CH676990A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die vorliegenden Unterlagen basieren auf einer continuation-in-part Anmeldung der USA Anmeldung Serial no. 801 090, die am 22. November 1985 eingereicht wurde, und es wird auf die dort gemachten Aussagen Bezug genommen. 



  Ferner wird Bezug genommen auf alle Offenbarungen, die in den Veröffentlichungen genannt sind, welche in der vorliegenden Beschreibung erwähnt sind. 



  Superoxid-dismutase, die in der Folge als SOD abgekürzt wird und das Phänomen der freien Sauerstoffradikale, also der Radikale der Formel (O2-) wurden im Jahre 1948 von McCord entdeckt und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M.  und Fridovich, I, im J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969) verwiesen. 



  Superoxid Radikale und andere hochreaktive Sauerstoffarten werden in jeder atmenden Zelle als Nebenprodukt eines oxidativen Stoffwechsels gebildet und es hat sich gezeigt, dass diese eine starke Schädigung bei einer grossen Anzahl von makromolekularen Komponenten und Zellkomponenten hervorrufen. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffent lichung von Fridovich, I. in "Advances in Inorganic Biochemistry", Verlag Eichhorn, G.L. und Marzilli, L.G. (Elsevier/North Holland, New York), Seiten 67-90 (1979) und auf die Veröffentlichung von Freeman, B.A. und Crapo, J.D. in "Laboratory Investion" 47:412-26 (1982) verwiesen. 



  Eine Gruppe an Metalloproteinen, die als Superoxid-dismutasen bekannt sind, katalisieren die oxidative Reduktionsreaktion von freien Sauerstoffradikalen nach dem folgenden Reaktionsmechanismus
 
 2O2- + 2H<+  >-> H2O2 + O2
 
 Diese Superoxid-dismutasen stellen also einen Abwehrmechanismus gegen die Toxizität des Sauerstoffes dar. 



  Es gibt verschiedene bekannte Formen von Superoxid-dismutasen, die unterschiedliche Metalle und  unterschiedliche Proteine enthalten. Zu den Metallen, die in diesen Superoxid-dismutasen enthalten sind, gehören Eisen, Mangan, Kupfer und Zink. Alle bekannten Formen der Superoxid-dismutasen katalisieren die gleiche Reaktion. Diese Enzyme werden in verschiedenen Gruppen der Evolutionsreihe gefunden. 



  Superoxid-dismutasen, die Eisen enthalten, sind hauptsächlich in prokaryotischen Zellen anzutreffen. 



  Superoxid-dismutasen, die Kupfer und Zink enthalten, werden in praktisch allen eukaryotischen Organismen gefunden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Steinman, H.M. in "Superoxide Dismutase", Verlag Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), Seiten 11-68 (1982) verwiesen. 



  Superoxid-dismutasen, die Mangan enthalten, wurden in Organismen gefunden, die von Mikroorganismen bis zu menschlichen Lebewesen reichen. 



  Jedes biologische Makromolekül kann das Produkt sein, das durch überflüssige Superoxid-Radikale beschädigt wird und deshalb hat man sich für die therapeutischen Möglichkeiten der Verwendung von Superoxid dismutase bereits interessiert. In der wissenschaftlichen Literatur wird vorgeschlagen, dass Superoxid-dismutase in einem weiten Bereich von klinischen Anwendungen nützlich sein kann. Zu diesen klinischen Anwendungen gehört die Verhinderung einer Onkogenese, also die Verhinderung einer Geschwürsbildung, und die Verhinderung der Bildung von Tumoren, sowie ferner eine Verminderung der cytotoxischen und cardiotoxischen Wirkungen von Antikrebsmitteln. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Oberley, L.W. und Buettner, G.R. in Cancer Research 39:1141-49 (1979) verwiesen. 



  Weitere Einsatzgebiete sind die Schützung von ischämischen Geweben, also von blutleeren Geweben, und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Roy, R.S. in Can. J. Physiol. Pharma, 60:1346-52 (1982) verwiesen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Schützung von Spermatozoen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Alvarez, J.G. und Storey, B.T. in Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983) hingewiesen. Ausserdem besteht ein Interesse daran, den Einfluss von Superoxid-dismutase auf den Alterungsprozess zu untersuchen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Talmasoff, J.M., Ono, T. und Cutler, R.G. in Proc. Natl.  Acad. Sci. USA 77:2777-81 (1980) hingewiesen. 



  Die Erforschung der therapeutischen Möglichkeiten von menschlicher Superoxid-dismutase war bisher hauptsächlich durch die begrenzten, zur Verfügung stehenden Mengen dieses Produktes beschränkt. 



  Superoxid-dismutase ist auch deshalb von Interesse, weil sie entzündungshemmende Eigenschaften besitzt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Huber, W. und Menander-Huber, K.B. in Clinics in Rheum. Dis. 6:465-87 (1980) hingewiesen. 



  Es wurde festgestellt, dass von Rindern stammende Superoxid-dismutase (Orgotein) entzündungshemmende Eigenschaften besitzt und derzeit ist diese in bestimmten Teilen Europas als pharmazeutisches Präparat zur Anwendung am Menschen im Handel erhältlich. Dieses Produkt ist auch in den Vereinigten Staaten als pharmazeutisches Produkt zur veterinärmedizinischen Anwendung erhältlich und es wird insbesondere zur Behandlung von entzündeten Sehnen bei Pferden eingesetzt. Aber auch das Ausmass, in dem Orgotein zur Verfügung steht, ist begrenzt. Nach den bisher bekannten Verfahren wurde dieses Produkt aus Rinderzellen oder anderen tierischen Zellen gewonnen, aber diese Arbeitsverfahren sind drastischen  Einschränkungen unterworfen und das so erhaltene Orgotein kann bei Menschen allergische Reaktionen hervorrufen, weil dieses Produkt nicht menschlichen Ursprungs ist. 



  Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase, die in der Folge als CuZn SOD abgekürzt wird, ist die am häufigsten untersuchte und am besten beschriebene Form der verschiedenen Formen der Superoxid-dismutase. 



  Die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid dismutase ist ein dimeres Metallisch-O-Protein, das aus identischen nicht kovalent gebundenen Untereinheiten aufgebaut ist, wobei jede dieser Untereinheiten ein Molekulargewicht von 16 000 Dalton aufweist und ein Atom Kupfer und ein Atom Zink enthält. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Hartz, J.W. und Deutsch, H.F. im J. Biol. Chem. 247:7043-50 (1972) verwiesen. Jede dieser Untereinheiten ist aus 153 Aminosäuren zusammengesetzt und die Aminosäuresequenz wurde ebenfalls bereits aufgeklärt.

   Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. und Deutsch, H.F., in Biochemistry 19:2310-16 (1980), sowie auf die Veröffentlichung von Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. und Bossa, F. in FEBS  Letters 120:53-56 (1980) hingewiesen. 



  Die komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, die in der Folge mit cDNA abgekürzt wird, welche die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase kodiert, wurde kloniert. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2808-11 (1982) verwiesen. Die vollständige Aminosäuresequenz der geklonten DNA wurde auch bereits aufgeklärt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5465-69 (1983) hingewiesen. 



  Ausserdem wurden auch schon die Expressions-vektoren beschrieben, welche eine DNA enthalten, die für Superoxid-dismutase kodiert ist und ferner wurde auch die Herstellung und Gewinnung von Superoxid-dismutase in Bakterien bereits beschrieben. Es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 131 843 A1 verwiesen, die am 23. Januar 1985 veröffentlicht wurde und die der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 107 717.5 entspricht, welche am 3. Juli 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität der am 15. Juli 1983 eingereich ten USA Anmeldung Serial No. 514 188. Des weiteren sei auf die Veröffentlichung von Hallewell, et al., in Nucleic Acids Res. 5, (1985) hingewiesen. 



  Des weiteren ist die Expression einer Superoxid-dismutase-DNA und die Herstellung von Superoxid dismutase in Hefe ebenfalls bereits beschrieben worden und es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung 0 138 111 A1, die am 24. April 1985 veröffentlicht wurde, hingewiesen, welche der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 111 416.8 entspricht, die am 25. September 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität vom 3. Oktober 1983 der USA Patentanmeldung Serial No. 538 607 und der Priorität vom 11. Mai 1984 der USA Patentanmeldung Serial No. 609 412. 



  In jüngster Zeit wurde auch die Genstelle für CuZn SOD auf dem menschlichen Chromosom 21 beschrieben und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung im EMBO Journal, Band 4, Nr. 1, Seiten 77-84 (Januar 1985) hingewiesen. Die neuesten Entwicklungen im Zusammenhang mit der Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase wurden in dem Abstract der vierten internationalen Konferenz über Superoxide und Superoxid-dismutase zusammengefasst, die in Rom, Italien, im Zeitraum vom 1.-6. September 1985 abgehalten wurde. 



  Wesentlich weniger ist jedoch über die Mangan Superoxid-dismutase, die in der Folge auch mit MnSOD abgekürzt werden wird, bekannt. Die MnSOD von  Escherichia coli K-12 wurde kürzlich kloniert und in das Verzeichnis aufgenommen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Touati, D., im Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983) verwiesen. Barra et al. beschreiben eine Sequenz von 196 Aminosäuren für das MnSOD-Polypeptid, das aus menschlichen Leberzellen isoliert worden war. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984) verwiesen.

  Die bisherigen Veröffentlichungen unterscheiden sich jedoch bezüglich der Struktur des MnSOD-Moleküls, und zwar insbesondere dahingehend, ob dieses zwei identische oder vier identische Polypeptid Untereinheiten aufweist. Es sei in diesem Zusammenhang auf die gerade oberhalb genannte Veröffentlichung von Barra hingewiesen und ferner auf die Veröffentlichung von McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. und Salin, M.L. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michaelson, A.M., McCord, J.M., und Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 129-138 (1977) verwiesen. Es ist jedoch klar, dass das MnSOD-polypeptid und das CuZn-Sod-Polypeptid nicht homolog sind und in  diesem Zusammenhang sei auf die erwähnte Veröffentlichung von Barra verwiesen.

  Die Homologien der Aminosäuresequenz von verschiedenen MnSOD und FeSOD, die aus verschiedenen Quellen stammten, wurden miteinander verglichen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) hingewiesen. 



  Baret et al. beschreiben in einem Rattenmodell, dass die Halbwertzeit von menschlichem MnSOD wesentlich länger ist, als die Halbwertzeit von menschlichem Kupfer-SOD. Diese Autoren beschreiben auch, dass in dem Rattenmodell menschliche MnSOD und Ratten-Kupfer-SOD nicht wirksam sind als entzündungshemmende Mittel,  während  die  Kupfer-SOD  von  Rindern  und  die menschliche Kupfer-SOD vollständig aktiv sind. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Baret, A., Jadot, G., und Michelson, A.M., in Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (September 1, 1984) hingewiesen. 



  McCord et al. beschreiben, dass die natürlich vorkommende menschliche MnSOD, also die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase die menschlichen phagocytierenden  polymorphonuklearen Leukocyten, die in der Folge als PMN-Leukocyten abgekürzt werden, gegen freie Superoxid-Radikale besser schützt, als die von Rindern stammende oder die von Schweinen stammende Kupfer-Zink-Superoxiddismutase, wobei diese Ergebnisse durch in vitro Tests gewonnen wurden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Salin, M.L., im Buch "Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes", Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. Verlag, Seiten 257-264 (1977) hingewiesen. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft ein Desoxiribonucleinsäure-Molekül, das in der Folge als cDNA-Molekül abgekürzt wird, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Kloning-vehikel, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten und welche zur Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben oder der Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet sind. Zellen, beispielsweise Zellen einzelliger Lebewesen, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten, sind zur Herstellung des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben, beziehungsweise zur Herstellung von menschlichem Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet, und bevorzugte derartige einzellige Organismen sind Bakterien. 



  Wenn das menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptid, komplexiert mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen vorliegt, dann stellt dieses Produkt ein Enzym dar, welches die Aktivität der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase aufweist. Die entsprechenden Enzyme können als Wirkstoff in pharmazeutischen Präparaten zur Verwendung  in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin eingesetzt werden. Die entsprechenden pharmazeutischen Präparate sind in der Lage, um Schädigungen bei der Wiederdurchblutung nach einer Blutleere, also Schäden bei der Reperfusion nach einer Ischämie, zu vermindern. Mit Hilfe entsprechender pharmazeutischer Präparate kann eine verlängerte Lebenszeit von entfernten und isolierten Organen gewährleistet werden. 



  Des weiteren sind pharmazeutische Präparate, welche die entsprechenden Enzyme als Wirkstoff enthalten, zur Behandlung von Entzündungen geeignet. 



  Die Erfindungsgegenstände werden nun näher erläutert. 



  Ein DNA-Molekül, welches cDNA enthält, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde aus menschlichen T-Zellen-cDNA-Bruchstücken (T-cell library) isoliert. Die Aminosäuresequenz des Nucleotides eines doppelsträngigen DNA-Moleküles, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde gefunden. Die Aminosäuresequenz eines Stranges, der das Polypeptid oder ein Analoges desselben codiert, ist in Fig. 1a und 1b dargestellt, und zwar reicht sie dort vom Nucleotid 115 hinunter bis zum Nucleotid 708. Andere Sequenzen, die das Analoge oder eine Mutante codieren, können im wesentlich ähnlich dem Strang sein, der das Polypeptid codiert.

  Die Nucleotid Sequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches ein 24 Aminosäuren umfassendes Prepeptid codiert, ist ebenfalls in Fig. 1a  dargestellt, und zwar reicht diese Aminosäuresequenz im Nucleotid von der Aminosäure 43 bis einschliesslich zur Aminosäure 114. 



  Das doppelsträngige cDNA-Molekül oder irgend ein anderes doppelsträngiges DNA-Molekül, welches einen Nucleotidstrang enthält, der eine Sequenz aufweist, die das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, kann in ein Klonierungs-Vehikel einverleibt werden und als Beispiels für ein Klonierungs-Vehikel sei ein Plasmid oder ein Virus genannt. Entweder kann das DNA-Molekül in eine Zelle eingefügt werden, und zwar entweder eine procaryotische Zelle, beispielsweise eine bakterielle Zelle, oder eine eukaryotische Zelle, beispielsweise eine Hefezelle oder Säugetierzelle, indem man bekannte Methoden anwendet. Zu diesen bekannten Methoden gehört die Anwendung eines Klonierungs-Vehikels, das beide Moleküle enthält, die Erfindung sei jedoch nicht auf diese Methode beschränkt. 



  Vorzugsweise wird die cDNA oder die DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert in ein Plasmid einverleibt, beispiels weise in pMSE-4 oder pMS DELTA RB4, und dann in eine geeignete Wirtzelle eingefügt, in der die Expression der DNA erfolgen kann und das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben produziert wird. Die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase wird in der Folge auch als hMnSOD abgekürzt. 



  Zu den bevorzugten Wirtzellen gehören Escherichia coli, sind zwar insbesondere Escherichia coli A4255 und Escherichia coli A1645. Das Plasmid pMSE-4 in dem Escherichia coli Stamm A4255 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. 53250 hinterlegt. 



  Das Plasmid pMS DELTA RB4 kann so erhalten werden, wie dies in Fig. 4 gezeigt wird. Dieses in Fig. 4 veranschaulichte Verfahren wird später noch näher erläutert. 



  Zellen, in welche solche DNA-Moleküle eingeführt worden waren, können nach Verfahren gezüchtet oder kultiviert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, wobei man geeignete Bedingungen anwendet, die eine Transkription der DNA in die messenger Ribonucleinsäure, welche in der Folge mit mRNA abgekürzt  wird und eine Expression der mRNA als Protein erlaubt. Das so gebildete Mangan-Superoxid-dismutase Protein kann dann gewonnen werden. 



  Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Anwendung in der Veterinärmedizin und in der Humanmedizin geeignet sind und die die menschliche Mangan-Superoxiddismutase, also das menschliche MnSOD oder Analoge oder Mutanten desselben enthalten, können ebenso hergestellt werden und derartige pharmazeutische Präparate enthalten im allgemeinen als weitere Komponente ein Trägermaterial. Diese pharmazeutischen Präparate, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder Mutanten derselben enthalten, können eingesetzt werden, um die folgende Reaktion zu katalysieren:
 
 2O2- + 2H <+> -> H2O2 +O2
 



  Durch die Katalysierung dieser Reduktion werden Zellschädigungen vermindert, die durch Superoxid Radikale hervorgerufen werden. 



  Insbesondere können diese Enzyme oder Analoge oder Mutanten derselben verwendet werden, um Schäden zu vermindern, welche bei einer Wiederdurchblutung nach einer Blutleere auftreten, also bei einer Reperfusion  nach einer Ischämie, und um die Überlebenszeit von entnommenen isolierten Organen zu erhöhen oder um Entzündungen zu behandeln. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder von Analogen oder Mutanten derselben in Bakterienzellen. Die Bakterienzelle enthält die DNA-Sequenz und ist in der Lage, die Expression der DNA-Sequenz hervorzurufen, die für die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges oder eine Mutante derselben kodiert ist. 



  Bei diesem Verfahren stellt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen und in einem Produktionsmedium. Dieses Produktionsmedium enthält als Zusatz eine Menge an Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration an diesen Manganionen, die der Zelle in dem Medium zur Verfügung steht, höher als 2 ppm ist. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli, die ein Plasmid enthält, welches eine DNA-Sequenz enthält, welche für das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert ist,  beispielsweise für pMSE-4 oder pMS RB4 in dem Escherichia coli Stamm A4255. Die Konzentration an den Manganionen in dem Produktionsmedium liegt in diesem Fall vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm, wobei Konzentrationen im Bereich von 150 bis 750 ppm speziell bevorzugt sind. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben aus Bakterienzellen, welche diese Dismutase enthalten. Dabei werden im allgemeinen die Zellen zuerst einer Behandlung unterworfen, um eine Proteinfraktion zu erhalten, die Proteine enthält, welche in den Zellen anwesend sind, und zwar einschliesslich der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutanten derselben. Diese Proteinfraktion wird dann weiterbehandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu erhalten. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zuerst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand zu isolieren und dabei werden die löslichen Proteine gewonnen. Die löslichen Proteine werden  dann weiterbehandelt um eine Fraktion des löslichen Proteins abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-oxydase, abgekürzt als hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante derselben enthält. Diese Abtrennung der gewünschten Fraktion kann beispielsweise durch Ausfällung erfolgen. Diejenige Fraktion, welche die hMnSOD oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält, wird gewonnen. Diese gewonnene Fraktion an löslichen Proteinen wird dann weiterbehandelt, um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen. 



  Eine speziell bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben aus Bakterienzellen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthalten. Bei diesem Verfahren werden zuerst die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium abgetrennt und dann in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist. 



  Anschliessend werden dann die Zellen aufgebrochen und zentrifugiert und das dabei gebildete überstehende Material wird dann während etwa 30 bis  120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von 55-65 DEG C erhitzt. Vorzugsweise erhitzt man während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C und speziell bevorzugt eine Stunde lang auf eine Temperatur von 60 DEG C. Anschliessend wird dann auf eine Temperatur von unterhalb von 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf 4 DEG C. Irgend ein Niederschlag, der sich dabei gebildet hat, muss entfernt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, und das gekühlte darüber stehende Material wird dann gegen einen geeigneten Puffer dialysiert. Als Beispiel für einen geeigneten Puffer sei ein 2 mN Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von etwa 7,8 genannt. 



  Vorzugsweise wird die Dialyse durch eine Ultrafiltration durchgeführt, indem man eine Filtrationsmembran von kleiner als 30K verwendet. Gleichzeitig mit der Dialyse oder nach der Dialyse kann das gekühlte darüber stehende Material gegebenenfalls bis zur Erreichung eines geeigneten und angenehm zu handhabenden Volumens konzentriert werden, beispielsweise auf 0,03 des Ausgangsvolumens. 



  Das Retentat wird dann auf einer Anionaustausch-chromatographiesäule mit einer geeigneten Pufferlösung eluiert, beispielsweise einer Lösung aus minde stens 20 mM Kaliumphosphatpuffer, die einen pH-Wert von 7,8 aufweist. Diejenigen Fraktionen des Eluates, welche Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt und dann gegen einen etwa 40 mM Kaliumacetatpuffer eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. 



  Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden dann durch eine Kationaustauscherchromatographiesäule eluiert, die einen linearen Gradienten von etwa 40 mM bis etwa 200 mM Kaliumacetat und einen pH-Wert von 5,5 aufweist. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt. 



  Gegebenenfalls können die vereinigten Peakfraktionen dann gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung aus einem etwa 10mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die gereinigte enzymatisch aktive menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder Analoge derselben, beispielsweise met-hMnSOD, oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind. 


 Kurze Beschreibung der Figuren 
 



  In Fig. 1a und 1b wird die Aminosäuresequenz der komplimentären Desoxiribonucleinsäure, abgekürzt als cDNA der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht. Diese wird in der Folge auch mit MnSOD cDNA abgekürzt. 



  Fig. 1a und 1b zeigt die Nucleotidsequenz des einen Stranges eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert und ausserdem die 198 Aminosäuresequenz der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase, die der DNA-Sequenz entspricht. Fig. 1a zeigt auch die Nucleotidsequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welche ein Präpeptid für die reife menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, wobei dieses Präpeptid aus 24 Aminosäuren besteht und eine Aminosäuresequenz aufweist, die derjenigen der DNA-Sequenz entspricht. Es werden ferner Teile der 5 min  und 3 min untranslatierten Sequenzen dargestellt. 



   Das Plasmid pMS8-4, welches die MnSOD auf einer mit R1 bezeichneten EcoRI Einfügung enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI abgebaut. Das grosse Fragment, das bei diesem Restriktionsabbau gebildet wurde, wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomer in der in Fig. 2 dargestellten Weise verbunden. Das grosse Fragment erstreckt sich von der NdeI Restriktionsstelle in der Stellung "8 Uhr" auf dem pMS8-4 zu der NarI Restriktionsstelle, die sich in der Stellung "3 Uhr" auf dem Plasmid pMS8-4 befindet. Dieses Restriktionsfragment enthält das Ampicillin-resistenz-gen und ausserdem die meisten der MnSOD-gene. Dieser Restriktionsabbau hat die 5 min  untranslatierte Region und die Präpeptid kodierende Region des MnSOD-genes entfernt. Dieser Restriktionsabbau hat ebenfalls ungefähr 36 Basenpaare der kodierenden Region des reifen MnSOD-Polyeptides entfernt.

  Diese fehlenden Basenpaare, welche das reife MnSOD kodieren, wurden durch die Ligation an den synthetischen Linker eingeführt, welcher in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das erhaltene Plasmid pMS8-NN enthält die kodierende Region für das reife MnSOD und  vor dieser ein ATG-Initiationskodon. 



  Das oben erwähnte Plasmid pMS8-NN wurde mit EcoRI abebaut oder verdaut, die Enden wurden gefüllt indem man das Klenow-fragment der Polymerase 1 verwendete und dann weiter mit NdeI gespaltet. 



  Das kleine Fragment beherbergt das MnSOD-gen, angeordnet zwischen der eingefüllten EcoRI-Stelle und der NdeI-Stelle und dieses kleine Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment entspricht dem für MnSOD kodierenden Bereich. 



  Dieses Fragment wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI und StuI behandelt worden war. 



  Die Behandlung von PSOD alpha 13 mit NdeI und StuI und die nachfolgende Isolierung des grossen Fragments führt zu einem Fragment, welches die  lambda PL Promoterseguenz, die cII-ribosomale Bindungsstelle, das Ampicillin-resistanz-gen und die meisten CuZn SOD-gene enthält. 



  Das CuZn SOD-gen fehlt jedoch in dem kodierenden Bereich für das 5 min  Ende des Gens, weil dieses durch die Restriktionsspaltung und  die nachfolgende Isolierung des grossen Fragmentes entfernt worden war. 



  Das MnSOD-gen von pMS8-NN wurde zwischen die NdeI und StuI-Stellen von pSOD alpha 13 eingefügt. Das pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 vom 5. März 1986, die der USA Patentanmeldung Serial No. 644 245 entspricht, beschrieben ist. Durch diese Ligation wurde das Plasmid pMSE-4 gebildet, das den MnSOD kodierenden Bereichen enthält und vor diesem liegen die cII-ribosomale Bindungsstelle und unter der Kontrolle des  lambda  Pl-Promoters. Das Plasmid pMSE-4 ist am 25. Sept. 1985 bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt worden. 



  In Fig. 3 wird der Einfluss der Konzentration an Manganionen auf die Aktivität der Superoxid-dismutase veranschaulicht, die in dem Mikroorganismus Escherichia coli gebildet wird. 



  In dieser Fig. 3 ist auf der Abszisse die Konzentration an Manganionen, nämlich an Mn<+><+> in dem Zuchtmedium in ppm angegeben. Diese reicht von 0 ppm bis 600 ppm. Auf der Ordinate der Fig. 3 sind die spezifischen Superoxid-dismutase Aktivitätseinheiten pro mg des löslichen Proteines angegeben. 



  Das Diagramm der Fig. 3 zeigt also den Zusammenhang zwischen der spezifischen Aktivität, angegeben in Einheiten pro mg des rekombinierten löslichen MnSOD, das von dem Escherichia coli Stamm A4255 gebildet wurde, der das Plasmid pMSE-4 enthält. In dieser Figur sind sowohl die entsprechenden Einheiten für Nichtinduktion (bei 32 DEG C) angeführt, es handelt sich dabei um die entsprechenden nicht strichlierten Säulen, und des weiteren sind in dieser Figur die Ergebnisse unter den Be dingungen einer Induktion bei 42 DEG C angeführt. Dabei handelt es sich um die entsprechenden strichlierten Flächen. Die Konzentration an den Ionen des zweiwertigen Mangans in dem Wachstumsmedium ist wie erwähnt in ppm, also in Teilen pro Million angeführt. 



  In Fig. 4 ist der Aufbau von pMS  DELTA  RB4, nämlich des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Expressionsplasmides veranschaulicht. 



  Der Tet<R>-Expressionsvektor, p DELTA RB wurde aus dem pSOD beta 1T-11 gebildet, indem man das pSOD beta 1T-11 vollständig mit EcoRI abbaute und anschliessend eine teilweise Spaltung mit den BamHI-Restriktionsenzymen durchführte. 



  Das grosse Fragment, das durch diesen Abbau gebildet worden war, wurde isoliert und an ein synthetisches Oligomer gebunden, dessen Sequenz wie folgt war:
 
 5 min  - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min 
 
 3 min  - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min 
 



  Dadurch erhielt man p DELTA RB, welches den  lambda Pl Promoter enthält. Das grosse EcoRI/BamHI Restriktionsfragment, das bei diesem Abbau gebildet wird, erstreckt sich von der EcoRI-Stelle, die in der pSOD  beta 1T11-Restriktionskarte in Stellung "12 Uhr" dargestellt ist, in der Gegenuhrzeigerrichtung bis zu der BamHI-Stelle, die in der pSOD 1T11-Restriktionskarte in der "5 Uhr" Stellung dargestellt ist. Das pSOD beta 1T11 ist bei der American Type Culture Colection 3. März 1986 unter der Accession No. 53 468 hinterlegt worden. 



  Das EcoRI-Fragment vom pMSE-4 wurde erhalten, indem man pMSE-4 mit EcoRI abbaut und das kleine Fragment isoliert, das bei diesem Abbau gebildet wird. Dieses Fragment ist das Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält und es erstreckt sich auf der pMSE-4-Restriktionskarte von der Stelle EcoRI in  der Stellung "1 Uhr" zu der Stelle EcoRI in der Stellung "3 Uhr" auf der pMSE-4-Restriktionskarte. Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches die cII-ribosomale Bindungsstelle und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzyms enthält, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von p DELTA RB eingeführt. Das erhaltene Plasmid pMS RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von  lambda Pl und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin. 



  In der Folge wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen beschrieben. 



  Ein doppelsträngiges Desoxiribonucleinsäuremolekül, das in der Folge mit DNA-Molekül abgekürzt wird, und das komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, umfasst, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, wurde isoliert. Diese komplimentäre Desoxiribonucleinsäure wird in der Folge mit cDNA abgekürzt. Das erwähnte doppelsträngige DNA-Molekül wurde aus einem menschlichen T-Zellen-cDNA-genetischem Material oder Abschnitt mit der englischen Bezeichnung "human T-cellcDNA library" isoliert. Unter dieser englischen Bezeichnung versteht man eine Sammlung von Escherichia coli Bakterien oder Bakteriophagen  lambda , welche die cDNA-Abschnitte oder Einfügungen enthält, die durch die  Messenger-RNA (abgekürzt als MRNA) synthetisiert wurden, die aus menschlichen T-Zellen isoliert wurde. 



   Die Nucleotidsequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert oder ein Analoges oder eine Mutante desselben kodiert, wurde gefunden. 



  Die Sequenz des einen Stranges des DNA-Moleküls, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben kodiert, ist in Fig. 1a und b dargestellt und diese Sequenz umfasst die Nucleotide mit den Zahlen 115 bis einschliesslich 708. 



  Die Sequenz des einen Stranges, der ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase- Polypeptides, das in der Folge als hMnSOD-analoges bezeichnet wird oder eine Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, ist im wesentlichen ähnlich demjenigen Strang, der das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid, das in der Folge mit hMnSOD-polypeptid abgekürzt wird, kodiert. 



  Die Nucleotidsequenz des Präpeptides der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ist ebenfalls in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die Nucleotide der Zahlen 43 bis einschliesslich 114 kodieren dieses Präpeptid. 



  Die Methoden zur Herstellung der cDNA und zur Bestimmung der Sequenz der DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und sie werden in der Folge noch genauer beschrieben. Da  jetzt die DNA-Sequenz aufgeklärt wurde, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, können ausserdem bekannte synthetische Verfahren angewandt werden, um DNA-Moleküle herzustellen, die Teile dieser Sequenz enthalten. 



  Übliche Kloning-vehikel, wie Plasmide, beispielsweise pBR322, oder Viren oder Bakteriophagen, beispielsweise  lambda , können modifiziert oder hergestellt werden, indem man bekannte Arbeitsverfahren anwendet, die geeignet sind, um neue Kloning-vehikel herzustellen, welche eine cDNA enthalten, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase Polypeptid oder Analoge desselben oder Mutanten desselben, kodieren. 



  In ähnlicher Weise können derartige Kloning-vehikel so modifiziert oder so erzeugt werden, dass sie DNA-Moleküle enthalten, von denen ein Strang ein Segment enthält, welches die in Fig. 1a und b dargestellte Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist oder Segmente, die im wesentlichen ähnlich diesen dargestellten Segmenten sind. Die eingefügten DNA-Molekule können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden, einschliesslich einer enzymatischen oder chemischen Synthese. 



  Die erhaltenen Kloning-vehikel sind chemische Einheiten, die in der Natur nicht vorkommen und die nur durch moderne Technologie erzeugt werden können, die als Rekombination-DNA-Technologie bezeichnet wird. Vorzugsweise ist das Kloning-vehikel ein Plasmid, beispielsweise pMSE-4 oder pMS DELTA RB4. Diese Kloning-vehikel können in Zellen eingefügt werden, und zwar entweder in procaryotische Zellen, beispielsweise Bakterienzellen, wie zum Beispiel diejenigen von Escherichia coli, von Bacillus subtilis, und ähnliche Bakterienzellen, oder sie können in eukaryotische Zellen einverleibt werden, wie zum Beispiel in die Zellen von Hefe oder Säugetieren, indem man Arbeitstechniken anwendet, die für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, wie zum Beispiel eine Transformation, eine Transfektion und ähnliche Arbeitsweisen. 



  Diejenigen Zellen, in welche die Kloning-vehikel eingeführt sind, enthalten dementsprechend cDNA, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, wenn diese cDNA in dem Kloning-vehikel anwesend war oder sie werden eine DNA enthalten, welche einen Strang, und zwar einen gesamten Strang oder einen  Teil des Stranges enthält, welcher die Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist, die in Fig. 1a und b dargestellt wird oder eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen ähnlich dieser Sequenz ist, wenn eine solche DNA in dem Kloning-vehikel anwesend war. 



  Die Zellen von Escherichia coli sind die bevorzugten Wirtzellen für die erfindungsgemässen Kloningvehikel. Als der im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugte auxotrophische Stamm der Escherichia coli ist der Stamm A1645, der bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt wurde, welcher das Plasmid pApoE-Ex2 enthält und welcher unter der ATCC Accession No. 39 787 hinterlegt ist. Alle Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection, die in den vorliegenden Unterlagen erwähnt werden, wurden in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag der International Anerkennung von hinterlegten Kulturen von Mikroorganismen durchgeführt. 



  Das A1645 wurde aus A1637 durch Selektion auf Gal<+>, d.h. durch Selektion auf die Fähigkeit, Galaktose abzubauen, erhalten und auch durch einen Verlust der Tetracyclin-resistenz. Es enthält immer noch Elemente  der Phage  lambda . Sein Phenotyp ist c600 r<-> m<+> gal<+> thr<-> leu<-> lacZ-bl ( lambda cI857  DELTA  Hl  DELTA  BamHl N<+>). 



  A1637 wurde aus dem C600 erhalten, indem man Transposon, welches ein Gen für Tetracyclin-resistenz enthält, in das Galactose-Operon einführt und ausserdem Elemente der Phage  lambda  einfügt, einschliesslich derjenigen Elemente, die verantwortlich sind für die Synthese des cI Repressors. C600 kann bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 23 724 bezogen werden. 



  Die prototrophischen Stämme von Escherichia coli, welche ein hohes Ausmass der Expression des Polypeptides sogar dann ermöglichen, wenn sie in einem minimalen Medium gezüchtet werden, sind als Wirtzellen für die Expression des Gens, welches Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, noch mehr bevorzugt. Ein im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugter prototrophischer Stamm ist A4255. Der Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt. 



  Die erhaltenen Zellen, in die eine DNA eingefügt worden war, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben  oder eine Mutante desselben kodiert, können behandelt werden, beispielsweise gezüchtet werden oder vermehrt werden, wie dies unter geeigneten Bedingungen für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, sodass die DNA die Expression der genetischen Information richtet, die durch die DNA kodiert wurde. Diese DNA dirigiert beispielsweise die Expression des hMnSOD-Polypeptides oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und die Zelle führt dementsprechend zur Expression von hMnSOD-Polypeptid oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und diese Produkte können dann gewonnen werden. 



   In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Superoxid-dismutase", bzw. die Abkürzung "SOD" ein Enzym oder ein Polypeptid, welche auf Superoxid oder freie Sauerstoffradikale als Rezeptor wirkt oder welche die folgende Dismutationsreaktion katalysiert:
 
 2O2- + 2H<+ >->  O2 + H2O2
 



  Der Ausdruck "Mangan-Superoxid-dismutase", bzw. die entsprechende Abkürzung "MnSOD", bedeutet in der vorliegenden Beschreibung irgend ein beliebiges Superoxid-dismutase Molekül, welches das chemische Element Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen enthält. 



  In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutase-Polypeptid", bzw. die entsprechende Abkürzung "hMnSOD" ein Polypeptid aus 198 Aminosäuren, von dem ein Teil der Aminosäuresequenz ln Fig. 1a und b dargestellt ist. Das Stickstoffende, also der N-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist. 



  Der Ausdruck "Polypeptid-Mangan-Komplex" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches ein menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid in einem Komplex mit Mangan in irgend einer chemischen Formel enthält und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Der Ausdruck "menschliche Mangan-Superoxid-dismutase" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptide in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der  natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Der Ausdruck "Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid umfasst, an welches an eines der beiden Enden oder an beide Enden der Aminosäuresequenz eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren gebunden sind. 



  In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "Analoges des Polypeptid-ManganKomplexes" ein Molekül, welches einen Polypeptid-Mangan-Komplex umfasst, wobei der Polypeptidanteil dieses Komplexes ein oder mehrere zusätzliche Aminosäuren umfasst, die an eines der beiden Enden oder an beide Enden des Polypeptides gebunden sind. 



  Unter dem Ausdruck "Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, das mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines der beiden ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, und zwar in Form eines Komplexes mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen und  welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Unter dem Ausdruck "Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen identisch mit derjenigen des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, wobei sich diese Aminosäuresequenz jedoch von diesem Polypeptid durch ein oder mehrere Aminosäuren unterscheidet. 



  Unter dem Ausdruck "Mutante des Polypeptid-Mangan-Komplexes" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Unter dem Ausdruck "Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines dieser Polypeptide eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit  Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen ist und dabei dieser Komplex die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Die Mutanten des hMnSOD-Polypeptides und des hMnSOD, die einen Teil des Erfindungsgegenstandes darstellen, können hergestellt werden, indem man die DNA-Sequenz, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, mutiert, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 kodiert ist und das Carboxylende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz, durch die Nucleotide 706-708 kodiert ist. 



  Die DNA kann nach Methoden mutiert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind und es sei in diesem Zusammenhang beispielsweise auf die Veröffentlichung von Bauer et al., in Gene 37: 73-81 (1985) hingewiesen. Die mutierte Sequenz kann nach dem hier beschriebenen Verfahren in geeignete Expressions-vektoren eingefügt werden, und diese Expressions-vektoren können wieder in Zellen eingefügt werden, die dann so behandelt werden, dass die mutierte DNA die Expression der hMnSOD-Polypeptide-Mutanten und die Expression der hMnSOD-Mutanten dirigiert. 



  Man nimmt an, dass die enzymatisch aktive Form der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ein Protein ist, das mindestens zwei und möglicherweise vier identische Untereinheiten aufweist, von denen jede ungefähr 198 Aminosäuren in derjenigen Sequenz aufweist, die in Fig. 1a und b für die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht ist, wobei das Stickstoffende, also der N-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist. 



  Menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können von Zellen gebildet werden, in welche die DNA oder die cDNA, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ihre Analogen oder ihre Mutanten kodiert, eingebracht worden ist. Die menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können verwendet werden, um die Dismutation oder die einwertige Reduktion von Superoxidanionen in Anwesenheit von Protonen unter Bildung von Wasserstoffperoxid zu katalysieren und die entsprechende Reaktion ist anhand der folgenden Gleichung veranschaulicht: 
EMI46.1
 



   Pharmazeutische Präparate zur Anwendung in der Veterinärmedizin oder der Humanmedizin können auch hergestellt werden, die als Wirkstoff hMnSOD oder einen oder mehrere Analoge oder Mutanten der hMnSOD enthalten und vorzugsweise ausserdem ein geeignetes Trägermaterial. Derartige Trägermaterialien sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt. 



  Entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante desselben enthalten, können direkt verabreicht werden oder sie können mit Hilfe von weiteren Zusätzen zu entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die dann zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten oder tierischen Patienten geeignet sind. Entsprechende pharmazeutische Präparate können verwendet werden, um Entzündungen zu bekämpfen oder um Schäden zu vermindern, die von freien Sauerstoffradikalen bei der erneuten Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der auf eine Ischämie folgenden Reperfusion auftreten können oder bei einer Organtransplantation. 



  In diesen Fällen kann das hMnSOD oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben  direkt, also ohne weitere Zusätze, oder in Form einer Zusammensetzung dem Durchspülungsmedium, also dem Perfusionsmedium, zugesetzt werden, mit dem ein isoliertes Organ durchspült wird, wobei dadurch Schädigungen des isolierten Organes durch sauerstoff-freie Radikale bei der Perfusion nach der Isolierung des Organes vermindert werden und somit die Überlebenszeit des isolierten Organes verlängert wird. 



  Des weiteren können entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben enthalten, verwendet werden, um neurologische Schäden zu vermindern, die bei der neuerlichen Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der Reperfusion anschliessend an eine Ischämie auftreten können und die entsprechenden pharmazeutischen Präparate können auch eingesetzt werden, um eine Missbildung der Bronchien und der Lunge, also eine Bronchial-pulmonar-dysplasie zu behandeln. 



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben in Bakterienzellen. Bei diesem Verfahren enthält die Bak terienzelle eine DNA Sequenz und sie ist in der Lage, eine Expression einer DNA Sequenz durchzuführen, die die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert. Bei diesem Verfahren belässt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Produktionsmedium. Das Produktionsmedium enthält als Zusatzstoff eine Menge an zweiwertigen Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration in diesen zweiwertigen Manganionen in dem Medium höher gehalten wird als 2 ppm. 



  Die Bakterienzelle kann irgend ein beliebiges Bakterium sein, in welches die DNA-Sequenz, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, eingefügt worden war, indem man Rekombinations-DNA-Techniken angewandt hatte. Dieses Bakterium muss zu einer Expression der DNA-Sequenz geeignet sein und zur Produktion des Proteinproduktes. Die geeigneten Bedingungen und das Produktionsmedium variieren je nach der Spezies und dem Stamm des Bakteriums. 



  Die Bakterienzelle kann die DNA-Sequenz, welche die Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben kodiert, in dem Körper eines Vektor-DNA-Moleküles  enthalten, wie zum Beispiel eines Plasmides. Der Vektor oder das Plasmid wird durch Rekombinations-DNA-Techniken so aufgebaut oder konstruiert, dass er die Sequenz, welche die Superoxid-dismutase kodiert, an einer geeigneten Stelle in dem Molekül einverleibt hat. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli. Ein bevorzugter auxotrophischer Stamm von Escherichia coli ist A1645. 



  Ein bevorzugter prototrophischer Stamm von Escherichia coli ist A4255. Die erfindungsgemässen Zellen von Escherichia coli enthalten ein Plasmid, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMSE-4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmids wird in der Beschreibung der Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 2 beschrieben. Dieses Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No.53 250 hinterlegt. 



  Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung enthält die Bakterienzelle  das Plasmid pMS DELTA RB4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmides ist in der Beschreibung und in den Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Plasmid kann ausgehend von pSOD beta T-11, welches bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt ist, aufgebaut werden. 



  Gemäss speziellen Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung wird ein enzymatisch aktives Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, der das Plasmid pMSE-4 enthält, sowie durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, die das Plasmid pMS DELTA RB4 enthalten. 



  Das geeignete Produktionsmedium für die Bakterienzelle kann irgend eine Art eines annehmbaren Zuchtmediums sein, wie zum Beispiel ein Casein-hydrolysat-Medium oder ein Luria-Brühe-Medium, welches in der Folge auch als LB-Medium abgekürzt wird. Das letztgenannte Medium ist dabei bevorzugt. 



  Die geeigneten Züchtungsbedingungen hängen von dem Stamm der Escherichia coli und dem Plasmid, das diese enthält, ab. Beispielsweise wird der Stamm  Escherichia coli A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 42 DEG C induziert und bei dieser Temperatur während etwa 1-5 Stunden belassen. Die geeigneten Bedingungen bezüglich der Züchtungstemperatur, der Züchtungszeit, des Rührens und der Belüftung, sowohl bei der Anzucht des Züchtungsmateriales als auch für die Züchtung der Kulturen auf eine geeignete Zelldichte vor der Produktionsphase, sowie ferner auch für die Aufrechterhaltung der Züchtung während des Produktionszeitraumes können variieren und all diese möglichen Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend. 



   Die Konzentration der zweiwertigen Manganionen, also der Mn<+><+> in dem Medium, die nötig ist, um die enzymatisch aktive Mangan-Superoxid-dismutase herzustellen, variiert mit der Art des angewandten Mediums. 



  Es zeigte sich, dass bei einem Zuchtmedium des LB-Typs Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen im Bereich von 150 ppm bis 750 ppm wirksam sind. Es ist bevorzugt, dass in allen komplexen Typen der Wachstumsmedien die Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Medium im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm liegt. 



  Die speziellen Bestandteile für einen  geeigneten Stamm, das Züchtungsmedium, das Impfmedium und das Produktionsmedium können variieren und all diese Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben oder eines Mutanten derselben, und zwar ausgehend von Bakterienzellen, welche diese enthalten. Die Zellen werden zuerst behandelt, um eine Proteinfraktion zu gewinnen, welche Proteine enthält, die in den Zellen anwesend sind und zu diesen Proteinen gehört die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben. Dann wird die Proteinfraktion entsprechend behandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zunächst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand abzutrennen und die löslichen Proteine werden dann gewonnen. Die so gewonnenen löslichen Proteine werden dann behandelt um eine Fraktion der  löslichen Proteine abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält und diese Fraktion wird gewonnen. Die entsprechende Behandlung kann beispielsweise eine Ausfällung sein. Die Fraktion wird dann weiterbehandelt um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen. 



  In der Folge werden speziell bevorzugte Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung beschrieben. 



  Zuerst werden die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium isoliert und in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist. Die Zellen werden dann aufgebrochen und abzentrifugiert. 



  Das überstehende Material wird abgetrennt und während 30 bis 120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von etwa 55-65 DEG C erhitzt, vorzugsweise während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C, und speziell bevorzugt während einer Stunde auf 60 DEG C. Anschliessend an diese Erhitzungsphase wird dann auf eine Temperatur von weniger als 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 4 DEG C. Wenn sich während  dieses Kühlvorganges ein Niederschlag gebildet hat, dann wird dieser entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren und dann wird das gekühlte überstehende Material gegen einen geeigneten Puffer dialysiert. 



  Vorzugsweise wird das gekühlte überstehende Material durch eine Ultrafiltration dialysiert, indem man eine Filtrationsmembran verwendet, die kleiner als 30K ist, und speziell bevorzugt 10K ist. Als Beispiele für einen geeigneten Puffer sei ein 2 MM Kaliumphosphatpuffer genannt, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



  Nach dieser Dialyse oder gleichzeitig mit dieser Dialyse kann das gekühlte überstehende Material gegebenenfalls auf ein geeignetes Volumen konzentriert werden. Beispielsweise hat sich eine Konzentration auf 0,03 des ursprünglichen Volumens des überstehenden Materiales als geeignet herausgestellt. 



  Anschliessend wird das Material auf eine Anionenaustauscher enthaltende Chromatographiesäule aufgebracht, und man eluiert dieses Retentat mit einer geeigneten Pufferlösung, beispielsweise einer Lösung eines 20 mM Phosphatpuffers, die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



  Die Fraktionen des eluierten Materiales, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen, miteinander vereinigt und gegen eine etwa 40 mM Kaliumacetatlösung eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. 



  Diese vereinigten und dialysierten Fraktionen werden dann auf eine mit Kationenaustauscher gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen und man eluiert mit einem linearen Gradienten von etwa 40 mM Kaliumacetatlösung bis etwa 200 mM Kaliumacetatlösung, wobei diese Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufweisen. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt. Gegebenenfalls können dann die vereinigten Peakfraktionen gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung, die etwa 10 mM an Kaliumphosphat ist und die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gereinigte menschliche Mangan-superoxid-dismutase oder Analoge derselben oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind und wobei man im vorliegenden Zusammenhang unter dem Ausdruck "gereinigt" versteht, dass die fraglichen  Produkte im wesentlichen frei von anderen Substanzen menschlichen Ursprungs sind. 



  Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Analoges der menschlichen Mangan-superoxiddismutase, das mindestens zwei Polypeptide aufweist, von denen mindestens eines der Polypeptide diejenige Aminosäuresequenz besitzt, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert wird und das Carboxylatende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert wird und wobei in dieser Aminosäuresequenz ein zusätzlicher Methioninrest an das Stickstoffende der Aminosäuresequenz gebunden ist. Dieses Analoge der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase wird in der Folge mit Met-hMnSOD abgekürzt, wobei in dieser Abkürzung "Met" den zusätzlich gebundenen Methioninrest veranschaulicht.

   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart dieses Produktes weist dieses gereinigte Met-hMnSOD eine spezifische Aktivität von mindestens 3500 Einheiten/mg auf. 



  Die vorliegende Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert. 



  Diese Beispiele sollen lediglich zu einem  noch besseren Verständnis des Erfindungsgegenstandes führen, sie sollen jedoch den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Es sei ferner darauf hingewiesen, dass diese Beispiele keine detaillierten Erläuterungen der üblichen Methoden enthalten, die bei dem Aufbau von Vektoren, der Einfügung von Genen, die für Polypeptide kodiert sind, in derartige Vektoren oder die Einführung der entsprechenden Plasmide in Wirte, bzw. Wirtzellen, betreffen. Die Beispiele enthalten ferner auch keine detaillierte Beschreibung üblicher Methoden, die angewandt werden, um Polypeptide zu testen, die durch derartige Wirt-Vektorsysteme produziert werden oder um die Identität derartiger Polypeptide durch Aktivitäts-Färbeverfahren von isoelektrisch fokussierenden Gelen, die in der Folge als IEF Gele bezeichnet werden, zu bestimmen.

  Derartige Arbeitsmethoden sind nämlich für den Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt und sie sind in vielen Publikationen näher beschrieben, wobei hier als Beispiel auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen sei: 



  T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sombrook, "Molecular Cloning", ein Laboratoriumshandbuch des Cold Spring Harbor Laboratoriums, New York, 1982. 



  J.M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969), sowie C. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971). 


 Beispiel 1 
 



  Um die MnSOD-cDNA-Klone zu identifizieren, wurden gemischte Oligormerproben synthetisiert, und zwar in Übereinstimmung mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz, die in zwei weiter vorne bereits genannten Veröffentlichungen beschrieben ist, und zwar in der Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M., in dem Buch Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) und in der Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984). 



  5 min -Probe - 30-mer-sequenz von AA15-AA24 (siehe diese beiden Veröffentlichungen. 
EMI58.1
 
EMI59.1
 



  3 min -Probe - 32-mer-sequenz von AA179-AA189 (siehe die zweite der beiden genannten Veröffentlichungen) 
EMI59.2
 



  Die 5 min -Probe besteht aus 30 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 15-24 des reifen MnSOD. 



  Die 3 min -Probe besteht aus 32 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 179-189 des reifen MnSOD. 



  Die 5 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 36 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben veranschaulicht wird. 



  Die 3 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 16 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben gezeigt ist. 



   Wenn in dem oben angegebenen Schema mehr als ein Nucleotid in einer vorgegebenen Position gezeigt wird, dann wurde der entsprechende DNA-Strang unter Ver wendung von äquimolaren Mengen jedes der beiden dargestellten Nucleotide synthetisiert und es handelt sich dementsprechend um eine gemischte Probe. 



  Die 5 min -Probe wurde verwendet um 300 000 Plaques einer T-Zelle-cDNA-genetischen Abschnittes (mit der englischen Bezeichnung T-cell cDNA library), der in einer  lambda -gt-10-Vector kloniert ist, zu screenen. Die Hybridisierung an Phagen-plaque-replicas, die auf Nitrozellulosefiltern immobilisiert sind, wurde nach Standard Arbeitsverfahren durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die unmittelbar vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von Maniatis et al. hingewiesen, wobei der Unterschied zu dem dort beschriebenen Verfahren darin bestand, dass die Hybridisierung bei 50 DEG C in 8 x SSC während 16 Stunden durchgeführt wurde. Die Filter wurden dann bei 50 DEG C mit 5 x SSC und 0,1% SDS gewaschen. Drei positive Plaques wurden isoliert und diese wurden als Phi MS8, bzw. als Phi MS1, bzw. als Phi MSlJ bezeichnet. 



  Das EcoRI verdaut die DNA von Phi MS8 und die DNA von Phi MSL und daraus sieht man, dass diese beiden Produkte cDNA-Einfügungen, die auch als cDNA-Inserts bezeichnet werden, aufweisen, die etwa 800 bp  lang sind und die beide mit dem 5 min  und dem 3 min  Oligonucleotid-proben hydridisieren. 



  Das Phi MSlJ trug nur die cDNA-Einfügung oder das cDNA-Insert einer Menge von 450 bp, welches nur mit der 5 min -Endprobe hybridisiert. 



  Die EcoRI-Inserts der drei Phagen-klone wurden in die EcoRI Stelle von pBR322 subkloniert und man erhielt dabei jeweils pMS8-4, bzw. pMS1-4, bzw. pMS1J. 



  Die Restriktionsanalyse und die Hybridisierung mit den 5 min und den 3 min  Oligonucleotid-proben ergaben ähnliche Muster, die auch als Pattern bezeichnet werden, für die beiden Produkte pMS8-4 und pMS1-4. 



  Die in Fig. 5 veranschaulichte Restriktions-karte zeigt die 5 min  -> 3 min  Orientierung, und diese wurde für beide Plasmide deduziert. 



  Die Sequenz des cDNA-Inserts von pMS8-4 ist in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die vorher-gesagte Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der Aminosäuresequenz der am Beginn dieses Beispiels genannten Veröffentlichung von Barra et al. dahingehend, dass an drei Stellen Glu anstelle von Gln aufscheint, und zwar an den Stellen AA 42, 88, 108 und dahingehend, dass zwei zusätzliche Aminosäuren, nämlich Gly und Trp zwischen AA123-124 aufscheinen. 



  Die Sequenzanalyse von pMS1-4 und pMS1J zeigte, dass drei MnSOD-Klone unabhängig abgeleitet wurden und diese Sequenzanalyse bestätigte die Unterschiede zu der früher veröffentlichten Aminosäuresequenz. 



  Die Sequenz oberhalb des Lysines der Stickstoffendgruppe, also des N-terminalen Lysines der reifen MnSOD ermöglicht die Vorhersage einer Präpeptid Sequenz von 24 Aminosäuren. 


 Beispiel 2 
 



  Aufbau des Plasmides, das die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt. 



  Das Plasmid, welches die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt, wird  in der Folge auch als Amp<R>-menschliche MnSOD-Expression Plasmid bezeichnet und als pMSE-4 abgekürzt. 



   Das Ausgangsprodukt für den Aufbau oder die Konstruktion dieses pMSE-4 ist das Plasmid pMS8-4, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. 



  Das Plasmid pMS8-4, welches menschliche MnSOD-cDNA auf einer EcoRI-Einfügung, die auch als EcoRI-Insert bezeichnet wird, enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI verdaut. Das grosse Fragment wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomeren verbunden, wie dies in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das dabei erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS8-NN, das ebenfalls in Fig. 2 dargestellt ist, enthält den kodierenden Bereich für die reife oder endgültige MnSOd, die in der englischsprachigen Literatur als mature MnSOD bezeichnet wird, und vor diesem Bereich befindet sich ein ATG-Initiations-codon. Das oben genannte Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, die Enden wurden mit dem Klenow-fragment der Polymerase I gefüllt und weiter mit NdeI gespalten. 



  Das kleine Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält, wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI  und StuI behandelt wurde. 



  Das genannte pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 beschrieben ist, die am 5. März 1986 veröffentlicht wurde. Alles was dort geoffenbart ist, trifft auch im vorliegenden Fall zu. 



  Dadurch wurde das Plasmid pMSE-4 erzeugt, welches einen die MnSOD kodierenden Bereich enthält, vor dem sich die cII-riosomale Bindungsstelle befindet und unter der Kontrolle des  lambda PL-Promoters. 



  Das Plasmid pMSE-4 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt. Alle Arbeitsmethoden, die bei dem oben beschriebenen Verfahren angewandt werden, sind im wesentlichen die gleichen, wie diejenigen, die in der Veröffentlichung von Maniatis et al., die vor dem Beispiel 1 genannt ist, beschrieben sind. 


 Beispiel 3 
 


 Expression der rekombinanten menschlichen MnSOD 
 



  Das Plasmid pMSE-4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingefügt. Anschliessend wurde der Escherichia coli  Stamm 4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 32 DEG C in einem Luria-Brühe-Medium gezüchtet, wobei das Medium 100  mu g/ml Medium an Ampicillin enthielt. Diese Züchtung wurde so lange durchgeführt, bis die optische Dichte, abgekürzt als "OD" bei 600 nm 0,7 betrug. 



  Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeitabständen wurden Proben genommen und diese wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelen getrennt. Diese Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel Electrophorese wird in der Folge mit "SDS-PAGE" abgekürzt. Aus dieser Gel Electrophorese war ersichtlich, dass der Spiegel an dem gebildeten menschlichen MnSOD bis zu 120 Minuten nach der Induktion anstieg. Zu diesem Zeitpunkt machte das recombinante MnSOD-Protein 27% der gesamten Zellproteine aus. Die entsprechende Bestimmung der Zellproteine wurde durch ein Scanning mit Gel durchgeführt, das mit Coomassie-Blau gefärbt war. 



  Die Ultraschallbehandlung der Proben während 90 Sekunden mit einem W-375-Ultraschallgerät und die Aufteilung der Proteine in lösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als s-Fraktionen bezeichnet werden und in unlösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als  p-Fraktionen bezeichnet werden, erfolgte durch Zentrifugieren unter Anwendung von 10 000 g während eines Zeitraumes von 5 Minuten. Dabei zeigte es sich, dass die geprüfte Menge der gebildeten rekombinanten MnSOD nicht löslich war. 



  Die induzierte lösliche Proteinfraktion enthielt nur etwas mehr an der MnSOD-Aktivität als die Proteinfraktion des nicht induzierten Parallelversuches. Diese Tests wurden nach den Standardmethoden durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von McCord et al. hingewiesen. 



  Offensichtlich ist ein Teil der MnSOD, die sich in der löslichen Fraktion befindet, inaktiv. Dies legt nahe, dass die grösste Menge der menschlichen MnSOD, die unter den Bedingungen dieses Beispiels produziert wird, tatsächlich inaktiv ist. 


 Beispiel 4 
 



  In diesem Beispiel wird der Einfluss der Konzentration an zweiwertigen Manganionen auf die Löslichkeit und die Aktivität der gebildeten MnSOD untersucht. 



  Es wurden zweiwertige Manganionen, also  Ionen Mn<+><+> in ansteigenden Konzentrationen zugegeben, bis ein Gehalt von 450 ppm (450 Teilen pro Million) in dem Wachstumsmedium erreicht war, in welchem der Escherichia coli Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, gezüchtet wurde. Die Zugabe der Manganionen erfolgte vor einer zwei Stunden dauernden Induktion bei 42 DEG C bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,7 und der Zusatz der Manganionen hatte keinen nachteiligen Einfluss auf die Gesamtausbeute an dem menschlichen MnSOD. 



  Nach der Ultraschallbehandlung wurden die löslichen Proteinfraktionen (s) und die nicht löslichen Proteinfraktionen (p) einer Gelelektrophorese auf eine Natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamidgel unterworfen. Diese Gelelektrophorese zeigte, dass die Löslichkeit des rekombinanten Proteines anstieg, wenn die Löslichkeit der zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium gesteigert wurde.

  Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 1 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Mn<++> in ppm im Zuchtmedium: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an gebildeter menschlicher MnSOD: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge des löslichen bakteriellen Proteines: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Pro-
teine:

   
<tb> <SEP>0 <SEP>30,6 <SEP>7,2 <SEP>30 
<tb> <SEP>50 <SEP>72,7 <SEP>15,4 <SEP>241 
<tb> <SEP>100 <SEP>78,0 <SEP>16,9 <SEP>356 
<tb> <SEP>150 <SEP>82,9 <SEP>18,8 <SEP>606 
<tb> <SEP>200 <SEP>82,0 <SEP>20,8 <SEP>338 
<tb> <SEP>250 <SEP>79,2 <SEP>20,4 <SEP>380 
<tb> <SEP>300 <SEP>80,8 <SEP>20,3 <SEP>381 
<tb> <SEP>450 <SEP>89,2 <SEP>22,4 <SEP>323 
<tb></TABLE> 



   Die in der Tabelle 1 angeführte MnSOD-Aktivität wurde nach demjenigen Verfahren getestet, das in der Veröffentlichung von McCord et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Wie man aus den in der Tabelle 1 angeführten Daten sieht, ist ein Zusammenhang zwischen ansteigenden Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium und der ansteigenden Löslichkeit der MnSOD festzustellen. Man sieht aus der Tabelle ferner, dass offensichtlich die  optimale Konzentration in dem Medium bei 150 ppm an zweiwertigen Manganionen liegt. Die entsprechenden Werte sind auch graphisch in Fig. 3 veranschaulicht und auch dort ist sehr deutlich zu sehen, dass die höchste spezifische Aktivität pro mg des löslichen Proteines erreicht wird, wenn die Konzentration an Manganionen in dem Medium 150 ppm beträgt. 



  Ausserdem aktivierten erhöhte Mangankonzentrationen in dem Zuchtmedium das früher inaktive lösliche Enzym. Lösliche Proteinfraktionen von induzierten Kulturen, die bei diesen Mangangehalten gezüchtet wurden, zeigten einen bis zu 60-fachen Anstieg in der SOD Aktivität im Vergleich zu löslichen Proteinfraktionen von nicht induzierten Kulturen, die bei gleichen Mangangehalten in der Kultur gezüchtet wurden. 



  Die Aktivitätsfärbung von isoelektrisch fokussierenden Gelen, also sogenannten IEF Gelen, wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in der Veröffentlichung von Beauchamp et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Diese Färbetechnik zeigte, dass viele Formen der rekombinanten MnSOD identisch mit denjenigen der nativen menschlichen Leber-MnSOD waren. 



  Die Ergebnisse, die für die Produktion von menschlicher MnSOD durch den Escherichia coli Stamm A1645, der das Plasmid pMSE-4 enthielt, erzielt wurden, waren ähnlich denjenigen Ergebnissen, die oben beschrieben sind. 


 Beispiel 5 
 


 Herstellung des Tet<R>-menschlichen MnSOD-Expressions- Plasmides. 
 



  Das Tet<R>-menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Expressions-Plasmid wird in der Folge mit pMS DELTA RB4 abgekürzt. Der Tet<R>-Expressionsvektor mit der Bezeichnung p DELTA RB, wurde aus pSOD beta 1T-11 hergestellt, indem man dieses einer vollständigen Verdauung mit dem Restriktionsenzym EcoRI unterwarf, worauf dann eine teilweise Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI erfolgte. 



  Das pSOD beta 1-T-11 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt worden. 



  Das verdaute Plasmid wurde mit dem synthetischen Oligomer der Struktur
 
 5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min 
 3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min  
 
 gebunden und man erhielt so das p DELTA RB des  lambda  PL Promoters. 



  Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches cII-ribosomale Bindungsstellen und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzymes enthält, wurde in die einzige EcoRI Stelle von p DELTA RB eingefügt, also insertiert. Das so erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von  lambda  PL und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin. 



  Das hier beschriebene Verfahren ist durch Fig. 4 veranschaulicht, in welcher oben links das Ausgangsprodukt pSOD beta 1T-11 veranschaulicht wird, einschliesslich der Stellen, wo die Spaltung mit den Restriktionsenzymen erfolgt, wobei das dabei entstehende grosse Fragment dann an den synthetischen Linker, nämlich das oben genannte synthetische Oligomere, gebunden wird. Auch das so hergestellte Endprodukt, nämlich das Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 ist in dieser Fig. 4 unten in der Mitte dargestellt. 


 Beispiel 6 
 


 Expression von menschlichem MnSOD durch das Plasmid PMS DELTA RB4 
 



  Das Plasmid pMS DELTA RB4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingeführt. 



  Man liess die Kulturen bei 32 DEG C in einer Luria-Brühe wachsen, welche verschiedene Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen enthielt, bis eine optische Dichte bei 600 nm von 0,7 erreicht wurde. 



  Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeiträumen wurden Proben genommen und diese Proben wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen untersucht. 



  Es zeigte sich, dass der Gehalt an menschlichem MnSOD in der Induktionszeit bis zum Zeitraum von 120 Minuten anstieg. Zu diesem Zeitpunkt betrug das menschliche MnSOD etwa 15% der gesamten Zellproteine, wie dies durch ein Scanning festgestellt werden konnte, das unter Verwendung von einem mit Coomassie-Blau gefärbtem Gel durchgeführt wurde. 



  Unabhängig von der Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Wachstumsmedium war das indu zierte MnSOD löslich. Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen, die im Beispiel 4 im Zusammenhang mit der Untersuchung des Amp<R>-Plasmides mit der Bezeichnung pMSE-4 gemacht wurden. 



  Auch in diesem Beispiel waren jedoch die maximale SOD Aktivität und das Ausmass der Expression, also der Expressionsspiegel, abhängig von der Menge an zweiwertigen Manganionen, die zur Verfügung gestellt wurden. 



  Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 2 
<tb>SubHead Col 01 to 04 AL=L: MnSOD-Expression in E.Coli A4255 (pMS DELTA RB4) 
<tb> 
<tb>Title: Gehalt an Mn<++> im Zuchtmedium in ppm 
<tb>Title: Prozentsatz an löslichem menschlichen MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an löslichen Bakterienproteinen 
<tb>Title:

  Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Proteine 
<tb> <SEP>42 DEG  DEG <SEP>32 DEG  DEG <SEP>42 DEG  DEG 
<tb> <SEP>0 <SEP>10,9 <SEP>8,0 <SEP>23 
<tb> <SEP>50 <SEP>19,8 <SEP>8,0 <SEP>227 
<tb> <SEP>100 <SEP>16,0 <SEP>8,0 <SEP>241 
<tb> <SEP>200 <SEP>17,0 <SEP>10,0 <SEP>278 
<tb> <SEP>300 <SEP>16,0 <SEP>9,3 <SEP>238 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 7 
 


 Reinigung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-superoxid-dismutase, die durch die rekombinante Gentechnologie hergestellt wurde. 
 



  Der Escherichia coli Stamm A4255 in dessen Zellen das Plasmid pMS DELTA RB4 aufgenommen worden war, wurde in Luria-Brühe gezüchtet, der 750 ppm an Mangan ionen, bezogen auf diese Brühe, zugesetzt worden waren. Die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 32 DEG C bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 17,0 erreicht hatte. Die Induktion der Expression der menschlichen MnSOD wurde durchgeführt, indem man während zwei Stunden lang eine Temperaturerhöhung auf 42 DEG C vornahm. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm  von 43,0 erreicht. Die Zellen wurden aus der Kultur gewonnen, indem man zentrifugierte und die so isolierten Zellen wurden dann in 0,2 des ursprünglichen Volumens an einem 50 mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,8 aufwies und 250 mM an Natriumchlorid enthielt, erneut suspendiert. 



   Die Bakterien wurden dann durch ein zweimaliges Hindurchleiten durch eine Vorrichtung mit der Bezeichnung Dynomill aufgebrochen und dann wurde zentrifugiert und die Zellbruchstücke wurden verworfen. 



  Das so gewonnene überstehende Material wurde eine Stunde lang auf 60 DEG C erhitzt und dann auf 4 DEG C abgekühlt und das darüber stehende Material einer Klärung unterworfen. Das geklärte überstehende Material wurde dann auf 0,03 seines ursprünglichen Volumens konzentriert und gegen einen 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 dialysiert, und zwar unter Ver wendung einer Ultrafiltrationseinrichtung der Bezeichnung Pelicon-Ultrafiltration Unit, die mit einer 10K Membran ausgestattet war. 



  Das so erhaltene rohe Enzympräparat wurde auf eine DE52-Säule aufgebracht, gründlich mit einem 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 gewaschen und dann erfolgte die Elution mit einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8. 



  Diejenigen Fraktionen, welche das Enzym enthielten, wurden miteinander vereinigt und dann gegen eine 40 mM Lösung von Kaliumacetat eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. Anschliessend wurde das Material auf eine CM52-Säule aufgebracht und die Elution wurde durchgeführt, indem man einen Lineargradienten von 40 mM Kaliumacetat bis 200 mM Kaliumacetat anwandte, wobei die Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufwiesen. 



  Diejenigen Peakfraktionen, die das menschliche MnSOD enthielten, wurden miteinander vereinigt und man  dialysierte  gegen Wasser. Anschliessend  wurde  das Enzympräparat  so  eingestellt,  dass  es sich in einem 10 mM Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 befand und dieses Produkt wurde dann bei -20 DEG C gefroren. 



  Das durch diese rekombinante Gentechnologie  gewonnene menschliche MnSOD war reiner als 99%ig und die spezifische Aktivität dieses Produktes betrug etwa 3500 Einheiten/mg. 



  Die Gesamtausbeute bei diesem Reinigungsverfahren betrug etwa 30%. 



  Diese Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellt. 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Tabelle 3 
<tb>SubHead Col 01 to 05 AL=L: Reinigung des durch rekombinante Gentechnologie gewonnenen menschlichen MnSOD 
<tb>Title: Reinigungsstufe 
<tb>Title: Gesamtmenge an Proteinen in g 
<tb>Title: Ausbeute in g 
<tb>Title: an MnSOD in % 
<tb>Title:

  Spezifische 
Aktivität in 
Einheiten/mg 
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der Behandlung mit der Dynomill <SEP>100,0 <SEP>11,9 <SEP>100,0 <SEP>417 
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der 
Erhitzung auf 60 DEG C <SEP>24,0 <SEP>8,2 <SEP>68,9 <SEP>1197 
<tb> <SEP>Retentat nach der Ultrafiltration mit der Peliconvorrichtung <SEP>20,0 <SEP>7,5 <SEP>63,0 <SEP>1350 
<tb> <SEP>Eluat aus der DE52-Säule <SEP>7,3 <SEP>5,7 <SEP>48,0 <SEP>2732 
<tb> <SEP>Eluat aus der CM52-Säule <SEP>4,2 <SEP>4,2 <SEP>35,3 <SEP>3500 
<tb></TABLE> 



  Die in der Tabelle 3 angegebenen Werte beziehen sich auf das gereinigte Enzym, das unter Verwendung eines 15 Liter fassenden Gärbehälters hergestellt wurde. 



   Die Untersuchung der Aminosäuresequenz des gereinigten Enzymes zeigte, dass ein zusätzlicher Methioninrest am Stickstoffende der Aminosäuresequenz anwesend war, und zwar im Vergleich zu der bekannten Aminosäuresequenz des aus menschlichen Zellen gewonnenen MnSOD, die in der im Beispiel 1 zitierten Veröffentlichung von Barra et al. beschrieben ist. 



  Der Metallgehalt des durch die rekombinante Gentechnologie hergestellten MnSOD wurde durch Atomabsorption bestimmt und es zeigte sich, dass etwa 0,77 Atome an Mangan pro Enzymuntereinheit vorhanden sind. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit den entsprechenden Ergebnissen, die von McCord et al. in dem weiter vorne genannten Buch "Superoxide und Superoxid-dismutase" veröffentlicht sind. 
 



  Die vorliegenden Unterlagen basieren auf einer continuation-in-part Anmeldung der USA Anmeldung Serial no. 801 090, die am 22. November 1985 eingereicht wurde, und es wird auf die dort gemachten Aussagen Bezug genommen. 



  Ferner wird Bezug genommen auf alle Offenbarungen, die in den Veröffentlichungen genannt sind, welche in der vorliegenden Beschreibung erwähnt sind. 



  Superoxid-dismutase, die in der Folge als SOD abgekürzt wird und das Phänomen der freien Sauerstoffradikale, also der Radikale der Formel (O2-) wurden im Jahre 1948 von McCord entdeckt und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M.  und Fridovich, I, im J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969) verwiesen. 



  Superoxid Radikale und andere hochreaktive Sauerstoffarten werden in jeder atmenden Zelle als Nebenprodukt eines oxidativen Stoffwechsels gebildet und es hat sich gezeigt, dass diese eine starke Schädigung bei einer grossen Anzahl von makromolekularen Komponenten und Zellkomponenten hervorrufen. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffent lichung von Fridovich, I. in "Advances in Inorganic Biochemistry", Verlag Eichhorn, G.L. und Marzilli, L.G. (Elsevier/North Holland, New York), Seiten 67-90 (1979) und auf die Veröffentlichung von Freeman, B.A. und Crapo, J.D. in "Laboratory Investion" 47:412-26 (1982) verwiesen. 



  Eine Gruppe an Metalloproteinen, die als Superoxid-dismutasen bekannt sind, katalisieren die oxidative Reduktionsreaktion von freien Sauerstoffradikalen nach dem folgenden Reaktionsmechanismus
 
 2O2- + 2H<+  >-> H2O2 + O2
 
 Diese Superoxid-dismutasen stellen also einen Abwehrmechanismus gegen die Toxizität des Sauerstoffes dar. 



  Es gibt verschiedene bekannte Formen von Superoxid-dismutasen, die unterschiedliche Metalle und  unterschiedliche Proteine enthalten. Zu den Metallen, die in diesen Superoxid-dismutasen enthalten sind, gehören Eisen, Mangan, Kupfer und Zink. Alle bekannten Formen der Superoxid-dismutasen katalisieren die gleiche Reaktion. Diese Enzyme werden in verschiedenen Gruppen der Evolutionsreihe gefunden. 



  Superoxid-dismutasen, die Eisen enthalten, sind hauptsächlich in prokaryotischen Zellen anzutreffen. 



  Superoxid-dismutasen, die Kupfer und Zink enthalten, werden in praktisch allen eukaryotischen Organismen gefunden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Steinman, H.M. in "Superoxide Dismutase", Verlag Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), Seiten 11-68 (1982) verwiesen. 



  Superoxid-dismutasen, die Mangan enthalten, wurden in Organismen gefunden, die von Mikroorganismen bis zu menschlichen Lebewesen reichen. 



  Jedes biologische Makromolekül kann das Produkt sein, das durch überflüssige Superoxid-Radikale beschädigt wird und deshalb hat man sich für die therapeutischen Möglichkeiten der Verwendung von Superoxid dismutase bereits interessiert. In der wissenschaftlichen Literatur wird vorgeschlagen, dass Superoxid-dismutase in einem weiten Bereich von klinischen Anwendungen nützlich sein kann. Zu diesen klinischen Anwendungen gehört die Verhinderung einer Onkogenese, also die Verhinderung einer Geschwürsbildung, und die Verhinderung der Bildung von Tumoren, sowie ferner eine Verminderung der cytotoxischen und cardiotoxischen Wirkungen von Antikrebsmitteln. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Oberley, L.W. und Buettner, G.R. in Cancer Research 39:1141-49 (1979) verwiesen. 



  Weitere Einsatzgebiete sind die Schützung von ischämischen Geweben, also von blutleeren Geweben, und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Roy, R.S. in Can. J. Physiol. Pharma, 60:1346-52 (1982) verwiesen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Schützung von Spermatozoen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Alvarez, J.G. und Storey, B.T. in Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983) hingewiesen. Ausserdem besteht ein Interesse daran, den Einfluss von Superoxid-dismutase auf den Alterungsprozess zu untersuchen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Talmasoff, J.M., Ono, T. und Cutler, R.G. in Proc. Natl.  Acad. Sci. USA 77:2777-81 (1980) hingewiesen. 



  Die Erforschung der therapeutischen Möglichkeiten von menschlicher Superoxid-dismutase war bisher hauptsächlich durch die begrenzten, zur Verfügung stehenden Mengen dieses Produktes beschränkt. 



  Superoxid-dismutase ist auch deshalb von Interesse, weil sie entzündungshemmende Eigenschaften besitzt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Huber, W. und Menander-Huber, K.B. in Clinics in Rheum. Dis. 6:465-87 (1980) hingewiesen. 



  Es wurde festgestellt, dass von Rindern stammende Superoxid-dismutase (Orgotein) entzündungshemmende Eigenschaften besitzt und derzeit ist diese in bestimmten Teilen Europas als pharmazeutisches Präparat zur Anwendung am Menschen im Handel erhältlich. Dieses Produkt ist auch in den Vereinigten Staaten als pharmazeutisches Produkt zur veterinärmedizinischen Anwendung erhältlich und es wird insbesondere zur Behandlung von entzündeten Sehnen bei Pferden eingesetzt. Aber auch das Ausmass, in dem Orgotein zur Verfügung steht, ist begrenzt. Nach den bisher bekannten Verfahren wurde dieses Produkt aus Rinderzellen oder anderen tierischen Zellen gewonnen, aber diese Arbeitsverfahren sind drastischen  Einschränkungen unterworfen und das so erhaltene Orgotein kann bei Menschen allergische Reaktionen hervorrufen, weil dieses Produkt nicht menschlichen Ursprungs ist. 



   Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase, die in der Folge als CuZn SOD abgekürzt wird, ist die am häufigsten untersuchte und am besten beschriebene Form der verschiedenen Formen der Superoxid-dismutase. 



  Die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid dismutase ist ein dimeres Metallisch-O-Protein, das aus identischen nicht kovalent gebundenen Untereinheiten aufgebaut ist, wobei jede dieser Untereinheiten ein Molekulargewicht von 16 000 Dalton aufweist und ein Atom Kupfer und ein Atom Zink enthält. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Hartz, J.W. und Deutsch, H.F. im J. Biol. Chem. 247:7043-50 (1972) verwiesen. Jede dieser Untereinheiten ist aus 153 Aminosäuren zusammengesetzt und die Aminosäuresequenz wurde ebenfalls bereits aufgeklärt.

  Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. und Deutsch, H.F., in Biochemistry 19:2310-16 (1980), sowie auf die Veröffentlichung von Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. und Bossa, F. in FEBS  Letters 120:53-56 (1980) hingewiesen. 



  Die komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, die in der Folge mit cDNA abgekürzt wird, welche die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase kodiert, wurde kloniert. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2808-11 (1982) verwiesen. Die vollständige Aminosäuresequenz der geklonten DNA wurde auch bereits aufgeklärt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5465-69 (1983) hingewiesen. 



  Ausserdem wurden auch schon die Expressions-vektoren beschrieben, welche eine DNA enthalten, die für Superoxid-dismutase kodiert ist und ferner wurde auch die Herstellung und Gewinnung von Superoxid-dismutase in Bakterien bereits beschrieben. Es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 131 843 A1 verwiesen, die am 23. Januar 1985 veröffentlicht wurde und die der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 107 717.5 entspricht, welche am 3. Juli 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität der am 15. Juli 1983 eingereich ten USA Anmeldung Serial No. 514 188. Des weiteren sei auf die Veröffentlichung von Hallewell, et al., in Nucleic Acids Res. 5, (1985) hingewiesen. 



  Des weiteren ist die Expression einer Superoxid-dismutase-DNA und die Herstellung von Superoxid dismutase in Hefe ebenfalls bereits beschrieben worden und es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung 0 138 111 A1, die am 24. April 1985 veröffentlicht wurde, hingewiesen, welche der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 111 416.8 entspricht, die am 25. September 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität vom 3. Oktober 1983 der USA Patentanmeldung Serial No. 538 607 und der Priorität vom 11. Mai 1984 der USA Patentanmeldung Serial No. 609 412. 



  In jüngster Zeit wurde auch die Genstelle für CuZn SOD auf dem menschlichen Chromosom 21 beschrieben und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung im EMBO Journal, Band 4, Nr. 1, Seiten 77-84 (Januar 1985) hingewiesen. Die neuesten Entwicklungen im Zusammenhang mit der Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase wurden in dem Abstract der vierten internationalen Konferenz über Superoxide und Superoxid-dismutase zusammengefasst, die in Rom, Italien, im Zeitraum vom 1.-6. September 1985 abgehalten wurde. 



  Wesentlich weniger ist jedoch über die Mangan Superoxid-dismutase, die in der Folge auch mit MnSOD abgekürzt werden wird, bekannt. Die MnSOD von  Escherichia coli K-12 wurde kürzlich kloniert und in das Verzeichnis aufgenommen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Touati, D., im Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983) verwiesen. Barra et al. beschreiben eine Sequenz von 196 Aminosäuren für das MnSOD-Polypeptid, das aus menschlichen Leberzellen isoliert worden war. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984) verwiesen.

  Die bisherigen Veröffentlichungen unterscheiden sich jedoch bezüglich der Struktur des MnSOD-Moleküls, und zwar insbesondere dahingehend, ob dieses zwei identische oder vier identische Polypeptid Untereinheiten aufweist. Es sei in diesem Zusammenhang auf die gerade oberhalb genannte Veröffentlichung von Barra hingewiesen und ferner auf die Veröffentlichung von McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. und Salin, M.L. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michaelson, A.M., McCord, J.M., und Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 129-138 (1977) verwiesen. Es ist jedoch klar, dass das MnSOD-polypeptid und das CuZn-Sod-Polypeptid nicht homolog sind und in  diesem Zusammenhang sei auf die erwähnte Veröffentlichung von Barra verwiesen.

  Die Homologien der Aminosäuresequenz von verschiedenen MnSOD und FeSOD, die aus verschiedenen Quellen stammten, wurden miteinander verglichen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) hingewiesen. 



  Baret et al. beschreiben in einem Rattenmodell, dass die Halbwertzeit von menschlichem MnSOD wesentlich länger ist, als die Halbwertzeit von menschlichem Kupfer-SOD. Diese Autoren beschreiben auch, dass in dem Rattenmodell menschliche MnSOD und Ratten-Kupfer-SOD nicht wirksam sind als entzündungshemmende Mittel,  während  die  Kupfer-SOD  von  Rindern  und  die menschliche Kupfer-SOD vollständig aktiv sind. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Baret, A., Jadot, G., und Michelson, A.M., in Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (September 1, 1984) hingewiesen. 



  McCord et al. beschreiben, dass die natürlich vorkommende menschliche MnSOD, also die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase die menschlichen phagocytierenden  polymorphonuklearen Leukocyten, die in der Folge als PMN-Leukocyten abgekürzt werden, gegen freie Superoxid-Radikale besser schützt, als die von Rindern stammende oder die von Schweinen stammende Kupfer-Zink-Superoxiddismutase, wobei diese Ergebnisse durch in vitro Tests gewonnen wurden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Salin, M.L., im Buch "Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes", Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. Verlag, Seiten 257-264 (1977) hingewiesen. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft ein Desoxiribonucleinsäure-Molekül, das in der Folge als cDNA-Molekül abgekürzt wird, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Kloning-vehikel, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten und welche zur Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben oder der Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet sind. Zellen, beispielsweise Zellen einzelliger Lebewesen, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten, sind zur Herstellung des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben, beziehungsweise zur Herstellung von menschlichem Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet, und bevorzugte derartige einzellige Organismen sind Bakterien. 



  Wenn das menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptid, komplexiert mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen vorliegt, dann stellt dieses Produkt ein Enzym dar, welches die Aktivität der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase aufweist. Die entsprechenden Enzyme können als Wirkstoff in pharmazeutischen Präparaten zur Verwendung  in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin eingesetzt werden. Die entsprechenden pharmazeutischen Präparate sind in der Lage, um Schädigungen bei der Wiederdurchblutung nach einer Blutleere, also Schäden bei der Reperfusion nach einer Ischämie, zu vermindern. Mit Hilfe entsprechender pharmazeutischer Präparate kann eine verlängerte Lebenszeit von entfernten und isolierten Organen gewährleistet werden. 



  Des weiteren sind pharmazeutische Präparate, welche die entsprechenden Enzyme als Wirkstoff enthalten, zur Behandlung von Entzündungen geeignet. 



  Die Erfindungsgegenstände werden nun näher erläutert. 



  Ein DNA-Molekül, welches cDNA enthält, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde aus menschlichen T-Zellen-cDNA-Bruchstücken (T-cell library) isoliert. Die Aminosäuresequenz des Nucleotides eines doppelsträngigen DNA-Moleküles, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde gefunden. Die Aminosäuresequenz eines Stranges, der das Polypeptid oder ein Analoges desselben codiert, ist in Fig. 1a und 1b dargestellt, und zwar reicht sie dort vom Nucleotid 115 hinunter bis zum Nucleotid 708. Andere Sequenzen, die das Analoge oder eine Mutante codieren, können im wesentlich ähnlich dem Strang sein, der das Polypeptid codiert.

  Die Nucleotid Sequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches ein 24 Aminosäuren umfassendes Prepeptid codiert, ist ebenfalls in Fig. 1a  dargestellt, und zwar reicht diese Aminosäuresequenz im Nucleotid von der Aminosäure 43 bis einschliesslich zur Aminosäure 114. 



  Das doppelsträngige cDNA-Molekül oder irgend ein anderes doppelsträngiges DNA-Molekül, welches einen Nucleotidstrang enthält, der eine Sequenz aufweist, die das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, kann in ein Klonierungs-Vehikel einverleibt werden und als Beispiels für ein Klonierungs-Vehikel sei ein Plasmid oder ein Virus genannt. Entweder kann das DNA-Molekül in eine Zelle eingefügt werden, und zwar entweder eine procaryotische Zelle, beispielsweise eine bakterielle Zelle, oder eine eukaryotische Zelle, beispielsweise eine Hefezelle oder Säugetierzelle, indem man bekannte Methoden anwendet. Zu diesen bekannten Methoden gehört die Anwendung eines Klonierungs-Vehikels, das beide Moleküle enthält, die Erfindung sei jedoch nicht auf diese Methode beschränkt. 



  Vorzugsweise wird die cDNA oder die DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert in ein Plasmid einverleibt, beispiels weise in pMSE-4 oder pMS DELTA RB4, und dann in eine geeignete Wirtzelle eingefügt, in der die Expression der DNA erfolgen kann und das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben produziert wird. Die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase wird in der Folge auch als hMnSOD abgekürzt. 



  Zu den bevorzugten Wirtzellen gehören Escherichia coli, sind zwar insbesondere Escherichia coli A4255 und Escherichia coli A1645. Das Plasmid pMSE-4 in dem Escherichia coli Stamm A4255 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. 53250 hinterlegt. 



  Das Plasmid pMS DELTA RB4 kann so erhalten werden, wie dies in Fig. 4 gezeigt wird. Dieses in Fig. 4 veranschaulichte Verfahren wird später noch näher erläutert. 



  Zellen, in welche solche DNA-Moleküle eingeführt worden waren, können nach Verfahren gezüchtet oder kultiviert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, wobei man geeignete Bedingungen anwendet, die eine Transkription der DNA in die messenger Ribonucleinsäure, welche in der Folge mit mRNA abgekürzt  wird und eine Expression der mRNA als Protein erlaubt. Das so gebildete Mangan-Superoxid-dismutase Protein kann dann gewonnen werden. 



  Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Anwendung in der Veterinärmedizin und in der Humanmedizin geeignet sind und die die menschliche Mangan-Superoxiddismutase, also das menschliche MnSOD oder Analoge oder Mutanten desselben enthalten, können ebenso hergestellt werden und derartige pharmazeutische Präparate enthalten im allgemeinen als weitere Komponente ein Trägermaterial. Diese pharmazeutischen Präparate, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder Mutanten derselben enthalten, können eingesetzt werden, um die folgende Reaktion zu katalysieren:
 
 2O2- + 2H <+> -> H2O2 +O2
 



  Durch die Katalysierung dieser Reduktion werden Zellschädigungen vermindert, die durch Superoxid Radikale hervorgerufen werden. 



   Insbesondere können diese Enzyme oder Analoge oder Mutanten derselben verwendet werden, um Schäden zu vermindern, welche bei einer Wiederdurchblutung nach einer Blutleere auftreten, also bei einer Reperfusion  nach einer Ischämie, und um die Überlebenszeit von entnommenen isolierten Organen zu erhöhen oder um Entzündungen zu behandeln. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder von Analogen oder Mutanten derselben in Bakterienzellen. Die Bakterienzelle enthält die DNA-Sequenz und ist in der Lage, die Expression der DNA-Sequenz hervorzurufen, die für die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges oder eine Mutante derselben kodiert ist. 



  Bei diesem Verfahren stellt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen und in einem Produktionsmedium. Dieses Produktionsmedium enthält als Zusatz eine Menge an Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration an diesen Manganionen, die der Zelle in dem Medium zur Verfügung steht, höher als 2 ppm ist. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli, die ein Plasmid enthält, welches eine DNA-Sequenz enthält, welche für das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert ist,  beispielsweise für pMSE-4 oder pMS RB4 in dem Escherichia coli Stamm A4255. Die Konzentration an den Manganionen in dem Produktionsmedium liegt in diesem Fall vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm, wobei Konzentrationen im Bereich von 150 bis 750 ppm speziell bevorzugt sind. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben aus Bakterienzellen, welche diese Dismutase enthalten. Dabei werden im allgemeinen die Zellen zuerst einer Behandlung unterworfen, um eine Proteinfraktion zu erhalten, die Proteine enthält, welche in den Zellen anwesend sind, und zwar einschliesslich der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutanten derselben. Diese Proteinfraktion wird dann weiterbehandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu erhalten. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zuerst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand zu isolieren und dabei werden die löslichen Proteine gewonnen. Die löslichen Proteine werden  dann weiterbehandelt um eine Fraktion des löslichen Proteins abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-oxydase, abgekürzt als hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante derselben enthält. Diese Abtrennung der gewünschten Fraktion kann beispielsweise durch Ausfällung erfolgen. Diejenige Fraktion, welche die hMnSOD oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält, wird gewonnen. Diese gewonnene Fraktion an löslichen Proteinen wird dann weiterbehandelt, um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen. 



  Eine speziell bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben aus Bakterienzellen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthalten. Bei diesem Verfahren werden zuerst die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium abgetrennt und dann in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist. 



  Anschliessend werden dann die Zellen aufgebrochen und zentrifugiert und das dabei gebildete überstehende Material wird dann während etwa 30 bis  120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von 55-65 DEG C erhitzt. Vorzugsweise erhitzt man während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C und speziell bevorzugt eine Stunde lang auf eine Temperatur von 60 DEG C. Anschliessend wird dann auf eine Temperatur von unterhalb von 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf 4 DEG C. Irgend ein Niederschlag, der sich dabei gebildet hat, muss entfernt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, und das gekühlte darüber stehende Material wird dann gegen einen geeigneten Puffer dialysiert. Als Beispiel für einen geeigneten Puffer sei ein 2 mN Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von etwa 7,8 genannt. 



  Vorzugsweise wird die Dialyse durch eine Ultrafiltration durchgeführt, indem man eine Filtrationsmembran von kleiner als 30K verwendet. Gleichzeitig mit der Dialyse oder nach der Dialyse kann das gekühlte darüber stehende Material gegebenenfalls bis zur Erreichung eines geeigneten und angenehm zu handhabenden Volumens konzentriert werden, beispielsweise auf 0,03 des Ausgangsvolumens. 



  Das Retentat wird dann auf einer Anionaustausch-chromatographiesäule mit einer geeigneten Pufferlösung eluiert, beispielsweise einer Lösung aus minde stens 20 mM Kaliumphosphatpuffer, die einen pH-Wert von 7,8 aufweist. Diejenigen Fraktionen des Eluates, welche Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt und dann gegen einen etwa 40 mM Kaliumacetatpuffer eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. 



  Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden dann durch eine Kationaustauscherchromatographiesäule eluiert, die einen linearen Gradienten von etwa 40 mM bis etwa 200 mM Kaliumacetat und einen pH-Wert von 5,5 aufweist. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt. 



  Gegebenenfalls können die vereinigten Peakfraktionen dann gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung aus einem etwa 10mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die gereinigte enzymatisch aktive menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder Analoge derselben, beispielsweise met-hMnSOD, oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind. 


 Kurze Beschreibung der Figuren 
 



   In Fig. 1a und 1b wird die Aminosäuresequenz der komplimentären Desoxiribonucleinsäure, abgekürzt als cDNA der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht. Diese wird in der Folge auch mit MnSOD cDNA abgekürzt. 



  Fig. 1a und 1b zeigt die Nucleotidsequenz des einen Stranges eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert und ausserdem die 198 Aminosäuresequenz der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase, die der DNA-Sequenz entspricht. Fig. 1a zeigt auch die Nucleotidsequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welche ein Präpeptid für die reife menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, wobei dieses Präpeptid aus 24 Aminosäuren besteht und eine Aminosäuresequenz aufweist, die derjenigen der DNA-Sequenz entspricht. Es werden ferner Teile der 5 min  und 3 min untranslatierten Sequenzen dargestellt. 



  Das Plasmid pMS8-4, welches die MnSOD auf einer mit R1 bezeichneten EcoRI Einfügung enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI abgebaut. Das grosse Fragment, das bei diesem Restriktionsabbau gebildet wurde, wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomer in der in Fig. 2 dargestellten Weise verbunden. Das grosse Fragment erstreckt sich von der NdeI Restriktionsstelle in der Stellung "8 Uhr" auf dem pMS8-4 zu der NarI Restriktionsstelle, die sich in der Stellung "3 Uhr" auf dem Plasmid pMS8-4 befindet. Dieses Restriktionsfragment enthält das Ampicillin-resistenz-gen und ausserdem die meisten der MnSOD-gene. Dieser Restriktionsabbau hat die 5 min  untranslatierte Region und die Präpeptid kodierende Region des MnSOD-genes entfernt. Dieser Restriktionsabbau hat ebenfalls ungefähr 36 Basenpaare der kodierenden Region des reifen MnSOD-Polyeptides entfernt.

  Diese fehlenden Basenpaare, welche das reife MnSOD kodieren, wurden durch die Ligation an den synthetischen Linker eingeführt, welcher in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das erhaltene Plasmid pMS8-NN enthält die kodierende Region für das reife MnSOD und  vor dieser ein ATG-Initiationskodon. 



  Das oben erwähnte Plasmid pMS8-NN wurde mit EcoRI abebaut oder verdaut, die Enden wurden gefüllt indem man das Klenow-fragment der Polymerase 1 verwendete und dann weiter mit NdeI gespaltet. 



  Das kleine Fragment beherbergt das MnSOD-gen, angeordnet zwischen der eingefüllten EcoRI-Stelle und der NdeI-Stelle und dieses kleine Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment entspricht dem für MnSOD kodierenden Bereich. 



  Dieses Fragment wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI und StuI behandelt worden war. 



  Die Behandlung von PSOD alpha 13 mit NdeI und StuI und die nachfolgende Isolierung des grossen Fragments führt zu einem Fragment, welches die  lambda PL Promoterseguenz, die cII-ribosomale Bindungsstelle, das Ampicillin-resistanz-gen und die meisten CuZn SOD-gene enthält. 



  Das CuZn SOD-gen fehlt jedoch in dem kodierenden Bereich für das 5 min  Ende des Gens, weil dieses durch die Restriktionsspaltung und  die nachfolgende Isolierung des grossen Fragmentes entfernt worden war. 



  Das MnSOD-gen von pMS8-NN wurde zwischen die NdeI und StuI-Stellen von pSOD alpha 13 eingefügt. Das pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 vom 5. März 1986, die der USA Patentanmeldung Serial No. 644 245 entspricht, beschrieben ist. Durch diese Ligation wurde das Plasmid pMSE-4 gebildet, das den MnSOD kodierenden Bereichen enthält und vor diesem liegen die cII-ribosomale Bindungsstelle und unter der Kontrolle des  lambda  Pl-Promoters. Das Plasmid pMSE-4 ist am 25. Sept. 1985 bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt worden. 



  In Fig. 3 wird der Einfluss der Konzentration an Manganionen auf die Aktivität der Superoxid-dismutase veranschaulicht, die in dem Mikroorganismus Escherichia coli gebildet wird. 



  In dieser Fig. 3 ist auf der Abszisse die Konzentration an Manganionen, nämlich an Mn<+><+> in dem Zuchtmedium in ppm angegeben. Diese reicht von 0 ppm bis 600 ppm. Auf der Ordinate der Fig. 3 sind die spezifischen Superoxid-dismutase Aktivitätseinheiten pro mg des löslichen Proteines angegeben. 



  Das Diagramm der Fig. 3 zeigt also den Zusammenhang zwischen der spezifischen Aktivität, angegeben in Einheiten pro mg des rekombinierten löslichen MnSOD, das von dem Escherichia coli Stamm A4255 gebildet wurde, der das Plasmid pMSE-4 enthält. In dieser Figur sind sowohl die entsprechenden Einheiten für Nichtinduktion (bei 32 DEG C) angeführt, es handelt sich dabei um die entsprechenden nicht strichlierten Säulen, und des weiteren sind in dieser Figur die Ergebnisse unter den Be dingungen einer Induktion bei 42 DEG C angeführt. Dabei handelt es sich um die entsprechenden strichlierten Flächen. Die Konzentration an den Ionen des zweiwertigen Mangans in dem Wachstumsmedium ist wie erwähnt in ppm, also in Teilen pro Million angeführt. 



  In Fig. 4 ist der Aufbau von pMS  DELTA  RB4, nämlich des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Expressionsplasmides veranschaulicht. 



  Der Tet<R>-Expressionsvektor, p DELTA RB wurde aus dem pSOD beta 1T-11 gebildet, indem man das pSOD beta 1T-11 vollständig mit EcoRI abbaute und anschliessend eine teilweise Spaltung mit den BamHI-Restriktionsenzymen durchführte. 



  Das grosse Fragment, das durch diesen Abbau gebildet worden war, wurde isoliert und an ein synthetisches Oligomer gebunden, dessen Sequenz wie folgt war:
 
 5 min  - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min 
 
 3 min  - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min 
 



  Dadurch erhielt man p DELTA RB, welches den  lambda Pl Promoter enthält. Das grosse EcoRI/BamHI Restriktionsfragment, das bei diesem Abbau gebildet wird, erstreckt sich von der EcoRI-Stelle, die in der pSOD  beta 1T11-Restriktionskarte in Stellung "12 Uhr" dargestellt ist, in der Gegenuhrzeigerrichtung bis zu der BamHI-Stelle, die in der pSOD 1T11-Restriktionskarte in der "5 Uhr" Stellung dargestellt ist. Das pSOD beta 1T11 ist bei der American Type Culture Colection 3. März 1986 unter der Accession No. 53 468 hinterlegt worden. 



  Das EcoRI-Fragment vom pMSE-4 wurde erhalten, indem man pMSE-4 mit EcoRI abbaut und das kleine Fragment isoliert, das bei diesem Abbau gebildet wird. Dieses Fragment ist das Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält und es erstreckt sich auf der pMSE-4-Restriktionskarte von der Stelle EcoRI in  der Stellung "1 Uhr" zu der Stelle EcoRI in der Stellung "3 Uhr" auf der pMSE-4-Restriktionskarte. Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches die cII-ribosomale Bindungsstelle und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzyms enthält, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von p DELTA RB eingeführt. Das erhaltene Plasmid pMS RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von  lambda Pl und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin. 



   In der Folge wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen beschrieben. 



  Ein doppelsträngiges Desoxiribonucleinsäuremolekül, das in der Folge mit DNA-Molekül abgekürzt wird, und das komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, umfasst, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, wurde isoliert. Diese komplimentäre Desoxiribonucleinsäure wird in der Folge mit cDNA abgekürzt. Das erwähnte doppelsträngige DNA-Molekül wurde aus einem menschlichen T-Zellen-cDNA-genetischem Material oder Abschnitt mit der englischen Bezeichnung "human T-cellcDNA library" isoliert. Unter dieser englischen Bezeichnung versteht man eine Sammlung von Escherichia coli Bakterien oder Bakteriophagen  lambda , welche die cDNA-Abschnitte oder Einfügungen enthält, die durch die  Messenger-RNA (abgekürzt als MRNA) synthetisiert wurden, die aus menschlichen T-Zellen isoliert wurde. 



  Die Nucleotidsequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert oder ein Analoges oder eine Mutante desselben kodiert, wurde gefunden. 



  Die Sequenz des einen Stranges des DNA-Moleküls, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben kodiert, ist in Fig. 1a und b dargestellt und diese Sequenz umfasst die Nucleotide mit den Zahlen 115 bis einschliesslich 708. 



  Die Sequenz des einen Stranges, der ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase- Polypeptides, das in der Folge als hMnSOD-analoges bezeichnet wird oder eine Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, ist im wesentlichen ähnlich demjenigen Strang, der das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid, das in der Folge mit hMnSOD-polypeptid abgekürzt wird, kodiert. 



  Die Nucleotidsequenz des Präpeptides der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ist ebenfalls in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die Nucleotide der Zahlen 43 bis einschliesslich 114 kodieren dieses Präpeptid. 



  Die Methoden zur Herstellung der cDNA und zur Bestimmung der Sequenz der DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und sie werden in der Folge noch genauer beschrieben. Da  jetzt die DNA-Sequenz aufgeklärt wurde, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, können ausserdem bekannte synthetische Verfahren angewandt werden, um DNA-Moleküle herzustellen, die Teile dieser Sequenz enthalten. 



  Übliche Kloning-vehikel, wie Plasmide, beispielsweise pBR322, oder Viren oder Bakteriophagen, beispielsweise  lambda , können modifiziert oder hergestellt werden, indem man bekannte Arbeitsverfahren anwendet, die geeignet sind, um neue Kloning-vehikel herzustellen, welche eine cDNA enthalten, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase Polypeptid oder Analoge desselben oder Mutanten desselben, kodieren. 



  In ähnlicher Weise können derartige Kloning-vehikel so modifiziert oder so erzeugt werden, dass sie DNA-Moleküle enthalten, von denen ein Strang ein Segment enthält, welches die in Fig. 1a und b dargestellte Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist oder Segmente, die im wesentlichen ähnlich diesen dargestellten Segmenten sind. Die eingefügten DNA-Molekule können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden, einschliesslich einer enzymatischen oder chemischen Synthese. 



  Die erhaltenen Kloning-vehikel sind chemische Einheiten, die in der Natur nicht vorkommen und die nur durch moderne Technologie erzeugt werden können, die als Rekombination-DNA-Technologie bezeichnet wird. Vorzugsweise ist das Kloning-vehikel ein Plasmid, beispielsweise pMSE-4 oder pMS DELTA RB4. Diese Kloning-vehikel können in Zellen eingefügt werden, und zwar entweder in procaryotische Zellen, beispielsweise Bakterienzellen, wie zum Beispiel diejenigen von Escherichia coli, von Bacillus subtilis, und ähnliche Bakterienzellen, oder sie können in eukaryotische Zellen einverleibt werden, wie zum Beispiel in die Zellen von Hefe oder Säugetieren, indem man Arbeitstechniken anwendet, die für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, wie zum Beispiel eine Transformation, eine Transfektion und ähnliche Arbeitsweisen. 



  Diejenigen Zellen, in welche die Kloning-vehikel eingeführt sind, enthalten dementsprechend cDNA, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, wenn diese cDNA in dem Kloning-vehikel anwesend war oder sie werden eine DNA enthalten, welche einen Strang, und zwar einen gesamten Strang oder einen  Teil des Stranges enthält, welcher die Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist, die in Fig. 1a und b dargestellt wird oder eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen ähnlich dieser Sequenz ist, wenn eine solche DNA in dem Kloning-vehikel anwesend war. 



  Die Zellen von Escherichia coli sind die bevorzugten Wirtzellen für die erfindungsgemässen Kloningvehikel. Als der im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugte auxotrophische Stamm der Escherichia coli ist der Stamm A1645, der bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt wurde, welcher das Plasmid pApoE-Ex2 enthält und welcher unter der ATCC Accession No. 39 787 hinterlegt ist. Alle Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection, die in den vorliegenden Unterlagen erwähnt werden, wurden in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag der International Anerkennung von hinterlegten Kulturen von Mikroorganismen durchgeführt. 



  Das A1645 wurde aus A1637 durch Selektion auf Gal<+>, d.h. durch Selektion auf die Fähigkeit, Galaktose abzubauen, erhalten und auch durch einen Verlust der Tetracyclin-resistenz. Es enthält immer noch Elemente  der Phage  lambda . Sein Phenotyp ist c600 r<-> m<+> gal<+> thr<-> leu<-> lacZ-bl ( lambda cI857  DELTA  Hl  DELTA  BamHl N<+>). 



  A1637 wurde aus dem C600 erhalten, indem man Transposon, welches ein Gen für Tetracyclin-resistenz enthält, in das Galactose-Operon einführt und ausserdem Elemente der Phage  lambda  einfügt, einschliesslich derjenigen Elemente, die verantwortlich sind für die Synthese des cI Repressors. C600 kann bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 23 724 bezogen werden. 



   Die prototrophischen Stämme von Escherichia coli, welche ein hohes Ausmass der Expression des Polypeptides sogar dann ermöglichen, wenn sie in einem minimalen Medium gezüchtet werden, sind als Wirtzellen für die Expression des Gens, welches Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, noch mehr bevorzugt. Ein im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugter prototrophischer Stamm ist A4255. Der Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt. 



  Die erhaltenen Zellen, in die eine DNA eingefügt worden war, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben  oder eine Mutante desselben kodiert, können behandelt werden, beispielsweise gezüchtet werden oder vermehrt werden, wie dies unter geeigneten Bedingungen für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, sodass die DNA die Expression der genetischen Information richtet, die durch die DNA kodiert wurde. Diese DNA dirigiert beispielsweise die Expression des hMnSOD-Polypeptides oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und die Zelle führt dementsprechend zur Expression von hMnSOD-Polypeptid oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und diese Produkte können dann gewonnen werden. 



  In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Superoxid-dismutase", bzw. die Abkürzung "SOD" ein Enzym oder ein Polypeptid, welche auf Superoxid oder freie Sauerstoffradikale als Rezeptor wirkt oder welche die folgende Dismutationsreaktion katalysiert:
 
 2O2- + 2H<+ >->  O2 + H2O2
 



  Der Ausdruck "Mangan-Superoxid-dismutase", bzw. die entsprechende Abkürzung "MnSOD", bedeutet in der vorliegenden Beschreibung irgend ein beliebiges Superoxid-dismutase Molekül, welches das chemische Element Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen enthält. 



  In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutase-Polypeptid", bzw. die entsprechende Abkürzung "hMnSOD" ein Polypeptid aus 198 Aminosäuren, von dem ein Teil der Aminosäuresequenz ln Fig. 1a und b dargestellt ist. Das Stickstoffende, also der N-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist. 



  Der Ausdruck "Polypeptid-Mangan-Komplex" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches ein menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid in einem Komplex mit Mangan in irgend einer chemischen Formel enthält und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Der Ausdruck "menschliche Mangan-Superoxid-dismutase" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptide in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der  natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Der Ausdruck "Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid umfasst, an welches an eines der beiden Enden oder an beide Enden der Aminosäuresequenz eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren gebunden sind. 



  In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "Analoges des Polypeptid-ManganKomplexes" ein Molekül, welches einen Polypeptid-Mangan-Komplex umfasst, wobei der Polypeptidanteil dieses Komplexes ein oder mehrere zusätzliche Aminosäuren umfasst, die an eines der beiden Enden oder an beide Enden des Polypeptides gebunden sind. 



  Unter dem Ausdruck "Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, das mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines der beiden ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, und zwar in Form eines Komplexes mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen und  welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Unter dem Ausdruck "Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen identisch mit derjenigen des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, wobei sich diese Aminosäuresequenz jedoch von diesem Polypeptid durch ein oder mehrere Aminosäuren unterscheidet. 



  Unter dem Ausdruck "Mutante des Polypeptid-Mangan-Komplexes" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Unter dem Ausdruck "Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines dieser Polypeptide eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit  Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen ist und dabei dieser Komplex die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist. 



  Die Mutanten des hMnSOD-Polypeptides und des hMnSOD, die einen Teil des Erfindungsgegenstandes darstellen, können hergestellt werden, indem man die DNA-Sequenz, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, mutiert, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 kodiert ist und das Carboxylende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz, durch die Nucleotide 706-708 kodiert ist. 



  Die DNA kann nach Methoden mutiert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind und es sei in diesem Zusammenhang beispielsweise auf die Veröffentlichung von Bauer et al., in Gene 37: 73-81 (1985) hingewiesen. Die mutierte Sequenz kann nach dem hier beschriebenen Verfahren in geeignete Expressions-vektoren eingefügt werden, und diese Expressions-vektoren können wieder in Zellen eingefügt werden, die dann so behandelt werden, dass die mutierte DNA die Expression der hMnSOD-Polypeptide-Mutanten und die Expression der hMnSOD-Mutanten dirigiert. 



   Man nimmt an, dass die enzymatisch aktive Form der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ein Protein ist, das mindestens zwei und möglicherweise vier identische Untereinheiten aufweist, von denen jede ungefähr 198 Aminosäuren in derjenigen Sequenz aufweist, die in Fig. 1a und b für die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht ist, wobei das Stickstoffende, also der N-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist. 



  Menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können von Zellen gebildet werden, in welche die DNA oder die cDNA, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ihre Analogen oder ihre Mutanten kodiert, eingebracht worden ist. Die menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können verwendet werden, um die Dismutation oder die einwertige Reduktion von Superoxidanionen in Anwesenheit von Protonen unter Bildung von Wasserstoffperoxid zu katalysieren und die entsprechende Reaktion ist anhand der folgenden Gleichung veranschaulicht: 
EMI46.1
 



  Pharmazeutische Präparate zur Anwendung in der Veterinärmedizin oder der Humanmedizin können auch hergestellt werden, die als Wirkstoff hMnSOD oder einen oder mehrere Analoge oder Mutanten der hMnSOD enthalten und vorzugsweise ausserdem ein geeignetes Trägermaterial. Derartige Trägermaterialien sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt. 



  Entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante desselben enthalten, können direkt verabreicht werden oder sie können mit Hilfe von weiteren Zusätzen zu entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die dann zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten oder tierischen Patienten geeignet sind. Entsprechende pharmazeutische Präparate können verwendet werden, um Entzündungen zu bekämpfen oder um Schäden zu vermindern, die von freien Sauerstoffradikalen bei der erneuten Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der auf eine Ischämie folgenden Reperfusion auftreten können oder bei einer Organtransplantation. 



  In diesen Fällen kann das hMnSOD oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben  direkt, also ohne weitere Zusätze, oder in Form einer Zusammensetzung dem Durchspülungsmedium, also dem Perfusionsmedium, zugesetzt werden, mit dem ein isoliertes Organ durchspült wird, wobei dadurch Schädigungen des isolierten Organes durch sauerstoff-freie Radikale bei der Perfusion nach der Isolierung des Organes vermindert werden und somit die Überlebenszeit des isolierten Organes verlängert wird. 



  Des weiteren können entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben enthalten, verwendet werden, um neurologische Schäden zu vermindern, die bei der neuerlichen Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der Reperfusion anschliessend an eine Ischämie auftreten können und die entsprechenden pharmazeutischen Präparate können auch eingesetzt werden, um eine Missbildung der Bronchien und der Lunge, also eine Bronchial-pulmonar-dysplasie zu behandeln. 



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben in Bakterienzellen. Bei diesem Verfahren enthält die Bak terienzelle eine DNA Sequenz und sie ist in der Lage, eine Expression einer DNA Sequenz durchzuführen, die die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert. Bei diesem Verfahren belässt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Produktionsmedium. Das Produktionsmedium enthält als Zusatzstoff eine Menge an zweiwertigen Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration in diesen zweiwertigen Manganionen in dem Medium höher gehalten wird als 2 ppm. 



  Die Bakterienzelle kann irgend ein beliebiges Bakterium sein, in welches die DNA-Sequenz, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, eingefügt worden war, indem man Rekombinations-DNA-Techniken angewandt hatte. Dieses Bakterium muss zu einer Expression der DNA-Sequenz geeignet sein und zur Produktion des Proteinproduktes. Die geeigneten Bedingungen und das Produktionsmedium variieren je nach der Spezies und dem Stamm des Bakteriums. 



  Die Bakterienzelle kann die DNA-Sequenz, welche die Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben kodiert, in dem Körper eines Vektor-DNA-Moleküles  enthalten, wie zum Beispiel eines Plasmides. Der Vektor oder das Plasmid wird durch Rekombinations-DNA-Techniken so aufgebaut oder konstruiert, dass er die Sequenz, welche die Superoxid-dismutase kodiert, an einer geeigneten Stelle in dem Molekül einverleibt hat. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli. Ein bevorzugter auxotrophischer Stamm von Escherichia coli ist A1645. 



  Ein bevorzugter prototrophischer Stamm von Escherichia coli ist A4255. Die erfindungsgemässen Zellen von Escherichia coli enthalten ein Plasmid, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMSE-4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmids wird in der Beschreibung der Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 2 beschrieben. Dieses Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No.53 250 hinterlegt. 



  Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung enthält die Bakterienzelle  das Plasmid pMS DELTA RB4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmides ist in der Beschreibung und in den Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Plasmid kann ausgehend von pSOD beta T-11, welches bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt ist, aufgebaut werden. 



   Gemäss speziellen Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung wird ein enzymatisch aktives Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, der das Plasmid pMSE-4 enthält, sowie durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, die das Plasmid pMS DELTA RB4 enthalten. 



  Das geeignete Produktionsmedium für die Bakterienzelle kann irgend eine Art eines annehmbaren Zuchtmediums sein, wie zum Beispiel ein Casein-hydrolysat-Medium oder ein Luria-Brühe-Medium, welches in der Folge auch als LB-Medium abgekürzt wird. Das letztgenannte Medium ist dabei bevorzugt. 



  Die geeigneten Züchtungsbedingungen hängen von dem Stamm der Escherichia coli und dem Plasmid, das diese enthält, ab. Beispielsweise wird der Stamm  Escherichia coli A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 42 DEG C induziert und bei dieser Temperatur während etwa 1-5 Stunden belassen. Die geeigneten Bedingungen bezüglich der Züchtungstemperatur, der Züchtungszeit, des Rührens und der Belüftung, sowohl bei der Anzucht des Züchtungsmateriales als auch für die Züchtung der Kulturen auf eine geeignete Zelldichte vor der Produktionsphase, sowie ferner auch für die Aufrechterhaltung der Züchtung während des Produktionszeitraumes können variieren und all diese möglichen Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend. 



  Die Konzentration der zweiwertigen Manganionen, also der Mn<+><+> in dem Medium, die nötig ist, um die enzymatisch aktive Mangan-Superoxid-dismutase herzustellen, variiert mit der Art des angewandten Mediums. 



  Es zeigte sich, dass bei einem Zuchtmedium des LB-Typs Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen im Bereich von 150 ppm bis 750 ppm wirksam sind. Es ist bevorzugt, dass in allen komplexen Typen der Wachstumsmedien die Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Medium im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm liegt. 



  Die speziellen Bestandteile für einen  geeigneten Stamm, das Züchtungsmedium, das Impfmedium und das Produktionsmedium können variieren und all diese Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben oder eines Mutanten derselben, und zwar ausgehend von Bakterienzellen, welche diese enthalten. Die Zellen werden zuerst behandelt, um eine Proteinfraktion zu gewinnen, welche Proteine enthält, die in den Zellen anwesend sind und zu diesen Proteinen gehört die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben. Dann wird die Proteinfraktion entsprechend behandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen. 



  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zunächst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand abzutrennen und die löslichen Proteine werden dann gewonnen. Die so gewonnenen löslichen Proteine werden dann behandelt um eine Fraktion der  löslichen Proteine abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält und diese Fraktion wird gewonnen. Die entsprechende Behandlung kann beispielsweise eine Ausfällung sein. Die Fraktion wird dann weiterbehandelt um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen. 



  In der Folge werden speziell bevorzugte Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung beschrieben. 



  Zuerst werden die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium isoliert und in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist. Die Zellen werden dann aufgebrochen und abzentrifugiert. 



  Das überstehende Material wird abgetrennt und während 30 bis 120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von etwa 55-65 DEG C erhitzt, vorzugsweise während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C, und speziell bevorzugt während einer Stunde auf 60 DEG C. Anschliessend an diese Erhitzungsphase wird dann auf eine Temperatur von weniger als 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 4 DEG C. Wenn sich während  dieses Kühlvorganges ein Niederschlag gebildet hat, dann wird dieser entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren und dann wird das gekühlte überstehende Material gegen einen geeigneten Puffer dialysiert. 



  Vorzugsweise wird das gekühlte überstehende Material durch eine Ultrafiltration dialysiert, indem man eine Filtrationsmembran verwendet, die kleiner als 30K ist, und speziell bevorzugt 10K ist. Als Beispiele für einen geeigneten Puffer sei ein 2 MM Kaliumphosphatpuffer genannt, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



  Nach dieser Dialyse oder gleichzeitig mit dieser Dialyse kann das gekühlte überstehende Material gegebenenfalls auf ein geeignetes Volumen konzentriert werden. Beispielsweise hat sich eine Konzentration auf 0,03 des ursprünglichen Volumens des überstehenden Materiales als geeignet herausgestellt. 



  Anschliessend wird das Material auf eine Anionenaustauscher enthaltende Chromatographiesäule aufgebracht, und man eluiert dieses Retentat mit einer geeigneten Pufferlösung, beispielsweise einer Lösung eines 20 mM Phosphatpuffers, die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



  Die Fraktionen des eluierten Materiales, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen, miteinander vereinigt und gegen eine etwa 40 mM Kaliumacetatlösung eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. 



  Diese vereinigten und dialysierten Fraktionen werden dann auf eine mit Kationenaustauscher gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen und man eluiert mit einem linearen Gradienten von etwa 40 mM Kaliumacetatlösung bis etwa 200 mM Kaliumacetatlösung, wobei diese Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufweisen. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt. Gegebenenfalls können dann die vereinigten Peakfraktionen gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung, die etwa 10 mM an Kaliumphosphat ist und die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gereinigte menschliche Mangan-superoxid-dismutase oder Analoge derselben oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind und wobei man im vorliegenden Zusammenhang unter dem Ausdruck "gereinigt" versteht, dass die fraglichen  Produkte im wesentlichen frei von anderen Substanzen menschlichen Ursprungs sind. 



  Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Analoges der menschlichen Mangan-superoxiddismutase, das mindestens zwei Polypeptide aufweist, von denen mindestens eines der Polypeptide diejenige Aminosäuresequenz besitzt, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert wird und das Carboxylatende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert wird und wobei in dieser Aminosäuresequenz ein zusätzlicher Methioninrest an das Stickstoffende der Aminosäuresequenz gebunden ist. Dieses Analoge der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase wird in der Folge mit Met-hMnSOD abgekürzt, wobei in dieser Abkürzung "Met" den zusätzlich gebundenen Methioninrest veranschaulicht.

  Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart dieses Produktes weist dieses gereinigte Met-hMnSOD eine spezifische Aktivität von mindestens 3500 Einheiten/mg auf. 



  Die vorliegende Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert. 



  Diese Beispiele sollen lediglich zu einem  noch besseren Verständnis des Erfindungsgegenstandes führen, sie sollen jedoch den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Es sei ferner darauf hingewiesen, dass diese Beispiele keine detaillierten Erläuterungen der üblichen Methoden enthalten, die bei dem Aufbau von Vektoren, der Einfügung von Genen, die für Polypeptide kodiert sind, in derartige Vektoren oder die Einführung der entsprechenden Plasmide in Wirte, bzw. Wirtzellen, betreffen. Die Beispiele enthalten ferner auch keine detaillierte Beschreibung üblicher Methoden, die angewandt werden, um Polypeptide zu testen, die durch derartige Wirt-Vektorsysteme produziert werden oder um die Identität derartiger Polypeptide durch Aktivitäts-Färbeverfahren von isoelektrisch fokussierenden Gelen, die in der Folge als IEF Gele bezeichnet werden, zu bestimmen.

  Derartige Arbeitsmethoden sind nämlich für den Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt und sie sind in vielen Publikationen näher beschrieben, wobei hier als Beispiel auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen sei: 



  T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sombrook, "Molecular Cloning", ein Laboratoriumshandbuch des Cold Spring Harbor Laboratoriums, New York, 1982. 



  J.M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969), sowie C. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971). 


 Beispiel 1 
 



  Um die MnSOD-cDNA-Klone zu identifizieren, wurden gemischte Oligormerproben synthetisiert, und zwar in Übereinstimmung mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz, die in zwei weiter vorne bereits genannten Veröffentlichungen beschrieben ist, und zwar in der Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M., in dem Buch Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) und in der Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984). 



  5 min -Probe - 30-mer-sequenz von AA15-AA24 (siehe diese beiden Veröffentlichungen. 
EMI58.1
 
EMI59.1
 



  3 min -Probe - 32-mer-sequenz von AA179-AA189 (siehe die zweite der beiden genannten Veröffentlichungen) 
EMI59.2
 



  Die 5 min -Probe besteht aus 30 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 15-24 des reifen MnSOD. 



  Die 3 min -Probe besteht aus 32 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 179-189 des reifen MnSOD. 



  Die 5 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 36 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben veranschaulicht wird. 



  Die 3 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 16 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben gezeigt ist. 



   Wenn in dem oben angegebenen Schema mehr als ein Nucleotid in einer vorgegebenen Position gezeigt wird, dann wurde der entsprechende DNA-Strang unter Ver wendung von äquimolaren Mengen jedes der beiden dargestellten Nucleotide synthetisiert und es handelt sich dementsprechend um eine gemischte Probe. 



  Die 5 min -Probe wurde verwendet um 300 000 Plaques einer T-Zelle-cDNA-genetischen Abschnittes (mit der englischen Bezeichnung T-cell cDNA library), der in einer  lambda -gt-10-Vector kloniert ist, zu screenen. Die Hybridisierung an Phagen-plaque-replicas, die auf Nitrozellulosefiltern immobilisiert sind, wurde nach Standard Arbeitsverfahren durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die unmittelbar vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von Maniatis et al. hingewiesen, wobei der Unterschied zu dem dort beschriebenen Verfahren darin bestand, dass die Hybridisierung bei 50 DEG C in 8 x SSC während 16 Stunden durchgeführt wurde. Die Filter wurden dann bei 50 DEG C mit 5 x SSC und 0,1% SDS gewaschen. Drei positive Plaques wurden isoliert und diese wurden als Phi MS8, bzw. als Phi MS1, bzw. als Phi MSlJ bezeichnet. 



  Das EcoRI verdaut die DNA von Phi MS8 und die DNA von Phi MSL und daraus sieht man, dass diese beiden Produkte cDNA-Einfügungen, die auch als cDNA-Inserts bezeichnet werden, aufweisen, die etwa 800 bp  lang sind und die beide mit dem 5 min  und dem 3 min  Oligonucleotid-proben hydridisieren. 



  Das Phi MSlJ trug nur die cDNA-Einfügung oder das cDNA-Insert einer Menge von 450 bp, welches nur mit der 5 min -Endprobe hybridisiert. 



  Die EcoRI-Inserts der drei Phagen-klone wurden in die EcoRI Stelle von pBR322 subkloniert und man erhielt dabei jeweils pMS8-4, bzw. pMS1-4, bzw. pMS1J. 



  Die Restriktionsanalyse und die Hybridisierung mit den 5 min und den 3 min  Oligonucleotid-proben ergaben ähnliche Muster, die auch als Pattern bezeichnet werden, für die beiden Produkte pMS8-4 und pMS1-4. 



   Die in Fig. 5 veranschaulichte Restriktions-karte zeigt die 5 min  -> 3 min  Orientierung, und diese wurde für beide Plasmide deduziert. 



  Die Sequenz des cDNA-Inserts von pMS8-4 ist in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die vorher-gesagte Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der Aminosäuresequenz der am Beginn dieses Beispiels genannten Veröffentlichung von Barra et al. dahingehend, dass an drei Stellen Glu anstelle von Gln aufscheint, und zwar an den Stellen AA 42, 88, 108 und dahingehend, dass zwei zusätzliche Aminosäuren, nämlich Gly und Trp zwischen AA123-124 aufscheinen. 



  Die Sequenzanalyse von pMS1-4 und pMS1J zeigte, dass drei MnSOD-Klone unabhängig abgeleitet wurden und diese Sequenzanalyse bestätigte die Unterschiede zu der früher veröffentlichten Aminosäuresequenz. 



  Die Sequenz oberhalb des Lysines der Stickstoffendgruppe, also des N-terminalen Lysines der reifen MnSOD ermöglicht die Vorhersage einer Präpeptid Sequenz von 24 Aminosäuren. 


 Beispiel 2 
 



  Aufbau des Plasmides, das die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt. 



  Das Plasmid, welches die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt, wird  in der Folge auch als Amp<R>-menschliche MnSOD-Expression Plasmid bezeichnet und als pMSE-4 abgekürzt. 



  Das Ausgangsprodukt für den Aufbau oder die Konstruktion dieses pMSE-4 ist das Plasmid pMS8-4, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. 



  Das Plasmid pMS8-4, welches menschliche MnSOD-cDNA auf einer EcoRI-Einfügung, die auch als EcoRI-Insert bezeichnet wird, enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI verdaut. Das grosse Fragment wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomeren verbunden, wie dies in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das dabei erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS8-NN, das ebenfalls in Fig. 2 dargestellt ist, enthält den kodierenden Bereich für die reife oder endgültige MnSOd, die in der englischsprachigen Literatur als mature MnSOD bezeichnet wird, und vor diesem Bereich befindet sich ein ATG-Initiations-codon. Das oben genannte Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, die Enden wurden mit dem Klenow-fragment der Polymerase I gefüllt und weiter mit NdeI gespalten. 



  Das kleine Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält, wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI  und StuI behandelt wurde. 



  Das genannte pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 beschrieben ist, die am 5. März 1986 veröffentlicht wurde. Alles was dort geoffenbart ist, trifft auch im vorliegenden Fall zu. 



  Dadurch wurde das Plasmid pMSE-4 erzeugt, welches einen die MnSOD kodierenden Bereich enthält, vor dem sich die cII-riosomale Bindungsstelle befindet und unter der Kontrolle des  lambda PL-Promoters. 



  Das Plasmid pMSE-4 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt. Alle Arbeitsmethoden, die bei dem oben beschriebenen Verfahren angewandt werden, sind im wesentlichen die gleichen, wie diejenigen, die in der Veröffentlichung von Maniatis et al., die vor dem Beispiel 1 genannt ist, beschrieben sind. 


 Beispiel 3 
 


 Expression der rekombinanten menschlichen MnSOD 
 



  Das Plasmid pMSE-4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingefügt. Anschliessend wurde der Escherichia coli  Stamm 4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 32 DEG C in einem Luria-Brühe-Medium gezüchtet, wobei das Medium 100  mu g/ml Medium an Ampicillin enthielt. Diese Züchtung wurde so lange durchgeführt, bis die optische Dichte, abgekürzt als "OD" bei 600 nm 0,7 betrug. 



  Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeitabständen wurden Proben genommen und diese wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelen getrennt. Diese Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel Electrophorese wird in der Folge mit "SDS-PAGE" abgekürzt. Aus dieser Gel Electrophorese war ersichtlich, dass der Spiegel an dem gebildeten menschlichen MnSOD bis zu 120 Minuten nach der Induktion anstieg. Zu diesem Zeitpunkt machte das recombinante MnSOD-Protein 27% der gesamten Zellproteine aus. Die entsprechende Bestimmung der Zellproteine wurde durch ein Scanning mit Gel durchgeführt, das mit Coomassie-Blau gefärbt war. 



  Die Ultraschallbehandlung der Proben während 90 Sekunden mit einem W-375-Ultraschallgerät und die Aufteilung der Proteine in lösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als s-Fraktionen bezeichnet werden und in unlösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als  p-Fraktionen bezeichnet werden, erfolgte durch Zentrifugieren unter Anwendung von 10 000 g während eines Zeitraumes von 5 Minuten. Dabei zeigte es sich, dass die geprüfte Menge der gebildeten rekombinanten MnSOD nicht löslich war. 



  Die induzierte lösliche Proteinfraktion enthielt nur etwas mehr an der MnSOD-Aktivität als die Proteinfraktion des nicht induzierten Parallelversuches. Diese Tests wurden nach den Standardmethoden durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von McCord et al. hingewiesen. 



  Offensichtlich ist ein Teil der MnSOD, die sich in der löslichen Fraktion befindet, inaktiv. Dies legt nahe, dass die grösste Menge der menschlichen MnSOD, die unter den Bedingungen dieses Beispiels produziert wird, tatsächlich inaktiv ist. 


 Beispiel 4 
 



  In diesem Beispiel wird der Einfluss der Konzentration an zweiwertigen Manganionen auf die Löslichkeit und die Aktivität der gebildeten MnSOD untersucht. 



  Es wurden zweiwertige Manganionen, also  Ionen Mn<+><+> in ansteigenden Konzentrationen zugegeben, bis ein Gehalt von 450 ppm (450 Teilen pro Million) in dem Wachstumsmedium erreicht war, in welchem der Escherichia coli Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, gezüchtet wurde. Die Zugabe der Manganionen erfolgte vor einer zwei Stunden dauernden Induktion bei 42 DEG C bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,7 und der Zusatz der Manganionen hatte keinen nachteiligen Einfluss auf die Gesamtausbeute an dem menschlichen MnSOD. 



  Nach der Ultraschallbehandlung wurden die löslichen Proteinfraktionen (s) und die nicht löslichen Proteinfraktionen (p) einer Gelelektrophorese auf eine Natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamidgel unterworfen. Diese Gelelektrophorese zeigte, dass die Löslichkeit des rekombinanten Proteines anstieg, wenn die Löslichkeit der zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium gesteigert wurde.

   Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 1 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Mn<++> in ppm im Zuchtmedium: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an gebildeter menschlicher MnSOD: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge des löslichen bakteriellen Proteines: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Pro-
teine:

   
<tb> <SEP>0 <SEP>30,6 <SEP>7,2 <SEP>30 
<tb> <SEP>50 <SEP>72,7 <SEP>15,4 <SEP>241 
<tb> <SEP>100 <SEP>78,0 <SEP>16,9 <SEP>356 
<tb> <SEP>150 <SEP>82,9 <SEP>18,8 <SEP>606 
<tb> <SEP>200 <SEP>82,0 <SEP>20,8 <SEP>338 
<tb> <SEP>250 <SEP>79,2 <SEP>20,4 <SEP>380 
<tb> <SEP>300 <SEP>80,8 <SEP>20,3 <SEP>381 
<tb> <SEP>450 <SEP>89,2 <SEP>22,4 <SEP>323 
<tb></TABLE> 



  Die in der Tabelle 1 angeführte MnSOD-Aktivität wurde nach demjenigen Verfahren getestet, das in der Veröffentlichung von McCord et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Wie man aus den in der Tabelle 1 angeführten Daten sieht, ist ein Zusammenhang zwischen ansteigenden Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium und der ansteigenden Löslichkeit der MnSOD festzustellen. Man sieht aus der Tabelle ferner, dass offensichtlich die  optimale Konzentration in dem Medium bei 150 ppm an zweiwertigen Manganionen liegt. Die entsprechenden Werte sind auch graphisch in Fig. 3 veranschaulicht und auch dort ist sehr deutlich zu sehen, dass die höchste spezifische Aktivität pro mg des löslichen Proteines erreicht wird, wenn die Konzentration an Manganionen in dem Medium 150 ppm beträgt. 



  Ausserdem aktivierten erhöhte Mangankonzentrationen in dem Zuchtmedium das früher inaktive lösliche Enzym. Lösliche Proteinfraktionen von induzierten Kulturen, die bei diesen Mangangehalten gezüchtet wurden, zeigten einen bis zu 60-fachen Anstieg in der SOD Aktivität im Vergleich zu löslichen Proteinfraktionen von nicht induzierten Kulturen, die bei gleichen Mangangehalten in der Kultur gezüchtet wurden. 



  Die Aktivitätsfärbung von isoelektrisch fokussierenden Gelen, also sogenannten IEF Gelen, wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in der Veröffentlichung von Beauchamp et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Diese Färbetechnik zeigte, dass viele Formen der rekombinanten MnSOD identisch mit denjenigen der nativen menschlichen Leber-MnSOD waren. 



  Die Ergebnisse, die für die Produktion von menschlicher MnSOD durch den Escherichia coli Stamm A1645, der das Plasmid pMSE-4 enthielt, erzielt wurden, waren ähnlich denjenigen Ergebnissen, die oben beschrieben sind. 


 Beispiel 5 
 


 Herstellung des Tet<R>-menschlichen MnSOD-Expressions- Plasmides. 
 



  Das Tet<R>-menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Expressions-Plasmid wird in der Folge mit pMS DELTA RB4 abgekürzt. Der Tet<R>-Expressionsvektor mit der Bezeichnung p DELTA RB, wurde aus pSOD beta 1T-11 hergestellt, indem man dieses einer vollständigen Verdauung mit dem Restriktionsenzym EcoRI unterwarf, worauf dann eine teilweise Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI erfolgte. 



  Das pSOD beta 1-T-11 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt worden. 



  Das verdaute Plasmid wurde mit dem synthetischen Oligomer der Struktur
 
 5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min 
 3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min  
 
 gebunden und man erhielt so das p DELTA RB des  lambda  PL Promoters. 



  Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches cII-ribosomale Bindungsstellen und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzymes enthält, wurde in die einzige EcoRI Stelle von p DELTA RB eingefügt, also insertiert. Das so erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von  lambda  PL und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin. 



  Das hier beschriebene Verfahren ist durch Fig. 4 veranschaulicht, in welcher oben links das Ausgangsprodukt pSOD beta 1T-11 veranschaulicht wird, einschliesslich der Stellen, wo die Spaltung mit den Restriktionsenzymen erfolgt, wobei das dabei entstehende grosse Fragment dann an den synthetischen Linker, nämlich das oben genannte synthetische Oligomere, gebunden wird. Auch das so hergestellte Endprodukt, nämlich das Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 ist in dieser Fig. 4 unten in der Mitte dargestellt. 


 Beispiel 6 
 


 Expression von menschlichem MnSOD durch das Plasmid PMS DELTA RB4 
 



  Das Plasmid pMS DELTA RB4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingeführt. 



  Man liess die Kulturen bei 32 DEG C in einer Luria-Brühe wachsen, welche verschiedene Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen enthielt, bis eine optische Dichte bei 600 nm von 0,7 erreicht wurde. 



  Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeiträumen wurden Proben genommen und diese Proben wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen untersucht. 



  Es zeigte sich, dass der Gehalt an menschlichem MnSOD in der Induktionszeit bis zum Zeitraum von 120 Minuten anstieg. Zu diesem Zeitpunkt betrug das menschliche MnSOD etwa 15% der gesamten Zellproteine, wie dies durch ein Scanning festgestellt werden konnte, das unter Verwendung von einem mit Coomassie-Blau gefärbtem Gel durchgeführt wurde. 



  Unabhängig von der Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Wachstumsmedium war das indu zierte MnSOD löslich. Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen, die im Beispiel 4 im Zusammenhang mit der Untersuchung des Amp<R>-Plasmides mit der Bezeichnung pMSE-4 gemacht wurden. 



  Auch in diesem Beispiel waren jedoch die maximale SOD Aktivität und das Ausmass der Expression, also der Expressionsspiegel, abhängig von der Menge an zweiwertigen Manganionen, die zur Verfügung gestellt wurden. 



  Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 2 
<tb>SubHead Col 01 to 04 AL=L: MnSOD-Expression in E.Coli A4255 (pMS DELTA RB4) 
<tb> 
<tb>Title: Gehalt an Mn<++> im Zuchtmedium in ppm 
<tb>Title: Prozentsatz an löslichem menschlichen MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an löslichen Bakterienproteinen 
<tb>Title:

   Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Proteine 
<tb> <SEP>42 DEG  DEG <SEP>32 DEG  DEG <SEP>42 DEG  DEG 
<tb> <SEP>0 <SEP>10,9 <SEP>8,0 <SEP>23 
<tb> <SEP>50 <SEP>19,8 <SEP>8,0 <SEP>227 
<tb> <SEP>100 <SEP>16,0 <SEP>8,0 <SEP>241 
<tb> <SEP>200 <SEP>17,0 <SEP>10,0 <SEP>278 
<tb> <SEP>300 <SEP>16,0 <SEP>9,3 <SEP>238 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 7 
 


 Reinigung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-superoxid-dismutase, die durch die rekombinante Gentechnologie hergestellt wurde. 
 



  Der Escherichia coli Stamm A4255 in dessen Zellen das Plasmid pMS DELTA RB4 aufgenommen worden war, wurde in Luria-Brühe gezüchtet, der 750 ppm an Mangan ionen, bezogen auf diese Brühe, zugesetzt worden waren. Die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 32 DEG C bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 17,0 erreicht hatte. Die Induktion der Expression der menschlichen MnSOD wurde durchgeführt, indem man während zwei Stunden lang eine Temperaturerhöhung auf 42 DEG C vornahm. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm  von 43,0 erreicht. Die Zellen wurden aus der Kultur gewonnen, indem man zentrifugierte und die so isolierten Zellen wurden dann in 0,2 des ursprünglichen Volumens an einem 50 mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,8 aufwies und 250 mM an Natriumchlorid enthielt, erneut suspendiert. 



  Die Bakterien wurden dann durch ein zweimaliges Hindurchleiten durch eine Vorrichtung mit der Bezeichnung Dynomill aufgebrochen und dann wurde zentrifugiert und die Zellbruchstücke wurden verworfen. 



  Das so gewonnene überstehende Material wurde eine Stunde lang auf 60 DEG C erhitzt und dann auf 4 DEG C abgekühlt und das darüber stehende Material einer Klärung unterworfen. Das geklärte überstehende Material wurde dann auf 0,03 seines ursprünglichen Volumens konzentriert und gegen einen 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 dialysiert, und zwar unter Ver wendung einer Ultrafiltrationseinrichtung der Bezeichnung Pelicon-Ultrafiltration Unit, die mit einer 10K Membran ausgestattet war. 



  Das so erhaltene rohe Enzympräparat wurde auf eine DE52-Säule aufgebracht, gründlich mit einem 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 gewaschen und dann erfolgte die Elution mit einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8. 



  Diejenigen Fraktionen, welche das Enzym enthielten, wurden miteinander vereinigt und dann gegen eine 40 mM Lösung von Kaliumacetat eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. Anschliessend wurde das Material auf eine CM52-Säule aufgebracht und die Elution wurde durchgeführt, indem man einen Lineargradienten von 40 mM Kaliumacetat bis 200 mM Kaliumacetat anwandte, wobei die Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufwiesen. 



  Diejenigen Peakfraktionen, die das menschliche MnSOD enthielten, wurden miteinander vereinigt und man  dialysierte  gegen Wasser. Anschliessend  wurde  das Enzympräparat  so  eingestellt,  dass  es sich in einem 10 mM Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 befand und dieses Produkt wurde dann bei -20 DEG C gefroren. 



  Das durch diese rekombinante Gentechnologie  gewonnene menschliche MnSOD war reiner als 99%ig und die spezifische Aktivität dieses Produktes betrug etwa 3500 Einheiten/mg. 



  Die Gesamtausbeute bei diesem Reinigungsverfahren betrug etwa 30%. 



  Diese Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellt. 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Tabelle 3 
<tb>SubHead Col 01 to 05 AL=L: Reinigung des durch rekombinante Gentechnologie gewonnenen menschlichen MnSOD 
<tb>Title: Reinigungsstufe 
<tb>Title: Gesamtmenge an Proteinen in g 
<tb>Title: Ausbeute in g 
<tb>Title: an MnSOD in % 
<tb>Title:

  Spezifische 
Aktivität in 
Einheiten/mg 
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der Behandlung mit der Dynomill <SEP>100,0 <SEP>11,9 <SEP>100,0 <SEP>417 
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der 
Erhitzung auf 60 DEG C <SEP>24,0 <SEP>8,2 <SEP>68,9 <SEP>1197 
<tb> <SEP>Retentat nach der Ultrafiltration mit der Peliconvorrichtung <SEP>20,0 <SEP>7,5 <SEP>63,0 <SEP>1350 
<tb> <SEP>Eluat aus der DE52-Säule <SEP>7,3 <SEP>5,7 <SEP>48,0 <SEP>2732 
<tb> <SEP>Eluat aus der CM52-Säule <SEP>4,2 <SEP>4,2 <SEP>35,3 <SEP>3500 
<tb></TABLE> 



  Die in der Tabelle 3 angegebenen Werte beziehen sich auf das gereinigte Enzym, das unter Verwendung eines 15 Liter fassenden Gärbehälters hergestellt wurde. 



   Der Metallgehalt des durch die rekombinante Gentechnologie hergestellten MnSOD wurde durch Atomabsorption bestimmt und es zeigte sich, dass etwa 0,77 Atome an Mangan pro Enzymuntereinheit vorhanden sind. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit den entsprechenden Ergebnissen, die von McCord et al. in dem weiter vorne genannten Buch "Superoxide und Superoxid-dismutase" veröffentlicht sind.