JP2005006552A - 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類、特に（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを高光学純度かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
【解決手段】イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母由来の新規カルボニル還元酵素とそれをコードするＤＮＡを提供する。このカルボニル還元酵素を用いてカルボニル基含有化合物を還元し、光学活性アルコール類、特に（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを高光学純度かつ高収率で生産することが出来る。
【選択図】 なし
【解決手段】イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母由来の新規カルボニル還元酵素とそれをコードするＤＮＡを提供する。このカルボニル還元酵素を用いてカルボニル基含有化合物を還元し、光学活性アルコール類、特に（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを高光学純度かつ高収率で生産することが出来る。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類に変換する活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体に関し、さらに該形質転換体、該形質転換体処理物および／または培養液を用いた光学活性アルコール類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールは生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）あるいはこれらの合成中間体の合成原料として有用な物質である。
光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造法としては１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンを微生物により立体選択的に還元する方法（特許文献１）、１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノンを微生物により立体選択的に還元する方法（特許文献２）、光学活性３−クロロ−１，２−プロパンジオールをジエステル化してから酵素的加水分解によりモノエステル化する方法（特許文献３）などが知られている。しかし、いずれの方法も操作が煩雑であったり、立体選択性や生産性が不充分である等の問題点が多い。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１０３８７８号公報
【特許文献２】国際公開０２／００５８５号パンフレット
【特許文献３】特開２０００−２８７６９６号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、より光学純度の高い１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを、さらに安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを本発明の課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造方法について鋭意検討した結果、原料となる１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンの還元反応を触媒する新規酵素を単離し、該酵素をコードする遺伝子を単離してその塩基配列を解析した。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、組換え菌を用いて該遺伝子を発現させた該酵素形質転換体細胞、該形質転換体処理物および／または培養液を、原料となる１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンに作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを得ることができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（２）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（３）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（５）（４）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（６）（２）又は（３）に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
（７）下記一般式（Ｉ）
【０００７】
【化５】
【０００８】
（式中、Ｒはアシル基を示す）で表される１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノンに、（５）または（６）に記載の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【０００９】
【化６】
【００１０】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを生成させることを特徴とする光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造方法。
（８）下記一般式（Ｉ）
【００１１】
【化７】
【００１２】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノンに、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母、該菌体処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化８】
【００１４】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを生成させることを特徴とする光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造方法。
（９）Ｒがアセチル基であることを特徴とする（７）または（８）に記載の製造方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するもの（以下これを単に「カルボニル還元酵素」と称することがある）である。
【００１６】
本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類とする活性をいう。このような活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有し、さらにＮＡＤＰＨを補酵素として含有する反応系において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する能力を有する形質転換体、形質転換体処理物、または培養液を作用させてＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することにより測定することができる。
【００１７】
本発明のタンパク質は、本発明によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列が明らかになったので、後述するように本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発明を完成するにあたってなされたように、カルボニル基の還元活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、好ましくはイサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母の培養物より精製することも出来る。
【００１８】
イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母としては、例えば、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株が特に本発明のカルボニル還元酵素の産生能に優れている。本菌株は、理化学研究所微生物系統保存施設（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ（ＪＣＭ））より入手可能である。
【００１９】
微生物の培養物からの本発明のタンパク質の取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物をＹＭ培地等の酵母の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することが出来る。
【００２０】
例えば、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００２１】
このように精製されたイサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株に由来する本発明のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと省略）によると約４０，０００Ｄａのサブユニット１種からなり、また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲル濾過に決定された分子量は、約４０，０００Ｄａである。
【００２２】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
まず、本発明のタンパク質を上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決める。
【００２３】
決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００２４】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株のｃＤＮＡを用いてＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、以下Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）により本発明のＤＮＡを得ることも可能である。
【００２５】
なお本発明のＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、本発明によりその塩基配列が明らかになったため、配列番号２に基づく化学合成等によって得ることもできる。
【００２６】
本発明のタンパク質のホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に一個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものである。ここで複数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００２７】
また、本発明のタンパク質のホモログとは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。
ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ））等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の機能未知のタンパク質Ｙｄｒ５４１ｃｐｐｒｏｔｅｉｎ（配列番号３：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＢ６４９８３）であり、４２％の相同性を示した。
【００２８】
また、本発明のＤＮＡは、上記タンパク質をコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
上記タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ここで複数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２９】
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより本発明のＤＮＡホモログを得ることが可能である。
【００３０】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列またはその一部や、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部を元に、例えばＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株からのＰＣＲ等により該ＤＮＡ断片を手に入れることが可能である。
【００３１】
さらに、本発明のＤＮＡのホモログは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３２】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００３３】
上記のようにして単離された、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。あるいは、形質転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡに本発明のＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３４】
形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
このとき、本発明のＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む必要がある。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ． ４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ８，４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３５】
本発明のカルボニル還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３６】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００３７】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００３８】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００３９】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００４０】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００４１】
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法）。
【００４２】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００４３】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４４】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００４５】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００４６】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４７】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４８】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４９】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５０】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２８３−２８７（１９８９））。
【００５１】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００５２】
さらに本発明は、上記の方法などで得られる本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【００５３】
【化９】
【００５４】
（式中、Ｒはアシル基を示す）で表される１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノンに作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【００５５】
【化１０】
【００５６】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを製造することができる。
【００５７】
また本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）で表される光学活性アルコールを製造することもできる。
【００５８】
また本発明は、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母、該細菌処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）で表される光学活性アルコールを製造することもできる。
【００５９】
イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母細菌としては、例えば、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株が好適に使用される。
【００６０】
前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、置換基Ｒのアシル基としては反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的に好ましい置換基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、及びピバロイル基などのアルカノイル基、ホルミル基、シクロヘキサンカルボニル基などの脂環式アシル基、並びにベンゾイル基、及びトルオイル基などの芳香族アシル基から選ばれる基が挙げられる。これらアシル基のうち、さらに好ましい置換基としてはアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、及びベンゾイル基から選ばれる基が挙げられる。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えばＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ （１９９７） ２０（５），６４４に記載の方法に従って、容易に合成することができる。
【００６１】
また、反応基質となる上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００６２】
本発明の製造方法において、式（Ｉ）のカルボニル基含有化合物（反応基質）に上記形質転換体細胞を作用させるに当たっては、該形質転換体細胞をそのまま、あるいは該形質転換体細胞処理物、例えば、該形質転換体細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の細胞処理物、該形質転換体細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いることができる。反応液に添加する形質転換体細胞及び／又は該形質転換体細胞処理物の量は、形質転換体細胞を添加する場合は反応液にその細胞の濃度が通常、湿菌体重で０．１〜５０％ｗ／ｖ程度、好ましくは１〜２０％ｗ／ｖとなるように添加し、酵素のような調製物を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
【００６３】
また、本発明の製造方法においては、補酵素ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤＰＨを添加するのが好ましく、通常、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ添加する。
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへ再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ＋還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、
３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、
が挙げられる。
【００６４】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いても良い。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素に比較して、酵素活性で通常、０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料であるカルボニル基含有化合物に対して通常、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００６５】
また、上記３）の方法においては、本発明のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００６６】
本発明の製造方法は、反応基質及び本発明の形質転換体、該形質転換体処理物および／または培養液、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。
本発明の方法は、通常４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。反応時間は通常、１〜７２時間程度である。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００６７】
本発明の方法により生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【００６８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６９】
（１）カルボニル還元酵素の単離
イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株を２Ｌの培地（グルコース８０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）２０ｇ、ペプトン（極東製薬製）４０ｇ／Ｌ）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体１５０ｇを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）、０．１ｍＭ ＤＴＴ（以下これを単に「バッファー」と称する）で懸濁し、ダイノーミルＫＤＬ（シンマルエンタープライゼス製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に９０ｇ／Ｌの濃度になるようＰＥＧ６０００を添加し４℃で１時間静置後、遠心分離により沈殿を除去した。この上清より、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを経て目的のカルボニル還元酵素を電気泳動的に単一バンドまで精製した。
【００７０】
精製の際、カルボニル還元酵素の活性は、酵素液を含む反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．３２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ １−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノン）の３４０ｎｍの吸光度の減少を３７℃でモニターすることによりＮＡＤＰＨの消費量を算出することにより測定した。測定にはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用した。尚、上記反応において１分間に１ｎｍｏｌのＮＡＤＰＨを消費する活性を１Ｕとした。
精製の結果を下表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
上記活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果、ほぼ単一バンドであり、その分子量は約４０，０００Ｄａであった。以下、本酵素をＩｓＡＤＨ１と呼ぶ。
【００７３】
（２）ＩｓＡＤＨ１の基質特異性
様々なカルボニル化合物について酵素液を含む反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．３２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ 基質）を調製し、３４０ｎｍの吸光度の減少を３７℃でモニターすることによりそれぞれの化合物に対する酵素活性を測定した。測定にはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用した。１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンに対する活性を１００として、他の化合物に対する活性を下表２にまとめた。
【００７４】
【表２】
【００７５】
（３）カルボニル還元酵素のアミノ酸配列の解析
上記（１）で得られたカルボニル還元酵素を含む画分を脱塩、濃縮後、エドマン法によりＮ末端アミノ酸の解析を行い１８残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。結果を配列番号４に示す。
また、精製したカルボニル還元酵素を、リジルエンドペプチダーゼを用いた消化法（タンパク質実験ノート・下、羊土社）により消化して得たペプチドを逆相ＨＰＬＣ（アマシャム バイオサイエンス社製 μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＰＣ３．２／３）を用い、ペプチドを分離し、分取した。分取したペプチドピーク１種をエドマン法によりアミノ酸配列の解析を行い、アミノ酸配列を配列番号５に示した。
【００７６】
（４）イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株由来の本発明ＤＮＡの配列解析及び形質転換体の作製
イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株を実施例（１）に示した培地で培養し、菌体を調製した。
菌体からのゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出、精製した。得られたゲノムＤＮＡを元に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社製）を用いて、酵素添付のプロトコルによりｃＤＮＡを合成した。
【００７７】
上記（３）で得られた配列番号４のＮ末端アミノ酸配列を元にセンスデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー及び配列番号５の内部アミノ酸配列を元にアンチセンスのデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを計２種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号６，７に示した。この２種のプライマーを用いて、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ）ＪＣＭ１８２８株のｃＤＮＡに対してデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲを行ったところ、約３５０ｂｐの増幅断片が認められた。
【００７８】
このＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動を行い、約３５０ｂｐの断片のバンドを切り出しＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、Ｔ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＳＰ６プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決定された塩基配列を配列番号８として示した。
【００７９】
次に、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株のゲノムＤＮＡを元に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ記載の方法に従ってＲＡＣＥ反応用のｃＤＮＡを合成し、同文献記載の方法で５’−及び３’−ＲＡＣＥ反応を行った。反応には上記塩基配列を元に設計した配列番号９および１０に示す２種の遺伝子特異的プライマーを用いた。
【００８０】
ＲＡＣＥ反応による増幅遺伝子断片の配列解析の結果、本カルボニル還元酵素の推定ｃＤＮＡ配列を配列番号１１に、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２に示した。
【００８１】
引き続き、上記配列番号１１に記載の配列を元に、クローニング用のプライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列及び配列番号１３に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０００ｎｍｏｌ、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株のｃＤＮＡ ２５０ｎｇ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用１０×緩衝液（タカラバイオ社製）１０μＬ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５ユニット（タカラバイオ社製）を含む１００μＬの反応液を用い、変性（９５℃、１分）、アニール（５８℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を３０サイクル、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００８２】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８とＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＩｓＡＤＨ１とした。
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号２の塩基配列と一致した。
【００８３】
（５）本発明のＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ）−１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノール合成
上記（４）で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭ イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で３７℃で１８時間生育させ、得られた菌体ブロス５ｍＬを遠心分離により集菌後、下記に示す方法により、１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンを基質として還元活性を確認した。
【００８４】
上記菌体に５００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、２０ｇ／Ｌ グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、１０ｇ／Ｌ １−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノン）を添加後３０℃で２０時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出し、（Ｒ）−１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノールを定量した。
【００８５】
定量は酢酸エチル溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定した。ＧＣの条件は以下の通りである。
カラム：β−ＤＥＸ２２５ （ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ １．５ｍｌ／ｍｉｎ、 ｓｐｌｉｔ １／５０
カラム温度：１５０℃
注入温度：２２０℃
検出：ＦＩＤ ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ
【００８６】
この結果、（Ｒ）−１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノールの収量は４．２ｍｇであり、光学純度は＞９９．９％ｅ．ｅ．であった。
また該遺伝子を含まないプラスミドｐＵＣ１１８を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【００８７】
【発明の効果】
医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類を高光学純度かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類に変換する活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体に関し、さらに該形質転換体、該形質転換体処理物および／または培養液を用いた光学活性アルコール類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールは生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）あるいはこれらの合成中間体の合成原料として有用な物質である。
光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造法としては１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンを微生物により立体選択的に還元する方法（特許文献１）、１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノンを微生物により立体選択的に還元する方法（特許文献２）、光学活性３−クロロ−１，２−プロパンジオールをジエステル化してから酵素的加水分解によりモノエステル化する方法（特許文献３）などが知られている。しかし、いずれの方法も操作が煩雑であったり、立体選択性や生産性が不充分である等の問題点が多い。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１０３８７８号公報
【特許文献２】国際公開０２／００５８５号パンフレット
【特許文献３】特開２０００−２８７６９６号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、より光学純度の高い１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを、さらに安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを本発明の課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造方法について鋭意検討した結果、原料となる１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンの還元反応を触媒する新規酵素を単離し、該酵素をコードする遺伝子を単離してその塩基配列を解析した。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、組換え菌を用いて該遺伝子を発現させた該酵素形質転換体細胞、該形質転換体処理物および／または培養液を、原料となる１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンに作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを得ることができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（２）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（３）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（５）（４）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（６）（２）又は（３）に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
（７）下記一般式（Ｉ）
【０００７】
【化５】
（式中、Ｒはアシル基を示す）で表される１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノンに、（５）または（６）に記載の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【０００９】
【化６】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを生成させることを特徴とする光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造方法。
（８）下記一般式（Ｉ）
【００１１】
【化７】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノンに、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母、該菌体処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化８】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを生成させることを特徴とする光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールの製造方法。
（９）Ｒがアセチル基であることを特徴とする（７）または（８）に記載の製造方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するもの（以下これを単に「カルボニル還元酵素」と称することがある）である。
【００１６】
本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類とする活性をいう。このような活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有し、さらにＮＡＤＰＨを補酵素として含有する反応系において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する能力を有する形質転換体、形質転換体処理物、または培養液を作用させてＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することにより測定することができる。
【００１７】
本発明のタンパク質は、本発明によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列が明らかになったので、後述するように本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発明を完成するにあたってなされたように、カルボニル基の還元活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、好ましくはイサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母の培養物より精製することも出来る。
【００１８】
イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母としては、例えば、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株が特に本発明のカルボニル還元酵素の産生能に優れている。本菌株は、理化学研究所微生物系統保存施設（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ（ＪＣＭ））より入手可能である。
【００１９】
微生物の培養物からの本発明のタンパク質の取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物をＹＭ培地等の酵母の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することが出来る。
【００２０】
例えば、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００２１】
このように精製されたイサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株に由来する本発明のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと省略）によると約４０，０００Ｄａのサブユニット１種からなり、また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲル濾過に決定された分子量は、約４０，０００Ｄａである。
【００２２】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
まず、本発明のタンパク質を上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決める。
【００２３】
決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００２４】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株のｃＤＮＡを用いてＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、以下Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）により本発明のＤＮＡを得ることも可能である。
【００２５】
なお本発明のＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、本発明によりその塩基配列が明らかになったため、配列番号２に基づく化学合成等によって得ることもできる。
【００２６】
本発明のタンパク質のホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に一個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものである。ここで複数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００２７】
また、本発明のタンパク質のホモログとは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。
ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ））等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の機能未知のタンパク質Ｙｄｒ５４１ｃｐｐｒｏｔｅｉｎ（配列番号３：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＢ６４９８３）であり、４２％の相同性を示した。
【００２８】
また、本発明のＤＮＡは、上記タンパク質をコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
上記タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ここで複数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２９】
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより本発明のＤＮＡホモログを得ることが可能である。
【００３０】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列またはその一部や、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部を元に、例えばＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株からのＰＣＲ等により該ＤＮＡ断片を手に入れることが可能である。
【００３１】
さらに、本発明のＤＮＡのホモログは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３２】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００３３】
上記のようにして単離された、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。あるいは、形質転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡに本発明のＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３４】
形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
このとき、本発明のＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む必要がある。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ． ４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ８，４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３５】
本発明のカルボニル還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３６】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００３７】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００３８】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００３９】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００４０】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００４１】
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法）。
【００４２】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００４３】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４４】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００４５】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００４６】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４７】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４８】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４９】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５０】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２８３−２８７（１９８９））。
【００５１】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００５２】
さらに本発明は、上記の方法などで得られる本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【００５３】
【化９】
（式中、Ｒはアシル基を示す）で表される１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノンに作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【００５５】
【化１０】
（式中、Ｒは前記と同義である）で表される（Ｒ）−１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノールを製造することができる。
【００５７】
また本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）で表される光学活性アルコールを製造することもできる。
【００５８】
また本発明は、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母、該細菌処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）で表される光学活性アルコールを製造することもできる。
【００５９】
イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属酵母細菌としては、例えば、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株が好適に使用される。
【００６０】
前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、置換基Ｒのアシル基としては反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的に好ましい置換基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、及びピバロイル基などのアルカノイル基、ホルミル基、シクロヘキサンカルボニル基などの脂環式アシル基、並びにベンゾイル基、及びトルオイル基などの芳香族アシル基から選ばれる基が挙げられる。これらアシル基のうち、さらに好ましい置換基としてはアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、及びベンゾイル基から選ばれる基が挙げられる。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えばＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ （１９９７） ２０（５），６４４に記載の方法に従って、容易に合成することができる。
【００６１】
また、反応基質となる上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００６２】
本発明の製造方法において、式（Ｉ）のカルボニル基含有化合物（反応基質）に上記形質転換体細胞を作用させるに当たっては、該形質転換体細胞をそのまま、あるいは該形質転換体細胞処理物、例えば、該形質転換体細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の細胞処理物、該形質転換体細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いることができる。反応液に添加する形質転換体細胞及び／又は該形質転換体細胞処理物の量は、形質転換体細胞を添加する場合は反応液にその細胞の濃度が通常、湿菌体重で０．１〜５０％ｗ／ｖ程度、好ましくは１〜２０％ｗ／ｖとなるように添加し、酵素のような調製物を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
【００６３】
また、本発明の製造方法においては、補酵素ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤＰＨを添加するのが好ましく、通常、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ添加する。
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへ再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ＋還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、
３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、
が挙げられる。
【００６４】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いても良い。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素に比較して、酵素活性で通常、０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料であるカルボニル基含有化合物に対して通常、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００６５】
また、上記３）の方法においては、本発明のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００６６】
本発明の製造方法は、反応基質及び本発明の形質転換体、該形質転換体処理物および／または培養液、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。
本発明の方法は、通常４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。反応時間は通常、１〜７２時間程度である。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００６７】
本発明の方法により生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【００６８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６９】
（１）カルボニル還元酵素の単離
イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株を２Ｌの培地（グルコース８０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）２０ｇ、ペプトン（極東製薬製）４０ｇ／Ｌ）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体１５０ｇを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）、０．１ｍＭ ＤＴＴ（以下これを単に「バッファー」と称する）で懸濁し、ダイノーミルＫＤＬ（シンマルエンタープライゼス製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に９０ｇ／Ｌの濃度になるようＰＥＧ６０００を添加し４℃で１時間静置後、遠心分離により沈殿を除去した。この上清より、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを経て目的のカルボニル還元酵素を電気泳動的に単一バンドまで精製した。
【００７０】
精製の際、カルボニル還元酵素の活性は、酵素液を含む反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．３２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ １−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノン）の３４０ｎｍの吸光度の減少を３７℃でモニターすることによりＮＡＤＰＨの消費量を算出することにより測定した。測定にはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用した。尚、上記反応において１分間に１ｎｍｏｌのＮＡＤＰＨを消費する活性を１Ｕとした。
精製の結果を下表１に示す。
【００７１】
【表１】
上記活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果、ほぼ単一バンドであり、その分子量は約４０，０００Ｄａであった。以下、本酵素をＩｓＡＤＨ１と呼ぶ。
【００７３】
（２）ＩｓＡＤＨ１の基質特異性
様々なカルボニル化合物について酵素液を含む反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．３２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ 基質）を調製し、３４０ｎｍの吸光度の減少を３７℃でモニターすることによりそれぞれの化合物に対する酵素活性を測定した。測定にはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用した。１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンに対する活性を１００として、他の化合物に対する活性を下表２にまとめた。
【００７４】
【表２】
（３）カルボニル還元酵素のアミノ酸配列の解析
上記（１）で得られたカルボニル還元酵素を含む画分を脱塩、濃縮後、エドマン法によりＮ末端アミノ酸の解析を行い１８残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。結果を配列番号４に示す。
また、精製したカルボニル還元酵素を、リジルエンドペプチダーゼを用いた消化法（タンパク質実験ノート・下、羊土社）により消化して得たペプチドを逆相ＨＰＬＣ（アマシャム バイオサイエンス社製 μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＰＣ３．２／３）を用い、ペプチドを分離し、分取した。分取したペプチドピーク１種をエドマン法によりアミノ酸配列の解析を行い、アミノ酸配列を配列番号５に示した。
【００７６】
（４）イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株由来の本発明ＤＮＡの配列解析及び形質転換体の作製
イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株を実施例（１）に示した培地で培養し、菌体を調製した。
菌体からのゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出、精製した。得られたゲノムＤＮＡを元に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社製）を用いて、酵素添付のプロトコルによりｃＤＮＡを合成した。
【００７７】
上記（３）で得られた配列番号４のＮ末端アミノ酸配列を元にセンスデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー及び配列番号５の内部アミノ酸配列を元にアンチセンスのデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを計２種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号６，７に示した。この２種のプライマーを用いて、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ）ＪＣＭ１８２８株のｃＤＮＡに対してデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲを行ったところ、約３５０ｂｐの増幅断片が認められた。
【００７８】
このＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動を行い、約３５０ｂｐの断片のバンドを切り出しＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、Ｔ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＳＰ６プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決定された塩基配列を配列番号８として示した。
【００７９】
次に、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株のゲノムＤＮＡを元に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ記載の方法に従ってＲＡＣＥ反応用のｃＤＮＡを合成し、同文献記載の方法で５’−及び３’−ＲＡＣＥ反応を行った。反応には上記塩基配列を元に設計した配列番号９および１０に示す２種の遺伝子特異的プライマーを用いた。
【００８０】
ＲＡＣＥ反応による増幅遺伝子断片の配列解析の結果、本カルボニル還元酵素の推定ｃＤＮＡ配列を配列番号１１に、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２に示した。
【００８１】
引き続き、上記配列番号１１に記載の配列を元に、クローニング用のプライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列及び配列番号１３に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０００ｎｍｏｌ、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ ｓｃｕｔｕｌａｔａ ｖａｒ． ｓｃｕｔｕｌａｔａ） ＪＣＭ１８２８株のｃＤＮＡ ２５０ｎｇ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用１０×緩衝液（タカラバイオ社製）１０μＬ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５ユニット（タカラバイオ社製）を含む１００μＬの反応液を用い、変性（９５℃、１分）、アニール（５８℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を３０サイクル、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００８２】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８とＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＩｓＡＤＨ１とした。
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号２の塩基配列と一致した。
【００８３】
（５）本発明のＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ）−１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノール合成
上記（４）で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭ イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で３７℃で１８時間生育させ、得られた菌体ブロス５ｍＬを遠心分離により集菌後、下記に示す方法により、１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンを基質として還元活性を確認した。
【００８４】
上記菌体に５００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、２０ｇ／Ｌ グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、１０ｇ／Ｌ １−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノン）を添加後３０℃で２０時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出し、（Ｒ）−１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノールを定量した。
【００８５】
定量は酢酸エチル溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定した。ＧＣの条件は以下の通りである。
カラム：β−ＤＥＸ２２５ （ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ １．５ｍｌ／ｍｉｎ、 ｓｐｌｉｔ １／５０
カラム温度：１５０℃
注入温度：２２０℃
検出：ＦＩＤ ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ
【００８６】
この結果、（Ｒ）−１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノールの収量は４．２ｍｇであり、光学純度は＞９９．９％ｅ．ｅ．であった。
また該遺伝子を含まないプラスミドｐＵＣ１１８を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【００８７】
【発明の効果】
医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類を高光学純度かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
【配列表】
Claims (9)
- 下記（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。 - 下記（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。 - 下記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 請求項２又は３に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
- 請求項４に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
- 請求項２又は３に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
- 下記一般式（Ｉ）
- 下記一般式（Ｉ）
- Ｒがアセチル基であることを特徴とする請求項７または８に記載の製造方法。
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