JP5042831B2 - ヒドロキシ化合物の立体選択的製造用アルコール脱水素酵素 - Google Patents
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Description
ADHは、クラスE.C.1.1.1.1又はクラスE.C.1.1.1.2に分類されている。したがって、いわゆる酸化還元酵素の部類に属する。これらは、多数の微生物中に存在する(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis、編集:K. Drauz及びH. Waldmann、1995、VCH、第II巻、595ff)。
さらに、Keinan及びLamedを含む研究グループは、サーモアナエロビウム ブロッキイ由来のADHを報告している(E. Keinan, E. K. Hafeli, K. K. Seth, R. Lamed, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 162)。これらは、小さい基質に対して(R)−特異性であるが、一方で、より大きい基質に対しては(S)−特異性である。
表1は、大腸菌のADH Tの異種発現を伴う高濃度の細胞発酵における異なる亜鉛濃度の影響を検討した結果である。OD60030、0.4mMのIPTGを使用して、14時間、30℃で誘導を行った。その活性は、誘導期間後の細胞湿重量1グラム当たりで示した。
表7は、50mMのトリス/塩酸(pH7.0)中、30℃で48時間インキュベーションした後の基質含量及び生成物含量を示す。
(S)−4−ヒドロキシ−2−ペンタノンの調製には、5U/mlの酵素とイソプロパノール(10%)を使用して再生した基質結合補酵素を使用し、(S,S)−2,4−ペンタンジオールの調製には、10U/mlの酵素とグルコース脱水素酵素を使用して再生した酵素結合補酵素を使用した。
この両者の場合、補酵素はNADPである。
活性は、補酵素の減少を光度測定することにより決定した。測定バッチ:10mMの基質及び0.2mMのNADPHを含む50mMのトリス−Cl(pH7.0)。ADH−TEの測定バッチは1mMの塩化マグネシウムをさらに含む。
サーモアナエロバクター種由来のアルコール脱水素酵素のクローン化のために、関連生物であるサーモアナエロバクター エサノリカス(Th.ethanolicus)、サーモアナエロバクター ブロッキイ(Th.brockii)及びサーモアナエロバクター テングコンゲンシス(Th.tengcongensis)由来のアルコール脱水素酵素の対応する遺伝子配列が、これらの配列のプライマー対を誘導するのに十分相同性があると仮定した。
新たに発酵したサーモアナエロバクター種生物のバイオマス100mgを回収した。ゲノムDNAは、キアゲン(QIAGEN)社のゲノムチップで単離した。
DNAは、ロシュ(Roche)のT4リガーゼを使用して、Sma I切断部位及び脱リン酸化されたベクターpUC18に結合した。
アルコール脱水素酵素に関する遺伝子を、制限酵素であるNde I及びXho Iを使用してベクターpUC18[ADH T]から切断し、同じ酵素で消化したベクターpET24aに結合した。
このようにして得られたRosetta[DE3]pLacIにおけるpET24a[ADH T]株を、LB培地で5時間培養し、0.5mMのイソプロピルチオガラクシド(IPTG)で誘導して、さらに一晩培養した。
見出されたDNA配列は、「クローン」プログラムによってアミノ酸配列に翻訳され、サーモアナエロバクター エサノリカス(Th.ethanolicus)由来の対応する配列と比較した。
無機塩培地:
NaH2PO4×2H2O 4.0g/l
K2HPO4 14.6g/l
NH4Cl 0.5g/l
(NH4)2SO4 2.5g/l
(NH4)2Hクエン酸塩 1.0g/l
Na2SO4 2.0g/l
CaCl2×6H2O 0.74g/l
ZnSO4×7H2O 0.18g/l
MnSO4×H2O 0.1g/l
Na2EDTA 20.1g/l
FeCl3×6H2O 16.7g/l
CuSO4 0.1g/l
CoCl2 0.104g/l
から成る微量元素溶液、及び34mg/lのチアミンをそれぞれ2ml/Lずつ添加した。20g/lのグルコースを炭素源として使用した。
得られた細胞集団を10%の1M NaClを含む50mMのトリス−Cl(pH7.0)中に再懸濁して、ホモゲナイザーで解砕した。次に、水槽中、70℃で7.5分間熱変性した。変性したタンパク質及び細胞残屑を遠心分離した。
Claims (12)
- 請求項1に記載のDNA配列の少なくとも1つのコピーを含有することを特徴とするベクター。
- 下記宿主細胞が前記アルコール脱水素酵素を発現できるように、請求項1に記載のDNA配列で形質転換又トランスフェクションした原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
- 大腸菌(Escherichia coli)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、及び枯草菌(Bacillus subtilis)からなる群より選ばれることを特徴とする請求項3に記載の原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
- 請求項1に記載のDNA配列のうちの1つによってコードされるアルコール脱水素酵素。
- 前記アルコール脱水素酵素を発現できるように、請求項1に記載のDNA配列で形質転換又はトランスフェクションした原核宿主細胞又は真核宿主細胞を、亜鉛イオンを0.1〜5mMの濃度で含有する培地中で培養し、前記アルコール脱水素酵素を、前記DNA配列の発現産物として単離することを特徴とする請求項5に記載のアルコール脱水素酵素の製造方法。
- 前記アルコール脱水素酵素を単離するために、前記宿主細胞を、第1族元素及び第2族元素のイオン、アンモニウムイオン、および鉄イオンからなる群より選ばれるイオンを少なくとも0.2Mの濃度で含有する培地中で、ホモジナイズ及び/又は熱変性することを特徴とする請求項7に記載のアルコール脱水素酵素の製造方法。
- 第1族元素及び第2族元素のイオン、アンモニウムイオン、および鉄イオンからなる群より選ばれるイオンを少なくとも0.2Mの濃度で含有する培地中で、請求項5又は6に記載のアルコール脱水素酵素を用いてケト化合物を酵素還元して立体選択的にヒドロキシ化合物を生成させる方法。
- 第1族元素及び第2族元素のイオン、アンモニウムイオン、並びに鉄イオンからなる群より選ばれるイオンを少なくとも0.2Mの濃度で含有する培地中で、請求項5又は6に記載のアルコール脱水素酵素によってケト化合物を酵素還元することを特徴とする第2級アルコールの立体選択的製造方法。
- 前記ケト化合物が、脂肪族ケトン、芳香族ケトン類、2−ケトエステル類、3−ケトエステル類、およびジケトン類からなる群より選ばれることを特徴とする請求項10に記載の第2級アルコールの立体選択的製造方法。
- 前記ケト化合物が、2−ブタノン、2−ヘキサノン、2−オクタノン、モノクロロアセトン、アセトアルデヒド、2−メチルブチルアルデヒド、ジアセチル、2,4−ペンタンジオン、2,5−ヘキサンジオン、アセト酢酸エチル、4−クロロアセト酢酸エチル、アセトフェノン、p−クロロアセトフェノン、2−アセチルピリジン、3−ブチン−2−オン、1,2−シクロヘキサンジオン、ピルビン酸塩、2−オキソ酪酸、4−クロロ−2−ブタノン、4−ヒドロキシ−2−ブタノン、3−オクタノン及び塩化フェナシルからなる群より選ばれることを特徴とする請求項10に記載の第2級アルコールの立体選択的製造方法。
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