JPH0643340B2 - 虚血性心疾患治療薬 - Google Patents
虚血性心疾患治療薬Info
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- JPH0643340B2 JPH0643340B2 JP61205778A JP20577886A JPH0643340B2 JP H0643340 B2 JPH0643340 B2 JP H0643340B2 JP 61205778 A JP61205778 A JP 61205778A JP 20577886 A JP20577886 A JP 20577886A JP H0643340 B2 JPH0643340 B2 JP H0643340B2
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- Japan
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- human
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- heart disease
- ischemic heart
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は虚血性心疾患治療薬に関する。さらに詳しく
は、単細胞微生物特にヒト銅、亜鉛型スーパーオキシド
デイスムターゼ（またはヒト銅・亜鉛スーパーオキシド
ジスムターゼともいう）構造遺伝子を有する組換えＤＮ
Ａで形質転換された単細胞微生物中で産生されたヒトス
ーパーオキシドデイスムターゼと実質的に同一のアミノ
酸配列を有するポリペプチドを活性成分とする虚血性心
疾患治療薬に関する。
は、単細胞微生物特にヒト銅、亜鉛型スーパーオキシド
デイスムターゼ（またはヒト銅・亜鉛スーパーオキシド
ジスムターゼともいう）構造遺伝子を有する組換えＤＮ
Ａで形質転換された単細胞微生物中で産生されたヒトス
ーパーオキシドデイスムターゼと実質的に同一のアミノ
酸配列を有するポリペプチドを活性成分とする虚血性心
疾患治療薬に関する。
＜従来の技術＞ スーパーオキシドデイスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド
（・Ｏ２ −）を消失させる酵素である。
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド
（・Ｏ２ −）を消失させる酵素である。
・Ｏ２ −＋・Ｏ２ −＋２Ｈ＋→Ｏ２＋Ｈ２Ｏ２ スーパーオキシドは、生体における酸素毒性の中で最も
毒性の高い分子種で、炎症、未熟児酸素網膜症、放射線
障害、ガンなどの疾病を引き起こすと言われている。
毒性の高い分子種で、炎症、未熟児酸素網膜症、放射線
障害、ガンなどの疾病を引き起こすと言われている。
ところで、虚血性心疾患の代表的なものとして心筋梗塞
があるが、心筋梗塞においては、冠動脈の狭窄あるいは
閉塞により冠動脈の支配下にある心筋は血液の供給を受
けることができなくなって、酸素不足の状態となる。そ
の際電子伝達系から自由電子が放出され活性酸素が作ら
れることになる。
があるが、心筋梗塞においては、冠動脈の狭窄あるいは
閉塞により冠動脈の支配下にある心筋は血液の供給を受
けることができなくなって、酸素不足の状態となる。そ
の際電子伝達系から自由電子が放出され活性酸素が作ら
れることになる。
また、心筋梗塞の治療においては、外科的療法や薬物療
法等によって血流が再開されるが、その際に心臓は急激
に酸素負荷されて、細胞内の酸素分圧（ＰＯ２）を上昇
させて活性酸素の産生を高める。このことが血流再開の
障害（Reperfusion injurg）の一要因となっているとい
われている。
法等によって血流が再開されるが、その際に心臓は急激
に酸素負荷されて、細胞内の酸素分圧（ＰＯ２）を上昇
させて活性酸素の産生を高める。このことが血流再開の
障害（Reperfusion injurg）の一要因となっているとい
われている。
現在、心筋梗塞の治療法としては、大動脈−冠動脈バイ
パス法、大動脈内バルーンパンピング法の如き外科的療
法あるいは血管拡張薬、抗不整脈剤あるいは抗凝血剤等
を使用する薬物療法が知られているが、いずれも未だ十
分なものではない。
パス法、大動脈内バルーンパンピング法の如き外科的療
法あるいは血管拡張薬、抗不整脈剤あるいは抗凝血剤等
を使用する薬物療法が知られているが、いずれも未だ十
分なものではない。
一方、特開昭５７−１４１，２８８号公報には、ヒト細
胞スーパーオキシドデイスムターゼの特異抗体結合担体
を用いて、ヒト細胞からスーパーオキシドデイスムター
ゼを該担体に結合させて単離する方法が開示されてい
る。
胞スーパーオキシドデイスムターゼの特異抗体結合担体
を用いて、ヒト細胞からスーパーオキシドデイスムター
ゼを該担体に結合させて単離する方法が開示されてい
る。
特開昭５７−１５５，９９１号公報には、ヒト・胎盤の
水抽出液から４０〜５０％飽和硫安沈殿画分を除去した
後の７０〜８０％飽和硫安上清から、硫安分画、陰イオ
ンクロマトグラフィー、デルろ過等によってスーパーオ
キシドデイスムターゼを取得する方法が開示されてい
る。
水抽出液から４０〜５０％飽和硫安沈殿画分を除去した
後の７０〜８０％飽和硫安上清から、硫安分画、陰イオ
ンクロマトグラフィー、デルろ過等によってスーパーオ
キシドデイスムターゼを取得する方法が開示されてい
る。
また、特開昭５９−９１，８８１号公報には、不純な銅
亜鉛スーパーオキシドデイスムターゼを含有する溶液
を、非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と接触させ、次
いで該樹脂を洗浄し、さらに該樹脂に吸着した銅、亜鉛
スーパーオキシドデイスムターゼを溶出して精製する方
法が開示されている。
亜鉛スーパーオキシドデイスムターゼを含有する溶液
を、非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と接触させ、次
いで該樹脂を洗浄し、さらに該樹脂に吸着した銅、亜鉛
スーパーオキシドデイスムターゼを溶出して精製する方
法が開示されている。
＜発明が解決しようとする問題点＞ 本発明の目的は、ヒト・スーパーオキシドデイスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含有する虚血性心疾患治療薬を提供することにある。
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含有する虚血性心疾患治療薬を提供することにある。
本発明の他の目的は、遺伝子組換え技術によって製造し
た上記構造を持つポリペプチドを含有する虚血性心疾患
治療薬を提供することにある。
た上記構造を持つポリペプチドを含有する虚血性心疾患
治療薬を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。
らかとなろう。
＜問題点を解決するための手段及び作用＞ 本発明によれば、本発明の上記目的及び利点はヒトスー
パーオキシドデイスムターゼと実質的に同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドを活性成分とする虚血性心疾
患治療薬によって達成される。
パーオキシドデイスムターゼと実質的に同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドを活性成分とする虚血性心疾
患治療薬によって達成される。
上記ポリペプチドは、例えばポジテイブレギユレーシヨ
ンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、
亜鉛型スーパーオキシドデイスムターゼ構造遺伝子を有
する組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培
養物中に蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドデ
イスムターゼ（以下ヒトCu,Zn−ＳＯＤという）を採取
することによって製造される。
ンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、
亜鉛型スーパーオキシドデイスムターゼ構造遺伝子を有
する組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培
養物中に蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドデ
イスムターゼ（以下ヒトCu,Zn−ＳＯＤという）を採取
することによって製造される。
上記ヒトCu,Zn−ＳＯＤのcDNA合成の鋳型として用いら
れるmRNAは正常なヒト組織（肝臓、胎盤、腎臓など）か
ら分離される。組織からのＤＮＡの分離は、フエノール
−クロロホルム法、グアニジニウム−熱フエノール法、
グアニジニウム−塩化セシウム法などの公知の方法（Ma
niatis,T.ら，Molecular Cloning，１８７−１９８，１
９８２，Cold Spring Harbor Laboratory）が利用でき
る。次いでオリゴ（dT）セレロース、ポリ（Ｕ）セフア
ロースなどを用いてポリ（Ａ）テイルをもつｍＲＮＡを
分離する。
れるmRNAは正常なヒト組織（肝臓、胎盤、腎臓など）か
ら分離される。組織からのＤＮＡの分離は、フエノール
−クロロホルム法、グアニジニウム−熱フエノール法、
グアニジニウム−塩化セシウム法などの公知の方法（Ma
niatis,T.ら，Molecular Cloning，１８７−１９８，１
９８２，Cold Spring Harbor Laboratory）が利用でき
る。次いでオリゴ（dT）セレロース、ポリ（Ｕ）セフア
ロースなどを用いてポリ（Ａ）テイルをもつｍＲＮＡを
分離する。
このようにして得られたｍＲＮＡは、ヒトCu,Zn−ＳＯ
ＤのｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ混合物であるが、こ
れをそのままｃＤＮＡ合成に用いる。まず、逆転写酵素
を用いｍＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成し、
次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを用いて二
本鎖ｃＤＮＡを合成した後、適当なベクターに組込まれ
た形でｃＤＮＡを得る。これにはdG−dCまたはdA−dTホ
モポリマー結合法（Nelson,T.S.,Methods in Enzymolog
y,６８，４１，１９７９，Academic Press Inc.）やOka
yama-Berg法（Okayama,H.and Berg,P.,Mol.Cell.Bio
l.，２，１６１，１９８２）が利用できる。
ＤのｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ混合物であるが、こ
れをそのままｃＤＮＡ合成に用いる。まず、逆転写酵素
を用いｍＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成し、
次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを用いて二
本鎖ｃＤＮＡを合成した後、適当なベクターに組込まれ
た形でｃＤＮＡを得る。これにはdG−dCまたはdA−dTホ
モポリマー結合法（Nelson,T.S.,Methods in Enzymolog
y,６８，４１，１９７９，Academic Press Inc.）やOka
yama-Berg法（Okayama,H.and Berg,P.,Mol.Cell.Bio
l.，２，１６１，１９８２）が利用できる。
この場合のようにｍＲＮＡ混合物中の目的ｍＲＮＡ含量
が低い場合は、効率の高いOkayama-Berg法が好ましい。
この方法に必要なＤＮＡおよび宿主菌はフアルマシア
Ｐ．Ｌ．バイオケミカルズ社カタログNo.２７−４７５
０−０１として入手できる。
が低い場合は、効率の高いOkayama-Berg法が好ましい。
この方法に必要なＤＮＡおよび宿主菌はフアルマシア
Ｐ．Ｌ．バイオケミカルズ社カタログNo.２７−４７５
０−０１として入手できる。
このようにして得られる組換えＤＮＡをたとえばエシエ
リヒア・コリ（Escherichia coli）×１７７６株あるい
はＤＨ１株（Low,B.,Proc.Natl.Acad.Sci.，６０，１６
０，１９６８；Meselson,M.and Yuan,R.,Nature,２１
７，１１１０，１９６８；Hanahan,D.,J.Mol,Biol,１６
６，５５７，１９８３）に導入して形質転換させる。形
質転換法は公知の方法（重定勝或，細胞工学、Vol.２，
No.３，６１６，１９８３）またはそれに準ずる方法で
行うことができる。アンピシリン耐性などの薬剤耐性に
よりまず形質転換体を選別したのち、ヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄ遺伝子に対応すると考えられる塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドを化学合成しこれを３２Ｐで標識してプ
ローブとして用い、公知のコロニーハイブリダイゼーシ
ヨン法（Hanahan,D.ら、Methods in Enzymology,１０
０，３３３，１９８３）によりポジテイブなシグナルを
示した形質転換体を選択する。これらの形質転換体より
常法に従ってプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡ部分
の塩基配列をMaxam−Gilbert法（Maxam,A.M.and Gilber
t,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.,７４，５６０，１９７７）
またはジデオキシ法（Messing,J.ら，Nucleic Acids Re
s.,９，３０９，１９８１）によって決定し、ヒトCu,Zn
−ＳＯＤｃＤＮＡの存在を確認する。確認には、ヒト赤
血球より単離されたCu,Zn−ＳＯＤのアミノ酸配列（Jab
usch,J.R.,Biochemistry,１９，２３１０，１９８０）
またはダウン症候群患者に由来する樹立細胞株より分離
されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩基配列（Sher
man,L.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.，８０，５４６５，１
９８３）を参考にすることができる。
リヒア・コリ（Escherichia coli）×１７７６株あるい
はＤＨ１株（Low,B.,Proc.Natl.Acad.Sci.，６０，１６
０，１９６８；Meselson,M.and Yuan,R.,Nature,２１
７，１１１０，１９６８；Hanahan,D.,J.Mol,Biol,１６
６，５５７，１９８３）に導入して形質転換させる。形
質転換法は公知の方法（重定勝或，細胞工学、Vol.２，
No.３，６１６，１９８３）またはそれに準ずる方法で
行うことができる。アンピシリン耐性などの薬剤耐性に
よりまず形質転換体を選別したのち、ヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄ遺伝子に対応すると考えられる塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドを化学合成しこれを３２Ｐで標識してプ
ローブとして用い、公知のコロニーハイブリダイゼーシ
ヨン法（Hanahan,D.ら、Methods in Enzymology,１０
０，３３３，１９８３）によりポジテイブなシグナルを
示した形質転換体を選択する。これらの形質転換体より
常法に従ってプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡ部分
の塩基配列をMaxam−Gilbert法（Maxam,A.M.and Gilber
t,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.,７４，５６０，１９７７）
またはジデオキシ法（Messing,J.ら，Nucleic Acids Re
s.,９，３０９，１９８１）によって決定し、ヒトCu,Zn
−ＳＯＤｃＤＮＡの存在を確認する。確認には、ヒト赤
血球より単離されたCu,Zn−ＳＯＤのアミノ酸配列（Jab
usch,J.R.,Biochemistry,１９，２３１０，１９８０）
またはダウン症候群患者に由来する樹立細胞株より分離
されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩基配列（Sher
man,L.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.，８０，５４６５，１
９８３）を参考にすることができる。
次に、得られたヒトCu,Zn−ＳＯＤのｃＤＮＡを適当な
形質発現調節遺伝子の下流に連結する。これにはトリプ
トフアンオペロンプロモーター（trpプロモーター）、
ラクトースオペロンプロモーター（lacプロモータ
ー）、λフアージのＰＬプロモーター、tacプロモータ
ーなどの公知のプロモーターが利用できる。
形質発現調節遺伝子の下流に連結する。これにはトリプ
トフアンオペロンプロモーター（trpプロモーター）、
ラクトースオペロンプロモーター（lacプロモータ
ー）、λフアージのＰＬプロモーター、tacプロモータ
ーなどの公知のプロモーターが利用できる。
しかし、ここで注目すべきことは、生体内にはＯ２ −を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦，スー
パーオキサイドと医学，５８，１９８１，共立出版）、
従って、Ｏ２ −を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量に産生させることが好ましい。
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦，スー
パーオキサイドと医学，５８，１９８１，共立出版）、
従って、Ｏ２ −を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量に産生させることが好ましい。
エシエリヒア・コリから分離されたプラスミドCol Ｅ
１ 上に存在するコリシンＥ１遺伝子はコリシンＥ１タ
ンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常の状態
においてはリプレツサータンパクがオペレーターに結合
することにより遺伝子の発現は抑制されているが、ＤＮ
Ａに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線照射、マ
イトマイシンＣ処理、ナリジキシン酸処理などによりこ
の抑制が解除されて誘発が起り、。コリシンＥ１タンパ
クが多量につくられる。これはいわゆる負の制御と呼ば
れる調節機構である。これに加えて、コリシンＥ１遺伝
子には正の制御も存在しており（調恒明ら、生化学、Vo
l.５６，No.８，１０８２，１９８４）、ユニークな形
質発現調節機構を持つ遺伝子であって、誘発時には正の
制御の効果も加わってきわめて多量のコリシンＥ１タン
パク質が産生される。さらにコリシンＥ１タンパク質は
エシエリヒア・コリに対する抗菌性を機能とするタンパ
ク質であって、通常時の細胞の成育には必要ないタンパ
ク質とみなし得るものであり、その性質上、通常時のコ
リシンＥ１遺伝子の発現が厳密に抑制されていることか
らも、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の利用
は本発明にとってきわめて有利である。
１ 上に存在するコリシンＥ１遺伝子はコリシンＥ１タ
ンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常の状態
においてはリプレツサータンパクがオペレーターに結合
することにより遺伝子の発現は抑制されているが、ＤＮ
Ａに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線照射、マ
イトマイシンＣ処理、ナリジキシン酸処理などによりこ
の抑制が解除されて誘発が起り、。コリシンＥ１タンパ
クが多量につくられる。これはいわゆる負の制御と呼ば
れる調節機構である。これに加えて、コリシンＥ１遺伝
子には正の制御も存在しており（調恒明ら、生化学、Vo
l.５６，No.８，１０８２，１９８４）、ユニークな形
質発現調節機構を持つ遺伝子であって、誘発時には正の
制御の効果も加わってきわめて多量のコリシンＥ１タン
パク質が産生される。さらにコリシンＥ１タンパク質は
エシエリヒア・コリに対する抗菌性を機能とするタンパ
ク質であって、通常時の細胞の成育には必要ないタンパ
ク質とみなし得るものであり、その性質上、通常時のコ
リシンＥ１遺伝子の発現が厳密に抑制されていることか
らも、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の利用
は本発明にとってきわめて有利である。
Col Ｅ１ ＤＮＡはたとえばフアルマシアＰ．Ｌ．バ
イオケミカルズ社のカタログNo.２７−４９１４−０１
として入手することが可能である。また、正の制御に関
与する領域、プロモーター・オペレーター領域、リボソ
ーム結合領域からなるコリシンＥ１遺伝子の形質発現調
節遺伝子の塩基配列は既に報告されている（Ebina,Y.
ら，Gene,１５，１１９，１９８１）。なお、本発明に
おけるコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子とは、
第１図の−１４０から７８番目までの塩基配列の存在を
必須とするものである。
イオケミカルズ社のカタログNo.２７−４９１４−０１
として入手することが可能である。また、正の制御に関
与する領域、プロモーター・オペレーター領域、リボソ
ーム結合領域からなるコリシンＥ１遺伝子の形質発現調
節遺伝子の塩基配列は既に報告されている（Ebina,Y.
ら，Gene,１５，１１９，１９８１）。なお、本発明に
おけるコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子とは、
第１図の−１４０から７８番目までの塩基配列の存在を
必須とするものである。
コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ ｃＤＮＡを連結する際に、いわゆる融
合タンパク質を産生するような形での連結は、適当な制
限酵素の切断部位を利用することにより比較的容易に行
うことができる。しかし、コリシンＥ１タンパク質に由
来する部分がある程度以上の長さを持っている場合、こ
の融合タンパク質を人体に投与した際に免疫原性（抗原
性）を発揮する危険性が充分に考えられる。従って、コ
リシンＥ１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直後に
ヒトCu,Zn−ＳＯＤのＮ末端アミノ酸コドンが連結され
る形が好ましい。しかし、これを満足させてくれるよう
な適当な制限酵素の切断部位はどちらの遺伝子にも存在
しない。そこで、制限酵素を用いて両方のＤＮＡ断片を
必要部分が欠失した形で切り出し、欠失した部分は合成
ＤＮＡ断片により補間することができる。
Cu,Zn−ＳＯＤ ｃＤＮＡを連結する際に、いわゆる融
合タンパク質を産生するような形での連結は、適当な制
限酵素の切断部位を利用することにより比較的容易に行
うことができる。しかし、コリシンＥ１タンパク質に由
来する部分がある程度以上の長さを持っている場合、こ
の融合タンパク質を人体に投与した際に免疫原性（抗原
性）を発揮する危険性が充分に考えられる。従って、コ
リシンＥ１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直後に
ヒトCu,Zn−ＳＯＤのＮ末端アミノ酸コドンが連結され
る形が好ましい。しかし、これを満足させてくれるよう
な適当な制限酵素の切断部位はどちらの遺伝子にも存在
しない。そこで、制限酵素を用いて両方のＤＮＡ断片を
必要部分が欠失した形で切り出し、欠失した部分は合成
ＤＮＡ断片により補間することができる。
合成ＤＮＡ断片は、たとえば固相トリエステル法（Miyo
shi,K.ら、Nucl.Acids Res.，８，５５０７，１９８
０）によりオリゴヌクレオチドを化学合成し、これらを
たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼでつなぎ合せることにより
得られる。合成ＤＮＡ断片は、もとの塩基配列を再現す
るものである必要は必ずしもない。アミノ酸コドンには
縮重が存在し、かつ生物の種によってコドンの使用頻度
が異なることは良く知られている。従って、アミノ酸の
配列を変えない限りにおいては、合成ＤＮＡ断片の作製
時にどのようなコドンを選んでも自由であるが、宿主菌
中で使用頻度の高いコドンを選択すると、遺伝子の発現
量の増大が期待できる。コリシンＥ１遺伝子の形質発現
調節遺伝子領域に関しては、もとの塩基配列を再現する
方が好ましいが、結果として遺伝子の発現量の増加につ
ながるような塩基配列の変更は採用できる。
shi,K.ら、Nucl.Acids Res.，８，５５０７，１９８
０）によりオリゴヌクレオチドを化学合成し、これらを
たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼでつなぎ合せることにより
得られる。合成ＤＮＡ断片は、もとの塩基配列を再現す
るものである必要は必ずしもない。アミノ酸コドンには
縮重が存在し、かつ生物の種によってコドンの使用頻度
が異なることは良く知られている。従って、アミノ酸の
配列を変えない限りにおいては、合成ＤＮＡ断片の作製
時にどのようなコドンを選んでも自由であるが、宿主菌
中で使用頻度の高いコドンを選択すると、遺伝子の発現
量の増大が期待できる。コリシンＥ１遺伝子の形質発現
調節遺伝子領域に関しては、もとの塩基配列を再現する
方が好ましいが、結果として遺伝子の発現量の増加につ
ながるような塩基配列の変更は採用できる。
自律複製できるベクターに、コリシンＥ１遺伝子の形質
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成ＤＮＡ断片、ヒ
トCu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子断片を正しく組込むことに
より目的の組換えＤＮＡが得られる。これらのＤＮＡ断
片は、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結すること
ができ、最終的に得られる組換えＤＮＡの構造が目的と
するものである限り、ＤＮＡ断片の連結順序に制限はな
い。使用するベクターは宿主微生物内で複製可能なもの
であれば特に制限はなく、宿主がエシエリヒア・コリの
場合はpBR３２２が良く用いられている。
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成ＤＮＡ断片、ヒ
トCu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子断片を正しく組込むことに
より目的の組換えＤＮＡが得られる。これらのＤＮＡ断
片は、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結すること
ができ、最終的に得られる組換えＤＮＡの構造が目的と
するものである限り、ＤＮＡ断片の連結順序に制限はな
い。使用するベクターは宿主微生物内で複製可能なもの
であれば特に制限はなく、宿主がエシエリヒア・コリの
場合はpBR３２２が良く用いられている。
得られた組換えＤＮＡをベクターの宿主微生物内に導入
し形質転換させる。本発明では宿主微生物としてエシエ
リヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、
特にコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子が機能す
る限りにおいては、バチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis）、サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyc
es cerevisiae）等の他の微生物も使用できる。エシエ
リヒア・コリの場合はＷ３１１０株、２０Ｓ０株、Ｃ６
００Ｓ株などの名前があげられる。特にＷ３１１０株が
好ましい。Ｗ３１１０株はエシエリヒア・コリＫ１２株
の野性株（λ＋，Ｆ＋）から誘導されたλ−，Ｆ−株で
あり、栄養要求性などその他の点では野性株と同一であ
る（Bachmann,B.J.,Bacteriological Reviews,３６，５
２５，１９７２）。
し形質転換させる。本発明では宿主微生物としてエシエ
リヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、
特にコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子が機能す
る限りにおいては、バチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis）、サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyc
es cerevisiae）等の他の微生物も使用できる。エシエ
リヒア・コリの場合はＷ３１１０株、２０Ｓ０株、Ｃ６
００Ｓ株などの名前があげられる。特にＷ３１１０株が
好ましい。Ｗ３１１０株はエシエリヒア・コリＫ１２株
の野性株（λ＋，Ｆ＋）から誘導されたλ−，Ｆ−株で
あり、栄養要求性などその他の点では野性株と同一であ
る（Bachmann,B.J.,Bacteriological Reviews,３６，５
２５，１９７２）。
テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのち、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
酵素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う。
さらに誘発時のヒトCu,Zn−ＳＯＤの産生能によって目
的の形質転換体を選択する。
したのち、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
酵素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う。
さらに誘発時のヒトCu,Zn−ＳＯＤの産生能によって目
的の形質転換体を選択する。
ＳＯＤ活性の測定法としては、チトクロームＣ−キサン
チン−キサンチンオキシダーゼを用いる方法（McCord,
J.M.and Fridovich,I.,J.Biol.Chem.，２４４，６０４
９，１９６９）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢ
Ｔ）−リボフラビンを用いる方法（Beauchamp,C.and Fr
idovich,I.,Anal.Biochem.，４４，２７６，１９７１）
等が利用できる。ＮＢＴ−リボフラビン法は簡便であ
り、電気泳動後のタンパクの活性染色にも利用できるた
め便利である。エシエリヒア・コリの場合について言う
と、組換えＤＮＡから産生されるヒトCu,Zn−ＳＯＤに
加えて、宿主染色体から産生されるMn−ＳＯＤおよびFe
−ＳＯＤが混在している。これらのＳＯＤの酵素として
の作用は同一であるが、Cu,Zn−ＳＯＤは１〜２mMのＣ
Ｎ−イオンによって活性が阻害されるのに対し、Mn−Ｓ
ＯＤ，Fe−ＳＯＤは同条件下での阻害を受けないことか
ら区別できる。また、これら３種のＳＯＤは分子量や等
電点が互いに異なるため、電気泳動、イオン交換または
ゲル過カラムクロマトグラフイーによって分離するこ
とができる。
チン−キサンチンオキシダーゼを用いる方法（McCord,
J.M.and Fridovich,I.,J.Biol.Chem.，２４４，６０４
９，１９６９）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢ
Ｔ）−リボフラビンを用いる方法（Beauchamp,C.and Fr
idovich,I.,Anal.Biochem.，４４，２７６，１９７１）
等が利用できる。ＮＢＴ−リボフラビン法は簡便であ
り、電気泳動後のタンパクの活性染色にも利用できるた
め便利である。エシエリヒア・コリの場合について言う
と、組換えＤＮＡから産生されるヒトCu,Zn−ＳＯＤに
加えて、宿主染色体から産生されるMn−ＳＯＤおよびFe
−ＳＯＤが混在している。これらのＳＯＤの酵素として
の作用は同一であるが、Cu,Zn−ＳＯＤは１〜２mMのＣ
Ｎ−イオンによって活性が阻害されるのに対し、Mn−Ｓ
ＯＤ，Fe−ＳＯＤは同条件下での阻害を受けないことか
ら区別できる。また、これら３種のＳＯＤは分子量や等
電点が互いに異なるため、電気泳動、イオン交換または
ゲル過カラムクロマトグラフイーによって分離するこ
とができる。
このようにして得られた、形質発現調節遺伝子、特には
コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質
転換された微生物を、その宿主微生物の増殖に適した条
件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を行わせて
ヒトCu,Zn−ＳＯＤを大量に産生させる。エシエリヒア
・コリの場合、たとえばＬ培地、グルコースおよびカザ
ミノ酸を含むＭ９培地などの公知の培地により培養を行
う。培養は通常１５〜４３℃の温度で２〜２４時間行
う。必要により通気、撹拌を加えることができる。対数
増殖期にある培養物にマイトマイシンＣ、ナリジキシン
酸などの薬剤を添加したり、紫外線を照射することによ
り誘発合成を行わせることができる。
コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質
転換された微生物を、その宿主微生物の増殖に適した条
件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を行わせて
ヒトCu,Zn−ＳＯＤを大量に産生させる。エシエリヒア
・コリの場合、たとえばＬ培地、グルコースおよびカザ
ミノ酸を含むＭ９培地などの公知の培地により培養を行
う。培養は通常１５〜４３℃の温度で２〜２４時間行
う。必要により通気、撹拌を加えることができる。対数
増殖期にある培養物にマイトマイシンＣ、ナリジキシン
酸などの薬剤を添加したり、紫外線を照射することによ
り誘発合成を行わせることができる。
培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパク質の精製法に従ってヒトCu,Zn−Ｓ
ＯＤ活性を持つタンパク質を単離することによりヒトC
u,Zn−ＳＯＤが製造できる。精製は、たとえば熱処理、
塩析、濃縮、透析、イオン交換クロマトグラフイー、ゲ
ル過クロマトグラフイー、クロマトフオーカシング、
電気泳動、高束液体クロマトグラフイー、アフイニテイ
クロマトグラフイーなどの操作を適宜組合せて行うこと
ができる。
られているタンパク質の精製法に従ってヒトCu,Zn−Ｓ
ＯＤ活性を持つタンパク質を単離することによりヒトC
u,Zn−ＳＯＤが製造できる。精製は、たとえば熱処理、
塩析、濃縮、透析、イオン交換クロマトグラフイー、ゲ
ル過クロマトグラフイー、クロマトフオーカシング、
電気泳動、高束液体クロマトグラフイー、アフイニテイ
クロマトグラフイーなどの操作を適宜組合せて行うこと
ができる。
かくして製造されたヒトスーパーオキシドデイスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、虚血性心疾患の治療薬としての活性を示す。
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、虚血性心疾患の治療薬としての活性を示す。
本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って注射剤、
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソーム製剤などの製剤
とすることができる。
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソーム製剤などの製剤
とすることができる。
本発明のポリペプチドは、例えば１〜１０mgの量で好適
に用いられ、あるいは１日０．０１７〜０．１７mg／kg
・体重の投与量で１回〜数回に分けて例えば急性心筋梗
塞の治療を目的として、経口的また非経口的に投与し得
る。
に用いられ、あるいは１日０．０１７〜０．１７mg／kg
・体重の投与量で１回〜数回に分けて例えば急性心筋梗
塞の治療を目的として、経口的また非経口的に投与し得
る。
以下に実施例および参考例を示す。
参考例１ ヒトCu,Zn−ＳＯＤのｃＤＮＡを組込んだプ
ラスミドｐＳＯＤ２の作製： 正常分娩によって得られたヒト胎盤からグアニジウム−
塩化セシウム法によってＲＮＡを分離し、ついでオリゴ
（dT）セルロースを用いてポリ（Ａ）テイルをもったｍ
ＲＮＡを分離した。
ラスミドｐＳＯＤ２の作製： 正常分娩によって得られたヒト胎盤からグアニジウム−
塩化セシウム法によってＲＮＡを分離し、ついでオリゴ
（dT）セルロースを用いてポリ（Ａ）テイルをもったｍ
ＲＮＡを分離した。
得られたｍＲＮＡより、Okayama−Berg法に従って、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した。宿主菌として大腸菌Ｄ
Ｈ１株を用いた。
ＤＮＡライブラリーを作成した。宿主菌として大腸菌Ｄ
Ｈ１株を用いた。
コロニーハイブリダイゼーシヨン法にて、ヒトCu,Zn−
ＳＯＤのｃＤＮＡが組込まれたプラスミドｐＳＯＤ２を
保持した大腸菌ＤＨ１（ｐＳＯＤ２）株を得た。この菌
株より常法に従ってプラスミドｐＳＯＤ２を単離した。
ＳＯＤのｃＤＮＡが組込まれたプラスミドｐＳＯＤ２を
保持した大腸菌ＤＨ１（ｐＳＯＤ２）株を得た。この菌
株より常法に従ってプラスミドｐＳＯＤ２を単離した。
参考例２ ヒトCu,Zn−ＳＯＤ産生用組換換えＤＮＡの
作製： コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を連結して、ヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄを産生させるためのプラスミドは、第３図に示すスト
ラテジーに従って作製した。
作製： コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を連結して、ヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄを産生させるためのプラスミドは、第３図に示すスト
ラテジーに従って作製した。
（１）コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子断片を
組込んだプラスミドｐＡＯＫ１の作製： コリシンＥ１ＤＮＡをDraIで切断し、ついで、StuIで切
断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で３
４０bpのStuI−DraI断片を得た。この断片をプラスミド
ｐＢＲ３２２のDraIサイトに挿入し、プラスミドｐＡＯ
Ｋ１を作製した。
組込んだプラスミドｐＡＯＫ１の作製： コリシンＥ１ＤＮＡをDraIで切断し、ついで、StuIで切
断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で３
４０bpのStuI−DraI断片を得た。この断片をプラスミド
ｐＢＲ３２２のDraIサイトに挿入し、プラスミドｐＡＯ
Ｋ１を作製した。
（２）ヒトCu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子断片の作製： プラスミドｐＳＯＤ２をAluIで切断し、ついでTaqIで切
断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で４
４０bp断片を得た。
断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で４
４０bp断片を得た。
（３）合成ＤＮＡの作製： コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を連結するために、コリシン
Ｅ１ ３４０bp断片およびＳＯＤ構造遺伝子の４４０bp
断片で欠失している部分８４bpを第４図に示すように１
２個のオリゴペプチドに分割して合成した。
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を連結するために、コリシン
Ｅ１ ３４０bp断片およびＳＯＤ構造遺伝子の４４０bp
断片で欠失している部分８４bpを第４図に示すように１
２個のオリゴペプチドに分割して合成した。
（４）ヒトCu,Zn−ＳＯＤ産生用組換えＤＮＡの作製： プラスミドｐＡＯＫ１のDraIサイトに、８４bpの合成Ｄ
ＮＡと、４４０bpのＳＯＤ構造遺伝子断片を挿入し、コ
リシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流に、ヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子が連結したヒトCu,Zn−ＳＯＤ
産生用組換えＤＮＡｐＵＢＥ２を得た。
ＮＡと、４４０bpのＳＯＤ構造遺伝子断片を挿入し、コ
リシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流に、ヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子が連結したヒトCu,Zn−ＳＯＤ
産生用組換えＤＮＡｐＵＢＥ２を得た。
参考例３ ヒトCu,Zn−ＳＯＤを産生する組換え大腸菌
５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株の作製： ＳＯＢ培地でＯＤ５５０＝０．５５まで培養した大腸菌
５４５πＨＲ株をTfbI、ついでTfbIIで処理したのち、
処理液にプラスミドｐＵＢＥ２を加え、０℃で３０分
間、ついで４２℃で９０秒間熱処理して、プラスミドｐ
ＵＢＥ２を保持する大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）
株を得た。
５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株の作製： ＳＯＢ培地でＯＤ５５０＝０．５５まで培養した大腸菌
５４５πＨＲ株をTfbI、ついでTfbIIで処理したのち、
処理液にプラスミドｐＵＢＥ２を加え、０℃で３０分
間、ついで４２℃で９０秒間熱処理して、プラスミドｐ
ＵＢＥ２を保持する大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）
株を得た。
参考例４ ヒトCu,Zn−ＳＯＤと実質上同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドの製造： カザミノ酸３００ｇ、グルコース４００ｇ、テトラサイ
クリン１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４６００ｇ、KH2PO4３００
ｇ、ＮａＣｌ５０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ１００ｇ、CuCl2・２
Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．９ｇを含む
培地１００に大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）を接
種し、クレツト１１６まで３７℃で撹拌（２０００rp
m）培養後、培養液にＮａ２ＨＰＯ４６００ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４３００ｇ、ＮａＣｌ５０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ１００ｇ
を含む水２、グルコース４５０ｇを含む水１とマイ
トマイシンＣ２００mgを含む水５００mlを加えて誘発合
成を３７℃、２時間行わせた。シヤープレス型遠心分離
機での遠心（２０００rpm、３時間）により３４４ｇの
湿菌体を得た。
配列を有するポリペプチドの製造： カザミノ酸３００ｇ、グルコース４００ｇ、テトラサイ
クリン１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４６００ｇ、KH2PO4３００
ｇ、ＮａＣｌ５０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ１００ｇ、CuCl2・２
Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．９ｇを含む
培地１００に大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）を接
種し、クレツト１１６まで３７℃で撹拌（２０００rp
m）培養後、培養液にＮａ２ＨＰＯ４６００ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４３００ｇ、ＮａＣｌ５０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ１００ｇ
を含む水２、グルコース４５０ｇを含む水１とマイ
トマイシンＣ２００mgを含む水５００mlを加えて誘発合
成を３７℃、２時間行わせた。シヤープレス型遠心分離
機での遠心（２０００rpm、３時間）により３４４ｇの
湿菌体を得た。
集菌した菌体を３の１０ｍＭトリエタノールアミン緩
衝液（pH７．０）に懸濁して、ダイノミルで破砕した。
破砕液を遠心（９０００rpm，６０分間）し、得られた
粗抽出液の全量を３．５とした。粗抽出液に１ＭＣｕ
Ｃｌ２水溶液０．３５mlを加え、一晩撹拌したのち６０
℃で５分間加熱処理した。生じた沈殿を９０００rpm、
２０分間の遠心により除去した。上清から硫安沈殿によ
って７０〜９５％飽和画分を回収し、透析後イオン交換
セルロースＤＥ５２カラムクロマトグラフイーにかけ
て、２０ｍＭ ＮａＣｌ濃度（１０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液）で溶出しＳＯＤ活性画分を得た。この画
分から１００％飽和硫安で分離した硫安沈殿を遠心（１
５０００rpm、１０分）で得、透析後、凍結乾燥してヒ
トCu,Zn−ＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを得た（９９０mg）。
衝液（pH７．０）に懸濁して、ダイノミルで破砕した。
破砕液を遠心（９０００rpm，６０分間）し、得られた
粗抽出液の全量を３．５とした。粗抽出液に１ＭＣｕ
Ｃｌ２水溶液０．３５mlを加え、一晩撹拌したのち６０
℃で５分間加熱処理した。生じた沈殿を９０００rpm、
２０分間の遠心により除去した。上清から硫安沈殿によ
って７０〜９５％飽和画分を回収し、透析後イオン交換
セルロースＤＥ５２カラムクロマトグラフイーにかけ
て、２０ｍＭ ＮａＣｌ濃度（１０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液）で溶出しＳＯＤ活性画分を得た。この画
分から１００％飽和硫安で分離した硫安沈殿を遠心（１
５０００rpm、１０分）で得、透析後、凍結乾燥してヒ
トCu,Zn−ＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを得た（９９０mg）。
実施例１（マウスにおける急性毒性試験） ddY系雄マウス（体重３２±２ｇ）１群８匹を用いて、
本物質を生理食塩液に溶解し、静脈内（ｉ．ｖ．）投与
した。投与量は３０mg／kg、１００mg／kg、３００mg／
kgの３群である。投与後２週間中毒症状について観察し
たが、各群ともに異常なく生存した。屠殺後の解剖所見
においても、生理食塩液のみを投与したコントロール群
と何ら変わるところがなかった。従って、マウスにおけ
る本物質の静脈内投与におけるＬＤ５０値は３００mg／
kg以上である（第１表参照）。
本物質を生理食塩液に溶解し、静脈内（ｉ．ｖ．）投与
した。投与量は３０mg／kg、１００mg／kg、３００mg／
kgの３群である。投与後２週間中毒症状について観察し
たが、各群ともに異常なく生存した。屠殺後の解剖所見
においても、生理食塩液のみを投与したコントロール群
と何ら変わるところがなかった。従って、マウスにおけ
る本物質の静脈内投与におけるＬＤ５０値は３００mg／
kg以上である（第１表参照）。
実施例２（急性心筋梗塞に対する効果） 体重１０〜１２kgの雑種成犬をControl６例、ヒトCu,Zn
−ＳＯＤ投与群６例、計１２例を用いた。
−ＳＯＤ投与群６例、計１２例を用いた。
実験犬をＧＯＦ麻酔下で胸骨縦切開により開胸した。左
冠動脈回旋枝（ＬＣＣＡ）根部をクレンメにより完全に
閉塞させることにより急性心筋梗塞モデルを作製した。
ヒトCu,Zn−ＳＯＤ（Control群では生理食塩水）は、Ｌ
ＣＣＡ閉塞１０分前から血流再開後３０分まで１０分毎
に左心房へ留置したカテーテルより、第５図に示したス
ケジユールに従って、総量６０mgを投与した。
冠動脈回旋枝（ＬＣＣＡ）根部をクレンメにより完全に
閉塞させることにより急性心筋梗塞モデルを作製した。
ヒトCu,Zn−ＳＯＤ（Control群では生理食塩水）は、Ｌ
ＣＣＡ閉塞１０分前から血流再開後３０分まで１０分毎
に左心房へ留置したカテーテルより、第５図に示したス
ケジユールに従って、総量６０mgを投与した。
ＬＣＣＡ遮断時間は９０分とし、その後血流を再開さ
せ、６時間後に屠殺し心臓を摘出し、ＴＴＣ（Tripheny
l Tetrazorium Chloride）により染色し、梗塞率を測定
した。
せ、６時間後に屠殺し心臓を摘出し、ＴＴＣ（Tripheny
l Tetrazorium Chloride）により染色し、梗塞率を測定
した。
梗塞率は次のようにして求められる。
摘出心標本のＬＣＣＡ根部をクランプする。その状態
で、左冠動脈からＴＴＣ溶液を灌流させ、また右冠動脈
及び左冠動脈前下降枝からEvans Blue溶液を灌流させ
る。この方法によれば、冠動脈遮断により影響を受けな
い部分はEvans Blueによって青く染まり、該遮断により
影響を受ける部分はＴＴＣによって赤く染まるか（生き
ている部分）あるいは染まらず白のままである（梗塞部
分）。
で、左冠動脈からＴＴＣ溶液を灌流させ、また右冠動脈
及び左冠動脈前下降枝からEvans Blue溶液を灌流させ
る。この方法によれば、冠動脈遮断により影響を受けな
い部分はEvans Blueによって青く染まり、該遮断により
影響を受ける部分はＴＴＣによって赤く染まるか（生き
ている部分）あるいは染まらず白のままである（梗塞部
分）。
染料溶液の灌流が終了したのち、この摘出心から左心
房、右心房を除去して左心室および右心室のみとし、こ
の部分を横方向に６〜７切片にスライスした。それぞれ
のスライスの重量並びに切断して青色部分、赤色部分お
よび白色部分の重量を測定した。
房、右心房を除去して左心室および右心室のみとし、こ
の部分を横方向に６〜７切片にスライスした。それぞれ
のスライスの重量並びに切断して青色部分、赤色部分お
よび白色部分の重量を測定した。
第６図には、摘出心を染料溶液で灌流したのちのスライ
スの模式図が示されている。第６図の(a)および(b)はそ
れぞれコントロール、およびヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与群
についてのものである。図中斜線部分はEvans Blue染色
部分、多数の黒点部分は赤く染色された部分であり、白
い部分は染まらなかった部分である。
スの模式図が示されている。第６図の(a)および(b)はそ
れぞれコントロール、およびヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与群
についてのものである。図中斜線部分はEvans Blue染色
部分、多数の黒点部分は赤く染色された部分であり、白
い部分は染まらなかった部分である。
スライスの全重量をＬＲＶ(g)とし、赤く染まった部分
と白のままの部分の合せた重量をRisk(g)とし、そして
白のままの部分の重量をInf(g)とすると、梗塞率はInf
／ＬＲＶ、Risk／ＬＲＶおよびInf／Riskの値によって
総合的に判断される。
と白のままの部分の合せた重量をRisk(g)とし、そして
白のままの部分の重量をInf(g)とすると、梗塞率はInf
／ＬＲＶ、Risk／ＬＲＶおよびInf／Riskの値によって
総合的に判断される。
結果を、第２表および第７図に示した。
なお、第７図において、斜線を施した柱は、ヒトCu,Zn
−ＳＯＤ群についてのものであり、他の柱はcontrol群
についてのものである。
−ＳＯＤ群についてのものであり、他の柱はcontrol群
についてのものである。
第２表および第７図の結果から、Control群に比較ヒトC
u,Zn−ＳＯＤ投与群では有意に梗塞範囲の縮小効果が認
められた。
u,Zn−ＳＯＤ投与群では有意に梗塞範囲の縮小効果が認
められた。
また、実験中、心電図、血圧、心拍数を経時的に測定し
た。心電図を第８図（ヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与群）およ
び第９図（Control群）に示した。
た。心電図を第８図（ヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与群）およ
び第９図（Control群）に示した。
第８図及び第９図中、(a)はcontrol、(b)はＬＣＣＡ根
部閉塞３０分後、(c)は閉塞解除直後および(d)は閉塞解
除直３時間後の心電図を各々示している。
部閉塞３０分後、(c)は閉塞解除直後および(d)は閉塞解
除直３時間後の心電図を各々示している。
第８図と第９図の比較から、Control群に比較し、ヒトC
u、Zn−ＳＯＤ投与群ではＴ波の増高、心室性期外収縮の
出現が少ないことがわかる。
u、Zn−ＳＯＤ投与群ではＴ波の増高、心室性期外収縮の
出現が少ないことがわかる。
また血圧、心拍数については両群の間に有意な差は認め
られなかった。
られなかった。
第１図はコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域
の塩基配列を示したものである。ＰＢはＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位、ＲＳはＲＮＡポリメラーゼの認識部位
である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示してい
る。破線による下線部はリボソーム結合部位を示し、Me
tが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所存在す
る実線下線部は正の制御に関与する領域である。また制
限酵素DraIの切断位置を示した。 第２図は胎盤のｍＲＮＡから得られたヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄ ｃＤＮＡの構造遺伝子領域の塩基配列と、塩基配列
から決定されるアミノ酸配列を示した。２カ所の下線部
はコロニーハイブリダイゼーシヨンに用いた２種類の合
成ＤＮＡがハイブリダイズする領域である。 第３図は組換えＤＮＡ ｐＵＢＥ２が作製されるまでの
経過の概略を図示したものである。 第４図は合成ＤＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合して得られる合成ＤＮＡ断片は、
５′端はDraI断端、３′端はTaqI切断端となっている。
＊印は第２図の塩基配列を変更した個所で２カ所存在し
ている。但しアミノ酸配列は変わっていない。 第５図は、ヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与のスケジユールであ
る。 第６図は、摘出心を染料溶液（ＴＴＣ溶液とEvans Blue
溶液）で灌流したのちのスライスの模式図ある。 第７図は、Control群とヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与群とにつ
いての心臓の梗塞率の比較を示している。 第８図および第９図は、それぞれヒトCu,Zn−ＳＯＤ投
与群およびcontrol群についての心電図である。
の塩基配列を示したものである。ＰＢはＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位、ＲＳはＲＮＡポリメラーゼの認識部位
である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示してい
る。破線による下線部はリボソーム結合部位を示し、Me
tが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所存在す
る実線下線部は正の制御に関与する領域である。また制
限酵素DraIの切断位置を示した。 第２図は胎盤のｍＲＮＡから得られたヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄ ｃＤＮＡの構造遺伝子領域の塩基配列と、塩基配列
から決定されるアミノ酸配列を示した。２カ所の下線部
はコロニーハイブリダイゼーシヨンに用いた２種類の合
成ＤＮＡがハイブリダイズする領域である。 第３図は組換えＤＮＡ ｐＵＢＥ２が作製されるまでの
経過の概略を図示したものである。 第４図は合成ＤＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合して得られる合成ＤＮＡ断片は、
５′端はDraI断端、３′端はTaqI切断端となっている。
＊印は第２図の塩基配列を変更した個所で２カ所存在し
ている。但しアミノ酸配列は変わっていない。 第５図は、ヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与のスケジユールであ
る。 第６図は、摘出心を染料溶液（ＴＴＣ溶液とEvans Blue
溶液）で灌流したのちのスライスの模式図ある。 第７図は、Control群とヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与群とにつ
いての心臓の梗塞率の比較を示している。 第８図および第９図は、それぞれヒトCu,Zn−ＳＯＤ投
与群およびcontrol群についての心電図である。
フロントページの続き (72)発明者 杉本 久 東京都港区白金台４−６−１ 東京大学医 科学研究所宿舎 (72)発明者 藤原 寛 山口県宇部市大字小串1978の５ 宇部興産 株式会社宇部研究所内 (72)発明者 中越 一郎 山口県宇部市大字小串1978の５ 宇部興産 株式会社宇部研究所内 (56)参考文献 特開 昭56−32422（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−289187（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−226958（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−91881（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】ヒト銅・亜鉛スーパーオキシドジスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を活性成分として含んでなる虚血性心疾患治療薬。 - 【請求項２】上記ポリペプチドが単細胞微生物中で産生
されたものである特許請求の範囲第１項に記載の虚血性
心疾患治療薬。 - 【請求項３】上記単細胞微生物がポジテイブレギユレー
シヨンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト
銅、亜鉛型スーパーオキシドジスムターゼ構造遺伝子を
有する組換えＤＮＡで形質転換されたものである特許請
求の範囲第２項に記載の虚血性心疾患治療薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61205778A JPH0643340B2 (ja) | 1986-09-03 | 1986-09-03 | 虚血性心疾患治療薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61205778A JPH0643340B2 (ja) | 1986-09-03 | 1986-09-03 | 虚血性心疾患治療薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6393726A JPS6393726A (ja) | 1988-04-25 |
| JPH0643340B2 true JPH0643340B2 (ja) | 1994-06-08 |
Family
ID=16512513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61205778A Expired - Lifetime JPH0643340B2 (ja) | 1986-09-03 | 1986-09-03 | 虚血性心疾患治療薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0643340B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6377822A (ja) * | 1986-09-18 | 1988-04-08 | Ube Ind Ltd | 臓器機能改善剤 |
| JPH01233228A (ja) * | 1988-03-11 | 1989-09-19 | Toyo Jozo Co Ltd | 悪性腫瘍細胞転移防止剤 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5632422A (en) * | 1979-08-27 | 1981-04-01 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Preventive and remedy for disorder caused by active oxygen in living body |
| IE59498B1 (en) * | 1985-11-22 | 1994-03-09 | Bio Technology General Corp | Human manganese superoxide dismutase analog, plasmid for its expression and method of recovering it in enzymatically active form |
| DE3609152A1 (de) * | 1986-03-19 | 1987-09-24 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung des (-)-antipoden des (e)-1-cyclohexyl-4,4-dimethyl- 3-hydroxy-2-(1,2,4-triazol-1-yl)-pent-1-ens |
-
1986
- 1986-09-03 JP JP61205778A patent/JPH0643340B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6393726A (ja) | 1988-04-25 |
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