HU229667B1 - Enzymatic method for the enantioselective reduction of keto compounds - Google Patents
Enzymatic method for the enantioselective reduction of keto compounds Download PDFInfo
- Publication number
- HU229667B1 HU229667B1 HU0303803A HUP0303803A HU229667B1 HU 229667 B1 HU229667 B1 HU 229667B1 HU 0303803 A HU0303803 A HU 0303803A HU P0303803 A HUP0303803 A HU P0303803A HU 229667 B1 HU229667 B1 HU 229667B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- process according
- enzyme
- volume
- alcohol
- organic solvent
- Prior art date
Links
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title description 5
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 title description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 31
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 29
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 22
- -1 ketone compounds Chemical class 0.000 claims description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 18
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 8
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 8
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CCl OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 2,5-hexanedione Chemical compound CC(=O)CCC(C)=O OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 2-octanone Chemical compound CCCCCCC(C)=O ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N Ethyl pyruvate Chemical compound CCOC(=O)C(C)=O XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 claims description 2
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 claims description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229940117360 ethyl pyruvate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims 3
- KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N Acetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1 KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims 2
- 101100008046 Caenorhabditis elegans cut-2 gene Proteins 0.000 claims 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 claims 1
- 241000531897 Loma Species 0.000 claims 1
- WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N Methylacetoacetic acid Chemical compound COC(=O)CC(C)=O WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 claims 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims 1
- STPXIOGYOLJXMZ-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-oxo-4-phenylbutanoate Chemical compound CCOC(=O)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 STPXIOGYOLJXMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims 1
- NUMQCACRALPSHD-UHFFFAOYSA-N tert-butyl ethyl ether Chemical compound CCOC(C)(C)C NUMQCACRALPSHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 67
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 67
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 17
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 4
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 4
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- UCTNTYHJFWMUBD-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-3-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)CCl UCTNTYHJFWMUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001238 wet grinding Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- FUOSTELFLYZQCW-UHFFFAOYSA-N 1,2-oxazol-3-one Chemical compound OC=1C=CON=1 FUOSTELFLYZQCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000389 2-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- IGAVZWMNOPFOCW-UHFFFAOYSA-N 2h-1,2,4-thiadiazol-5-one Chemical class O=C1NC=NS1 IGAVZWMNOPFOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCEPFRNVLLBMLD-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypyrrole-2,4-dione Chemical class OC1C(=O)C=NC1=O MCEPFRNVLLBMLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001397 3-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- XTSWKOYSLJQXOI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-2-ethyl-3-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(C(O)=O)C(=O)CCl XTSWKOYSLJQXOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MAGOYBJJLVSJIC-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobutan-2-one Chemical compound CC(=O)CCCl MAGOYBJJLVSJIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- PQBHGSGQZSOLIR-RYUDHWBXSA-N Arg-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PQBHGSGQZSOLIR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N Asn-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 1
- SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 244000228088 Cola acuminata Species 0.000 description 1
- 235000010205 Cola acuminata Nutrition 0.000 description 1
- 235000015438 Cola nitida Nutrition 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N Glu-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N Gly-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- ZAVCJRJOQKIOJW-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZAVCJRJOQKIOJW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 241001435619 Lile Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BDFHWFUAQLIMJO-KXNHARMFSA-N Lys-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O BDFHWFUAQLIMJO-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N Phe-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000243142 Porifera Species 0.000 description 1
- QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N Pro-Gly-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical compound CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N Ser-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007918 Tacca chantrieri Species 0.000 description 1
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- JWQNAFHCXKVZKZ-UVOCVTCTSA-N Thr-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JWQNAFHCXKVZKZ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MVHHTXAUJCIOMZ-WDSOQIARSA-N Trp-Arg-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N MVHHTXAUJCIOMZ-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- DYIXEGROAOVQPK-VFAJRCTISA-N Trp-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O DYIXEGROAOVQPK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000186864 Weissella minor Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005428 anthryl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C3C(*)=C([H])C([H])=C([H])C3=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 125000006268 biphenyl-3-yl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 125000006003 dichloroethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 125000004655 dihydropyridinyl group Chemical group N1(CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 150000002168 ethanoic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000012851 eutrophication Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000003983 fluorenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)* 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- VDBNYAPERZTOOF-UHFFFAOYSA-N isoquinolin-1(2H)-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NC=CC2=C1 VDBNYAPERZTOOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N isothiazole Chemical compound C=1C=NSC=1 ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N isoxazole Chemical compound C=1C=NOC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 108010084525 phenylalanyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011916 stereoselective reduction Methods 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Optikailag aktív hidnoxi-vegyületek értékes kiindniáai anyagok számos fontos femrakológíni hatóanyag szintézisében. Ezek a vegyüietek klasszikus kémiai eljárásokkal csak nehezen állíthatók elő, és a farmakológia! felhasználás esetén követelt enantiorner-tisztaságot csak ritkán érik el, Emiatt kimiis vegyüietek előállítására általában biotechnológiai eljárásokat alkalmaznak, amelyek során a sztereoszelektiv lépést teljes mikroorganizmusokkal vagy izA'ílált enzimekkel oldják meg.
Az izolált enzimek alkalmazása gyakran előnyősnek bizonyult, mert izolált enzimekkel általában nagyobb hozam és nagyobb enantíomer-nsztaság érhető el
A dehidrogenázok, különösen az alkobol-dehidtogesáz enzimek értékes katalizátorok kiralis termékek előállításában; szerves ketovegyületeknek a megfelelő birális alkohollá történő sztereoszelektiv redukálását katalizálják. A megfelelő ismén enzimek élesztőből, iőmájből vagy Thermoanaeröhium broekii mikroorganizmusból nyerik. Ezek az enzimek csak akkor műkődnek, ha joenzlmként NADH íníkotin-adenia-dtnakleotíd) vagy NADFH (nikotia-adenln-diaukleotid-foszfátj van jelen. További ismert afkoboi-dehídrogenáz poklául az· (S)-fájlagos alkohol-dehidrogettáz Rhodococcas erythropolis vagy aa (R}-fejiagos atohol-dehidrogenáz a Laotobacilins nemzetségből. Mindkét enzimtipus sabsztrátumként ketovegyőletek széles spektrumát képes hasznosítani, emtíioszelektiviiásek nagy. A Lactóbacilins kefir-bői (DE 40 14 573) és Lactohaciilus brevis-hől (DE 19é 10 984} származó alkobol-dehidtogenázok löleg kitáíís (R>aikoholok kinyerésére alkalmazhatók.
Az atohol-defeídrogenázok alkahstazásásiak egyik hátránya, hogy az alkoboi-defeidrogenázoksak szerves oldószerekben csekély az enzimsiahíiítása és enzimaktivitása, a redukálni kívánt ketovegyőletek viszont vízben gyakran alig oldódnak. Az aikohol-dehidro-genázok szerves oldószerben történő alkalmazásának további hátránya, hogy ko-faktorként NADH-í vagy NADPH-t kell használni, mert ezek a kofaktorok vízben oldódnak és gazdaságos élj áfásokban regenerálják azokat.
A találmány célja, hogy az eljárási körülmények módosításával az említett hátrányokat csökkentse. Ezt a feladatok a találmány értelmében kétfázisú rendszer alkalmazásával oldjuk meg, amely szerves oldószert, alkohol-dehídrogenázi, vizet, kofaktort és ketovegyületet tartalmaz.
A találmány szerinti eljárásban az oldószer eazimstabsUzáló hatása miatt az enzim élettartama nagy, az eljárással előállítod kbális bidrosil-vegyáiet enantfomer--tisztasága meghaladja a 99,9 %-of, és a kiindulási ketovegyületre vonatkoztatva a hozam nagy.
A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képlető ketovegyőletek
Ri-C?(O>RÍ (í) enantioszelektsv redukálására, amelyek képletében
R* és R5Jelentése egymástól függetlenül
99483-I714F SVJG
1. hidrogénatom,
2. -(CrC:a?}-elkilc-soport, amely egyenes vagy elágazó szénláneú,
3. -(Cj-CjíU-aikentlesoport, amely egyenes vagy elágazó szénláneú, és adott esetben egy, kés, bárom vagy négy kettőskütést tartalmaz,
4. -(CyCj^alleisüíesopört, amely egyenes vagy elágazó szénláneú, és adott esetben egy, két, bárom vagy négy hármaskötést tartalmaz,
5. (C^-Ci.·<í~ari lesöpört,
6. -(Ci -£8>-aikiÍ-(C«-CM>arílcsöport, vagy
7. K.! és IV a -C(O) csoporttal együtt -fQ-CHj-arilgyÚrüt vagy (Cs-CHf-beterociklust alkot, és az 1.. ,7. pontok alatt említett csoportok szuhsziáaálatlaook vagy egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szuhsztituáltak egymástól függetlenül
a) -OH csoporttal, b} balogénatommal, így fluor-, kién·-, bróm- vagy jódatommal, c) -NO> csoporttal, d> ~€(O)-O-{CrC.SÍ>alkilc8öporttal, ahol az alklltész egyenes vagy elágazó szénláneú, szubsztltuálatlan vagy egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan balogénatommal, lúdroxtl-, arrnno- és/vagy nitrocsoporttal szubsztimálí, vagy
e) ••{Cj-C^.l-heterociklassal, amely sznbsztitoáiaiian vagy egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosa» halogénatommal, ksdroxd-, amino- és/vagy nitrocsoporttal szubsztituált, amelyre jellemző,, hogy
a) az (I) általános képleíü vegyüíet, aikohoi-dehídrogenáZj víz, kofaktor és 0,5--4,0 logP-értékkel rendelkező oldószer clegj-éí bl kétfázisú rendszerben inkubáljuk és
c) a keletkezett kírális hidroxivsgyületet elkülönítjük.
A C&-C),raritcsoport lehet például ienil- vagy aafiitcsoport. Az arilcsoport kifejezés itt ő-14 szénatomos aromás szénhidrogént jelöl, ilyen például az i-naftil-, 2-siahsk bifönílil-, például S-biRmsbi-, 3-biföniUl- és 4-bifemhi-esoport, az antril- vagy fiuorenil-csoport. Előnyös arilesoportok a bifeoU'ű- és naftilesoportok és különösen előnyős a fenilcsoport. A bslogénstom kifejezés irt fluor-, klór··, bróm- vagy jódatomot jelöl. Az C)-C'J9-aikiicsoport kifejezésen egyenes vagy elágazó szénláncú, 1-29 szénatomé» szénbidrogénesoportot értünk.
A. C<-Cwbeterociklus kifejezés mono- vagy biciklusos, 5-14-tagö, részben vagy teljesen telíted heterociklusos gyűrű; értünk, A heteroatomok lehetnek például N-, O- és S-atomok. A C>-€ ^heterociklusos csoport pékiául az alábbi vegyületekröl leszármaztatok csoport sebei; pirrol, furán, tiofén, imidazol, plrazoi, oxazoí, izoxazol, tfazol, izotiazoi, tetrazoi, .1,2,3,5-oxabadiazoÍ-2-oxidok, tnazokmok, oxadtazolottok, izoxszoionnk, oxaáiazoiidinonok, Öuorstommal, ciano-, trifluonnetil- vagy ---47(0)-0--((7:-C^j-alkii-csoportíal szuhsztstuáit triazolok, 3-htdroxi-pirro-2,4-djonok, 5-oxo-1,2,4-tiadiazolok, piridís, pirazm, pirimidin, indul, izoátdoi, okiazol, Ííálazin, kmolin, izokinolia, kínosaim, kiuazolin, enmolm, katboitn és a felsoroltak benz-anelláit, ciklopenta-, cikiokexa- vagy eiklohepta-aneíláit származékai. Különösen előnyösek az alábbi csoportok: 2- vagy 3-pirrolíl-, Rrssipirrolsl·, igy 4- vagy 5-fesii-pirmltl-·, 2-Imii.-, 2-tiesil-, 4-iandazoÍ.ií-, metii-múdazoíil-, például i-metü-2-, -4- vagy -5-hmsíazolii-, 1.3-siszol-2-ll--, 2-pirbbi-, 3-piridil-, 4-piridii-, 2-, 3- vagy 4-pirídíl-N-oxiá-,
2-ptrazinil-, 2·, 4- vagy S-pinmidmife, 2-,3-- vagy S-indol.il-, szubsztituált 2-mdolil-, például i-metii-, 5-mettl-, 5-metoxi-, S-benztloxi-, 5-klór- vsgy 4,5-di.m«tii-2-iodoit.l-, l-beoztl-2- vagy ~3~indeltl-, 4,5.6,?-tetrahidro-2iödeltl-·, otklohepta(bj-S-pirroiii’, 2-, 3- vagy 4-kií!<sid-, 1-, 3- vagy 4-izoktJSohi-, í-oxo-l,2-dthtdro-3izokiaeiii-, 2-kinoxaiinii-, 2-benzofo.moii··, 2-benzoíieail·, 2-benzoxazoiU-, vagy benzotiazolil- vagy dihidropiridinil-, pirroíldmil-, például 2- vagy 3<N-metil-pimoltdtmi)-,, ptperaxiaii-, s»or.folinál~, tiomodblinii-, setrabidfoiientj- vagy benzodioxolanil-csoport.
Előnyös (1) általános képletü vegyületek például 4-klör-3-exe-butánsav-eí0észter, aceiofonon, acetecetsav-metilészter, etil-2Oxo-4-ienil-butirát, 2,5-hexán-dion, etil-piruvát vagy 2-oktanon. különösen előnyős a 4-klőx-3-oxo-hutá».$av-etiÍészÍer. Az (1) általános képletö vegyületet a találmány szerinti eljátás sorát! 10-25 térfogat^», különösen előnyösen 15-22 térfogati» menuyiségben alkalmazzuk, a xendszer őssztérfogatára vonatkoztatva.
A vízhez előnyösen puffért adunk, például 5 és 10 közötti, előnyösen 6 és 9 közötti pH-jó kálxnmfoszfát-. trtsaZHCl- vagy tóetanolamin-pufiert. A puffer koncentrációja lő snM és 150 mM közötti, előnyösen 90 mM és 110 rnM közötti, különösen előnyösen 100 tnM, A puffer járulékosan magnézium-ionokat is tanaimáz, például magnézium-kloridot 0,2 mM és lő xnM közötti, előnyösen 0,5 és 2 isM, különösen előnyösen I mM koncentrációban.
A hőmérséklet például mintegy 10 C es 70 ®C közötti, előnyösen 30 °C és öő ®C közötti'.
A találmány szerint alkalmazható szerves oldószerek fogP-értéke Ö,ő - 2,0, előnyösen 0,6 - 1,8, különösen előnyösen 0,63-1,75. Előnyös szerves oldószerek például az alábbiak: dseíll-éter, terc-butil-nxetil-étex, dlizopropil-éter, dibuíil-éter vagy etil-aeetát. Az etil-acetát különösen előnyős. Az etil-aeetátot például 1-90 térfogati, előnyösen 15-60 térfogati, különösen előnyösen 20-50 térfogati mennyiségben alkalmazhatjuk, a rendszer Őssztérfogatára vonatkoztatva.
A viz és a szerves oldószer aránya 9:1 és 1:9 közönt, előnyösen 1:1 ás 1:3 közötti.
A találmány szerinti kétfázisú rendszerben a víz az egyik folyékony fázis és a szerves oldószer a másik folyékony fázis. Adott esetben őség szilárd fázis vagy további folyékony fázis lehet jelen, amely például a nem teljesen feloldódott aJkohol-dehidrogenáz vágy az (1) áltaiáoos képletü vegyüiet. Előnyősén azonban két folyékony tézis van jelen szilárd lazts nélkül. A két folyékony fázist előnyösen mechanikai módon keverjük, hogy a két fázis minél nagyobb határfelületen érintkezzék.
Az NADPH vagy NADH koxaktor koncentrációja a vizes fázisra vonatkoztatva 0,05 tnM és 0,25 mM közötti, különösen ö,öő mM és 0,2 taM közötti,
A találmány szerinti eljárásban előnyösen az alköhol-dehtdrogenáa egy további stahilizátorát is adagoljuk. Alkalmas stabdizáfor például glicerin, szerbitől vegy dimettl-szulfoxid (DMSO).
A glicerin mennyisége 5 térfogati, előnyösen 10-20 térfogati, különösen előnyösen 20 térfógat%, a rendszer őssztérfogatára vonatkoztatva.
Az elhasznált N'ADH vagy NADPH regenerálására a találmány szerinti eljárás során járulékosan izopropanolt is adagolhatunk. Az Izopropanol és N ADH &z alkohol-dehídrogenáz behatására NADPH-vá, 111. aeetonná alakul. Az izopropanolt 5-3Ő térfogattá, előnyösen 10-2(1 térfogattá, különösen előnyösen 10 térfogati» mennyiségben alkalmazzuk, a rendszer őssztérfogatára vonatkoztatva.
Alkalmas alkobol-dehtdtogenáz például élesztőből, iómájből vagy Rhőáoeoccas erytbropoiis-ból nyerhető, ezek az enzimek kefáktorként NADH-t igényelnek, .őrig a szintért alkalmas, de Thermoanaerobium .d ferockii, taclobacillns kefir vagy Lactobacllfus brevis mikroorganizmusból nyerhető alkohol-detadrogenáz enzimek kofiiktorkém N.aDPH-í igényeinek.
Ha a oláhsfony szerinti eljárás során például élesztőből, kartájból vagy Rfeodococcns erythropolis-hól származó alkohol·dehidrogenáz· alkalmazunk, az (1) általános képleté vegyöletböl a megfelelő (Sj-hidroxívegyületet nyerjük. Ha viszont Lacfobaciii.us kefir vagy Lactobacllfus brevís isikroorganrzmusböi származó alkohol-dehidrogenázt alkalmazunk, az (1) általános képlető vegyület megfelelő (R)-hidroxi-vegynlete keletkezik.
Az alkohol-dehidtogenázt a találmány szerinti eljárásban teljesen vagy részben tisztítóit formában vagy sejteklxtn alkalmazhatjuk. A sejtek lehetnek natív állapotban, permcnbilizáhak vagy lízáít&k.
Az alkalmazott afkolxd-dehídrogextáz térfogat-aktivitása 100-2000 egység/ml, előnyösen kb. 8ÖÖ egységónl, kb. 20-22 mg/ml protemtartalörn mellett. Az előnyösen alkalmazón alköhoi-dektdtogenúz fajlagos aktivitása kb. 35-40 egység/mg profom. Az átalakítani kívánt ÍS) általános képletü vegyület 1 kg-jára 20.000 200.000. előnyösen mintegy 100.000 egység tdkokol-dehidrogenázt számítunk. Az „egység az az enzimmennyiség, amely percenként I pútól (1) általános képfotfi vegyületet képes átalakítani.
A találmány szerinti eljárást például üvegből vagy lémből álló zárt edényben valósíthatjuk meg. A komponenseket adagoljuk a reakeiöedénybe, majd nitrogén- légkör vagy levegő alatt összekeverj ők. A szuhsztrátum és az alkalmazott (1) általános képletü vegyidet milyenségétől függően a reakcióidő I nap és 14 nap közötti, előnyösen 4-7 nap.
Utána a reakcíóelegyet feldolgozzak, A vizes fázist elválasztjuk és az etíf-acctátos fázist szűrjük. A vizes fázist adott esetben még egyszer etil-acetáttai extrahálhatjuk. A szűrt szerves fázist csökkentett nyomáson bepárofjuk. így például a 4~kióf-3(S)--hidmx.i-btf{áasav-eíilészte« > 99,9 % enantionter-tíszlasággal, lényegében a 4-kiér-3'CíS<>-butái5sav-ctilész;ier kiindulási anyagtól mentesen nyerhetjük ki. A termék desztilhllása után a hozam 82-88 %< a kiindulási anyagra vonatkoztatva.
Meglepő módon a 0 és 4 közötti logR-értékkei rendelkező szerves oldószerek stabilizáló hatást fejtenek ki az alkehöi-dehldrogenázm, ugyanakkor a technika állása, szerinti irodalomban a kétfázisú remiszer alkalmazását nem tanácsolják (M.R, Kóla, U. Krages, 28. fejezet, Dehydtogenases in Synthesis of Chiral Compotatds; R.N. Pitid, Stereoselectíve Biocatalyscs, 2000; Petem 1 9 Dehydrogenase-Chamcteristícs, Design of Reaeíion Conditions, and Application (a HJ.Rehm és G. Reed szerkesztette Bioteehnology c. könyvben, 3. kőt., Bioprocessing, VCH Weinheim 1903); .1, Lynda és mtsai, Solvent selection sirategies fór extraetive Biocataíysis, Biotechnok Prog. 1991, 7, 1 lő-124. old.). A találmány szerinti eljárásban szerves fázisként eíilacetátos alkalmazunk; a szerves fázis egyrészt az (1) általános képletü vegyület rezervoárja, másrészt a reakcióterméket, a királis hidrexivegyületet is extrahálja a vizes fázisból. A technika állásában talált véleményekkel ellentétben a 0-3 logiMrtékkei rendelkező szerves oldószerek járulékosan stabilizálják az alkoholdehiánögenáat. A technika állásit szerint éppen a 0-2 logP-értékkcí rendelkező szerves oldószerek (a logP az oktanol és viz kOzöits megoszlási tényező logaritmusa) különösen msiabslízáiíák. az. enzimeket és ezért kétfázisú rendszer szerves fázisaként alig jöhetnek számításba (K. Faher, Biotransformations in orgarne chemistry, 3. kiadás 190?, Springer Verlag, 3, fejezet - 3.17, pontjáig).
A találmány további tárgya Laetobacíflus minor ntííaoorganizreasból származó aikohol-dehidrogenáz, amelynek magas a hőmérséklet-optimuma. A taciohacilius minor miknxsrgamzmnsból származó alkoholdehidrogenáz DNS-szekvenciája a csatolt szekvencia-ptoiokollhan SEQ ID NO: 3, atninosav-szokvestclája S.EQ
.. 5 ID NO: 4 alatt megadott szekvenciának felel meg. A Lactobactllus mtaor-böl származó alkohol-dehidrogenáz R-fajlagos, azaz egy 0) általános képletü vegyidéiből a megfelelő (Rj-htdroxí-vegyüieí nyertseid. A Laetohaeiíius minor-hói származó enaotío-szelekiív alkohol-dehidrogenáz meglepő módon az Escheriehia coll RB 791 sejtben tülexprimálható, mig a Laetohaeiíius nemzetiség más fajtáiból származó alkohol· dehidrogenázok csak lényegesen kisebb mennyiségekben esprimáiódtak. Ez ázást meglepő, mert a LactobaciUua tumor mezei törzs az alkohoi-dehidrogenázt csak olyan csekély mértékben exprimálja, hogy szokásos módszerekkel (egész sejt hiotranszformáeiója» aklivisás-teszt) nem volt kimutatható. Ezért nagyon meglepő volt, hogy Lactobaciilus mínor-ból enantio-szeiektív alkohoi-dehidrogenázt lehetett klónozni, amely Escherichiu coli-ban rendkívüli módon tülexprímálödik (a klón sejtptoteinjének 50 %~s, 2ö,öö0 egység/g ncdvés anyagi.
A Lactobaciilus tulnot-ból nyert tisztított enzim kb. 5.5-3,5 ρΗ-tartományban stabil. Rőstnhüitása kb. 40 ''C-ig tetjed, az enzimes reakció pH-öptímuma pH 7 és pH 7,5 között van. Az enzimes reakció höoptímnma kb. 55 °C-on van. Áz enzim szuhsztrátum-spektruma széles,
Az enzim hidrofób interakciós kromatográfiás módszer segítségévei tisztítható 35-40 egységesig protein fajlagos akii vitásig.
A találmány további tárgya eljárás alkohol-dehidrogenáz kinyerésére Lactobaciilus mtaor-ból. Ennek során a Laetohaeiíius minor alkohol-dehidrogenáz enzimjét kódoló DNS-t alkalmas prokarióta vsgy eukariőta mikroorganizmusban exprtmáljuk. A LactobaciUns nsinor alkohol-dehidrogenáz enzimjét előnyösen Escheriehia coll törzsbe. különösen Escheriehia coli RB 791 törzsbe transzformáljak, majd ott exprtmáljuk.
A Lactobaciilus mín»r alkohol-dehidrogenáz enzimjét például úgy nyerhetjük, hogy a rekombináns E, coli sejteket tenyésztjük, az aikohoi-detódrogenáz expressziőját indukáljak, majd kb. 10-18 óra elteltével a sejteket ultrahangos kezeléssel vagy francia prés (öaullbs. Siemens) segítségével feltárjuk. A kapott sejtextraktumot közvetlenül felhasználhatjuk, vagy tovább tisztíthatjuk. Tisztítás céljából a sejtkivonatot például centrifugáljuk és a kapott felülüszöt hidrofób interakciós kromatográfiás tisztításnak vetjük alá. Ez a kromatográfiás eljárást előnyösen pH 7.ö mellett, magnézium-ionokat is tartalmazó vizes puffeihen valósítjuk, meg.
Az alkohoi-dehidrogenázt a találmány szerinti eljárásban teljesen vagy részben tisztított formában vagy sejtekben alkalmazhatjuk. A sejtek lehetnek natív állapotban, petmeahílízáltak vagy fixáltak.
A találmány további tárgya Escheriehia coli RB 791 rekombináns kiönja, amely a Lacíobaeillua minor alkohol-dehidrogenáz enzimjét exprtmálja és 2001. március 26-án a Budapesti Szerződés feltételei mellett a Mikroorganizmus és Sejfkultőrák Német Gyűjteményében (Deutsche Samminng lur Mikroorganismen und .Zelikulturen, Mascberoder Weg 1b, 58124 Braunsehwetgj DSM 14196 szám alatt került letétbe.
A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük.
1, példa
R-alkohol-dehidrogesázok egész sejtes biotíanszfomtálássai végzett keresése Lactobaciilus nemzetiség törzseiben
Különböző Laetohaeiíius törzseket az alábbi közegben tenyésztettük (a számadatok gd-t jelentenek): glükóz (20), élesztőkivooaí (5), háskivonat 0.0), dí-ammósium-hidtogén-cittát (2), náttium-acetát (5), magnézium-szulfát (0,2), mangán-szuliat (0,05), dikálhan-hídrogén-foszfát (2).
A közeget 121 !>C-on csíratnensestteixük, és a Lactobaciilus törzseket (az alábbiakban LA pHszabályozás és oxigénadagolás nélkül tenyésztettük. Utána a sejteket centrifugáltuk. Az egész sejtes
-6biottmiszfonnóláshoz 4-4 g sejtet 10 ml káliumfoszföt-puffétben ÍKEi-pufter, Sö tnM, pH “ ?»ö) szuszpendáltuuk. Mindegyik szuszpeítzióhoz 0,1 g glükózt adtunk és a szuszpenziöt 30 'T-ou 15 percen át rázattufc, A sz«s2penzióhoz 4-klór-3-oxo-b«tansav-etilésztert adtunk 40 tnM végsó koncentrációig, majd 10 pere és 120 perc elteltével elemeztük a közegei gázkromatográfiásán ágy, hogy a sejteket kiceotrifogáltuk, a lelillúszós szűrtök és kloroformmal 5 0-15 pg/ml. 4-klór-3-oso-butánsav-etiíészter végkoneentrációig hígítottak,
A szubsztrátumként alkalmazott 4-kiór-3-oxo-buíat^av-etilészíe« a különböző Lactobacilius törzsek az alábbi enamiooier-tisztasággai alakították, át etil-{SE4-klór-3-hldroxi.-butiráttá,
Az enaatiotner-felesleg az alábbiak szerint számítható:
<?e(%) ~ {(R-alkohol ·-· S-ttlkoltölplR-alkohol 4· S-aíkohoí}) x líXk
1. táblázat
| Lactobaeillus-tÖrzs | ee4-klór~3-ÍS)-hidroxi-butánsav-eiilészter (%) |
| L.reuteri | 34,6 |
| L, kandiért | 90,0 |
| L. collitsoides | 71.3 |
| L. bifenrtentans | 53,6 |
| 1... orí.s | 63.4 |
| L. brevis | 74.0 |
| U, balotelerans | 67,2 |
| L tninor | 16,6 |
| parabuchnerí | 73,5 |
| L, kvnr | 67,6 |
| t. iruciösus | 26,9 |
2, példa
Rekösibináns R-lajlagos aikobol-dehidrogenázok kinyerése
A) Laciobacíllus nemzetiségű törzsek genom-DN'S-ének kipreparálása
Lactobacilius mintegy 2 ml ieayfefoiyadékának sejtpeiletjét 300 pi TE-pnlTetben 11.0 tnM' trisz líCl, pH ·» 8, i mM EDTA) szuszpendáiutk, a szuszpenzióhoz 20 mg/mi üzoziraet adtunk és az eiegyet 37 “'C-oo 10 percen át inkubáituk. Ezt követően löö pl lö %-os ttátriutn-dödecil-szullStot (SOS), 100 pl nátrium-perklorátot (5 M) és SOÖ pl klomformözoamllalkohol eiegyet (24; 1} adagoltunk. Erélyes rázós titán a. proteint centrílagáitak és a vizes fázist új Eppeodorfedéttybe vittük út, Utána 800 pl 06 %-os etanolt adagoltunk» az Eppeadorfedéoyt többször Invertáltak, t; kicsapódott fcromoszómás DNS-t áj Eppendorf-edénybe vittük át és 200 pl etanolial mostuk. A DNS-t megint új Eppendorf-edénybe vittük át, csökkentett nyomáson szárítottuk, tnajtl 100 pl TEpuíletöen oldottuk.
B) Oligonakleotídek mint 5’- és 3’-primer a PC-reakcióban (Polyotemse chnin reactíon)
A PC-reakcióban alkalmazott printereket az L. kefír-böl származó nikohol-dehidrogenüz ismert Nlermíxtáiis és Ó-terminális szekvenciájából vezettük le. Ennek során figyelembe vettük, hogy a Lnctobaeülus bizonyos kódosokat preferál, így minden 5’-prímer elé az ATG (Mets ködöst helyeztük el starikodonként, továbbá az 5’-primeren a startkodon elé a Bánt Hl restrikciós enzim vágéheiyét. (GGATCC) alakítottuk ki, ezzel az expressziós szektorba később történő klónozást téve lehetővé. A 35-primer mögé a stop-kodont (TAG) és a
Hind ΙΊΪ enzim vágóhelyét {AÁGCTT) helyeztük el. A primerek szerkezetét az alábbiakban megadjuk;
N - A, T, C vagy G; Y T vagy C; R - A vagy 0 '-primer
5’GCGGATCCATGACNGAYCGNT f RAARGGNAARGTNGC3' (SEQ ID NO: 1)
Γ-primer:
5*GGGAAGCnCTAYTGNGCNG'rRTANCCNCCRTCNAC3’ (SEQ.IDNO:2)
A printereket ismert eljárásokkal állítottuk elő.
C) PC-reakció (Polvmerase chain reaction) Lactobacillus törzsekből származó genom-ONS-sel PCE elegy i 100 μί)
| Anyag | Mennyiség reakciónként | Koncentráció |
| dNTP-ok | 8 !.ti | mindegyik ΝΤΡ 2,5 nmól/μΙ |
| olígok | oligonként lö μί: 20 μί | 2 pmól/μΐ |
| kromoszómás DNS | 3 μί | kb. 1 μμ/μϊ |
| 10 x putTer (Promega) | 10 μί | |
| 'faq-polfrneráz (Promega) | Ιμΐ | 2 egység,;μ1 |
| HjO | 58 μί |
dNTP-ok: dezoxinukleodd-trifoszfetok ídÁTP, dGTP, dCTP, dTFP) elegye.
Ciklus) perc 95 °C-on, utána
SO ®C-ot tartant, forró start, utána másodperc 95 ’C-on, utána
I percen át 40 °C 30x utána 30x 95 ’C-on 30 mp és 40 öC-on I perc, ezt követően °C-oo 2,5 perc, utána °C-on 2,5 perc, utána °C-ot tartani.
Elemzés céljából az elegy 10 μΐ-jét i %-os agaróz-gébe vittük és 100 V állandó feszültség mellett elektroforetikusan szétválasztottuk. Mindegy 750 bp mérető DNS-darab amplifikáiása világosan látszott.
I)) A PCRfragtnensék izolálása a gélből
A PCR-fragmensek kinyerésére az egész PCR-elegyet 1 %-os agaróz gélre vittük és 100 V állandó feszültség mellett elektroforetikusan Összetevőire bontottuk. A gélt két sávra osztottuk, az egyik sávban az egész elegy volt, a másikban csak egy 5 μί-es minta; így a PCR-fragmens kivágásához elég volt orientációként a kis mintát etidiumbromiddal befestem, az izolálni kívánt PCR-fragmens eödmmbromidlól és UV-fénytől nem szenvedett károsodást.
A gélből a fragmenst a Qtagen eég (Hilden) QlAquick Gél Extraction Kit-évei izoláltuk. Meghatároztuk a koncentrációt: 20 ng/μί DNS.
E) I.igálás
- 8~
A. Iigáiás előkészítése során a tisztítod PCR-fragmeast és az alkalmazott klónozó vektort (pQE3ö vagy pQE 70, mind a kettő a Qulagen cégtől) Bam Hl és Hinti iii enzi«un«i vágtak (4 pl DNS -- 200 ng DNS, I pl iöxpirífer, 1 pl enzim, BSA és víz (Biolabs, New Englaná}),
A vágott plazmidot újból QIAquiek <iel Ex duciién Kit segítségével tisztítottuk, vízben tehettük és alkáiikus foszfatázzal defoszforileztük (USB, Antershaot Lile Science).
Tisztítás céljából az «legyeket külön-kniőtt éjből 1 %-os agatöz-géi vittük fel, majd az emésztett amplifskáiuntöt, valamint a plaztnidoí a C) alatt leírtak, szerint a gélből izoláltok. Tisztítás után a plazmid és az atxspltírkátutn konoexteációja mintegy 20 rtg/μΐ volt.
Llgátásfeoz 3 pl pQE30 vagy pQE70 (60 ng), 2,5 pl amplifikátum (50 ng), 2 pl ligáz-puffer (Bcehrmger, MannheimX 1,5 pl HjO és 1 pl T4-ligáz (Boehrntget, Mattakéin)} eiegyét egy éjszakát) át 1.6 ®Con hxkubáltuk.
Utána bachericbia coli R870I 40 pl elektrokotnpeíens sejtjeit 1,5 pl ligációs eieggyel elektroporalás tóján transzformáltuk, .A sejteket 500 pl SOC-közegbe adtuk. 37 *€-on 45 percen át inkubáltuk, majd 250-250 pi-es adagokban LB^-agártexnezeken széleszlettük. A $OC-közeg I I vízben az alábbiakat tartalmazza: 20 g triplon. 5 g élesztők!vonat, 0,5 g NsCi, lö ml 1M MsSCh-okiat és 10 ml 1M MgCh-oldat, Az agárlemezek I 1 vízben az alábbiakat tartalmazzák: 10 g triton, 5 g éíesztökivnnat, 10 g NaCI, 20 g agár, pH 7,0. és 50 mg aatptcüUn.
A kinőtt telepeket 4-4 mi. folyékony közegben íEBaw;,-közeg) egy éjszakán át 37 ’C-on tenyésztettük. Mindegyik szaszpextzxéból 2-2 ml-t felhasználtunk a plazmid-preparáíáshez (a Qulagexs mintprep Protokoll szerint (Qulagen, Holdén».
A plazmid-preparátunxot Bán) Hl és HútáHÍ restrikciós enzimmel emésztettük. Az egész emésztett elegyet. 1 %-os agaróz-gélre vittük tel és IOö V állandó feszültség mellett elekboforetikusast összetevőire bontottuk (a 750 kp inzert kimutatása) és a megfelelő piazmidokat szekvenáltuk. A 750 kp inzerttel rendelkező Időnokat LB^-lemezeken szélesztettük,
F) A plazmiáek szekvenálása
A szekvenálást a SetjttiTbetntEXCEL 11 I,ox)g-Read F>NA Seqnecing Kit {Bíozym, Oldendorf) segítségével Li-Cor-Sequenzer (MWG ötefech, Ebetsberg) készüléken a gyártó adatai szerint végeztük. Pxinxerként a pQE-vekterok szabvány szekvenálö printeréit alkalmaztuk.
G) Klánok vizsgálata, hogy exprintáinak-e oldható R-aikofeol-debídrogenázt
A 750 kp inzertet tartalmazó klőnnk enzim-aktivitását és sztereeszeiektívitását vizsgáltuk. E célból a telepeket levettük az E8w-agár-iemezekrői és 20-20 ml folyékony közegben {LB^-kezeg) 25 *C-»n. tenyésztőtök. Antikor a sejtsöröség (ÖDjoo) elérte a 0,5-ői, 1 mM !zopn>pil-j)-D-tíogalaktopiímtozidot (IPTG) adagoltunk. Tizennyolc óm elteltével a sejteket centrifugáltuk és mmdets telepből 40 mg sejteket 350 pl Kpi-puflbrben (50 mM, pH - 7, l ®M MgCL) szuszpendálhmk. Az enzimet a sejtekből üveggyöngyös (6,5 g, 0,3 mm) nedves őrléssel szabadítottuk lel, ezt követte egy 20 perces feltárás, Reísch-malom segítségévei 4 ^C-on.
Az enzimtesxt összetétele: 870 pl trietanolamin pullsr (100 mM.> pH :k 7,0, I mM MgCIj). 100 pl 100 mM 4-klőr-aceteeetsav-eülészter-oidat, 10 pl NADPH (vég-konceníráesó 0,19 mM) és 20 pl enzímoldat.
Az enzimegység definíciója: 1 egység az az enziimnsnayíség,. amely szükséges 1 pxnői szubsztrátum <4-Mór-3-oxo-hatátmv-etíiészter} 1 pere alatt történő átalakításához.
„ 9 A sztörecszeicktivitáB kimutatására 480 μΙ trietanilannn puífer (100 mM, pH 7,0, 1 ssM MgCL), Lö mM 4-klőr-3-oxo-bután»av-etilészter, 1,9 mM: NADPH (végkcncentráció) és 20 μί enzimokiat elegyét inkubáltuk. Tizenöt perc inkubáiás után a roakcióelegyet szűrőik és 1:10 arányban klörofemnnai hígítottuk. Egy mintát HC-MS-sel elemeztünk.
A gázkromatográfiás vizsgálat körülményei:
kíxálís oszlop: Lipod.es. E, ID :: 0,25 sron, 1 - 25m (Maclserey-Nagei)
1. 2 pem 60 °£
2. 24 perc alatt. 60 ”€ ···> 130 X (2,5 °C percenként)
3. 15 perc 130 °C,
Az alábbi Eactohaciilus törzsekből lehetett (R>lájlsgos alköhoi-defeidnogenázt klónozni és tőlexprímálni.
| Törzs | Eláznod | Klón sorszáma | Aktivitás egység/g sejt* | ee 1%) |
| 1... parabneimeri | pQE 30 | 12 | 450 | >90,0 |
| ±.^“^3.............. | pQE 30 | 14 | 170 | >09,9 |
| I,. kandién | PQ 30 | 11 | 200 | >99,9 |
| L minor | pQE 30 | 2 | 2.830 | >90,0 |
| L, minor | pQE 70 | 3 | 680 | >99,9 |
| t. minor | pQE 70 | 4 | 700 | >90,0 |
* az aktivitás a G) lépésben (nedves őrlés), Fermentálás és francia préssel végzett leltárás után az aktivitás lényegesen nagyobb.
1-1) Az enzim kinyerése és tisztítása
A legnagyobb enzimaktívitással rendelkező törzset az enzim kinyerése céljából 10 literes fernientorban tenyésztettük. Amikor a sejtsürüség (ΟΕΗχό elérte a 40-ei, az expránáiást I mM íPTG-veí indukáltuk. Tizennyolc óra «licitével a sejteket elkülönítettük, 300 g sejteket 3 Altér Rpí-ptrflfcrben {50 mM, pH -- 7, 1 mM MgCij) sznszpendáltnnk. A sejteket francia préssel (G&uíiin, Siemens) feltártuk. A eeatrifogálás után kapott felülüszé (az alábbiakban: nyers kivonat) térfogat-aktivitása kb. 2000 egység/ml (20 000 egység/g nedves anyag) volt.
Az enzim jellemzésére az enzim egy részét hidroföb interakciós ktomatográfiás eljárással Q-Sepharose ff (fost tlow) oszlopon tisztítottuk. Az oszlopot először 50 mM Kpi-paíTertel (pH -- 7,0, } mM MgCL) tóegyensólyc-ztíik. A nyers .kivonatos az oszlopra vittük, a fenti púderrel röviden öblítettünk, majd az enzimet lineárisan emelkedő só-gradienssel (ö ~s 1M NaCl, 1 mkperc) eiuálmk (kb. 0,3 M sókoncentrá-cióniil jön le). Az enzimtartahná frakciókat egyesítettük, így mintegy 25 ml tisztított enzimet kaptunk, amelynek térfogat-aktivitása kb. 400 egységf'mk protein-tartalma 20-22 mg/nti volt. Az így tisztított enzim fajlagos aktivitása tehát kb. 35-40 egységúng protein.
Az összes enzimaktivitást 25 e£-on határoztok meg. Az enzimaktívitást az alábbiak szerint számítottuk.
Számítás: 1 egység - 1 pmóí szubsztrátum-fogyás/pere
Lambert-Seer (éle törvény
A. N.A13PH fogyását 340 nm-en követtük (lásd enzimteszt összetétele) ™ AF/pete N -- az enzim húpíásl tényezője
- 10ν ·- az eíiziixí térfogata 1 ml-bea(ö,öi}
Vvi«as a küvettu térfogata ·-» 1 mi d ···’· a kőveku rétegvastagsága - 1 ot Snaoph NADPK extinkcióstényezője ~ ö,22 [«M'! · «Ί aktivitás » (ΛΕ/perc - N - - V - d)
A proteint öradford szerint határoztuk meg (Bio-Rad-Laheratories OrnbH, Protein Assey t
3, példa
EfíKS)-4-kiór-3-hidyoxi-btitiíás enzimmel katalizált UoáHstása
Aj 5-1 iteres térfogatban
Az etiliS}-4-khk-3'hi<lroxi-bsnir:P 4-klőr-3-«ao-butá«sav-ettlé»2terbói történő esöáttifására az aikohoídehidrogenáz 2, példa szerint kapott nyers kivonatát és a NAJ>P koíaktort alkalmaztuk. Az oxidált koiaktor izopropanol egyidejű jelenléte miatt folyamatosan regenerálódott, igy a .reakcióhoz csak katalitikus mennyiségű kofaktor szükséges.
A reaketéelegy összetétele:
1 trfetanolamin puffer 100 mM pH -· 7,0, f aM MgCIj, IÖ % glicerin,
400 mg NADP,
600 mi izopropanol,
S00 ml etii-acetát,
600 ml 4-klör-3-oxö~bu?áösav-eljlészler és kb. 100 000 egység aikohoí-dehidrogenáz,
A.z elegyet szobahőmérsékleten 3 napon keresztül kevertük. Utána gázkromatográfiás módszerrel ki lehetett mutatni, hogy az összes 4-klór-3-ox<:-butánsav-etilésxter átalakult ettl{S}-4-klór-3-hidn>xi-butiráná, amelynek enautiomer-tisztasága >99,9 % volt.
A vizes ilzis elválasztása, az oldószer elpárologlatása és adott esetben áesztiliálás mán kapjuk a tiszta ettllSM-klór-ö-iddroxi-buílrátot, amelynek enantlomer-sisztasága --99,9 %.
B) 50 literes térfogaiban
Tíz liter 4-k!ór’3-oxe~bmánsav-elilészier áiolakitásáía a reakeiöelegy összetétele az alábbi:
1 tríetanolamln pufiér 100 ;nM, pH -- 9.0,1 mg MgClj, 10 % gheerin, g NADP.
1 izopropanol,
1 etii-acetát,
14-kl6r-3-oxo-b«táBsav-etiíésxter és kb. 2 millió egység atkohot-siehklrogersáz (1,25 liter nyers kivonat).
Az elegyet szobahőmérsékleten ? napon keresztül kevertük. Utána gázkromatográfiás módszerrel ki lehetett mutatni, hogy az összes 4-klór-3-oxObutánsav~etilészter átalakult etil{S)-4-kiór-3’hidroxi-hutifátiá, amelynek enandomer-tisztasága >99,9 % volt.
4, példa
A Lactobaelllus minor-ból származó klónozott aikohoí-dehidrogenáz biokémiai jellemzéseA) pH-stabilitás ·· π Az tmzinistkíiviíásnak a pH-értéktől. való függőségéi pH 4 és pH 1I közötti tartományban vizsgáltuk ógy, hogy az enzimet különböző pH-jó pofferekben tároltuk. Különböző puftereket (50 mM) készítettünk pH 4 és pH 1 1 közötti tartományban, és a 2. példa szerint tisztított enzimet a púderekkel 1:100 arányban higtfotfuk, majd 30 percen át ínkubáltuk. Mindegyik puífer 1 mM magnézíum-kloridot tartalmazott. A hígított inkubált oldatból 10 μΙ-t a normális enzimtesztben alkalmaztunk (trietanolamin puífer 100 mM, pH ~ 7, 1 mM MgCi2, 10 mM 4-klór-3-oxo-butánsav-ettlészter és 0,19 mM NADPHí. A reakciót egy percen át 30 °C-<m 340 mn mellett követtük. A kiindulási érték itt az a mért érték, amely közvetlenül az enzim trietanolamin pufferrel (50 mM, pH ··'· 7,0) történő hígítása után mérhető. Az adott körülmények között ez az érték 0,20/perc extinkcióváltozásnak felelt meg; 100 %-értéknek tekintettük és a következő mért értekeket ehhez viszonyítottuk.
2, táblázat
| pH-érték | P uffer-rend szer | Aktivitás %-baa <tt 2} | Pufter-rendszer | Aktivitás %bán (n=2) |
| 4 | Na-acetát/ecetsav | 87,5 ± 6,5 | ||
| 4,5 | Na-acetáVecetsav | 94,5 * 3,0 | ||
| 5 | Na-acetát/ecetsav | 94,5 ± 1,5 | MES/NaOH | 55 ±5 |
| 5,5 | K.H2PO2K.jPO4 | 96 ± 3 | MES/NaOH | 77,1 ±2,1 |
| 6 | kh2po«/k2pg4 | 100 ±0 | trietanclamin/N'aÜH | 100 ± 0 |
| 6,5 | KH2PCVK2POa | 97,3 ± 2.5 | trietanoiamín/NaQH | í00±0 |
| 7 | KH2PÖ4/K2PO4 | 100 ± 0 | trietanolamin/NaöH | 97,9 ±2,1 |
| 7,5 | KH2PO.:/KjPO4 | 97,5 ± 7,5 | ttisz/HCl | 94,6 ± 1,3 |
| s | kh>poak;po4 | 93,0 £ -\0 | tósz/HCl | 89,2 ± 0 |
| 8,5 | KHdWKaPO,: | 102,5 ± 2,5 | ttiszZHCI | 60 ± 4,2 |
| n | glieín/NaöH | 76,5 ·± 1,5 | írisz·''MCI | 63,1 ±4,8 |
| 9.5 | glicin/NaOH | 52,5 ± 7,5 | ||
| 10 | glicisv'NaOH | 52,5 ± 7,5 | ||
| j 11 | gíicín/NaOH | 0,0 i 0 |
A 2. táblázat azt muta^a, hogy az enzimnek jó a pH-stabílítása, főleg a savas tartományban, ügy tűnik, hogy az enzim stabilitása nem csak a p.H-értéktői, hanem az alkalmazott pnfter-rendszertől is függ, Például trisz- és MES-puffer alkalmazása esetén azonos pH-érték melleit az enzim erősebben infektiválódík, mint KPtpnfterben, KPi-pufferben az. 3.5 és S,5 közötti pH-tartományban nem mutatkozik szignifikáns inaktiválás.
8) A hőmérséklettel szembeni stabilitás ,\z A) alatt leírtakra analóg módon határoztuk meg a 25 °C és 50 SC közötti tartományban. A tisztított enzim 1:100 arányban készített hígítását 30 percen át az adott hőmérsékleten inknbáltuk, majd az aktivitást 30 ’C-on a fenti enzirateszttel mértük, itt is a kiindulási érték az a mért érték volt, amely közvetlenül az enzim trietanolamin pufferrel 150 mM. pH ~ 7,0} történő hígítása után mérhető. Ezt az értéket itt is löö %-nak tekmtettiik. Az L. minor-ból származó alkohol-detódmgenáz 40 ftC hőmérsékletig stabil. E felett az. aktivitás rohamosan csökken.
- 122. táblásai
| Hőmérséklet | Aktivitás %-ban (n~4) | Hőmérséklet | Akti vitás %-bart (n-~4) |
| 25 | 101 i 3,2 | 40 | 33,4x3,8 |
| 30 | 81,2 i 5,8 | 42 | 0 ± 0 |
| 35 | 67,0 ± 1,6 | 45 | 0 ± 0 |
| 37 | 20,2 + 2,4 | 5Ö | 0 ± 0 |
C) pH-optimum
A pH-optitnum meghatározására a 3. táblázatban szereplő pufterekben határoztuk meg az enzimes reakciói. A szabvány tesztben a 4-kiór-3-oxo-btttánsav-etitészter koncentrációja 10 mM, az NADPH-é 0,19 atM volt. A mérést 30 ’-C-on végeztük. A. mérések szerint a találmány szerinti enzim pH-opttmuma 7 és 7,5 között van,
4. táblázat
| pH-érték | Puffer-fendszeí | aktivitás [egység/ml hígítás nélküli enzimben] |
| 4 | Na-acetát/ecetsav | SS |
| 4,5 | Na-acetát/ecetsav | 132 |
| 5 | MES/NaOH | 213 |
| 5,5 | MES/NaOH | 240 |
| 6 | trietanoiamin/NaGH | 381 |
| 6,5 | trieíanolamin/NaOH | 349 |
| 7 | trieíanolamin/NaOH | 5IÖ |
| 7,5 | trisz/HCI | 707 |
| 8,5 | írisz/HCl | 486 |
| 0 | trisz.·-HCI | 488 |
| I 10 | glscin/NaOH | 131 |
| 1 11 | glicín/NaOíí | 0 |
í>) Hőmérséklet-optimum
Az optimális teszt-hőmérséklet meghatározására a 25 ’C és 60 ’C közötti tartományban mértük az enzimaktivitást. A 4-klór-3-oxo-b«tánsav-etilészter és az NADPH koncentrációja a fenti szabvány tesztben megadott volt. Az S. táblázatból kivehető módon az enzim optimális teszt-hőmérséklete 55 CC, utána az aktivitás gyorsan csökken.
5. táblázat
| Hőmérséklet | Aktivitás [egység/mi bigitatlan enzim] | Hőmérséklet | Aktivitás [egység/ml higitatlan enzim] |
| 25 | 540 | 45 | 2469 |
| 30 | 1235 | 50 | 2469 |
| 35 | 1968 | 55 | 2855 |
| 40 | 1621 | 60 | 0 |
Ε) A hasznosítható szubsztrátumok spektruma
A 4-klór-3-oxo-buíáasav-etilészter helyett további szuhszsrátumokat vizsgáltunk az enzimes tesztben. Az alábbi összetételt alkalmaztuk:
970 μΙ tdetanolamín puffét· (100 mM, pH ~ 7,0, I mM MgCl:í és 10 mM. keiovegyület, μΐ NADPH (0,19 mM végkoncentráciö) lö ul enzim (!: 100)
A 4“klór“3-oxO“butánsav-etilészterrel meghatározott aktivitást 100 %-nak tekintettük és az egyéb szubsztrátu* mok esetén kapott aktivitásokat erre vonatkoztattttk.
6. táblázat
| Szübsztrátum | Aktivitás %-bau (n - 2) |
| 4-k!ór-3~oxo-butánsav-etiiészter | 100 |
| eiil-pimvát | 192,3 + 11,5 |
| 2-oktanon | 90,8 ± 1,2 |
| acetóacetátmetilészter | 120 ±7,7 |
| 2-oxö*4-feoil-butirát-etilészter | «2,7 + 4,8 |
1·'} Enzimstabüítás szerves oldószerekben
Annak vizsgálatára, hogyan változik az enzimsíabtiltás, ha az enzim szerves oldószerekkel érintkezik, az L. mtnor-ból származó alkohol-dehidrogenázt a megadott oldószerekkel El00 arányban hígítottuk és szobahőmérsékleten Inkubáituk (vízzel nem elegyedő oldószerek esetén a hígítást arány a vizes fázisra vonatkozik). A. két fázist állandóan összekevertük (200 íbtduiaVperc). Utána 10 ul enzimoldatot a szabvány tesztben vizsgáltuk. Itt is a pufterrei végzett hígítás (trieianolamin pnffer 100 mM, pH ?,ö, 1 mM MgCb) után mérhető értéket f 00 %-nak tekintettük, és a többi értéket ehhez viszonyítottuk.
7. táblázat
A ?A) táblázasbói kitűnik, hogy glicerin, .ÖMSÖ és szerbitől aktiváló, íll, stabilizáló itatási gyakorol az alkoholdehidregenázm. A lolyamathan alkalmazandó izopropanol viszont inaktiválóan hat.
B) Vízzel nem elegyedő oldószerek
| Oldószer | logP | í~'2óra | t~8 óra | 5-24 óra | i;:=4S óra |
| Puffét | 56 | 70 | 3 | 0 | |
| 20 % etil-acetát | 0,68 | 5? | 50 | 10 | 8 |
| 20 % dietil-észter | 0,85 | 53 | 42 | 37 | 23 |
| 20 % terc-butil-metilészíer | 1,21 | 6? | 51 | 38 | 24 |
| 20 % diizopropiiétet | 1,55 | 100 | 57 | 41. | 20 |
| 20 % dibot síéter | 2,9 | 92 | 71 | 23 | 6 |
| 20 % pentán | 3,0 | 74 | 55 | 7 | 6 |
| 20 % hexán | 3,5 | 80 | 30 | > d. | 5 |
| 20 % huptán | 4 | 51 | 49 | 7 | 6 |
| 20 % oldás | 4,5 | 87 | 47 | 2 | 1 |
A ?B) táblázat. azt mutatja, hogy a vizsgált alkohoi-dehidrogenáz számos oldószerben figyelemre méltó stabilitást mutat. Feltűnő, hogy a 0 és 3 közötti logP-értékekkel rendelkező oldószerek az alkohol-dehidrogenázt nem erősebben gátolják, mint a 3-4,5 logP-értékkel rendelkező oldószerek. Különösen a hosszabb inkubálási időre való tekintettel (24 és 48 óra) a Ö és 3 közötti logP-értékkel rendelkező oldószerek stabilizálják az alkoholdehidrogenázt, ba a sima puSérbeu mért értékekkel összehasonlítjuk. A vizsgáit alifás oldószerek - pentán, hexán, heptán és oktán - ezt a stabilizáló hatást hosszabb inkubálás esetén nem mutatják.
Egy X komponens logP-értéke X oktaool/viz kétfázisú rendszerben i 50/50) mérhető megoszlási tényezőjének. logaritmusa. F::: X koncentrációja az okianol-fázisb&tt/X koncentrációja a vizes fázisban.
G) Enzimstabilitás gyártási körülmények között
Az enzim gyártási körülmények közötti stabilitásának vizsgálata céljából az az t, mmor-ból származó alkohol-dehidrogenázt a kétfázisú rendszerben alkalmazni kívánt oldószerekkel 1:100 arányban hígítottuk és szobahőmérsékleten inkíibálmk. Az igy kapod enzimoldatbol 10 μΐ-t a szabvány tesztben alkalmaztunk. A 8. táblázat mutatja az enzimaktivitások a kiindulási érték százalékában.
3. táblázat
| 6 óra | 20 óra | 46 óra | 60 óra | 84 óra | |
| rtietanoiamin puffcr 100 t»M< 1 mg MgClj | 100 | 75 | 0 | 0 | 0 |
| 8-eiegy | löö | 85 | 80 | 60 | .55 |
| C-elegy | no | 95 ............. | 95 | 85 | 80 |
| D-elegy | W0 | 65 | 55 | 50 | 50 |
B-slegy: puffét, 10 % glicerin, 1 ö % izoptupanol
C-elegy: puffét, 20 % glicerin, 10 % izopropanol
D-elegy:puffer, 10 % glicerin, 10 % izopropanol + 20 % etii-aeetát
- 15MogáHspsíhsíó. hogy az L. mátor-bói származó rekombínáns &tkohol-dshidrogsnáz a kétfázisú rendszerben alkalmazott okiószer-kömbtnádiókbsn több napon át stabil és aktív.
S5EKVECIALXSTA <110> Onellcb Snzyme Products GmbH <12Ö> Enzimes eljárás ketovegydletek enanticszelektív redukálására <130> (Tk! Ouelicb Enzyme <140>
<141>
<160> 4 <170> Patentln Var. 2,1 <210 1 <211> 795 <210 003 <213> Kssterságess szekvencia <228>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: DKS primer <400 1
| atgagaggat | cgcatcacca | tcaecacac | ggafcccatga | ccgatcggtt | gaaggggaaa | ŐQ |
| gtagcaattg | taactggcgg | taccttggga | stggcttgg | caatcgctga | faagttfcgtt | 120 |
| gaagaaggcg | casaggttgt | tattaccggc | cgcacgctg | atgtaggtga | na a.-got geo | 180 |
| agatcaatcg | gcggcacaga | cgttatccgt | tfctgtcoaac | acgatgctte | tgatgaaacc | 240 |
| ggct: ggacta | agttgttfcga | tacgactgsa | gaagcatttg | g o '.· C::í g t se | cacggttgtc | 300 |
| aacaatgccg | gaattgcggt | eagca&gagt | gttgaagsts | ccacaacLga | agaatggege | 360 |
| aagetgctet | cagttaactt | ggatggtgtc | ttcttcggra | cccgtctfcgg | a»tccaacgt | 420 |
| atgaagaata | aaggactcgg | egcatcaatc | atcaatatgt | catctatcga | aggttttgtt | 480 |
| ggtgatccag | ctctgggtgc | 3 O CgCÍ | tcaaaaggtg | ctgtcagaat | tatgtcfcaaa | 54 0 |
| tcagctgcct | tggattgcgc | tttgaaggac | tacgatgttc | gggs:aacac | tgttcatcca | 600 |
| ggttatatca | agacaccatt | ggttgacgat | ctgaagggg | cagaagaaat | gatgtcacag | 660 |
| cggaeeaaga | cacc&a — q g g | teatatccgt | gaacctaacg | atatcgcttg | gatctgtgtt | 720 |
| tacctggcat | ctgacgaatc | taaatttgcc | actggtgcag | aattcgttgt | egaeggaggg | 78 0 |
| tscaccgccc | aatag | 795 |
<210.> 2 <211> 37 <212> OKS <213> Mesterséges szekvencia <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása: DHS primer <400> 2 gcggatccat gscngaycgn ttraarggna argtngc · 16<21·3> 3 <211> 36 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: DNS pxix&ex? <4 00> 3 gggaagette caytgngcng trtaxiccncc x'tcnao <210> 4 <2H> 264 <212> PRT <213> Lactöhaciiius sp.
<400> 4
| Met Arg 1 | Gly | Ser His 5 | Kis | Kis | His His Kis Gly Ser 10 | he 5 | Thr | Asp 15 | Arg | ||||||
| Le a | Lys | Gly | Lys | Val | .Ai.a | He | Val | Thr | Giy | Giy | Thr | Len | Giy | He | Giy |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Len | Ara | He | Αχ a | Asp | Lya | Phe | Vai | Gin | Gin. | Giy | Aia | Lys | Val | Vai | He |
| 35 | 4 0 | 45 | |||||||||||||
| Thr | Gly | Arg | Kis | Alá | Asp | Vai | Gly | Gin | Kys | Ai.a | Aia | Arg | Se?;' | He | Giy |
| Sö | 53 | 60 | |||||||||||||
| ο ry | Thr | Asp | Vai | He | Arg | Phe | Vai | Gin | B i s | Asp | Aia | Ser | Aap | Gin. | Thr |
| 65 | 70 | 75 | Sö | ||||||||||||
| hív | Trp | Thr | Lys | Leu | Phe | Asp | Thr | Thr | Gin | Giu | Aia | ?he | Gly | Pro | Val. |
| 85 | 00 | OS | |||||||||||||
| Thr | Thr | Val | Vai | .Asn | Asn | Alá | Giy | He | Alá | Val. | Ser | Lys | Ser | Val | Gin |
| 3.00 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Aep | Thr | Thr | Thr | Gi a | Gin | Trp | Arg | Lys | Lee | Len | Ser | Val | As n | Len | Aap |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Gly | Vai | Phe | Phe | Giy | Thr | Arg | Len | Giy | He | Gin | Arg | Mer | Lys | Asn | Lys |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gly | Let: | .e.1. y | Ara | Ser | 11© | n.s | Asn | Mer | Ser | Ser | He | Glu | Giy | Gin | Val |
| 14 5 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Asp | Pro | A.1 a | La a | G.l y | Aia | Tyr | Asn | Aia | Ser | Lys | Giy | Aia | Vei | Arg |
| US | no | 1V5 | |||||||||||||
| He | Mas | Ser | Lys | Aia | Alá | Lse.: | Asp | Cys | Alá | Len | Lys | Asn | Ty r | Asp | |
| ISO | 185 | 130 | |||||||||||||
| Val | Arg | Vai | Asn | Thr | Val. | Kis | Pro | Giy | Tyr | I la | Lys | Thr | Pro | Len | Vai. |
| 195 | 200 | 205 |
| Asp Asp Leu | Glu | Giy | Aia | Glu Glu Met Get 215 | Ser | Gin 220 | Ar® | Thr | Lys | Thr | |||||
| 21.0 | |||||||||||||||
| Pro | ?k;>: | Giy | kis | 11« | Gi y | Glu | Artí | Asn | Asp | II. e | Ars | Trp | lie | Cys | Vai |
| 725 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Tyr | Oü; | Alá | Ser | Asp | Glu | Ser | lys | Oh® | AJ. a | Th.r | Giy | AJ. a | Glu | Phe | Vai |
| 24 5 | 250 | 2 5 5 | |||||||||||||
| Vai | Asp | Giy | Giy | Tyr | Thr | Aia | Gin | ||||||||
| 260 |
Srabadaimi Igénypontok
Claims (16)
1, Eljárás (i) általános képletű ketovegyüfeíek
IC-C/Oj-R2 (!) eaantioszelektiv redukálására, amelyek képletében
R{ és Rs jelentése egymástól föggeilenöl
1. hidrogénatom,
2. -(Cs-CjoJ-alkilcsoport, amely egyenes vagy elágazó szénláncü,
3. -/CrCjoj-alkenilcsoport, amely egyenes vagy elágazó sténláneó, és adott esetben egy, két, három vagy négy kettöskölést tartalmaz,
4. -CCyCsoWkimtesoport, amely egyenes vagy elágazó szésláncsK és adott esetben egy, két, három vagy négy hármaskötést tartalmaz,
5. -CQ-Cul-snlesoport,
6. -<C rC0-alkrl-(Cö-Ci.í)-Í5í'ik'sop<srí, vagy
7. R’ és R'’ a -C(0) csoporttal együtt -(Cs-CsO-eriigyűrűt vagy {Cs-Cu>heterocik.lnsí alkot, és az 1,,.7, pontok,alatt említett csoportokszabsztlmábílanok vagy egyszeresen, kétszeresen vagy- háromszorosan szubsztttoálték. egymástól tUggefeül
a) ~0H csoporttal,
b) halogénatommal, igy ílttor-, klór-, bróm- vagy jódatommal,
c) --NO> csoporttal,
d) -tgOVO-CCrQíÍ.j-aikilcsoporttal, ahol az ttlkilrész egyenes vstgy elágazó széniáncá, szubszliPíálatlan vagy·· egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosait haiogénatommal, hidroxii-, amino- és/vagy nitrocsoporttai szuhszthnált, vagy
e) <Cs-CM)-heterocik!nssal, amely szubsztituálatlan vagy egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan halogénatommal, hidroxii-, amiso- és/vagy aiiröesopörtt&i szabszthuák, íteeö.y/ft'íoí.visr-e, hogy
a) a reaksiáelegy Sssztérfogaíára vonatkoztatva 10-25 % (Π általános képlett) vegyület, alkoholdehidrogenáz, víz, NADPH vagy NADH kofakíor és 0,5-4,0 legP-ériékke! rendelkező, szerves oldószer elegyét
-18b) vízből, szerves oldószerből és az (í) általános képletö vegyületböi álló kétfázisú rendszerben h'íktíbáfjuk,
e) sz alkohol-dehidrogenáz; hatására keletkező oxidált kofaktort folyamatosan regeneráljuk és d) a királis hidroxi-vegyületet izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (1) általános képletö vegyidéiként 4-kíór-.3oxo-buíánsav-eíil-észtert, acetofenont, aceteeetsav-meiilésztert, etil-2-oxo-4-feail-butírátot, 2,5-hexándtont, etilpiruvátot vagy 2-oktanoní alkalmazunk.
3. Az 1. vágj' 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,6-3, különösen 0,6-1,9 logPértékkel rendelkező szerves oldószert alkalmazunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,63-1,75 logP-értékkel rendelkező szerves oldószert alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy szerves oldószerként dietíl-étert, (terc-butii)Htetil-étert, düzopropii-étert vagy etii-acetátot alkalmazunk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőből, lómájból, Thermoanaerobiura brockií, Rhodoeoccus erythropolís, Lactobacillos kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rainor mikroorganizmusokból származó alkohol-debidrogenázt vagy SEQ ID NO:4 szekvenciájö alkoholdebidrogenázt alkalmazunk,
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5 és lö közötti, előnyösen 6 és 9 közötti p.H-jú puffért, így kálium-foszfát-, trisz/HCl- vagy trietanolamin-puffert adagolunk,
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pufferhez magnézium-ionokat, így magnézium-kiorídot adunk 0,2 m.M-iÖ mM, előnyösen 0,5 mM-2 mM koncentrációban.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kofefctorfcéat NADPH-r vagy NÁDH-t adagolunk, a vizes fázisra vonatkoztatva 0,05 mM - 0,25 mM, előnyösen t),Ö6 mM - (1,2 mM mennyiségben.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkohol-dehidrogenáz stabihzátoraként glicerint, szorbitoit vagy dímeiil-szulfoxídot alkalmazunk.
11. Az 1-10, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, aszal jellemezve, hogy izopropanolt adagolunk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (lj általános képletö vegyületet a reakeíóelegy össztérfogatára vonatkoztatva 15-22 térfogattá mennyiségben alkalmazzak.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáiíaíást kb. 10 °C és 70 °C közötti, előnyösen 30 °C és 60 SC közötti hőmérsékleten végezzük.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert a reakeíóelegy össztérfogatára vonatkoztatva 1-90 térfogat%, előnyösen 15-60 térfogatié, különösen előnyösen 20-50 térfogat% mennyiségben alkalmazzuk,
15. Az 1-1.4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószer és a viz aránya 9:1 és 1:9 közötti, előnyösen 1:1 ós 1:3 közötti.
16. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabílizátort a reakeíóelegy össztérfogatára vonatkoztatva 5-30 térfogat®/», előnyösen 10-20 térfogatié, különösen előnyösen 20 térfogatié mennyiségben alkalmazzuk.
-1917. A 1 1, igénypont szerinti eljárás. esai/«&«aw; hegy az tzopropanolt a teakcióelegy össztérfogal· ára vonatkoztatva 5-31) térfogati, előnyösen ÍÖ-21) térfogati, különösen előnyösen 10 térfi>gaí% mennyiségben alkalmazzuk.
IS, A 6, igénypont szerinti eljárás, ózza//'e/iewesve, hogy az aikohoi-őehklrogenázt 1 kg átalakítani kívánt 0} általános képletű vegyítette számítva 20.000 ~ 200.000 egység, előnyösen mintegy ÍÖ0.000 egység mennyiségben alkalmazzuk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10119274A DE10119274A1 (de) | 2001-04-20 | 2001-04-20 | Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen |
| PCT/EP2002/004143 WO2002086126A2 (de) | 2001-04-20 | 2002-04-15 | Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven reduktion von ketoverbindungen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0303803A2 HUP0303803A2 (hu) | 2004-03-01 |
| HUP0303803A3 HUP0303803A3 (en) | 2011-05-30 |
| HU229667B1 true HU229667B1 (en) | 2014-04-28 |
Family
ID=7682020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0303803A HU229667B1 (en) | 2001-04-20 | 2002-04-15 | Enzymatic method for the enantioselective reduction of keto compounds |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040265978A1 (hu) |
| EP (2) | EP2123760A1 (hu) |
| JP (2) | JP4417628B2 (hu) |
| AT (1) | ATE443770T1 (hu) |
| CZ (1) | CZ20032820A3 (hu) |
| DE (2) | DE10119274A1 (hu) |
| DK (1) | DK1383899T3 (hu) |
| ES (1) | ES2334016T3 (hu) |
| HU (1) | HU229667B1 (hu) |
| PL (1) | PL207271B1 (hu) |
| PT (1) | PT1383899E (hu) |
| SK (1) | SK288326B6 (hu) |
| WO (1) | WO2002086126A2 (hu) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10208007A1 (de) * | 2002-02-26 | 2003-09-18 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Alkoholen aus Substraten mittels Oxidoreduktasen, Zweiphasensystem umfassend eine wässrige Phase und eine organische Phase sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| KR20050026498A (ko) * | 2002-07-20 | 2005-03-15 | 데구사 아게 | 알콜 탈수소효소를 기재로 하는 2상 복합 효소 반응 시스템 |
| DE10300335B4 (de) * | 2003-01-09 | 2008-06-26 | Iep Gmbh | Oxidoreduktase |
| DE10313972A1 (de) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Degussa Ag | Gekoppeltes cofaktorabhängiges enzymatisches Reaktionssystem |
| DE10327454A1 (de) * | 2003-06-18 | 2005-01-20 | Juelich Enzyme Products Gmbh | Oxidoreduktase aus Pichia capsulata |
| DE102004007029A1 (de) * | 2004-02-12 | 2005-09-08 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen durch Enzyme |
| AT501928B1 (de) * | 2004-10-27 | 2010-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen |
| AT501496B1 (de) * | 2005-02-21 | 2007-03-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen |
| AT502395B1 (de) | 2005-07-27 | 2007-03-15 | Iep Gmbh | Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen |
| AT502185B1 (de) * | 2005-09-23 | 2007-02-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen |
| DE102006009744A1 (de) * | 2006-03-02 | 2007-09-06 | Wacker Chemie Ag | Herstellung von (S)-2-Butanol durch oxidative Racematspaltung |
| AT503486B1 (de) * | 2006-04-11 | 2008-05-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden |
| CN101528917B (zh) | 2006-10-02 | 2015-07-29 | 科德克希思公司 | 用于制备立体异构纯的他汀类及其合成中间体的组合物和方法 |
| AT504542B1 (de) | 2006-12-07 | 2008-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von secodionderivaten |
| JP2010517574A (ja) * | 2007-02-08 | 2010-05-27 | コデクシス， インコーポレイテッド | ケトレダクターゼおよびその使用 |
| US7977078B2 (en) * | 2007-08-24 | 2011-07-12 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of (R)-3-hydroxythiolane |
| US8748143B2 (en) | 2007-09-13 | 2014-06-10 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the reduction of acetophenones |
| TWI601825B (zh) | 2007-09-27 | 2017-10-11 | Ｉｅｐ有限公司 | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 |
| CN101889081B (zh) * | 2007-09-28 | 2014-06-18 | 科德克希思公司 | 酮还原酶多肽及其用途 |
| JP5646328B2 (ja) | 2007-10-01 | 2014-12-24 | コデクシス， インコーポレイテッド | アゼチジノンの生産のためのケトレダクターゼポリペプチド |
| EP2281034B1 (en) | 2008-04-30 | 2015-10-21 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Process using Pseudoglucanobacter saccharoketogenes alcohol dehydrogenase |
| US8288141B2 (en) * | 2008-08-27 | 2012-10-16 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| WO2010025238A2 (en) | 2008-08-27 | 2010-03-04 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| CN102186972B (zh) | 2008-08-29 | 2014-08-20 | 科德克希思公司 | 用于立体选择性生产(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的酮还原酶多肽 |
| EP2226386A1 (de) | 2009-03-05 | 2010-09-08 | IEP GmbH | Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen |
| AU2009348523B2 (en) * | 2009-06-22 | 2015-02-26 | Sk Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| ES2575560T3 (es) | 2009-08-19 | 2016-06-29 | Codexis, Inc. | Polipéptidos cetorreductasa para preparar fenilefrina |
| US8404461B2 (en) * | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| KR20120115349A (ko) | 2009-12-29 | 2012-10-17 | 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 | 저급 알킬 알코올의 발효 생성에 유용한 알코올 탈수소효소(ａｄｈ) |
| US9040262B2 (en) | 2010-05-04 | 2015-05-26 | Codexis, Inc. | Biocatalysts for ezetimibe synthesis |
| US9096825B2 (en) | 2010-05-27 | 2015-08-04 | Pharmazell Gmbh | 7 α-hydroxysteroid dehydrogenase knockout mutants and use therefor |
| CN103889997B (zh) | 2011-01-18 | 2017-08-25 | 通用原子公司 | 水解酶酶底物及其应用 |
| MA37647A1 (fr) | 2012-05-17 | 2016-03-31 | Genentech Inc | Procédé de fabrication de composés de cyclopentapyrimidine hydroxylée et sels de ceux-ci |
| US9410169B2 (en) | 2012-06-18 | 2016-08-09 | Laboratorio Chimico Internazionale S.P.A. | Process for producing chiral 1- substituted 2-piperidinols employing oxidoreductases |
| DE102013104418B4 (de) | 2013-04-30 | 2018-09-27 | Cambrex Iep Gmbh | Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol |
| JP6511448B2 (ja) * | 2013-12-11 | 2019-05-15 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | キラルな２−アリールモルホリン類の調製のためのプロセス |
| CN106811491B (zh) * | 2015-12-01 | 2022-07-19 | 焦作健康元生物制品有限公司 | 光学活性的β-羟基酯类化合物的制备方法及其中间体 |
| BR112020008498A2 (pt) * | 2017-11-01 | 2020-10-20 | Melinta Therapeutics, Inc. | síntese de derivados de éster boronato e usos dos mesmos |
| WO2024150146A1 (en) | 2023-01-12 | 2024-07-18 | Novartis Ag | Engineered ketoreductase polypeptides |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4014573C1 (hu) | 1990-05-07 | 1991-10-10 | Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De | |
| US5225339A (en) * | 1992-02-26 | 1993-07-06 | The Scripps Research Institute | Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase |
| US5385833A (en) * | 1992-02-26 | 1995-01-31 | The Scripps Research Institute | Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase |
| US5719039A (en) * | 1995-06-01 | 1998-02-17 | University Of Iowa Research Foundation | Enzyme-surfactant ion-pair complex catalyzed reactions in organic solvents |
| DE19610984A1 (de) * | 1996-03-21 | 1997-09-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen |
-
2001
- 2001-04-20 DE DE10119274A patent/DE10119274A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-04-15 PT PT02737953T patent/PT1383899E/pt unknown
- 2002-04-15 HU HU0303803A patent/HU229667B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-04-15 EP EP09010760A patent/EP2123760A1/de not_active Withdrawn
- 2002-04-15 US US10/475,150 patent/US20040265978A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-15 DE DE50213871T patent/DE50213871D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-15 EP EP02737953A patent/EP1383899B1/de not_active Revoked
- 2002-04-15 WO PCT/EP2002/004143 patent/WO2002086126A2/de active Application Filing
- 2002-04-15 SK SK1269-2003A patent/SK288326B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-04-15 JP JP2002583640A patent/JP4417628B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-15 CZ CZ20032820A patent/CZ20032820A3/cs unknown
- 2002-04-15 DK DK02737953.6T patent/DK1383899T3/da active
- 2002-04-15 PL PL367043A patent/PL207271B1/pl unknown
- 2002-04-15 ES ES02737953T patent/ES2334016T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-15 AT AT02737953T patent/ATE443770T1/de active
-
2007
- 2007-06-19 US US11/820,418 patent/US8361765B2/en active Active
-
2009
- 2009-06-23 JP JP2009148703A patent/JP2009207499A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002086126A3 (de) | 2003-11-06 |
| PL367043A1 (en) | 2005-02-21 |
| JP4417628B2 (ja) | 2010-02-17 |
| EP1383899A2 (de) | 2004-01-28 |
| CZ20032820A3 (cs) | 2004-02-18 |
| SK12692003A3 (sk) | 2004-05-04 |
| US20090017510A1 (en) | 2009-01-15 |
| HUP0303803A2 (hu) | 2004-03-01 |
| JP2009207499A (ja) | 2009-09-17 |
| US20040265978A1 (en) | 2004-12-30 |
| HUP0303803A3 (en) | 2011-05-30 |
| PT1383899E (pt) | 2009-12-24 |
| EP1383899B1 (de) | 2009-09-23 |
| DE50213871D1 (de) | 2009-11-05 |
| ATE443770T1 (de) | 2009-10-15 |
| PL207271B1 (pl) | 2010-11-30 |
| JP2004527251A (ja) | 2004-09-09 |
| DK1383899T3 (da) | 2010-01-25 |
| DE10119274A1 (de) | 2002-10-31 |
| EP2123760A1 (de) | 2009-11-25 |
| SK288326B6 (sk) | 2016-01-07 |
| US8361765B2 (en) | 2013-01-29 |
| WO2002086126A2 (de) | 2002-10-31 |
| ES2334016T3 (es) | 2010-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU229667B1 (en) | Enzymatic method for the enantioselective reduction of keto compounds | |
| US6225099B1 (en) | Alcohol dehydrogenase and its use for the enzymatic production of chiral hydroxy compounds | |
| TWI408234B (zh) | 對映異構選擇性酶催化還原羥基酮化合物類之方法 | |
| CN104017794B (zh) | 用于生产(+)-客烯的方法 | |
| EP3650537A1 (en) | Use of stereoselective transaminase in asymmetric synthesis of chiral amine | |
| CA2393343C (en) | Nadh oxidase from lactobacillus | |
| AU2003221082B2 (en) | Novel carbonyl reductase, gene encoding it and process for producing optically active alcohols using the same | |
| Yamamoto et al. | Cloning and expression in Escherichia coli of a gene coding for a secondary alcohol dehydrogenase from Candida parapsilosis | |
| Garcia-Junceda et al. | A new strategy for the cloning, overexpression and one step purification of three DHAP-dependent aldolases: Rhamnulose-1-phosphate aldolase, fuculose-1-phosphate aldolase and tagatose-1, 6-diphosphate aldolase1 | |
| CN113621590B (zh) | 一种s-尼古丁的制备方法 | |
| EP1762625B1 (en) | Reductase gene and use thereof | |
| JPWO2004027055A1 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
| Deng et al. | Acetoin catabolic system of Klebsiella pneumoniae CG43: sequence, expression, and organization of the aco operon | |
| CA2343970A1 (en) | Process for producing optically active pyridineethanol derivatives | |
| JP2004215666A (ja) | オキシドレダクターゼ | |
| JP2005006552A (ja) | 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| EP1080205B1 (en) | Guava (psidium guajava)) 13-hydroperoxide lyase and uses thereof | |
| US20080305534A1 (en) | Novel Glycerol Dehydrogenase, Gene Therefor, and Method of Utilizing the Same | |
| EP1231266B1 (en) | Arabidopsis-origin gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene | |
| Kawano et al. | Cloning and overexpression of an NADH-dependent alcohol dehydrogenase gene from Candida maris involved in (R)-selective reduction of 5-acetylfuro [2, 3-c] pyridine | |
| CN112852775B (zh) | 一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用 | |
| JP4039037B2 (ja) | 還元酵素遺伝子及びその利用 | |
| JP2000350585A (ja) | 耐熱耐酸素性ヒドロゲナーゼ遺伝子 | |
| JPH05344890A (ja) | Ｎａｄｈオキシダーゼをコードする遺伝子及びその利用 | |
| JP3518501B2 (ja) | 酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NF4A | Restoration of patent protection | ||
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |