ES2334016T3 - Procedimiento enzimatico para la reduccion enantioselectiva de cetocompuestos. - Google Patents
Procedimiento enzimatico para la reduccion enantioselectiva de cetocompuestos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la reducción enantioselectiva de un cetocompuesto de fórmula I R1-C(O)-R2 (I) en la que R1 y R2 independientemente entre sí son iguales o diferentes y representan
Description
Procedimiento enzimático para la reducción
enantioselectiva de cetocompuestos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento enzimático para la reducción enantioselectiva de
cetocompuestos orgánicos para dar los correspondientes
hidroxicompuestos quirales, a una alcohol deshidrogenasa de
Lactobacillus minor y a un procedimiento enzimático para la
obtención enantioselectiva de (S)-hidroxicompuesto a
partir de un racemato.
Los hidroxicompuestos ópticamente activos son
componentes de síntesis valiosos para la producción de un gran
número de compuestos farmacológicamente importantes. Estos
compuestos son con frecuencia difíciles de producir mediante
procedimientos químicos clásicos y pueden lograr sólo rara vez la
pureza enantiomérica requerida para las aplicaciones
farmacológicas. Por tanto, para la producción de compuestos quirales
se emplean por regla general procedimientos biotecnológicos,
realizándose la reacción estereoselectiva o bien con microorganismos
completos o bien con enzimas aisladas.
A este respecto ha resultado ventajosa con
frecuencia la utilización de enzimas aisladas, dado que con éstas
pueden conseguirse por regla general rendimientos mayores así como
una pureza enantiomérica mayor.
Las deshidrogenasas y especialmente las alcohol
deshidrogenasas son catalizadores valiosos para la obtención de
productos quirales mediante la reducción estereoselectiva de
cetocompuestos orgánicos para dar los correspondientes alcoholes
quirales. Esencialmente se conocen enzimas correspondientes de
levadura, hígado de caballo o Thermoanaerobium brockii.
Estas enzimas necesitan NADH (nicotinadenindinucleótido) o NADPH
(nicotinadenindinucleótido fosfato) como coenzima. Otras alcohol
deshidrogenasas conocidas son por ejemplo una alcohol deshidrogenasa
(S)-específica de Rhodococcus erythropolis o
una alcohol deshidrogenada (R)-específica del género
Lactobacillus. Ambos tipos de enzimas tienen un amplio
espectro de sustratos de cetocompuestos y presentan una alta
enantioselectividad. Las alcohol deshidrogenasas de
Lactobacillus kefir (documento DE 40 14 573) y
Lactobacillus brevis (documento DE 196 10 984) son adecuadas
especialmente para la obtención de (R)-alcoholes
quirales.
Sin embargo para el empleo de las alcohol
deshidrogenasas son desventajosas la estabilidad enzimática y la
actividad enzimática reducidas de las alcohol deshidrogenasas en
disolventes orgánicos y la solubilidad en agua con frecuencia sólo
reducida de los cetocompuestos a reducir. Además, otro factor
limitativo para el empleo de las alcohol deshidrogenasas en
disolventes orgánicos es la utilización necesaria de NADP o NAD como
cofactor requerido, dado que el cofactor (NADP, NAD) es soluble en
agua y se regenera en procedimientos económicos.
La invención tiene como objetivo mejorar las
desventajas mencionadas mediante la modificación de las condiciones
de procedimiento. Este objetivo se soluciona según la invención
mediante el uso de un sistema bifásico, que contiene un disolvente
orgánico, alcohol deshidrogenasa, agua, cofactor y
cetocompuesto.
El procedimiento según la invención presenta una
alta durabilidad gracias a la acción estabilizadora de enzimas del
disolvente, una pureza enantiomérica de más del 99,9% de los
hidroxicompuestos quirales producidos y un alto rendimiento con
respecto a la cantidad utilizada del cetocompuesto.
Por tanto, el procedimiento según la invención
se refiere a un procedimiento para la reducción enantioselectiva de
un cetocompuesto de fórmula I
(I)R^{1}-C(O)-R^{2}
en la que R^{1} y R^{2}
independientemente entre sí son iguales o diferentes y
representan
- 1.
- átomo de hidrógeno,
- 2.
- alquilo (C_{1}-C_{20}), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada,
- 3.
- alquenilo (C_{2}-C_{20}), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,
- 4.
- alquinilo (C_{2}-C_{20}), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,
- 5.
- arilo (C_{6}-C_{14}),
- 6.
- alquil (C_{1}-C_{8})-arilo (C_{6}-C_{14}), o
\newpage
- 7.
- R^{1} y R^{2} forman junto con el resto -C(O)- un arilo (C_{6}-C_{14}) o un heterociclo (C_{5}-C_{14}),
- en la que los restos mencionados anteriormente en 1 a 7 están no sustituidos o están de mono- a trisustituidos independientemente entre sí con
- a)
- -OH,
- b)
- halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,
- c)
- -NO_{2},
- d)
- -C(O)-O-alquilo (C_{1}-C_{20}), en el que alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o de mono- a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o
- e)
- heterociclo (C_{5}-C_{14}), que está no sustituido o de mono- a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro,
caracterizado porque
- a)
- el compuesto de fórmula I, la alcohol deshidrogenasa, agua, el cofactor y un disolvente orgánico con un logP de desde 0,5 hasta 4,0,
- b)
- se incuban en un sistema bifásico y
- c)
- se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
\vskip1.000000\baselineskip
Átomos de carbono en el anillo. Los restos arilo
(C_{6}-C_{14}) son por ejemplo fenilo, naftilo.
Por el término arilo se entienden restos de carbono aromáticos con
de 6 a 14 por ejemplo 1-naftilo,
2-naftilo, bifenililo, por ejemplo
2-bifenililo, 3-bifenililo y
4-bifenililo, antrilo o fluorenilo. Restos
bifenililo, restos naftilo y especialmente restos fenilo son restos
arilo preferidos. Por el término "halógeno" se entiende un
elemento de la serie flúor, cloro, bromo o yodo. Por la expresión
"alquilo (C_{1}-C_{20})" se entiende un
resto hidrocarbonado, cuya cadena de carbono es de cadena lineal o
ramificada y contiene de 1 a 20 átomos de carbono.
La expresión "heterociclo
(C_{5}-C_{14})" representa un anillo
heterocíclico de 5 miembros a 14 miembros monocíclico o bicíclico,
que está parcialmente saturado o completamente saturado. Ejemplos de
heteroátomos son N, O y S. Ejemplos de las expresiones heterociclo
(C_{5}-C_{14}) son restos que se derivan de
pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol,
tiazol, isotiazol, tetrazol,
1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxido,
triazolona, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidindiona,
triazoles, que están sustituidos con F, -CN, -CF_{3} o
-C(O)-O-alquilo
(C_{1}-C_{4}),
3-hidroxipirro-2,4-diona,
5-oxo-1,2,4-tiadiazoles,
piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol,
ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina,
cinnolina, carbolina y derivados benzo-anillados,
ciclopenta-, ciclohexa- o ciclohepta-anillados de
estos heterociclos. Se prefieren especialmente los restos 2- ó
3-pirrolilo, fenilpirrolilo tal como 4- ó
5-fenil-2-pirrolilo,
2-furilo, 2-tienilo,
4-imidazolilo, metil-imidazolilo,
por ejemplo 1-metil-2-, -4- ó
-5-imidazolilo,
1,3-tiazol-2-ilo,
2-piridilo, 3-piridilo,
4-piridilo, 2-, 3- ó
4-piridil-N-óxido,
2-pirazinilo, 2-, 4- ó
5-pirimidinilo, 2-, 3- ó
5-indolilo, 2-indolilo sustituido,
por ejemplo 1-metil-, 5-metil-,
5-metoxi-, 5-benciloxi-,
5-cloro- o
4,5-dimetil-2-indolilo,
1-bencil-2- ó
-3-indolilo,
4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo,
ciclohepta[b]-5-pirrolilo,
2-, 3- ó 4-quinolilo, 1-, 3- ó
4-isoquinolilo,
1-oxo-1,2-dihidro-3-isoquinolilo,
2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo,
2-benzotienilo, 2-benzoxazolilo o
benzotiazolilo o dihidropiridinilo, pirrolidinilo, por ejemplo 2- ó
3-(N-metilpirrolidinilo), piperazinilo,
morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrotienilo o
benzodioxolanilo.
Compuestos preferidos de fórmula I son éster
etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico,
acetofenona, éster metílico del ácido acetoacético,
2-oxo-4-fenilbutirato
de etilo, 2,5-hexanodiona, piruvato de etilo o
2-octanona, preferiblemente éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico.
Los compuestos de fórmula I se utilizan en el procedimiento según
la invención en una cantidad de desde el 10% hasta el 25% con
respecto al volumen total, especialmente desde el 15% hasta el
22%.
Preferiblemente se añade al agua un tampón, por
ejemplo tampón fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanolamina con un
valor de pH de desde 5 hasta 10, preferiblemente un valor de pH de
desde 6 hasta 9. La concentración de tampón asciende a desde 10 mM
hasta 150 mM, preferiblemente desde 90 mM hasta 110 mM,
especialmente 100 mM. Adicionalmente, el tampón contiene también
iones magnesio, por ejemplo MgCl_{2} en una concentración de desde
0,2 mM hasta 10 mM, preferiblemente de 0,5 a 2 mM, especialmente 1
mM.
La temperatura asciende por ejemplo a desde
aproximadamente 10ºC hasta 70ºC, preferiblemente desde 30ºC hasta
60ºC.
Los disolventes orgánicos que pueden utilizarse
según la invención tienen preferiblemente un logP de desde 0,6
hasta 2,0, especialmente desde 0,6 hasta 1,9, de manera
especialmente preferible desde 0,63 hasta 1,75. Los disolventes
orgánicos preferidos son por ejemplo dietil éter,
terc-butilmetil éter, diisopropil éter, dibutil
éter o éster etílico del ácido acético, especialmente éster etílico
del ácido acético. Puede utilizarse éster etílico del ácido acético
por ejemplo en una cantidad de desde el 1% hasta el 90% con respecto
al volumen total de la mezcla de reacción, preferiblemente desde el
15% hasta el 60%, especialmente desde el 20% hasta el 50%.
La razón del disolvente orgánico con respecto al
agua asciende a desde 9 con respecto a 1 hasta 1 con respecto a 9,
preferiblemente desde 1 con respecto a 1 hasta 1 con respecto a
3.
El agua forma en el sistema bifásico según la
invención la primera fase líquida y el disolvente orgánico forma la
segunda fase líquida. Dado el caso, también puede estar presente
todavía otra fase sólida u otra líquida, que resulta por ejemplo de
la alcohol deshidrogenasa no completamente disuelta o del compuesto
de fórmula I. Sin embargo, se prefieren dos fases líquidas sin fase
sólida. Las dos fases líquidas se mezclan preferiblemente de manera
mecánica, de modo que se generan grandes superficies entre las dos
fases líquidas.
La concentración del cofactor NADPH o NADH con
respecto a la fase acuosa asciende a desde 0,05 mM hasta 0,25 mM,
especialmente desde 0,06 mM hasta 0,2 mM.
Preferiblemente se utiliza en el procedimiento
según la invención aún un estabilizador adicional de la alcohol
deshidrogenasa. Estabilizadores adecuados son por ejemplo glicerina,
sorbitol o dimetilsulfóxido (DMSO).
La cantidad de glicerina asciende a desde el 5%
hasta el 30% con respecto al volumen de la mezcla total. Cantidades
preferidas de glicerina son desde el 10% hasta el 20%, especialmente
del 20%.
Para la regeneración del NADH o NADPH empleado
en el procedimiento según la invención puede agregarse
adicionalmente isopropanol. Por ejemplo, se hace reaccionar el
isopropanol y NADP con la alcohol deshidrogenasa para dar NADPH y
acetona. La cantidad de isopropanol utilizada asciende a desde el 5%
hasta el 30% con respecto al volumen de la mezcla total. Cantidades
preferidas de isopropanol son de desde el 10% hasta el 20%,
especialmente del 10%.
Las alcohol deshidrogenasas adecuadas proceden
por ejemplo de levadura, hígado de caballo o Rhodococcus
erythropolis, necesitando estas enzimas NADH como coenzima, o de
Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir o
Lactobacillus brevis, necesitando estas enzimas NADPH como
coenzima.
Si se utiliza una alcohol deshidrogenasa por
ejemplo de levadura, hígado de caballo, Thermoanaerobium
brockii o Rhodococcus erythropolis en el procedimiento
según la invención, entonces se obtiene a partir del compuesto de
fórmula I el correspondiente (S)-hidroxicompuesto.
Si se utiliza una alcohol deshidrogenasa por ejemplo de
Lactobacillus kefir o Lactobacillus brevis en el
procedimiento según la invención, entonces se obtiene a partir del
compuesto de fórmula I el correspondiente
(R)-hidroxicompuesto.
La alcohol deshidrogenasa puede utilizarse en el
procedimiento según la invención o bien completamente purificada o
bien parcialmente purificada o puede usarse contenida en células. A
este respecto, las células utilizadas pueden estar presentes en
forma nativa, permeabilizada o lisada.
La actividad volumétrica de la alcohol
deshidrogenasa utilizada asciende a desde 100 unidades/ml (U/ml)
hasta 2000 U/ml, preferiblemente a aproximadamente 800 U/ml, en el
caso de un contenido en proteínas de desde aproximadamente 20 mg/ml
hasta 22 mg/ml. La alcohol deshidrogenasa utilizada preferiblemente
tiene una actividad específica de desde aproximadamente 35 hasta 40
U/mg de proteína. Por cada kg de compuesto de fórmula I que va a
hacerse reaccionar se utilizan de 20000 a 200000 U de alcohol
deshidrogenasa, de manera preferible aproximadamente 100000 U. A
este respecto la unidad enzimática 1 U corresponde a la cantidad de
enzimas que se necesita para hacer reaccionar 1 \mumol del
compuesto de fórmula I por minuto (min.).
El procedimiento según la invención se realiza
por ejemplo en un recipiente de reacción cerrado de vidrio o metal.
Para ello se transfieren individualmente los componentes al
recipiente de reacción y se agitan bajo una atmósfera de por
ejemplo nitrógeno o aire. Según el sustrato y el compuesto de
fórmula I utilizado, el tiempo de reacción asciende a desde 1 día
hasta 14 días, preferiblemente de 4 a 7 días.
A continuación se trata la mezcla de reacción.
Para ello se separa la fase acuosa, se filtra la fase de éster
etílico del ácido acético. Dado el caso puede extraerse una vez más
la fase acuosa y tratarse adicionalmente como la fase de éster
etílico del ácido acético. Después se evapora la fase filtrada a
presión reducida. Se obtiene así por ejemplo el producto éster
etílico del ácido
4-cloro-3-(S)-hidroxi-butanoico
con una pureza enantiomérica de más del 99,9% y esencialmente libre
del educto éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico.
El rendimiento total de los procesos asciende tras la destilación
del producto a desde el 82% hasta el 88% con respecto a la cantidad
de educto utilizada.
Sorprendentemente, los disolventes orgánicos con
un valor de log-P de desde 0 hasta 4 muestran un
efecto estabilizador sobre la alcohol deshidrogenasa, mientras que
en el estado de la técnica se desaconseja el uso de los sistemas
bifásicos con disolventes orgánicos (M. R. Kula, U. Kragel; capítulo
28, Dehydrogenases in Synthesis of Chiral Compounds; R. N. Patel,
Stereoselective Biocatalyses, 2000; Peters J. 9.
Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction
Conditions, and Application, en: H. J. Rehm, G. Reed Biotechnology,
vol 3, Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993; J. Lynda et al.;
Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis,
Biotechnol. Prog. 1991, 7, páginas 116-124). En el
procedimiento según la invención se usa como fase orgánica éster
etílico del ácido acético, en el que la fase orgánica sirve por un
lado como reserva para el compuesto de fórmula I, pero también
simultáneamente extrae el producto de reacción, el hidroxicompuesto
quiral de la fase acuosa.
En contraposición al estado de la técnica, la
utilización de disolventes orgánicos con un valor de
log-P de desde 0 hasta 3 conduce a una
estabilización adicional creciente con el transcurso del tiempo de
la alcohol deshidrogenasa. En el estado de la técnica, los
disolventes orgánicos especiales con un valor de
log-P (logaritmo del coeficiente de reparto de
octanol/agua) de desde 0 hasta 2 ejercen un efecto especialmente
desestabilizador sobre las enzimas y por consiguiente apenas se
tienen en consideración como fase orgánica en el sistema bifásico
(K. Faber, Biotransformations in organic chemistry, 3ª edición 1997,
Springer Verlag, capítulo 3. a 3.17).
La invención se refiere además a la alcohol
deshidrogenasa de Lactobacillus minor con un alto valor
óptimo de temperatura. La alcohol deshidrogenasa de
Lactobacillus minor tiene la secuencia de ADN según la SEQ
ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 4 según
el protocolo de secuencias adjunto. Esta alcohol deshidrogenasa de
Lactobacillus minor es R-específica,
pudiéndose obtener por ejemplo a partir de un compuesto de fórmula
I el correspondiente (R)-hidroxicompuesto. La
alcohol deshidrogenasa enantioselectiva de Lactobacillus
minor puede sobreexpresarse sorprendentemente en Escherichia
coli RB 791, mientras que las alcohol deshidrogenasas de otras
clases del género Lactobacillus sólo pudieron expresarse
esencialmente de modo más reducido. Esto es tanto más sorprendente
dado que la alcohol deshidrogenasa en la cepa salvaje de
Lactobacillus minor incluso se expresa sólo muy poco y por
consiguiente no era detectable con procedimientos de detección de
uso común (biotransformación de células completas, prueba de
actividad). Por tanto fue muy sorprendente que pudiera clonarse a
partir de Lactobacillus minor una alcohol deshidrogenasa
R-enantioselectiva y pudiera sobreexpresarse en
Escherichia coli de manera excepcionalmente intensa (el 50%
de la proteína celular del clon, 20.000 unidades/g de peso
húmedo).
La enzima purificada de Lactobacillus
minor es estable en un intervalo de pH de desde aproximadamente
5,5 hasta 8,5. La enzima es estable hasta aproximadamente 40ºC y el
valor óptimo del pH de la reacción enzimática se encuentra en el
intervalo de desde pH 7 hasta pH 7,5. El valor óptimo de temperatura
de la reacción enzimática se encuentra en aproximadamente 55ºC. La
enzima presenta un amplio espectro de sustratos.
La enzima puede purificarse por medio de
cromatografía de interacción hidrófoba hasta una actividad
específica de desde 35 hasta 40 U/mg de proteína.
La invención se refiere también a un
procedimiento para la obtención de la alcohol deshidrogenasa de
Lactobacillus minor. Para ello se expresa el ADN, que
codifica para la alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus
minor, en un microorganismo procariota o eucariota adecuado.
Preferiblemente, la alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus
minor se transforma y se expresa en una cepa de Escherichia
coli, especialmente en Escherichia coli RB 791.
La alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus
minor puede obtenerse por ejemplo de modo que se cultivan las
células de Escherichia coli recombinantes, se induce la
expresión de la alcohol deshidrogenasa y a continuación, tras
aproximadamente de 10 a 18 horas (h) se liberan las células mediante
tratamiento con ultrasonidos o mediante la prensa francesa
(Gaullin, Siemens). El extracto celular obtenido o bien puede usarse
directamente o bien puede purificarse adicionalmente. Para ello,
por ejemplo, el extracto celular se centrifuga y el sobrenadante
obtenido se somete a una cromatografía de interacción hidrófoba.
Esta cromatografía tiene lugar preferiblemente a pH 7,0 en un tampón
acuoso que también contiene iones magnesio.
La alcohol deshidrogenasa según la invención
puede estar presente para la producción del compuesto de fórmula II
o bien completa o bien parcialmente purificada o también puede
utilizarse en el procedimiento contenida en células. A este
respecto, las células pueden estar presentes en forma nativa,
permeabilizada o lisada.
Es también objeto de la invención un clon
recombinante de Escherichia coli RB 791, que expresa la
alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus minor y que se
depositó el 26 de marzo de 2001 bajo los requisitos del Tratado de
Budapest en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos
Celulares, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig con el número DSM
14196.
La invención se explica mediante los siguientes
ejemplos:
Para el cribado se cultivaron distintas cepas de
lactobacilos en el siguiente medio (datos en cada caso en g/l):
glucosa (20), extracto de levadura (5), extracto de carne (10),
hidrogenocitrato de diamonio (2), acetato de sodio (5), sulfato de
magnesio (0,2), sulfato de manganeso (0,05), hidrogenofosfato de
dipotasio (2).
Se esterilizó el medio a 121ºC y se cultivaron
las cepas del género Lactobacillus (a continuación abreviado
como L.) sin suministro de oxígeno ni regulación del pH adicionales.
A continuación se separaron por centrifugación las células y para la
biotransformación de células completas se resuspendieron en cada
caso 4 g de células en un volumen final de 10 ml de tampón fosfato
de potasio (tampón KPi) (50 mM, pH = 7,0). Tras la adición de en
cada caso 0,1 g de glucosa se agitaron las células durante 15 min. a
30ºC. A la suspensión celular se le añadió éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
4 en una concentración final de 40 mM y tras 10 min. y 120 min. en
cada caso tuvo lugar el análisis del medio mediante cromatografía de
gases. Para ello se separaron por centrifugación las células, se
filtró el sobrenadante y se diluyó en cloroformo hasta una
concentración final de 10-15 \mug/ml de éster
etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico.
El éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
utilizado como sustrato se hizo reaccionar a partir de las distintas
cepas de lactobacilos con la siguiente pureza enantiomérica para dar
(S)-4-cloro-3-hidroxibutirato
de etilo.
El exceso enantiomérico se calcula tal como
sigue: ee(%) = ((R-alcohol -
S-alcohol)/(R-alcohol +
S-alcohol)) x 100.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspendió el sedimento celular de
aproximadamente 2 ml de líquido de cultivo del género
Lactobacillus en 300 \mul de tampón TE (que contenía
Tris/HCl 10 mM, pH = 8, EDTA 1 mM), se mezcló con lisozima 20 mg/ml
y se incubó durante 10 min. a 37ºC. A continuación se añadieron 100
\mul de dodecilsulfato de sodio (SDS) (10%), 100 \mul de
perclorato de Na (5 M) y 500 \mul de cloroformo/alcohol isoamílico
(24:1). Tras agitación fuerte se separó por centrifugación la
proteína y se transfirió la fase acuosa a un nuevo recipiente
Eppendorf. Después se añadieron 800 \mul de etanol (EtOH) (96%).
Se invirtió múltiples veces el recipiente Eppendorf y a continuación
se transfirió el ADN cromosómico precipitado a un nuevo recipiente
Eppendorf y se lavó con 200 \mul de EtOH. Se transfirió de nuevo
el ADN a un nuevo recipiente Eppendorf, se secó a presión reducida y
se disolvió en 100 \mul de tampón TE.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores usados para la PCR se derivaron de
la secuencia N-terminal y C-terminal
conocida de la alcohol deshidrogenasa de L. kefir. A este
respecto, se consideraron preferencias conocidas para los
determinados codones en lactobacilos. De ese modo se colocó delante
de cada cebador en 5' el codón ATG (Met) como codón de iniciación,
además se colocó delante del codón de iniciación en el cebador en 5'
el sitio de corte para la enzima de restricción BamHI (GGATCC), para
permitir la clonación posterior en el vector de expresión. Detrás
del cebador en 3' se colocó el codón de terminación (TAG) y el sitio
de corte para HindIII (AAGCTT). Los constructos de cebador se
enumeran a continuación
N = A, T, C o G; Y = T o C; R = A o G
Cebador en 5'
| 5'GCGGATCCATGACNGAYCGNTTRAARGGNAARGTNGC3' | (SEQ ID NO: 1) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador en 3'
| 5'GGGAAGCTTCTAYTGNGCNGTRTANCCNCCRTCNAC3' | (SEQ ID NO: 2) |
Se produjeron los cebadores según procedimientos
conocidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla para PCR (100 \mul):
Los dNTP son una mezcla de desoxinucleótidos
trifosfato tales como dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclo:
2 min. a 95ºC, después
mantener a 80ºC
iniciación en caliente, después
30 s a 95ºC, después
1 min. a 40ºC 30x
después en cada caso 30 veces durante 30 s a
95ºC y 1 min. a 40ºC, a continuación
2,5 min. a 72ºC
después
2,5 min. a 72ºC
después
mantener a 10ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Para el análisis se pusieron 10 \mul de la
mezcla en un gel agarosa al 1% y se separaron electroforéticamente a
100 V constantes. La PCR mostró la amplificación clara de un trozo
de ADN de aproximadamente 750 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la obtención del fragmento de PCR se puso
la mezcla de PCR total en un gel de agarosa al 1% y se separó
electroforéticamente a 100 V constantes. Para ello se dividió el gel
en dos carriles, de los que uno contenía la mezcla de PCR completa y
el otro sólo una muestra de 5 \mul, de modo que para cortar el
fragmento de PCR del gel para la orientación sólo el carril con la
muestra se tiñó con bromuro de etidio, para evitar un daño del
fragmento de PCR que va a aislarse mediante el bromuro de etidio y
mediante luz UV.
El aislamiento del gel tuvo lugar con el kit de
extracción de gel QIAquick de la empresa Qiagen de Hilden.
La determinación de la concentración dio como
resultado una concentración total de 20 ng/\mul de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la preparación del ligamiento se cortaron
el fragmento de PCR purificado y el vector de clonación usado pQE30
o pQE 70 ambos de la empresa Quiagen con BamHI y HindIII (4 \mul
de ADN = 200 ng de ADN, 1 \mul de tampón 10x; 1 \mul de enzima,
BSA y H_{2}O (Biolabs, Nueva Inglaterra)).
Entonces se purificó de nuevo el plásmido
cortado por medio del kit de extracción de gel QIAquick, se llevó a
agua por medio de fosfatasa alcalina desfosforilada (USB, Amersham
Life Science).
Para la purificación se pusieron las
correspondientes mezclas de reacción de nuevo en un gel agarosa al
1% y de ese modo se aislaron del gel el producto amplificado
digerido así como el plásmido tal como se describió en D.). La
concentración del plásmido y el producto amplificado tras la
purificación ascendía a aproximadamente 20 ng/\mul.
Para el ligamiento se utilizaron 3 \mul de
pQE30 o pQE 70 (60 ng), 2,5 \mul de producto amplificado (50 ng),
2 \mul de tampón ligasa (Boehringer; Mannheim), 1,5 \mul de
H_{2}O y 1 \mul de ligasa de T4 (Boehringer; Mannheim). Se
incubó la mezcla durante la noche a 16ºC.
A continuación se transformaron mediante
electroporación 40 \mul de células electrocompetentes de
Escherichia coli RB791 con 1,5 \mul de mezcla de
ligamiento. Se añadieron las células a 500 \mul de medio SOC, se
incubaron durante 45 min. a 37ºC y a continuación se colocaron en
placa 250 \mul en cada caso en placas de agar LB_{amp}. El
medio SOC contiene por litro de agua 20 g de triptona, 5 g de
extracto de levadura, 0,5 g de NaCl, 10 ml de MgSO_{4} 1 M y 10
ml de MgCl_{2} 1 M. Las placas de agar LB_{amp} contienen por
litro de agua 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de
NaCl, 20 g de agar, pH 7,0 y 50 mg de ampicilina.
Se sembraron colonias lavadas y se cultivaron en
4 ml de cultivo líquido (medio LB_{amp}) durante la noche a 37ºC.
De esta suspensión celular se utilizaron en cada caso 2 ml para la
preparación de plásmidos (de manera correspondiente al protocolo
miniprep de Quiagen (Quiagen, Hilden)).
A partir de la preparación de plásmidos se
aplicó una digestión de restricción con BamHI y HindIII. La
digestión completa se puso en un gel de agarosa al 1% y se separó
electroforéticamente a 100 V (detección del inserto de 750 kp) y a
continuación se utilizaron los plásmidos dado el caso para la
secuenciación. Entonces se colocaron en placa clones con el inserto
de 750 kp en placas de agar LB_{amp}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la secuenciación por medio del kit de
secuenciación de ADN SequiThermEXCEL II
Long-Read
(Biozym, Oldendorf) en el secuenciador Li-Cor (MWG Biotech, Ebersberg) de manera correspondiente a las indicaciones del fabricante. Se usaron como cebador los cebadores de secuenciación convencionales para los vectores pQE.
(Biozym, Oldendorf) en el secuenciador Li-Cor (MWG Biotech, Ebersberg) de manera correspondiente a las indicaciones del fabricante. Se usaron como cebador los cebadores de secuenciación convencionales para los vectores pQE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a ensayo clones con insertos de
750 kp con respecto a la actividad enzimática y la
estereoselectividad. Para ello se sembraron las colonias de las
placas de agar LB_{amp} y se cultivaron en 20 ml de cultivos
líquidos (medio LB_{amp}) a 25ºC. Entonces, a una densidad celular
(DO_{500}) de 0,5 tuvo lugar la inducción con
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) 1 mM. Tras 18 h se separaron por centrifugación las células y
se llevaron en cada caso 40 mg de células a 350 \mul de tampón Kpi
(50 mM, pH = 7, MgCl_{2} 1 mM). Se logró la liberación enzimática
de las células mediante molienda en húmedo con ayuda de perlas de
vidrio (0,5 g, 0,3 mm). Para ello tuvo lugar una disgregación de 20
minutos por medio de un molino Retsch a 4ºC.
La prueba enzimática contenía 870 \mul de
tampón trietanolamina (100 mM, pH=7,0, MgCl_{2} 1 mM), 100 \mul
de una disolución 100 mmolar de éster etílico del ácido
4-Cl-acetoacético, 10 \mul de
NADPH (concentración final de 0,19 mM) y 20 \mul de disolución
enzimática.
La definición de unidad enzimática: 1 U
corresponde a la cantidad de enzima que se necesita para hacer
reaccionar 1 \mumol de sustrato (éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico)
por 1 min.
Para la detección de la estereoselectividad se
incubaron 480 \mul de tampón trietanolamina (100 mM; pH=7,0,
MgCl_{2} 1 mM) con éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
1,0 mM, NADPH 1,9 mM (en cada caso concentración final) y 20 \mul
de disolución enzimática. Tras 15 min. de incubación se filtró la
mezcla de reacción y se diluyó 1:10 en cloroformo y se analizó una
muestra por medio de CG-EM.
Condiciones de la cromatografía de gases
(CG):
Columna quiral: Lipodex E, DI = 0,25 mm, l = 25
m (Macherey-Nagel)
- 1.
- 2 min. a 60ºC
- 2.
- en 28 min. desde 60ºC hasta 130ºC con una velocidad de 2,5ºC por minuto
- 3.
- 15 min. a 130ºC
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las siguientes cepas de lactobacilos
pudo clonarse una alcohol deshidrogenasa
(R)-específica y sobreexpresarse de manera
activa:
Se cultivó la cepa con la mayor actividad
enzimática para la obtención de enzimas en un fermentador (Fed
batch, 10 l). La inducción tuvo lugar a una DO_{500} de 40 con
IPTG 1 mM. Tras 18 h tuvo lugar la recogida de células en la que se
llevaron 300 g de células a 3 l de tampón Kpi (50 mM, pH = 7,
MgCl_{2} 1 mM), a continuación tuvo lugar la disgregación celular
por medio de una prensa francesa (Gaullin, Siemens). El sobrenadante
obtenido tras la centrifugación se denomina a continuación extracto
bruto y presentaba una actividad volumétrica de aproximadamente 2000
U/ml (20000 U/g de masa húmeda).
Para la caracterización enzimática se purificó
una parte de la enzima obtenida por medio de cromatografía de
interacción hidrófoba en Q-Sepharose ff (fast
flow, flujo rápido). Para ello se equilibró la columna usada con
tampón Kpi 50 mM pH = 7,0, MgCl_{2} 1 mM. Tras la aplicación del
extracto bruto en la columna y el lavado corto con el tampón de
equilibrio se eluyó la enzima con un gradiente salino lineal
creciente (NaCl 0-1 M, 1 ml/min.) a una
concentración salina de aproximadamente NaCl 0,3 M. Tras la
combinación de las fracciones que contenían enzima se obtuvieron
aproximadamente 25 ml de la enzima purificada con una actividad
volumétrica de aproximadamente 800 U/ml y un contenido en proteína
de desde 20 hasta 22 mg/ml. La enzima purificada de ese modo tiene
por lo tanto una actividad específica de desde aproximadamente 35
hasta 40 U/mg de proteína.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Se determinaron todas las actividades
enzimáticas a 25ºC. La actividad enzimática se calculó tal como
sigue:
- Cálculo:
- 1 unidad = 1 \mumol de conversión de sustrato/min.
- \quad
- Ley de Lambert-Beer
\vskip1.000000\baselineskip
Se siguió la reducción de NADPH a 340 nm (véase
la mezcla de prueba enzimática) = \DeltaE/min.
- N =
- Factor de dilución de enzima
- V =
- Volumen de enzima en ml (0,01)
- V_{cubeta} =
- Volumen de la cubeta = 1 ml
- d =
- Espesor de la capa de la cubeta = 1 cm
- e_{NADPH} =
- Coeficiente de extinción de NADPH = 6,22[mM^{-1} * cm^{-1}]
- Actividad =
- (\DeltaE/min. * N * V_{cubeta})/(e_{NADPH} * V * d)
Se empleó la determinación de proteínas según
Bradford (Bio-Rad-Laboratories GmbH,
Protein Assay)
\vskip1.000000\baselineskip
Para la síntesis catalizada por enzimas de
(S)-4-cloro-3-hidroxibutirato
de etilo a partir de éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
se utilizó el extracto bruto obtenido en el ejemplo 2 de la alcohol
deshidrogenasa y la coenzima NADP. Se regeneró continuamente la
coenzima oxidada mediante la presencia simultánea de isopropanol, de
modo que la reacción necesitó sólo cantidades catalíticas de
coenzima.
La mezcla contenía:
2 l de tampón trietanolamina 100 mM pH =7,0,
MgCl_{2} 1 mM, glicerina al 10%,
400 mg de NADP,
800 ml de éster etílico del ácido acético,
600 ml éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
y
aproximadamente 100000 unidades de alcohol
deshidrogenasa.
Tras la agitación durante 3 días a temperatura
ambiente pudo detectarse mediante cromatografía de gases la reacción
completa del éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
para dar
(S)-4-cloro-3-hidroxibutirato
de etilo con más del 99,9% de pureza enantiomérica.
Tras la separación de la fase acuosa,
evaporación del disolvente y dado el caso destilación se obtiene el
(S)-4-cloro-3-hidroxibutirato
de etilo puro con más del 99,9% de pureza enantiomérica.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción para la reacción de 10 l
de éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
es tal como sigue:
18 l de tampón trietanolamina 100 mM pH =7,0,
MgCl_{2} 1 mM, glicerina al 10%,
4 g de NADP,
10 l de isopropanol,
10 l de éster etílico del ácido acético,
10 l de éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
y
aproximadamente 2 millones de unidades de
alcohol deshidrogenasa (1,25 l de extracto bruto).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tras la agitación durante 7 días a temperatura
ambiente pudo detectarse mediante cromatografía de gases la reacción
completa del éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
para dar
(S)-4-cloro-3-hidroxibutirato
de etilo con más del 99,9% de pureza enantiomérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió a ensayo la dependencia de la
actividad de la enzima en caso de almacenamiento en tampones con
distintos valores de pH en el intervalo de desde pH 4 hasta 11. Para
ello se aplicaron distintos tampones (50 mM) en el intervalo de
desde pH 4 hasta 11 y en los mismos se diluyó 1:100 la enzima
purificada en el ejemplo 2 y se incubó durante 30 min. Todos los
tampones contenían MgCl_{2} 1 mM. A continuación de los mismos se
utilizaron 10 \mul en la prueba enzimática normal (tampón
trietanolamina 100 mM pH = 7,0, MgCl_{2} 1 mM, éster etílico del
ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
10 mM y NADPH 0,19 mM). Se siguió la reacción durante 1 min. a 30ºC
y 340 nm.
A este respecto el valor inicial es el valor de
medición, que se obtiene inmediatamente tras la dilución la enzima
en tampón trietanolamina 50 mM pH = 7,0. Este valor correspondía en
condiciones fijadas a una modificación de la extinción de 0,20/min.
y se fijó como el valor del 100% y todos los siguientes valores de
medición se fijaron en relación a este valor.
La tabla 2 muestra que la enzima presenta una
buena estabilidad con respecto al pH especialmente en el intervalo
ácido, a este respecto la estabilidad enzimática parece depender no
sólo del valor del pH sino también del sistema tampón usado. Por
ejemplo se comprueba con el uso de tampones TRIS y MES con igual
valor de pH una inactivación más fuerte de la enzima que en el
tampón KPi. En el tampón Kpi no se mostró en el intervalo de pH de
desde 5,5 hasta 8,5 ninguna inactivación significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera análoga a lo descrito en A.) se
determinó la estabilidad térmica para el intervalo de desde 25ºC
hasta 50ºC. Para ello se incubó en cada caso una dilución 1:100 de
la enzima purificada durante 30 min. a la temperatura respectiva y a
continuación se midió a 30ºC con la mezcla de prueba anterior.
También en este caso se recurrió al valor de medición como valor de
partida, que se obtiene inmediatamente tras la dilución de la enzima
en el tampón trietanolamina 50 mM pH = 7,0. Este valor se fijó
también en este caso como el valor del 100%. La alcohol
deshidrogenasa de L. minor es estable hasta una temperatura
de 40ºC. Después disminuye rápidamente la actividad.
Para la determinación del valor óptimo de pH se
determinó la reacción enzimática en los respectivos tampones
enumerados en la tabla 3. La concentración del éster etílico del
ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
ascendía tal como en la prueba patrón a 10 mM y de NADPH a 0,19 mM.
Se determinó la reacción a 30ºC. A este respecto pudo establecerse
para la enzima según la invención un valor óptimo de pH entre 7 y
7,5.
\newpage
Para la determinación de la temperatura de
prueba óptima se midió la actividad enzimática desde 25ºC hasta
60ºC. La mezcla de prueba correspondía a la concentración patrón del
éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
y NADPH. Tal como es evidente a partir de la tabla 5, la enzima
tiene su temperatura de prueba óptima a 55ºC, a continuación
disminuye rápidamente la actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Además del éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
se utilizaron además aún otros sustratos en la mezcla de prueba
enzimática. Para ello se usó la siguiente mezcla de prueba:
970 \mul de tampón trietanolamina (100 mM, pH
= 7,0, MgCl_{2} 1 mM con cetocompuesto 10 mM)
20 \mul de NADPH (0,19 mM en la mezcla de
prueba)
10 \mul de enzima (1:100)
A este respecto se fijó al 100% la actividad
establecida con el éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico
y las actividades enzimáticas de los otros sustratos se fijaron en
relación a este valor.
\vskip1.000000\baselineskip
Para someter a ensayo la estabilidad enzimática
en contacto con disolventes orgánicos se diluyó 1:100 la alcohol
deshidrogenasa de L. minor en las mezclas de disolventes
expuestas y se incubó a temperatura ambiente (en el caso de
disolventes orgánicos no miscibles con agua, la dilución se refiere
a la fase acuosa). A este respecto se garantizó un mezclado continuo
de ambas fases (mezcladora, 200 rpm). A continuación se utilizaron
10 \mul de la disolución enzimática en la mezcla de prueba patrón.
También en este caso se fijó el valor de partida tras la dilución en
el tampón (tampón trietanolamina 100 mM, pH = 7,0, MgCl_{2} 1 mM)
igual al 100% y todos los otros valores se fijaron en relación a
éste.
A.) Disolventes miscibles con
agua
Tal como es evidente a partir de la tabla 7A,
glicerina, DMSO y sorbitol actúan de manera activadora o
estabilizadora sobre la alcohol deshidrogenasa utilizada. El
isopropanol que va a usarse en el procedimiento actúa por el
contrario de manera inactivadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como es evidente a partir de la tabla 7B, la
alcohol deshidrogenasa sometida a ensayo en un gran número de
disolventes orgánicos muestra una estabilidad considerable. A este
respecto es llamativo que los disolventes con valores de logP entre
0 y 3 no inhiban más fuerte la alcohol deshidrogenasa sometida a
ensayo que aquéllos con valores de log P entre 3 y 4,5,
especialmente teniendo en cuenta los tiempos de incubación más
largos (24 h y 48 h) los disolventes con valores de log P entre 0 y
3 tienen un efecto estabilizador sobre la ADH sometida a ensayo, en
comparación con los correspondientes valores en el tampón. Los
disolventes alifáticos sometidos a ensayo pentano, hexano, heptano y
octano muestran este efecto estabilizador en incubación de larga
duración.
El valor de log P de un componente X es el
logaritmo del coeficiente de reparto de X en el sistema bifásico de
octanol/agua (50/50)
P = concentración de X en fase de
octanol/concentración de X en fase acuosa
\vskip1.000000\baselineskip
Para someter a ensayo la estabilidad enzimática
en las condiciones de procedimiento se diluyó 1:100 la alcohol
deshidrogenasa de L. minor con la mezcla de disolventes usada
en el sistema bifásico y se incubó a temperatura ambiente. A
continuación se utilizaron 10 \mul de la disolución enzimática en
la mezcla de prueba patrón.
En la tabla 8 están representadas las
actividades enzimáticas en % del valor de partida.
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla B: tampón, glicerina al 10%, isopropanol
al 10%
Mezcla C: tampón, glicerina al 20%, isopropanol
al 10%
Mezcla D: tampón, glicerina al 10%, isopropanol
al 10% + éster etílico del ácido acético al 20%
\vskip1.000000\baselineskip
Se comprobó que la alcohol deshidrogenasa de
L. minor en la combinación de disolventes usada en el sistema
bifásico es activa y estable durante varios días.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Juelich Enzyme Products GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento enzimático para la
reducción enantioselectiva de cetocompuestos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> (TH) Juelich Enzyme
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 795
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatccat gacngaycgn ttraarggna argtngc
\hfill37
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaagcttc taytgngcng trtanccncc rtcnac
\hfill36
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Procedimiento para la reducción
enantioselectiva de un cetocompuesto de fórmula I
(I)R^{1}-C(O)-R^{2}
en la que R^{1} y R^{2}
independientemente entre sí son iguales o diferentes y
representan
- 1.
- átomo de hidrógeno,
- 2.
- alquilo (C_{1}-C_{20}), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada,
- 3.
- alquenilo (C_{2}-C_{20}), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,
- 4.
- alquinilo (C_{2}-C_{20}), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,
- 5.
- arilo (C_{6}-C_{14}),
- 6.
- alquil (C_{1}-C_{8})-arilo (C_{6}-C_{14}), o
- 7.
- R^{1} y R^{2} forman junto con el resto -C(O)- un arilo (C_{6}-C_{14}) o un heterociclo (C_{5}-C_{14}),
- en la que los restos mencionados anteriormente en 1 a 7 están no sustituidos o están de mono- a trisustituidos independientemente entre sí con
- a)
- -OH,
- b)
- halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,
- c)
- -NO_{2},
- d)
- -C(O)-O-alquilo (C_{1}-C_{20}), en el que alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o de mono- a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o
- e)
- heterociclo (C_{5}-C_{14}), que está no sustituido o de mono- a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro,
caracterizado porque
- a)
- un compuesto de fórmula I con un porcentaje de desde el 10% hasta el 25%, con respecto al volumen total de la mezcla de reacción, alcohol deshidrogenasa, agua, cofactor NADPH o NADH y un disolvente orgánico con un logP de desde 0,5 hasta 4,0;
- b)
- se incuban en un sistema bifásico de agua, disolvente orgánico y el compuesto de fórmula (I);
- c)
- se regenera continuamente el cofactor oxidado formado por la alcohol deshidrogenasa, y
- d)
- se aísla el hidroxicompuesto quiral.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza un compuesto de fórmula I de
la serie éster etílico del ácido
4-cloro-3-oxo-butanoico,
acetofenona, éster metílico del ácido acetoacético,
2-oxo-4-fenilbutirato
de etilo, 2,5-hexanodiona, piruvato de etilo o
2-octanona.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque se utiliza un disolvente orgánico con un
logP de desde 0,6 hasta 3,0, especialmente desde 0,6 hasta 1,9.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque se utiliza un disolvente orgánico con un
logP de desde 0,63 hasta 1,75.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como disolvente orgánico se utiliza
dietil éter, terc-butilmetil éter, diisopropil éter
o éster etílico del ácido acético.
6. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utiliza una
alcohol deshidrogenasa de levadura, hígado de caballo,
Thermoanaerobium brockii, Rhodococcus erythropolis, Lactobacillus
kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor o una alcohol
deshidrogenasa con la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:
4.
7. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se añade un
tampón tal como tampón fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanolamina
con un valor de pH de desde 5 hasta 10, preferiblemente con un valor
de pH de desde 6 hasta 9.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque se añaden al tampón iones magnesio tales
como MgCl_{2}, en una concentración de desde 0,2 mM hasta 10 mM,
preferiblemente de 0,5 mM a 2 mM.
9. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque como cofactor se
añade NADPH o NADH en una cantidad de desde 0,05 mM hasta 0,25 mM,
especialmente desde 0,06 mM hasta 0,2 mM, con respecto a la fase
acuosa.
10. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque como
estabilizador para la alcohol deshidrogenasa se agrega glicerina,
sorbitol o dimetilsulfóxido.
11. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se agrega
isopropanol.
12. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los compuestos
de fórmula I se utilizan en una cantidad de desde el 15% hasta el
22%, con respecto al volumen total.
13. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se realiza la
reacción a una temperatura de desde aproximadamente 10ºC hasta 70ºC,
preferiblemente desde 30ºC hasta 60ºC.
14. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque se utiliza el
disolvente orgánico en una cantidad de desde el 1% hasta el 90%, con
respecto al volumen total de la mezcla de reacción, preferiblemente
desde el 15% hasta el 60%, especialmente desde el 20% hasta el
50%.
15. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la razón del
disolvente orgánico con respecto al agua asciende a desde 9 con
respecto a 1 hasta 1 con respecto a 9, preferiblemente desde 1 con
respecto a 1 hasta 1 con respecto a 3.
16. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque se utiliza el estabilizador en una
cantidad de desde el 5% hasta el 30%, con respecto al volumen de la
mezcla de reacción total, preferiblemente desde el 10% hasta el 20%,
especialmente del 20%.
17. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se utiliza isopropanol en una cantidad
de desde el 5% hasta el 30%, con respecto al volumen de la mezcla de
reacción total, preferiblemente desde el 10% hasta el 20%,
especialmente del 10%.
18. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque se utiliza la alcohol deshidrogenasa en
una cantidad de desde 20000 U hasta 200000 U por kg de compuesto de
fórmula I que va a hacerse reaccionar, de manera preferible
aproximadamente 100000 U.
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