SK12692003A3 - Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín - Google Patents
Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín Download PDFInfo
- Publication number
- SK12692003A3 SK12692003A3 SK1269-2003A SK12692003A SK12692003A3 SK 12692003 A3 SK12692003 A3 SK 12692003A3 SK 12692003 A SK12692003 A SK 12692003A SK 12692003 A3 SK12692003 A3 SK 12692003A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- gly
- carbon atoms
- group
- ala
- thr
- Prior art date
Links
- 230000009467 reduction Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 title claims abstract description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 68
- -1 hydroxy, amino Chemical group 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 241000186864 Weissella minor Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims abstract description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 9
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 45
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 35
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CCl OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical group CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 13
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 12
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 10
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 10
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 7
- ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 2-octanone Chemical compound CCCCCCC(C)=O ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 claims description 6
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 claims description 6
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 claims description 5
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims description 5
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 5
- OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 2,5-hexanedione Chemical compound CC(=O)CCC(C)=O OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HAEQAUJYNHQVHV-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(aminomethyl)-6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy-N-phenylbenzamide Chemical compound NCC1=CC(=NC(=C1)C(F)(F)F)OC=1C=C(C(=O)NC2=CC=CC=C2)C=CC=1 HAEQAUJYNHQVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000895502 Blumeria graminis f. sp. tritici Species 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 4
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 claims description 4
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000005840 aryl radicals Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 3
- XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N Ethyl pyruvate Chemical compound CCOC(=O)C(C)=O XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940117360 ethyl pyruvate Drugs 0.000 claims description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 2
- JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N compound E Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=N1)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 2
- STPXIOGYOLJXMZ-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-oxo-4-phenylbutanoate Chemical compound CCOC(=O)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 STPXIOGYOLJXMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims 4
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N Acetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1 KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N Asp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N 0.000 claims 2
- AIGROOHQXCACHL-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O AIGROOHQXCACHL-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 2
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 2
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N Ala-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N 0.000 claims 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N Ala-Leu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- MMLHRUJLOUSRJX-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MMLHRUJLOUSRJX-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 claims 1
- OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N Ala-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N 0.000 claims 1
- NYDIVDKTULRINZ-AVGNSLFASA-N Arg-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NYDIVDKTULRINZ-AVGNSLFASA-N 0.000 claims 1
- DDBMKOCQWNFDBH-RHYQMDGZSA-N Arg-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O DDBMKOCQWNFDBH-RHYQMDGZSA-N 0.000 claims 1
- KEUNWIXNKVWCFL-FXQIFTODSA-N Asn-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KEUNWIXNKVWCFL-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- KTTCQQNRRLCIBC-GHCJXIJMSA-N Asp-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KTTCQQNRRLCIBC-GHCJXIJMSA-N 0.000 claims 1
- USENATHVGFXRNO-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 USENATHVGFXRNO-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N Gly-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N 0.000 claims 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 claims 1
- NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N 0.000 claims 1
- UMBDRSMLCUYIRI-DVJZZOLTSA-N Gly-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)CN)O UMBDRSMLCUYIRI-DVJZZOLTSA-N 0.000 claims 1
- KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N Gly-Tyr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N 0.000 claims 1
- BNMRSWQOHIQTFL-JSGCOSHPSA-N Gly-Val-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BNMRSWQOHIQTFL-JSGCOSHPSA-N 0.000 claims 1
- KZTLOHBDLMIFSH-XVYDVKMFSA-N His-Ala-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KZTLOHBDLMIFSH-XVYDVKMFSA-N 0.000 claims 1
- RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N His-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- JIUYRPFQJJRSJB-QWRGUYRKSA-N His-His-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CN=CN1 JIUYRPFQJJRSJB-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 1
- LPFBXFILACZHIB-LAEOZQHASA-N Ile-Gly-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N LPFBXFILACZHIB-LAEOZQHASA-N 0.000 claims 1
- NPAYJTAXWXJKLO-NAKRPEOUSA-N Ile-Met-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N NPAYJTAXWXJKLO-NAKRPEOUSA-N 0.000 claims 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 claims 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 claims 1
- FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N 0.000 claims 1
- HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- VWPJQIHBBOJWDN-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VWPJQIHBBOJWDN-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N Lys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N 0.000 claims 1
- DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N Met-Arg-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCNC(N)=N DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N 0.000 claims 1
- XKJUFUPCHARJKX-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-His Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XKJUFUPCHARJKX-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims 1
- WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N Methylacetoacetic acid Chemical compound COC(=O)CC(C)=O WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NPLGQVKZFGJWAI-QWHCGFSZSA-N Phe-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O NPLGQVKZFGJWAI-QWHCGFSZSA-N 0.000 claims 1
- QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N Phe-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N 0.000 claims 1
- YUPRIZTWANWWHK-DZKIICNBSA-N Phe-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N YUPRIZTWANWWHK-DZKIICNBSA-N 0.000 claims 1
- IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N Ser-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N Ser-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- RXSWQCATLWVDLI-XGEHTFHBSA-N Ser-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RXSWQCATLWVDLI-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims 1
- UDQBCBUXAQIZAK-GLLZPBPUSA-N Thr-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UDQBCBUXAQIZAK-GLLZPBPUSA-N 0.000 claims 1
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 claims 1
- LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N 0.000 claims 1
- BONYBFXWMXBAND-GQGQLFGLSA-N Trp-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N BONYBFXWMXBAND-GQGQLFGLSA-N 0.000 claims 1
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 claims 1
- XUIOBCQESNDTDE-FQPOAREZSA-N Tyr-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O XUIOBCQESNDTDE-FQPOAREZSA-N 0.000 claims 1
- BYOHPUZJVXWHAE-BYULHYEWSA-N Val-Asn-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N BYOHPUZJVXWHAE-BYULHYEWSA-N 0.000 claims 1
- KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N 0.000 claims 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 claims 1
- 108010066988 asparaginyl-alanyl-glycyl-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 claims 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 claims 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 claims 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 claims 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 claims 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 claims 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 claims 1
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 claims 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 claims 1
- 108010084525 phenylalanyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 claims 1
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 claims 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 claims 1
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005192 partition Methods 0.000 abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 abstract 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 abstract 1
- HGASFNYMVGEKTF-UHFFFAOYSA-N octan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCCCCCO HGASFNYMVGEKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 55
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 55
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 55
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 8
- ZAJNMXDBJKCCAT-YFKPBYRVSA-N ethyl (3s)-4-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@H](O)CCl ZAJNMXDBJKCCAT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 6
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 6
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241001643453 Lactobacillus parabuchneri Species 0.000 description 3
- 241001147775 Thermoanaerobacter brockii Species 0.000 description 3
- 241000186837 Weissella kandleri Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N benzopyrazine Natural products N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 3-(1-methylpyrrolidin-2-yl)pyridine;7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC=N2.CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N methyl acetate Chemical compound COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000001238 wet grinding Methods 0.000 description 2
- FUOSTELFLYZQCW-UHFFFAOYSA-N 1,2-oxazol-3-one Chemical group OC=1C=CON=1 FUOSTELFLYZQCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 1H-indazole Chemical compound C1=CC=C2C=NNC2=C1 BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002941 2-furyl group Chemical group O1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001622 2-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C(*)C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000389 2-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 2H-isoindole Chemical compound C1=CC=CC2=CNC=C21 VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGAVZWMNOPFOCW-UHFFFAOYSA-N 2h-1,2,4-thiadiazol-5-one Chemical compound O=C1NC=NS1 IGAVZWMNOPFOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001397 3-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- UCTNTYHJFWMUBD-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-3-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)CCl UCTNTYHJFWMUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- KPDUDLVFJLFRBG-UHFFFAOYSA-N C(C)(=O)C1=CC=CC=C1.ClCC(CC(=O)OCC)=O Chemical compound C(C)(=O)C1=CC=CC=C1.ClCC(CC(=O)OCC)=O KPDUDLVFJLFRBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186777 Fructobacillus fructosus Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000186723 Lactobacillus bifermentans Species 0.000 description 1
- 241001468197 Lactobacillus collinoides Species 0.000 description 1
- 241000186784 Lactobacillus oris Species 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical compound C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186838 Weissella halotolerans Species 0.000 description 1
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M acetoacetate Chemical compound CC(=O)CC([O-])=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000005428 anthryl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C3C(*)=C([H])C([H])=C([H])C3=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- HTRXGEPDTFSKLI-UHFFFAOYSA-N butanoic acid;ethyl acetate Chemical compound CCCC(O)=O.CCOC(C)=O HTRXGEPDTFSKLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004655 dihydropyridinyl group Chemical group N1(CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 235000019262 disodium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002526 disodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229940079896 disodium hydrogen citrate Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(carboxymethyl)-2-hydroxybutanedioate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- BOZNWXQZCYZCSH-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-oxo-4-phenylbutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CC1=CC=CC=C1 BOZNWXQZCYZCSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 125000003983 fluorenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)* 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910001867 inorganic solvent Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003049 inorganic solvent Substances 0.000 description 1
- ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N isothiazole Chemical compound C=1C=NSC=1 ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N isoxazole Chemical compound C=1C=NOC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- ZVTQYRVARPYRRE-UHFFFAOYSA-N oxadiazol-4-one Chemical group O=C1CON=N1 ZVTQYRVARPYRRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDCVQGAUCOROHB-UHFFFAOYSA-N oxadiazolidine-4,5-dione Chemical group O=C1NNOC1=O YDCVQGAUCOROHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N phthalazine Chemical compound C1=NN=CC2=CC=CC=C21 LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000246 pyrimidin-2-yl group Chemical group [H]C1=NC(*)=NC([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004527 pyrimidin-4-yl group Chemical group N1=CN=C(C=C1)* 0.000 description 1
- 125000004528 pyrimidin-5-yl group Chemical group N1=CN=CC(=C1)* 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N quinazoline Chemical compound N1=CN=CC2=CC=CC=C21 JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011916 stereoselective reduction Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000005958 tetrahydrothienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000004568 thiomorpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- FFSJPOPLSWBGQY-UHFFFAOYSA-N triazol-4-one Chemical group O=C1C=NN=N1 FFSJPOPLSWBGQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical group 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka enzymatického spôsobu enantioselektívnej redukcie organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne hydroxyzlúčeniny, alkoholdehydrogenázy z Lactobacillus minor a enzymatického spôsobu enantioselektívneho získania (S)-hydroxyzlúčeniny z racemátu.
Doterajší stav techniky
Opticky aktívne hydroxyzlúčeniny sú cennými syntéznymi produktami na výrobu veľkého množstva farmakologicky dôležitých zlúčenín. Tieto zlúčeniny sú často ťažko vyrobiteľné klasickými chemickými spôsobmi a môžu len zriekla poskytnúť enantiomérnu čistotu požadovanú pre farmakologické použitie. Preto sa na výrobu chirálnych zlúčenín spravidla používajú biotechnologické spôsoby, pričom stereoselektívna reakcia je uskutočnená buď celými mikroorganizmami alebo použitím izolovaných enzýmov.
Pritom sa ukázalo ako výhodné použitie izolovaných enzýmov, pretože sa pri ich použití spravidla dosiahnu vyššie výťažky a vyššie enatiomérne čistoty.
Dehydrogenázy a najmä alkohol-dehydrogenázy sú cennými katalyzátormi pre získanie chirálnych produktov stereoselektívnou redukciou organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne alkoholy. V podstate sú známe zodpovedajúce enzýmy z kvasníc, konských pečienok alebo z Thermoanaerobium brockii. Tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADH (nikotínadeníndinukleotid) alebo NADPH (nikotínadeníndinukleotidfosfát). Ďalšími známymi alkohol-dehydrogenázami sú napríklad (S)-špecifická alkoholdehydrogenáza z Rhodococcus erythropolis alebo (R)-špecifická alkohol32201Π dehydrogenáza z rodu Lactobacillus. Oba tieto enzýmy majú široké substrátové spektrum na ketozlúčeniny a vykazujú vysokú enantioselektivitu. Alkoholdehydrogenázy z Lactobacillu kefír (DE 40 14 573) a Lactobacillus brevis (DE 196 10 984) sa hodí najmä na získanie chirálnych (R)-alkoholov.
Nevýhodou použitia alkohol-dehydrogenáz je však malá enzýmová stabilita a enzýmová účinnosť alkohol-dehydrogenáz v organických rozpúšťadlách a veľa krát len nepatrná rozpustnosť vo vode ketozlúčenín určených na redukciu. Okrem toho je ďalším limitujúcim faktorom použitia alkohol-dehydrogenáz v organických rozpúšťadlách nutnosť použitia NADP alebo NAD ako kofaktoru vzhľadom na to, že kofaktor (NADP, NAD) je vo vode rozpustný a ekonomickým spôsobom sa regeneruje.
Cieľom vynálezu je odstrániť uvedené nedostatky modifikácií procesných podmienok. Tento cieľ je podľa vynálezu dosiahnutý použitím dvojfázového systému, obsahujúceho anorganické rozpúšťadlo, alkohol-dehydrogenázu, vodu, kofaktor a ketozlúčeninu.
Spôsob podľa vynálezu vykazuje vysokú životnosť enzýmu v dôsledku enzým-stabilizujúceho účinku rozpúšťadla, enantiomérnu čistotu vyššiu ako 99,9 % vyrobenej chirálnej hydroxyzlúčeniny a vysoký výťažok vztiahnutý na použitie množstva ketozlúčeniny.
Podstata vynálezu
Vynález sa preto týka spôsobu enantioselektívnej redukcie ketozlúčeniny všeobecného vzorca I
R1-C(O)-R2 (I) v ktorom
R1 a R2, ktoré sú nezávisle jeden od druhého rovnaké alebo odlišné a znamenajú
32201/T
1. atóm vodíka,
2. alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkylová skupina je priama alebo rozvetvená,
3. alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkenylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri dvojité väzby,
4. alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkinylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri trojité väzby,
5. arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov,
6. alkylarylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 8 uhlíkových atómov a arylový zvyšok obsahuje 6 až 14 uhlíkových atómov, alebo
7. R1 a R2 tvoria spoločne so zvyškom -C(O)- arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov alebo heterocyklickú skupinu obsahujúcu 5 až 14 uhlíkových atómov, pričom skupiny uvedené vyššie v odstavcoch 1. až 7. sú nesubstituované alebo nezávisle od seba raz až trikrát substituované
a) skupinou -OH,
b) atómom halogénu, akým je atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu,
c) skupinou -NO2,
d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov v priamom alebo rozvetvenom reťazci a je nesubstituovaný alebo raz až trikrát substituovaný atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, alebo
e) heterocyklickou skupinou obsahujúcou 5 až 14 uhlíkových atómov, ktorá je nesubstituovaná alebo raz až trikrát
32201/T substituovaná atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, ktorého podstata spočíva v tom, že sa
a) zlúčenina všeobecného vzorca I, alkohol-dehydrogenáza, voda, kofaktor a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,5 až 4,0
b) inkubuje vo dvojfázovom systéme a
c) vytvorená chirálna hydroxyzlúčenina izoluje.
Arylovými skupinami obsahujúcimi 6 až 14 uhlíkových atómov sú napríklad fenylová skupina a naftylová skupina. Pod pojmom arylová skupina sa rozumejú aromatické uhľovodíkové skupiny obsahujúce 6 až 14 uhlíkových atómov v kruhu, napríklad 1-naftylová skupina, 2-naftylová skupina, bifenylylová skupina, napríklad 2-bifenylylová skupina a 4-bifenylylová skupina, antrylová skupina alebo fluorenylová skupina. Výhodnými arylovými skupinami sú bifenylylová skupina, naftylová skupina a najmä fenylová skupina.
Pod pojmom atóm halogénu sa rozumie atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu.
Pod pojmom alkylová skupina obsahujúca 1 až 20 uhlíkových atómov sa rozumie uhľovodíková skupina, ktorej uhlíkatý reťazec je priamy alebo rozvetvený a obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov.
Pod pojmom heterocyklická skupina obsahujúca 5 až 14 uhlíkových atómov sa rozumie monocyklický alebo bicyklický 5-členný až 14-členný heterocyklický kruh, ktorý je čiastočne nasýtený alebo celkom nasýtený. Príklady heteroatómov sú atóm dusíka, atóm kyslíka a atóm síry. Príklady heterocyklických skupín obsahujúcich 5 až 14 uhlíkových atómov sú skupiny, ktoré sú odvodené od pyrolu, furánu, tiofénu, imidazolu, pyrazolu, oxazolu, izoxazolu, tiazolu, izotiazolu, tetrazolu, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-oxidu, triazolónu, oxadiazolónu, izoxazolónu, oxadiazolidíndiónu a triazolu, ktoré sú substituované atómom fluóru, skupinou -CN, skupinou -CF3 alebo -C(O)-Oskupinou obsahujúcou v alkylovom zvyšku 1 až 4 uhlíkové atómy, 3hydroxypyro-2,4-diónu, 5-oxo-1,2,4-tiadiazolu, pyridínu, pyrazínu, pyrimidínu,
32201/T indolu, izoindolu, indazolu, ftalazínu, chinolínu, izochinolínu, chinoxalínu, chinazolínu, cinolínu, karbolínu a benzoanelovaných, cyklopenta-, cyklohexaalebo cykloheptaanelovaných derivátov uvedených heterocyklov. Obzvlášť výhodné sú 2-pyrolylový zvyšok, 3-pyrolylový zvyšok, fenylpyrolylový zvyšok, ako napríklad 4-fenyl-2-pyrolylový zvyšok alebo 5-fenyl-2-pyrolylový zvyšok, 2furylový zvyšok, 2-tienylový zvyšok, 4-imidazolylový zvyšok, metylimidazolylový zvyšok, napríklad 1-metyl-2-imidazolylový zvyšok, 1-metyl-4-imidazolylový zvyšok alebo 1-metyl-5-imidazolylový zvyšok, 1,3-tiazol-2-ylový zvyšok, 2pyridylový zvyšok, 3-pyridylový zvyšok, 4-pyridylový zvyšok, 2-pyridyl-N-oxidový zvyšok, 3-pyridyl-N-oxidový zvyšok alebo 4-pyridyl-N-oxidový zvyšok, 2pyrimidinylový zvyšok, 4-pyrimidinylový zvyšok alebo 5-pyrimidinylový zvyšok, 2-indolylový zvyšok, 3-indolylový zvyšok alebo 5-indolylový zvyšok, substituovaný indolylový zvyšok, napríklad 1-metyl-, 5-metyl-, 5-benzyloxy-, 5chlór- alebo 4,5-dimetyl-2-indolylový zvyšok, 1-benzyl-2-alebo -3-indolylový zvyšok, 4,5,6,7-tetrahydro-2-indolylový zvyšok, cyklohepta[b]-5-pyrolylový zvyšok, 2-chinolylový zvyšok, 3-chinolylový zvyšok, 4-chinolylový zvyšok, 1izochinolylový zvyšok, 3-izochinolylový zvyšok, 4-izochinolylový zvyšok, 1-oxo1,2-dihydro-3-izochinolylový zvyšok, 2-chinoxalinylový zvyšok, 2benzofuranylový zvyšok, 2-benzotienylový zvyšok alebo benzotiazolylový zvyšok alebo dihydropyridinylový zvyšok, pyrolidinylový zvyšok, napríklad 2-(Nmetylpyrolidinyl)ový zvyšok alebo 3-(N-metylpyrolidinyl)ový zvyšok, piperazinylový zvyšok, morfolinylový zvyšok, tiomorfolinylový zvyšok, tetrahydrotienylový zvyšok alebo benzodioxolanylový zvyšok.
Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca I sú etylester kyseliny 4chlór-3-oxobutánovej acetofenón, metylester kyseliny octovej, etyl-3-oxo-4fenylbutyrát, 2,5-hexándión, pyrohroznan etylnatý alebo 2-oktanón, pričom obzvlášť výhodný je etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej.
Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa v rámci spôsobu podľa vynálezu použijú v množstve 2 až 30 %, vzťahujúc na celkový objem, pričom výhodne sa tieto zlúčeniny použijú v množstve 1 % až 25 %, najmä v množstve 15 až 22 %, vzťahujúc na celkový objem.
32201 /T
Do vody sa výhodne pridá pufor, napríklad fosforečnan draselný, Tris/HCI-pufor alebo trietanolaminový pufor s hodnotou pH 5 až 10, výhodne s hodnotou pH 6 až 9. Koncentrácia pufru je 10 až 150 mM, výhodne 90 až 110 mM, najmä 100 mM. Dodatočne pufor obsahuje tiež horečnaté ióny, napríklad vo forme chloridu horečnatého, v koncentrácii 0,2 až 10 mM, výhodne v koncentrácii 0,5 až 2 mM, najmä v koncentrácii 1 mM.
Teplota sa napríklad pohybuje od asi 10 do 70 °C, výhodne od 30 do 60 °C.
Organické rozpúšťadlá použiteľné v rámci vynálezu majú výhodne logP 0,6 až 2,0, najmä 0,6 až 1,9, obzvlášť výhodne 0,63 až 1,75. Výhodnými organickými rozpúšťadlami sú napríklad dietyléter, terc-butylmetyléter, diizopropyléter, dibutyléter alebo etylester kyseliny octovej, pričom obzvlášť výhodným rozpúšťadlom je etylester kyseliny octovej. Etylester kyseliny octovej môže byť napríklad použitý v množstve 1 až 90 %, vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek, výhodne v množstve 15 až 60 %, vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek, najmä v množstve 20 až 50 %, vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek.
Pomer organického rozpúšťadla k vode je 9:1 až 1:9, výhodne 1:1 až 1:3.
Voda tvorí v dvojfázovom systéme podľa vynálezu jednu kvapalnú fázu a organické rozpúšťadlo tvorí druhú kvapalnú fázu. Tiež môže byť ešte prípadne prítomná pevná fáza alebo ďalšia kvapalná fáza, ktorá je napríklad tvorená nie celkom rozpustenou alkohol-dehydrogenázou alebo zlúčeninou všeobecného vzorca I. Výhodné sú však obe kvapalné fázy bez pevnej fázy. Uvedené dve kvapalné fázy sa výhodne mechanicky premiešajú, takže sa dosiahne veľký povrch medzi oboma kvapalnými fázami.
Koncentrácia kofaktora NADPH alebo NADH, vzťahujúc na vodnú fázu je 0,05 až 0,25 mM, najmä 0,06 až 0,2 mM.
Výhodne sa pri spôsobe podľa vynálezu použije ešte ďalší stabilizátor alkohol-dehydrogenázy. Výhodnými stabilizátormi sú napríklad glycerín, sorbitol
32201/T alebo dimetylsulfoxid (DMSO).
Množstvo glycerínu je 5 až 30 %, vzťahujúc na objem celkovej násady. Výhodne množstvo glyrecínu je 10 až 20 %, najmä 20 %, vzťahujúc na objem celkovej násady.
Za účelom regenerácie použitého NADH alebo NADPH môže byť v rámci vynálezu dodatočne pridaný izopropanol. Napríklad izopropanol a NADP zreaguje s alkohol-dehydrogenázou na NADPH a acetón. Použité množstvo izopropanolu je 5 až 30 %, vzťahujúc na objem celkovej násady. Výhodné množstvo izopropanolu je 10 až 20 %, najmä 10 %.
Vhodné alkohol-dehydrogenázy pochádzajú napríklad z kvasníc, konských pečienok alebo z Rhodococcus erythropolis, pričom tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADH, alebo z Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefír alebo Lactobacillus brevis, pričom tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADPH.
Ak sa použije v rámci vynálezu napríklad alkohol-dehydrogenáza z kvasníc, konských pečienok, z Thermoanaerobium brockii alebo z Rhodococcus erythropolis, potom sa zo zlúčeniny všeobecného vzorca I získa zodpovedajúca (S)-hydroxyzlúčenina. Ak sa použije v rámci vynálezu napríklad alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus kefír alebo Lactobacillus brevis, potom sa zo zlúčeniny všeobecného vzorca I získa zodpovedajúca (R)hydroxyzlúčenina.
Alkohol-hydrogenáza môže byť v rámci vynálezu použitá buď celkom vyčistená alebo čiastočne vyčistená alebo môže byť v rámci tohto použitia obsiahnutá v bunkách. Použité bunky pritom môžu byť v natívnom stave, v permeabilizovanom stave alebo v stave bunkovej lézie.
Objemová účinnosť použitej aikohol-dehydrogenázy je 100 jednotiek/ml (U/ml) až 2000 U/mk, výhodne asi 800 U/ml, pri obsahu proteínu asi 20 až 22 mg/ml. Výhodne má použitá alkohol-dehydrogenáza špecifickú aktivitu asi 35 až 40 U/mg proteínu. Na každý kilogram zreagovanej zlúčeniny všeobecného vzorca I sa použije asi 20 000 až 200 000 U alkoholdehydrogenázy, výhodne
32201/T asi 100 000 U alkohol-dehydrogenázy. Enzýmová jednotka 1 U pritom zodpovedá množstvu enzýmu, ktoré je potrebné na to, aby každú minútu zreagoval 1 pmol zlúčeniny všeobecného vzorca I.
Spôsob podľa vynálezu sa napríklad uskutočňuje v uzavretej reakčnej nádobe zo skla alebo z kovu. Pre tento účel sa reakčné zložky jednotlivo zavedú do reakčnej nádoby, kde sa miešajú pod atmosférou napríklad dusíka alebo vzduchu. V závislosti od charakteru substrátu a použitej zlúčeniny všeobecného vzorca i je reakčná doba 1 až 14 dní, výhodne 4 až 7 dní.
Získaná reakčná zmes sa následne spracuje. Pre tento účel sa oddelí vodná fáza a etylacetátová fáza sa sfiltruje. Vodná fáza môže byť pripadne ešte raz extrahovaná a ďalej spracovaná ako etylacetátová fáza. Potom sa sfiltrovaná fáza odparí za zníženého tlaku. Takto sa získa napríklad produkt tvorený etylesterom kyseliny 4-chlór-3-(S)-hydroxybutánovej, ktorý má enantiomérnu čistotu vyššiu ako 99,9 % a ktorý je v podstate zbavený produktu etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxo-butánovej. Celkový výťažok uvedeného spôsobu je po destilovaní produktu 82 až 88 %, vzťahujúc na použité množstvo eduktu.
S prekvapením bolo zistené, že organické rozpúšťadlá s hodnotou logP rovnou 0 až 4 majú stabilizačný účinok na alkohol-dehydrogenázu, zatiaľ čo v rámci doterajšieho stavu techniky sa od použitia dvojfázového systému s organickými rozpúšťadlami odstupuje (M.R.Kula, U. Kragel; kap.28, Dehydrogenases in Synthesis of Chiral Compounds; R. N. Patel, Stereoselective Biocatalyses, 2000; Peters J. 9. DehydrogenasesCharacteristics, Design of Reaction Conditions, and Application, In: H.J.Rehm, G. Reed Biotechlogy, sv.3. Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993; J. Lynda a kol., Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis, Biotechnol. Prog. 1991, 7, str. 116-124). Pri spôsobe podľa vynálezu sa ako organická fáza použije etylester kyseliny octovej (etylacetát), pričom táto organická fáza slúži ako zásobník pre zlúčeninu všeobecného vzorca I, ale tiež súčasne extrahuje z vodnej fázy reakčný produkt, ktorým je chirálna hydroxyzlúčenina.
32201/T
Na rozdiel od doterajšieho stavu techniky vedie použitie organického rozpúšťadla s hodnotou logP rovnou 0 až 3 v priebehu času k zvýšenej stabilizácii alkohol-dehydrogenázy. Podľa doterajšieho stavu techniky majú najmä organické rozpúšťadlá s hodnotou logP (logaritmus rozdeľovacieho koeficientu oktanol/voda) 0 až 2 výrazný destabilizujúci vplyv na enzýmy a prichádzajú takto ťažko do úvahy ako organická fáza v dvojfázových systémoch (K. Faber, Biotransformations in organic chemistry, 3.vyd. 1997, Springer Verlag, kap.3.Bis 3.17).
Vynález sa ďalej týka alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor s vysokým teplotným optimom. Alkohol-hydrogenáza z Lactobacillus minor má DNA-sekvenciu podľa SEQ ID NO:3 a aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 4 v rámci priloženého sekvenčného protokolu. Táto alkoholdehydrogenáza z Lactobacillus minor je R-špecifická, pričom napríklad zo zlúčeniny všeobecného vzorca I môže byť získaná zodpovedajúca (R)hydroxyzlúčenina. Enantioselektívny alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor môže byť prekvapivo superexprimovaná v Escherichia coli RB 791, zatiaľ čo z ostatných druhov rodu Lactobacillus sa alkohol-dehydrogenáza exprímuje podstatne obmedzenejšie. To je o to viac prekvapujúce, že sa alkoholdehydrogenáza len veľmi málo exprímuje v divokom kmeni Lactobacillus minor, a takto je nedetekovateľná bežnými metódami screeningu (biotransformácia celých buniek, aktívny test). Bolo preto veľmi prekvapujúce, že došlo ku klonovaniu R-enantioselektívnej alkohol-hydrogenázy z Lactobacillus minor a že táto alkohol-dehydrogenáza je tak výrazne silne superexprimovaná v Escherichia coli (50 % bunkového proteínu klonu, 20 000 U/g vlhkej hmotnosti).
Vyčistený enzým z Lactobacillus minor je stabilný v rozmedzí pH asi 5,5 až 8,5. Tento enzým je stabilný do teploty asi 40 °C a pH-optimum enzymatickej reakcie leží v rozmedzí od pH 7 do pH 7,5. Teplotné optimum tejto enzymatickej reakcie leží v blízkosti 55 °C a enzým vykazuje široké substrátové spektrum.
32201/T
Uvedený enzým môže byť pomocou hydrofóbnej interakčnej chromatografíe vyčistený až k dosiahnutiu špecifickej aktivity 35 až 40 U/mg proteínu.
Vynález sa rovnako týka spôsobu získania alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor. Pre tento účel sa vo vhodnom prokaryotickom alebo eukaryotickom mikroorganizme exprimuje DNA, ktorá kóduje alkoholdehydrogenázu z Lactobacillus minor. Výhodne sa alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor transformuje a exprimuje v kmeni Escherichia coli, výhodne v Escherichia coli RB 791.
Alkohol-dehydrogenázu je možné z Lactobacillus minor získať napríklad tak, že sa kultivujú rekombinantné bunky Escherichia coli, načo sa indukuje expresia alkohol-dehydrogenázy a po asi 10 až 18 hodinách (h) sa bunky otvoria pôsobením ultrazvuku alebo v lise French (Gaullin, Siemens). Získaný bunkový extrakt môže byť buď priamo použitý alebo ešte ďalej čistený. Pre tento účel sa bunkový extrakt napríklad odstredí a získaný supematant sa podrobí hydrofóbnej interakčnej chromatografii. Táto chromatografia sa výhodne uskutočňuje pri hodnote pH 7,0 vo vodnom pufri, ktorý obsahuje tiež horečnaté ióny.
Vynález sa ďalej týka spôsobu získania enantioselektívnej (S)hydroxyzlúčeniny všeobecného vzorca II
R1-C(OH)-R2 (II) v ktorom
R1 a R2, ktoré sú nezávisle jeden od druhého rovnaké alebo odlišné a znamenajú
1. atóm vodíka,
2. alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkylová skupina je priama alebo rozvetvená,
3. alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto
32201/T alkenylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri dvojité väzby,
4. alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkinylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri trojité väzby,
5. arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov,
6. alkylarylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 8 uhlíkových atómov a arylový zvyšok obsahuje 6 až 14 uhlíkových atómov, alebo
7. R1 a R2 tvoria spoločne so zvyškom -C(O)- arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov alebo heterocyklickú skupinu obsahujúcu 5 až 14 uhlíkových atómov, pričom skupiny uvedené vyššie v odstavcoch 1. až 7. sú nesubstituované alebo nezávisle od seba raz až trikrát substituované
a) skupinou -OH,
b) atómom halogénu, akým je atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu,
c) skupinou -NO2,
d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov v priamom alebo rozvetvenom reťazci a je nesubstituovaný alebo raz až trikrát substituovaný atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, alebo
e) heterocyklickou skupinou obsahujúcou 6 až 14 uhlíkových atómov, ktorá je nesubstituovaná alebo raz až trikrát substituovaná atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, ktorého podstata spočíva v tom, že sa
32201/T
a) racemická zmes obsahujúca zlúčeninu všeobecného vzorca II, alkoholdehydrogenázu podľa vynálezu, vodu, kofaktor a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,5 až 4,0, napríklad z množiny zahrňujúcej dietyléter, terc-butylmetyléter, diizopropyléter a etylester kyseliny octovej,
b) inkubuje v dvojfázovom systéme a
c) vytvorená enantiomérne čistá (S)-hydroxyzlúčenina sa izoluje.
Reakčné podmienky sú v podstate rovnaké ako pri vyššie uvedenom spôsobe enantiošpecifickej redukcie ketozlúčeniny všeobecného vzorca I. Pri tomto spôsobe sa však namiesto enantioselektívnej redukcie ketozlúčeniny všeobecnéo vzorca I oxiduje zodpovedajúca (R)-hydroxyzlúčenina všeobecného vzorca II na zodpovedajúcu ketozlúčeninu. Ďalej sa pri tomto spôsobe na regeneráciu NADP používa namiesto izopropanolu acetón. Takto sa napríklad acetón a NADPH zreagujú s alkohol-dehydrogenázou na NADP a izopropanol. Použité množstvo acetónu je 5 až 30 %, vzťahujúc na objem celkovej násady. Výhodné množstvo acetónu je 10 až 20 %, najmä 10 %, vzťahujúc na objem celkovej násady.
Alkohol-dehydrogenáza môže byť pri výrobe zlúčeniny všeobecného vzorca II buď v celkom alebo čiastočne vyčistenom stave alebo môže byť tiež obsiahnutá v bunkách. Tieto bunky môžu byť pritom v natívnom alebo permeabilizovanom stave alebo v stave bunkovej lézie.
Predmetom vynálezu je tiež rekombinantný kloň Escherichia coli RB 791, ktorý exprimuje alkohol-dehydrogenázu z Lactobacillus minor a ktorý bol 26. marca 2001 uložený za podmienok Budapeštianskej zmluvy v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr so sídlom Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig pod depozitným číslom DSM 14196.
V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnení, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov a obsahom opisnej časti.
32201/T
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Screening R-Alkohol-dehydrogenázy v kmeňoch rodu Laktobacillus pomocou biotransformácie celých buniek
Pre účel screeningu boli kultivované rôzne kmene Lactobacillus v nasledujúcich prostrediach (údaje sú vyjadrené vo všetkých prípadoch v g/l): glukóza (20), kvasnicový extrakt (5), mäsový extrakt (10), hydrogéncitran dvojsodný (2), octan sodný (5), síran horečnatý (0,2), síran manganatý (0,05), hydrogénfosforečnan dvojsodný (2).
Uvedené prostredie bolo sterilizované pri teplote 121 °C a kmene rodu Lactobacillus (ďalej skrátene len L.) boli na tomto prostredí kultivované bez ďalšej regulácie pH alebo prívodu kyslíka. Potom boli bunky odstredené a resuspendované pre celobunkovú biotransformáciu, pričom vždy 4 g buniek boli suspendované v koncovom objeme 10 ml káliumfosforečnanového pufru (KPipufor) (50 mM, pH=7,0). Po pridaní 0,1 g glukózy boli bunky vystavené trepaniu po dobu 15 minút pri teplote 30 °C. K získanej bunkovej suspenzii bol pridaný etylester kyseliny 4-chlór-3-oxo-butánovej a po 10 minútach a 120 minútach bola uskutočnená analýza prostredia pomocou plynovej chromatografie. Potom boli bunky odstredené, supernatant bol sfiltrovaný a zriedený chloroformom až k dosiahnutiu koncovej koncentrácie 10 až 15 μο/ηηΙ etylesteru kyseliny 4-chlór3-oxobutánovej.
32201/T
Ako substrát použitý etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej bol jednotlivými kmeňmi Lactobacillus prevedený na etyl-(S)-4-chlór-3hydroxybutyrát majúci nasledujúce enantiomérne čistoty.
Enantiomérny prebytok sa vypočíta nasledujúcim spôsobom: ee(%)= ((R-alkohol-S-alkohol) / (R-alkohol + S-alkohol)) x 100.
Tabuľka 1
| Kmeň Lactobacillus | ee etylesteru kyseliny 4-chlór-3-(S)-hydroxybutánovej (%) |
| L. reuteri | 34,6 |
| L. kandleri | 90,0 |
| L. collinoides | 71,3 |
| L. bifermentans | 53,6 |
| L. oris | 63,4 |
| L. brevis | 74,0 |
| L. halotolerans | 67,2 |
| L. minor | 18,6 |
| L. parabuchneri | 78,5 |
| L. kefir | 87,8 |
| L. fructosus | 28,9 |
32201/T
Príklad 2
Získanie rekombinantnej R-špecifickej alkohol-dehydrogenázy
A) Príprava genómovej DNA z kmeňov rodu Lactobacillus
Bunková peleta z asi 2 ml kvapalnej kultúry rodu Lactobacillus sa resuspenduje v 300 μΙ TE-pufru (obsahujúceho 10 mM Tris/HCl, pH=8, 1 mM EDTA), načo sa k získanej suspenzii pridá 20 mg/ml lyzozýmu a zmes sa inkubuje po dobu 10 minút pri teplote 37 °C. Potom sa ku kultivačnej zmesi pridá 100 μΙ dodecylsulfátu sodného (SDS) (10 %), 100 μΙ chloristanu sodného a 500 μΙ zmesi chloroformu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1. Po intenzívnom premiešaní sa proteín odstredí a vodná fáza sa prevedie do novej Eppendorfovej nádobky. Potom sa pridá 800 μ etanolu (EtOH) (96 %). Eppendorfova nádoba sa niekoľkokrát obráti a vylúčená chromozomálna DNA sa prevedie do novej Eppendorfovej nádoby a premyje 200 μΙ EtOH. Získaná DNA sa opäť prevedie do novej Eppendorfovej nádoby, kde sa vysuší za zníženého tlaku a rozpustí v 100 μΙ TE-pufru.
B) Oligonukleotid ako 5'- a 3'-primér pre PCR (polymerázová reťazová reakcia)
Priméry použité pre PCR boli odvodené od známej N-terminálnej a Cterminálnej sekvencie alkohol-dehydrogenázy z L. kefir. Pritom boli zohľadnené známe preferencie pre určité kodóny v laktobaciloch. Takto bol pred každý 5'primér predradený kodón ATG (Met) ako štartovací kodón, ďalej bolo na 5'priméru štartovaciemu miestu predradené miesto strihu pre reštrikčný enzým Bam Hl (GGATCC), aby bolo umožnené neskoršie klonovanie na expresný sektor. Za 3'-primér boli zaradené stop-kodón (TAG) a miesto strihu pre Hind III (AAGCTT). Primérové konštrukty sú uvedené ďalej.
N = A, T, C alebo G;
Y = T alebo C;
R = A alebo B
32201/T
5'-primér
5'- GCGGATCCATGACNGAYCGNTTRAARGGNAARGTNGC3' (SEQ ID N0:1)
3'B-primér
5OGGAAGCTTCTAYTGNGCNGTRTANCCNCCRTCNAC3' (SEQ ID N0:2). Priméry boli vyrobené známym spôsobom.
C) PCR (polymerázová reťazová reakcia) s génomovou DNA z kmeňov rodu Lactobacillus.
PCR-násada (100 μΙ)
| Násada pre reakciu | Koncentrácia | |
| dNTP's | 8 μΙ | každý ΝΤΡ 2,5 nmol/μΙ |
| Oligos | každý oligo 10 μΙ: 20μΙ | 2 pmol/μΙ |
| Chromozómová DNA | 3 μΙ | asi 1μο/μΙ |
| 10 x pufor (Promega) | 10 μΙ | |
| Taq-polymeráza (Promega) | 1 μΙ | 2υ/μΙ |
| h2o | 58 μΙ |
dNTP's sú zmesí dezoxynukleotidtrifosfátov ako dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Cyklus:
°C, 2 minúty, potom °C vydržanie horúci štart, potom °C, 30 sekúnd, potom °C, 1 min 30 x
32201/T potom vždy 30 krát 95 °C, 30 sekúnd a 40 °C, 1 min, potom 72 °C, 2,5 min potom °C vydržanie.
Pre účel analýzy bolo na 1 % agarózový gél nanesené 10 μΙ násady a nanesená násada bola pri konštantnej hodnote 100 V elektroforeticky rozdelená. PCG ukázala zreteľnú amplifikáciu kusu DNA s asi 750 bp.
D) Izolácia PCR-fragmentov z gélu
Pre účel získania PCR-fragmentov bola celá PCR-násada nanesená na 1 % agarózový gél a rozdelená elektroforeticky pri konštantnej hodnote 100 V. Gél bol potom rozdelený do dvoch stôp, z ktorých jedna obsahovala kompletnú PCR-násadu a druhá obsahovala iba 5 μΙ vzoriek, takže pre účel oddelenia PCR-fragmentov z gélu bola pre orientáciu vyfarbená etídiumbromidom iba stopa so vzorkou, aby sa vylúčilo poškodenie PCR-fragmentu, ktorý má byť izolovaný, etídiumbromidom.
Izolácia z gélu bola uskutočnená pomocou súpravy QIAquick Gel Extraction Kit, ktorá je komerčne dostupná u spoločnosti Qiagen z Hilden.
Stanovenie koncentrácie poskytlo celkovú koncentráciu 20 nG/μΙ DNA.
E) Ligácia
Pre účel prípravy ligácie boli vyčistený PCR-fragment a použitý klonovací vektor pQE 70 (oba komerčne dostupné u firmy Quiagen) zrezané pomocou Bam Hl a Hind III (4 μΙ DNA= 200 ng DNA), 1 μΙ 10xpufor, 1 μΙ enzým, BSA a H2O (Biolab, New England).
Zrezaný plazmid bol potom znovu prečistený použitím súpravy QIAquick Gel Extraction Kit, vybratý vodou a defosforylovaný alkalickou fosfatázou (USB, Amershan Life Science).
Za účelom čistenia boli zodpovedajúce reakčné násady nanesené na 1 % agarónový gél a takto strávený amplifikát, ako i plazmid boli z gélu izolované
32201/T spôsobom opísaným v odstavci D. Koncentrácia plazmidu a amplifikátu bola po čistení asi 20 ng/μΙ.
Pre účel ligácie bola použitá násada tvorená 3 μΙ pQE30 alebo pQE (60 ng), 2,5 μΙ amplifikátu (50 ng), 2 μΙ ligačného pufru (Boehringen, Manheim), 1,5 μΙ H2O a 1 μΙ T4-ligázy (Boehringer, Mannheim). Celá násada bola inkubovaná cez noc pri teplote 16 °C.
Potom bolo 40 μΙ elektrokomponentných buniek Escherichia coli RB791 transformovaných elektroporáciou použitím 1,5 μΙ ligačnej násady. Bunky boli zavedené do 500 μΙ SOC-prostredia, inkubované 45 minút pri teplote 37 °C a potom boli nanesené v objemoch 250 μΙ na LBamp-agarovej dosky. SOCprostredie obsahuje v litri vody 20 g tryptónu, 5 g kvasnicového extraktu, 0,5 g chloridu sodného, 10 ml 1M MgSO4 a 10 ml 1M MgCb- LBarrip-agarovej dosky obsahujú na liter vody 10 g tryptónu, 5 g kvasnicového extraktu, 10 g NaCl, 20 g agaru a 50 mg ampicilínu pri pH 7,0.
Vzrastlé kolónie boli preočkované a kultivované v 4 ml kvapalného kultivačného prostredia (LBamp-prostredia) cez noc pri teplote 37 °C. Z tejto bunkovej suspenzie boli vždy použité 2 ml pre prípravu plazmidu (podľa minipreparačného protokolu Quiagen (Quiagen, Hilden). Z plazmidového preparátu bola získaná reštrikčná zmes použitím Bam Hl a Hindlll. Kompletná reštrikčná zmes bola potom nanesená na 1 % agarózový gél, kde bola elektroforeticky rozdelená pri 100 V (identifikácia 750 kp insertu) a plazmidy boli potom prípadne použité pre sekvencovanie.
F) Sekvencovanie plazmidov
Sekvencovanie bolo uskutočnené pomocou súpravy SequiThermEXCEL II Long-Read DNA Sequencing Kit (Biozym, Oídendorf) a sekvenčného zariadenia Li-Cor-Sequencer (MWG Biotec, Ebersberg) podľa inštrukcií výrobcu. Ako priméry boli použité štandardné sekvenčné priméry pre pQEvektory.
32201/T
G) Screening klonu pokiaľ ide o expresiu v roztoku R-ADH
Klony s insertmi 750 kp boli skúmané s cieľom stanoviť ich enzymatickú aktivitu a stereoselektivitu. Pre tento účel boli kolónie z agarových platní preočkované do 20 ml tekutého kultivačného prostredia (LBamp-prostredia), kde boli kultivované pri 25 °C. Pri bunkovej hustote (OD50o) 0,5 nasledovala indukcia použitím 1 mM izopropyl-beta-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG). Po 18 hodinách boli bunky odstredené a vždy 40 mg buniek bolo vybratých 350 mikrolitrami Kpi-pufru (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCI2). Uvoľnenie enzýmu z buniek bolo dosiahnuté mokrým mletím pomocou sklenených perlí (0,5 g, 0,3 mm). Potom nasledovala 20 minútová dezintegrácia pomocou Retschovho mlynu pri teplote 4 °C.
V rámci enzýmového testu bolo použitých 870 mikrolitrov trietanolamínového pufru (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCI2), 100 mikrolitrov 100 mM roztoku etylesteru kyseliny 4-chlóracetooctovej, 10 mikrolitrov NAPDH (finálnej koncentrácie 0,19 mM) a 20 mikrolitrov roztoku enzýmu.
Definícia enzýmovej jednotky: 1U zodpovedá množstvu enzýmu, ktoré je potrebné na to, aby došlo ku konverzii 1 mikromólu substrátu (etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej) za 1 minútu.
Pre účel stanovenia stereosektivity bolo inkubované 480 mikrolitrov trietanolamínového pufru (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCI2) s 1,0 mM etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej, 1,9 mM NADPH (vždy finálna koncentrácia) a 20 mikrolitrov roztoku enzýmu. Po 15 minútach inkubácie sa reakčná zmes sfiltruje a zriedi v pomere 1:10 chloroformom, načo sa vzorka zriedenej reakčnej zmesi analyzuje pomocou plynového chromatografu združeného s hmotovým spektrometrom.
Podmienky plynovej chromatografie:
chirálny stĺpec: Lipodex E, ID = 0,25 mm, I = 25 m (Macherey-Nagel),
1. 2 minúty pri 60 °C,
2. v priebehu 28 minút z 60 °C na 130 °C pri rýchlosti zvyšovania teploty
2,5 °C za minútu,
32201/T
3. 15 minút pri 130 °C.
(R)-Špecifická alkohol-dehydrogenáza môže byť klonovaná a aktívne superexprimovaná z kmeňov Lactobacillus uvedených v nasledujúcej tabuľke.
Tabuľka
| Kmeň | Plazmid | Číslo klonu | aktivita U/g buniek* | ee v % |
| L. parabuchneri | pQE 30 | 12 | 450 | >99,9 |
| L. parabuchneri | pQE 30 | 14 | 170 | >99,9 |
| L. kandleri | pQE 30 | 11 | 280 | >99,9 |
| L. kandleri | pQE 70 | 17 | 710 | >99,9 |
| L. minor | pQE 30 | 2 | 2830 | >99,9 |
| L. minor | pQE 70 | 3 | 680 | >99,9 |
| L. minor | pQE 70 | 4 | 700 | >99,9 |
*) Aktivita vypočítaná podľa G) (mokré mletie); aktivity po fermentácii a dezintegrácii použitím French-lisu sú výrazne vyššie.
H) Získanie enzýmu a čistenie enzýmu
Pre účel získania enzýmu sa kmeň s najväčšou enzymatickou aktivitou kultivuje vo fermentore (vsádzka 10 I). K indukcii dochádza pri OD50o 40 použitím 1 mM IPTG. Po 18 hodinách sa uskutoční zber buniek, pričom 300 g týchto buniek sa vyberie 3 litrami Kpi-pufru (50 mM, pH = 7,1 mM MgCI2), načo sa uskutoční dezintegrácia buniek pomocou French-lisu (Gaullin, Siemens). Zvyšok získaný po odstredení bude ďalej uvádzaný ako surový extrakt a má objemovú aktivitu asi 2000 U/ml (20 000 U/g vlhkej hmoty).
32201/T
Pre účel charakterizácie enzýmu sa časť získaného enzýmu prečistí hydrofóbnou interakčnou chromatografiou na Q-Sepharóze ff (fast flow). Použitý stĺpec bol uvedený do rovnováhy s 50mM Kpi-pufrom, pH=7,0, 1mM MgCI2. Po nanesení surového extraktu na stĺpec a krátkom prepláchnutí ekvilibračným pufrom sa enzým eluuje pri stúpajúcom lineárnom soľnom gradiente (0-1M NaCl, 1 ml/min) pri koncentrácii soli asi 0,3 M NaCl. Po prečistení frakcií s obsahom enzýmu sa získa asi 25 ml vyčisteného enzýmu s objemovou aktivitou asi 800 U/ml a obsahom proteínu 20 až 22 mg/mol. Takto vyčistený enzým má teda špecifickú aktivitu asi 35 až 40 U/mg proteínu.
Všetky enzymatické aktivity boli stanovené pri teplote 25 °C. Enzymatická aktivita bola vypočítaná nasledujúcim spôsobom:
Výpočet: 1 jednotka = 1 mikromol násady substrátu/min,
Lambert-Beerschov zákon.
Úbytok NADPH bol sledovaný pri 340 nm (pozri enzymatická testová násada) =
| ΔΕ/min, | |
| N | zrieďovací faktor enzýmu, |
| V | objem enzýmu v ml (0,01), |
| Vkyveta — | objem kyvety = 1 ml, |
| d | hrúbka vsádzky v kyvete = 1 cm, |
| θΝΑ0ΡΗ= | extinkčný koeficient NADPH = 6,22 [mM'1*cnrf1] |
| aktivita | = (AE/lTIÍn*N*Vkyveta)/ (eNADPH*V*d). |
Stanovenie proteínu bolo uskutočnené podľa Bradforda (Bio-RadLaboratoites GmbH, Protein Assay).
Príklad 3
Enzýmom katalyzovaná výroba etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrátu
32201/T
A) V 5 litrovej mierke
Pre enzýmom kalatyzovanú syntézu etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrátu z etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxo-butánovej sa použijú surový extrakt alkoholdehydrogenázy získaný v príklade 2 a koenzým NADP. Oxidovaný koenzým je súčasnou prítomnosťou izopropanolu kontinuálne regenerovaný, takže reakcia potrebuje iba katalytické množstvo koenzýmu.
Násada obsahuje:
litre trietanolamínového pufru 100 mM pH=7,0, 1mM MgCI2, 10 % glycerín,
400 mg NADF,
600 ml izopropanolu,
800 ml etylesteru kyseliny octovej,
600 ml etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej a asi 100 000 jednotiek alkohol-dehydrogenázy.
Po 3 dňoch miešania pri teplote miestnosti bola plynovou chromatografiou preukázaná úplná konverzia etylesteru kyseliny 4-chlór-3oxobutánovej na etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrát s viac ako 99,9 % enantiomérnou čistotou.
Po oddelení vodnej fázy, odparení rozpúšťadla a prípadnej destilácii sa získa čistý etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrát s viac ako 99,9 % enantiomérnou čistotou.
B) V 50 litrovej mierke
Reakčná násada pre konverziu 10 I etylesteru kyseliny 4-chlór-3oxobutánovej má nasledujúce zloženie:
litrov trietanolamínového pufru 100 mM pH=7,0, 1mM MgCI2, 10 % glycerín, 4 g NADP, litrov izopropanolu,
32201/T litrov etylesteru kyseliny octovej, litrov etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej a asi 2 milióny jednotiek alkohol-dehydrogenázy (1,25 I surového extraktu).
Po 7 dňoch miešania pri teplote miestnosti bola plynovou chromatografiou preukázaná úplná konverzia etylesteru kyseliny 4-chlór-3oxobutánovej na etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrát s viac ako 99,9 % enantiomérnou čistotou.
Príklad 4
Biochemická charakterizácia klonovanej alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor
A) pH-Stabitila
Závislosť aktivity enzýmu pri skladovaní v pufroch s rozdielnymi hodnotami pH bola skúmaná v rozmedzí pH 4 až 11. Pre tento účel boli použité rôzne pufry (50 mM) v rozmedzí pH 4 až 11, pričom sa inkubuje po dobu 30 minút enzým vyčistený podľa príkladu 2 a zriedenie v pufri v pomere 1:100. Všetky použité pufry obsahovali 1 mM MgCI2. 10 mikrolitrov bolo potom použitých pri normálnom enzýmovom teste (trietanolamínový pufor 100 mM pH=7,0, 1 mM MgCI2, 10 mM etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej a 0,19 mM NADPH). Reakcia bola uskutočnená po dobu 1 minúty pri teplote 30 °C a 340 nm. Východisková hodnota je pritom nameraná hodnota, ktorá sa získa bezprostredne po zriedení enzýmu v trietanolovom pufri 50 mM pH=7,0. Táto hodnota zodpovedala za vopred daných podmienok zmene extinkcie 0,20 /min a bola určená ako hodnota 100 %, pričom všetky následne získané namerané hodnoty boli k tejto hodnote vztiahnuté. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 2.
32201/T
Tabuľka 2
| Hodnota pH | Pufrovací systém | Aktivita v % (n=2) | Pufrovací systém | Aktivita % (n=2) |
| 4 | Na acetát/ kyselina octová | 87,5±6,5 | ||
| 4,5 | Na-acetát/ kyselina octová | 94,5±3,0 | ||
| 5 | Na-acetát/ kyselina octová | 94,5±1,5 | MES/NaOH | 55±5 |
| 5,5 | KH2PO4/K2PO4 | 93±3 | MES/NaOH | 77,1±2,1 |
| 6 | KH2PO4/K2PO4 | 100±0 | Trietanolamin/ NaOH | 100±0 |
| 6,5 | KH2PO4/K2PO4 | 97,5±2,5 | Trietanolamin/ NaOH | 100±0 |
| 7 | KH2PO4/K2PO4 | 100±0 | Trietanolamin/ NaOH | 97,9±2,1 |
| 7 5 | KH2PO4/K2PO4 | 97,5±7,5 | Tris/HCI | 94,6±1,3 |
| 8 | KH2PO4/K2PO4 | 93,0±3,0 | Tris/HCI | 89,2±0 |
| 8,5 | KH2PO4/K2PO4 | 102,5± 2,5 | Tris/HCI | 60±4,2 |
| 9 | Glycín/NaOH | 76,5±1,5 | Tris/HCI | 63,1±4,8 |
| 9,5 | Glycín/NaOH | 52,5±7,5 | ||
| 10 | Glycín/NaOH | 52,5±7,5 | ||
| 11 | Glycín/NaOH | 0,0±0 |
Tabuľka 2 ukazuje, že enzým má dobrú pH-stabilitu najmä v kyslej oblasti pH, pričom sa zdá, že táto stabilita je závislá nielen od hodnoty pH, ale tiež od použitého pufrovacieho systému. Tak napríklad pri použití TRIS- a MESpufru pri rovnakej hodnote pH možno pozorovať silnú inaktiváciu enzýmu. Pri KPi-pufri nedochádza v rozmedzí pH 5,5 až 8,5 k žiadnej významnej inaktivácii.
32201/T
-25 emulgačného činidla. Nasledujúci deň sa ošetrené rastliny naočkovali so spórami Blumeria graminis f. sp. tritici (= synonymum pre Erysiphe graminis f. sp. tritici) intenzívnym pretriasaním napadnutých základných rastlín nad ošetrenými črepníkmi. Po kultivácii v skleníku počas 7 dní pri teplote 22 až 26 °C a relatívnej vlhkosti medzi 60 a 90 % sa rozsah napadnutia hubami na listoch zhodnotil vizuálne ako percento napadnutej plochy listov.
V tomto pokuse rastliny, ktoré sa ošetrili s 200 ppm zlúčeniny 1-7 vykazovali napadnutie 3 % a rastliny, ktoré sa ošetrili s 50 ppm zlúčeniny 1-7 vykazovali napadnutie 7 %, zatiaľ čo rastliny ošetrené s 200 ppm a 50 ppm porovnávacích zlúčenín D a E boli infikované (pri 200 ppm) pre zlúčeninu D na 60 % a pre zlúčeninu E na 80 % a pri 50 ppm na 80 %, a neošetrené rastliny boli infikované na 100%.
Tabuľka 4
| Hodnota pH | Pufrovací systém | Aktivita v U/ml nezdedeného enzýmu |
| 4 | Na-acetát/ kyselina octová | 85 |
| 4,5 | Na-acetát/ kyselina octová | 132 |
| 5 | MES/NaOH | 218 |
| 5,5 | MES/NaOH | 240 |
| 6 | Trietanolamín/ NaOH | 381 |
| 6,5 | Trietanolamín/ NaOH | 349 |
| 7 | Trietanolamín/ NaOH | 510 |
| 7,5 | Tris/HCI | 707 |
| 8 | Tris/HCI | 585 |
| 8,5 | Tris/HCI | 486 |
| 9 | Tris/HCI | 488 |
| 10 | Glycín/NaOH | 131 |
| 11 | Glycín/NaOH | 0 |
D) Teplotné optimum
Pre účel stanovenia optimálnej teploty účinnosti enzýmu bola aktivita enzýmu meraná pri teplotách od 25 do 60 °C. Násada použitá pri tomto teste zodpovedala štandardnej koncentrácii etylesteru kyseliny 4-chlór-3oxobutánovej. Ako je to zrejmé z tabuľky 5 má enzým optimálnu teplotu pri teplote 55 °C, pričom potom aktivita enzýmu so zvyšujúcou sa teplotou rýchlo klesá.
32201/T
Tabuľka 5
| Teplota (°C) | Účinnosť v U/ml nezdedeného enzýmu |
| 25 | 540 |
| 30 | 1235 |
| 35 | 1968 |
| 40 | 1621 |
| 45 | 2469 |
| 50 | 2469 |
| 55 | 2855 |
| 60 | 0 |
E) Substrátové spektrum
Ďalej boli v testovaných násadách namiesto etylesteru kyseliny 4-chlór3-oxobutánovej použité ešte ďalšie substráty. Na tento účel bola použitá nasledujúca testovacia násada:
970 mikrolitrov trietanolamínového pufru (100 mM, pH=7,0, 1 mM MgCI2 s 10 mM ketónovej zlúčeniny), 10 mikrolitrov enzýmu (1:100).
Za týchto podmienok bola stanovená aktivita pre etylester kyseliny 4chlór-3-oxobutánovej považovaná za 100 % a stanovené aktivity enzýmu pri použití iných substrátov boli vztiahnuté k tejto 100 % hodnote. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 6.
32201/T
Tabuľka 6
| Substrát | Aktivita v % (n=2) |
| Etylester kyseliny 4-chlór-3oxobutánovej | 100 |
| Pyrohroznan etylnatý | 192, 3±11,5 |
| 2-Oktanón | 90,8±1,2 |
| Metylesteracetoacetát | 120±7,7 |
| Etylester kyseliny 2-oxo-4fenylbutánovej | 62,7±4 |
F) Stabilita enzýmu v organických rozpúšťadlách
Za účelom štúdia stability enzýmu pri jeho styku s organickými rozpúšťadlami bola alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor zriedená v uvedených rozpúšťadlových zmesiach a inkubovaná pri teplote miestnosti (v rozpúšťadlách nemiešateľných s vodou sa zriedenie vzťahuje k vodnej fáze). Pri teste bolo zaistené stále premiešavanie oboch fáz (trepačka, 200 otáčok za minútu). Následne bolo 10 mikrolitrov roztoku enzýmu použitých v štandardnej testovej násade. Tiež tu bola východisková hodnota po zriedení v pufri (trietanolamínový pufor 100 mM, pH=7,0, 1 mM MgCI2) určená ako hodnota 100 % a všetky ďalej zistené hodnoty boli k tejto východiskovej hodnote vztiahnuté. Získané hodnoty sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách 7A a 7B.
32201/T
Tabuľka 7A
S vodou miešateľné rozpúšťadlá
| Rozpúšťadlo | LogP | t=2h | t=8h | t=24h | t=48h |
| Pufor | 86 | 70 | 3 | 0 | |
| 10 % izopropanolu | 0,28 | 32 | 34 | 16 | 0 |
| 20 % izopropanolu | 0,28 | 16 | 17 | 7 | 0 |
| 10 % DMSO | -1,3 | 73 | 54 | 60 | 40 |
| 20 % DMSO | -1,3 | 73 | 54 | 57 | 40 |
| 1M Sorbitol | 93 | 74 | 60 | 6 | |
| 10 % Glycerínu | -3,0 | 120 | 64 | 62 | 28 |
| 20 % Glycerínu | -3,0 | 120 | 100 | 100 | 104 |
Ako je zrejmé z tabuľky 7A, pôsobí glycerín, DMSO a sorbitol na použitú alkohol-dehydrogenázu aktivačné, poprípade stabilizačné. Pri teste použitý izopropanol naopak pôsobí deaktivačne.
32201/T
Tabuľka 7B
Rozpúšťadlá nemiešateľné s vodou
| Rozpúšťadlo | LogP | t=2h | t=8h | t=24h | t=48h |
| Pufor | 86 | 70 | 3 | 0 | |
| 20 % Etylesteru kyseliny octovej | 0,68 | 87 | 50 | 10 | 8 |
| 20 % Dietyléteru | 0,85 | 53 | 42 | 37 | 23 |
| 20 % tercButylmetyléteru | 1,21 | 67 | 51 | 38 | 24 |
| 20 % Diizopropyléteru | 1,55 | 100 | 57 | 41 | 29 |
| 20 % Pentánu | 3,0 | 74 | 55 | 7 | 6 |
| 20 % Hexánu | 3,5 | 80 | 39 | 2 | 5 |
| 20 % Heptánu | 4 | 51 | 49 | 7 | 6 |
| 20 % Oktánu | 4,5 | 87 | 47 | 2 | 1 |
Ako je zrejmé z tabuľky 7B, vykazuje skúmaná alkohol-dehydrogenáza vo veľkom počte organických rozpúšťadiel pozoruhodnú stabilitu. Nápadné je to, že rozpúšťadlá s hodnotami logP medzi 0 a 3 neinhibujú skúmanú alkoholdehydrogenázu silnejšie ako rozpúšťadlá s hodnotami logP medzi 3 a 4,5, pričom pokiaľ ide o dlhšie inkubačné doby (24 g a 48 h), majú rozpúšťadlá s hodnotami logP medzi 0 a 3 na skúmanú alkohol-dehydrogenázu stabilizujúci účinok v porovnaní so zodpovedajúcimi hodnotami stanovenými pre pufor. Skúmané alifatické rozpúšťadlá pentán, hexán, heptán a oktán tento stabilizačný účinok pri dlhodobej inkubácii nevykazujú.
32201/T
Hodnota logP zložky X je logaritmus rozdeľovacieho koeficientu zložky X v dvojfázovom systéme oktanol/voda v objemovom pomere 50:50. P = koncentrácia zložky X v oktanolovej fáze/koncentrácia zložky X vo vodnej fáze.
G) Stabilita enzýmu za procesných podmienok
Pre účel skúmania stability enzýmu za procesných podmienok bola alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor zriedená v rozpúšťadlových zmesiach použitých v rámci dvojfázového systému v pomere 1:100 a inkubovaná pri teplote miestnosti. Následne bolo 10 mikrolitrov roztoku enzýmu použitých v násade štandardného aktivitného testu. V nasledujúcej tabuľke 8 sú aktivity enzýmu vyjadrené v percentických hodnotách vztiahnutých na východiskovú hodnotu.
Tabuľka 8
| 6h | 20h | 46h | 60h | 84h | |
| Trietanolamínový pufor, 100 mM, 1mM Mg2Cl2 | 100 | 75 | 0 | 0 | 0 |
| Zmes B | 100 | 85 | 80 | 60 | 55 |
| Zmes C | 110 | 95 | 95 | 85 | 80 |
| Zmes D | 100 | 65 | 55 | 50 | 50 |
Zmes B: pufor, 10 % glycerín, 10 % izopropanol, zmes C: pufor, 20 % glycerín, 10 % izopropanol, zmes D: pufor, 10 % gycerín, 10 % izopropanol + 20 % etylester kyseliny octovej.
Bolo zistené, že rekombinantný alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor je stabilný a aktívny po dobu niekoľkých dní v kombinácii rozpúšťadiel použitých v uvedenom dvojfázovom systéme.
32201/T
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob enantiomérnej redukcie ketozlúčenín všeobecného vzorca IR1-C(O)-R2 (I) v ktoromR1 a R2, ktoré sú nezávisle jeden od druhého rovnaké alebo odlišné a znamenajú1. atóm vodíka,2. alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkylová skupina je priama alebo rozvetvená,3. alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkenylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri dvojité väzby,4. alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkinylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri trojité väzby,5. arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov,6. alkylarylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 8 uhlíkových atómov a arylový zvyšok obsahuje 6 až 14 uhlíkových atómov, alebo7. R1 a R2 tvoria spoločne so zvyškom -C(O)- arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov alebo heterocyklickú skupinu obsahujúcu 5 až 14 uhlíkových atómov, pričom skupiny uvedené vyššie v odstavcoch 1. až 7. sú nesubstituované alebo nezávisle od seba raz až trikrát substituované32201 ns/Ta) skupinou -OH,b) atómom halogénu, akým je atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu,c) skupinou -NO2,d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov v priamom alebo rozvetvenom reťazci a je nesubstituovaný alebo raz až trikrát substituovaný atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, aleboe) heterocyklickou skupinou obsahujúcou 5 až 14 uhlíkových atómov, ktorá je nesubstituovaná alebo raz až trikrát substituovaná atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, vyznačujúci sa tým, že saa) zlúčenina všeobecného vzorca I s podielom 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady, alkohol-hydrogenáza, voda, kofaktor NADPH alebo NADH a organické, vodou nemiešateľné rozpúšťadlo s hodnotou logP 0,5 až 4,0,b) inkubujú v dvojfázovom systéme vody a organického, vodou nemiešateľného rozpúšťadlac) pričom sa alkohol-dehydrogenázou vytvorený oxidovaný kofaktor kontinuálne regeneruje ad) izoluje sa chirálna hydroxyzlúčenina.2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije zlúčenina všeobecného vzorca I zvolená z množiny zahrňujúcej etylester kyseliny 4-chlór3-oxobutánovej, acetofenón, metylester kyseliny acetooctovej, etyl-2-oxo-4fenylbutyrát, 2,5-hexándión, pyrohroznan etylnatý a 2-oktanón.32201 ns/T3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa použije organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,6 až 3,0 najmä rovnou 0,6 až 1,9.4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa použije organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,63 až 1,75.5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa ako organické rozpúšťadlo použije dietyléter, terc-butylmetylester, diizopropyléter alebo etylester kyseliny octovej.6. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa použije alkohol-dehydrogenáza z kvasníc, z konských pečienok, z Termoanaerobium brocki, z Rhodococcus erythropolis, z Lactobacillus kefir, z Lactobacillus brevis, z Lactobacillus minor alebo alkoholdehydrogenáza s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID NO: 4.7. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že sa pridá pufor, ako káliumfosforečnanový pufor, Tris/HCI-pufor alebo trietanolamínový pufor s hodnotou pH 5 až 10, výhodne s hodnotou pH 6 až 9.8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sa k pufru pridajú horečnaté ióny, ako MgCb, v koncentrácii 0,2 až 10 mM, výhodne v koncentrácii 0,5 až 2 mM.32201 ns/T9. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa ako kofaktor pridá NADPH alebo NADH v množstve 0,01 až 0,25 mM, najmä v množstve 0,06 až 0,2 mM, vztiahnuté na vodnú fázu.10. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa ako stabilizátor alkohol-dehydrogenázy pridá glycerín, sorbitol alebo dimetylsulfoxid.11. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa pridá izopropanol.12. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca I použije v množstve 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem, výhodne v množstve 10 až 25 %, vztiahnuté na celkový objem, najmä v množstve 15 až 22 %, vztiahnuté na ceíkový objem.13. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje pri teplote asi 10 až 70 °C, výhodne pri teplote 30 až 60 °C.14. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že sa organické rozpúšťadlo použije v množstve 1 až 90 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady, výhodne v množstve 15 až 60 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady, najmä v množstve 20 až 50 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady.32201 ns/T15. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 14, vyznačujúci sa tým, že pomer organického rozpúšťadla k vode je rovný 9:1 až 1:9, výhodne 1:1 až 1:3.16. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa stabilizátor použije v množstve 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady, výhodne v množstve 10 až 20 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady, najmä v množstve 20 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady.17. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa izopropanol použije v množstve 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady, výhodne v množstve 10 až 20 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady, najmä v množstve 10 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej násady.18. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa alkoholdehydrogenáza použije v množstve 20 000 až 200 000 U na kilogram zlúčeniny všeobecného vzorca I určenej na konverziu, výhodne v množstve asi 100 000 U na kilogram zlúčeniny všeobecného vzorca I určenej na konverziu.19. Použitie alkohol-hydrogenázy z Lactobacillus minor s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID NO: 4 pri spôsobe podľa nároku18.20. Použitie alkohol-hydrogenázy z Lactobacillus minor s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID NO: 3 pri spôsobe podľa nároku 18.32201 ns/T21. Spôsob získania alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor podfa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že sa vo vhodnom prokaryotickom alebo eukaryotickom mikroorganizme, najmä v bunkách Escherichia coli uložených pod depozitným kódom DSM 14196, exprimuje DNA, ktorá kóduje alkoholdehydrogenázu z Lactobacillus minor, a alkohol-dehydrogenáza sa prípadne vyčistí.22. Spôsob získania enantioselektívnej (S)-hydroxyzlúčeniny všeobecného vzorca IIR1-C(OH)-R2 (II) v ktoromR1 a R2, ktoré sú nezávisle jeden od druhého rovnaké alebo odlišné a znamenajú1. atóm vodíka,2. alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkylová skupina je priama alebo rozvetvená,3. alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto aikenylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri dvojité väzby,4. alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkinylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri trojité väzby,5. arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov,6. alkylarylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 8 uhlíkových atómov a arylový zvyšok obsahuje 6 až 14 uhlíkových atómov, alebo32201 ns/T7. R1 a R2 tvoria spoločne so zvyškom -C(O)- arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov alebo heterocyklickú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov, pričom skupiny uvedené vyššie v odstavcoch 1. až 7. sú nesubstituované alebo nezávisle od seba raz až trikrát substituovanéa) skupinou -OH,b) atómom halogénu, akým je atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu,c) skupinou -NO2,d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov v priamom alebo rozvetvenom reťazci a je nesubstituovaný alebo raz až trikrát substituovaný atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, aleboe) heterocyklickou skupinou obsahujúcou 6 až 14 uhlíkových atómov, ktorá je nesubstituované alebo raz až trikrát substituovaná atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, vyznačujúci sa tým, že saa) racemická zmes obsahujúca zlúčeninu všeobecného vzorca II, alkoholdehydrogenázu, vodu, kofaktor NADP alebo NAD a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,6 až 1,9 z množiny, zahrňujúcej dietyléter, terc-butylmetyléter, diizopropyléter a etylester kyseliny octovej,b) inkubuje v dvojfázovom systéme vody a organického, vodou nemiešateľného rozpúšťadla ac) izoluje sa enantiomérne čistá (S)-hydroxyzlúčenina.23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že sa pridá acetón.32201 ns/TSekvenčný protokol <210> 1 <211> 795 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> opis umelej sekvencie: DNA primér <401> 1 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatga ccgatcggtt gaaggggaaa 60 gtagcaattg taactggcgg taccttggga attggcttgg caatcgctga taagtttgtt 120 gaagaaggcg caaaggttgt tattaccggc cgtcacgctg atgtaggtga aaaagctgcc 180 agatcaatcg gcggcacaga cgttatccgt tttgtccaac acgatgcttc tgatgaaacc 240 ggctggacta agttgtttga tacgactgaa gaagcatttg gcccagttac cacggttgtc 300 aacaatgccg gaattgcggt cagcaagagt gttgaagata ccacaactga agaatggcgc 360 aagctgctct cagttaactt ggatggtgtc ttcttcggta cccgtcttgg aatccaacgt 420 atgaagaata aaggactcgg agcatcaatc atcaatatgt catctatcga aggttttgtt 480 ggtgatccag ctctgggtgc atacaacgct tcaaaaggtg ctgtcagaat tatgtctaaa 540 tcagctgcct tggattgcgc tttgaaggac tacgatgttc gggttaacac tgttcatcca 600 ggttatatca agacaccatt ggttgacgat cttgaagggg cagaagaaat gatgtcacag 660 cggaccaaga caccaatggg tcatatcggt gaacctaacg atatcgcttg gatctgtgtt 720 tacctggcat ctgacgaatc taaatttgcc actggtgcag aattcgttgt cgacggaggg 780 tacaccgccc aatag 795 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> opis umelej sekvencie: sekvencia: DNA primér <400> 2 gcggatccat gacngaycgn ttraarggna argtngc32201/r <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: DNA primér <400> 3 gggaagcttc taytgngcng trtanccncc rtcnac <210> 4 <211> 264 <212> PRT <213> Lactobacillus sp. <400> 4 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Thr Asp Arg 1 5 10 15 Leu Lys Gly Lys Val Ala íle Val Thr Gly Gly Thr Leu Gly íle Gly 20 25 30 Leu Ala íle Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala Lys Val Val íle 35 40 45 Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala Arg Ser íle Gly 50 55 60 Gly Thr Asp Val íle Arg Phe Val Gin His Asp Ala Ser Asp Glu Thr 65 70 75 80 Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala Phe Gly Pro Val 85 90 95 Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly íle Ala Val Ser Lys Ser Val Glu 100 105 110 Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser Val Asn Leu Asp 115 120 125 . Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly íle Gin Arg Met Lys Asn Lys 32201/Τ130 135 140Gly 145 Leu Gly Ala Ser íle 150 íle Asn Met Ser Ser íle Glu Gly Glu Val 155 160 Gly Asp Pro Ala Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly Ala Val Arg 165 170 175 íle Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu Lys Asp Tyr Asp ISO 185 190 Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr íle Lys Thr Pro Leu Val 195 200 205 Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gin Arg Thr Lys Thr .210 215 220 Pro Met Gly His íle Gly Glu Pro Asn Asp íle Ala Trp íle Cys Val 225 230 235 240 Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly Ala Glu Phe Val 245 250 255 Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gin 26032201/T-25 emulgačného činidla. Nasledujúci deň sa ošetrené rastliny naočkovali so spórami Blumeria graminis f. sp. trítici (= synonymum pre Erysiphe graminis f. sp. trítici) intenzívnym pretriasaním napadnutých základných rastlín nad ošetrenými črepníkmi. Po kultivácii v skleníku počas 7 dní pri teplote 22 až 26 °C a relatívnej vlhkosti medzi 60 a 90 % sa rozsah napadnutia hubami na listoch zhodnotil vizuálne ako percento napadnutej plochy listov.V tomto pokuse rastliny, ktoré sa ošetrili s 200 ppm zlúčeniny 1-7 vykazovali napadnutie 3 % a rastliny, ktoré sa ošetrili s 50 ppm zlúčeniny 1-7 vykazovali napadnutie 7 %, zatiaľ čo rastliny ošetrené s 200 ppm a 50 ppm porovnávacích zlúčenín D a E boli infikované (pri 200 ppm) pre zlúčeninu D na 60 % a pre zlúčeninu E na 80 % a pri 50 ppm na 80 %, a neošetrené rastliny boli infikované na 100%.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10119274A DE10119274A1 (de) | 2001-04-20 | 2001-04-20 | Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen |
| PCT/EP2002/004143 WO2002086126A2 (de) | 2001-04-20 | 2002-04-15 | Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven reduktion von ketoverbindungen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK12692003A3 true SK12692003A3 (sk) | 2004-05-04 |
| SK288326B6 SK288326B6 (sk) | 2016-01-07 |
Family
ID=7682020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1269-2003A SK288326B6 (sk) | 2001-04-20 | 2002-04-15 | Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040265978A1 (sk) |
| EP (2) | EP2123760A1 (sk) |
| JP (2) | JP4417628B2 (sk) |
| AT (1) | ATE443770T1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20032820A3 (sk) |
| DE (2) | DE10119274A1 (sk) |
| DK (1) | DK1383899T3 (sk) |
| ES (1) | ES2334016T3 (sk) |
| HU (1) | HU229667B1 (sk) |
| PL (1) | PL207271B1 (sk) |
| PT (1) | PT1383899E (sk) |
| SK (1) | SK288326B6 (sk) |
| WO (1) | WO2002086126A2 (sk) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10208007A1 (de) * | 2002-02-26 | 2003-09-18 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Alkoholen aus Substraten mittels Oxidoreduktasen, Zweiphasensystem umfassend eine wässrige Phase und eine organische Phase sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| EP1523552A1 (en) * | 2002-07-20 | 2005-04-20 | Degussa AG | Two-phase alcohol dehydrogenase-based coupled enzymatic reaction system |
| DE10300335B4 (de) * | 2003-01-09 | 2008-06-26 | Iep Gmbh | Oxidoreduktase |
| DE10313972A1 (de) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Degussa Ag | Gekoppeltes cofaktorabhängiges enzymatisches Reaktionssystem |
| DE10327454A1 (de) * | 2003-06-18 | 2005-01-20 | Juelich Enzyme Products Gmbh | Oxidoreduktase aus Pichia capsulata |
| DE102004007029A1 (de) * | 2004-02-12 | 2005-09-08 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen durch Enzyme |
| AT501928B1 (de) * | 2004-10-27 | 2010-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen |
| AT501496B1 (de) * | 2005-02-21 | 2007-03-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen |
| AT502395B1 (de) | 2005-07-27 | 2007-03-15 | Iep Gmbh | Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen |
| AT502185B1 (de) * | 2005-09-23 | 2007-02-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen |
| DE102006009744A1 (de) * | 2006-03-02 | 2007-09-06 | Wacker Chemie Ag | Herstellung von (S)-2-Butanol durch oxidative Racematspaltung |
| AT503486B1 (de) | 2006-04-11 | 2008-05-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden |
| EP2066788B1 (en) | 2006-10-02 | 2014-07-23 | Codexis, Inc. | Compositions and methods for producing stereoisomerically pure statins and synthetic intermediates therefor |
| AT504542B1 (de) | 2006-12-07 | 2008-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von secodionderivaten |
| KR101502634B1 (ko) | 2007-02-08 | 2015-03-16 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 케토 환원 효소 및 이의 용도 |
| WO2009029554A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (r)-3-hydroxythiolane |
| JP5973131B2 (ja) | 2007-09-13 | 2016-08-23 | コデクシス， インコーポレイテッド | アセトフェノンの還元のためのケトレダクターゼポリペプチド |
| TWI601825B (zh) | 2007-09-27 | 2017-10-11 | Ｉｅｐ有限公司 | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 |
| KR20100061571A (ko) | 2007-09-28 | 2010-06-07 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 케토리덕타제 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| EP2205727B1 (en) | 2007-10-01 | 2015-06-24 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of azetidinone |
| EP2281034B1 (en) | 2008-04-30 | 2015-10-21 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Process using Pseudoglucanobacter saccharoketogenes alcohol dehydrogenase |
| WO2010025287A2 (en) * | 2008-08-27 | 2010-03-04 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| HUE026181T2 (en) | 2008-08-27 | 2016-05-30 | Codexis Inc | Ketoreductase polypeptide for the preparation of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from 3-aryl-3-ketopropanamine |
| CN102186972B (zh) | 2008-08-29 | 2014-08-20 | 科德克希思公司 | 用于立体选择性生产(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的酮还原酶多肽 |
| EP2226386A1 (de) | 2009-03-05 | 2010-09-08 | IEP GmbH | Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen |
| PL2445890T3 (pl) * | 2009-06-22 | 2016-02-29 | Sk Biopharmaceuticals Co Ltd | Sposób wytwarzania estru (R)-1-arylo-2-tetrazoliloetylowego kwasu karbaminowego |
| SG10201405022PA (en) | 2009-08-19 | 2014-10-30 | Codexis Inc | Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine |
| US8404461B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| MX2012007583A (es) | 2009-12-29 | 2012-07-30 | Butamax Tm Advanced Biofuels | Alcohol deshidrogenasas (adh) utiles para la produccion fermentativa de alcoholes alquilicos de cadena corta. |
| EP2566497B1 (en) | 2010-05-04 | 2015-07-29 | Codexis, Inc. | Biocatalysts for ezetimibe synthesis |
| EP2576600B1 (de) | 2010-05-27 | 2018-01-24 | Pharmazell GmbH | Neuartige 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase-knockout-mutanten und deren verwendung |
| CN103889997B (zh) | 2011-01-18 | 2017-08-25 | 通用原子公司 | 水解酶酶底物及其应用 |
| RU2642311C2 (ru) * | 2012-05-17 | 2018-01-24 | Дженентек, Инк. | Способ получения гидроксилированных циклопентапиримидиновых соединений и их солей |
| CN104603278A (zh) | 2012-06-18 | 2015-05-06 | 化学实验室国际股份公司 | 利用氧化还原酶制备手性1-取代的2-哌啶醇的方法 |
| DE102013104418B4 (de) | 2013-04-30 | 2018-09-27 | Cambrex Iep Gmbh | Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol |
| KR20160097291A (ko) | 2013-12-11 | 2016-08-17 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 키랄 2-아릴 모폴린의 제조 방법 |
| CN115057796A (zh) * | 2015-12-01 | 2022-09-16 | 焦作健康元生物制品有限公司 | 光学活性的β-羟基酯类化合物的中间体 |
| AU2018360502B2 (en) * | 2017-11-01 | 2024-05-02 | Melinta Therapeutics, Inc. | Synthesis of boronate ester derivatives and uses thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4014573C1 (sk) | 1990-05-07 | 1991-10-10 | Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De | |
| US5225339A (en) * | 1992-02-26 | 1993-07-06 | The Scripps Research Institute | Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase |
| US5385833A (en) * | 1992-02-26 | 1995-01-31 | The Scripps Research Institute | Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase |
| US5719039A (en) * | 1995-06-01 | 1998-02-17 | University Of Iowa Research Foundation | Enzyme-surfactant ion-pair complex catalyzed reactions in organic solvents |
| DE19610984A1 (de) * | 1996-03-21 | 1997-09-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen |
-
2001
- 2001-04-20 DE DE10119274A patent/DE10119274A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-04-15 AT AT02737953T patent/ATE443770T1/de active
- 2002-04-15 HU HU0303803A patent/HU229667B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-04-15 PL PL367043A patent/PL207271B1/pl unknown
- 2002-04-15 EP EP09010760A patent/EP2123760A1/de not_active Withdrawn
- 2002-04-15 US US10/475,150 patent/US20040265978A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-15 ES ES02737953T patent/ES2334016T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-15 SK SK1269-2003A patent/SK288326B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-04-15 CZ CZ20032820A patent/CZ20032820A3/cs unknown
- 2002-04-15 DK DK02737953.6T patent/DK1383899T3/da active
- 2002-04-15 JP JP2002583640A patent/JP4417628B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-15 WO PCT/EP2002/004143 patent/WO2002086126A2/de active Application Filing
- 2002-04-15 PT PT02737953T patent/PT1383899E/pt unknown
- 2002-04-15 EP EP02737953A patent/EP1383899B1/de not_active Revoked
- 2002-04-15 DE DE50213871T patent/DE50213871D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-06-19 US US11/820,418 patent/US8361765B2/en active Active
-
2009
- 2009-06-23 JP JP2009148703A patent/JP2009207499A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK288326B6 (sk) | 2016-01-07 |
| WO2002086126A3 (de) | 2003-11-06 |
| PL207271B1 (pl) | 2010-11-30 |
| US20090017510A1 (en) | 2009-01-15 |
| US20040265978A1 (en) | 2004-12-30 |
| WO2002086126A2 (de) | 2002-10-31 |
| JP2004527251A (ja) | 2004-09-09 |
| DE50213871D1 (de) | 2009-11-05 |
| PT1383899E (pt) | 2009-12-24 |
| ATE443770T1 (de) | 2009-10-15 |
| HU229667B1 (en) | 2014-04-28 |
| ES2334016T3 (es) | 2010-03-04 |
| EP1383899A2 (de) | 2004-01-28 |
| HUP0303803A3 (en) | 2011-05-30 |
| JP4417628B2 (ja) | 2010-02-17 |
| PL367043A1 (en) | 2005-02-21 |
| DK1383899T3 (da) | 2010-01-25 |
| HUP0303803A2 (hu) | 2004-03-01 |
| EP1383899B1 (de) | 2009-09-23 |
| DE10119274A1 (de) | 2002-10-31 |
| EP2123760A1 (de) | 2009-11-25 |
| US8361765B2 (en) | 2013-01-29 |
| CZ20032820A3 (cs) | 2004-02-18 |
| JP2009207499A (ja) | 2009-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK12692003A3 (sk) | Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín | |
| JP4845729B2 (ja) | ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素 | |
| AU2006274252B2 (en) | Oxidoreductases for the stereoselective reduction of keto compounds | |
| JP2007523617A6 (ja) | ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素 | |
| KR20070050461A (ko) | 신규 카르보닐 환원 효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법 | |
| TWI601825B (zh) | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 | |
| WO2010024445A1 (ja) | 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法 | |
| WO2010024444A1 (ja) | 光学活性なアミン誘導体の製造方法 | |
| EP1762625B1 (en) | Reductase gene and use thereof | |
| ES2358015T3 (es) | Oxidorreductasa. | |
| KR101780510B1 (ko) | 케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법 | |
| JP4688313B2 (ja) | 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法 | |
| US20080305534A1 (en) | Novel Glycerol Dehydrogenase, Gene Therefor, and Method of Utilizing the Same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20151110 |