ES2363374T3 - Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de compuestos hidroxiceto. - Google Patents

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de compuestos hidroxiceto. Download PDF

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Abstract

Proceso para la reducción enzimática enantioselectiva de una hidroxicetona de fórmula general I **Fórmula** en donde R1 = alquilo C1-C6 y R2 = -Cl, -CN, -OH, -H o alquilo C1-C6, a un diol quiral de fórmula general II **Fórmula** en el que R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I, en donde la hidroxicetona se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un cofactor, caracterizado en que, la oxidorreductasa a) muestra una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 50% de los aminoácidos son idénticos a los de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705, b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, o c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que en condiciones rigurosas hibrida con SEQ ID NO: 20 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.

Description

La invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de una hidroxicetona de
imagen1
en la que R1 = alquilo C1-C6 y R2 = -Cl, -CN, -OH, -H o alquilo C1-C6, a un diol quiral de fórmula general II
imagen2
10 en la que R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I, en donde la hidroxicetona se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un cofactor.
Los dioles quirales de la fórmula general II son compuestos intermedios importantes en la producción de medicamentos, en particular en la producción de inhibidores de HMG-CoA-reductasa. Tales dioles quirales son, por 15 ejemplo, (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo, (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo
o (5S,3R)-3,5,6-trihidroxihenaoato de terc-butilo.
Los dioles de esta clase se producen en particular mediante la reducción enantioselectiva de las correspondientes hidroxicetonas de fórmula I, como por ejemplo, (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, (5S)-6-cloro-5
20 hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo o (5S)-5,6-dihidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo. La reducción química catalizada tiene al mismo tiempo el inconveniente que por una parte, debido a las duras condiciones de reacción puede producir subproductos, y por otra parte produce excesos enantioméricos o diastereoméricos insuficientes y técnicamente solo se puede realizar de forma muy laboriosa.
25 Por este motivo desde hace tiempo se hacen esfuerzos para desarrollar procedimientos biocatalíticos, que permitan la reducción enantioselectiva de las hidroxicetonas mencionadas. Los procedimientos biocatalíticos normalmente operan en condiciones moderadas, por lo que se espera que hagan posible la reducción de los derivados 5-hidroxi3-oxohexanoato, que de todos modos son bastante inestables, sin la formación de subproductos adicionales. Sin embargo, hasta ahora no se ha podido encontrar ningún biocatalizador apropiado con el que sea posible la
30 reducción enzimática de los derivados 5-hidroxi-3-oxohexanoato mencionados de forma efectiva y con enzimas aisladas.
La patente de EE UU 6.001.615 y la solicitud internacional de patente WO 01/85975 A1, por ejemplo, describen la reducción de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo o (5S)-5,6-dihidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo,
35 con diferentes levaduras de los géneros Beauvaria, Pichia, Candida, Kluyveromyces y Toruplaspora. Las conversiones tienen lugar en efecto solo con células enteras de las cepas salvajes y por tanto solo se pudieron llevar a cabo a concentraciones muy bajas, muy por debajo del 5%. Las secuencias de la enzima y ADN responsables de las conversiones no se han podido identificar hasta la fecha.
40 Además se describen conversiones microbianas de compuestos estructuralmente similares en el documento EP 0 569 998 B1. En el mismo se pudo purificar incluso una enzima dependiente de NADH de Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305, que también se usa aislada junto con glucosa deshidrogenasa para la regeneración de coenzimas. En el proceso descrito se usa el sustrato en concentraciones del 1% y se alcanza un “número total de recambio” (“total turn over number”) de NADH de solo 10. No se muestra un procedimiento industrial aplicable.
45 En la patente de EE UU 6.645.746 B1 se divulga una secuencia de aminoácidos de Candida magnoliae que se puede usar para reducir (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5S)-6-cloro-3,5dihidroxihexanoato de terc-butilo con ayuda de NADPH. En la descripción de este documento se usa preferiblemente la enzima coexpresada con glucosa deshidrogenasa de Bacillus megaterium, en donde la regeneración del cofactor
50 NADPH se produce con ayuda de la glucosa deshidrogenasa y con glucosa como cosustrato.
El documento WO 2004/111083 A describe un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de cetonas, en particular ésteres de 2- y 3-oxoácidos, estando catalizada la reacción por una oxidorreductasa de Pichia capsulata.
55 En el documento WO 2005/108593 A se describe un procedimiento para la producción de 1-butanol, en el que se reduce 2-butanona con una carbonilreductasa, por ejemplo de Candida parapsilosis, y una coenzima en un sistema de dos fases.
Es el objeto de la invención proporcionar un procedimiento que permite la producción económica de dioles enantioméricamente puros de fórmula general II con mayor rendimiento y mayor pureza enantiomérica sin subproductos.
El objeto anteriormente mencionado se soluciona según la invención mediante un proceso del tipo mencionado al principio según el cual la oxidorreductasa
a) muestra una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 50% de los aminoácidos son idénticos a los de la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la
secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705,
b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, o
c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 en condiciones rigurosas.
Se ha encontrado que los polipéptidos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 11 muestran actividad oxidorreductasa y se pueden usar para reducir (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de tercbutilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo con un exceso diastereomérico de >99%. De la misma manera se pueden reducir otras hidroxicetonas de la fórmula general I por medio de las secuencias de aminoácidos SEQ IDNO: 1, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 11.
Además, las oxidorreductasas anteriormente mencionadas tienen la ventaja de que son capaces de regenerar el cofactor oxidado producido en la reducción mediante la reducción de un alcohol secundario. Una ventaja económica particular de la oxidorreductasa mencionada consiste también en que, al contrario que en los procesos de la técnica anterior (documentos US 6.645.746 B y EP 0 569 998 B) no se debe emplear ninguna enzima adicional para la regeneración del cofactor.
Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 2, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 1, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Rubrobacter xylanophilus DSM 9941. Además se ha encontrado que la secuencia de ADN SEQ ID NO: 3 se puede usar para expresar el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en Escherichia.
Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 9, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 8, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Geobacillus thermodenitrificans DSM 465. Además se ha encontrado que la secuencia de ADN SEQ ID NO: 10 se puede usar para expresar el polipéptido de SEQ ID NO: 8 en Escherichia.
Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 12, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 11, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Chloroflexus aurantiacus DSM 635.
Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 15, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 14, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Candida magnoliae CBS 6396.
La presente invención se refiere por tanto a un proceso para la reducción de hidroxicetonas de fórmula general I a dioles de fórmula general II mediante el uso de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, o un polipéptido que muestra una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, esto es, un polipéptido que puede derivar mediante sustitución, inserción, deleción o adición de al menos un aminoácido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705, o mediante el uso de un polipéptido, codificado por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 15 o que está codificado por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEQ ID: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 15 en condiciones rigurosas.
Mediante una secuencia de ácido nucleico que por ejemplo hibrida con SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas, se entiende un polinucleótido que se puede identificar mediante el método de hibridación en colonias, el método de hibridación en placa, método de hibridación Southern o similares, usando SEQ ID NO: 2 como sonda de ADN.
Para este fin se hibrida el polinucleótido inmovilizado en un filtro por ejemplo con SEQ ID NO: 2 en una solución de NaCl 0,7-1 M a 60ºC. La hibridación se llevará cabo como se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o publicaciones similares. A continuación, el filtro se lava con solución SSC de 0,1 a 2 veces a 65ºC, en donde se entiende que una solución SSC de 1 vez es una mezcla que consiste en NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM.
En el proceso según la invención, el polipéptido con la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, o los polipéptidos derivados de estos polipéptidos, respectivamente, se pueden usar completamente purificados, parcialmente purificados o como células que comprenden el polipéptido SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14. Por tanto, las células usadas se pueden suministrar en forma nativa, permeabilizada o lisada. Preferiblemente, el polipéptido con la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, o derivados obtenibles de los mismos, respectivamente, se sobreexpresan en un organismo huésped adecuado tal como, por ejemplo, Escherichia coli, y se usa el polipéptido recombinante para la reducción de la hidroxicetona de fórmula general I.
Por cada kg de compuesto de fórmula I que se va a hacer reaccionar se usan de 5000 a 10 millones U de oxidorreductasa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, o sus respectivos derivados (abiertos hacia arriba). La unidad enzimática 1 U corresponde a tal cantidad de enzima que se requiere para hacer reaccionar 1 µmol de la hidroxicetona de fórmula I por minuto (min).
La reducción enzimática según la invención transcurre en condiciones suaves, de modo que la descomposición de la con frecuencia inestable hidroxicetona y por tanto la formación de subproductos no deseados se puede evitar en gran parte. El proceso según la invención muestra un tiempo de vida alto y una pureza diastereomérica de normalmente > 99% de los dioles quirales producidos.
Una forma de realización preferida de la invención se caracteriza en que el cofactor usado en el proceso se reduce continuamente con un cosustrato. Preferiblemente, se usa NAD(P)H como cofactor, en donde el NAD(P) formado por la reducción se vuelve a reducir a NAD(P)H por medio del cosustrato.
Como cosustratos se usan preferiblemente alcoholes secundarios, como 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 3pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-heptanol, 2-octanol o ciclohexanol. Según una forma de realización especialmente preferida se usa 2-propanol para la regeneración de la coenzima. La parte de cosustrato para la regeneración puede variar del 5 al 95% en volumen, referido al volumen total.
La regeneración coenzimática se efectúa, por ejemplo, asimismo a través del polipéptido con la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14.
La hidroxicetona de fórmula general I se usa en un proceso según la invención preferiblemente en una cantidad del 5% en peso hasta el 50% en peso (de 50 g/l hasta 50 g/l), referido al volumen total, preferiblemente del 8% en peso hasta el 40% en peso, especialmente del 10% en peso hasta el 25% en peso.
Una forma de realización especialmente preferida se caracteriza en que como la hidroxicetona de fórmula general (I) se usa (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo o (5S)-5,6-dihidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo.
Preferiblemente el proceso según la invención se lleva a cabo en un sistema bifásico acuoso orgánico.
La parte acuosa de la mezcla de reacción, en la que transcurre la reducción enzimática, comprende preferiblemente un tampón, por ejemplo, tampón fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanolamina, con un valor de pH de 5 a 10, preferiblemente un pH de 6 a 9. El tampón puede comprender además iones para estabilizar o activar la enzima, como por ejemplo iones de zinc o iones de magnesio.
La temperatura varía durante la realización del proceso según la invención de forma conveniente desde alrededor de 10ºC hasta 70ºC, preferiblemente de 20ºC a 45ºC.
En una forma de realización más preferida del proceso según la invención, la conversión enzimática se lleva a cabo en presencia de un disolvente orgánico no miscible con agua o solo miscible a un grado limitado. Este disolvente es, por ejemplo, un dialquil(C1-C6)éter simétrico o asimétrico, un alcano o cicloalcano de cadena lineal o ramificado o un alcohol secundario insoluble en agua, que al mismo tiempo representa el cosustrato. Los disolventes orgánicos preferidos son dietiléter, terc-butilmetil éter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de butilo, heptano, hexano, 2-octanol, 2-heptanol, 4-metil-2-pentanol y ciclohexanol. En el caso de los alcoholes secundarios mencionados en último lugar, el disolvente también puede servir al mismo tiempo como cosustrato para la regeneración del cofactor.
La mezcla de reacción consiste en, si se usan disolventes o cosustratos insolubles en agua, respectivamente, una fase acuosa y una orgánica. La hidroxicetona se reparte según su solubilidad entre la fase orgánica y la acuosa. La fase orgánica tiene en general una proporción del 5 al 95%, preferiblemente del 10 al 90%, referido al volumen total de reacción. Las dos fases líquidas se mezclan preferiblemente de forma mecánica, de modo que se produzca una gran superficie entre ellas. También en esta forma de realización, por ejemplo, el NAD formado por la reducción enzimática, se puede reducir de nuevo a NADH con un cosustrato, como se ha descrito anteriormente.
La concentración del cofactor, en especial NADH o NADPH, respectivamente, en la fase acuosa varía en general de 0,001 mM a 10 mM, en especial de 0,01 mM a 1 mM.
En el proceso según la invención también se puede usar un estabilizador de la oxidorreductasa/deshidrogenasa. Estabilizadores adecuados son por ejemplo, glicerol, sorbitol, 1,4-DL-ditiotreitol (DTT) o dimetilsulfóxido (DMSO).
El proceso según la invención se lleva a cabo, por ejemplo, en un recipiente de reacción cerrado de vidrio o metal. Para ello, se transfieren los componentes individuales en el recipiente de reacción y se agitan en una atmósfera de, por ejemplo, nitrógeno o aire.
Según otra forma de realización posible de la invención, el cosustrato oxidado (por ejemplo, acetona) se puede eliminar continuamente y/o añadir de nuevo el cosustrato (por ejemplo, 2-propanol) continuamente, para desplazar el equilibrio de la reacción en dirección hacia el producto de reacción (diol de fórmula general II).
En una forma de realización adicional la adición de oxidorreductasa según SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14 y/o de cosustrato también se puede efectuar por pasos durante el curso del proceso.
Después de terminar la reducción la mezcla de reacción se procesa. Para ello, la fase acuosa se separa, dado el caso, de la fase orgánica y la fase orgánica que contiene el producto se filtra. La fase acuosa también se puede, si se diera el caso, extraer y procesar adicionalmente como la fase orgánica. Después de ello, el disolvente se evapora de la fase orgánica y se obtiene el diol de fórmula general II como producto crudo. El producto crudo se puede purificar entonces adicionalmente o usar directamente para la síntesis de un producto sucesivo.
A continuación, la invención se explica adicionalmente por medio de ejemplos.
Ejemplo 1
Clonación de una oxidorreductasa de Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
A) Cultivo de Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
Se cultivaron células de Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 en el siguiente medio a 50ºC (pH 7,2) y 140 rpm en un agitador de bacterias: extracto de levadura al 0,1%, triptona al 0,1%, CaSO4 x 2H2O al 0,004%, MgCl2 x 6H2O al 0,02%, ácido nitrilotriacético al 0,01%, 100 ml de tampón fosfato [KH2PO4 5,44 g/l, Na2HPO4 x 12H2O 43 g/l], 500 µl/l de citrato de Fe 0,01 M, 500 µl/l de oligoelementos [H2SO4 500 µl/l, MnSO4 x H2O 2,28 g/l, ZnSO4 x 7H2O 500 mg/l, H3BO3 500 mg, CuSO4 x 5H2O 25 mg/l, Na2MoO4 x 2H2O 25 mg/l, CoCl2 x 6H2O 45 mg/l]. El día 6 del cultivo se separaron las células del medio de cultivo mediante centrifugación y se almacenaron a -80ºC.
B) Amplificación del gen que codifica la oxidorreductasa selectiva
Se extrajo el ADN genómico según el método descrito en “Molecular Cloning” de Manniatis & Sambrook. El ácido nucleico resultante sirvió de molde para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores específicos, que se derivaron de la secuencia génica publicada en la base de datos de NCBI con el número 46106817. Para ello se proporcionó a los cebadores en posición 5’ terminal sitios de corte de restricción para las endonucleasas Nde I y Hind III o Sph I, respectivamente (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO. 7), para una clonación posterior en un vector de expresión.
La amplificación se llevó a cabo en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; por 20 pMol de cebador y 2,5 U de Pfx ADN polimerasa Platinum (Invitrogen)] con 500 ng de ADN genómico y los siguientes ciclos de temperatura:
Ciclo 1: 94ºC, 2 minutos
Ciclo 2 x 30: 94ºC, 15 segundos
54ºC, 30 segundos
68ºC, 60 segundos Ciclo 3: 68ºC, 7 minutos
4ºC, ∞
El producto de PCR resultante con un tamaño de alrededor de 750 pb después de purificación en un gel de agarosa al 1% se sometió a restricción con ayuda de las endonucleasas Nde I y Hind III o Sph I y Hind III, respectivamente y se ligó en el esqueleto del vector pET21a (Novagen) o del vector pQE70 (Qiagen) tratados con las mismas endonucleasas. Después de la transformación de 2 µl de la reacción de ligación en células E. coli Top 10F’ (Invitrogen) se probó la presencia de un inserto de un tamaño de 750 pb en el ADN plasmídico de colonias resistentes a ampicilina por medio de un análisis de restricción con las endonucleasas Nde I y Hind III o Sph I y Hind III, respectivamente. Las preparaciones de plásmido de los clones positivos para el fragmento se sometieron a un análisis de secuencia y por último se transformaron en Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) o E. coli RB791 (reserva genética, Yale), respectivamente.
Ejemplo 2
Expresión eficiente de polipéptido SEQ ID NO: 1 en células de Escherichia coli
Para la expresión eficiente del polipéptido SEQ ID NO: 1 en células de Escherichia coli se usó el ADN codificante de SEQ ID NO: 3 para la clonación en un vector de expresión como molde en una reacción de PCR. Esta secuencia de ADN se diferencia en la región de los primeros 160 pares de bases de la secuencia de ADN anteriormente conocida (SEQ ID NO: 2) en 51 bases. Esta modificación era conservadora y no produjo ningún cambio de la secuencia de aminoácidos.
La amplificación se llevó a cabo en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; por 20 pMol de cebador (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 5) y 2,5 U de Pfx ADN polimerasa Platinum (Invitrogen)] con 50 ng de ADN de SEQ ID NO: 3 como molde y los siguientes ciclos de temperatura:
Ciclo 1: 94ºC, 2 minutos
Ciclo 2 x 30: 94ºC, 40 segundos
56ºC, 30 segundos
68ºC, 60 segundos Ciclo 3: 68ºC, 7 minutos
4ºC, ∞
El producto de PCR resultante con un tamaño de alrededor de 750 pb después de purificación en un gel de agarosa al 1% con ayuda de las endonucleasas Nhe I y Hind III se ligó en el esqueleto del vector pET21a (Novagen) tratado con las mismas endonucleasas. Después de la transformación de 2 µl de la reacción de ligación en células E. coli Top 10F’ (Invitrogen) se probó la presencia de un inserto de un tamaño de 750 pb en el ADN plasmídico de colonias resistentes a ampicilina por medio de un análisis de restricción con las endonucleasas Nhe I y Hind III. Las preparaciones de plásmido de los clones positivos para el fragmento se sometieron a un análisis de secuencia y por último se transformaron en Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen).
Ejemplo 3
Producción de la oxidorreductasa de Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
Se cultivaron Escherichia coli de las cepas BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y RB791 (reserva genética de E. coli, Yale, EE UU), respectivamente, transformadas con la construcción de expresión en medio (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%) con ampicilina (50 µg/ml), hasta que se alcanzó una densidad óptica de 0,5 medida a 550 nm. La expresión de proteína recombinante se indujo mediante la adición de isopropiltiogalactósido (IPTG) a una concentración de 0,1 mM. 16 horas después de la inducción a 25ºC y 220 rpm se recogieron las células y se congelaron a -20ºC.
Para la obtención de la enzima se suspendieron 30 g de células en 150 ml de tampón de trietanolamina (100 mM, pH=7, MgCl2 2 mM, glicerol al 10%) y se rompieron por medio de un homogenizador de alta presión. A continuación, la solución de enzima se mezcló con 150 ml de glicerol y se almacenó a -20ºC.
La solución enzimática obtenida de esta manera se usó para la síntesis de (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo.
La solución enzimática obtenida se diluyó también para usarla en las correspondientes medidas enzimáticas. Para ello, la prueba de actividad se realizó como sigue: 870 µl de tampón TEA 100 mM, pH 7,0, 160 µg de NAD(P)H, 10 µl de lisado celular diluido. La reacción se inició mediante la adición de 100 µl de la disolución de sustrato (5R)-6ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo 100 mM a la mezcla de reacción.
Ejemplo 4
Conversión de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 1
Para la conversión de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo se incubó en un tubo Eppendorf una mezcla de 900 µl de tampón (TEA 100 mM, pH = 7, MgCl2 1 mM), 100 µl de 2-propanol, 10 µl de producto crudo (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo (pureza enantiomérica >99%), 0,1 mg de NAD y 100 µl de suspensión enzimática (véase el ejemplo 3) durante 24 horas a temperatura ambiente con agitación continua. Después de 24 horas el 96% del (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3oxohexanoato de terc-butilo usado se había reducido a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo. El exceso diastereomérico ascendía a >99%.
La determinación de la conversión así como del exceso diastereomérico se produjo mediante cromatografía de gases quiral. Para ello se usaron un cromatógrafo de gases GC-17A de Shimadzu con una columna de separación quiral CP-Chirasil-DEX CB (Varian Chrompack, Darmstadt, Alemania), un detector de ionización de llama y helio como gas portador.
La separación de 6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo se produjo a 0,72 bares y 10 minutos a 50ºC, 5ºC/min
→ 200ºC durante 10 minutos.
Los tiempos de retención fueron: (R-BCH) 4,4 minutos; (R,R-BCH) 47,1 minutos y (R,S-BCH) 48,2 minutos.
Ejemplo 5
Síntesis de (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo a partir de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 1
Para una conversión adicional del (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5dihidroxihexanoato de terc-butilo se incubó en un tubo Eppendorf una mezcla de 550 µl de tampón (TEA 100 mM, pH = 7, MgCl2 1 mM), 150 µl de 2-propanol, 200 µl de producto crudo (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de tercbutilo (pureza enantiomérica >99%), 0,1 mg de NAD y 200 µl de suspensión enzimática (véase el ejemplo 3). En el curso de la reacción la mezcla acetona/2-propanol formada se evaporó varias veces mediante la introducción de nitrógeno y se añadieron 2-propanol y 50 µl de enzima nuevos. Después de repetir de 2 a 3 veces en un intervalo de 24 horas, >90% del (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo usado se había reducido a (3R,5R)-6ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo. El exceso diastereomérico ascendía a >99%.
Ejemplo 6
Síntesis de (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo a partir de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 1
Para una conversión adicional del (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5dihidroxihexanoato de terc-butilo se incubó en un recipiente de reacción una mezcla de 6,7 ml de tampón (TEA 100 mM, pH = 9), 1,7 ml de 2-propanol, 2 ml de producto crudo (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo (pureza enantiomérica >99%), 1,0 mg de NAD y 150 mg de células congeladas de E. coli BL21 Star, que contenían la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 1 (véase el ejemplo 3) a 45ºC. Después de 24 horas, >90% del (5R)-6-ciano-5hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo usado se había reducido a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de tercbutilo. El exceso diastereomérico ascendía a >99%.
Ejemplo 7
Síntesis de (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo a partir de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 8
Para una conversión adicional del (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5dihidroxihexanoato de terc-butilo se incubó en un recipiente de reacción una mezcla de 5,0 ml de tampón (TEA 100 mM, pH = 7,5), 2,0 ml de 2-propanol, 4,0 ml de producto crudo (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo (pureza enantiomérica >99%), 1,0 mg de NAD y 250 mg de células congeladas de E. coli RB 791, que contenían la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 8 (según los ejemplo 2 y 3) a 40ºC. Después de 24 horas, >90% del (5R)-6-ciano-5hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo usado se había reducido a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de tercbutilo. El exceso diastereomérico ascendía a >99%.
Ejemplo 8
Síntesis de (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo a partir de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 11
Para la conversión del (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5dihidroxihexanoato de terc-butilo se incubó en un tubo Eppendorf una mezcla de 350 µl de tampón (tampón fosfato de potasio 100 mM, pH = 7), 150 µl de 2-propanol, 50 µl de producto crudo (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo (pureza enantiomérica >99%), 0,025 mg de NAD y 15 µl de suspensión enzimática de SEQ ID NO: 11 (véase el ejemplo 3) durante 48 horas a temperatura ambiente con agitación continua. Después de 48 h, >80% del (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo usado se había reducido a (3R,5R)-6-ciano-3,5dihidroxihexanoato de terc-butilo. El exceso diastereomérico ascendía a >99%.
Lista de secuencias
SEQ ID NO:1
imagen3
SEQ ID NO:2
imagen2
SEQ ID NO: 3
imagen2
imagen2
SEQ ID NO:4
imagen2
SEQ ID NO:5
imagen2
SEQ ID NO:6
imagen4
SEQ ID NO:7
imagen2
15 SEQ ID NO:8 Geobacillus thermodenitrificans DSM 465. Secuencia de proteína de carbonilreductasa
imagen2
SEQ ID NO:9 Geobacillus thermodenitrificans DSM 465. Secuencia de ácido nucleico de carbonilreductasa SEQ ID NO:10 Geobacillus thermodenitrificans DSM 465. Secuencia de ácido nucleico de gen sintético
imagen2
imagen2
SEQ ID NO:11 Chloroflexus auratiacus DSMZ 635. Secuencia de proteína de carbonilreductasa
imagen2
15 SEQ ID NO:12 Chloroflexus auratiacus DSMZ 635. Secuencia de ácido nucleico de carbonilreductasa SEQ ID NO:13 Chloroflexus auratiacus DSMZ 635. Secuencia de ácido nucleico de gen sintético
imagen2
imagen2
10 SEQ ID NO:14 Candida magnoliae CBS 6396. Secuencia de proteína de carbonilreductasa
imagen2
SEQ ID NO:15 Candida magnoliae CBS 6396. Secuencia de ácido nucleico de carbonilreductasa
imagen2
Lista de secuencias
5 <110> IEP GmbH
<120> Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de compuestos hidroxiceto
<130> I 9844 10
<150> AT A 2027/2005
<151> 2005-12-19
<160> 15 15
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 249 20 <212> PRT
<213> Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
<400> 1
imagen5
imagen2
<210> 2
<211> 750
<212> ADN
<213> Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
imagen6
<210> 3
<211> 750
<212> ADN 15 <213> Construcción sintética
<400> 3
imagen2
<210> 4
<211> 33
<212> ADN
<213> Construcción sintética
<400> 4
imagen2
<210> 5
<211> 34
<212> ADN
<213> Construcción sintética
<400> 5
imagen2
<210> 6
<211> 30
<212> ADN
<213> Construcción sintética
<400> 6
imagen2
<210> 7
<211> 31
<212> ADN
<213> Construcción sintética
<400> 7
imagen2
<210> 8
<211> 250
<212> PRT
<213> Geobacillus thermodenitrificans DSM 465
<400> 8 <210> 9
imagen2
<211> 753
<212> ADN
<213> Geobacillus thermodenitrificans DSM 465
imagen7
imagen2
<210> 10
<211> 753
<212> ADN
<213> Construcción sintética
<400> 10
imagen2
10
<210> 11
<211> 252
<212> PRT
<213> Chloroflexus aurantiacus DSM 635
15
<400> 11
imagen2
imagen2
<210> 12
<211> 759
<212> ADN
<213> Chloroflexus aurantiacus DSM 635
<400> 12
imagen2
imagen2
<210> 13
<211> 759
<212> ADN
<213> Construcción sintética
<400> 13
imagen2
10
<210> 14
<211> 243
<212> PRT
<213> Candida magnoliae CBS 6396 15
<400> 14
imagen2
imagen2
<210> 15
<211> 732
<212> ADN
<213> Candida magnoliae CBS 6396
imagen8
imagen2

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Proceso para la reducción enzimática enantioselectiva de una hidroxicetona de fórmula general I
    imagen1
    en donde R1 = alquilo C1-C6 y R2 = -Cl, -CN, -OH, -H o alquilo C1-C6, a un diol quiral de fórmula general II
    imagen1
    en el que R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I, en donde la hidroxicetona se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un cofactor, caracterizado en 10 que, la oxidorreductasa
    a) muestra una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 50% de los aminoácidos son idénticos a los de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705,
    15 b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, o
    c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que en condiciones rigurosas hibrida con SEQ ID NO: 20 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
  2. 2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado en que el cofactor se reduce continuamente con un cosustrato.
    25 3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado en que se usa NAD(P)H como cofactor.
  3. 4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado en que se usa 2-propanol, 2-butanol, 2pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-heptanol o 2-octanol como cosustrato y alcohol secundario, respectivamente.
    30 5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado en que la hidroxicetona se usa en una cantidad del 5-50% en peso, preferiblemente del 8-40% en peso, en particular del 10-25% en peso, referido al volumen total de reacción.
  4. 6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que como hidroxicetona de fórmula
    35 general (I) se usa (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo o (5S)-5,6-dihidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo.
  5. 7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado en que el TTN (“total turn over number”
    , número total de recambio = moles de hidroxicetona reducida/moles de cofactor usado) es ≥103. 40
  6. 8.
    Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado en que se lleva a cabo en un sistema bifásico acuoso orgánico.
  7. 9.
    Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado en que se usa adicionalmente un
    45 disolvente orgánico como dietiléter, terc-butilmetil éter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano.
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