：一般6分钟后，即可开始实时观测PCR结果。整个扩增反应的时间设定为30分钟，即，扩增反应30分钟后步骤一）的条件仍然无法满足时，就进入步骤三），即判定为检测失败。

具体结果如表5所示。

表5 恒温扩增仪下检测结果

备注说明：21:14代表21分钟14秒。以下类同。

注：对检测结果进行拍照，如图3所述。

从表5中我们可以得知：在恒温扩增仪内进行扩增反应，结果显示如下：

阴性对照未出现荧光（浊度）信号，阳性对照出现荧光（浊度）信号；待测样品的检测结果同表5。

综上所述，本发明的检测结果与传统的荧光定量PCR方法相比，检测一致率为100%。

实施例2、将转基因水稻LLRICE62所得的大米，按照1:1的质量比与以下任意一种大米相混合：转基因大米Bt63、转基因大米科峰6号、非转基因大米秀水11、非转基因大米明恢86；所得混合物命名为待测样品1、待测样品2、待测样品3、待测样品4。

以非转基因大米秀水11、明恢86、明恢63、籼优63为待测样品5、待测样品6、待测样品7、待测样品8。

将上述待测样品1~ 8按照实施例1所述的方法（即，替代实施例1所述的待测样品）进行检测（需用步骤4）中的方式①），所得结果如表6所述：

表6 可见光下检测结果

	检测结果
		阳性对照（positive）	白色混浊
阴性对照(negative)	透明澄清
		待测样品1（Bt63+ LLRICE62）	白色混浊
待测样品2（科峰6号+ LLRICE62）	白色混浊
		待测样品3（大米秀水11+ LLRICE62）	白色混浊
待测样品4（明恢86+ LLRICE62）	白色混浊
		待测样品5（秀水11）	透明澄清
待测样品6（明恢86）	透明澄清
		待测样品7（明恢63）	透明澄清
待测样品8（籼优63）	透明澄清

对比例1-1、

改变实施例1中的引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP的用量，从而使“引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP在PCR反应体系中的浓度均为8μM”改成“引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP引物在PCR反应体系中的浓度均为1μM”；其余同实施例1。即，LLRICE62-F3、LLRICE62-B3的用量及在PCR反应体系中的浓度均同实施例1。按照实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

对比例1-2、

改变实施例1中的引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP的用量，从而使“引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP在PCR反应体系中的浓度均为8μM”改成“引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP引物在PCR反应体系中的浓度均为4μM”；其余同实施例1。即，LLRICE62-F3、LLRICE62-B3的用量及在PCR反应体系中的浓度均同实施例1。按照实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

对比例1-3、

改变实施例1中的引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP的用量，从而使“引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP在PCR反应体系中的浓度均为8μM”改成“引物LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP引物在PCR反应体系中的浓度均为10μM”；其余同实施例1。即，LLRICE62-F3、LLRICE62-B3的用量及在PCR反应体系中的浓度均同实施例1。按照实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

上述对比例1-1~对比例1-3的结果如表7所示。

表7 恒温扩增仪下检测结果

结论：根据表7与表5的对比，我们得知：

当FIP/BIP引物浓度为1μM（对比例1-1）时，则在设定的反应时间内未出现荧光信号，该体系不可用。

当FIP/BIP引物浓度为4μM（对比例1-2）时，扩增效率明显降低，即，出现荧光信号时间延迟。

当FIP/BIP引物浓度为10μM（对比例1-3）时，阴性对照，转基因大米Bt63（1），转基因大米科峰6号（2）同时出现荧光信号，该体系不可用。

综上所述，该反应体系中，FIP/BIP引物浓度为8μM（如实施例1所述）为最优反应体系。

对比例2-1、

改变实施例1中的引物的LLRICE62-F3、LLRICE62-B3用量，从而使“引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度均为1μM”改成“引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度均为4μM”；其余同实施例1。即，LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP的用量及在PCR反应体系中的浓度均同实施例1。按照实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

对比例2-2、

改变实施例1中的引物的LLRICE62-F3、LLRICE62-B3用量，从而使“引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度均为1μM”改成“引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度均为8μM”；其余同实施例1。即，LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP的用量及在PCR反应体系中的浓度均同实施例1。按照实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

对比例2-3、

改变实施例1中的引物的LLRICE62-F3、LLRICE62-B3用量，从而使“引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度均为1μM”改成“引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度均为0.5μM”；其余同实施例1。即，LLRICE62- FIP、LLRICE62- BIP的用量及在PCR反应体系中的浓度均同实施例1。按照实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

上述对比例2-1~对比例2-3的结果如表8所示。

表8 恒温扩增仪下检测结果

结论：根据表8与表5的对比，我们得知：

当引物F3/B3在PCR反应体系中的浓度均为4μM、8μM扩增反应皆出现假阳性信号，该2体系均不可用。

当引物F3/B3在PCR反应体系中的浓度0.5μM时，荧光信号出现时间延迟（说明反应效率偏低），该体系效果不佳。

对比例3-1、取实施例1阳性对照进行扩增反应，将实施例1中的“于62℃扩增反应30min”改成“于61、62、63、64、65、66、67、68℃扩增反应30min”，其余完全同实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

表9 恒温扩增仪下检测结果

反应温度	检测结果
		61℃	21:54时出现荧光信号
62℃	21:14时出现荧光信号
		63℃	22:27时出现荧光信号
64℃	23:15时出现荧光信号
		65℃	23:24时出现荧光信号
66℃	22:54时出现荧光信号
		67℃	24:13时出现荧光信号
68℃	25:10时出现荧光信号

上述实验结果表明：扩增反应温度为62℃时，扩增反应效率最高，为最优反应条件。

对比例4-1、将实施例1中的“于62℃扩增、反应时间为30min”改成“于62℃扩增，反应时间为60min”；其余完全同实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

表10 恒温扩增仪下检测结果

上述实验结果表明：当反应时间过长时易出现假阳性，综合判断反应时间在30min时，实验结果可信度较高。

对比例4-2、将实施例1中的“于62℃扩增、反应时间为30min”改成“于62℃扩增，反应时间为20min”；其余完全同实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

表11 恒温扩增仪下检测结果

上述实验结果表明：阳性对照、6号样品均未出现阳性扩增，该反应条件不可用。

对比例5、

将2条内引物改成：

ATTGATAGACGATGCACCCGTTCATATGTATGTAACACGCACAC，

TAAATAATCGGTGCGGGCCTCTTAATCGCCTTGCAGCAC；

内引物在PCR反应体系中的浓度仍均为8μM；

将2条外引物改成：

CGTTTGTTGTGAGAAGTTGG，

TTACAACGTCGTGACTGG；

外引物在PCR反应体系中的浓度仍均为1μM。

其余完全同实施例1的方式③的直接置于恒温扩增仪中进行反应，观察实时PCR结果。

表12 恒温扩增仪下检测结果

上述实验结果表明：该引物会导致出现假阳性，不可用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江省检验检疫科学技术研究院

 

<120> 米或米制品中是否含转基因水稻LLRICE62检测法

 

<160> 4

 

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物LLRICE62- FIP

 

<400> 1

agctggcgta atagcgaaga ggggtgcatc gtctatcaat               40

 

 

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物LLRICE62- BIP

 

<400> 2

ggatgtgctg caaggcgatt tacaacgtcg tgactgg                   37

 

 

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物LLRICE62-F3

 

<400> 3

tgtaacacgc acactcac                           18

 

 

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物LLRICE62-B3

 

<400> 4

ctccatggga attcactgg                19

 

 

 

Claims (4)

1.米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，其特征是：以米或米制品为待测样品，以转基因稻米LLRICE62为阳性对照，以非转基因稻米或者非LLRICE62的转基因稻米为阴性对照；包括以下步骤：

1)、设计引物：

设计耐除草剂转基因水稻LLRICE62的对应引物组；每套引物组由4条引物组成；4条引物中2条为内引物，另2条为外引物；

LLRICE62-FIP：AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGGGTGCATCGTCTATCAAT

LLRICE62-BIP：GGATGTGCTGCAAGGCGATTTACAACGTCGTGACTGG

LLRICE62-F3：TGTAACACGCACACTCAC

LLRICE62-B3：CTCCATGGGAATTCACTGG；

所述LLRICE62-FIP、LLRICE62-BIP为内引物，所述LLRICE62-F3、LLRICE62-B3为外引物；

2)、提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；

3)、核酸的恒温扩增：

将步骤2)所得的待测样品的DNA、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA分别利用步骤1)所得的每套引物组进行以下操作：

①、步骤1)所得的每套引物组中的4条引物用DEPC处理水进行溶解稀释；

②、设置扩增反应体系：

PCR反应体系

所述每条内引物在PCR反应体系中的浓度为7.5～8.5μmol/L；

所述每条外引物在PCR反应体系中的浓度为0.8～1.2μmol/L；

从而分别得待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系；

③、所述待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系分别进行以下操作：

于62℃扩增反应30min；

从而分别得待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液；

4)、结果的判读：

步骤3)所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液分别按照以下任一方式进行操作：

方式①、

一)、将步骤3)所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液在可见光下直接用肉眼观察，比较待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液的混浊程度；

当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液为白色混浊时，进入步骤二)；否则进入步骤三)；

二)、进行样品的判定：

当待测样品反应液为澄清透明时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因水稻LLRICE62成分；

当待测样品反应液为白色混浊时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因水稻LLRICE62成分；

三)、检测失败，重新返回至步骤一)；

方式②、

一)、将步骤3)所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液在紫外灯照射的状态下用肉眼观察，比较待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液的混浊程度；

当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液出现肉眼可见的荧光时，进入步骤二)，否则进入步骤三)；

二)、进行样品的判定：

当待测样品反应液为澄清透明时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因水稻LLRICE62成分；

当待测样品反应液出现肉眼可见的荧光时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因水稻LLRICE62成分；

三)、检测失败，重新返回至步骤一)；

方式③、

一)、将步骤3)中的②所得的待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系直接置于恒温扩增仪中于60～65℃进行扩增反应，观察实时PCR结果，即，实时比较扩增反应所得的待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照液的荧光信号强度；

当同时满足阴性对照反应液未出现荧光信号、且阳性对照反应液出现荧光信号，进入步骤二)，否则进入步骤三)；

二)、进行样品的判定：

当待测样品反应液未出现荧光信号时，则待测样品的检测结果为阴性；即，待测样品中不含有转基因大米LLRICE62成分；

当待测样品反应液出现荧光信号时，则待测样品的检测结果为阳性；即，待测样品中含有转基因大米LLRICE62成分；

三)、检测失败，重新返回至步骤一)。

2.根据权利要求1所述的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，其特征是：

所述步骤3)的①中：所述4条引物用DEPC处理水进行溶解稀释至浓度为20μmol/L～200μmol/L。

3.根据权利要求2所述的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，其特征是：

所述步骤3)的②中：

引物LLRICE62-FIP、LLRICE62-BIP在PCR反应体系中的浓度均为8μmol/L；

引物LLRICE62-F3、LLRICE62-B3在PCR反应体系中的浓度成均为1μmol/L。

4.根据权利要求1～3中任一所述的米或米制品中是否含有转基因水稻LLRICE62的检测法，其特征是：

所述步骤2)中选用CTAB分步离心法或者DNA提取试剂盒进行DNA的提取。