KR20210020663A

KR20210020663A - 가용성 하이드로게나아제 유전자가 도입된 재조합 균주 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피오네이트 제조 방법

Info

Publication number: KR20210020663A
Application number: KR1020190100475A
Authority: KR
Inventors: 박우찬; 김재형; 성민경
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-02-24

Abstract

세포질 (Cytosol)에서 가용 형태로 발현되는 가용성 하이드로게나아제 (soluble hydrogenase)를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주, 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자의 도입에 의한 산화-환원 불균형 해소 방법, 및 이를 통한 3-하이드록시프로피오네이트 제조 방법이 제공된다.

Description

가용성 하이드로게나아제 유전자가 도입된 재조합 균주 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피오네이트 제조 방법{Recombinant Cell comprising Soluble Hydrogenase Gene and Method of Preparing 3-hydroxypropionate Using the Same}

산화환원 (Redox) 균형은 미생물을 이용한 대사산물 회로를 설계함에 있어서 가장 중요한 요소이다. 에탄올 또는 젖산 등과 같이 산화환원 균형이 맞는 물질을 생산하는 물질의 경우, 추가적인 산화/환원 요소가 없으므로, 산소 제공이 없는 혐기 조건에서도 잘 생산된다. 그러나, 목적 대사산물이 산화환원 균형이 맞지 않는 경우에는, 이를 해소하기 위하여 추가적으로 부산물이 생성되거나 산소를 추가하여 추가적인 환원력을 산화시키거나 부족한 환원력을 보충시켜 주는 것이 필요하다.

호기성 발효를 수행하는 경우에는 혐기성 발효 대비 수득되는 ATP가 많기 때문에, 이러한 에너지 균형을 위하여 ATP를 소비할 수 있는 세포 성장 또는 생합성 등이 동반되어, 목적 대사산물의 수율이 혐기 발효에 비하여 낮아진다. 이와 같이 호기성 발효시의 낮은 목적 대사산물의 수율을 혐기 발효와 동등 수준으로 올리기 위하여 생산 균주에 대하여 다양한 추가적 조작이 필요하다.

시트르산, 프로판디올, 부탄디올, 이소프렌 등의 대사산물은 포도당으로부터 대사공학을 이용하여 생산 시 잉여의 환원력 (NADH)이 발생하여 이를 산화시켜줄 산소의 투입을 필요로 한다. 또한, 기질로서 포도당보다 더 환원된 글리세롤을 이용하는 경우, 에탄올, 젖산, 3-하이드로프로피온산 등의 생산 시에도 잉여의 환원력이 발생하게 된다. 이러한 잉여의 환원력을 산소가 아닌 수소로 전환할 경우 물이 발생되지 않으므로 대사산물의 농도를 보다 높일 수 있고, 호기성 발효가 아닌 혐기성 발효의 수행을 통해 발효 공정비를 줄일 수 있다.

대사산물 생산 시 발생하는 산화환원 불균형을 해소하여 대사산물의 생산 효율을 개선시킬 수 있는 기술의 개발이 요구된다.

US 2011-0125118 A1 (2011.05.26 공개)

일 예는 하이드로게나아제(hydrogenase) 암호화 유전자가 도입된 재조합 균주를 제공한다. 상기 하이드로게나아제 암호화 유전자는 세포질 가용성 (cytosol soluble) 하이드로게나아제를 암호화하는 유전자로, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는 혐기 또는 약호기 조건에서의 발효시의 과잉 환원력 상태 (예컨대, NADH와 같은 환원 조효소 수준이 높은 항태)를 상쇄시켜 (예컨대, NADH와 같은 환원 조효소를 산화시키거나 제거), 세포 내 산화 환원 균형을 맞추는 기능을 하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제 또는 이의 암호화 유전자는 Ralstonia eutropha로부터 유래한 것일 수 있다.

다른 예는 상기 하이드로게나아제 암호화 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 포함하는, 3-하이드로프로피오네이트 (3-hydroxypropionate; 3-HP) 생산용 조성물을 제공한다. 상기 3-하이드로프로피오네이트는 글리세롤로부터 생성된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법을 제공한다. 상기 배양하는 단계는 상기 재조합 미생물을 글리세롤과 함께 배양(또는 발효)하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물의 배양 또는 발효 단계는 혐기 조건 또는 약호기(micro-aerobic) 조건에서 수행될 수 있다. 상기 생산 방법은 상기 재조합 미생물의 배양시 혐기 조건 또는 약호기 조건에서 환원력 (NADH)이 감소시켜 산화환원 균형 달성하고, 3-하이드로프로피오네이트를 고수율로 생산하는 것을 특징으로 한다.

다른 예는 상기 하이드로게나아제 암호화 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 포함하는, 미생물의 혐기 또는 약호기 발효시 환원력 저감용 조성물, 및 환원 조효소 (NADH)의 산화용 또는 NADH 제거용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 미생물을 혐기 또는 약호기 조건에서 배양하는 단계를 포함하는, 미생물의 혐기 또는 약호기 발효시 환원력 저감 방법, 및 환원 조효소 (NADH)의 산화 또는 NADH 제거 방법을 제공한다. 상기 배양하는 단계는 상기 재조합 미생물을 글리세롤과 함께 배양(또는 발효)하여 수행되는 것일 수 있다.

일 양태에서, 산소 이외의 전자 수용체를 이용하여 포도당보다 환원된 기질인 글리세롤로부터 대사산물, 예컨대, 3-하이드록시프로피오네이트 전환시 발생하는 NADH의 산화를 유도하는 기술이 제공된다.

구체적으로, 일 예에서 하이드로게나아제(hydrogenase) 암호화 유전자가 도입된 재조합 균주가 제공된다. 상기 하이드로게나아제 암호화 유전자는 세포질 가용성 (cytosol soluble) 하이드로게나아제를 암호화하는 유전자로, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는 혐기 또는 약호기 조건에서의 발효시의 과잉 환원력 상태 (예컨대, NADH와 같은 환원 조효소 수준 및/또는 활성이 높은 상태)를 상쇄시켜 (예컨대, NADH와 같은 환원 조효소를 산화시키거나 제거), 세포 내 산화 환원 균형을 맞추는 기능을 하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제 또는 이의 암호화 유전자는 Ralstonia eutropha로부터 유래한 것일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법을 제공한다. 상기 배양하는 단계는 상기 재조합 미생물을 탄소원으로서 글리세롤과 함께 배양(또는 발효)하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물의 배양 또는 발효 단계는 혐기 또는 약호기 조건에서 수행될 수 있다. 상기 생산 방법은 상기 재조합 미생물의 배양시 혐기 또는 약호기 조건에서 환원력 (예, NADH 활성 및/또는 수준)을 감소시켜 산화환원 균형을 달성하고, 3-하이드로프로피오네이트를 고수율로 생산하는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물 및 방법에 있어서, 상기 하이드로게나아제 암호화 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 사용함으로써, 동일 조건에서의 야생형 미생물 (예컨대, 상기 하이드로게나아제 암호화 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입되지 않은 미생물)과 비교하여, 3-하이드로프로피오네이트 생산 효율이 증가하거나, 미생물의 혐기 또는 약호기 발효시 환원력이 감소하거나, 및/또는 환원 조효소의 균형이 맞는 (예컨대, NADH 수준이 낮은 또는 NADH의 산화 또는 제거 효율이 높은) 것을 특징으로 한다.

이하, 보다 상세히 설명한다:

본 명세서에서, 산소 이외의 전자 수용체를 이용하여 포도당보다 더 환원된 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피오네이트로의 전환시 발생하는 환원 조효소 NADH의 산화를 유도하기 위하여 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자 (예컨대, Ralstonia eutropha 유래 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자)를 도입하였다.

글리세롤로부터 3-하이드록시프로피오네이트를 생산하기 위해서는 발효시 충분한 양의 산소를 공급하여야 하며, 이는 발효 공정 관점에서 투자비와 전기 사용량을 증가시키는 단점을 갖는다. 또한 산소가 물로 전환되면서 생성되는 물의 양이 증가함으로 인하여 Titer가 떨어지게 되어 공정비가 증가한다는 문제가 있다.

대장균 (E. coli)에서 하이드로게나아제를 발현시키기 위하여 다양한 연구가 시도되었으나, 대부분 막효소 (membrane enzyme) 특성을 가지고 있어서 효율적으로 발현되기 어려운 측면이 있었다.

본 명세서에서는 세포질 가용성 하이드로게나아제를 암호화하는 유전자(예컨대, Ralstonia eutropha 유래 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자)를 사용함으로써, 숙주세포에서 발현시 하이드로게나아제가 세포질 가용성 형태로 발현되므로, 실제 대사가 이루어지는 NADH의 직접적인 전환에 유리하다.

본 명세서에서 제공되는 기술은 숙주세포를 세포질 가용성 하이드로게나아제를 암호화하는 유전자(예컨대, Ralstonia eutropha 유래 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자)로 형질전환시킴(즉, 상기 유전자를 숙주세포에 도입함)으로써, 혐기 또는 약호기 조건에서 환원된 기질(예컨대, 글리세롤)을 포함하는 배지에서 배양 또는 발효 시에 과잉 발생하는 NADH를 산화시켜 (또는 제거하여) (즉, 잉여 환원력을 낮추어), 산화환원 균형을 맞추어, 상기 기질로부터 전환(생성/생산)되는 대사산물 (예컨대, 3-하이드록시프로피오네이트)의 생산 효율을 증가시킨 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용된 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자는 Ralstonia eutropha로부터 유래한 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는, Ralstonia eutropha의

(1) NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 알파 (NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit alpha; GenBank Accession No. AAP85841.1 (서열번호 1); 유전자: hoxF (AY305378.1 상의 79712..81520 부위),

(2) NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 감마 (NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit gamma; GenBank Accession No. AAP85842.1 (서열번호 2); 유전자: hoxU (AY305378.1 상의 81517..82221 부위),

(3) NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 델타 (NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit delta; GenBank Accession No. AAP85843.1 (서열번호 3); 유전자: hoxY (AY305378.1 상의 82218..82847 부위),

(4) NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 베타 (NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit beta; GenBank Accession No. AAP85844.1 (서열번호 4); 유전자: hoxH (AY305378.1 상의 82865..84331 부위),

(5) [NiFe] 하이드로게나아제 (HoxH-특이적) C-말단 프로테아제 ([NiFe] hydrogenase (HoxH-specific) C-terminal protease; GenBank Accession No. AAP85845.1 (서열번호 5); 유전자: hoxW (AY305378.1 상의 84315..84812 부위),

(6) HoxI (GenBank Accession No. AAP85846.1 (서열번호 6); 유전자: hoxI (AY305378.1(서열번호 1) 상의 84835..85338 부위),

(7) Hydrogenase maturation factor HypA2 (GenBank Accession No. AAP85847.1 (서열번호 7); 유전자: hypA2 (AY305378.1 상의 85449..85790 부위),

(8) HypB2 (GenBank Accession No. AAP85848.1 (서열번호 8); 유전자: hypB2 (AY305378.1 상의 85836..86798부위), 및

(9) Carbamoyltransferase HypF2 (GenBank Accession No. AAP85849.1 (서열번호 9); 유전자: hypF2 (AY305378.1 상의 86804..89227부위)

로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개)을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는 (1) 내지 (9)를 N 말단부터 순서대로 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제를 암호화하는 유전자는 Ralstonia eutropha의 게놈 (AY305378.1)의 79712-89227 부위를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "혐기 (anaerobic)"는, 배양 또는 발효 등의 미생물 또는 세포 성장 조건에서, 실질적으로 산소(O₂)가 없는 상태 또는 배지 내 산소 농도가 1%(v/v) 이하인 상태를 의미할 수 있다. 또한, 용어 "약호기 (micro-aerobic)"는, 배양 또는 발효 등의 미생물 또는 세포 성장 조건에서, 실질적으로 산소 농도가 대기중 산소 농도보다 낮은 상태, 예컨대, 배지 내 산소 농도가 5%(v/v) 이하인 상태를 의미할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 하이드로게나아제 암호화 유전자는, 하이드로게나아제아미노산 서열을 암호화하는 핵산분자, 또는 기능적으로 균등한 코돈 또는 (코돈의 축퇴성에 의해) 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자가 도입 (형질전환)되는 숙주세포는 3-하이드로프로피오네이트 생산능을 갖는 균주일 수 있으며, 일 예에서, 3-하이드로프로피오네이트 생산능을 갖는 대장균 균주일 수 있다.

상기 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자의 도입(형질전환)은 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계에 의하여 수행할 수 있다.

상기 "벡터"는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 암호화하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하기 위한 수단이 된다. 사용 가능한 벡터로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등 다양한 형태의 벡터가 예시될 수 있다. 재조합 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터는 복제기점, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 코스미드의 복제 기점을 포함하며, 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편이 복제될 수 있는 레플리콘이다. 발 현 벡터는 단백질을 합성하는데 사용되도록 개발된다.

본원에서 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포 등 각종 숙주 세포에서 목적하는 효소 유전자를 발현하고 이를 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 벡터내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 벡터가 바람직하다.

이러한 벡터는, 해당 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열로는, 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.　예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및/또는 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

유용한 발현 조절 서열의 예로는, 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase, PGK) 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합을 포함할 수 있다.

세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 목적하는 유전자와 전사 및 해독 발현 조절 서열이 서로 작동가능하도록 연결되어야 한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA가 단백질의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있고, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.

당업자는 숙주 세포의 성질, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현 등을 고려하여, 본 발명에 적합한 각종 벡터, 발현 조절 서열, 숙주 등을 선정할 수 있다.

상기와 같은 재조합 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킴에 있어서, 용어, "형질전환"은 유전자를 숙주 세포로 도입하여 도입된 유전자가 숙주 세포의 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있으며, 외래 유전자의 도입효율이 높고, 도입된 유전자A의 발현효율이 높은 세포가 통상 사용될 수 있다. 구체 예로, 대장균 (예를 들어, E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli B 및 E. coli XL1-Blue)을 포함하는 에스케리키아 속, 슈도모나스 속, 바실러스 속, 스트렙토마이세스 속, 어위니아 속, 세라티아 속, 프로비덴시아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속, 살모넬라 속, 브레비박테리아 속, 하이포모나스 속, 크로모박테리움 속, 노카디아 속, 진균 또는 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

또한, 본 발명의 목적상, 상기 숙주 세포는 탄소원으로부터 3-하이드로프로피오네이트를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물일 수 있다.

형질전환 방법으로는, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양(또는 발효)에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시키는 것을 적절히 선택할 수 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 배지 내 탄소원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 탄소원은 글리세롤, 포도당 또는 이들의 조합일 수 있다. 배지 내 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 배지 내 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하거나, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양 과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 필요에 따라, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배양물의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 또는 25℃ 내지 40℃를 유지할 수 있다. 배양은 원하는 대사산물, 예컨대 3-하이드로프로피오네이트의 생산량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법은, 상기한 배양 단계 이후에, 생산된 3-하이드록시프로피오네이트를 회수 또는 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 균주 또는 이의 배양물로부터 생산된 3-하이드록시프로피오네이트를 회수 또는 분리하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법 중에서 선택될 수 있다. 예컨대, 3-하이드록시프로피오네이트의 회수 방법의 예로서, 원심분리, 초음파파쇄, 여과, 이온교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC), 가스 크로마토그래피(gas chromatography: GC) 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 세포질 가용성 하이드로게나아제를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주 및 이를 이용한 기술은 재조합 균주 (예컨대, 재조합 대장균)에서 세포질 가용성 하이드로게나아제의 공동발현을 통한 환원력 과다 발생 대사 경로에서의 보조인자 (cofactor) 재생을 유도하고, 이를 통하여 산소가 없는 혐기 또는 약호기 (micro-aerobic) 조건에서의 대사산물 (3-하이드록시프로피오네이트) 생산능을 향상시킬 수 있다.

도 1은 실시예 1의 프라이머 설계 과정을 모식적으로 보여준다.
도 2는 RSF-duet1 벡터의 개열지도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자가 도입된 재조합3 -HP 생산 균주의 제조

Ralstonia eutropha로부터 가용성 하이드로게나아제 유전자를 클로닝하여 pRSFDuet-1 vector에 클로닝하고, 합성 프로모터를 통하여 구성적으로 발현되도록 하였다. 상기 제작된 플라스미드를 3-하이드로프로피오네이트(3-HP) 생산 균주에 도입하여, 재조합 3-HP 생산 균주를 제조하였다.

보다 구체적으로, 6개의 프라이머 (표 1)를 이용하여, Ralstonia eutropha 게놈 (Ralstonia eutropha H16 megaplasmid pHG1 'GenBank Accession No. AY305378.1')의 79712-89227 부위로부터 3개의 DNA 조각을 PCR 하였다. 사용된 PCR kit은 TAKARA社 Primestar mix이며, PCR 수행조건은 kit의 매뉴얼을 따랐다.

프라이머	핵산 서열 (5'→3')	서열번호
5'_1^st_F	ctagtctagattgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcATGGATAGTCGTATCACGACAATACTCGA	10
3'_1^st_R	CCAGCGCCGGATCCATCG	11
5'_2^nd_F	CGCCGATGGATCCGGCGCT	12
3'_2^nd_R	CAGGCGCGCCACCGTCT	13
5'_3^rd_F	GGTGGCGCGCCTGCAG	14
3'_3^rd_R	tattaattaaTCAGTTGGGCGCCCGCTG	15

상기 사용된 AY305378.1의 79712-89227 부위는 다음의 가용성 하이드로게나아제 서브유닛들을 카세트 형태로 발현한다:

AY305378.1 상의 부위 (CDS)	Gene	Product	GenBank Accession No.	아미노산 서열 (N'→C')	서열번호
79712..81520	hoxF	NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit alpha	AAP85841.1	MDSRITTILERYRSDRTRLIDILWDVQHEYGHIPDAVLPQLGAGLKLSPLDIRETASFYHFFLDKPSGKYRIYLCNSVIAKINGYQAVREALERETGIRFGETDPNGMFGLFDTPCIGLSDQEPAMLIDKVVFTRLRPGKITDIIAQLKQGRSPAEIANPAGLPSQDIAYVDAMVESNVRTKGPVFFRGRTDLRSLLDQCLLLKPEQVIETIVDSRLRGRGGAGFSTGLKWRLCRDAESEQKYVICNADEGEPGTFKDRVLLTRAPKKVFVGMVIAAYAIGCRKGIVYLRGEYFYLKDYLERQLQELREDGLLGRAIGGRAGFDFDIRIQMGAGAYICGDESALIESCEGKRGTPRVKPPFPVQQGYLGKPTSVNNVETFAAVSRIMEEGADWFRAMGTPDSAGTRLLSVAGDCSKPGIYEVEWGVTLNEVLAMVGARDARAVQISGPSGECVSVAKDGERKLAYEDLSCNGAFTIFNCKRDLLEIVRDHMQFFVEESCGICVPCRAGNVDLHRKVEWVIAGKACQKDLDDMVSWGALVRRTSRCGLGATSPKPILTTLEKFPEIYQNKLVRHEGPLLPSFDLDTALGGYEKALKDLEEVTR	1
81517..82221	hoxU	NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit gamma	AAP85842.1	MSIQITIDGKTLTTEEGRTLVDVAAENGVYIPTLCYLKDKPCLGTCRVCSVKVNGNVAAACTVRVSKGLNVEVNDPELVDMRKALVEFLFAEGNHNCPSCEKSGRCQLQAVGYEVDMMVSRFPYRFPVRVVDHASEKIWLERDRCIFCQRCVEFIRDKASGRKIFSISHRGPESRIEIDAELANAMPPEQVKEAVAICPVGTILEKRVGYDDPIGRRKYEIQSVRARALEGEDK	2
82218..82847	hoxY	NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit delta	AAP85843.1	MRAPHKDEIASHELPATPMDPALAANREGKIKVATIGLCGCWGCTLSFLDMDERLLPLLEKVTLLRSSLTDIKRIPERCAIGFVEGGVSSEENIETLEHFRENCDILISVGACAVWGGVPAMRNVFELKDCLAEAYVNSATAVPGAKAVVPFHPDIPRITTKVYPCHEVVKMDYFIPGCPPDGDAIFKVLDDLVNGRPFDLPSSINRYD	3
82865..84331	hoxH	NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit beta	AAP85844.1	MSRKLVIDPVTRIEGHGKVVVHLDDDNKVVDAKLHVVEFRGFEKFVQGHPFWEAPMFLQRICGICFVSHHLCGAKALDDMVGVGLKSGIHVTPTAEKMRRLGHYAQMLQSHTTAYFYLIVPEMLFGMDAPPAQRNVLGLIEANPDLVKRVVMLRKWGQEVIKAVFGKKMHGINSVPGGVNNNLSIAERDRFLNGEEGLLSVDQVIDYAQDGLRLFYDFHQKHRAQVDSFADVPALSMCLVGDDDNVDYYHGRLRIIDDDKHIVREFDYHDYLDHFSEAVEEWSYMKFPYLKELGREQGSVRVGPLGRMNVTKSLPTPLAQEALERFHAYTKGRTNNMTLHTNWARAIEILHAAEVVKELLHDPDLQKDQLVLTPPPNAWTGEGVGVVEAPRGTLLHHYRADERGNITFANLVVATTQNNQVMNRTVRSVAEDYLGGHGEITEGMMNAIEVGIRAYDPCLSCATHALGQMPLVVSVFDAAGRLIDERAR	4
84315..84812	hoxW	[NiFe] hydrogenase (HoxH-specific) C-terminal protease	AAP85845.1	MNAPAEFPYVTLADFDDPSTLIYGIGNVGRQDDGLGWAFIDRLEAESLCSGAEVQRHYQLHLEDADLISRKRKVLFIDATKDASVASFSLERAEPRMDFSFTSHAISIPSIMATCQRCFQCLPEVYVLAIRGYEWELRMGLTPQARHNLDDAIAHFSMRAERQTS	5
84835..85338	hoxI	HoxI	AAP85846.1	MKEQEIDRIATMIYEAPLGEYIGRDGAAILAEHAAEARLLKGDEFLYRRGDVTSSFYIVTDGRLALVREKTNERTAPIVHVLEKGDLVGELGFIDQTPHSLSVRALGDAAVLSFSAESIKPLITEHPELIFNFMRAVIKRVHHVVVTVGEHERELQEYISTGGRGRG	6
85449..85790	hypA2	Hydrogenase maturation factor HypA2	AAP85847.1	MHEMSLAVGVLQIVEDVAQRDGFSRVTAVRLEIGRLSSIEPEALRFCFEEVVRGSVADGARLEIVDTPGAGWCLHCSETVAIGALYDPCPQCGGYQVQPTGGTEMRVMDLEVA	7
85836..86798	hypB2	HypB2	AAP85848.1	MCTNCGCAAGETRIEGQELEHVDEHAHADGTVHGHAPHHHGEHDHDHGPAYRAVRGTDHLHYGHGPAGAHAPGMSQARMVKIEQDILGKNNAYAAQNRRWFDEHGVFALNFVSSPGSGKTTLLVRTIEALKSTSRLAVIEGDQQTSFDAERIRATGVQALQINTGKGCHLDAHMVGHALEKLRPEDESVLLIENVGNLVCPSAFDLGEAHKVVILSVTEGEDKPLKYPDMFRAASLMLLNKCDLLPHLSFDVERAIEYAKRVNPDLHVIRTSSATGEGFDAWLTWIADGLAGQAARRSQSMELLRSRIAGLEAQLAALKV	8
86804..89227	hypF2	Carbamoyltransferase HypF2	AAP85849.1	MLMPRRPRNPRTVRIRIRVRGVVQGVGFRPFVYRLARELGLAGWVRNDGAGVDIEAQGSAAALVELRERLRRDAPPLARVDEIGEERCAAQVDADGFAILESSRSDAAVHTAIGHDTAVCPDCLAELFDPANRRYRYAFINCTQCGPRYTLTWALPYDRATTSMAPFPQCRPCLDEYNAPEHRRFHAEPNACPDCGPSLALLNAQGMPVEDVDPIAETVARLQRGEIVAIKGLGGFHLACDAHNADAVARLRSRKQREEKPFAVMVANLATAAQWGDIGSGEAALLTASERPIVLLRKRSGVDGRFAGVAPGLVWLGVMLPYTPLQYLLFHEAAGRPEGLGWLAQPQSLVLVMTSANPGGEPLVTGNDEAAQRLTGIADAFLLHDREILVRCDDSVVRGDGEPAPHVQFIRRARGYTPRAIKLARSGPSVLALGGSFKNTVCLTRGDEAFVSQHVGDLGNAATCEALIEAVAHLQRVLEIRPQLVAHDLHPDFFSTRHAAELAAQWGVPAVAVQHHHAHIAAVLAEHGSDEPAIGLALDGVGLGDDGQAWGGELLLVDGGACKRLGHLRELPLPGGDRAAREPWRMAAAALHAMGRGEEIEGRFPRQPGAPMVNRMLAQRLNAPLSSSMGRWFDAAAGLLGTRETMAYEGQAAMLLEGLAESWGEQPSPGRPKTVAHSLGGVPRSGGGTYKALALPDAWRIDAGNTLDLLPLLEALSAETNAARGAAQFHATLVAALEAWTVATVQVTGVRTVVFGGGCFLNHILARNLCRRLAARGLTVLTARQLPPNDGGIALGQVWVALQRAPN	9

RSF-duet1 벡터(도 2)와 첫 번째 PCR 산물을 XbaI과 BamHI으로 처리 (digestion) 후 ligase를 이용하여 상기 첫 번째 PCR 산물을 벡터 내로 삽입하였다. 첫 번째 DNA조각(첫 번째 PCR 산물)에 프로모터가 포함되어 있으므로 기존 벡터의 프로모터는 이 과정에서 제거된다.

상기 얻어진 첫 번째 PCT 산물이 삽입된 벡터와 두 번째 PCR 산물을 BamHI과 AscI으로 처리 (digestion) 후 ligase를 이용하여 상기 두 번째 PCR 산물을 상기 벡터 내로 삽입하였다. 이와 같이 얻어진 두 번째 PCR 산물이 삽입된 벡터와 세 번째 PCR 산물을 AscI과 PacI으로 처리 (digestion) 후 ligase를 이용하여 세 번째 PCR 산물을 상기 벡터 내로 삽입하였다.

상기 얻어진 첫 번째 PCR 산물, 두 번째 PCR 산물, 및 세 번째 PCR 산물이 삽입된 벡터를 E. coli W3110 (KCCM 40219, 한국미생물보존센터)를 기반으로 하는 3-HP 생산 균주(E. coli W3110 (ΔyqhDΔackA-ptaΔldhA) 균주)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여, Ralstonia eutropha 가용성 하이드로게나아제 유전자가 도입된 균주 (이하, 'RH 도입 균주')와 대조군 균주 (RSFDuet-1 도입) 를 제작하였다. 상기 균주들을 50mg/L 카나마이신이 포함된 고체 LB 배지(효모 추출물 5 g/L, 트립톤 10g/L, 및 NaCl 10g/L 함유)에서 선별하였다.

실시예 2. 재조합 균주를 이용한 3-하이드로프로피오네이트의 생산 시험

상기 실시예 1에서 준비된 실험군(RH 도입 균주)과 대조군 (Mock-cell)을 plate로부터 pickin하여 50mL volume의 LB 배지 (50mg/L 카나마이신 함유)에서 배양하였다 (200rpm, 35℃, overnight). 실험군과 대조군의 배양된 세포를 원심분리(2000rpm)하여 회수하였다. 새로운 LB 배지 50ml (50mg/L 카나마이신과 0.02 uM의 시아노코발아민(대정화금) 함유)을 각각 준비하고, 실험군과 대조군 모두 초기 시작 OD가 2.0이 되도록 하였다. 여기에, 각각 40%(w/v) glycerol solution 5mL씩을 주입하여 두 경우 모두 glycerol 함량이 40g/L 정도가 되도록 하였다. 상기와 같이 준비된 실험군 및 대조군을 90rpm, 및 32℃의 준혐기 조건에서 이틀간 배양하였다.

그 후, HPLC를 이용하여 배지내 3-HP 농도를 정량하였다. HPLC 조건은 다음과 같다:

HPLC Model: Agilent Technologies 1200 Series

Column: Bio-Rad Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column 300 mmx7.8 mm

Detector: Refractive Index (RI) / Ultraviolet (UV) Detector

Mobile Phase: 0.5 mM H2SO4

Flow rate: 0.4 mL/min

Run time: 35 min

Column temperature: 35℃

Detector temperature: 35℃

Injection volume: 10 uL

상기 조건으로 HPLC 결과, 실험군(RH 도입 균주)의 3-HP 생산량은 약 1.2g/L로, 대조군 (1.0g/L)보다 우수한 3-HP 생산량 효율을 보였다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> Recombinant Cell comprising Soluble Hydrogenase Gene and Method of Preparing 3-hydroxypropionate Using the Same <130> DPP20191558KR <160> 15 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 602 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit alpha <400> 1 Met Asp Ser Arg Ile Thr Thr Ile Leu Glu Arg Tyr Arg Ser Asp Arg 1 5 10 15 Thr Arg Leu Ile Asp Ile Leu Trp Asp Val Gln His Glu Tyr Gly His 20 25 30 Ile Pro Asp Ala Val Leu Pro Gln Leu Gly Ala Gly Leu Lys Leu Ser 35 40 45 Pro Leu Asp Ile Arg Glu Thr Ala Ser Phe Tyr His Phe Phe Leu Asp 50 55 60 Lys Pro Ser Gly Lys Tyr Arg Ile Tyr Leu Cys Asn Ser Val Ile Ala 65 70 75 80 Lys Ile Asn Gly Tyr Gln Ala Val Arg Glu Ala Leu Glu Arg Glu Thr 85 90 95 Gly Ile Arg Phe Gly Glu Thr Asp Pro Asn Gly Met Phe Gly Leu Phe 100 105 110 Asp Thr Pro Cys Ile Gly Leu Ser Asp Gln Glu Pro Ala Met Leu Ile 115 120 125 Asp Lys Val Val Phe Thr Arg Leu Arg Pro Gly Lys Ile Thr Asp Ile 130 135 140 Ile Ala Gln Leu Lys Gln Gly Arg Ser Pro Ala Glu Ile Ala Asn Pro 145 150 155 160 Ala Gly Leu Pro Ser Gln Asp Ile Ala Tyr Val Asp Ala Met Val Glu 165 170 175 Ser Asn Val Arg Thr Lys Gly Pro Val Phe Phe Arg Gly Arg Thr Asp 180 185 190 Leu Arg Ser Leu Leu Asp Gln Cys Leu Leu Leu Lys Pro Glu Gln Val 195 200 205 Ile Glu Thr Ile Val Asp Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gly Gly Ala Gly 210 215 220 Phe Ser Thr Gly Leu Lys Trp Arg Leu Cys Arg Asp Ala Glu Ser Glu 225 230 235 240 Gln Lys Tyr Val Ile Cys Asn Ala Asp Glu Gly Glu Pro Gly Thr Phe 245 250 255 Lys Asp Arg Val Leu Leu Thr Arg Ala Pro Lys Lys Val Phe Val Gly 260 265 270 Met Val Ile Ala Ala Tyr Ala Ile Gly Cys Arg Lys Gly Ile Val Tyr 275 280 285 Leu Arg Gly Glu Tyr Phe Tyr Leu Lys Asp Tyr Leu Glu Arg Gln Leu 290 295 300 Gln Glu Leu Arg Glu Asp Gly Leu Leu Gly Arg Ala Ile Gly Gly Arg 305 310 315 320 Ala Gly Phe Asp Phe Asp Ile Arg Ile Gln Met Gly Ala Gly Ala Tyr 325 330 335 Ile Cys Gly Asp Glu Ser Ala Leu Ile Glu Ser Cys Glu Gly Lys Arg 340 345 350 Gly Thr Pro Arg Val Lys Pro Pro Phe Pro Val Gln Gln Gly Tyr Leu 355 360 365 Gly Lys Pro Thr Ser Val Asn Asn Val Glu Thr Phe Ala Ala Val Ser 370 375 380 Arg Ile Met Glu Glu Gly Ala Asp Trp Phe Arg Ala Met Gly Thr Pro 385 390 395 400 Asp Ser Ala Gly Thr Arg Leu Leu Ser Val Ala Gly Asp Cys Ser Lys 405 410 415 Pro Gly Ile Tyr Glu Val Glu Trp Gly Val Thr Leu Asn Glu Val Leu 420 425 430 Ala Met Val Gly Ala Arg Asp Ala Arg Ala Val Gln Ile Ser Gly Pro 435 440 445 Ser Gly Glu Cys Val Ser Val Ala Lys Asp Gly Glu Arg Lys Leu Ala 450 455 460 Tyr Glu Asp Leu Ser Cys Asn Gly Ala Phe Thr Ile Phe Asn Cys Lys 465 470 475 480 Arg Asp Leu Leu Glu Ile Val Arg Asp His Met Gln Phe Phe Val Glu 485 490 495 Glu Ser Cys Gly Ile Cys Val Pro Cys Arg Ala Gly Asn Val Asp Leu 500 505 510 His Arg Lys Val Glu Trp Val Ile Ala Gly Lys Ala Cys Gln Lys Asp 515 520 525 Leu Asp Asp Met Val Ser Trp Gly Ala Leu Val Arg Arg Thr Ser Arg 530 535 540 Cys Gly Leu Gly Ala Thr Ser Pro Lys Pro Ile Leu Thr Thr Leu Glu 545 550 555 560 Lys Phe Pro Glu Ile Tyr Gln Asn Lys Leu Val Arg His Glu Gly Pro 565 570 575 Leu Leu Pro Ser Phe Asp Leu Asp Thr Ala Leu Gly Gly Tyr Glu Lys 580 585 590 Ala Leu Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Arg 595 600 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit gamma <400> 2 Met Ser Ile Gln Ile Thr Ile Asp Gly Lys Thr Leu Thr Thr Glu Glu 1 5 10 15 Gly Arg Thr Leu Val Asp Val Ala Ala Glu Asn Gly Val Tyr Ile Pro 20 25 30 Thr Leu Cys Tyr Leu Lys Asp Lys Pro Cys Leu Gly Thr Cys Arg Val 35 40 45 Cys Ser Val Lys Val Asn Gly Asn Val Ala Ala Ala Cys Thr Val Arg 50 55 60 Val Ser Lys Gly Leu Asn Val Glu Val Asn Asp Pro Glu Leu Val Asp 65 70 75 80 Met Arg Lys Ala Leu Val Glu Phe Leu Phe Ala Glu Gly Asn His Asn 85 90 95 Cys Pro Ser Cys Glu Lys Ser Gly Arg Cys Gln Leu Gln Ala Val Gly 100 105 110 Tyr Glu Val Asp Met Met Val Ser Arg Phe Pro Tyr Arg Phe Pro Val 115 120 125 Arg Val Val Asp His Ala Ser Glu Lys Ile Trp Leu Glu Arg Asp Arg 130 135 140 Cys Ile Phe Cys Gln Arg Cys Val Glu Phe Ile Arg Asp Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gly Arg Lys Ile Phe Ser Ile Ser His Arg Gly Pro Glu Ser Arg Ile 165 170 175 Glu Ile Asp Ala Glu Leu Ala Asn Ala Met Pro Pro Glu Gln Val Lys 180 185 190 Glu Ala Val Ala Ile Cys Pro Val Gly Thr Ile Leu Glu Lys Arg Val 195 200 205 Gly Tyr Asp Asp Pro Ile Gly Arg Arg Lys Tyr Glu Ile Gln Ser Val 210 215 220 Arg Ala Arg Ala Leu Glu Gly Glu Asp Lys 225 230 <210> 3 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit delta <400> 3 Met Arg Ala Pro His Lys Asp Glu Ile Ala Ser His Glu Leu Pro Ala 1 5 10 15 Thr Pro Met Asp Pro Ala Leu Ala Ala Asn Arg Glu Gly Lys Ile Lys 20 25 30 Val Ala Thr Ile Gly Leu Cys Gly Cys Trp Gly Cys Thr Leu Ser Phe 35 40 45 Leu Asp Met Asp Glu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Thr Leu 50 55 60 Leu Arg Ser Ser Leu Thr Asp Ile Lys Arg Ile Pro Glu Arg Cys Ala 65 70 75 80 Ile Gly Phe Val Glu Gly Gly Val Ser Ser Glu Glu Asn Ile Glu Thr 85 90 95 Leu Glu His Phe Arg Glu Asn Cys Asp Ile Leu Ile Ser Val Gly Ala 100 105 110 Cys Ala Val Trp Gly Gly Val Pro Ala Met Arg Asn Val Phe Glu Leu 115 120 125 Lys Asp Cys Leu Ala Glu Ala Tyr Val Asn Ser Ala Thr Ala Val Pro 130 135 140 Gly Ala Lys Ala Val Val Pro Phe His Pro Asp Ile Pro Arg Ile Thr 145 150 155 160 Thr Lys Val Tyr Pro Cys His Glu Val Val Lys Met Asp Tyr Phe Ile 165 170 175 Pro Gly Cys Pro Pro Asp Gly Asp Ala Ile Phe Lys Val Leu Asp Asp 180 185 190 Leu Val Asn Gly Arg Pro Phe Asp Leu Pro Ser Ser Ile Asn Arg Tyr 195 200 205 Asp <210> 4 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NAD-reducing hydrogenase HoxS subunit beta <400> 4 Met Ser Arg Lys Leu Val Ile Asp Pro Val Thr Arg Ile Glu Gly His 1 5 10 15 Gly Lys Val Val Val His Leu Asp Asp Asp Asn Lys Val Val Asp Ala 20 25 30 Lys Leu His Val Val Glu Phe Arg Gly Phe Glu Lys Phe Val Gln Gly 35 40 45 His Pro Phe Trp Glu Ala Pro Met Phe Leu Gln Arg Ile Cys Gly Ile 50 55 60 Cys Phe Val Ser His His Leu Cys Gly Ala Lys Ala Leu Asp Asp Met 65 70 75 80 Val Gly Val Gly Leu Lys Ser Gly Ile His Val Thr Pro Thr Ala Glu 85 90 95 Lys Met Arg Arg Leu Gly His Tyr Ala Gln Met Leu Gln Ser His Thr 100 105 110 Thr Ala Tyr Phe Tyr Leu Ile Val Pro Glu Met Leu Phe Gly Met Asp 115 120 125 Ala Pro Pro Ala Gln Arg Asn Val Leu Gly Leu Ile Glu Ala Asn Pro 130 135 140 Asp Leu Val Lys Arg Val Val Met Leu Arg Lys Trp Gly Gln Glu Val 145 150 155 160 Ile Lys Ala Val Phe Gly Lys Lys Met His Gly Ile Asn Ser Val Pro 165 170 175 Gly Gly Val Asn Asn Asn Leu Ser Ile Ala Glu Arg Asp Arg Phe Leu 180 185 190 Asn Gly Glu Glu Gly Leu Leu Ser Val Asp Gln Val Ile Asp Tyr Ala 195 200 205 Gln Asp Gly Leu Arg Leu Phe Tyr Asp Phe His Gln Lys His Arg Ala 210 215 220 Gln Val Asp Ser Phe Ala Asp Val Pro Ala Leu Ser Met Cys Leu Val 225 230 235 240 Gly Asp Asp Asp Asn Val Asp Tyr Tyr His Gly Arg Leu Arg Ile Ile 245 250 255 Asp Asp Asp Lys His Ile Val Arg Glu Phe Asp Tyr His Asp Tyr Leu 260 265 270 Asp His Phe Ser Glu Ala Val Glu Glu Trp Ser Tyr Met Lys Phe Pro 275 280 285 Tyr Leu Lys Glu Leu Gly Arg Glu Gln Gly Ser Val Arg Val Gly Pro 290 295 300 Leu Gly Arg Met Asn Val Thr Lys Ser Leu Pro Thr Pro Leu Ala Gln 305 310 315 320 Glu Ala Leu Glu Arg Phe His Ala Tyr Thr Lys Gly Arg Thr Asn Asn 325 330 335 Met Thr Leu His Thr Asn Trp Ala Arg Ala Ile Glu Ile Leu His Ala 340 345 350 Ala Glu Val Val Lys Glu Leu Leu His Asp Pro Asp Leu Gln Lys Asp 355 360 365 Gln Leu Val Leu Thr Pro Pro Pro Asn Ala Trp Thr Gly Glu Gly Val 370 375 380 Gly Val Val Glu Ala Pro Arg Gly Thr Leu Leu His His Tyr Arg Ala 385 390 395 400 Asp Glu Arg Gly Asn Ile Thr Phe Ala Asn Leu Val Val Ala Thr Thr 405 410 415 Gln Asn Asn Gln Val Met Asn Arg Thr Val Arg Ser Val Ala Glu Asp 420 425 430 Tyr Leu Gly Gly His Gly Glu Ile Thr Glu Gly Met Met Asn Ala Ile 435 440 445 Glu Val Gly Ile Arg Ala Tyr Asp Pro Cys Leu Ser Cys Ala Thr His 450 455 460 Ala Leu Gly Gln Met Pro Leu Val Val Ser Val Phe Asp Ala Ala Gly 465 470 475 480 Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala Arg 485 <210> 5 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [NiFe] hydrogenase (HoxH-specific) C-terminal protease <400> 5 Met Asn Ala Pro Ala Glu Phe Pro Tyr Val Thr Leu Ala Asp Phe Asp 1 5 10 15 Asp Pro Ser Thr Leu Ile Tyr Gly Ile Gly Asn Val Gly Arg Gln Asp 20 25 30 Asp Gly Leu Gly Trp Ala Phe Ile Asp Arg Leu Glu Ala Glu Ser Leu 35 40 45 Cys Ser Gly Ala Glu Val Gln Arg His Tyr Gln Leu His Leu Glu Asp 50 55 60 Ala Asp Leu Ile Ser Arg Lys Arg Lys Val Leu Phe Ile Asp Ala Thr 65 70 75 80 Lys Asp Ala Ser Val Ala Ser Phe Ser Leu Glu Arg Ala Glu Pro Arg 85 90 95 Met Asp Phe Ser Phe Thr Ser His Ala Ile Ser Ile Pro Ser Ile Met 100 105 110 Ala Thr Cys Gln Arg Cys Phe Gln Cys Leu Pro Glu Val Tyr Val Leu 115 120 125 Ala Ile Arg Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Arg Met Gly Leu Thr Pro Gln 130 135 140 Ala Arg His Asn Leu Asp Asp Ala Ile Ala His Phe Ser Met Arg Ala 145 150 155 160 Glu Arg Gln Thr Ser 165 <210> 6 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HoxI <400> 6 Met Lys Glu Gln Glu Ile Asp Arg Ile Ala Thr Met Ile Tyr Glu Ala 1 5 10 15 Pro Leu Gly Glu Tyr Ile Gly Arg Asp Gly Ala Ala Ile Leu Ala Glu 20 25 30 His Ala Ala Glu Ala Arg Leu Leu Lys Gly Asp Glu Phe Leu Tyr Arg 35 40 45 Arg Gly Asp Val Thr Ser Ser Phe Tyr Ile Val Thr Asp Gly Arg Leu 50 55 60 Ala Leu Val Arg Glu Lys Thr Asn Glu Arg Thr Ala Pro Ile Val His 65 70 75 80 Val Leu Glu Lys Gly Asp Leu Val Gly Glu Leu Gly Phe Ile Asp Gln 85 90 95 Thr Pro His Ser Leu Ser Val Arg Ala Leu Gly Asp Ala Ala Val Leu 100 105 110 Ser Phe Ser Ala Glu Ser Ile Lys Pro Leu Ile Thr Glu His Pro Glu 115 120 125 Leu Ile Phe Asn Phe Met Arg Ala Val Ile Lys Arg Val His His Val 130 135 140 Val Val Thr Val Gly Glu His Glu Arg Glu Leu Gln Glu Tyr Ile Ser 145 150 155 160 Thr Gly Gly Arg Gly Arg Gly 165 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrogenase maturation factor HypA2 <400> 7 Met His Glu Met Ser Leu Ala Val Gly Val Leu Gln Ile Val Glu Asp 1 5 10 15 Val Ala Gln Arg Asp Gly Phe Ser Arg Val Thr Ala Val Arg Leu Glu 20 25 30 Ile Gly Arg Leu Ser Ser Ile Glu Pro Glu Ala Leu Arg Phe Cys Phe 35 40 45 Glu Glu Val Val Arg Gly Ser Val Ala Asp Gly Ala Arg Leu Glu Ile 50 55 60 Val Asp Thr Pro Gly Ala Gly Trp Cys Leu His Cys Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Ala Ile Gly Ala Leu Tyr Asp Pro Cys Pro Gln Cys Gly Gly Tyr Gln 85 90 95 Val Gln Pro Thr Gly Gly Thr Glu Met Arg Val Met Asp Leu Glu Val 100 105 110 Ala <210> 8 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HypB2 <400> 8 Met Cys Thr Asn Cys Gly Cys Ala Ala Gly Glu Thr Arg Ile Glu Gly 1 5 10 15 Gln Glu Leu Glu His Val Asp Glu His Ala His Ala Asp Gly Thr Val 20 25 30 His Gly His Ala Pro His His His Gly Glu His Asp His Asp His Gly 35 40 45 Pro Ala Tyr Arg Ala Val Arg Gly Thr Asp His Leu His Tyr Gly His 50 55 60 Gly Pro Ala Gly Ala His Ala Pro Gly Met Ser Gln Ala Arg Met Val 65 70 75 80 Lys Ile Glu Gln Asp Ile Leu Gly Lys Asn Asn Ala Tyr Ala Ala Gln 85 90 95 Asn Arg Arg Trp Phe Asp Glu His Gly Val Phe Ala Leu Asn Phe Val 100 105 110 Ser Ser Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Val Arg Thr Ile Glu 115 120 125 Ala Leu Lys Ser Thr Ser Arg Leu Ala Val Ile Glu Gly Asp Gln Gln 130 135 140 Thr Ser Phe Asp Ala Glu Arg Ile Arg Ala Thr Gly Val Gln Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ile Asn Thr Gly Lys Gly Cys His Leu Asp Ala His Met Val Gly 165 170 175 His Ala Leu Glu Lys Leu Arg Pro Glu Asp Glu Ser Val Leu Leu Ile 180 185 190 Glu Asn Val Gly Asn Leu Val Cys Pro Ser Ala Phe Asp Leu Gly Glu 195 200 205 Ala His Lys Val Val Ile Leu Ser Val Thr Glu Gly Glu Asp Lys Pro 210 215 220 Leu Lys Tyr Pro Asp Met Phe Arg Ala Ala Ser Leu Met Leu Leu Asn 225 230 235 240 Lys Cys Asp Leu Leu Pro His Leu Ser Phe Asp Val Glu Arg Ala Ile 245 250 255 Glu Tyr Ala Lys Arg Val Asn Pro Asp Leu His Val Ile Arg Thr Ser 260 265 270 Ser Ala Thr Gly Glu Gly Phe Asp Ala Trp Leu Thr Trp Ile Ala Asp 275 280 285 Gly Leu Ala Gly Gln Ala Ala Arg Arg Ser Gln Ser Met Glu Leu Leu 290 295 300 Arg Ser Arg Ile Ala Gly Leu Glu Ala Gln Leu Ala Ala Leu Lys Val 305 310 315 320 <210> 9 <211> 807 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Carbamoyltransferase HypF2 <400> 9 Met Leu Met Pro Arg Arg Pro Arg Asn Pro Arg Thr Val Arg Ile Arg 1 5 10 15 Ile Arg Val Arg Gly Val Val Gln Gly Val Gly Phe Arg Pro Phe Val 20 25 30 Tyr Arg Leu Ala Arg Glu Leu Gly Leu Ala Gly Trp Val Arg Asn Asp 35 40 45 Gly Ala Gly Val Asp Ile Glu Ala Gln Gly Ser Ala Ala Ala Leu Val 50 55 60 Glu Leu Arg Glu Arg Leu Arg Arg Asp Ala Pro Pro Leu Ala Arg Val 65 70 75 80 Asp Glu Ile Gly Glu Glu Arg Cys Ala Ala Gln Val Asp Ala Asp Gly 85 90 95 Phe Ala Ile Leu Glu Ser Ser Arg Ser Asp Ala Ala Val His Thr Ala 100 105 110 Ile Gly His Asp Thr Ala Val Cys Pro Asp Cys Leu Ala Glu Leu Phe 115 120 125 Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Arg Tyr Ala Phe Ile Asn Cys Thr Gln 130 135 140 Cys Gly Pro Arg Tyr Thr Leu Thr Trp Ala Leu Pro Tyr Asp Arg Ala 145 150 155 160 Thr Thr Ser Met Ala Pro Phe Pro Gln Cys Arg Pro Cys Leu Asp Glu 165 170 175 Tyr Asn Ala Pro Glu His Arg Arg Phe His Ala Glu Pro Asn Ala Cys 180 185 190 Pro Asp Cys Gly Pro Ser Leu Ala Leu Leu Asn Ala Gln Gly Met Pro 195 200 205 Val Glu Asp Val Asp Pro Ile Ala Glu Thr Val Ala Arg Leu Gln Arg 210 215 220 Gly Glu Ile Val Ala Ile Lys Gly Leu Gly Gly Phe His Leu Ala Cys 225 230 235 240 Asp Ala His Asn Ala Asp Ala Val Ala Arg Leu Arg Ser Arg Lys Gln 245 250 255 Arg Glu Glu Lys Pro Phe Ala Val Met Val Ala Asn Leu Ala Thr Ala 260 265 270 Ala Gln Trp Gly Asp Ile Gly Ser Gly Glu Ala Ala Leu Leu Thr Ala 275 280 285 Ser Glu Arg Pro Ile Val Leu Leu Arg Lys Arg Ser Gly Val Asp Gly 290 295 300 Arg Phe Ala Gly Val Ala Pro Gly Leu Val Trp Leu Gly Val Met Leu 305 310 315 320 Pro Tyr Thr Pro Leu Gln Tyr Leu Leu Phe His Glu Ala Ala Gly Arg 325 330 335 Pro Glu Gly Leu Gly Trp Leu Ala Gln Pro Gln Ser Leu Val Leu Val 340 345 350 Met Thr Ser Ala Asn Pro Gly Gly Glu Pro Leu Val Thr Gly Asn Asp 355 360 365 Glu Ala Ala Gln Arg Leu Thr Gly Ile Ala Asp Ala Phe Leu Leu His 370 375 380 Asp Arg Glu Ile Leu Val Arg Cys Asp Asp Ser Val Val Arg Gly Asp 385 390 395 400 Gly Glu Pro Ala Pro His Val Gln Phe Ile Arg Arg Ala Arg Gly Tyr 405 410 415 Thr Pro Arg Ala Ile Lys Leu Ala Arg Ser Gly Pro Ser Val Leu Ala 420 425 430 Leu Gly Gly Ser Phe Lys Asn Thr Val Cys Leu Thr Arg Gly Asp Glu 435 440 445 Ala Phe Val Ser Gln His Val Gly Asp Leu Gly Asn Ala Ala Thr Cys 450 455 460 Glu Ala Leu Ile Glu Ala Val Ala His Leu Gln Arg Val Leu Glu Ile 465 470 475 480 Arg Pro Gln Leu Val Ala His Asp Leu His Pro Asp Phe Phe Ser Thr 485 490 495 Arg His Ala Ala Glu Leu Ala Ala Gln Trp Gly Val Pro Ala Val Ala 500 505 510 Val Gln His His His Ala His Ile Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gly 515 520 525 Ser Asp Glu Pro Ala Ile Gly Leu Ala Leu Asp Gly Val Gly Leu Gly 530 535 540 Asp Asp Gly Gln Ala Trp Gly Gly Glu Leu Leu Leu Val Asp Gly Gly 545 550 555 560 Ala Cys Lys Arg Leu Gly His Leu Arg Glu Leu Pro Leu Pro Gly Gly 565 570 575 Asp Arg Ala Ala Arg Glu Pro Trp Arg Met Ala Ala Ala Ala Leu His 580 585 590 Ala Met Gly Arg Gly Glu Glu Ile Glu Gly Arg Phe Pro Arg Gln Pro 595 600 605 Gly Ala Pro Met Val Asn Arg Met Leu Ala Gln Arg Leu Asn Ala Pro 610 615 620 Leu Ser Ser Ser Met Gly Arg Trp Phe Asp Ala Ala Ala Gly Leu Leu 625 630 635 640 Gly Thr Arg Glu Thr Met Ala Tyr Glu Gly Gln Ala Ala Met Leu Leu 645 650 655 Glu Gly Leu Ala Glu Ser Trp Gly Glu Gln Pro Ser Pro Gly Arg Pro 660 665 670 Lys Thr Val Ala His Ser Leu Gly Gly Val Pro Arg Ser Gly Gly Gly 675 680 685 Thr Tyr Lys Ala Leu Ala Leu Pro Asp Ala Trp Arg Ile Asp Ala Gly 690 695 700 Asn Thr Leu Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Ser Ala Glu Thr 705 710 715 720 Asn Ala Ala Arg Gly Ala Ala Gln Phe His Ala Thr Leu Val Ala Ala 725 730 735 Leu Glu Ala Trp Thr Val Ala Thr Val Gln Val Thr Gly Val Arg Thr 740 745 750 Val Val Phe Gly Gly Gly Cys Phe Leu Asn His Ile Leu Ala Arg Asn 755 760 765 Leu Cys Arg Arg Leu Ala Ala Arg Gly Leu Thr Val Leu Thr Ala Arg 770 775 780 Gln Leu Pro Pro Asn Asp Gly Gly Ile Ala Leu Gly Gln Val Trp Val 785 790 795 800 Ala Leu Gln Arg Ala Pro Asn 805 <210> 10 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'_1st_F primer <400> 10 ctagtctaga ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagcatgga tagtcgtatc 60 acgacaatac tcga 74 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'_1st_R primer <400> 11 ccagcgccgg atccatcg 18 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'_2nd_F primer <400> 12 cgccgatgga tccggcgct 19 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'_2nd_R primer <400> 13 caggcgcgcc accgtct 17 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'_3rd_F primer <400> 14 ggtggcgcgc ctgcag 16 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'_3rd_R primer <400> 15 tattaattaa tcagttgggc gcccgctg 28

Claims

숙주세포에 세포질 가용성 하이드로게나아제를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 미생물로서,
상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는 상기 재조합 미생물 내에서 NADH를 산화 또는 제거하는 기능을 갖는 것인,
재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 3-하이드로프로피오네이트 생산능을 갖는 것인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 3-하이드로프로피오네이트 생산능을 갖는 대장균인, 재조합 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자는 Ralstonia eutropha로부터 유래한 것인, 재조합 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는 Ralstonia eutropha의 NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 알파, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 감마, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 델타, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 베타, [NiFe] 하이드로게나아제 (HoxH-특이적) C-말단 프로테아제, HoxI, Hydrogenase maturation factor HypA2, HypB2, 및 Carbamoyltransferase HypF2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 재조합 미생물.
NADH를 산화 또는 제거하는 기능을 갖는 세포질 가용성 하이드로게나아제의 암호화 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 유전자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물을 포함하는, 3-하이드로프로피오네이트 생산용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 3-하이드로프로피오네이트 생산능을 갖는 대장균인, 3-하이드로프로피오네이트 생산용 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자는 Ralstonia eutropha로부터 유래한 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산용 조성물.
제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는 Ralstonia eutropha의 NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 알파, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 감마, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 델타, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 베타, [NiFe] 하이드로게나아제 (HoxH-특이적) C-말단 프로테아제, HoxI, HypA2, HypB2, 및 HypF2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 3-하이드로프로피오네이트 생산용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 Ralstonia eutropha로부터 유래한 가용성 하이드로게나아제 암호화 유전자를 포함하는 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제11항에 있어서, 상기 세포질 가용성 하이드로게나아제는 Ralstonia eutropha의 NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 알파, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 감마, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 델타, NAD-환원 하이드로게나아제 HoxS 서브유닛 베타, [NiFe] 하이드로게나아제 (HoxH-특이적) C-말단 프로테아제, HoxI, Hydrogenase maturation factor HypA2, HypB2, 및 Carbamoyltransferase HypF2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 혐기 또는 약호기 조건에서 수행되는 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 탄소원으로 글리세롤을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제11항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 혐기 또는 약호기 조건에서 수행되는 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제11항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 탄소원으로 글리세롤을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제12항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 혐기 또는 약호기 조건에서 수행되는 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.
제12항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 탄소원으로 글리세롤을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 3-하이드로프로피오네이트 생산 방법.