SK288326B6 - Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín - Google Patents

Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín Download PDF

Info

Publication number
SK288326B6
SK288326B6 SK1269-2003A SK12692003A SK288326B6 SK 288326 B6 SK288326 B6 SK 288326B6 SK 12692003 A SK12692003 A SK 12692003A SK 288326 B6 SK288326 B6 SK 288326B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
process according
group
amount
alcohol dehydrogenase
carbon atoms
Prior art date
Application number
SK1269-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK12692003A3 (sk
Inventor
Antje Gupta
Klaus Breese
Gert Bange
Peter Neubauer
Original Assignee
Iep Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7682020&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK288326(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Iep Gmbh filed Critical Iep Gmbh
Publication of SK12692003A3 publication Critical patent/SK12692003A3/sk
Publication of SK288326B6 publication Critical patent/SK288326B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Vynález sa týka enzymatického spôsobu enantioselektívnej redukcie organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne hydroxyzlúčeniny. Ako enzým sa používa alkohol-dehydrogenáza.

Description

(54) Názov: Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín (57) Anotácia:
Vynález sa týka enzymatického spôsobu enantioselektívnej redukcie organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne hydroxyzlúčeniny. Ako enzým sa používa alkohol-dehydrogenáza.
Oblasť techniky
Vynález sa týka enzymatického spôsobu enantioselektívnej redukcie organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne hydroxyzlúčeniny.
Doterajší stav techniky
Opticky aktívne hydroxyzlúčeniny sú cennými syntéznymi produktmi na výrobu veľkého množstva farmakologicky dôležitých zlúčenín. Tieto zlúčeniny sú často ťažko vyrobiteľné klasickými chemickými spôsobmi a môžu len zriekla poskytnúť enantiomérnu čistotu požadovanú na farmakologické použitie. Preto sa na výrobu chirálnych zlúčenín spravidla používajú biotechnologické spôsoby, pričom stereoselektívna reakcia je uskutočnená buď celými mikroorganizmami, alebo použitím izolovaných enzýmov.
Pritom sa ukázalo ako výhodné použitie izolovaných enzýmov, pretože sa pri ich použití spravidla dosiahnu vyššie výťažky a vyššie enatiomérne čistoty.
Dehydrogenázy a najmä alkohol-dehydrogenázy sú cennými katalyzátormi na získanie chirálnych produktov stereoselektívnou redukciou organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne alkoholy. V podstate sú známe zodpovedajúce enzýmy z kvasníc, konských pečienok alebo z Thermoanaerobium brockii. Tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADH (nikotínadeníndinukleotid) alebo NADPH (nikotínadeníndinukleotidfosfát). Ďalšími známymi alkohol-dehydrogenázami je napríklad (S)-špecifická alkohol-dehydrogenáza z Rhodococcus erythropolis alebo (R)-špecifická alkohol- dehydrogenáza z rodu Lactobacillus. Oba tieto enzýmy majú široké substrátové spektrum na ketozlúčeniny a vykazujú vysokú enantioselektivitu. Alkoholdehydrogenázy z Lactobacillu kefir (DE 40 14 573) a Lactobacillu brevis (DE 196 10 984) sa hodia najmä na získanie chirálnych (R)-alkoholov.
Nevýhodou použitia alkohol-dehydrogenáz je však malá enzýmová stabilita a enzýmová účinnosť alkohol-dehydrogenáz v organických rozpúšťadlách a veľakrát len nepatrná rozpustnosť vo vode ketozlúčenín určených na redukciu. Okrem toho je ďalším limitujúcim faktorom použitia alkohol-dehydrogenáz v organických rozpúšťadlách nutnosť použitia NADP alebo NAD ako kofaktoru vzhľadom na to, že kofaktor (NADP, NAD) je vo vode rozpustný a ekonomickým spôsobom sa regeneruje.
Cieľom vynálezu je odstrániť uvedené nedostatky modifikácií procesných podmienok. Tento cieľ je podľa vynálezu dosiahnutý použitím dvojfázového systému, obsahujúceho anorganické rozpúšťadlo, alkoholdehydrogenázu, vodu, kofaktor a ketozlúčeninu.
Spôsob podľa vynálezu vykazuje vysokú životnosť enzýmu v dôsledku enzýmstabilizujúceho účinku rozpúšťadla, enantiomérnu čistotu vyššiu ako 99,9 % vyrobenej chirálnej hydroxyzlúčeniny a vysoký výťažok vztiahnutý na použitie množstva ketozlúčeniny.
Podstata vynálezu
Vynález sa týka spôsobu enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín všeobecného vzorca (I)
R'-C(O)-R2 (I), v ktorom
R1 a R2, ktoré sú nezávisle jeden od druhého rovnaké alebo odlišné a znamenajú 1. atóm vodíka,
2. alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkylová skupina je priama alebo rozvetvená,
3. alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkenylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri dvojité väzby,
4. alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkinylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri trojité väzby,
5. arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov,
6. alkylarylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 8 uhlíkových atómov a arylový zvyšok obsahuje 6 až 14 uhlíkových atómov alebo
7. R1 a R2 tvoria spoločne so zvyškom -C(O)- arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov alebo heterocyklickú skupinu obsahujúcu 5 až 14 uhlíkových atómov, pričom skupiny uvedené v odstavcoch 1. až 7. sú nesubstituované alebo nezávisle od seba raz až trikrát substituované
a) skupinou - OH,
b) atómom halogénu, akým je atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu,
c) skupinou -NO2,
d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov v priamom alebo rozvetvenom reťazci a je nesubstituovaný alebo raz až trikrát substituovaný atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, alebo
e) heterocyklickou skupinou obsahujúcou 5 až 14 uhlíkových atómov, ktorá je nesubstituovaná alebo raz až trikrát substituovaná atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, pričom
a) zlúčenina všeobecného vzorca (I) s podielom 10 až 25 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, alkohol-dehydrogenáza v úplne alebo čiastočne vyčistenej forme v množstve 20 000 až 200 000 na kilogram zlúčeniny všeobecného vzorca (I) určenej na konverziu, výhodne v množstve asi 100 000 U, voda, kofaktor NADPH alebo NADH a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP 0,5 až 4,0,
b) sa inkubujú v dvojfázovom systéme z vody, organického rozpúšťadla a zlúčeniny vzorca (I), pričom sa privádza izopropanol v množstve 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, výhodne v množstve 10 až 20 %, a najmä v množstve 10 %.
c) pričom sa alkohol-dehydrogenázou vytvorený oxidovaný kofaktor kontinuálne regeneruje tak, že sa izopropanol a oxidovaný kofaktor nechajú reagovať s alkoholdehydrogenázou na NADH alebo NADPH a acetón; a
d) izoluje sa chirálna hydroxyzlúčenina.
Podľa vynálezu sa použije zlúčenina všeobecného vzorca (I) zvolená z množiny zahrňujúcej etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej, acetofenón, metylester kyseliny acetooctovej, etyl-2-oxo-4-fenylbutyrát, 2,5-hexándión, pyrohroznan etylnatý alebo 2-oktanón a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,6 až 3,0 najmä rovnou 0,6 až 1,9, výhodne rovnou 0,63 až 1,75, ktorým je dietyléter, terc-butylmetyléter, diizopropyléter alebo etylester kyseliny octovej. Výhodne sa podľa vynálezu použije alkohol-dehydrogenáza z kvasiniek, z konských pečienok, z Termoanaerobium brocki, z Rhodococcus erythropolis, z Lactobacillus kefir, z Lactobacillus brevis, z Lactobacillus minor alebo alkohol-dehydrogenáza s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID NO: 4 a pridá sa pufer, ako je káliumfosforečnanový pufer, Tris/HCI-pufer alebo trietanolamínový pufer s hodnotou pH 5 až 10, výhodne s hodnotou pH 6 až 9. Ďalej sa podľa vynálezu k pufru pridajú horečnaté ióny ako MgCl2, v koncentrácii 0,2 až 10 mM, výhodne v koncentrácii 0,5 až 2 mM, a ako kofaktor sa pridá NADPH alebo NADH v množstve 0,05 až 0,25 mM, najmä v množstve 0,06 až 0,2 mM, vztiahnuté na vodnú fázu. Ako stabilizátor alkohol-dehydrogenázy sa podľa vynálezu pridá glycerín, sorbitol alebo dimetylsulfoxid v množstve 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, výhodne v množstve 10 až 20 % a najmä v množstve 20 %.
Arylovými skupinami obsahujúcimi 6 až 14 uhlíkových atómov sú napríklad fenylová skupina a naftylová skupina. Pod pojmom arylová skupina sa rozumejú aromatické uhľovodíkové skupiny obsahujúce 6 až 14 uhlíkových atómov v kruhu, napríklad 1-naftylová skupina, 2-naftylová skupina, bifenylylová skupina, napríklad 2-bifenylylová skupina a 4-bifenylylová skupina, antrylová skupina alebo fluorenylová skupina. Výhodnými arylovými skupinami sú bifenylylová skupina, naftylová skupina a najmä fenylová skupina.
Pod pojmom atóm halogénu sa rozumie atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu.
Pod pojmom alkylová skupina obsahujúca 1 až 20 uhlíkových atómov sa rozumie uhľovodíková skupina, ktorej uhlíkatý reťazec je priamy alebo rozvetvený a obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov.
Pod pojmom heterocyklická skupina obsahujúca 5 až 14 uhlíkových atómov sa rozumie monocyklický alebo bicyklický 5-členný až 14-členný heterocyklický kruh, ktorý je čiastočne nasýtený alebo celkom nasýtený. Príklady heteroatómov sú atóm dusíka, atóm kyslíka a atóm síry. Príklady heterocyklických skupín obsahujúcich 5 až 14 uhlíkových atómov sú skupiny, ktoré sú odvodené od pyrolu, furánu, tiofénu, imidazolu, pyrazolu, oxazolu, izoxazolu, tiazolu, izotiazolu, tetrazolu, l,2,3,5-oxatiadiazol-2-oxidu, triazolónu, oxadiazolónu, izoxazolónu, oxadiazolidíndiónu a triazolu, ktoré sú substituované atómom fluóru, skupinou -CN, skupinou -CF3 alebo -C(O)-O- skupinou obsahujúcou v alkylovom zvyšku 1 úhlíkový atóm až 4 uhlíkové atómy, 3-hydroxypyro-2,4-diónu, 5-oxo-l,2,4-tiadiazolu, pyridínu, pyrazínu, pyrimidínu, indolu, izoindolu, indazolu, ftalazínu, chinolínu, izochinolínu, chinoxalínu, chinazolínu, cinolínu, karbolínu a benzoanelovaných, cyklopenta-, cyklohexa- alebo cykloheptaanelovaných derivátov uvedených heterocyklov. Obzvlášť výhodné sú 2-pyrolylový zvyšok, 3-pyrolylový zvyšok, fenylpyrolylový zvyšok ako napríklad 4-fenyl-2-pyrolylový zvyšok alebo 5-fenyl-2-pyrolylový zvyšok, 2-furylový zvyšok, 2-tienylový zvyšok, 4-imidazolylový zvyšok, metylimidazolylový zvyšok, napríklad 1-metyl-2-imidazolylový zvyšok, l-metyl-4-imidazolylový zvyšok alebo l-metyl-5-imidazolylový zvyšok, l,3-tiazol-2-ylový zvyšok, 2-pyridylový zvyšok, 3-pyridylový zvyšok, 4-pyridylový zvyšok, 2-pyridyl-N-oxidový zvyšok, 3-pyridyl-N-oxidový zvyšok alebo 4-pyridyl-N-oxidový zvyšok, 2-pyrimidinylový zvyšok, 4-pyrimidinylový zvyšok alebo 5-pyrimidinylový zvyšok, 2-indolylový zvyšok, 3-indolylový zvyšok alebo 5-indolylový zvyšok, substituovaný indolylový zvyšok, napríklad 1-metyl-, 5-metyl-, 5-benzyloxy-, 5-chlór- alebo 4,5-dimetyl-2-indolylový zvyšok, l-benzyl-2-alebo 3-indolylový zvyšok, 4,5,6,7-tetrahydro-2-indolylový zvyšok, cyklohepta[b]-5-pyrolylový zvyšok, 2-chinolylový zvyšok, 3-chinolylový zvyšok, 4-chinolylový zvyšok, 1-izochinolylový zvyšok, 3-izochinolylový zvy šok, 4-izochinolylový zvyšok, 1-oxo- l,2-dihydro-3-izochinolylový zvyšok, 2-chinoxalinylový zvyšok, 2-benzofuranylový zvyšok, 2-benzotienylový zvyšok alebo benzotiazolylový zvyšok alebo dihydropyridinylový zvyšok, pyrolidinylový zvyšok, napríklad 2-(N- metylpyrolidinyl)ový zvyšok alebo 3-(N-metylpyrolidinyl)ový zvyšok, piperazinylový zvyšok, morfolinylový zvyšok, tiomorfolinylový zvyšok, tetrahydrotienylový zvyšok alebo benzodioxolanylový zvyšok.
Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca (I) sú etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej acetofenón, metylester kyseliny octovej, etyl-3-oxo-4-fenylbutyrát, 2,5-hexándión, pyrohroznan etylnatý alebo 2-oktanón, pričom obzvlášť výhodný je etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej.
Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa v rámci spôsobu podľa vynálezu použijú v množstve 10 % až 25 %, najmä v množstve 15 až 22 %, vzťahujúc na celkový objem.
Do vody sa výhodne pridá pufer, napríklad fosforečnan draselný, Tris/HCI-pufer alebo trietanolaminový pufer s hodnotou pH 5 až 10, výhodne s hodnotou pH 6 až 9. Koncentrácia pufra je 10 až 150 mM, výhodne 90 až 110 mM, najmä 100 mM. Dodatočne pufer obsahuje tiež horečnaté ióny, napríklad vo forme chloridu horečnatého, v koncentrácii 0,2 až 10 mM, výhodne v koncentrácii 0,5 až 2 mM, najmä v koncentrácii 1 mM.
Teplota sa napríklad pohybuje od asi 10 do 70 °C, výhodne od 30 do 60 °C.
Organické rozpúšťadlá použiteľné v rámci vynálezu majú výhodne logP 0,6 až 2,0, najmä 0,6 až 1,9, obzvlášť výhodne 0,63 až 1,75. Výhodnými organickými rozpúšťadlami sú napríklad dietyléter, tercbutylmetyléter, diizopropyléter, dibutyléter alebo etylester kyseliny octovej, pričom obzvlášť výhodným rozpúšťadlom je etylester kyseliny octovej. Etylester kyseliny octovej môže byť napríklad použitý v množstve 1 až 90 %, vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek, výhodne v množstve 15 až 60 %, vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek, najmä v množstve 20 až 50 %, vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek.
Pomer organického rozpúšťadla k vode je 9:1 až 1:9, výhodne 1:1 až 1:3.
Voda tvorí v dvojfázovom systéme podľa vynálezu jednu kvapalnú fázu a organické rozpúšťadlo tvorí druhú kvapalnú fázu. Tiež môže byť ešte prípadne prítomná pevná fáza alebo ďalšia kvapalná fáza, ktorá je napríklad tvorená nie celkom rozpustenou alkohol-dehydrogenázou alebo zlúčeninou všeobecného vzorca (I). Výhodné sú však obe kvapalné fázy bez pevnej fázy. Uvedené dve kvapalné fázy sa výhodne mechanicky premiešajú, takže sa dosiahne veľký povrch medzi oboma kvapalnými fázami.
Koncentrácia kofaktora NADPH alebo NADH, vzťahujúc na vodnú fázu je 0,05 až 0,25 mM, najmä 0,06 až 0,2 mM.
Výhodne sa pri spôsobe podľa vynálezu použije ešte ďalší stabilizátor alkohol-dehydrogenázy. Výhodnými stabilizátormi sú napríklad glycerín, sorbitol alebo dimetylsulfoxid (DMSO).
Množstvo glycerínu je 5 až 30 %, vzťahujúc na objem celkovej vsádzky. Výhodne množstvo glyrecínu je 10 až 20 %, najmä 20 %, vzťahujúc na objem celkovej vsádzky.
S cieľom regenerácie použitého NADH alebo NADPH môže byť v rámci vynálezu dodatočne pridaný izopropanol. Napríklad izopropanol a NADP zreaguje s alkohol-dehydrogenázou na NADPH a acetón. Použité množstvo izopropanolu je 5 až 30 %, vzťahujúc na objem celkovej vsádzky. Výhodné množstvo izopropanolu je 10 až 20 %, najmä 10 %.
Vhodné alkohol-dehydrogenázy pochádzajú napríklad z kvasníc, konských pečienok alebo z Rhodococcus erythropolis, pričom tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADH, alebo z Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefír alebo Lactobacillus brevis, pričom tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADPH.
Ak sa použije v rámci vynálezu napríklad alkohol-dehydrogenáza z kvasníc, konských pečienok, z Thermoanaerobium brockii alebo z Rhodococcus erythropolis, potom sa zo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) získa zodpovedajúca (S)-hydroxyzlúčenina. Ak sa použije v rámci vynálezu napríklad alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus kefír alebo Lactobacillus brevis, potom sa zo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) získa zodpovedajúca (R)-hydroxyzlúčenina.
Alkohol-dehydrogenáza môže byť v rámci vynálezu použitá buď celkom vyčistená alebo čiastočne vyčistená alebo môže byť v rámci tohto použitia obsiahnutá v bunkách. Použité bunky pritom môžu byť v natívnom stave, v permeabilizovanom alebo lýzovanom stave.
Objemová účinnosť použitej alkohol-dehydrogenázy je 100 jednotiek/ml (U/ml) až 2000 U/mk, výhodne asi 800 U/ml, pri obsahu proteínu asi 20 až 22 mg/ml. Výhodne má použitá alkohol-dehydrogenáza špecifickú aktivitu asi 35 až 40 U/mg proteínu. Na každý kilogram zreagovanej zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa použije asi 20 000 až 200 000 U alkoholdehydrogenázy, výhodne asi 100 000 U alkohol-dehydrogenázy. Enzýmová jednotka 1 U pritom zodpovedá množstvu enzýmu, ktoré je potrebné na to, aby každú minútu zreagoval 1 pmol zlúčeniny všeobecného vzorca (I).
Spôsob podľa vynálezu sa napríklad uskutočňuje v uzavretej reakčnej nádobe zo skla alebo z kovu. Na tento účel sa reakčné zložky jednotlivo zavedú do reakčnej nádoby, kde sa miešajú pod atmosférou napríklad dusíka alebo vzduchu. V závislosti od charakteru substrátu a použitej zlúčeniny všeobecného vzorca (I) je reakčná doba 1 deň až 14 dní, výhodne 4 dni až 7 dní.
Získaná reakčná zmes sa následne spracuje. Na tento účel sa oddelí vodná fáza a etylacetátová fáza sa sfiltruje. Vodná fáza môže byť prípadne ešte raz extrahovaná a ďalej spracovaná ako etylacetátová fáza. Potom sa sfiltrovaná fáza odparí za zníženého tlaku. Takto sa získa napríklad produkt tvorený etylesterom kyseliny 4-chlór-3-(S)-hydroxybutánovej, ktorý má enantiomérnu čistotu vyššiu ako 99,9 % a ktorý je v podstate zbavený produktu etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxo-butánovej. Celkový výťažok uvedeného spôsobu je po destilovaní produktu 82 až 88 %, vzťahujúc na použité množstvo eduktu.
S prekvapením bolo zistené, že organické rozpúšťadlá s hodnotou logP rovnou 0 až 4 majú stabilizačný účinok na alkohol-dehydrogenázu, zatiaľ čo v rámci doterajšieho stavu techniky sa od použitia dvojfázového systému s organickými rozpúšťadlami odstupuje (M.R.Kula, U. Kragel; kap.28, Dehydrogenases in Synthesis of Chiral Compounds; R. N. Patel, Stereoselective Biocatalyses, 2000; Peters J. 9. Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions, and Application, In: H.J.Rehm, G. Reed Biotechlogy, sv.3. Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993; J. Lynda a koľ, Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis, Biotechnol. Prog. 1991, 7, str. 116-124). Pri spôsobe podľa vynálezu sa ako organická fáza použije etylester kyseliny octovej (etylacetát), pričom táto organická fáza slúži ako zásobník pre zlúčeninu všeobecného vzorca (I), ale tiež súčasne extrahuje z vodnej fázy reakčný produkt, ktorým je chirálna hydroxyzlúčenina.
Na rozdiel od doterajšieho stavu techniky vedie použitie organického rozpúšťadla s hodnotou logP rovnou 0 až 3 v priebehu času k zvýšenej stabilizácii alkohol-dehydrogenázy. Podľa doterajšieho stavu techniky majú najmä organické rozpúšťadlá s hodnotou logP (logaritmus rozdeľovacieho koeficientu oktanol/voda) 0 až 2 výrazný destabilizujúci vplyv na enzýmy a prichádzajú takto ťažko do úvahy ako organická fáza v dvojfázových systémoch (K. Faber, Biotransformations in organic chemistry, 3.vyd. 1997, Springer Verlag, kap.3.Bis 3.17).
Vynález sa ďalej týka alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor s vysokým teplotným optimom. Alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor má DNA-sekvenciu podľa SEQ ID NO:3 a aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 4 v rámci priloženého sekvenčného protokolu. Táto alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor je R-špecifická, pričom napríklad zo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) môže byť získaná zodpovedajúca (R)-hydroxyzlúčenina. Enantioselektívny alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor môže byť prekvapivo superexprimovaná v Escherichia coli RB 791, zatiaľ čo z ostatných druhov rodu Lactobacillus sa alkohol-dehydrogenáza exprimuje podstatne obmedzenejšie. To je o to viac prekvapujúce, že sa alkohol-dehydrogenáza len veľmi málo exprimuje v divokom kmeni Lactobacillus minor, a takto je nedetekovateľná bežnými metódami screeningu (biotransformácia celých buniek, aktívny test). Bolo preto veľmi prekvapujúce, že došlo ku klonovaniu R-enantioselektívnej alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor a že táto alkohol-dehydrogenáza je tak výrazne silne superexprimovaná v Escherichia coli (50 % bunkového proteínu klonu, 20 000 U/g vlhkej hmotnosti).
Vyčistený enzým z Lactobacillus minor je stabilný v rozmedzí pH asi 5,5 až 8,5. Tento enzým je stabilný do teploty asi 40 °C a pH-optimum enzymatickej reakcie leží v rozmedzí od pH 7 do pH 7,5. Teplotné optimum tejto enzymatickej reakcie leží v blízkosti 55 °C a enzým vykazuje široké substrátevé spektrum.
Uvedený enzým môže byť pomocou hydrofóbnej interakčnej chromatografie vyčistený až na dosiahnutie špecifickej aktivity 35 až 40 U/mg proteínu.
Alkohol-dehydrogenáza je pripraviteľná z Lactobacillus minor. Na tento účel sa vo vhodnom prokaryotickom alebo eukaryotickom mikroorganizme exprimuje DNA, ktorá kóduje alkohol-dehydrogenázu z Lactobacillus minor. Výhodne sa alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor transformuje a exprimuje v kmeni Escherichia coli, výhodne v Escherichia coli RB 791.
Alkohol-dehydrogenázu je možné z Lactobacillus minor získať napríklad tak, že sa kultivujú rekombinantné bunky Escherichia coli, načo sa indukuje expresia alkohol-dehydrogenázy a po asi 10 až 18 hodinách (h) sa bunky otvoria pôsobením ultrazvuku alebo v lise French (Gaullin, Siemens). Získaný bunkový extrakt môže byť buď priamo použitý, alebo ešte ďalej čistený. Na tento účel sa bunkový extrakt napríklad odstredí a získaný supernatant sa podrobí hydrofóbnej interakčnej chromatografii. Táto chromatografia sa výhodne uskutočňuje pri hodnote pH 7,0 vo vodnom pufri, ktorý obsahuje tiež horečnaté ióny.
V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnení, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov a obsahom opisnej časti.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Skríning R-alkohol-dehydrogenázy v kmeňoch rodu Laktobacillus pomocou biotransformácie celých buniek
Na účel skríningu boli kultivované rôzne kmene Lactobacillus v nasledujúcich prostrediach (údaje sú vyjadrené vo všetkých prípadoch v g/1): glukóza (20), kvasnicový extrakt (5), mäsový extrakt (10), hydrogéncitran dvoj sodný (2), octan sodný (5), síran horečnatý (0,2), síran manganatý (0,05), hydrogénfosforečnan dvoj sodný (2).
Uvedené prostredie bolo sterilizované pri teplote 121 °C a kmene rodu Lactobacillus (ďalej skrátene len L.) boli na tomto prostredí kultivované bez ďalšej regulácie pH alebo prívodu kyslíka. Potom boli bunky odstredené a resuspendované na celobunkovú biotransformáciu, pričom vždy 4 g buniek boli suspendované v koncovom objeme 10 ml káliumfosforečnanového pufru (KPi-pufer) (50 mM, pH=7,0). Po pridaní 0,1 g glukózy boli bunky vystavené trepaniu po dobu 15 minút pri teplote 30 °C. K získanej bunkovej suspenzii bol pridaný etylester kyseliny 4-chlór-3-oxo-butánovej a po 10 minútach a 120 minútach bola uskutočnená analýza prostredia pomocou plynovej chromatografie. Potom boli bunky odstredené, supernatant bol sfiltrovaný a zriedený chloroformom až na dosiahnutie koncovej koncentrácie 10 až 15 pg/ml etylesteru kyseliny 4-chlór-3 -oxobutáno vej.
Ako substrát použitý etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej bol jednotlivými kmeňmi Lactobacillus prevedený na etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrát majúci nasledujúce enantiomérne čistoty.
Enantiomérny prebytok sa vypočíta nasledujúcim spôsobom:
ee(%)= ((R-alkohol-S-alkohol) / (R-alkohol + S-alkohol)) x 100.
Tabuľka 1
Kmeň Lactobacillus ee etylesteru kyseliny 4-chlór-3-(S)-hydroxybutánovej (%)
L. reuteri 34,6
L. kandleri 90,0
L. collinoides 71,3
L. bifermentans 53,6
L. oris 63,4
L. brevis 74,0
L. halotolerans 67,2
L. minor 18,6
L. parabuchneri 78,5
L. kefír 87,8
L. fructosus 28,9
Príklad 2
Získanie rekombinantnej R-špecifickej alkohol-dehydrogenázy
A) Príprava genómovej DNA z kmeňov rodu Lactobacillus
Bunková peleta z asi 2 ml kvapalnej kultúry rodu Lactobacillus sa resuspenduje v 300 μΐ TE-pufra (obsahujúceho 10 mM Tris/HCI, pH=8, 1 mM EDTA), načo sa k získanej suspenzii pridá 20 mg/ml lyzozýmu a zmes sa inkubuje po dobu 10 minút pri teplote 37 °C. Potom sa ku kultivačnej zmesi pridá 100 μΐ dodecylsulfátu sodného (SDS) (10 %), 100 μΐ chloristanu sodného a 500 μΐ zmesi chloroformu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1. Po intenzívnom premiešaní sa proteín odstredí a vodná fáza sa prevedie do novej Eppendorfovej nádobky. Potom sa pridá 800 μ etanolu (EtOH) (96 %). Eppendorfova nádoba sa niekoľkokrát obráti a vylúčená chromozomálna DNA sa prevedie do novej Eppendorfovej nádoby a premyje 200 μΐ EtOH. Získaná DNA sa opäť prevedie do novej Eppendorfovej nádoby, kde sa vysuší za zníženého tlaku a rozpustí v 100 μΐ TE-pufra.
B) Oligonukleotid ako 5'- a 3'-primér pre PCR (polymerázová reťazová reakcia)
Priméry použité pre PCR boli odvodené od známej N-terminálnej a C-terminálnej sekvencie alkoholdehydrogenázy z L. kefír. Pritom boli zohľadnené známe preferencie pre určité kodóny v laktobaciloch. Takto bol pred každý 5'-primér predradený kodón ATG (Met) ako štartovací kodón, ďalej bolo na 5'-priméru štartovaciemu miestu predradené miesto strihu pre reštrikčný enzým Bam Hl (GGATCC), aby bolo umožnené neskoršie klonovanie na expresný sektor. Za 3'-primér bol zaradený stop-kodón (TAG) a miesto strihu pre Hind III (AAGCTT). Primérové konŠtrukty sú uvedené ďalej.
N = A, T, C alebo G;
Y = T alebo C;
R = A alebo B
5'-primér
5'- GCGGATCCATGACNGAYCGNTTRAARGGNAARGTNGC3' (SEQ ID NO:1)
3'B-primér
5GGGAAGCTTCTAYTGNGCNGTRTANCCNCCRTCNAC3' (SEQ ID NO:2).
Priméry boli vyrobené známym spôsobom.
C) PCR (polymerázová reťazová reakcia) s génomovou DNA z kmeňov rodu Lactobacillus. PCR-vsádzka (100 μΐ)
Vsádzka na reakciu Koncentrácia
dNTP's 3 μΐ každý ΝΤΡ 2,5 nmol/μΐ
Oligos každý oligo 10 μΐ: 20 μΐ 2 pmol/μΐ
Chromozómová DNA 3 μΐ asi 1 pg/μΐ
10 x pufer (Promega) 10 μΐ
Taq-polymeráza 1 μΐ 2υ/μ1
H2O 58 μΐ
dNTP's sú zmesi dezoxynukleotidtrifosfátov ako dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Cyklus:
°C, 2 minúty, potom °C zdržanie horúci štart, potom °C, 30 sekúnd, potom °C, 1 min. 30 x potom vždy 30-krát 95 °C, 30 sekúnd a 40 °C, 1 min., potom 72 °C, 2,5 min. potom °C zdržanie.
Na účel analýzy bolo na 1 % agarózový gél nanesené 10 μΐ vsádzky a nanesená vsádzka bola pri konštantnej hodnote 100 V elektroforeticky rozdelená. PCG ukázala zreteľnú amplifikáciu kusu DNA s asi 750 bp.
D) Izolácia PCR-fragmentov z gélu
Na získanie PCR-fragmentov bola celá PCR-vsádzka nanesená na 1 % agarózový gél a rozdelená elektroforeticky pri konštantnej hodnote 100 V. Gél bol potom rozdelený do dvoch stôp, z ktorých jedna obsahovala kompletnú PCR-vsádzku a druhá obsahovala iba 5 μΐ vzoriek, takže na účel oddelenia PCR-fragmentov z gélu bola pre orientáciu vyfarbená etídiumbromidom iba stopa so vzorkou, aby sa vylúčilo poškodenie PCR-fragmentu, ktorý má byť izolovaný, etídiumbromidom.
Izolácia z gélu bola uskutočnená pomocou súpravy QIAquick Gel Extraction Kit, ktorá je komerčne dostupná u spoločnosti Qiagen z Hilden.
Stanovenie koncentrácie poskytlo celkovú koncentráciu 20 nG/μΙ DNA.
E) Ligácia
Na účel prípravy ligácie boli vyčistený PCR-fragment a použitý klonovací vektor pQE 70 (oba komerčne dostupné u firmy Quiagen) zrezané pomocou Bam Hl a Hind III (4 μΐ DNA= 200 ng DNA), 1 μΐ lOxpufer, 1 μΐ enzým, BSA a H2O (Biolab, New England).
Zrezaný plazmid bol potom znovu prečistený použitím súpravy QIAquick Gel Extraction Kit, vybratý vodou a defosforylovaný alkalickou fosfatázou (USB, Amershan Life Science).
Na čistenie boli zodpovedajúce reakčné vsádzky nanesené na 1 % agarónový gél a takto strávený amplifikát, ako i plazmid boli z gélu izolované spôsobom opísaným v odstavci D. Koncentrácia plazmidu a amplifikátu bola po čistení asi 20 ng/μΐ.
Na účel ligácie bola použitá vsádzka tvorená 3 μΐ pQE30 alebo pQE (60 ng), 2,5 μΐ amplifikátu (50 ng), 2 μΐ ligačného pufra (Boehringen, Manheim), 1,5 μΐ H2O a 1 μΐ T4-ligázy (Boehringer, Mannheim). Celá vsádzka bola inkubovaná cez noc pri teplote 16 °C.
Potom bolo 40 μΐ elektrokomponentných buniek Escherichia coli RB791 transformovaných elektroporáciou použitím 1,5 μΐ ligačnej vsádzky. Bunky boli zavedené do 500 μΐ SOC-prostredia, inkubované 45 minút pri teplote 37 °C, a potom boli nanesené v objemoch 250 μΐ na LBamp-ag árovej dosky. SOC- prostredie obsahuje v litri vody 20 g tryptónu, 5 g kvasnicového extraktu, 0,5 g chloridu sodného, 10 ml IM MgSO4 a 10 ml IM MgCl2. LBamp-agarovej dosky obsahujú na liter vody 10 g tryptónu, 5 g kvasnicového extraktu, 10 g NaCI, 20 g agaru a 50 mg ampicilínu pri pH 7,0.
Vzniknuté kolónie boli preočkované a kultivované v 4 ml kvapalného kultivačného prostredia (LBanip-prostredia) cez noc pri teplote 37 °C. Z tejto bunkovej suspenzie boli vždy použité 2 ml na prípravu plazmidu (podľa minipreparačného protokolu Quiagen (Quiagen, Hilden). Z plazmidového preparátu bola získaná reštrikčná zmes použitím Bam Hl a Hindlll. Kompletná reštrikčná zmes bola potom nanesená na 1 % agarózový gél, kde bola elektroforeticky rozdelená pri 100 V (identifikácia 750 kp insertu) a plazmidy boli potom prípadne použité na sekvencovanie.
F) Sekvencovanie plazmidov
Sekvencovanie bolo uskutočnené pomocou súpravy SequiThermEXCEL II Long-Read DNA Sequencing Kit (Biozym, Oldendorf) a sekvenčného zariadenia Li-Cor-Sequencer (MWG Biotec, Ebersberg) podľa inštrukcií výrobcu. Ako priméry boli použité štandardné sekvenčné priméry pre pQE-vektory.
G) Skríning klonu pokiaľ ide o expresiu v roztoku R-ADH
Klony s insertmi 750 kp boli skúmané s cieľom stanoviť ich enzymatickú aktivitu a stereoselektivitu. Na tento účel boli kolónie z agarových platní preočkované do 20 ml tekutého kultivačného prostredia (LBamp-prostredia), kde boli kultivované pri 25 °C. Pri bunkovej hustote (OD500) 0,5 nasledovala indukcia použitím 1 mM izopropyl-beta-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG). Po 18 hodinách boli bunky odstredené a vždy 40 mg buniek bolo vybratých 350 mikrolitrami Kpi-pufra (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCI2). Uvoľnenie enzýmu z buniek bolo dosiahnuté mokrým mletím pomocou sklenených perlí (0,5 g, 0,3 mm). Potom nasledovala 20 minútová dezintegrácia pomocou Retschovho mlyna pri teplote 4 °C.
V rámci enzýmového testu bolo použitých 870 mikrolitrov trietanolamínového pufru (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCI2), 100 mikrolitrov 100 mM roztoku etylesteru kyseliny 4-chlóracetooctovej, 10 mikrolitrov NAPDH (finálnej koncentrácie 0,19 mM) a 20 mikrolitrov roztoku enzýmu.
Definícia enzýmovej jednotky: 1U zodpovedá množstvu enzýmu, ktoré je potrebné na to, aby došlo ku konverzii 1 mikromólu substrátu (etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej) za 1 minútu.
Na účel stanovenia stereosektivity bolo inkubovaných 480 mikrolitrov trietanolamínového pufra (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCI2) s 1,0 mM etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej, 1,9 mM NADPH (vždy finálna koncentrácia) a 20 mikrolitrov roztoku enzýmu. Po 15 minútach inkubácie sa reakčná zmes sfiltruje a zriedi v pomere 1:10 chloroformom, načo sa vzorka zriedenej reakčnej zmesi analyzuje pomocou plynového chromatografu združeného s hmotovým spektrometrom.
Podmienky plynovej chromatografie:
chirálny stĺpec: Lipodex E, ID = 0,25 mm, I = 25 m (Macherey-Nagel),
1. 2 minúty pri 60 °C,
2. v priebehu 28 minút z 60 °C na 130 °C pri rýchlosti zvyšovania teploty 2,5 °C za minútu,
3. 15 minút pri 130 °C.
(R)-špecifická alkohol-dehydrogenáza môže byť klonovaná a aktívne superexprimovaná z kmeňov Lactobacillus uvedených v nasledujúcej tabuľke.
Kmeň Plazmid Číslo klonu aktivita U/g buniek* ee v %
L. parabuchneri pQE 30 12 450 >99,9
L. parabuchneri pQE 30 14 170 >99,9
L. kandleri pQE 30 11 280 >99,9
L. kandleri pQE 70 17 710 >99,9
L. minor pQE 30 2 2830 >99,9
L. minor pQE 70 3 680 >99,9
L. minor pQE 70 4 700 >99,9
*) Aktivita vypočítaná podľa G) (mokré mletie): aktivity po fermentácii a dezintegrácii použitím French-lisu sú výrazne vyššie.
H) Získanie enzýmu a čistenie enzýmu
Na účel získania enzýmu sa kmeň s najväčšou enzymatickou aktivitou kultivuje vo fermentore (vsádzka 10 I). K indukcii dochádza pri OD500 40 použitím 1 mM IPTG. Po 18 hodinách sa uskutoční zber buniek, pričom 300 g týchto buniek sa vyberie 3 litrami Kpi-pufra (50 mM, pH = 7,1 mM MgC2), načo sa uskutoční dezintegrácia buniek pomocou French-lisu (Gaullin, Siemens). Zvyšok získaný po odstredení bude ďalej uvádzaný ako surový extrakt a má objemovú aktivitu asi 2000 U/ml (20 000 U/g vlhkej hmoty).
Na charakteristiku enzýmu sa časť získaného enzýmu prečistí hydrofóbnou interakčnou chromatografiou na Q-Sepharóze ff (fast flow). Použitý stĺpec bol uvedený do rovnováhy s 50mM Kpi-pufrom, pH=7,0, ImM MgCI2. Po nanesení surového extraktu na stĺpec a krátkom prepláchnutí ekvilibračným pufrom sa enzým eluuje pri stúpajúcom lineárnom soľnom gradiente (0-1M NaCI, 1 ml/min.) pri koncentrácii soli asi 0,3 M NaCI. Po prečistení frakcií s obsahom enzýmu sa získa asi 25 ml vyčisteného enzýmu s objemovou aktivitou asi 800 U/ml a obsahom proteínu 20 až 22 mg/mol. Takto vyčistený enzým má teda špecifickú aktivitu asi 35 až 40 U/mg proteínu.
Všetky enzymatické aktivity boli stanovené pri teplote 25 °C. Enzymatická aktivita bola vypočítaná nasledujúcim spôsobom:
Výpočet: 1 jednotka = 1 mikromol vsádzky substrátu/min.,
Lambert-Beerschov zákon.
Úbytok NADPH bol sledovaný pri 340 nm (pozri enzymatická testová vsádzka) = ΔΕ/min,
N = zried’ovací faktor enzýmu,
V = objem enzýmu v ml (0,01),
Vkyveta = objem kyvety = 1 ml, d = hrúbka vsádzky v kyvete = 1 cm, eNADPH = extinkčný koeficient NADPH = 6,22 [mM ^cm1], aktivita = (AE/min*N*Vkyveta)/ (eNADPH*V*d).
Stanovenie proteínu bolo uskutočnené podľa Bradforda (Bio-Rad-Laboratoites GmbH, Protein Assay).
Príklad 3
Enzýmom katalyzovaná výroba etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrátu
A) V 5 litrovej mierke
Na enzýmom kalatyzovanú syntézu etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrátu z etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxo-butánovej sa použijú surový extrakt alkohol-dehydrogenázy získaný v príklade 2 a koenzým NADP. Oxidovaný koenzým je súčasnou prítomnosťou izopropanolu kontinuálne regenerovaný, takže reakcia potrebuje iba katalytické množstvo koenzýmu.
Vsádzka obsahuje:
litre trietanolamínového pufra 100 mM pH=7,0, ImM MgCI2, 10 % glycerín, 400 mg NADF, 600 ml izopropanolu,
800 ml etylesteru kyseliny octovej,
600 ml etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej a asi 100 000 jednotiek alkohol-dehydrogenázy.
Po 3 dňoch miešania pri teplote miestnosti bola plynovou chromatografiou preukázaná úplná konverzia etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej na etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrát s viac ako 99,9 % enantiomérnou čistotou.
Po oddelení vodnej fázy, odparení rozpúšťadla a prípadnej destilácii sa získa čistý etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrát s viac ako 99,9 % enantiomérnou čistotou.
B) V 50 litrovej mierke
Reakčná vsádzka pre konverziu 10 I etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej má nasledujúce zloženie: 18 litrov trietanolamínového pufru 100 mM pH=7,0, ImM MgCI2, 10 % glycerín, 4 g NADP, 10 litrov izopropanolu, 10 litrov etylesteru kyseliny octovej, 10 litrov etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej a asi 2 milióny jednotiek alkohol-dehydrogenázy (1,25 1 surového extraktu).
Po 7 dňoch miešania pri teplote miestnosti bola plynovou chromatografiou preukázaná úplná konverzia etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej na etyl-(S)-4-chlór-3-hydroxybutyrát s viac ako 99,9 % enantiomérnou čistotou.
Príklad 4
Biochemická charakteristika klonovanej alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor
A) pH-Stabitila
Závislosť aktivity enzýmu pri skladovaní v pufroch s rozdielnymi hodnotami pH bola skúmaná v rozmedzí pH 4 až 11. Na tento účel boli použité rôzne pufry (50 mM) v rozmedzí pH 4 až 11, pričom sa inkubuje po dobu 30 minút enzým vyčistený podľa príkladu 2 a zriedenie v pufri v pomere 1:100. Všetky použité pufry obsahovali 1 mM MgCI2. 10 mikrolitrov bolo potom použitých pri normálnom enzýmovom teste (trietanolamínový pufer 100 mM pH=7,0, 1 mM MgCI2, 10 mM etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej a 0,19 mM NADPH). Reakcia bola uskutočnená po dobu 1 minúty pri teplote 30 °C a 340 nm. Východisková hodnota je pritom nameraná hodnota, ktorá sa získa bezprostredne po zriedení enzýmu v trietanolovom pufri 50 mM pH=7,0. Táto hodnota zodpovedala za vopred daných podmienok zmene extinkcie 0,20 /min. a bola určená ako hodnota 100 %, pričom všetky následne získané namerané hodnoty boli k tejto hodnote vztiahnuté. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 2.
Tabuľka 2
Hodnota PH Pufrovací systém Aktivita v % (n=2) Pufrovací systém Aktivita % (n=2)
4 Na acetát/ kyselina octová 87,5+6,5
4,5 Na-acetát/ kyselina octová 94,5+3,0
5 Na-acetát/ kyselina octová 94,5+1,5 MES/NaOH 55+5
5,5 KH2PO4/K2PO4 93+3 MES/NaOH 77,1+2,1
6 KH2PO4/K2PO4 100+0 Trietanolamín/ NaOH 100+0
6,5 ΚΗ2Ρθ4/Κ2ΡΟ4 97,5+2,5 Trietanolamín/ NaOH 100+0
7 KH2PO4/K2PO4 100+0 Trietanolamín/ NaOH 97,9+2,1
7,5 ΚΗ2ΡΟ4/Κ2ΡΟ4 97,5+7,5 Tris/HCI 94,6+1,3
8 ΚΗ2ΡΟζι/Κ2ΡΟ4 93,0+3,0 Tris/HCI 89,2+0
8,5 ΚΗ2ΡΟ4/Κ2ΡΟ4 102,5+ 2,5 Tris/HCI 60+4,2
9 Glycín/NaOH 76,5+1,5 Tris/HCI 63,1+4,8
9,5 Glycín/NaOH 52,5+7,5
10 Glycín/NaOH 52,5+7,5
11 Glycín/NaOH 0,0+0
Tabuľka 2 ukazuje, že enzým má dobrú pH-stabilitu najmä v kyslej oblasti pH, pričom sa zdá, že táto stabilita je závislá nielen od hodnoty pH, ale tiež od použitého pufrovacieho systému. Tak napríklad pri použití TRIS- a MES-pufra pri rovnakej hodnote pH možno pozorovať silnú inaktiváciu enzýmu. Pri KPi-pufŕi nedochádza v rozmedzí pH 5,5 až 8,5 k žiadnej významnej inaktivácii.
B) Teplotná stabilita
Spôsobom, ktorý je analogický so spôsobom opísaným v odstavci A), sa stanoví teplotná stabilita v rozmedzí teplôt 25 až 50 °C. Na tento účel sa vždy zriedenie 1:100 vyčisteného enzýmu inkubuje pri udanej teplote počas 30 minút, načo sa uvedeným postupom zmeria pri 30 °C aktivita enzýmu. Tiež tu sa ako východisková hodnota použije hodnota, ktorá sa získa bezprostredne po zriedení enzýmu v trietanolamínovom pufri 50 nM pH=7,0. Táto hodnota sa tiež tu určí ako hodnota 100 %. Alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor sa stabilizuje až do teploty 40 °C. Potom jej aktivita rýchle klesá, čo je zrejmé z nasledujúcej tabuľky 3.
Tabuľka 3
Teplota Aktivita v % (n=4) Teplota Aktivita v % (n=4)
25 101+3,2 40 33,4+3,8
30 81,2+5,8 42 0+0
35 67,0+1,6 45 0+0
37 20,2+2,4 50 0+0
C) pH-Optimum
Na účel stanovenia uvedeného pH-optima bola sledovaná enzymatická reakcia v pufroch uvedených v tabuľke 3. Koncentrácia etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej bola ako pri štandardnom teste 10 mM, zatiaľ čo koncentrácia NADPH bola 0,19 mM. Reakcia bola uskutočnená pri teplote 30 °C. Pre enzým podľa vynálezu bolo takto nájdené pH-optimum medzi 7 a 7,5. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 4.
Tabuľka 4
Hodnota pH Pufrovací systém Aktivita v U/ml nezriedeného enzýmu
4 Na-acetát/ 85
kyselina octová
4,5 Na-acetát/ kyselina octová 132
5 MES/NaOH 218
5,5 MES/NaOH 240
6 Trietanolamín/ NaOH 381
6,5 Trietanolamín/ NaOH 349
7 Trietanolamín/ NaOH 510
7,5 Tris/HCI 707
8 Tris/HCI 585
8,5 Tris/HCI 486
9 Tris/HCI 488
10 Glycín/NaOH 131
11 Glycín/NaOH 0
D) Teplotné optimum
Na účel stanovenia optimálnej teploty účinnosti enzýmu bola aktivita enzýmu meraná pri teplotách od 25 do 60 °C. Vsádzka použitá pri tomto teste zodpovedala štandardnej koncentrácii etylesteru kyseliny 4-chlór3-oxobutánovej. Ako je to zrejmé z tabuľky 5 má enzým optimálnu teplotu pri teplote 55 °C, pričom potom aktivita enzýmu so zvyšujúcou sa teplotou rýchlo klesá.
Tabuľka 5
Teplota (°C) Účinnosť v U/ml nezriedeného enzýmu
25 540
30 1235
35 1968
40 1621
45 2469
50 2469
55 2855
60 0
E) Substrátové spektrum
Ďalej boli v testovaných vsádzkách namiesto etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej použité ešte ďalšie substráty. Na tento účel bola použitá nasledujúca testovacia vsádzka:
970 mikrolitrov trietanolamínového pufra (100 mM, pH=7,0, 1 mM MgCI2 s 10 mM ketónovej zlúčeniny), 10 mikrolitrov enzýmu (1:100).
Za týchto podmienok bola stanovená aktivita pre etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej považovaná za 100 % a stanovené aktivity enzýmu pri použití iných substrátov boli vztiahnuté k tejto 100 % hodnote. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 6.
Tabuľka 6
Substrát Aktivita v % (n=2)
Etylester kyseliny 4-chlór-3- -oxobutánovej 100
Pyrohroznan etylnatý 192,3+11,5
Substrát Aktivita v % (n=2)
2-Oktanón 90,8+1,2
Metylesteracetoacetát 120+7,7
Etylester kyseliny 2-oxo-4- -fenylbutánovej 62,7+4
F) Stabilita enzýmu v organických rozpúšťadlách
S cieľom štúdia stability enzýmu pri jeho styku s organickými rozpúšťadlami bola alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor zriedená v uvedených rozpúšťadlových zmesiach a inkubovaná pri teplote miestnosti (v rozpúšťadlách nemiešateľných s vodou sa zriedenie vzťahuje k vodnej fáze). Pri teste bolo zaistené stále premiešavame oboch fáz (trepačka, 200 otáčok za minútu). Následne bolo 10 mikrolitrov roztoku enzýmu použitých v štandardnej testovej vsádzke. Tiež tu bola východisková hodnota po zriedení v pufri (trietanolamínový pufer 100 mM, pH=7,0, 1 mM MgCI2) určená ako hodnota 100 % a všetky ďalej zistené hodnoty boli k tejto východiskovej hodnote vztiahnuté. Získané hodnoty sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách 7Aa7B.
Tabuľka 7A
S vodou miešateľné rozpúšťadlá
Rozpúšťadlo LogP t=2h t=8h t=24h t=48h
Pufer 86 70 3 0
10% izopropanolu 0,28 32 34 16 0
20% izopropanolu 0,28 16 17 7 0
10% DMSO -1,3 73 54 60 40
20 % DMSO -1,3 73 54 57 40
IM Sorbitol 93 74 60 6
10% Glycerínu -3,0 120 64 62 28
20% Glycerínu -3,0 120 100 100 104
Ako je zrejmé z tabuľky 7A, pôsobí glycerín, DMSO a sorbitol na použitú alkohol-dehydrogenázu aktivačne, poprípade stabilizačné. Pri teste použitý izopropanol naopak pôsobí deaktivačne.
Tabuľka 7B
Rozpúšťadlá nemiešateľné s vodou
Rozpúšťadlo LogP t=2h t=8h t=24h t=48h
Pufer 86 70 3 0
20 % Etylesteru kyseliny octovej 0,68 87 50 10 8
20 % Dietyléteru 0,85 53 42 37 23
20 % terc-Butylmetyléteru 1,21 67 51 38 24
20% Diizopropyléteru 1,55 100 57 41 29
20 % Pentánu 3,0 74 55 7 6
20 % Hexánu 3,5 80 39 2 5
20 % Heptánu 4 51 49 7 6
20 % Oktánu 4,5 87 47 2 1
Ako je zrejmé z tabuľky 7B, vykazuje skúmaná alkohol-dehydrogenáza vo veľkom počte organických rozpúšťadiel pozoruhodnú stabilitu. Nápadné je to, že rozpúšťadlá s hodnotami logP medzi 0 a 3 neinhibujú skúmanú alkohol-dehydrogenázu silnejšie ako rozpúšťadlá s hodnotami logP medzi 3 a 4,5, pričom pokiaľ ide o dlhšie inkubačné doby (24 g a 48 h), majú rozpúšťadlá s hodnotami logP medzi 0 a 3 na skúmanú alko hol-dehydrogenázu stabilizujúci účinok v porovnaní so zodpovedajúcimi hodnotami stanovenými pre pufer. Skúmané alifatické rozpúšťadlá pentán, hexán, heptán a oktán tento stabilizačný účinok pri dlhodobej inkubácii nevykazujú.
Hodnota logP zložky X je logaritmus rozdeľovacieho koeficientu zložky X v dvojfázovom systéme oktanol/voda v objemovom pomere 50:50. P = koncentrácia zložky X v oktanolovej fáze/koncentrácia zložky X vo vodnej fáze.
G) Stabilita enzýmu za procesných podmienok
Na účel skúmania stability enzýmu za procesných podmienok bola alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor zriedená v rozpúšťadlových zmesiach použitých v rámci dvojfázového systému v pomere 1:100 a inkubovaná pri teplote miestnosti. Následne bolo 10 mikrolitrov roztoku enzýmu použitých vo vsádzke štandardného aktivitného testu. V nasledujúcej tabuľke 8 sú aktivity enzýmu vyjadrené v percentických hodnotách vztiahnutých na východiskovú hodnotu.
Tabuľka 8
6h 20h 46h 60h 84h
Trietanolamínový pufer, 100 mM, ImM Mg2CI2 100 75 0 0 0
Zmes B 100 85 80 60 55
Zmes C 110 95 95 85 80
Zmes D 100 65 55 50 50
Zmes B: pufer, 10 % glycerín, 10 % izopropanol, zmes C: pufer, 20 % glycerín, 10 % izopropanol, zmes D: pufer, 10 % gycerín, 10 % izopropanol + 20 % etylester kyseliny octovej.
Bolo zistené, že rekombinantná alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor je stabilná a aktívna po dobu niekoľkých dní v kombinácii rozpúšťadiel použitých v uvedenom dvojfázovom systéme.
Sekvenčný protokol <210> 1 <211> 795 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: DNA primér <400 1 acgagaggat cgcatcacca tcaccazcac ggatccacga ccgaccggtt gaacgggaaa60 gtagcaattg taactgczgg tacctzggca attggcttgg caatcgctga taaczzíctt120' gaagaaggcg caaaggttgt tattaccggc cgtcacgctg atgtaggtga aaaagcčccc±8C agatcaatcg ccggcacaga cgttaíccgt tttgtccaac acgatgcttc tgaccaaacc240 ggctggacta agttgtttga tacgaczgaa gaagcacttg gcccagttac caccgztctc30C aacaatgccg caattgcggt cagcaagagt gttgaacata ccacaactga agaatccccc360 aagctgctct cagttaactt ggatcgtgtc ttcttčggta cčcgtcttgg aatccaacgt420 atgaagaata aaggactcgg agcatcaatc atcaatatgt catctatcga accttttczz480 ggtgatccag ctctgggzgc atacaaegct tcaaaaggtg ctgtcagaat tatctctaaa540 tcagctgcct tggattccgc tttgaagcac tacgatcttc gggttaacac tgttcazcca600 ggttatatca agacaccatt ggttcacgat cctgaagggg cagaagaaat gatczcacag660 cggaocaaga caccaazcgg tcatazcggt gaacctaacg atatcgcttc catczazczz720 tacctggcat ctgaccaatc taaazľigcc actggtgcag aattcgttgt cgacggacgg76C tacaccgccc aatag <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: sekvencia: DNA primér <400> 2 gcggatccat gacngaycgn ttraarggna argtngc 37 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: DNA primér <400> 3 gggaagcttc Laytgngcng trtanccncc rtcnac 36 <210> 4 <211> 264 <212> PRT <213> Lactobacillus sp.
<400> 4
Met Arg Gly Ser ris His His His nis His Gly Ser Met Thr Asp Arg
Lee Lys Gly Lys V=1 Ala íle Val Thr Gly Gly Thr Leu Gly íle Gly 20 2530
Leu Ala íle Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala Lys Val Val íle 33 414 5
Thr Gly Are His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala Arg Ser íle Gly 50 5560
Gly Thr Asp Val Ii.e Arg Phe Val Gin His Asp Ala Ser Asp Glu Thr 65 70 7580
Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala Phe Gly Pre Val 55 9095
Thr Thr Val Vál Asn Asn Alá Gly ľle Ala Val Ser Lys Ser Val Glu 100 105110
Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser Val Asn Leu Asp
115 12?125
Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly' íle Gin Arg Met uyp hsn Lys
130 135
Gly Leu Gly Ala Ser íle íle Asn 145 150
Gly Asp Pro Ala Leu Gly Ala Tyr 165 íle Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu 180
Val Arg Val Asn Thr Val His Pro 195200
Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu 210215
Pro Met Gly His íle Gly Glu Pro
225230
Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys
140
Met Ser Ser íle Glu Gly Glu Val
155160
Asn Ala Ser Lys Gly Ala Val Arg 170175
Asp Cys Ala Leu Lys Asp Tyr Asp 185190
Gly Tyr íle Lys Thr Pro Leu Val 205
Met Met Ser Gin Arg Thr Lys Thr 220
Asn Asp íle Ala Trp íle Cys val 235 240
Phe Ala Thr Gly Ala Glu Phe Val 25 C 255
Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Glr.
260

Claims (17)

1. Spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín všeobecného vzorca (I)
R'-C(O)-R2 (I), v ktorom
R1 a R2, ktoré sú nezávisle jeden od druhého rovnaké alebo odlišné a znamenajú
1. atóm vodíka,
2. alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkylová skupina je priama alebo rozvetvená,
3. alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkenylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu dvojitú väzbu, dve, tri alebo štyri dvojité väzby,
4. alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkinylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu trojitú väzbu, dve, tri alebo štyri trojité väzby,
5. arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov,
6. alkylarylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 uhlíkový atóm až 8 uhlíkových atómov a arylový zvyšok obsahuje 6 až 14 uhlíkových atómov alebo
7. R1 a R2 tvoria spoločne so zvyškom -C(O)- arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov alebo heterocyklickú skupinu obsahujúcu 5 až 14 uhlíkových atómov, pričom skupiny uvedené v odstavcoch 1. až 7. sú nesubstituované alebo nezávisle od seba raz až trikrát substituované
a) skupinou -OH,
b) atómom halogénu, akým je atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu,
c) skupinou -NO2,
d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 20 uhlíkových atómov v priamom alebo rozvetvenom reťazci a je nesubstituovaný alebo raz až trikrát substituovaný atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, alebo
e) heterocyklickou skupinou obsahujúcou 5 až 14 uhlíkových atómov, ktorá je nesubstituovaná alebo raz až trikrát substituovaná atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, vyznačujúci sa tým, že sa
a) zlúčenina všeobecného vzorca (I) s podielom 10 až 25 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, alkohol-dehydrogenáza v úplne alebo čiastočne vyčistenej forme, voda, kofaktor NADPH alebo NADH a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP 0,5 až 4,0,
b) inkubujú v dvojfázovom systéme z vody, organického rozpúšťadla a zlúčeniny vzorca (I), pričom sa privádza izopropanol,
c) pričom sa alkohol-dehydrogenázou vytvorený oxidovaný kofaktor kontinuálne regeneruje tak, že sa izopropanol a oxidovaný kofaktor nechajú reagovať s alkoholdehydrogenázou na NADH alebo NADPH a acetón; a
d) izoluje sa chirálna hydroxyzlúčenina.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije zlúčenina všeobecného vzorca (I) zvolená z množiny zahrňujúcej etylester kyseliny 4-chlór-oxobutánovej, acetofenón, metylester kyseliny acetooctovej, etyl-2-oxo-4-fenylbutyrát, 2,5-hexándión, pyrohroznan etylnatý alebo 2-oktanón.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa použije organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,6 až 3,0, najmä rovnou 0,6 až 1,9.
4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa použije organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,63 až 1,75.
5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa ako organické rozpúšťadlo použije dietyléter, terc-butylmetyléter, diizopropyléter alebo etylester kyseliny octovej.
6. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 5,vyznačujúci sa tým, že sa použije alkohol-dehydrogenáza z kvasiniek, z konských pečienok, z Termoanaerobium brocki, z Rhodococcus erythropolis, z Lactobacillus kefir, z Lactobacillus brevis, z Lactobacillus minor alebo alkoholdehydrogenáza s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID NO: 4.
7. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že sa pridá pufer, ako je káliumfosforečnanový pufer, Tris/HCl-pufer alebo trietanolamínový pufer s hodnotou pH 5 až 10, výhodne s hodnotou pH 6 až 9.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sa k pufru pridajú horečnaté ióny ako MgCl2, v koncentrácii 0,2 až 10 mM, výhodne v koncentrácii 0,5 až 2 mM.
9. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 8,vyznačujúci sa tým, že sa ako kofaktor pridá NADPH alebo NADH v množstve 0,05 až 0,25 mM, najmä v množstve 0,06 až 0,2 mM, vztiahnuté na vodnú fázu.
10. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že ako stabilizátor alkohol-dehydrogenázy sa pridá glycerín, sorbitol alebo dimetylsulfoxid.
11. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčeniny všeobecného vzorca (I) použijú v množstve 15 až 22 %, vztiahnuté na celkový objem.
12. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje pri teplote asi 10 až 70 °C, výhodne pri teplote 30 až 60 °C.
13. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že sa organické rozpúšťadlo použije v množstve 15 až 60 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, výhodne v množstve 20 až 50 %.
14. Spôsob podľa jedného nároku alebo niekoľkých z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že pomer organického rozpúšťadla k vode sa rovná 9:1 až 1:9, výhodne 1:1 až 1:3.
15. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa stabilizátor použije v množstve 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, výhodne v množstve 10 až 20 %, a najmä v množstve 20 %.
16. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa izopropanol použije v množstve 5 až 30 %, vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, výhodne v množstve 10 až 20 %, a najmä v množstve 10 %.
17. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa alkohol-dehydrogenáza použije v množstve 20 000 U až 200 000 U na kilogram zlúčeniny všeobecného vzorca (I) určenej na konverziu, výhodne v množstve asi 100 000 U.
SK1269-2003A 2001-04-20 2002-04-15 Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín SK288326B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10119274A DE10119274A1 (de) 2001-04-20 2001-04-20 Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen
PCT/EP2002/004143 WO2002086126A2 (de) 2001-04-20 2002-04-15 Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven reduktion von ketoverbindungen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK12692003A3 SK12692003A3 (sk) 2004-05-04
SK288326B6 true SK288326B6 (sk) 2016-01-07

Family

ID=7682020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1269-2003A SK288326B6 (sk) 2001-04-20 2002-04-15 Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20040265978A1 (sk)
EP (2) EP1383899B1 (sk)
JP (2) JP4417628B2 (sk)
AT (1) ATE443770T1 (sk)
CZ (1) CZ20032820A3 (sk)
DE (2) DE10119274A1 (sk)
DK (1) DK1383899T3 (sk)
ES (1) ES2334016T3 (sk)
HU (1) HU229667B1 (sk)
PL (1) PL207271B1 (sk)
PT (1) PT1383899E (sk)
SK (1) SK288326B6 (sk)
WO (1) WO2002086126A2 (sk)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10208007A1 (de) * 2002-02-26 2003-09-18 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur Herstellung von Alkoholen aus Substraten mittels Oxidoreduktasen, Zweiphasensystem umfassend eine wässrige Phase und eine organische Phase sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
KR20050026498A (ko) * 2002-07-20 2005-03-15 데구사 아게 알콜 탈수소효소를 기재로 하는 2상 복합 효소 반응 시스템
DE10300335B4 (de) * 2003-01-09 2008-06-26 Iep Gmbh Oxidoreduktase
DE10313972A1 (de) * 2003-03-27 2004-10-21 Degussa Ag Gekoppeltes cofaktorabhängiges enzymatisches Reaktionssystem
DE10327454A1 (de) * 2003-06-18 2005-01-20 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
DE102004007029A1 (de) * 2004-02-12 2005-09-08 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen durch Enzyme
AT501928B1 (de) * 2004-10-27 2010-09-15 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen
AT501496B1 (de) * 2005-02-21 2007-03-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen
AT502395B1 (de) * 2005-07-27 2007-03-15 Iep Gmbh Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen
AT502185B1 (de) * 2005-09-23 2007-02-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen
DE102006009744A1 (de) * 2006-03-02 2007-09-06 Wacker Chemie Ag Herstellung von (S)-2-Butanol durch oxidative Racematspaltung
AT503486B1 (de) * 2006-04-11 2008-05-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden
EP2066788B1 (en) 2006-10-02 2014-07-23 Codexis, Inc. Compositions and methods for producing stereoisomerically pure statins and synthetic intermediates therefor
AT504542B1 (de) 2006-12-07 2008-09-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von secodionderivaten
CN101627116B (zh) 2007-02-08 2013-07-10 科德克希思公司 酮还原酶及其用途
US7977078B2 (en) 2007-08-24 2011-07-12 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of (R)-3-hydroxythiolane
JP5973131B2 (ja) * 2007-09-13 2016-08-23 コデクシス， インコーポレイテッド アセトフェノンの還元のためのケトレダクターゼポリペプチド
TWI601825B (zh) 2007-09-27 2017-10-11 Ｉｅｐ有限公司 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法
WO2009042984A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and uses thereof
SI2205727T1 (sl) 2007-10-01 2015-09-30 Codexis, Inc. Polipeptidi ketoreduktaze za izdelavo azetidinona
CN102083996A (zh) 2008-04-30 2011-06-01 丹尼斯科公司 氧化方法
WO2010025287A2 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
US8426178B2 (en) * 2008-08-27 2013-04-23 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
WO2010025085A2 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (4s)-3[(5s)-5(4-fluorophenyl)-5-hydroxypentanoyl]-4-phenyl-1,3-oxazolidin-2-one
EP2226386A1 (de) 2009-03-05 2010-09-08 IEP GmbH Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen
RU2508290C2 (ru) * 2009-06-22 2014-02-27 ЭсКей БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ КО., ЛТД. Способ получения (r)-1-арил-2-тетразолилэтилового эфира карбаминовой кислоты
SG10201405022PA (en) 2009-08-19 2014-10-30 Codexis Inc Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine
US8404461B2 (en) 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
CA2784903A1 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Alcohol dehydrogenases (adh) useful for fermentive production of lower alkyl alcohols
US9040262B2 (en) 2010-05-04 2015-05-26 Codexis, Inc. Biocatalysts for ezetimibe synthesis
NZ603816A (en) 2010-05-27 2014-06-27 Pharmazell Gmbh Novel 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase knockout mutants and use thereof
CA2824858A1 (en) 2011-01-18 2012-07-26 General Atomics Hydrolase enzyme substrates and uses thereof
CN104471070B (zh) * 2012-05-17 2018-09-25 基因泰克公司 制备羟基化环戊并嘧啶化合物和其盐的方法
EP2861750B1 (en) 2012-06-18 2016-11-23 Laboratorio Chimico Internazionale S.p.A. Process for producing chiral 1-substituted 3-piperidinols employing oxidoreductases
DE102013104418B4 (de) 2013-04-30 2018-09-27 Cambrex Iep Gmbh Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol
KR20160097291A (ko) 2013-12-11 2016-08-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 키랄 2-아릴 모폴린의 제조 방법
CN106811491B (zh) * 2015-12-01 2022-07-19 焦作健康元生物制品有限公司 光学活性的β-羟基酯类化合物的制备方法及其中间体

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4014573C1 (sk) 1990-05-07 1991-10-10 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
US5385833A (en) * 1992-02-26 1995-01-31 The Scripps Research Institute Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase
US5225339A (en) * 1992-02-26 1993-07-06 The Scripps Research Institute Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase
US5719039A (en) * 1995-06-01 1998-02-17 University Of Iowa Research Foundation Enzyme-surfactant ion-pair complex catalyzed reactions in organic solvents
DE19610984A1 (de) * 1996-03-21 1997-09-25 Boehringer Mannheim Gmbh Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen

Also Published As

Publication number Publication date
PL367043A1 (en) 2005-02-21
US20040265978A1 (en) 2004-12-30
HU229667B1 (en) 2014-04-28
DK1383899T3 (da) 2010-01-25
HUP0303803A2 (hu) 2004-03-01
EP1383899A2 (de) 2004-01-28
WO2002086126A3 (de) 2003-11-06
JP4417628B2 (ja) 2010-02-17
CZ20032820A3 (cs) 2004-02-18
US8361765B2 (en) 2013-01-29
EP1383899B1 (de) 2009-09-23
HUP0303803A3 (en) 2011-05-30
ES2334016T3 (es) 2010-03-04
PL207271B1 (pl) 2010-11-30
SK12692003A3 (sk) 2004-05-04
US20090017510A1 (en) 2009-01-15
DE50213871D1 (de) 2009-11-05
ATE443770T1 (de) 2009-10-15
WO2002086126A2 (de) 2002-10-31
EP2123760A1 (de) 2009-11-25
JP2004527251A (ja) 2004-09-09
DE10119274A1 (de) 2002-10-31
JP2009207499A (ja) 2009-09-17
PT1383899E (pt) 2009-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK288326B6 (sk) Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín
JP4845729B2 (ja) ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素
JP2007523617A6 (ja) ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素
JP2009502148A (ja) ケト化合物の立体選択的還元に用いる酸化還元酵素
KR20070050461A (ko) 신규 카르보닐 환원 효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법
TWI601825B (zh) 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法
WO2010024445A1 (ja) 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法
WO2010024444A1 (ja) 光学活性なアミン誘導体の製造方法
ES2358015T3 (es) Oxidorreductasa.
KR101780510B1 (ko) 케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법
JP4688313B2 (ja) 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法
US20080305534A1 (en) Novel Glycerol Dehydrogenase, Gene Therefor, and Method of Utilizing the Same
AU2004272775B2 (en) An NADH dependent L-xylulose reductase
JP4270918B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードする遺伝子、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
CN113913403B (zh) 一种nadh激酶突变体、编码基因及其应用
CN115698310A (zh) 还原酶以及制备和使用还原酶的方法
CN114752572A (zh) 甲酸脱氢酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20151110