PL207271B1 - Sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego - Google Patents
Sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowegoInfo
- Publication number
- PL207271B1 PL207271B1 PL367043A PL36704302A PL207271B1 PL 207271 B1 PL207271 B1 PL 207271B1 PL 367043 A PL367043 A PL 367043A PL 36704302 A PL36704302 A PL 36704302A PL 207271 B1 PL207271 B1 PL 207271B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- alcohol dehydrogenase
- compound
- hydroxy
- organic solvent
- formula
- Prior art date
Links
- 230000009467 reduction Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 title abstract 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 58
- -1 hydroxy, amino Chemical group 0.000 claims abstract description 43
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 241000186864 Weissella minor Species 0.000 claims abstract description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims abstract description 9
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 36
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 22
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical group CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 8
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 7
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 claims description 6
- OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CCl OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 6
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 claims description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 2,5-hexanedione Chemical compound CC(=O)CCC(C)=O OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N Acetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1 KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 241001147775 Thermoanaerobacter brockii Species 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 4
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 3
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N Ethyl pyruvate Chemical compound CCOC(=O)C(C)=O XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N Methylacetoacetic acid Chemical compound COC(=O)CC(C)=O WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- STPXIOGYOLJXMZ-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-oxo-4-phenylbutanoate Chemical compound CCOC(=O)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 STPXIOGYOLJXMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940117360 ethyl pyruvate Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000005915 C6-C14 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 abstract description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 abstract 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 abstract 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 abstract 1
- HGASFNYMVGEKTF-UHFFFAOYSA-N octan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCCCCCO HGASFNYMVGEKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 51
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 51
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 12
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- ZAJNMXDBJKCCAT-YFKPBYRVSA-N ethyl (3s)-4-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@H](O)CCl ZAJNMXDBJKCCAT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 7
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 241001643453 Lactobacillus parabuchneri Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186837 Weissella kandleri Species 0.000 description 3
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N benzopyrazine Natural products N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N heptamethylene Natural products C1CCCCCC1 DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 2-octanone Chemical compound CCCCCCC(C)=O ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N Cyclopentane Chemical compound C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000001238 wet grinding Methods 0.000 description 2
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- FUOSTELFLYZQCW-UHFFFAOYSA-N 1,2-oxazol-3-one Chemical class OC=1C=CON=1 FUOSTELFLYZQCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 1H-indazole Chemical compound C1=CC=C2C=NNC2=C1 BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002941 2-furyl group Chemical group O1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001622 2-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C(*)C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000389 2-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 2H-isoindole Chemical compound C1=CC=CC2=CNC=C21 VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGAVZWMNOPFOCW-UHFFFAOYSA-N 2h-1,2,4-thiadiazol-5-one Chemical class O=C1NC=NS1 IGAVZWMNOPFOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001397 3-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NARBENWONSCWHU-UHFFFAOYSA-N 3h-1,2,3,5-oxathiadiazole Chemical compound N1SON=C1 NARBENWONSCWHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186777 Fructobacillus fructosus Species 0.000 description 1
- 101000933252 Homo sapiens Protein BEX3 Proteins 0.000 description 1
- 241000186723 Lactobacillus bifermentans Species 0.000 description 1
- 241001468197 Lactobacillus collinoides Species 0.000 description 1
- 241000186784 Lactobacillus oris Species 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025955 Protein BEX3 Human genes 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical compound C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186838 Weissella halotolerans Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 125000005428 anthryl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C3C(*)=C([H])C([H])=C([H])C3=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 108010064866 biozym Proteins 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N carbocromen Chemical compound CC1=C(CCN(CC)CC)C(=O)OC2=CC(OCC(=O)OCC)=CC=C21 KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- WCZVZNOTHYJIEI-UHFFFAOYSA-N cinnoline Chemical compound N1=NC=CC2=CC=CC=C21 WCZVZNOTHYJIEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004655 dihydropyridinyl group Chemical group N1(CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 125000003983 fluorenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)* 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N isothiazole Chemical compound C=1C=NSC=1 ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N isoxazole Chemical compound C=1C=NOC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZVTQYRVARPYRRE-UHFFFAOYSA-N oxadiazol-4-one Chemical class O=C1CON=N1 ZVTQYRVARPYRRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDCVQGAUCOROHB-UHFFFAOYSA-N oxadiazolidine-4,5-dione Chemical class O=C1NNOC1=O YDCVQGAUCOROHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N phthalazine Chemical compound C1=NN=CC2=CC=CC=C21 LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 125000004307 pyrazin-2-yl group Chemical group [H]C1=C([H])N=C(*)C([H])=N1 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000246 pyrimidin-2-yl group Chemical group [H]C1=NC(*)=NC([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004527 pyrimidin-4-yl group Chemical group N1=CN=C(C=C1)* 0.000 description 1
- 125000004528 pyrimidin-5-yl group Chemical group N1=CN=CC(=C1)* 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N quinazoline Chemical compound N1=CN=CC2=CC=CC=C21 JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000011916 stereoselective reduction Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005958 tetrahydrothienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000004568 thiomorpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego.
Optycznie czynne hydroksyzwiązki są wartościowymi syntetycznymi jednostkami budulcowymi do wytwarzania wielu farmakologicznie ważnych związków. Związki te są często trudne do wytworzenia za pomocą klasycznych chemicznych sposobów i tylko rzadko mogą uzyskiwać wymagane do zastosowań farmakologicznych czystości enancjomerów. Dlatego też zazwyczaj do wytwarzania związków chiralnych są stosowane sposoby biotechnologiczne, gdzie stereoselektywne reakcje są przeprowadzane albo przez całe mikroorganizmy albo przez izolowane enzymy.
Często korzystne okazało się stosowanie izolowanych enzymów, ponieważ z nimi z reguły uzyskiwane są wyższe wydajności jak i wyższa czystość enancjomerów.
Dehydrogenazy, a w szczególności dehydrogenazy alkoholowe, są wartościowymi katalizatorami do uzyskiwania produktów chiralnych przez stereoselektywną redukcję organicznych związków ketonowych do odpowiednich chiralnych alkoholi. Zasadniczo znane są odpowiednie enzymy z drożdży, wątroby konia lub Thermoanaerobium brockii. Enzymy te jako koenzymy wymagają NADH (dinukleotyd nikotynoadeninowy) lub NADPH (fosforan dinukleotydu nikotynoadeninowego). Dalszymi znanymi dehydrogenazami alkoholowymi są, na przykład, (S)-specyficzna dehydrogenaza alkoholowa z Rhodococcus erythropolis i (R)-specyficzna dehydrogenaza alkoholowa z rodzaju Lactobacillus. Oba typy enzymów mają szerokie spektrum substratów ketonowych i wykazują wysoką enancjoselektywność. Do uzyskiwania chiralnych (R)-alkoholi szczególnie nadają się dehydrogenazy alkoholowe z Lactobacillus kefir (DE 40 14 573) i Lactobacillus brevis (DE 196 10 984).
Niekorzystne dla stosowania dehydrogenaz alkoholowych są jednak niska stabilność enzymu i aktywność enzymatyczna dehydrogenaz alkoholowych w rozpuszczalnikach organicznych i czę sto tylko słaba rozpuszczalność w wodzie związków ketonowych, które mają być redukowane. Dalszym czynnikiem ograniczającym stosowanie dehydrogenaz alkoholowych w organicznych rozpuszczalnikach jest konieczne zastosowanie NADE lub NAD ze względu na potrzebę kofaktora, ponieważ kofaktor (NADP, NAD) jest rozpuszczalny w wodzie i jest regenerowany ekonomicznymi sposobami.
Wynalazek ma na celu poprawienie wymienionych wad przez modyfikację warunków sposobu. To zadanie jest rozwiązane według wynalazku przez zastosowanie układu dwufazowego, zawierającego organiczny rozpuszczalnik, dehydrogenazę alkoholową, wodę, kofaktor i związek ketonowy.
Wynalazek dotyczy sposobu enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego o wzorze I R1-C-(O)-R2 (I) w którym R1 i R2 niezależ nie od siebie są takie same lub inne i oznaczają
1. atom wodoru,
2. -(C1-C20)-alkil, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony
3. -(C2-C20)-alkenyl, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i ewentualnie zawiera jedno, dwa, trzy lub cztery wiązania podwójne
4. -(C2-C20)-alkinyl, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i ewentualnie zawiera jedno, dwa, trzy lub cztery wiązania potrójne
5. - (C6-C14)-aryl,
6. - (C1-C8)-alkilo-(C6-C14)-aryl, lub
7. R1 i R2 razem z resztą -C(O)- tworzą -(C6-C14-aryl) lub -(C5-C14)-heterocykl, przy czym wymienione powyżej w 1. do 7. reszty są niepodstawione lub podstawione 1 do 3 podstawnikami i są niezależnie od siebie podstawione podstawnikiem wybranym spośród następujących:
a) -OH,
b) halogen, taki jak fluor, chlor, brom lub jod,
c) -NO2,
d) -C(O)-O-(C1-C20)-alkil, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i jest niepodstawiony lub podstawiony 1, 2 lub 3 podstawnikami wybranymi spośród halogenu, hydroksylu, grupy aminowej lub nitrowej, lub
e) -(C5-C14)-heterocykl, który jest niepodstawiony lub podstawiony od 1 do 3 podstawnikami, takimi jak halogen, hydroksyl, grupa aminowa lub nitrowa,
PL 207 271 B1 przy czym
a) związek o wzorze I w ilości od 10% do 25% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, dehydrogenazę alkoholową, wodę, kofaktor NADPH lub NADH i rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,5 do 4,0;
b) inkubuje się w układzie dwufazowym obejmującym wodę, organiczny rozpuszczalnik i związek o wzorze (I);
c) regeneruje się w sposób ciągły tworzony przez dehydrogenazę alkoholową utleniony kofaktor i
d) izoluje się wytworzony chiralny hydroksyzwiązek.
Sposób według wynalazku wykazuje długi okres trwałości przez działanie stabilizujące rozpuszczalnika na enzym, czystość enancjomeryczną ponad 99,9% wytworzonych chiralnych związków hydroksylowych i wysoką wydajność w stosunku do użytej ilości związku ketonowego.
Resztami -(C6-C14)arylowymi są, na przykład, fenyl, naftyl. Określenie „aryl oznacza aromatyczne reszty zawierające od 6 do 14 atomów węgla, na przykład, 1-naftyl, 2-naftyl, bifenylil, na przykład, 2-bifenylil, 3-bifenylil i 4-bifenylil, antryl lub fluorenyl. Korzystnymi resztami arylowymi są reszty bifenylilowe, naftylowe, a zwłaszcza reszty fenylowe. Określenie „halogen oznacza pierwiastek z grupy obejmującej fluor, chlor, brom i jod. Określenie -(C1-C20)-alkil oznacza grupę węglowodorową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, zawierającą 1 do 20 atomów węgla.
Termin -(C5-C14)-heterocykl oznacza monocykliczny lub bicykliczny 5 do 14-członowy pierścień heterocykliczny, który jest częściowo lub całkowicie nasycony. Przykładami heteroatomów są atomy N, O i S. Przykładami -(C5-C14)-heterocykl są reszty, które pochodzą od pirolu, furanu, tiofenu, imidazolu, pirazolu, oksazolu, izoksazolu, tiazolu, izotiazolu, tetrazolu, 2-tlenków 1,2,3,5-oksatiadiazolu, triazolonów, oksadiazolonów, izoksazolonów, oksadiazolidynodionów, triazoli, które są podstawione przez F, -CN, -CF3 lub -C(O)-O-(C1-C4)-alkil, 3-hydroksypiro-2,4-dionów, 5-okso-1,2,4-tiadiazoli, pirydyny, pirazyny, pirymidyny, indolu, izoindolu, indazolu, ftalazyny, chinoliny, izochinoliny, chinoksaliny, chinazoliny, cynnoliny, karboliny i pochodnych tych heterocykli skondensowanych z benzenem z cyklopentanem, cykloheksanem lub cykloheptanem. Szczególnie korzystny jest 2- lub 3-pirolil, fenylopirolil taki jak 4- lub 5-fenylo-2-pirolil, 2-furyl, 2-tienyl, 4-imidazolil, metyloimidazolil, na przykład, 1-metylo-2-, -4- lub -5-imidazolil, 1,3-tiazol-2-il, 2-pirydyl, 3-pirydyl, 4-pirydyl, N-tlenek 2-, 3- lub 4-pirydylu, 2-pirazynyl, 2-, 4- lub 5-pirymidynyl, 2-, 3- lub 5-indolil, podstawiony 2-indolil, na przykład, 1-metylo-, 5-metylo-, 5-metoksy-, 5-benzyloksy-, 5-chloro- lub 4,5-dimetylo-2-indolil, 1-benzylo-2- lub -3-indolil, 4,5,6,7-tetrahydro-2-indolil, cyclohepta[b]-5-pirolil, 2-, 3- lub 4-chinolil, 1-, 3- lub 4-izochinolil, 1-okso-1,2-dihydro-3-izochinolil, 2-chinoksalinyl, 2-benzofuranyl, 2-benzotienyl, 2-benzoksazolil lub benzotiazolil lub dihydropyridynyl, pirolidynyl, na przykład, 2- lub 3-(N-tiomorfolidynyl), piperazynyl, morfolinyl, tiomorfolinyl, tetrahydrotienyl lub benzodioksoalanyl.
Korzystnie stosuje się związek o wzorze I wybrany spośród estru etylowego kwasu 4-chloro-3-okso-butanowego, acetofenonu, acetooctanu metylu, 2-okso-4-fenylomaślanu etylu, 2,5-heksanodionu, pirogronianu etylu i 2-oktanonu.
Korzystnie stosuje się rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,6 do 3,0, szczególnie od 0,6 do 1,9, jeszcze korzystniej z logP od 0,63 do 1,75.
Korzystnie jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się eter dietylowy, eter tert-butylowo-metylowy, eter diizopropylowy lub octan etylu.
Korzystnie w powyższych sposobach stosuje się dehydrogenazę alkoholową z drożdży, wątroby konia, Thermoanaerobium brockii lub Rhodococcus erythropolis Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor lub dehydrogenazę alkoholową z sekwencją aminokwasów Sekw. Id. Nr: 4.
Jeśli dehydrogenaza alkoholowa pochodzi, na przykład, z drożdży, wątroby konia, Thermoanaerobium brockii lub Rhodococcus erythropolis w sposobie według wynalazku, uzyskuje się ze związku o wzorze I odpowiedni zwią zek (S)-hydroksy. Jeś li dehydrogenaza alkoholowa stosowana w sposobie według wynalazku pochodzi, na przykład, z Lactobacillus kefir lub Lactobacillus brevis, ze związku o wzorze I powstaje odpowiedni związek (R)-hydroksy.
Korzystnie w sposobie dodaje się bufor, taki jak fosforan potasu, Tris/HCl lub bufor trietanoloaminowy o pH od 5 do 10, korzystnie o pH od 6 do 9. Korzystnie do buforu dodaje się jony magnezu, takie jak MgCl2, w stężeniu od 0,2 mM do 10 mM, korzystnie od 0,5 mM do 2 mM.
W sposobie wedł ug wynalazku moż e być stosowana dehydrogenaza alkoholowa w peł ni oczyszczona albo częściowo oczyszczona lub zawarta w komórkach. Wprowadzone komórki mogą być przy tym natywne, permeabilizowane lub lizowane.
PL 207 271 B1
Aktywność objętościowa stosowanej dehydrogenazy alkoholowej wynosi od 100 jednostek/ml (U/ml) do 2000 U/ml, korzystnie około 800 U/ml, przy zawartości białka od około 20 mg/ml do 22 mg/ml. Korzystnie stosowana dehydrogenaza alkoholowa ma aktywność specyficzną od około 35 do 40 U/mg białka.
Korzystnie na kilogram przekształconego związku o wzorze I stosuje się 20 000 do 200 000 U dehydrogenazy alkoholowej, korzystnie około 100 000 U.
Jednostka enzymu 1 U odpowiada przy tym ilości enzymu, która jest wymagana do przekształcenia 1 μmol związku o wzorze I w ciągu minuty (min).
Woda tworzy w dwufazowym układzie według wynalazku jedną fazę ciekłą, a organiczny rozpuszczalnik tworzy drugą fazę ciekłą. Ewentualnie może być też obecna jeszcze jedna faza stała lub ciekła, która, na przykład, powstaje z nie całkowicie rozpuszczonej dehydrogenazy alkoholowej lub ze związku o wzorze I. Korzystne są jednak dwie fazy ciekłe bez fazy stałej. Dwie fazy ciekłe są korzystnie mieszane mechanicznie tak, że powstają duże powierzchnie między obydwiema fazami ciekłymi.
Korzystnie jako kofaktor dodaje się NADPH lub NADH w ilości od 0,05 mM do 0,25 mM, zwłaszcza od 0,06 mM do 0,2 mM, w stosunku do fazy wodnej. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się jeszcze kolejny stabilizator dehydrogenazy alkoholowej.
Korzystnie jako stabilizator dla dehydrogenazy alkoholowej dodaje się glicerol, sorbitol lub sulfotlenek dimetylu (DMSO).
Korzystnie stabilizator stosuje się w ilości od 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 20%. W celu regeneracji zużytego NADH lub NADPH w sposobie według wynalazku korzystnie dodaje się izopropanol. Na przykład izopropanol i NADP są dodawane z dehydrogenazą alkoholową do NADPH i acetonu. Korzystnie izopropanol stosuje się w ilości 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 10%.
Korzystnie w sposobie według wynalazku związki o wzorze I stosuje się w ilości od 15% do 22% w stosunku do całkowitej objętości.
Korzystnie reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około 10°C do 70°C, korzystnie od 30°C do 60°C.
Korzystnie organiczny rozpuszczalnik stosuje się w ilości od 1% do 90% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 15% do 60%, szczególnie od 20% do 50%.
Korzystnie stosunek organicznego rozpuszczalnika do wody wynosi od 9:1 do 1:9, korzystnie od 1:1 do 1:3.
Sposób według wynalazku, na przykład, przeprowadza się w zamkniętym naczyniu reakcyjnym ze szkła lub metalu. W tym celu składniki pojedynczo wprowadza się do naczynia reakcyjnego i miesza w atmosferze, na przykład, azotu lub w atmosferze powietrza. W zależności od substratu i stosowanego związku o wzorze I czas reakcji wynosi od 1 dnia do 14 dni, korzystnie 4 do 7 dni.
Następnie mieszaninę reakcyjną poddaje się obróbce. W tym celu usuwa się fazę wodną i sączy się fazę octanu etylu. Fazę wodną można ewentualnie jeszcze raz ekstrahować i dalej obrabiać jak fazę octanu etylu. Następnie przesączoną fazę odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. W ten sposób uzyskuje się, na przykład, jako produkt 4-chloro-3-(S)-hydroksybutanian etylu o czystości enancjomerycznej ponad 99,9%, i zasadniczo wolny od reagenta 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu. Całkowita wydajność procesu wynosi po destylacji produktu od 82% do 88% w stosunku do użytej ilości reagenta.
Nieoczekiwanie, stosowane rozpuszczalniki organiczne z wartością log-P od 0 do 4 wykazywały stabilizujące działanie na dehydrogenazę alkoholową, podczas gdy w stanie techniki odradzane jest stosowanie układu dwufazowego z rozpuszczalnikami organicznymi (M. R. Kula, U. Kragel; Rozdział 28, Dehydrogenases in Synthesis of Chiral Compounds; R. N. Patel, Stereoselective Biocatalyses, 2000; Peters J. 9. Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions, and Application, W: H. J. Rehm, G. Reed Biotechnology, tom 3, Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993; J. Lynda i wsp., Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis, Biotechnol. Prog. 1991, 7, strony 116-124). W sposobie według wynalazku jako fazę organiczną stosuje się octan etylu, przy czym faza organiczna z jednej strony służy jako zbiornik związku o wzorze I, ale także ekstrahuje produkt reakcji, chiralny związek hydroksylowy, z fazy wodnej.
W przeciwieństwie do stanu techniki zastosowanie rozpuszczalników organicznych o wartości log-P od 0 do 3 prowadzi do dodatkowej wzrastającej z upływem czasu stabilizacji dehydrogenazy alkoholowej. Według stanu techniki, szczególnie rozpuszczalniki organiczne o wartości log-P (logaPL 207 271 B1 rytm współczynnika rozdziału oktanol/woda) od 0 do 2 mają destabilizujące działanie na enzymy i w zwią zku z tym prawie nie są brane pod uwagę , jako faza organiczna w ukł adzie dwufazowym (K. Faber, Biotransformations in organic chemistry, wyd. 3 1997, Springer Verlag, Rozdział 3. do 3.17).
Dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor o wysokiej temperaturze optymalnej ma sekwencję DNA według Sekw Id. Nr: 3 i sekwencję aminokwasową według Sekw Id. Nr: 4 jak na załączonej liście sekwencji. Ta dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor jest R-specyficzna, i na przykład, ze związku o wzorze I można uzyskać odpowiedni (R)-hydroksyzwiązek. Nieoczekiwanie enancjoselektywna dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor może być nadwyrażana w Escherichia coli RB 791, podczas gdy dehydrogenazy alkoholowe z innych gatunków rodzaju Lactobacillus były wyrażane tylko w znacznie mniejszym stopniu. Jest to tym bardziej nieoczekiwane, ponieważ szczep Lactobacillus minor typu dzikiego wyraża tylko bardzo małą ilość dehydrogenazy alkoholowej, która jest zatem niewykrywalna powszechnymi metodami skirininowymi (biotransformacja całych komórek, test aktywności). Nieoczekiwane było zatem, że możliwe było sklonowanie R-enancjoselektywnej dehydrogenazy alkoholowej z Lactobacillus minor i nadwyrażanie jej w Escherichia coli w tak dużej ilości (50% białka komórkowego klonu, 20000 U/g mokrej masy).
Oczyszczony enzym z Lactobacillus minor jest stabilny w zakresie pH od około 5,5 do 8,5. Enzym jest stabilny do około 40°C, a optimum pH reakcji enzymatycznej leży w zakresie od pH 7 do pH 7,5. Optimum temperatury reakcji enzymatycznej wynosi około 55°C. Enzym wykazuje szerokie spektrum substratów.
Za pomocą hydrofobowej chromatografii interakcyjnej możliwe jest oczyszczenie enzymu do aktywności specyficznej od 35 do 40 U/mg białka.
Dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor uzyskuje się przez ekspresję DNA, który koduje dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor, w odpowiednim mikroorganizmie prokariotycznym lub eukariotycznym. Korzystnie dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor jest transformowana i wyrażana w szczepie Escherichia coli, szczególnie w Escherichia coli RB 791.
Dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor można otrzymać, na przykład, w hodowli zrekombinowanych komórek Escherichia coli, gdzie indukuje się ekspresję dehydrogenazy alkoholowej, a następnie po około 10 do 18 godzinach komórki rozrywa się przez działanie ultradź więkami lub prasą Frencha (Gaullin, Siemens). Uzyskany ekstrakt komórkowy może być albo bezpośrednio stosowany albo dalej oczyszczany. W tym celu ekstrakt komórkowy, na przykład, wiruje się, a uzyskany supernatant poddaje się hydrofobowej chromatografii interakcyjnej. Chromatografię tę korzystnie przeprowadza się przy pH 7,0 w wodnym buforze, który zawiera także jony magnezu.
Zrekombinowany klon Escherichia coli RB 791, który wyraża dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor został zdeponowany 26 marca 2001 zgodnie z warunkami Traktatu Budapeszteńskiego w Deutsche Sammlung far Microorganismen Und Zelkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig pod numerem DSM 14196.
Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami.
P r z y k ł a d 1
Skrining dehydrogenaz R-alkoholowych w szczepach rodzaju Lactobacillus za pomocą biotransformacji całych komórek
W celu skriningu różne szczepy Lactobacillus hodowano w następującej pożywce: (w każdym przypadku ilość w g/l,): glukoza (20), ekstrakt z drożdży (5), ekstrakt mięsny (10), wodorocytrynian diamonowy (2), octan sodu (5), siarczan magnezu (0,2), siarczan manganu (0,05), fosforan dipotasu (2).
Pożywkę sterylizowano w 121°C i szczepy rodzaju Lactobacillus (dalej w skrócie oznaczane jako L.) hodowano bez dalszej regulacji pH lub dodawania tlenu. Następnie komórki odwirowano i w celu biotransformacji całych komórek zawieszano po 4 g komórek w końcowej objętości 10 ml buforu -fosforanu potasowego (bufor KPi) (50 mM, pH = 7,0). Po dodaniu 0,1 g glukozy komórki wytrząsano przez 15 minut w 30°C. Do zawiesiny komórek dodano 4-chloro-3-okso-butanian etylu w stężeniu końcowym 40 mM i po 10 i 120 minutach przeprowadzono analizę pożywki za pomocą chromatografii gazowej. W tym celu komórki odwirowano, supernatant przesączono i rozcieńczono chloroformem do końcowego stężenia 10-15 μg/ml w 4-chloro-3-okso-butanianie etylu.
Stosowany jako substrat 4-chloro-3-okso-butanian etylu był przekształcany przez różne szczepy Lactobacillus do (S)-4-chloro-3-hydroksymaślanu etylu z następującą czystością enancjomerów.
Nadmiar enancjomerów oblicza siew następujący sposób: ee(%) = ((R-alkohol - S-alkohol)/(Ralkohol + S-alkohol)) x 100.
PL 207 271 B1
T a b e l a 1
| Szczep Lactobacillus | ee 4-chloro-3-(S)-hydroksy-butanian etylu w % |
| L. reuteri | 34,6 |
| L. kandleri | 90,0 |
| L. collinoides | 71,3 |
| L. bifermentans | 53,6 |
| L. oris | 63,4 |
| L. brevis | 74,0 |
| L. halotolerans | 67,2 |
| L. minor | 18,6 |
| L. parabuchneri | 78,5 |
| L. kefir | 87,8 |
| L. fructosus | 28,9 |
P r z y k ł a d 2
Otrzymywanie zrekombinowanych R-specyficznych dehydrogenaz alkoholowych
A.) Wytwarzanie genomowego DNA ze szczepów z rodzaju Lactobacillus
Osad komórkowy z około 2 ml płynnej hodowli rodzaju Lactobacillus zawieszono w 300 μΐ buforu TE (zawierającego 10 mM Tris/HCl, pH = 8,1 mM EDTA), dodano 20 mg/ml lizozymu i inkubowano 10 minut przy 37°C. Następnie dodano 100 μl dodecylosiarczanu sodu(SDS) (10%), 100 μl nadchloranu sodu (5 M) i 500 μl chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1). Po silnym wytrząsaniu białko usunięto przez odwirowanie i przeniesiono fazę wodną do nowej probówki Eppendorfa. Następnie dodano 800 μl etanolu (EtOH) (96%). Probówkę Eppendorfa parokrotnie odwrócono, a następnie wytrącony DNA chromosomalny przeniesiono do nowej probówki Eppendorfa i przepłukano 200 μl EtOH. DNA ponownie przeniesiono do nowej probówki Eppendorfa, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono w 100 μl buforu TE.
B. ) Oligonukleotydy jako startery 5' i 3' do PGR (reakcja łańcuchowa polimerazy)
Startery stosowane do PCR opracowano na podstawie znanych sekwencji N-końcowych i C- końcowych dehydrogenazy alkoholowej z L. kefir. Uwzględniono przy tym znane preferencje dla określonych kodonów u Lactobacillus. Zatem w każdym starterze 5' stosowano kodon ATG (Met) jako kodon start i wstawiano, powyżej kodonu start wstawiono w starterze 5' miejsce dla enzymu restrykcyjnego Bam HI (GGATGG) dla umożliwienia późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym. Za starterem 3' wstawiono kodon stop (TAG) i miejsce cięcia dla Hind III (AAGGTT). Konstrukty dla starterów są podane poniżej
N = A,,C lub G; Y = T lub C; R = A lub G
Starter 5'
5'GCGGATCCATGACNGAYCGNTTRAARGGNAARGTNGC3' (Sekw. Id. Nr:1)
Starter 3'
5'GGGAAGCTTCTAYTGNGCNGTRTANCCNCCRTCNAC3' (Sekw. Id. Nr:2)
Startery wytworzono przygotowano zgodnie ze znanymi metodami.
C. ) PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy) z genomowym DNA ze szczepów z rodzaju Lactobacillus
Mieszanina PCR (100 μθ
| Ilość stosowana na reakcję | Stężenie | |
| dNTP | 8 pl | na dNTP 2,5 nmol/pl |
| Oligo | na oligo 10 pl; 20 pl | 2 pmol/pl |
| Chromosomalny DNA | 3 pl | Około 1 pg/pl |
| 10 x Bufor (Promega) | 10 pl | |
| Polimeraza Taq (Promega) | 1 pl | 2U/pl |
| H2O | 58 pl |
PL 207 271 B1
DTP są mieszaniną trifosforanów deoksyrybonukleotydów, takich jak dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Cykl:
95°C przez 2 minuty z późniejszym utrzymaniem temperatury
80°C gorący start, następnie
95°C przez 30 sekund, następnie
40°C przez 1 minutę, 30x następnie 30 razy 95°C przez 30 sekund, i 40°C przez 1 minutę, następnie
72°C przez 2,5 minuty następnie
72°C przez 2,5 minuty następnie utrzymywanie 10° C
W celu analizy naniesiono 10 μΐ mieszaniny na 1% żel agarozowy i rozdzielono elektroforetycznie przy stałym 100 V. PCR wykazała wyraźną amplifikację fragmentu DNA o około 750 bp.
D. ) Izolacja fragmentów PCR z żelu
W celu uzyskania fragmentu PCR całą mieszaninę PCR naniesiono na 1% żel agarozowy i rozdzielono elektroforetycznie przy stałym 100 V. W tym celu podzielono żel na dwie ścieżki, z których jedna zawierała całą mieszaninę PCR, a druga tylko próbkę 5 μ!, tak że do wycięcia fragmentu PCR z żelu w celu orientacji barwiono bromkiem etydyny tylko ścieżkę z próbką, aby wykluczyć uszkodzenie fragmentu PCR bromkiem etydyny i światłem UV.
Izolację z żelu przeprowadzono stosując zestaw QIAquick Gel Extraction Kit firmy Qiagen z Hilden. Określono całkowite stężenie 20 ng/ąl DNA.
E. ) Ligacja
Do przygotowania ligacji oczyszczony fragment PCR i stosowany do klonowania wektor pQE30 lub pQE70, oba firmy Quiagen, przecięto trawiono Bam HI i Hind III (4 ąl DNA = 200 ng DNA, 1 ąl 10 x buforu, 1 ąl enzymu, BSA i H2O (Biolabs, New England)).
Następnie przecięty plazmid ponownie czyszczono za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction, zawieszono w wodzie i defosforylowano za pomocą alkalicznej fosfatazy (USB, Amersham Life Science).
W celu oczyszczenia odpowiednią mieszaninę reakcyjną ponownie naniesiono na 1% żel agarozowy, a następnie trawiony amplikont i plazmid wyizolowano, jak opisano w D.)Stężenie plazmidu i amplikonu po oczyszczeniu wynosiło około 20 nq/ąl.
Do ligacji użyto 3 ąl pQE30 lub pQE70 (60 ng), 2,5 ąl amplikonu (50 ng), 2 ąl buforu do ligazy (Boehringer; Mannheim), 1,5 ąl H2O i 1 ąl ligazy T4 (Boehringer; Mannheim). Mieszaninę inkubowano przez noc w 16°C.
Następnie transformowano przez elektroporację 40 ąl elektrokompetentnych komórek Escherichia coli RB791 1,5 ąl mieszaniny ligacyjnej. Komórki umieszczono w 500 ąl pożywki SOC, inkubowano 45 minut w 37°C, a następnie wysiano po 250 ąl na płytki z agarem LBamp. Pożywka SOC zawiera 20 g tryptonu, 5 g ekstraktu z drożdży, 0,5 g NaCl, 10 ml 1 M MgSO4 i 10 ml 1 M MgCl2 na litr wody. Płytki agarowe LBamp zawierają na litr wody 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu z drożdży, 10 g NaCl, 20 g agaru, pH 7,0 i 50 mg ampicyliny.
Wyrośnięte kolonie usunięto i hodowano przez noc w 37°C w 4 ml płynnej hodowli (pożywka LBamp). W każdym przypadku z tej zawiesiny komórek pobierano po 2 ml do wytworzenia plazmidu (według protokołu Quiagen miniprep (Quiagen, Hilden)). Plazmid wytworzono zaczynając od trawienia enzymami restrykcyjnymi Bam HI i Hind III. Po całkowitym trawieniu naniesiono na 1% żel agarozowy i rozdzielono elektroforetycznie przy 100 V (wykazanie wstawki 750 kp) i te plazmidy ewentualnie zastosowano do sekwencjonowania.
Klony ze wstawką 750 kp następnie wysiewano na płytkach agarowych LBamp.
F. ) Sekwencjonowanie plazmidów
Sekwencjonowanie przeprowadzono za pomocą zestawu SequiThermEXCEL II Long-Read DNA Sequencing Kit (Biozym, Oldendorf) na sekwenatorze Li-Cor (MWG Biotech, Ebersberg) według zaleceń producenta. Jako startery stosowano standardowe startery do sekwencjonowania dla wektorów pQE.
G. ) Skrining klonów w odniesieniu do ekspresji rozpuszczalnego R-ADH Klony ze wstawkami 750 kp badano pod kątem aktywności enzymatycznej i stereoselektywności. W tym celu kolonie usunięto z płytek z agarem LBamp i hodowano w 20 ml płynnych hodowlach (pożywka LBamp) w 25°C, a następnie przy gęstości komórek (OD500) 0,5 przeprowadzono indukcję 1 mM izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Po 18 godzinach komórki odwirowano i w każdym przypadku rozpuszczono
PL 207 271 B1 po 40 mg komórek w 350 μΐ buforu Kpi (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCl2). Enzym uwolniono z komórek przez mielenie na mokro za pomocą szklanych kuleczek (0,5 g, 0,3 mm). Dodatkowo komórki były rozrywane za pomocą młynka Retsch w 4°C przez 20 minut.
Test enzymatyczny zawierał 870 μl buforu trietyloaminowego (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl2), 100 μl 100 mM roztworu 4-chloroacetooctanu etylu, 10 μl NADPH (stężenie końcowe 0,19 mM) i 20 μl roztworu enzymu.
Definicja jednostki enzymu: 1 U odpowiada ilości enzymu, która jest potrzebna do przekształcenia 1 μ mol substratu (etylo 4-chloro-3-oksy-butanian etylu w ciągu 1 minuty.
Dla wykazania stereoselektywności inkubowano 480 μl buforu trietanoloaminowego (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl2) z 1,0 mM 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, 1,9 mM NADPH (stężenia końcowe) i 20 μl roztworu enzymu. Po 15 minutach inkubacji mieszaninę reakcyjną sączono i rozcieńczono 1:10 chloroformem i analizowano próbkę za pomocą GC-MS.
Warunki chromatografii gazowej (GC):
chiralna kolumna: Lipodex E, ID = 0,25 mm, I = 25 m (Macherey-Nagel)
1. 2 minuty 60°C
2. w 28 minut od 60° C do 130°C z tempem 2,5°C na minutę
3. 15 minut w 130°C.
Z następujących szczepów Lactobacillus było możliwe wyizolowanie (R)-specyficznej dehydrogenazy alkoholowej i jej aktywna nadekspresja:
| Szczep | Plazmid | Numer klonu | Aktywność w U/g komórek* | ee w % |
| L. parabuchneri | pQE 30 | 12 | 450 | >99,9 |
| L. parabuchneri | pQE 30 | 14 | 170 | >99,9 |
| L. kandleri | pQE 30 | 11 | 280 | >99,9 |
| L. kandleri | pQE 70 | 17 | 710 | >99,9 |
| L. minor | pQE30 | 2 | 2.830 | >99,9 |
| L. minor | PQE 70 | 3 | 680 | >99,9 |
| L. minor | pQE 70 | 4 | 700 | >99,9 |
*Aktywność wyliczona z G) (mielenie na mokro).
Aktywności po fermentacji i rozerwaniu prasą Frencha są znacząco wyższe.
H.) Otrzymanie i czyszczenie enzymu
Enzym otrzymano przez hodowanie szczepu o najwyższej aktywności w fermentorze (Fed batch, 10 l) i indukcji przy OD500 40 za pomocą 1 mM IPTG. Po 18 godzinach zbierano komórki, przy czym wprowadzano 300 g komórek do 3 l buforu Kpi (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCl2), następnie rozrywano komórki za pomocą prasy Frencha (Gaullin, Siemens). Supernatant uzyskany po odwirowaniu dalej był określany jako surowy ekstrakt i wykazywał aktywność około 2000 U/ml (20 000 U/g wilgotnej masy).
W celu scharakteryzowania enzymu, część uzyskanego enzymu oczyszczono za pomocą hydrofobowej chromatografii interakcyjnej na Q-Sepharose ff (fast flow - szybki przepływ). Zastosowana kolumna była równoważona 50 mM buforem Kpi pH = 7,0, 1 mM MgCl2. Po naniesieniu surowego ekstraktu na kolumnę i krótkim płukaniu buforem do równoważenia enzym eluowano rosnącym liniowo gradientem soli (0-1 M NaCl, 1 ml/min) przy stężeniu soli około 0,3 M NaCl. Po połączeniu oczyszczonych frakcji zawierających enzym uzyskano około 25 ml oczyszczonego enzymu o aktywności objętościowej 800 U/ml i zawartości białka od 20 do 22 mg/ml. Oczyszczony w ten sposób enzym ma specyficzną aktywność od około 35 do 40 U/mg białka.
Wszystkie aktywności enzymatyczne oznaczano w 25°C. Aktywność enzymatyczną wyliczano, jak następuje:
Obliczenie: 1 jednostka = konwersja 1 μmol substratu/min Prawo Lamberta-Beera
Zużycie NADPH monitorowano przy 340 nm (patrz enzymatyczna próba testowa) = ΔΕ/min
N = czynnik rozcieńczenia enzymu
V = objętość enzymu w ml (0,01)
Vkiuwety = Objętość kiuwety = 1 ml
PL 207 271 B1 d = ś cież ka ś wiatł a kiuwety = 1 cm eNADPH = współczynnik ekstynkcji NADPH = 6,22 [Mm-1*cm-1]
Aktywność = ^E/min*N*Vk,uwety)/(eNADPH*V*d)
Oznaczenie białka przeprowadzono według analizy Bradforda (BioRad- Laboratories GmbH,
Protein Assay)
P r z y k ł a d 3
Wytworzenie (S)-4 chloro-3-hydroksymaślanu etylu katalizowane enzymatycznie
A) Na skalę 5 litrów
Do katalizowanej enzymatycznie syntezy (S)-4 chloro-3-hydroksymaślanu etylu z 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, stosowano uzyskany w Przykładzie 2 surowy ekstrakt dehydrogenazy alkoholowej i koenzym NADP. Utleniony koenzym regenerowano w sposób ciągły przez równoczesną obecność izopropanolu, tak że reakcja wymagała tylko katalitycznych ilości koenzymu.
Mieszanina zawierała:
l 100 mM buforu trietanoloaminowego pH = 7,0, 1 mM MgCl2,
10% glicerol,
400 mg NADP,
600 ml izopropanolu,
800 ml octanu etylu,
600 ml 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu i około 100 000 jednostek dehydrogenazy alkoholowej
Po 3 dniach mieszania w temperaturze pokojowej można było wykazać za pomocą chromatografii gazowej całkowite przekształcenie 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu do (S)-4 chloro-3-hydroksymaślanu etylu z czystością enancjomeru ponad 99,9%. Po usunięciu fazy wodnej, odparowaniu rozpuszczalnika i ewentualnie destylacji uzyskuje się czysty (S)-4 chloro-3-hydroksymaślan etylu z czystością enancjomeryczną ponad 99,9%.
B.) Na skalę 50 l
Mieszanina reakcyjna do przekształcenia 10 l 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, składa się z:
l 100 mM buforu trietanoloaminowego pH = 7.0, l mM MgCl2, 10% glicerolu, g NADP, l izopropanolu, l octanu etylu, l 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, i około 2 milionów jednostek dehydrogenazy alkoholowej (1,251 surowego ekstraktu).
Po 7 dniach mieszania w temperaturze pokojowej można było wykazać za pomocą chromatografii gazowej całkowitą konwersją 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, do (S)-4-chloro-3-hydroksymaślanu etylu z czystością enancjomeryczną ponad 99,9%.
P r z y k ł a d 4
Charakterystyka biochemiczna klonowanej dehydrogenazy alkoholowej z Lactobacillus minor
A.) Stabilność w pH
Aktywność enzymu jako funkację przechowywania w buforach o różnych wartościach pH badano w zakresie od pH 4 do 11. W tym celu przygotowano różne bufory (50 mM) w zakresie od pH 4 do 11 i rozcieńczano w nich 1:100 oczyszczony w przykładzie 2 enzym i inkubowano 30 minut. Wszystkie bufory zawierały 1 mM MgCl2. Następnie stosowano z tego 10 μΐ w normalnym teście enzymatycznym (bufor trietanoloaminowy 100 mM pH = 7,0, 1 mM MgCl2, 10 mM 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, i 0,19 mM NADPH). Reakcję monitorowano przez 1 minutę w 30° C i przy 340 nm.
Wartością wyjściową jest wartość mierzona, którą uzyskuje się bezpośrednio po rozcieńczeniu enzymu w 50 mM buforze trietanoloaminowym pH = 7,0. Ta wartość odpowiada w podanych uprzednio warunkach zmianie ekstynkcji o 0,20/minut i stosowano ją jako wartość 100%, a wszystkie następne mierzone wartości były odnoszone do tej wartości.
T a b e l a 2
| PH | Układ buforowy | Aktywność w % (n=2) | Układ buforowy | Aktywność w % (n=2) |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 4 | Octan sodu/kwas octowy | 87,5 ± 6,5 |
PL 207 271 B1 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 4,5 | Octan sodu/kwas octowy | 94,5 ± 3,0 | ||
| 5 | Octan N/kwas octowy | 94,5 ± 1,5 | MES/NaOH | 55 ± 5 |
| 5,5 | KH2PO4/K2PO4 | 96 ± 3 | MES/NaOH | 77,1 ± 2,1 |
| 6 | KH2PO4/K2PO4 | 100 ± 0 | T rietanoloamina/NaOH | 100 ± 0 |
| 6,5 | KH2PO4/K2PO4 | 97,5 ± 2,5 | T rietanoloamina/NaOH | 100 ± 0 |
| 7 | KH2PO4/K2PO4 | 100 ± 0 | T rietanoloamina/NaOH | 97,9 ± 2,1 |
| 7,5 | KH2PO4/K2PO4 | 97,5 ± 7,5 | Tris/HCl | 94,6 ± 1,3 |
| 8 | KH2PO4/K2PO4 | 93,0 ± 3,0 | Tris/HCl | 89,2 ± 0 |
| 8,5 | KH2PO4/K2PO4 | 102,5 ± 2,5 | Tris/HCl | 60 ± 4,2 |
| 9 | Glicyna/NaOH | 76,5 ± 1,5 | Tris/HCl | 63,1 ± 4,8 |
| 9,5 | Glicyna/NaOH | 52,5 ± 7,5 | ||
| 10 | Glicyna/NaOH | 52,5 ± 7,5 | ||
| 11 | Glicyna/NaOH | 0,0 ± 0 |
W Tabeli 2 wskazano, że enzym wykazuje dobrą stabilność szczególnie przy pH w kwaśnym zakresie, przy czym stabilność, enzymu wydaje się zależeć nie tylko od pH ale także od stosowanego układu buforowego. Na przykład, przy stosowaniu buforów TRIS i MES przy tym samym pH stwierdza się silniejszą inaktywację enzymu niż w buforze Kpi przy tym samym pH.
W buforze Kpi nie stwierdzono żadnej znaczącej inaktywacji w zakresie pH od 5,5 do 8,5.
B.) Stabilność w temperaturze
W analogiczny sposób jak opisano w A.) badano stabilność w temperaturze w zakresie od 25°C do 50°C. W tym celu w każdym przypadku rozcieńczenia 1 : 100 oczyszczonego enzymu inkubowano po 30 minut w odpowiedniej temperaturze, a następnie mierzono w 30°C stosując powyższą procedurę. Tutaj także jako wartość wyjściową przyjęto wartość pomiaru, który uzyskano bezpośrednio po rozcieńczeniu enzymu w 50 mM buforze trietanoloaminowym pH = 7,0. Tę wartość także uznano tutaj jako wartość 100%. Dehydrogenaza alkoholowa z L. minor jest stabilna do temperatury 40°C. Następnie aktywność szybko spada.
T a b e l a 3
| Temperatura | Aktywność w % (n=4) | Temperatura | Aktywność w % (n=4) |
| 25 | 101 ± 3,2 | 40 | 33,4 ± 3,8 |
| 30 | 81,2 ± 5,8 | 42 | 0 ± 0 |
| 35 | 67,0 ± 1,6 | 45 | 0 ± 0 |
| 37 | 20,2 ± 2,4 | 50 | 0 ± 0 |
C.) Optimum pH
W celu określenia optimum pH przeprowadzono reakcję enzymatyczną w odpowiednim buforze podanym w Tabeli 3. Stężenie 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu wynosiło tak jak w teście standardowym 10 mM, a NADPH 0,19 mM. Reakcję prowadzono w 30°C. W ten sposób dla enzymu według wynalazku ustalono optimum pH między 7 i 7,5.
T a b e l a 4
| PH | Układ buforowy | Aktywność w U/ml nierozcieńczonego enzymu |
| 1 | 2 | 3 |
| 4 | Octan sodu/kwas octowy | 85 |
PL 207 271 B1 cd. tabeli 4
| 1 | 2 | 3 |
| 4,5 | Octan sodu/kwas octowy | 132 |
| 5 | MES/NaOH | 218 |
| 5,5 | MES/NaOH | 240 |
| 6 | T rietanoloamina/NaOH | 381 |
| 6,5 | T rietanoloamina/NaOH | 349 |
| 7 | T rietanoloamina/NaOH | 510 |
| 7,5 | Tris/HCl | 707 |
| 8 | Tris/HCl | 585 |
| 8,5 | Tris/HCl | 486 |
| 9 | Tris/HCl | 488 |
| 10 | Glicyna/NaOH | 131 |
| 11 | Glicyna/NaOH | 0 |
D.) Optimum temperatury
Aby ustalić temperaturę optymalną, mierzono aktywność enzymatyczną w zakresie od 25°C do 60°C. Próba odpowiadała standardowym stężeniom 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu i NADPH. Jak widać w Tabeli 5 optymalna temperatura dla enzymu wynosi 55° C, następnie aktywność szybko spada.
T a b e l a 5
| Temperatura | Aktywność w U/ml nierozcieńczonego enzymu | Temperatura | Aktywność w U/ml nierozcieńczonego enzymu |
| 25 | 540 | 45 | 2469 |
| 30 | 1235 | 50 | 2469 |
| 35 | 1968 | 55 | 2855 |
| 40 | 1621 | 60 | 0 |
E.) Specyficzność względem substratu
Dalej w mieszaninie reakcyjnej zamiast 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu stosowano inne substraty. W tym celu stosowano następującą mieszaninę reakcyjną:
970 μl buforu trietanoloaminowego (100 mM, pH = 7,0 1 mM MgCl2 z 10 mM związku ketonowego) 20 μl NADPH (0,19 mM w badanej mieszaninie 10 μ enzymu (1 : 100)
Aktywność uzyskaną z 4-chloro-3-oksy-butanianem etylu uznawano za 100% i aktywności enzymatyczne innych substratów odnoszono do tej wartości.
T a b e l a 6
| Substrat | Aktywność w % (n=2) |
| 4-chloro-3-oksy-butanian etylu | 100 |
| Pirogronian etylu | 192,3 ± 11,5 |
| 2-oktanon | 90,8 ± 1,2 |
| Acetooctan metylu | 120 ± 7,7 |
| 2-okso-4-fenylobutanian etylu | 62,7 ± 4,8 |
F.) Stabilność enzymu w rozpuszczalnikach organicznych
W celu zbadania stabilności enzymu przy kontakcie z rozpuszczalnikami organicznymi rozcieńczano dehydrogenazę alkoholową z L. minor w podanych rozpuszczalnikach organicznych 1 : 100
PL 207 271 B1 i inkubowano w temperaturze pokojowej (dla niemieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych rozcieńczenie dotyczy fazy wodnej). Zapewniono ciągłe mieszanie obu faz (wytrząsanie przy 200 obr./min.). Następnie 10 μl roztworu enzymu stosowano w standardowej badanej mieszaninie. Także tutaj wartość wyjściowa po rozcieńczeniu buforem (bufor trietanoloaminowy 100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl2) była ustalana na 100% i wszystkie dalsze wartości były do niej odnoszone.
T a b e l a 7
A.) Rozpuszczalniki mieszające się z wodą
| Rozpuszczalnik | log | t = 2 godz. | t = 4 godz. | t = 24 godz. | t = 48 godz. |
| Bufor | 86 | 70 | 3 | 0 | |
| 10% izopropanol | 0,28 | 32 | 34 | 16 | 0 |
| 20% izopropanol | 0,28 | 16 | 17 | 7 | 0 |
| 10% DMSO | 1,3 | 73 | 54 | 60 | 40 |
| 20% DMSO | 1,3 | 73 | 54 | 57 | 40 |
| 1M sorbitol | 93 | 74 | 60 | 6 | |
| 10% glicerol | -3,0 | 120 | 64 | 62 | 28 |
| 20% glicerol | -3,0 | 120 | 100 | 100 | 104 |
Jak widać z Tabeli 7A glicerol, DMSO i sorbitol działają aktywująco i odpowiednio stabilizująco na użytą dehydrogenazę alkoholową. Zastosowany w procesie izopropanol działa natomiast inaktywująco.
B.) Rozpuszczalniki niemieszające się z wodą
| Rozpuszczalnik | log P | t = 2 godz. | t = 4 godz. | t = 24 godz. | t = 48 godz. |
| Bufor | 86 | 70 | 3 | 0 | |
| 20% octan etylowy | 0, 68 | 87 | 50 | 10 | 8 |
| 20% eter dietylu | 0,85 | 53 | 42 | 37 | 23 |
| 20% eter tert-butylowometylowy | 1,21 | 67 | 51 | 38 | 24 |
| 20 eter diizopropylowy | 1,55 | 100 | 57 | 41 | 29 |
| 20% eter dibutylowy | 2,9 | 92 | 71 | 23 | 6 |
| 20% pentan | 3,0 | 74 | 55 | 7 | 6 |
| 20% heksan | 3,5 | 80 | 39 | 2 | 5 |
| 20% heptan | 4 | 51 | 49 | 7 | 6 |
| 20% oktan | 4,5 | 87 | 47 | 2 | 1 |
Jak widać z Tabeli 7B badana dehydrogenaza alkoholowa wykazuje znaczącą stabilność w szerokim zakresie rozpuszczalników organicznych. Nieoczekiwanie rozpuszczalniki z wartościami logP między 0 13 hamują badaną dehydrogenazę alkoholową nie bardziej niż te, które mają wartości logP między 3 i 4,5, szczególnie ze względu na dłuższe czasy inkubacji (24 godziny i 48 godzin), rozpuszczalniki z wartościami logP między 0 i 3 mają stabilizujące działanie na badaną ADH w porównaniu z odpowiednimi wartościami w buforze. Badane alifatyczne rozpuszczalniki, pentan, heksan, heptan i octan nie wykazują tego stabilizującego działania przy długiej inkubacji.
Wartość logP składnika X jest logarytmem współczynnika podziału X w dwufazowym układzie oktanol/woda (50/50) P = stężenie X w fazie oktanolowej/stężenie X w fazie wodnej
G. Stabilność enzymu w warunkach procesu
W celu zbadania stabilności enzymu w warunkach procesu rozcieńczano dehydrogenazę alkoholową z L. minor stosowanymi w dwufazowym układzie mieszaninami rozpuszczalników 1 : 100 i inkubowano w temperaturze pokojowej. Następnie w standardowej badanej mieszaninie stosowano μl roztworu enzymu.
PL 207 271 B1
W Tabeli 8 podano aktywności enzymatyczne w % w stosunku do wartości wyjściowej. T a b e l a 8
| 0 godz. | 20 godz. | 46 godz. | 60 godz. | 84 godz. | |
| Bufor trietanoloaminowy 100 mM, 1 mM MgCl2 | 100 | 75 | 0 | 0 | 0 |
| Mieszanina B | 100 | 85 | 80 | 60 | 55 |
| Mieszanina C | 110 | 95 | 95 | 85 | 80 |
| Mieszanina B | 100 | 65 | 55 | 50 | 50 |
Mieszanina B: bufor, 10% glicerol, 10% izopropanol Mieszanina C: bufor, 20% glicerol, 10% izopropanol Mieszanina D: bufor, 10% glicerol, 10% izopropanol + 20% octan etylu
Stwierdzono, że zrekombinowana dehydrogenaza alkoholowa z L. minor jest stabilna i aktywna przez kilka dni w stosowanej w dwufazowym układzie kombinacji rozpuszczalników.
Claims (18)
1. atom wodoru,
1. Sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego o wzorze I R1-C(O)-R2 (I) w którym R1 i R2 niezależnie od siebie są takie same lub inne i oznaczają
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze I wybrany spośród estru etylowego kwasu 4-chloro-3-okso-butanowego, acetofenonu, acetooctanu metylu, -2-okso-4-fenylomaślanu etylu, 2,5-heksanodionu, pirogronianu etylu i 2-oktanonu.
PL 207 271 B1
2. -(C1-C20)-alkil, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,6 do 3,0, szczególnie od 0,6 do 1,9.
3. -(C2-C20)-alkenyl, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i ewentualnie zawiera jedno, dwa, trzy lub cztery wiązania podwójnie
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,63 do 1,75.
4. -(C2-C20)-alkinyl, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i ewentualnie zawiera jedno, dwa, trzy lub cztery wiązania potrójne
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się eter dietylowy, eter tert-butylowo-metylowy, eter diizopropylowy lub octan etylu.
5. -(C6-C14)-aryl,
6. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że stosuje się dehydrogenazę alkoholową z drożdży, wątroby konia, Thermoanaerobium brockii lub Rhodococcus erythropolis, Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor lub dehydrogenazę alkoholową z sekwencją aminokwasów Sekw. Id. Nr: 4.
6. -(C1-C8)-alkilo-(C6-C14)-aryl, lub
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że dehydrogenazę alkoholową stosuje się w ilości od 20 000 U do 200 000 U na kg przekształcanego związku o wzorze I, korzystnie około 100000 U.
7. R1 i R2 razem z resztą -C(O)- tworzą -(C6-C14-aryl) lub -(C5-C14)-heterocykl, przy czym wymienione powyżej w 1. do 7. reszty są niepodstawione lub podstawione 1 do 3 podstawnikami i są niezależnie od siebie podstawione podstawnikiem wybranym spośród następujących:
a) -OH,
b) halogen, taki jak fluor, chlor, brom lub jod,
c) -NO2,
d) -C(O)-O-(C1-C20)-alkil, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i jest niepodstawiony lub podstawiony 1, 2 lub 3 podstawnikami wybranymi spośród halogenu, hydroksylu, grupy aminowej lub nitrowej, lub
e) -(C5-C14)-heterocykl, który jest niepodstawiony lub podstawiony od 1 do 3 podstawnikami, takimi jak halogen, hydroksyl, grupa aminowa lub nitrowa, znamienny tym, że
a) związek o wzorze I w ilości od 10% do 25% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, dehydrogenazę alkoholową, wodę, kofaktor NADPH lub NADH i rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,5 do 4,0'.
b) inkubuje się w układzie dwufazowym obejmującym wodę, organiczny rozpuszczalnik i związek o wzorze (I);
c) regeneruje się w sposób ciągły tworzony przez dehydrogenazę alkoholową utleniony kofaktor, i
d) izoluje się wytworzony chiralny hydroksyzwiązek.
8.Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że dodaje się bufor, taki jak fosforan potasu, Tris/HCl lub bufor trietanoloaminowy o pH od 5 do 10, korzystnie o pH od 6 do 9.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że do buforu dodaje się jony magnezu, takie jak MgCl2, w stężeniu od 0,2 mM do 10 mM, korzystnie od 0,5 mM do 2 mM.
10. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że jako kofaktor dodaje się NADPH lub NADH w ilości od 0,05 mM do 0,25 mM, zwłaszcza od 0,06 mM do 0,2 mM, w stosunku do fazy wodnej.
11. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, jako stabilizator dla dehydrogenazy alkoholowej dodaje się glicerol, sorbitol lub sulfotlenek dimetylu.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stabilizator stosuje się w ilości od 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 20%.
13. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 15, znamienny tym, że dodaje się izopropanol.
14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że izopropanol stosuje się w ilości 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 10%.
15. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że związki o wzorze I stosuje się w ilości od 15% do 22% w stosunku do całkowitej objętości.
16. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około 10°C do 70°C, korzystnie od 30°C do 60°C.
17. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 16, znamienny tym, że organiczny rozpuszczalnik stosuje się w ilości od 1% do 90% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 15% do 60%, szczególnie od 20% do 50%.
18. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 17, znamienny tym, że stosunek organicznego rozpuszczalnika do wody wynosi od 9:1 do 1:9, korzystnie od 1:1 do 1:3.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10119274A DE10119274A1 (de) | 2001-04-20 | 2001-04-20 | Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL367043A1 PL367043A1 (pl) | 2005-02-21 |
| PL207271B1 true PL207271B1 (pl) | 2010-11-30 |
Family
ID=7682020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL367043A PL207271B1 (pl) | 2001-04-20 | 2002-04-15 | Sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040265978A1 (pl) |
| EP (2) | EP2123760A1 (pl) |
| JP (2) | JP4417628B2 (pl) |
| AT (1) | ATE443770T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ20032820A3 (pl) |
| DE (2) | DE10119274A1 (pl) |
| DK (1) | DK1383899T3 (pl) |
| ES (1) | ES2334016T3 (pl) |
| HU (1) | HU229667B1 (pl) |
| PL (1) | PL207271B1 (pl) |
| PT (1) | PT1383899E (pl) |
| SK (1) | SK288326B6 (pl) |
| WO (1) | WO2002086126A2 (pl) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10208007A1 (de) * | 2002-02-26 | 2003-09-18 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Alkoholen aus Substraten mittels Oxidoreduktasen, Zweiphasensystem umfassend eine wässrige Phase und eine organische Phase sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| EP1523552A1 (en) * | 2002-07-20 | 2005-04-20 | Degussa AG | Two-phase alcohol dehydrogenase-based coupled enzymatic reaction system |
| DE10300335B4 (de) * | 2003-01-09 | 2008-06-26 | Iep Gmbh | Oxidoreduktase |
| DE10313972A1 (de) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Degussa Ag | Gekoppeltes cofaktorabhängiges enzymatisches Reaktionssystem |
| DE10327454A1 (de) * | 2003-06-18 | 2005-01-20 | Juelich Enzyme Products Gmbh | Oxidoreduktase aus Pichia capsulata |
| DE102004007029A1 (de) * | 2004-02-12 | 2005-09-08 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen durch Enzyme |
| AT501928B1 (de) * | 2004-10-27 | 2010-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen |
| AT501496B1 (de) * | 2005-02-21 | 2007-03-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen |
| AT502395B1 (de) | 2005-07-27 | 2007-03-15 | Iep Gmbh | Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen |
| AT502185B1 (de) * | 2005-09-23 | 2007-02-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen |
| DE102006009744A1 (de) * | 2006-03-02 | 2007-09-06 | Wacker Chemie Ag | Herstellung von (S)-2-Butanol durch oxidative Racematspaltung |
| AT503486B1 (de) | 2006-04-11 | 2008-05-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden |
| EP2066788B1 (en) | 2006-10-02 | 2014-07-23 | Codexis, Inc. | Compositions and methods for producing stereoisomerically pure statins and synthetic intermediates therefor |
| AT504542B1 (de) | 2006-12-07 | 2008-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von secodionderivaten |
| KR101502634B1 (ko) | 2007-02-08 | 2015-03-16 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 케토 환원 효소 및 이의 용도 |
| WO2009029554A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (r)-3-hydroxythiolane |
| JP5973131B2 (ja) | 2007-09-13 | 2016-08-23 | コデクシス， インコーポレイテッド | アセトフェノンの還元のためのケトレダクターゼポリペプチド |
| TWI601825B (zh) | 2007-09-27 | 2017-10-11 | Ｉｅｐ有限公司 | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 |
| KR20100061571A (ko) | 2007-09-28 | 2010-06-07 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 케토리덕타제 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| EP2205727B1 (en) | 2007-10-01 | 2015-06-24 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of azetidinone |
| EP2281034B1 (en) | 2008-04-30 | 2015-10-21 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Process using Pseudoglucanobacter saccharoketogenes alcohol dehydrogenase |
| WO2010025287A2 (en) * | 2008-08-27 | 2010-03-04 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| HUE026181T2 (en) | 2008-08-27 | 2016-05-30 | Codexis Inc | Ketoreductase polypeptide for the preparation of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from 3-aryl-3-ketopropanamine |
| CN102186972B (zh) | 2008-08-29 | 2014-08-20 | 科德克希思公司 | 用于立体选择性生产(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的酮还原酶多肽 |
| EP2226386A1 (de) | 2009-03-05 | 2010-09-08 | IEP GmbH | Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen |
| PL2445890T3 (pl) * | 2009-06-22 | 2016-02-29 | Sk Biopharmaceuticals Co Ltd | Sposób wytwarzania estru (R)-1-arylo-2-tetrazoliloetylowego kwasu karbaminowego |
| SG10201405022PA (en) | 2009-08-19 | 2014-10-30 | Codexis Inc | Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine |
| US8404461B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| MX2012007583A (es) | 2009-12-29 | 2012-07-30 | Butamax Tm Advanced Biofuels | Alcohol deshidrogenasas (adh) utiles para la produccion fermentativa de alcoholes alquilicos de cadena corta. |
| EP2566497B1 (en) | 2010-05-04 | 2015-07-29 | Codexis, Inc. | Biocatalysts for ezetimibe synthesis |
| EP2576600B1 (de) | 2010-05-27 | 2018-01-24 | Pharmazell GmbH | Neuartige 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase-knockout-mutanten und deren verwendung |
| CN103889997B (zh) | 2011-01-18 | 2017-08-25 | 通用原子公司 | 水解酶酶底物及其应用 |
| RU2642311C2 (ru) * | 2012-05-17 | 2018-01-24 | Дженентек, Инк. | Способ получения гидроксилированных циклопентапиримидиновых соединений и их солей |
| CN104603278A (zh) | 2012-06-18 | 2015-05-06 | 化学实验室国际股份公司 | 利用氧化还原酶制备手性1-取代的2-哌啶醇的方法 |
| DE102013104418B4 (de) | 2013-04-30 | 2018-09-27 | Cambrex Iep Gmbh | Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol |
| KR20160097291A (ko) | 2013-12-11 | 2016-08-17 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 키랄 2-아릴 모폴린의 제조 방법 |
| CN115057796A (zh) * | 2015-12-01 | 2022-09-16 | 焦作健康元生物制品有限公司 | 光学活性的β-羟基酯类化合物的中间体 |
| AU2018360502B2 (en) * | 2017-11-01 | 2024-05-02 | Melinta Therapeutics, Inc. | Synthesis of boronate ester derivatives and uses thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4014573C1 (pl) | 1990-05-07 | 1991-10-10 | Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De | |
| US5225339A (en) * | 1992-02-26 | 1993-07-06 | The Scripps Research Institute | Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase |
| US5385833A (en) * | 1992-02-26 | 1995-01-31 | The Scripps Research Institute | Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase |
| US5719039A (en) * | 1995-06-01 | 1998-02-17 | University Of Iowa Research Foundation | Enzyme-surfactant ion-pair complex catalyzed reactions in organic solvents |
| DE19610984A1 (de) * | 1996-03-21 | 1997-09-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen |
-
2001
- 2001-04-20 DE DE10119274A patent/DE10119274A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-04-15 AT AT02737953T patent/ATE443770T1/de active
- 2002-04-15 HU HU0303803A patent/HU229667B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-04-15 PL PL367043A patent/PL207271B1/pl unknown
- 2002-04-15 EP EP09010760A patent/EP2123760A1/de not_active Withdrawn
- 2002-04-15 US US10/475,150 patent/US20040265978A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-15 ES ES02737953T patent/ES2334016T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-15 SK SK1269-2003A patent/SK288326B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-04-15 CZ CZ20032820A patent/CZ20032820A3/cs unknown
- 2002-04-15 DK DK02737953.6T patent/DK1383899T3/da active
- 2002-04-15 JP JP2002583640A patent/JP4417628B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-15 WO PCT/EP2002/004143 patent/WO2002086126A2/de active Application Filing
- 2002-04-15 PT PT02737953T patent/PT1383899E/pt unknown
- 2002-04-15 EP EP02737953A patent/EP1383899B1/de not_active Revoked
- 2002-04-15 DE DE50213871T patent/DE50213871D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-06-19 US US11/820,418 patent/US8361765B2/en active Active
-
2009
- 2009-06-23 JP JP2009148703A patent/JP2009207499A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK288326B6 (sk) | 2016-01-07 |
| SK12692003A3 (sk) | 2004-05-04 |
| WO2002086126A3 (de) | 2003-11-06 |
| US20090017510A1 (en) | 2009-01-15 |
| US20040265978A1 (en) | 2004-12-30 |
| WO2002086126A2 (de) | 2002-10-31 |
| JP2004527251A (ja) | 2004-09-09 |
| DE50213871D1 (de) | 2009-11-05 |
| PT1383899E (pt) | 2009-12-24 |
| ATE443770T1 (de) | 2009-10-15 |
| HU229667B1 (en) | 2014-04-28 |
| ES2334016T3 (es) | 2010-03-04 |
| EP1383899A2 (de) | 2004-01-28 |
| HUP0303803A3 (en) | 2011-05-30 |
| JP4417628B2 (ja) | 2010-02-17 |
| PL367043A1 (pl) | 2005-02-21 |
| DK1383899T3 (da) | 2010-01-25 |
| HUP0303803A2 (hu) | 2004-03-01 |
| EP1383899B1 (de) | 2009-09-23 |
| DE10119274A1 (de) | 2002-10-31 |
| EP2123760A1 (de) | 2009-11-25 |
| US8361765B2 (en) | 2013-01-29 |
| CZ20032820A3 (cs) | 2004-02-18 |
| JP2009207499A (ja) | 2009-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL207271B1 (pl) | Sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego | |
| CA2821719C (en) | Oxidoreductases for the stereoselective reduction of keto compounds | |
| JP4845729B2 (ja) | ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素 | |
| JP2007523617A6 (ja) | ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素 | |
| TWI601825B (zh) | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 | |
| JP2008529542A (ja) | ケト化合物のエナンチオ選択的酵素還元のプロセス | |
| JP5042831B2 (ja) | ヒドロキシ化合物の立体選択的製造用アルコール脱水素酵素 | |
| ES2358015T3 (es) | Oxidorreductasa. | |
| JP4753273B2 (ja) | 光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法 | |
| JPWO2007099764A1 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| US20080305534A1 (en) | Novel Glycerol Dehydrogenase, Gene Therefor, and Method of Utilizing the Same | |
| CN113913403B (zh) | 一种nadh激酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CA2308095A1 (en) | Thermostable alcohol dehydrogenases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |