JPH0643341B2 - 臓器機能改善剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は臓器機能改善剤に関する。さらに詳しくは、単
細胞微生物特にヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドジスム
ターゼ（またはヒト銅・亜鉛スーパーオキシドジスムタ
ーゼともいう）構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質
転換された単細胞微生物中で産生されたヒトスーパーオ
キシドデイスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を
有するポリペプチドを活性成分とする臓器機能改善剤に
関する。

スーパーオキシドデイスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド
（・Ｏ_２ ⁻）を消失させる酵素である。

・Ｏ_２ ⁻＋・Ｏ_２ ⁻＋２Ｈ^＋→Ｏ_２＋Ｈ_２Ｏ_２ スーパーオキシドは、生体における酸素毒性の中で最も
毒性の高い分子種で、炎症、未熟児酸素網膜症、放射線
障害、ガンなどの疾病を引き起こすと言われている。

ところで、近年、心臓、腎臓、肝臓、膵臓などの臓器移
植が行なわれるようになっているが、これらの臓器の移
植においては移植臓器の血流を一時的に遮断し、血液凝
固防止のためヘパリンかリンゲル液などの潅流する必要
がある。

しかして、潅流された移植臓器は生体へ移植されるまで
血液の供給を受けることが出来ないので、酸素不足とな
り、この際に電子伝達系から自由電子が放出され、移植
臓器中に活性酸素がつくられることになるという不都合
が生じる。

また、生体へ移植された臓器は、移植手術終了後血流の
再開により血液供給を受けるので、その際に移植臓器は
急激に酸素加されて細胞内のPO₂（酸素分圧）が上昇
し、活性酸素の産生が高まり組織障害を起こす問題もあ
る。臓器移植後に起こる拒絶反応もこの活性酸素に関係
しているとさえ云われている。

現在、臓器保存については保存剤というものはなく、ま
た拒絶反応については免疫抑制剤が使用されているが種
々の副作用が問題とされている。

一方、特開昭５７−141,288号公報には、ヒト細胞スー
パーオキシドデイスムターゼの特異抗体結合担体を用い
て、ヒト細胞からスーパーオキシドデイスムターゼを該
担体に結合させて単離する方法が開示されている。

特開昭５７−155,991号公報には、ヒト・胎盤の水抽出
液から４０〜５０％飽和硫安沈殿画分を除去した後の７
０〜８０％飽和硫安上清から、硫安分画、陰イオンクロ
マトグラフイー、ゲルろ過等によってスーパーオキシド
デイスムターゼを取得する方法が開示されている。

また、特開昭５９−91,881号公報には、不純な銅亜鉛ス
ーパーオキシドデイスムターゼを含有する溶液を、非極
性ハイポーラスポリマー系樹脂と接触させ、次いで該該
脂を洗浄し、さらに該樹脂に吸着した銅、亜鉛スーパー
オキシドデイスムターゼを溶出して精製する方法が開示
されている。

＜発明が解決しようとする問題点＞ しかしながら、前記した方法は原料を多量に入手するこ
とが困難であるし、また比較的入手し易い原料であるヒ
ト胎盤ではＳＯＤ含有量が低いなどの欠点があり、工業
生産に適したものとは言い難い。

この点を解決するため、本願出願人は、先に、遺伝子組
換え法によるヒトＳＯＤの製造法を提案した。

残された問題は、かくして製造されたヒトＳＯＤが実際
に酵素活性および薬理活性を持つか否かを明らかにする
ことであった。

それ故、本発明の目的は、上記残された問題を明らかに
することにある。

本発明の他の目的は、ヒト・スーパーオキシドデイスム
ターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含有する臓器機能改善剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、遺伝子組換え技術によって
製造した上記構造を持つポリペプチドを含有する臓器移
植改善剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。

＜問題点を解決するための手段及び作用＞ 本発明によれば、本発明の上記目的及び利点はヒトスー
パーオキシドデイスムターゼと実質的に同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドを活性成分とする臓器機能改
善剤によって達成される。

上記ポリペプチドは、例えばポジテイブレギユレーシヨ
ンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、
亜鉛型スーパーオキシドデイスムターゼ構造遺伝子を有
する組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培
養物中に蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドデ
イスムターゼ（以下ヒトCu,Zn−ＳＯＤという）を採取
することによって製造される。

上記ヒトCu,Zn−ＳＯＤのｃＤＮＡ含成の鋳型として用
いられるｍＲＮＡは正常なヒト組織（肝臓、胎盤、腎臓
など）から分離される。組織からのＤＮＡの分離は、フ
エノールークロロホルム法、グアニジニウム−熱フエノ
ール法、グアニジニウム−塩化セシウム法などの公知の
方法(Maniatis,Ｔ．ら，Molecular Cloning,１８７−１
９８，１９８２，Cold Spring Harbor Laboratory)が利
用できる。次いでオリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ
（Ｕ）セフアロースなどを用いてポリ（Ａ）テイルをも
つｍＲＮＡを分離する。

このようにして得られたｍＲＮＡは、ヒトCu,Zn−ＳＯ
ＤのｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ混合物であるが、こ
れをそのままｃＤＮＡ合成に用いる。まず、逆転写酵素
を用いｍＲＮＡを鋳型として一体鎖ｃＤＮＡを合成し、
次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを用いて二
本鎖ｃＤＮＡを合成した後、適当なベクターに組込まれ
た形でｃＤＮＡを得る。これにはｄＧ−ｄＣまたはｄＡ
−ｄＴホモポリマー結合法（Nelson，Ｔ．Ｓ．，Method
s in Enzymology，６８，４１，１９７９，Academic Pr
ess Inc.）やOkayama-Berg法(Okayama，Ｈ．and Ber
g，Ｐ．，Mol.Cell.Biol.，２，１６１，１９８２）が
利用できる。

この場合のようにｍＲＮＡ混合物中の目的ｍＲＮＡ含量
が低い場合は、効率の高いOkayama-Berg法が好ましい。
この方法に必要なＤＮＡおよび宿主菌はフアルマシア
Ｐ．Ｌ．バイオケミカルズ社カタログＮｏ．２７−４７
５０−０１として入手できる。

このようにして得られる組換えＤＮＡをたとえばエシエ
リヒア・コリ（Escherichia coli）×１７７６株あるい
はＤＨ１株（Low，Ｂ．，Proc.Natl.Acad.Sci.，６０，
１６０，１９６８；Meselson，Ｍ．and Yuan，Ｐ．，Na
ture，２１７，１１１０，１９６８；Hanahan，Ｄ．，
Ｊ．Mol,Biol，１６６，５５７，１９８３）に導入して
形質転換させる。形質転換法は公知の方法（重定勝哉，
細胞工学、Vol.２，No.３，６１６，１９８３）または
それに準ずる方法で行うことができる。アンピシリン耐
性などの薬剤耐性によりまず形質転換体を選別したの
ち、ヒトCu,Zn−ＳＯＤ遺伝子に対応すると考えられる
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成しこれ
を^３２Ｐで標識してプローブとして用い、公知のコロニ
ーハイブリダイゼーシヨン法(Hanahan．Ｄ．ら、Method
s in Enzymology，１００，３３３，１９８３）により
ポジテイブなシグナルを示した形質転換体を選択する。
これらの形質転換体より常法に従ってプラスミドＤＮＡ
を単離し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列をMaxam-Gilbert法
（Maxam，Ａ．Ｍ．and Gilbert，Ｗ．，Proc.Natl.Aca
d.Sci.，７４，５６０，１９７７）またはジデオキシ法
(Messing，Ｊ．ら，Nucleic Acids Res.，９，３０９，
１９８１）によって決定し、ヒトCu,Zn−ＳＯＤ ｃＤ
ＮＡの存在を確認する。確認には、ヒト赤血球より単離
されたCu,Zn−ＳＯＤのアミノ酸配列（Jabusch，Ｊ．
Ｒ．，Biochemistry，１９，２３１０，１９８０）また
はダウン症候群患者に由来する樹立細胞株より分離され
たｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩基配列（Sherma
n，Ｌ．ら，Proc.Natl.Acad.Sci.，８０，５４６５，１
９８３）を参考にすることができる。

次に、得られたヒトCu,Zn−ＳＯＤのｃＤＮＡを適当な
形質発現調節遺伝子の下流にに連結する。これにはトリ
プトフアンオペロンプロモーター（trpプロモータ
ー）、ラクトースオペロンプロモーター（lacプロモー
ター）、λフアージのＰ_Ｌプロモーター、tacプロモー
ターなどの公知のプロモーターが利用される。

しかし、ここで注目すべきことは、生体内にはＯ_２ ⁻を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦，スー
パーオキサイドと医学，５８，１９８１，共立出版）、
従って、Ｏ_２ ⁻を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を生育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量の産生させることが好ましい。

エシエリヒア・コリから分離されたプラスミドCol E1上
に存在するコリシンＥ１遺伝子はコリシンＥ１タンパク
の産生を支配している遺伝子であり、通常の状態におい
てはリプレツサータンパクがオペレーターに結合するこ
とにより遺伝子の発現は抑制されているが、ＤＮＡに損
傷を与えるような処理、たとえば紫外線照射、マイトマ
イシンＣ処理、ナリジキシン酸処理などによりこの抑制
が解除されて誘発が起り、コリシンＥ１タンパクが多量
につくられる。これはいわゆる負の制御と呼ばれる調節
機構である。これに加えて、コリシンＥ１遺伝子には正
の制御も存在しており（調恒明ら、生化学、Vol.５６，
No.８，１０８２，１９８４）、ユニークな形質発現調
節機構を持つ遺伝子であって、誘発時には正の制御の効
果も加わってきわめて多量のコリシンＥ１タンパクが産
生される。さらにコリシンＥ１タンパクはエシエリヒア
・コリに対する抗菌性を機能とするタンパクであって、
通常時の細胞の成育には必要ないタンパクと見なし得る
ものであり、その性質上、通常時のコリシンＥ１遺伝子
の発現が厳密に抑制されていることからも、コリシンＥ
１遺伝子の形質発現調節遺伝子の利用は本発明にとって
きわめて有利である。

Col Ｅ１ ＤＮＡはたとえばフアルマシアＰ．Ｌ．バ
イオケミカルズ社のカタログNo.２７−４９１４−０１
として入手することが可能である。また、正のの制御に
関与する領域、プロモーター・オペレーター領域、リボ
ソーム結合領域からなるコリシンＥ１遺伝子の形質発現
調節遺伝子の塩基配列は既に報告されている（Ebina，
Ｙ．ら，Cene，１５，１１９，１９８１）。なお、本発
明におけるコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子と
は、第１図の−１４０から７８番目までの塩基配列の存
在を必須とするものである。

コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ ｃＤＮＡを連結する際に、いわゆる融
合タンパクを産生するような形での連結は、適当な制限
酵素の切断部位を利用することにより比較的容易に行う
ことができる。しかし、コリシンＥ１タンパクに由来す
る部分がある程度以上の長さを持っている場合、この融
合タンパクを人体に投与した際に免疫原性（抗原性）を
発揮する危険性が充分に考えられる。従って、コリシン
Ｅ１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直後にヒトC
u,Zn−ＳＯＤのＮ末端アミノ酸コドンが連結される形が
好ましい。しかし、これを満足させてくれるような適当
な制限酵素の切断部位はどちらの遺伝子にも存在しな
い。そこで、制限酵素を用いて両方のＤＮＡ断片を必要
部分が欠失した形で切り出し、欠失した部分は合成ＤＮ
Ａ断片により補間することができる。

合成ＤＮＡ断片は、たとえば固相トリエステル法(Miyos
hi，Ｋ．ら、Nucl.Acids Res.，８，５５０７，１９８
０）によりオリゴヌクレオチドを化学合成し、これらを
たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼでつなぎ合せることにより
得られる。合成ＤＮＡ断片は、もとの塩基配列を再現す
るものである必要は必ずしもない。アミノ酸コドンには
縮重が存在し、かつ生物の種によってコドンの使用頻度
が異なることは良く知られている。従って、アミノ酸の
配列を変えない限りにおいては、合成ＤＮＡ断片の作製
時にどのようなコドンを選んでも自由であるが、宿主菌
中で使用頻度の高いコドンを選択すると、遺伝子の発現
量の増大が期待できる。コドンＥ１遺伝子の形質発現調
節遺伝子領域に関しては、もとの塩基配列を再現する方
が好ましいが、結果として遺伝子の発現量の増加につな
がるような塩基配列の変更は採用できる。

自律複製できるベクターに、コリシンＥ１遺伝子の形質
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成ＤＮＡ断片、ヒ
トCu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子断片を正しく組込むことに
より目的の組換えＤＮＡが得られる。これらのＤＮＡ断
片は、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結すること
ができ、最終的に得られる組換えＤＮＡの構造が目的す
るものである限り、ＤＮＡ断片の連結順序に制限はな
い。使用するベクターは宿主微生物内で複製可能なもの
であれば特に制限はなく、宿主がエシエリヒア・コリの
場合はｐＢＲ３２２が良く用いられている。

得られた組換えＤＮＡをベクターの宿主微生物内に導入
し形質転換させる。本発明では宿主微生物としてエシエ
リヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、
特にコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子が機能す
る限りにおいては、バチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis）、サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyc
es cerevisiae）等の他の微生物を使用できる。エシエ
リヒア・コリの場合はＷ３１１０株、２０Ｓ０株、Ｃ６
００Ｓ株などの名前があげられる。特にＷ３１１０株が
好ましい。Ｗ３１１０株はエシエリア・コリＫ１２株の
野生性株（λ^＋，Ｆ^＋）から誘導されたλ⁻，Ｆ⁻株で
あり、栄養要求性などその他の点では野性株と同一であ
る（Bachmann，Ｂ．Ｊ．，Bacteriological Reviews，
３６，５２５，１９７２）。

テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのち、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
酵素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う。
さらに誘発時のヒトCu,Zn−ＳＯＤの産生能によって目
的の形質転換体を選択する。

ＳＯＤ活性の測定法としては、チトクロームＣ−キサン
チン−キサンチンオキシダーゼを用いる方法（McCord，
Ｊ．Ｍ．and Fridovich，Ｉ．，Ｊ．Biol.Chem.，２４
４，６０４９，１９６９）、ニトロブルーテトラゾリウ
ム（ＮＢＴ）−リボフラビンを用いる方法（Beaucham
p，Ｃ．and Fridovich，Ｉ．，Anal.Biochem.，４４，
２７６，１９７１）等が利用できる。ＮＢＴ−リボフラ
ビン法は簡便であり、電気泳動後のタンパクの活性染色
にも利用できるため便利である。エシエリヒア・コリの
場合について言うと、組換えＤＮＡから産生されるヒト
Cu,Zn−ＳＯＤに加えて、宿主染色体から産生されるMn
−ＳＯＤおよびFe−ＳＯＤが混在している。これらのＳ
ＯＤの酵素としての作用は同一であるが、Cu,Zn−ＳＯ
Ｄは１〜２ｍＭのＣＮ−イオンによって活性が阻害され
るのに対し、Mn−ＳＯＤ，Fe−ＳＯＤは同条件下での阻
害を受けないことから区別できる。また、これら３種の
ＳＯＤは分子量や等電点が互いに異なるため、電気泳
動、イオン交換またはゲルロ過カラムクロマトグラフイ
ーによって分離することができる。

このようにして得られた、形質発現調節遺伝子特にはコ
リシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子に下流にヒトC
u,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質転
換された微生物を、その宿主微生物の増殖に適した条件
下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を行わせてヒ
トCu,Zn−ＳＯＤを大量に産生させる。エシエリヒア・
コリの場合、たとえばＬ培地、グルコースおよびカザミ
ノ酸を含むＭ９培地などの公知の培地により培養を行
う。培養は通常１５〜４３℃の温度で２〜２４時間行
う。必要により通気、撹拌を加えることができる。対数
増殖基にある培養物にマイトマイシンＣ、ナリジキシン
酸などの薬剤を添加したり、紫外線を照射することによ
り誘発合成を行わせることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパクの精製法に従ってヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄ活性を持つタンパクを単離することによりヒトCu,Zn
−ＳＯＤが製造できる。精製は、たとえば熱処理、塩
析、濃縮、透析、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル
ロ過クロマトグラフイー、クロマトフオーカシング、電
気泳動、高速液体クロマトグラフイー、アフイニテイク
ロマトグラフイーなどの操作を適宜組合せて行うことが
できる。

かくして製造されたヒトスーパーオキシドデイスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、例えば腸管、肝臓、腎臓、心臓等の臓器の機能を改
善する活性を示す。

本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って注射剤、
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソーム製剤などの製剤
とすることができる。

本発明のポリペプチドは、生体から取出した臓器を生き
たまま保存するためにあるいは生体に投与して臓器機能
を改善するために使用される。臓器の保存には、例えば
１〜１０mgの量が好適に用いられ、あるいは１日０．０
１７〜０．１７mg/kg・体重の投与量で１回〜数回に分
けて例えば各種腎疾患の治療を目的として、経口的また
非経口的に投与し得る。

以下に実施例および参考例を示す。

参考例１ ヒトCu,Zn−ＳＯＤのｃＤＮＡを組込んだプ
ラスミドｐＳＯＤ２の作製： 正常分娩によって得られたヒト胎盤からグアニジウム−
塩化セシウム法によってＲＮＡを分離し、ついでオリゴ
（ｄＴ）セルロースを用いてポリ（Ａ）テイルをもった
ｍＲＮＡを分離した。

得られたｍＲＮＡより、岡山−バーグ法に従って、ｃＤ
ＮＡライブラリーを作成した。宿主菌として大腸菌ＤＨ
１株を用いた。

コロニーハイブリダイゼーシヨン法にて、ヒトCu,Zn−
ＳＯＤのｃＤＮＡが組込まれたプラスミドｐＳＯＤ２を
保持した大腸菌ＤＨ１（ｐＳＯＤ２）株を得た。この菌
株より常法に従ってプラスミドｐＳＯＤ２を単離した。

参考例２ ヒトCu,Zn−ＳＯＤ産生用組換えＤＮＡの作
製： コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を連結して、ヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄを産生させるためのプラスミドは、第３図に示すスト
ラテジーに従って作製した。

(1) コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子断片を
組込んだプラスミドｐＡＯＫ１の作製： コリシンＥ１ＤＮＡをＤｒａｌで切断し、ついで、Ｓｔ
ｕｌで切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で３４０bpのＳｔｕＩ−ＤｒａＩ断片を得た。この
断片をプラスミドｐＢＲ３２２のＤｒａＩサイトに挿入
し、プラスミドｐＡＯＫ１を作製した。

(2) ヒトCu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子断片の作製： プラスミドｐＳＯＤ２をＡｌｕＩで切断し、ついでＴａ
ｑｌで切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で４４０bp断片を得た。

(3) 合成ＤＮＡの作製： コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Cu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子を連結するために、コリシン
Ｅ１ ３４０bp断片およびＳＯＤ構造遺伝子の４４０bp
断片で欠失している部分８４bpを第４図に示すように１
２個のオリゴペプチドに分割して合成した。

(4) ヒトCu,Zn−ＳＯＤ産生用組換えＤＮＡの作製： プラスミドｐＡＯＫ１のＤｒａＩサイトに、８４bpの合
成ＤＮＡと、４４０bpのＳＯＤ構造遺伝子断片を挿入
し、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流
に、ヒトCu,Zn−ＳＯＤ構造遺伝子が連結したヒトCu,Zn
−ＳＯＤ産生用組換えＤＮＡｐＵＢＥ２を得た。

参考例３ ヒトCu,Zn−ＳＯＤの産生する組換え大腸菌
５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株の作製： ＳＯＢ培地でＯＤ_５５０＝０．５５まで培養した大腸菌
５４５πＨＲ株をＴｆｂＩついでＴｆｂIIで処理したの
ち、処理液にプラスミドｐＵＢＥ２を加え、０℃で３０
分間、ついで４２℃で９０秒間熱処理して、プラスミド
ｐＵＢＥ２を保持する大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ
２）株を得た。

参考例４ ヒトCu,Zn−ＳＯＤと実質上同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドの製造： カザミノ酸３００ｇ、グルコース４００ｇ、テトラサイ
クリン１ｇ、Na₂HPO₄６００ｇ、KH₂PO₄３００ｇ、NaCl
５０ｇ、NH₄Cl１００ｇ、CuCl₂・２Ｈ_２Ｏ０、５ｇ、Zn
SO₄・７Ｈ_２Ｏ０・９ｇを含む１００ｌに大腸菌５４５
πＨＲ（ｐＵＢＥ２）を接種し、クレツト１１６まで３
７℃で撹拌（２０００rpm）培養後、培養液にNa₂HPO₄６
００ｇ、KH₂PO₄３００ｇ、NaCl５０ｇ、NH₄Cl１００ｇ
を含む水２、グルコース４５０ｇを含む水１とマイ
トマイシンＣ２００mgを含む水５００mlを加えて誘発合
成を３７℃、２時間行わせた。シヤープレス型遠心分離
機での遠心（２０００rpm、３時間）により３４４ｇの
温菌体を得た。

集菌した菌体を３の１０mMトリエタノールアン緩衝液
（pH７．０）に懸濁して、ダイノミルで破砕した。破砕
液を遠心（９０００rpm，６０分）し、得られた粗抽出
液の全量を３．５とした。粗抽出液に１Ｍ塩化第２銅
水溶液０．３５mlを加え、一晩撹拌したのち６０℃で５
分間加熱処理した。生じた沈殿を９０００rpm、２０分
の遠心により除去した。上清から硫安沈殿によって７０
〜９５％飽和画分を回収し、透析後イオン交換セルロー
スＤＥ５２カラムクロマトグラフイーにかけて、２０mM
NaCl濃度（１０mMトリエタノールアミン緩衝液）で溶
出しＳＯＤ活性画分を得た。この画分から１００％飽和
硫安で分離した硫安沈殿を遠心（１５０００rpm、１０
分）で得、透析後、凍結乾燥してヒトCu,Zn−ＳＯＤと
実質上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得た
（９９０mg）。

実施例１（腸管保存試験） モルモツトを撲殺し、放血させたのち、回腸を摘出し、
マグヌス試験装置を用いて腸管収縮能を測定した（コン
トロール値） その後、生理食塩液５０mlを入れたシヤーレ（コントロ
ール群）と本物質１０mgを生理食塩液５０mlの入ったシ
ヤーレ（本物質投与群）にそれぞれ収縮能測定後の腸管
を入れ、室温で２時間保存した。

保存後、再び腸管の収縮能を測定した結果、コントロー
ル群では２時間の保存により、収縮能の低下率は９２．
４％であったのに対し、投与群では２９．７％の低下率
しか示さなかった（第１表参照）。

実施例２（ウサギの腎虚血に対する効果） 体重２．３〜３．６kgのニユージーランド白ウサギ
（雄）をコントロール群１０例、ヒトCu,Zn−ＳＯＤ投
与群１０例用いた。

ウサギをペントバルビタールNaの静脈内投与により麻酔
し、正中切開により開腹した。右および左腎臓を周囲組
織から遊離したのち、ヘパリンNa１００Ｕ／kgを静脈内
投与した。次いで生理食塩液で１％に溶解したヒトCu,Z
n−ＳＯＤ溶液を５mg/kg静脈内投与したのち、左腎臓、
静脈、尿管を遮断し１時間放置した。遮断解除（血流再
開）２分前に再びヒトCu,Zn−ＳＯＤを５mg/kg静脈内投
与し、その後、経日的に血液を採取した血清クレアチニ
ン値を測定した。

その結果、クレアチニンの上昇はコントロール群に比較
し、ヒトCu,Zn−ＳＯＤ投与群では有意に低いことが認
められた（第２表および第５図参照）。

なお、第２表の値（平均値±標準偏差）および第５図の
縦軸の値は血清中のクレアチニンの濃度（mg/dl）であ
る。また第５図の黒丸はｈ−ＳＯＤ投与群（ｎ＝１０）
であり、白丸はコントロール群（ｎ＝１０）である。

実施例３（マウスにおける急性毒性試験） ddY系雄マウス（体重３２±２ｇ）１群８匹を用いて、
本物質を生理食塩液に溶解し、静脈内（ｉ．ｖ．）投与
した。投与量は３０mg/kg、１００mg/kg、３００mg/kg
の３群である。投与後２週間中毒症状について観察した
が、各群ともに異常なく生存した。屠殺後の解剖所見に
おいても、生理食塩液のみを投与したコントロール群と
何ら変わるところがなかった。従って、マウスにおける
本物質の静脈内投与におけるＬＤ_５０値は３００mg/kg
以上である（第３表参照）。

実施例４（移植腎に対する腎機能保護効果） イヌをＧＯＦ（笑気、Ｏ_２およびフローセン混合物）に
よる吸入麻酔下で正中切開により開膜し左腎臓を露出し
た。

腎動脈根部に塩酸プロカイン３〜５mlを注入し、左腎を
非接触分離技術（non-touch isolation technique）に
より摘出した。次いで左腎をヘパリンを加えた生理食塩
水により１００cmH₂Oの圧で初期還流を行ない、その後
ｈ−ＳＯＤ１０mgを摘出腎に局所投与し、その状態で６
０分間腹腔内で温保存した。

その後、同一犬の右腸骨窩に自己移植を行なった。移植
腎の腎静脈は外腸骨静脈に端側吻合、腎動脈は内腸骨動
脈に端々吻合、また尿管は胱膀に吻合した。この際、腎
動脈後壁を吻合し、前壁に維持縫合糸（stay suture）
を施した状態でｈ−ＳＯＤ１０mgを腎動脈より投与し血
流再開を行なった。また、術中の輸液は５％グルコース
を１５ml/kg/hrの速度で点滴投与した。上記腎移植の方
法を第６図に模式的に示した。

術後、抗生物質（pentorex ）２０mg/kgを１日１回７
日目まで連日静脈内投与した。輸液は５％グルコースお
よび乳酸リンゲル（Lactic Ringer）液を適宜投与し
た。

腎機能評価のためのパラメーターとしては、今回の実験
では一般的に、臨床で腎不全の指標としている血清クレ
アチニン値を用いた。

結果を第４表および第５表に示した。

第７図には、第４表および第５表の結果を図示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域
の塩基配列を示したものである。ＰＢはＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位、ＲＳはＲＮＡポリメラーゼの認識部位
である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示してい
る。破線による下線部はリボソーム結合部位を示し、Me
tが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所存在す
る実線下線部は正の制御に関与する領域である。また制
限酵素ＤｒａＩの切断位置を示した。 第２図は胎盤のｍＲＮＡから得られたヒトCu,Zn−ＳＯ
Ｄ ｃＤＮＡの構造遺伝子領域の塩基配列と、塩基配列
から決定されるアミノ酸配列を示した。２カ所の下線部
はコロニーハイブリダイゼーシヨンに用いた２種類の合
成ＤＮＡがハイブリダイズする領域である。 第３図は組換えＤＮＡ ｐＵＢＥ２が作製されるまでの
経過の概略を図示したものである。 第４図は合成ＤＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合して得られる合成ＤＮＡ断片は、
５′端はＤｒａＩ断端、３′端はＴａｑＩ切断端となっ
ている。＊印は第２図の塩基配列を変更した個所で２カ
所存在している。但しアミノ酸配列は変わっていない。 第５図は本発明のポリペプチドの臓器機能改善活性を示
す図である。 第６図は腎移植の方法を示す模式図である。 第７図はイヌの移植腎に対する腎機能保護効果を示して
いる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト銅・亜鉛スーパーオキシドジスムター
   ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
   を活性成分として含んでなる腸管または腎臓の機能改善
   剤。
2. 【請求項２】上記ポリペプチドが単細胞微生物中で産生
   されたものである特許請求の範囲第１項に記載の腸管ま
   たは腎臓の機能改善剤。
3. 【請求項３】上記単細胞微生物がポジテイブレギユレー
   シヨンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト
   銅・亜鉛型スーパーオキシドジスムターゼ構造遺伝子を
   有する組換えＤＮＡで形質転換されたものである特許請
   求の範囲第２項に記載の腸管または腎臓の機能改善剤。
4. 【請求項４】摘出された腸管または腎臓の保存に向けら
   れる特許請求の範囲第１項に記載の腸管または腎臓の機
   能改善剤。