FI90353B - Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasin ilmentämiseksi bakteereissa sekä menetelmä entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi ja talteenottamiseksi - Google Patents

Description

1 90353

Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasin ilmentämiseksi bakteereissa sekä menetelmä entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi ja tal-teenottamiseksi

Esillä olevassa hakemuksessa viitataan erilaisiin julkaisuihin arabialaisin numeroin, jotka ovat suluissa. Täydellisiä lainauksia näistä viitteistä voidaan löytää patenttihakemuksen lopusta välittömästi ennen patenttivaatimuksia. Nämä julkaisut kokonaisuudessaan on tässä yhteydessä sisällytetty viitteinä esillä olevaan hakemukseen kyseisen tutkimusalan tunnetun alueen kuvaamiseksi täydellisemmin henkilöille, jotka ovat aiheeseen perehtyneet, sellaisena kuin kyseinen tutkimusalue tunnetaan esillä olevan keksinnön ja patenttivaatimusten esitysajankohtana.

McCord ja Fridovich (1) löysivät vuonna 1968 superoksididis-mutaasin (SOD) sekä vapaiden happiradikaalien (02—) ilmenemisen. Superoksidiradikaaleja sekä muita erittäin reaktiivisia happilajeja valmistuu jokaisessa hengittävässä solussa sivutuotteina oksidatiivisessa hajoamisessa moniksi erilaisiksi makromolekyyleiksi ja solunkomponenteiksi (selonteon suhteen katso 2, 3). Metalloproteiinien ryhmä, joka tunnetaan superoksididismutaaseina, katalysoi hapetus-pelkistysreaktiota 202~ + 2H+ -* H202 + 02 ja antaa täten käyttöön torjuntamekanismin hapen myrkyllisyyttä vastaan.

On olemassa useita tunnettuja SOD:n muotoja, jotka sisältävät erilaisia metalleja ja erilaisia proteiineja. SOD:ssä läsnä oleviin metalleihin kuuluvat rauta, mangaani, kupari sekä sinkki. SOD:n tunnetuista muodoista kaikki katalysoivat samaa reaktiota. Nämä entsyymit esiintyvät monissa kehitysryhmissä. Superoksididismutaaseja, jotka sisältävät rautaa, on ensisijaisesti prokaryoottisissa soluissa. Superoksididismutaaseja, joissa on kuparia ja sinkkiä, on löydetty oleellisesti kaikista eukaryoottisistä organismeista (4). Superoksidi- 90353 dismutaaseja, jotka sisältävät mangaania, on löydetty organismeista, jotka ulottuvat mikro-organismeista ihmiseen saakka.

Koska jokainen biologinen makromolekyyli voi toimia voimakkaan superoksidiradikaalin tuhoavan toiminnan kohteena, on kehittynyt-mielenkiintoa SOD:n terapeuttisia mahdollisuuksia kohtaan. Tieteellinen kirjallisuus esittää, että SOD saattaa olla käyttökelpoinen kliinisten sovellutusten laajalla alueella. Näihin kuuluvat kasvaimen synnyn ja kasvun estäminen sekä syövänvastais-ten lääkkeiden (10) sytotoksisten ja sydäntoksisten vaikutusten vähentäminen, verettömien kudosten suojaus (12) sekä siittiöiden suojaus (13). Lisäksi esiintyy mielenkiintoa tutkia SOD vaikutuksia vanhenemistapahtumaan (14).

Humaani SOD:n terapeuttisten mahdollisuuksien tutkimus on ollut rajoitettua, mikä johtuu sen rajoitetusta saannista.

Superoksididismutaasilla on myös mielenkiintoa sen tulehduksen-vastaisten ominaisuuksien vuoksi (11). Härästä saadulla superoksididismutaasilla (orgoteiinilla) on havaittu tulehduksenvastai-sia ominaisuuksia, ja sitä myydään tällä hetkellä Euroopan osissa ihmislääkkeenä. Sitä myydään myös Yhdysvalloissa eläinlääkintä-valmisteena, erityisesti hevosten tulehtuneiden jänteiden hoitoa varten. Kuitenkin orgoteiinin saanti on rajoitettua. Aiemmilla tekniikoilla, joihin kuuluu orgoteiinin saanti härän- tai muista eläinsoluista, on vakavia rajoituksia, ja näin saatu orgoteiini saattaa saada aikaan ihmisessä allergisia reaktioita, koska se ei ole peräisin ihmisestä.

Kuparisinkkisuperoksididismutaasi (CuZn SOD) on superoksidi-dismutaasin erilaisista muodoista eniten tutkittu ja parhaiten karakterisoitu.

Humaani CuZn SOD on dimeerinen metalliproteiini, joka koostuu identtisistä, ei kovalenttisesti kytketyistä alayksiköistä, joista kullakin molekyylipaino on 16 OOO daltonia ja jotka sisältävät yhden atomin kuparia ja yhden sinkkiä (5). Kukin alayksikkö koostuu 153 aminohaposta, joiden sekvenssi on määritetty (6, 7).

3 90353

Humaani CuZn-superoksididismutaasia koodittava cDNA on kloonattu (8). Kloonatun DNA:n täydellinen sekvenssi on myös määritetty (9). Ennen kaikkea on kuvattu (24, 25) ilmentymisvekto-reita, jotka sisältävät DNA:a koodattavaa superoksididismutaasia superoksididismutaasin valmistamiseksi bakteereissa sekä eristämiseksi niistä. Superoksididismutaasi - DNA:n ilmentyminen sekä SOD:n valmistus hiivassa on myös julkaistu (26).

Äskettäin on karakterisoitu CuZn SOD-geenilokus humaani kromosomilla 21 (27), ja viimeaikaiset kehitystulokset, jotka koskevat CuZn superoksididismutaasia, on esitetty yhteenvetona (28).

Huomattavasti vähemmän tiedetään mangaanisuperoksididismutaasista (MnSOD).E. coli K-12:n MnSOD on äskettäin kloonattu ja kartoitettu (22). Barra et ai. julkaisevat 196 aminohapon mittaisen aminohapposekvenssin MnSOD-polypeptidille, joka on eristetty humaani maksasoluista (19). Aiemmat julkaisut eroavat kuitenkin sen seikan suhteen, mitä tulee MnSOD-molekyyli n rakenteeseen, onko siinä kaksi tai neljä identtistä polypeptidialayksikköä (19, 23). On kuitenkin selvää, että MnSOD-polypeptidi ja CuZn SOD-polypeptidi eivät ole homologisia (19). Eri lähteistä saatujen MnSOD:den ja FeSOD:den aminohapposekvenssien homologioi-ta on myös verrattu (18).

Baret et ai. julkaisevat, että rotalla humaani MnSOD:n puoliintumisaika on oleellisesti pitempi kuin humaani Cu SOD:n puoliintumisaika; he julkaisevat myös, että rotalla humaani MnSOD ja rotan Cu SOD eivät ole tehokkaita tulehduksenvastaisina aineina, kun taas härän Cu SOD ja humaani Cu SOD ovat täysin aktiivisia (20).

McCord et ai. julkaisevat tiedon, jonka mukaan luonnossa esiintyvä humaani mangaanisuperoksididismutaasi suojaa ihmisen fagosy-. . toivia liuskatumaisia (PMN) leukosyyttejä superoksidin vapailta radikaaleilta paremmin kuin härän tai sian CuZn superoksidi-dismutaasi "in vitro"-kokeissa (21).

4 SO 353

Keksinnössä on kyse humaani mangaanisuperoksididismutaasin polypeptidianalogista, joka käsittää 199 aminohappoa, jonka sekvenssissä on metioniini N-päässä ja jolla on kuviossa 1 annettu määrätty sekvenssi. Barra et ai., J. Biol. Chem., 259: 12595-12601, (1984) toisaalta esittää sivun 12596 ku viossa 1 196 aminohappoa käsittävän mangaanisuperoksididismutaasin, jonka N-pää on lysiini. Edelleen Barra et ai. ei esitä tai edes ehdota, että mangaanisuperoksididismutaasi, jolla on kolme lisäaminohappoa, voisi olla aktiivinen entsyymi. On huomattava, että lukuunottamatta esillä olevan polypeptidin N-pään lisämetioniinia, kaksi muuta lisäaminohappoa, Gly-Trp, sijaitsevat molekyylin keskellä.

Esillä olevan polypeptidin ja viitteen Barra et ai. mukaisen polypeptidin välillä on kolme eroavuutta siinä, että esillä olevassa polypeptidissä kolmessa paikassa on glutaamihappo-tähde (Glu), joissa kohdissa Barra et ai. esittää glutamiini-tähteen (Gin). Siten on kuusi pääeroa esillä olevan polypeptidin ja viitteen Barra et ai. mukaisen polypeptidin välillä (nimittäin kolme lisäaminohappoa ja kolme erilaista aminohappoa) .

Viite Barra et ai. ei esitä nyt esitettyä erityistä aminohapposekvenssiä eikä se myöskään ehdota, että se voitaisiin ilmentää bakteereissa, eikä varmasti ollut ilmeistä, että siten ilmennettynä se olisi ollut entsymaattisesti aktiivinen. Tosiasiassa Barra et ai. ei edes keskustele 196 aminohappoa käsittävän mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattisesta aktiivisuudesta. Siten alan ammattimiehelle ei olisi ollut ilmeistä, että esillä oleva keksintö, erityisesti superoksi-didismutaasin erityinen polypeptidianalogi, joka käsittää 199 aminohappoa, olisi entsymaattisesti aktiivinen.

Viitteen Barra et ai. sivulla 12598 väitetään, että "kaikissa mangaanisuperoksididismutaaseissa on 7 glysiinitähdettä asemissa 76, 77, 94, 101, 112, 130 ja 132 ja 3 proliinitähdettä asemissa 5, 165 ja 170. Kaikkien tähteiden pitäisi olla oleellisia sekundäärisen rakenteen ylläpitämiseksi." Haluamme 5 90353 painottaa, että esillä olevassa polypeptidissä läsnä olevat kaksi lisäaminohappoa sijaitsevat kohdissa 122 ja 123, jotka sijaitsevat viitteessä Barra et ai. viitatun kriittisen alueen keskellä. Toinen näistä kahdesta lisäaminohaposta on gly-siinitähde ja Barra et ai. tunnustaa, että glysiinitähteet ovat tärkeitä sekundäärisen rakenteen ylläpitämiseksi. Viitteen Barra et ai. mukaisessa sekvenssissä ei ole näitä lisä-glysiinitähteitä.

Lisäksi haluamme painottaa, että kaksi glutamiinihapon muutosta glutamiiniksi ovat myös molekyylin keskellä (tähteet 88 ja 109) ja nämä muutokset aminohapposekvenssissä vaikuttavat molekyylivaraukseen, mikä vaikuttaisi myös polypeptidin laskostumiseen ja siten polypeptidin aktiivisuuteen.

On hyvin tunnettua tekniikan tasossa, että entsymaattisesti aktiivinen polypeptidi on oikean primäärisen, sekundäärisen tai tertiäärisen rakenteen tulos. Jos joko primäärinen, sekundäärinen tai tertiäärinen rakenne muuttuu, entsymaattinen aktiivisuus voi muuttua.

Siten kuusi muutosta esillä olevan polypeptidin aminohappo-järjestyksessä tai "primäärisessä" rakenteessa (joista neljä ovat molekyylin keskellä) voisi vaikuttaa sekundääriseen ja tertiääriseen (konformationaaliseen) polypeptidin rakenteeseen. Siten polypeptidin entsymaattinen aktiivisuus voisi muuttua. Kuten edellä on esitetty, jopa viite Barra et ai. ehdottaa, että aminohappotähteiden, jotka muodostavat luonnollisesti esiintyvän hMbnSOD:n primäärisen rakenteen, pitäisi olla relevantteja sekundäärisen rakenteen ylläpitämiseksi.

EP-hakemusjulkaisussa 138 111 esitetään humaani Cu-Zn-supe-. . roksididismutaasin kloonaus ja ilmentäminen E. colissa ja hiivassa. Kuitenkin Cu-Zn-superoksididismutaasi ei ole sukua MnSOD:lle eikä näiden kahden entsyymin välillä ole sekvens-sihomologiaa (katso Barra et ai., sivu 12597). Siten Cu-Zn- 90 353 entsyymin kloonaus ja ilmentäminen ei millään tavoin opeta tai ehdota miten kloonataan tai ilmennetään entsymaattisesti aktiivista MnSOD:tä.

Esillä oleva keksintö koskee plasmidia humaani mangaanisuper-oksididismutaasin analogin ilmentämiseksi prokaryoottisessa isäntäsolussa.

Esillä oleva keksintö antaa edelleen käyttöön menetelmän entsymaattisesti aktiivisen humaani MnSOD:n valmistusmenetelmän bakteereissa sekä menetelmän tällaisen entsymaattisesti aktiivisen humaani MnSOD:n talteenottamiseksi sekä puhdistamiseksi .

Esillä oleva menetelmä koskee myös humaani mangaanisuperoksi-didismutaasin tai sen analogien tai mutanttien käyttöä katalysoimaan superoksidiradikaaleja vetyperoksidiksi ja molekyy-limuodossa esiintyväksi hapeksi. Erityisesti esillä oleva keksintö koskee bakteereiden avulla valmistetun MnSOD:n tai sen analogien tai mutanttien käyttöä vähentämään paikallista verettömyyttä seuraavan uudelleenperfuusion aiheuttamaa vauriota sekä pidentämään leikattujen, eristettyjen elinten elinaikaa.

DNA-molekyyli, joka sisältää cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaaspolypeptidiä tai sen analogia tai mutanttia, on eristetty humaani T-solukirjastosta. On saatu selville kaksisäikeisen DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiä tai sen analogia tai mutanttia. Yhden säikeen sekvenssi, joka koodittaa polypeptidiä tai sen analogia, esitetään kuvassa 1, nukleotidista 115 geenin alapuolelle nukleotidiin 708 saakka, viimeksi mainittu mukaan lukien. Muut sekvenssit, jotka koodit-tavat analogia tai mutanttia, saattavat olla suurin piirtein samanlaisia kuin säie, joka koodittaa polypeptidiä. Kaksisäikeisen DNA-molekyylin yhden säikeen nukleotidisekvenssi, joka 7 90353 koodittaa 24 aminohapon mittaista esipeptidiä nukleotideistä numero 43-114, mainitut nukleotidit mukaanlukien, esitetään myös kuvassa 1.

Kaksisäikeinen cDNA tai jokin muu kaksisäikeinen DNA-molekyyli, joka sisältää nukleotidisäikeen, jossa on sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiä tai sen analogia tai mutanttia, saatetaan sisällyttää kloonausvehikkeliin, kuten esimerkiksi plasmidiin tai virukseen. Kumpikin DNA-molekyyli saatetaan viedä sisään soluun, joko prokaryoottiseen, esimerkiksi bakteerisoluun, tai eukaryoottiseen soluun, esimerkiksi hiiva- tai nisäkässoluun, tunnettuja menetelmiä käyttämällä, mukaanluettuina menetelmät, mutta ei niihin rajoittuen, joihin sisältyvät kloonausvehikkelit, jotka sisältävät jomman kumman molekyylin.

Mieluummin cDNA tai DNA, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidiä tai sen analogia tai mutanttia, liitetään plasmidiin, esim. pMSE-4:ään tai pMSARB4:ään, ja sitten se viedään sopivaan isäntäsoluun, jossa DNA voi ilmentyä ja humaani mangaanisuperoksididismutaasi-, (hMnSOD)-polypeptidi : : : tai sen analogi tai mutantti voidaan valmistaa. Edullisiin isäntäsoluihin kuuluvat Escherichia coli, erityisesti E. coli A4255 sekä E. coli A1645. Plasmidi pMSE-4, E. colin kannassa .: A4255, on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-tulonumerolla 53250. Plasmidi pMSARB4 voidaan saada kuvassa 4 esitetyllä tavalla ja kuten kuvataan kuvia koskevassa kuvauksessa .

Soluja, joihin sellaisia DNA-molekyylejä on viety sisään, voidaan viljellä tai kasvattaa aiheeseen perehtyneelle tutuin menetelmin, sopivissa olosuhteissa, jotka sallivat DNA:n transkription mRNA:aan sekä mRNA:n ilmentymisen proteiinina. Syntyvä mangaanisuperoksididismutaasiproteiini voidaan sitten ottaa talteen.

8 90353

Voidaan myös valmistaa eläinlääketieteellisiä ja farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät humaani MnSOD:a tai sen analogeja tai mutantteja sekä sopivia kantaja-aineita. Tätä humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja voidaan käyttää katalysoimaan seuraavaa reaktiota: 20 *· + 2H+ -> H202 -I- 02 ja täten voidaan vähentää solun tulehdusta, jonka superoksidira-dikaalit ovat aiheuttaneet.

Tarkemmin sanottuna, näitä entsyymejä tai niiden analogeja tai mutantteja saatetaan käyttää vähentämään tulehdusta, jonka aiheuttaa paikallista verettömyyttä seuraava uudelleenperfuusio, leikattujen, eristettyjen elinten elinajan lisäämiseen tai tulehdusten hoitoon.

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin valmistamiseksi bakteerisolussa. Bakteerisolu sisältää DNA-sekvenssin ja pystyy ilmentämään DNA-sekvenssiä, joka koodittaa mangaanisuperokskdidismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. Menetelmään sisältyy bakteerisolun ylläpitäminen sopivissa olosuhteissa sekä sopivassa valmistuselatusaineessa. Valmistukseen käytettävää elatusainetta täydennetään Mn++:n sellaisella määrällä, että Mn++:n konsentraatio, joka on solun saatavilla elatusaineessa, on suurempi kuin 2 miljoonasosaa.

Kyseessä olevan keksinnön edullisessa patentinsuoritusmuodossa bakteerisolu on Eschericia coli, joka sisältää plasmidin, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidiä, esimerkiksi pMSE-4 tai pMS RB4 E. colin kannassa A4255. Mn++:n konsentraatio valmistukseen käytettävässä elatusaineessa on noin 50-1500 miljoonasosaa, siten että konsentraatio! 150-750 miljoonasosaa ovat edulliset.

9 90353

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin takaisin saamiseksi bakteerisoluista, jotka sisältävät mainitun entsyymin. Soluja käsitellään ensin, jotta saadaan takaisin proteiinijae, joka sisältää proteiineja, joita soluissa on läsnä, humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasi tai sen analogi tai mutantti mukaan luettuna, ja sitten proteiinijaetta käsitellään humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin tai mutantin takaisin saamiseksi. Kyseessä olevan patentin edullisessa suoritusmuodossa soluja käsitellään ensin liukoisten proteiinien erottamiseksi liukenemattomista proteiineista sekä solunseinämän pirstaleista, ja liukoiset proteiinit otetaan talteen. Sitten liukoisia proteiineja käsitellään liukoisten proteiinien erottamiseksi, esim. säestämällä liukoisten proteiinien jae, joka sisältää hMnSODrn tai sen analogin tai mutantin, sekä jae, joka sisältää hMnSOD:n tai sen analogin tai mutantin,saadaan takaisin. Liukoisten proteiinien takaisin saatua jaetta käsitellään sitten, siten että humaani mangaanisuperoksididismutaasi tai sen analogi saadaan talteen.

Kyseessä olevan keksinnön edullisempi patentinsuoritusmuoto koskee menetelmää humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi bakteerisoluista, jotka sisältävät humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin. Menetelmään sisältyy ensin bakteerisolujen eristäminen valmistukseen käytetystä elatusaineesta sekä niiden sus-pensointi sopivaan liuokseen, jonka pH on noin 7,0-8,0. Sitten solut pirstotaan ja sentrifugoidaan ja syntyvää supernatanttia kuumennetaan noin 30-120 minuutin ajan 55-65°C:n lämpötilassa, mieluummin 45-75 minuuttia 58-62°C:ssa ja vielä mieluummin noin yhden tunnin ajan 60°C:ssa, ja sitten se jäähdytetään alle 10°C:een, mieluummin 4°C:een. Jokainen muodostuva saostuma on poistettava sentrifugoiden, ja jäähdytetty supernatantti dialysoidaan sopivaa puskuria vastaan, esimerkiksi 2 mM kalium-fosfaattipuskuria vastaan, jonka pH on noin 7,8. Dialyysi suoritetaan mieluummin uitrafi1 traation avulla käyttämällä suodatinmembraania, joka on pienempi kuin 30K. Samanaikaisesti 10 90353 dialyysin kanssa tai sen jälkeen jäähdytetty supernatantti saatetaan valinnaisesti konsentroida sopivaan tilavuuteen, esimerkiksi 0,03:een sen alkuperäisestä tilavuudesta. Pidättynyt aines eluoidaan sitten anionikromatografiapylväässä sopivasti puskuroidun liuoksen avulla, esimerkiksi liuoksella, joka on ainakin 20-millimolaarinen kaliumfosfaatin suhteen ja jonka pH on noin 7,8. Kootaan eluentin jakeet, jotka sisältävät superoksididismutaasin, ne yhdistetään ja dialy-soidaan noin 40-millimolaarista kaliumasetaattia, jonka pH on 5,5, vastaan. Dialysoidut, yhdistetyt jakeet eluoidaan sitten kationinvaihtokromatografiapylvään kautta käyttäen lineaarista gradienttia, joka on noin 40-200-millimolaarinen kalium-asetaatin suhteen ja jonka pH on noin 5,5. Kootaan huippuja-keet, jotka sisältävät superoksididismutaasin, ja ne yhdistetään. Yhdistetyt huippujakeet saatetaan sitten valinnaisesti dialysoida sopivaa liuosta, esim. vettä tai puskuriliuosta vastaan, joka on noin 10-millimolaarinen kaliumfosfaatin suhteen ja jonka pH on noin 7,8.

Esillä oleva keksintö koskee myös puhdistettua, entsymaattisesti aktiivista humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja, esim. met-hMnSOD:a, tai sen mutantteja, jotka on valmistettu esillä olevan keksinnön mukaisin menetelmin.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Kuva 1. Humaani MnSQD-CDNA:n sekvenssi

Kuva 1 esittää kaksisäikeisen DNA-molekyylin yhden säikeen nukleotidisekvenssiä, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia sekä humaani MnSOD:n 198 aminohapon mittaista sekvenssiä, joka vastaa mainittua DNA-sekvenssiä. Kuva 1 esittää myös kaksisäikeisen DNA-molekyylin yhtä säiettä, joka koodittaa kypsää humaani MnSOD:a edeltävää peptidiä, joka koostuu 24 aminohaposta, sekä aminohapposekvenssiä, joka vastaa tätä DNA-sekvenssiä. Kuvassa esitetään myös 5'- ja 3'-sekvenssit, joille ei translaatiota suoriteta.

11 90353

Kuva 2. pMSE-4:n rakenne: humaani MnSOD:n ekspressioplasmidi Plasmidi pMS8-4, joka sisälsi MnSODrn EcoRI (R-^)-insertillä, pilkottiin täydellisesti Ndel- ja Narl-restriktioentsyymien avulla. Suuri fragmentti eristettiin ja sidottiin synteettisen oli-gomeerin kanssa, kuten kuvataan kuvassa 2. Syntyvä plasmidi, pMS8-NN sisältää koodittavan alueen kypsälle MnSODrlle, jota koodittavaa aluetta edeltää ATG-aloituskodoni. Yllä esitetty plasmidi pilkottiin EcoRI:llä, päätteet täydennettiin polyme-raasi I:n Klenow-fragmentilla ja pilkottiin edelleen Ndelrllä. Pieni fragmentti, joka sisälsi MnSOD-geenin, liitettiin pSODit,13 : een , jota käsiteltiin Ndelrllä ja Stul:llä. pSODet-13 saatetaan saada, kuten on kuvattu käsittelyn alaisena olevassa US-patenttihakemuksessa 644 245 ja joka tähän yhteyteen liitetään viitteenä. Tämä tuotti plasmidin pMSE-4:n, joka sisälsi MnSODrä koodittavan alueen, jota edelsi ribosomien sitoutumiskohta dl ja joka oli promoottorin k PL säätelyn alainen. Plasmidi pMSE-4 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-tulonumerolla 53250.

Kuva 3. Mn++:n konsentraation vaikutus E. colissa valmistetun S0D:n aktiivisuuteen_

Kuvassa 3 esitetty kartta ilmaisee korrelaation, joka vallitsee E. colin kannan A 4255, joka sisältää plasmidin pMSE-4, valmista- man liukoisen rekombinantti-MnSOD:n spesifisen aktiivisuuden, ilmaistuna yksiköinä/mg sekä ei-induktio- (32°C) että induktio-(42°C) olosuhteissa, ja elatusaineen Mn++:n konsentraation välillä.

‘ ‘ Kuva 4. pMSARB4:n rakenne: humaani MnS0D:n ilmentymisplasmidi

Tet ekspressiovektori, pARB, valmistettiin pSODd^T-ll:stä täydellisen EcoRI-käsittelyn avulla, jonka jälkeen sitä pilkottiin osittain BamHI-restriktioentsyymien avulla. pSOD/i^T-ll on tallennettu the American Type Culture Collectioniin (ATCC) tulonumerolla 53468. Uutettu plasmidi kytkettiin seuraavan synteettisen oligomeerin kanssa -·- 5 1 - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3' V 3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5' 12 90 353 jolloin tuloksena oli pARB, joka sisältää Ϊ1 P^-promoot tor in .

MnSODrn ekspressioplasmidin pMSE-4:n EcoRI-fragmentti, joka sisältää ribosomin sitoutumispaikan dl sekä kypsää entsyymiä koodattavan täydellisen sekvenssin, vietiin pARB:n ainoaan EcoRI-kohtaan. Syntyvä plasmidi. pMSARB4 sisältää MnSOD-geenin, joka on ^P :n säätelyn alainen, sekä eli RBS: n ja antaa resis-tenssin tetrasykliinille.

Kaksisäikeinen DNA-molekyyli, joka sisältää cDNA:n, joka koodit-taa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiä tai sen analogia tai mutanttia, on eristetty humaani T-solu DNA-kirjas-tosta. Kaksisäikeisen DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiä tai sen analogia tai mutanttia, on keksitty. DNA-molekyylin yhden säikeen sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidiä tai sen analogia, esitetään kuvassa 1 , ja se sisältää nukleotidinumerot 115-708, mainitut nukleotidit mukaanluettuina. Yhden säikeen sekvenssi, joka koodittaa hMnSOD-analogia tai mutanttia, on suurin piirtein samankaltainen kuin säie, joka koodittaa hMnSOD-polypeptidiä. Kuvassa 1 esitetään myös humaani mangaanisuperoksididismutaasia edeltävä peptidi. Nukleotidit numerot 43-114, mainitut nukleotidit mukaan luettuina, koodittavat tätä peptidiä.

Menetelmät cDNArn valmistamiseksi sekä DNA:n sekvenssin määrittämiseksi, joka sekvenssi koodittaa humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidiä, sen analogia tai mutanttia, ovat tutkimustyöhön perehtyneiden tuntemia, ja niitä kuvataan yksityiskohtaisemmin tässä yhteydessä myöhemmin. Ennen kaikkea, nyt on löydetty DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia, ja tunnettuja synteesimenetelmiä voidaan käyttää tämän sekvenssin osia sisältävien DNA-molekyylien valmistamiseksi .

Tavanomaiset kloonausvehikkelit, kuten esimerkiksi plasmidit, esimerkiksi pBR322, virukset tai bakteriofaagit, esim. "K voidaan i3 90353 muuntaa tai rakentaa tunnettuja menetelmiä käyttämällä uusien kloonausvehikkeleiden valmistamiseksi, jotka vehikkelit sisältävät cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaa-sipolypeptidiä tai sen analogeja tai mutantteja. Samalla tavalla voidaan sellaisia kloonausvehikkeleitä muuntaa tai rakentaa, siten että ne sisältävät DNA-molekyylejä, joiden yhteen säikee-seen sisältyy segmentti, jolla on kuvassa 1 esitetty sekvenssi humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiä varten tai segmenttejä, jotka ovat oleellisesti sen kaltaisia. DNA-molekyyli, joka on sijoitettu väliin, voidaan valmistaa erilaisin menetelmin, joihin kuuluu entsymaattinen tai kemiallinen synteesi.

Tuloksena saadut kloonausvehikkelit ovat kemiallisia kokonaisuuksia, joita ei esiinny luonnossa ja jotka voidaan luoda uudenaikaisella tekniikalla, jota kuvataan yhdistelmä-DNA-tekniikkana. Kloonausvehikkeli on mieluummin plasmidi, esimerkiksi pMSE-4 tai pMS RB4. Nämä kloonausvehikkelit saatetaan viedä sisään soluihin, joko prokaryoottisiin, esimerkiksi bakteerisoluihin (Escherichia coli, B. subtilis, jne.), tai eukaryoottisiin soluihin, eismerkiksi hiiva- tai nisäkässoluihin, käyttämällä tutkimustyössä tunnettuja menetelmiä, kuten esimerkiksi transformaatiota, transfektiota yms. Solut, joihin kloonausvehikkelit viedään sisään, sisältävät täten cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiä tai sen mutanttia tai analogia, jos cDNA oli läsnä kloonausvehikkelissä, tai solut sisältävät DNA:n, joka sisältää säikeen, jolla kokonaan tai jonka osalla on sekvenssi kuvassa esitettyä humaani MnSOD-polypeptidiä varten tai samankaltainen sekvenssi, jos sellainen DNA oli läsnä kloonausvehikkelissä.

Escherichia colin solut ovat edullisia isäntäsoluja kyseessä olevan keksinnön mukaisia kloonausvehikkeleitä varten. Tällä hetkellä edullinen E. colin auksotroofinen kanta on A1645, joka on tallennettu the American Type Culture Collectioniin Rockvillessä, Marylandissa, USA, ja joka sisältää plasmidin pApoE-Ex2, ATCC-talletusnumerolla 39787. Kaikki the American i4 90353

Type Culture Collectioniin tehdyt tallennukset, joihin tässä hakemuksessa viitataan, suoritettiin Budapestin sopimuksen mukaisesti perustuen sopimustekstiin "the International Recognition of the Deposit of Microorganisms".

A1645 saatiin Al637:stä valitsemalla Gal+:n suhteen (kyky käyttää galaktoosia) sekä tetrasykliiniresistenssin häviämisen suhteen. Se sisältää vielä faagi λ:η aineosia. Sen fenotyyppi on C600 r~m+ gal+ thr- leu- IacZ- bl (λοΙ857ΔΗ1ABamHl N+).

A1637 saatiin C600:sta siirtämällä (insertoimalla) genomin osa, joka sisälsi geenin tetrasykliiniresistenssiä varten, galaktoosi-operoniin sekä faagi λ:η elementteihin, jotka sisältävät aineosat cl-repressorin synteesiä varten. C600 on saatavissa the American Type Culture Collectionista, ATCC-talletusnumerolla 23724.

Escherichia colin fototrooppiset kannat, jotka tekevät mahdolliseksi polypeptidiekspression korkean tason vieläpä, kun niitä on kasvatettu minimaalisessa elatusaineessa, ovat vieläpä isäntinä edullisempia ekspressoitaessa geenejä, jotka koodittavat mangaani-superoksididismutaasia. Nykyisin eräs edullinen kanta on A4255. Kanta A4255, joka sisältää plasmidin pMSE-4, on tallennettu the American Type Culture Collectioniin talletusnumerolla 53250.

Syntyviä soluja, joihin DNA, joka koodittaa humaani mangaani-superoksididismutaasipolypeptidiä tai sen analogia tai mutant-tia, on viety sisään, saatetaan käsitellä, kun niitä on kasvatettu tai viljelty tarkoituksenmukaisesti sopivissa olosuhteissa, jotka ovat aiheeseen perehtyneille tuttuja, niin että DNA ohjaa DNA:n koodittaman geneettisen informaation ilmentymistä, esimerkiksi, niin että se ohjaa hMnSOD-polypeptidin tai sen analogin tai mutantin ilmentymistä, ja solu ilmentää hMnSOD-polypeptidiä tai sen analogia tai mutanttia, joka voidaan sitten saada takaisin.

is 90 3 53

Koko tässä hakemuksessa käytetty termi "superoksididismutaasi" (SOD tarkoittaa entsyymiä tai polypeptidiä, joka toimii super-oksidi- tai hapettomien radikaalien reseptorina tai joka katalysoi seuraavan dismutaatioreaktion: 20 2~ + 2H+ ------> 02 + H202

Termi "mangaanisuperoksididismutaasi" (MnSOD) tässä yhteydessä käytettynä tarkoittaa alkuaine mangaania kaikissa sen kemiallisissa muodoissa.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidi" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä käytettynä tarkoittaa polypeptidiä, jossa on 198 aminohappoa, ja jonka aminohapposekvenssin osa esitetään kuvassa 1: sekvenssin N-pääte on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 115-1.17, ja sekvenssin COOH-pääte on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708.

Termi "polynukleotidimangaanikompleksi" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä käytettynä tarkoittaa molekyyliä, johon sisältyy humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidi kompleksina mangaanin kanssa, joka on missä tahansa kemiallisessa muodossa, jolla molekyylillä on luonnossa esiintyvän humaani mangaani-superoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasi" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä käytettynä tarkoittaa molekyyliä, johon sisältyy ainakin kaksi humaani mangaanisuperoksididismutaasi-polypeptidiä kompleksina mangaanin kanssa, joka on missä tahansa kemiallisessa muodossaan, ja jolla polypeptidillä on luonnossa esiintyvän humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin analogi" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä käytettynä tarkoittaa polypeptidiä, johon sisältyy humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidi, jonka joko molempiin tai toiseen päähän on kiinnittynyt yksi tai useampia lisäksi tulevia aminohappoja.

16 90353

Termillä "polypeptidimangaanikompleksin analogi" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä käytettynä tarkoitetaan molekyyliä, johon sisältyy polypeptidimangaanikompleksi, jonka polypeptidi-osaan sisältyy yksi tai useampia lisäksi tulevia aminohappo ja, jotka ovat kiinnittyneet jompaan kumpaan tai molempiin päihin.

Termillä "humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogi" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä käytettynä tarkoitetaan molekyyliä, johon sisältyy ainakin kaksi polypeptidiä, joista ainakin yksi on humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin analogi, kompleksina mangaanin kanssa, joka on missä tahansa kemiallisista muodoistaan, ja jonka polypeptidin analogilla on luonnossa esiintyvän humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Termillä "humaani mangaani superoksididismutaasipolypeptidin mutantti" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä tarkoitetaan poly-peptidiä, jonka aminohapposekvenssi on suurin piirtein yhtäläinen humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin kanssa, mutta joka eroaa siitä yhden tai useamman aminohapon suhteen.

Termillä "polypeptidimangaanikompleksin mutantti" tarkoitetaan molekyyliä, johon sisältyy humaani mangaanisuperoksididismutaa-sipolypeptidin mutantti kompleksina mangaanin kanssa, joka on jossain kemiallisista muodoistaan, ja jolla kompleksilla on mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Termillä "humaani mangaanisuperoksididismutaasin mutantti" kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä käytettynä tarkoitetaan molekyyliä, johon sisältyy ainakin kaksi polypeptidiä, joista polypeptideistä ainakin yksi on humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidin mutantti kompleksina mangaanin kanssa, joka on jossain kemiallisista muodoistapa jolla peptidillä on luonnossa esiintyvän humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

17 90353 hMnSOD-polypeptidin ja hMnSODrn mutantteja, jotka on sisällytetty kyseessä olevan keksinnön osana, voidaan valmistaa suorittamalla kuvan 1 mukaisen DNA-sekvenssin mutaatio, jonka sekvenssin N-pääte on lysiini, jota nukleotidit 115-117 koodittavat, ja jonka sekvenssin COOH-päätettä koodittavat nukleotidit 706-708.

DNA:n mutaatio voidaan suorittaa menetelmin, jotka ovat aiheeseen perehtyneelle tuttuja, esimerkiksi menetelmän avulla, jonka Bauer et ai. ovat esittäneet julkaisussa Gene 37:73-81 (1985). Sekvenssi, jolle mutaatio on suoritettu, voidaan sijoittaa väliin (insertoida) sopiviin ekspressiovektoreihin kyseessä olevassa hakemuksessa kuvatulla tavalla, jotka vektorit sitten viedään soluihin, joita sitten käsitellään, niin että DNA, jolle mutaatio on suoritettu, ohjaa hMnSOD-polypeptidimutanttien ja hMnSOD-mutanttien ilmentymistä.

Humaani mangaanisuperoksididismutaasin oletetaan olevan proteiinin, jolla on ainakin kaksi, mahdollisesti neljä yhtäläistä alayksikköä, joista kullakin on noin 198 aminohappoa sekvenssissä, joka on esitetty kuvassa 1 humaani mangaanisuperoksididismutaa-sille ja jonka N-päässä on lysiini, joka on kuvan 1 mukaisten nukleotidien 115-117 koodittama, ja jonka sekvenssin COOH-pääte on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708.

Humaani MnS0D:a tai sen analogeja tai mutantteja saatetaan valmistaa soluista, joihin on viety sisään DNA:a tai cDNA:a, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja. Tätä humaani MnS0D:a tai sen analogeja tai mutantteja saatetaan käyttää katalysoimaan superoksidianionin dismutaatio tai yksivalenssinen pelkistyminen protonien läsnäollessa, jotta muodostuu vetyperoksidia seuraavan yhtälön mukaisesti : , 0Li+ humaani MnSOD „ Λ 20^i + 2H -> H202 + 02

Voidaan myös valmistaa eläinlääketieteellisiä ja farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät tehokkaita määriä hMnS0D:a 18 90 353 tai yhtä tai useampaa hMnSOD-analogia tai mutanttia sekä sopivaa kantaja-ainetta. Sellaiset kantaja-aineet ovat aiheeseen perehtyneiden hyvin tuntemia. hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan annostella suoraan tai koostumuksen muodossa eläimelle tai ihmiselle, esimerkiksi, jotta voidaan hoitaa tulehduksia tai vähentää vauriota, jonka hapettomat radikaalit aiheuttavat uudelleenperfuusiossa, joka seuraa verettömyyttä tai elinsiirtoa. hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan myös lisätä suoraan tai koostumuksen muodossa eristetyn elimen perfuusioväliaineeseen, jotta vähennetään eristetyn elimen vaurioitumista, jonka aiheuttavat hapettomat radikaalit elimen irrottamista seuraavan perfuusion aikana, täten pidennetään elimen elinaikaa. Lisäksi hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan käyttää neurologisen vaurion vähentämiseksi verettömyyttä seuraavan uudelleenperfuusion aikana sekä keuhkoputken ja keuhkojen kasvuhäiriön hoitamiseksi.

On myös keksitty menetelmä entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin valmistamiseksi bakteerisolussa. Bakteerisolu sisältää DNA-sekvens-sin sekä pystyy ilmentämään DNA-sekvenssiä, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. Menetelmään sisältyy bakteerisolun ylläpitäminen sopivissa olosuhteissa sekä sopivassa tuotantoväliaineessa. Valmistukseen käytettävää väliainetta täydennetään sellaisella

Il X.L.

Mn :n määrällä, että Mn :n konsentraatio elatusaineessa on suurempi kuin 2 miljoonasosaa.

Bakteerisolu voi olla mikä tahansa bakteeri, jossa DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia on viety sisään yhdistelmä-DNA-tekniikoin. Bakteerin pitää pystyä ilmentämään DNA-sekvenssiä sekä valmistamaan proteiinituotetta.

Sopivat olosuhteet ja valmistukseen käytettävä elatusaine vaih-t-el evät: bakteeri 1 a j i n ja kannan mukaan.

19 90353

Bakteerisolu saattaa sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa superoksididismutaasia tai analogia, vektori-DNA-molekyylin, kuten esimerkiksi plasmidin, sisällä. Vektori tai plasmidi konstruoidaan yhdistelmä-DNA-tekniikoin, jotta saadaan sekvenssi, joka koodittaa molekyylin sopivaan kohtaan sisään liitettyä SOD:a.

Kyseessä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa bakteeri-solu on Escherichia coli-solu. Edullinen E. colin auksotrofinen kanta on A1645. Edullinen E. colin prototrofinen kanta on A4255. Kyseessä olevan keksinnön mukaisen E. colin solu sisältää plasmidin, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismu-taasia tai sen analogia tai mutanttia.

Kyseessä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa bakteeri-solu sisältää plasmidi pMSE-4:n. Menetelmä tämän plasmidin konstruoimiseksi kuvataan kuvien selityksissä, ja plasmidia itseään kuvataan esimerkissä 2. Tämä plasmidi on tallennettu ATCC-talletusnumerolla 43250.

Kyseessä olevan keksinnön eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa bakteerisolu sisältää plasmidin pMSARB4. Menetelmää tämän plasmidin konstruoimiseksi kuvataan kuvien selityksissä, ; ja plasmidia itseään kuvataan esimerkissä 5. Tämä plasmidi saat- ' taa olla konstruoitu pSOD/j^T-ll: stä, joka on tallennettu the

American Type Culture Collectioniin talletusnumerolla 53468.

Kyseessä olevan keksinnön spesifisissä suoritusmuodoissa entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogin valmistaa E. colin kannan A4255 solu, joka sisältää plasmidin pMSE-4, sekä E. colin kannan A4255 solu, joka sisältää plasmidin pMSARB4.

Sopiva valmistukseen käytettävä elatusaine bakteerisolua varten voi olla hyväksyttävän elatusaineen mikä tahansa tyyppi, kuten esimerkiksi kaseiinihydrolysaatti- tai LB (Luria Broth)-elatusaine, joista viimeksi mainittu on edullinen. Sopivat 20 90353 kasvatusolosuhteet vaihtelevat E. colin kannan ja sen sisältämän plasmidin mukaisesti, esimerkiksi E. coli A4255, joka sisältää plasmidin pMSE-4, indusoidaan 42°C:ssa ja sitä pidetään yllä mainitussa lämpötilassa noin 1-5 tunnin ajan. Sopivat lämpötila-, aika-, ravistelu- ja ilmastusolosuhteet ympin kasvatusta sekä viljelmän kasvatusta varten sopivaan tiheyteen ennen tuotantovaihetta sekä viljelmän ylläpitämiseksi tuotantovaiheen aikana, saattavat vaihdella ja ne ovat tuttuja aiheeseen perehtyneille .

Elatusaineen Mn++-ionikonsentraatio, joka tarvitaan entsymaattisesti aktiivisen MnSODrn valmistamiseksi, vaihtelee käytetyn elatusaineen tyypin mukaisesti.

LB-tyyppisessä elatusaineessa Hn++-ionikonsentraation, joka on 150-750 miljoonasosaa, on havaittu olevan tehokkaan. On edullista, että yhdistelmätyyppisissä elatusaineissa Mn++:n konsentraa-tio on noin 50-1500 miljoonasosaa.

Sopivien varastointi-, viljely-, ymppäys- sekä tuotantoelatus-aineiden spesifiset aineosat saattavat vaihdella, ja ne ovat tuttuja aiheeseen perehtyneelle.

Kyseessä oleva keksintö koskee myös menetelmää humaani mangaani-superoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi takaisin bakteerisoluista, jotka sisältävät mainitun entsyymin. Ensin soluja käsitellään, jotta saadaan proteiinijae, joka sisältää soluissa läsnäolevat proteiinit, humaani mangaanisuper-oksididismutaasi tai sen analogi tai mutantti mukaanluettuina, ja sitten proteiinijaetta käsitellään humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi.

Kyseessä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa soluja käsitellään ensin liukoisten proteiinien erottamiseksi ensin liukenemattomista proteiineista sekä solunpirstaleista, ja sitten liukoiset proteiinit saadaan takaisin. Näin saatuja liukoisia proteiineja käsitellään sitten liukoisten proteiinien jakeen, 21 90353 joka sisältää humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia, erottamiseksi, esimerkiksi saostami-seksi, ja jae otetaan talteen. Sitten jaetta käsitellään erikseen, jotta saadaan talteen humaani mangaanisuperoksididismu-taasi tai sen analogi tai mutantti.

Seuraavassa kuvataan kyseessä olevan keksinnön edullisempaa suoritusmuotoa. Ensin bakteerisolut eristetään tuotantoela-tusaineesta, ja ne lietetään sopivaan liuokseen, jonka pH on noin 7,0 tai 8,0. Sitten solut pirstotaan ja sentrifugoidaan. Syntyvää supernatanttia kuumennetaan noin 30-120 minuutin ajan lämpötilassa, joka on noin 55-65°C, mieluummin 45-75 minuutin ajan 58-62°C:ssa ja vielä edullisemmin yhden tunnin ajan 60° C:ssar sitten se jäähdytetään alle 10°C, mieluummin noin 4°C:een. Jäähdyttämisen aikana muodostuva saostuma poistetaan, esim. sentrifugoiden, ja sitten jäähdytetty supernatantti dialysoi-daan sopivaa puskuria vastaan. Jäähdytetty supernatantti dialy-soidaan mieluummin ultrasuodatuksen avulla, käyttäen suodatin-membraania, joka on pienempi kuin 30K, mieluiten 10K. Sopiviin puskureihin sisältyy 2-millimolaarinen kaliumfosfaattipuskuri, jonka pH on noin 7,8. Samanaikaisesti tämän dialyysin kanssa tai dialyysin jälkeen jäähdytetty supernatantti saatetaan valinnaisesti konsentroida sopivaan tilavuuteen, esimerkiksi - 0,03 supernatantin alkuperäisestä tilavuudesta on havaittu sopi vaksi. Pidättyvä liuos eluoidaan sitten anioninvaihtokromatogra-; fiapylväässä sopivasti puskuroidulla liuoksella, esimerkiksi liuoksella, jossa on vähintään 20 millimoolia kaliumfosfaatti-: puskuria, jonka pH on noin 7,8. Jakeet, jotka sisältävät super- oksididismutaasin, kootaan, yhdistetään sekä dialysoidaan noin 40-millimolaarista kaliumasetaattia vastaan, jonka pH on 5,5. Dialysoidut, yhdistetyt jakeet eluoidaan sitten kationinvaihto-kromatografiapylvään läpi, jossa on kaliumasetaatin (KOAC) lineaarinen gradientti noin 40 millimoolista noin 200 millimoo-liin kaliumasetaatti ja pH on 5,5. Huippujakeet, jotka sisälsi-vät superoksididismutaasia, kootaan ja yhdistetään. Valinnaisesti '"· saatetaan yhdistetyt huippujakeet sitten dialysoida sopivaa 22 90353 liuosta, esimerkiksi puskuriliuosta vastaan, joka on noin lQ_ millimolaarinen kaliumfosfaatin suhteen ja jonka pH on noin 7,8.

Kyseessä oleva keksintö koskee myös puhdistettua, esimerkiksi sellaista, jossa ei oleellisesti ole muita ihmisperäisiä aineosia, humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja, jotka on valmistettu kyseessä olevan keksinnön mukaisin menetelmin. Erityisesti kyseessä oleva keksintö koskee humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia, jonka polypep-tideillä on kuvassa 1 esitetty aminohapposekvenssi, jonka N-pääte on lysiini, jota kuvan 1 nukleotidit 115-117 koodittavat, ja jonka sekvenssin COOH-pääte on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708, ja jossa sekvenssissä on ylimääräinen metioniinitähde N-päässä (Met-hMnSOD). Kyseessä olevan keksinnön edullinen patentinsuoritusmuoto koskee puhdistettua Met-hMnSOD:a, jonka spesifinen aktiivisuus on 3500 yksikköä/mg.

Esimerkkejä

Esimerkkien, joita seuraavassa esitetään kyseessä olevan keksinnön ymmärtämiseksi, tarkoituksena ei ole rajoittaa keksinnön piiriä eikä niiden tulisi olla siten laadittuja. Kyseessä olevat esimerkit eivät sisällä yksityiskohtia tavanomaisista menetelmistä, joita käytetään vektoreiden konstruointiin, polypeptideitä koodittavien geenien vientiin (insertioon) sellaisiin vektorei-h iri tai syntyvien plasmidien si i rtämisessä i säntäso] ui hi n . Esimerkkeihin ei myöskään sisälly yksityiskohtaista kuvausta tavanomaisista menetelmistä, joita käytetään määritettäessä polypeptidejä, joita sellaiset isäntävektorijärjestelmät valmistavat tai joita käytetään sellaisten polypeptidien identiteetin määrittämiseksi isoelektristen fokusointigeelien (IEF) aktiivisen värjäyksen avulla. Sellaiset menetelmät ovat aiheeseen perehtyneiden hyvin tuntemia, ja niitä kuvataan useissa julkaisuissa, esimerkiksi seuraavat julkaisut mukaan luettuina: T. Maniatis, E.F. Fritsch ja J. Sombrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) .

23 90353 J.M. McCord ja I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969).

C. Beauchamp ja I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971).

Esimerkki 1

MnSOD-cDNA-kloonien identifioimiseksi syntetisoitiin seos-oligomeerikoettimia julkaistun aminohapposekvenssin mukaisesti (18, 19).

5'-koetin - 30 mer sekvenssi AA, _ - aa„. (18, 19) - lb 24 5 ' 3 '

TTGCATAATTTGTGCCTTAATGTGTGGTTC

T G T G

G G

31-koetin - 32 mer sekvenssi AA179 - AAlsg (18) 5' 3 '

TCTGTTACGTTTTCCCAGTTTATTACGTTCCA G G G G

5'-koetin, joka koostuu 30 nukleotidista, vastaa kypsän MnSODrn aminohappoja 15-24. 3'-koetin, joka koostuu 32 nukleotidista, vastaa kypsän MnSOD:n aminohappoja 179-189. 5'-koetin on seos- koetin, joka koostuu 36 eri sekvenssistä, kuten yllä on osoitettu. 3'-koetin on seoskoetin, joka koostuu 16 eri sekvenssistä, kuten yllä on osoitettu. (Kun useampia kuin yksi nukleotidi on merkitty tiettyyn asemaan, DNA-säie syntetisoitiin käyttäen ekvimolaarisia määriä kutakin merkittyä nukleotidiä, jolloin syntyi seoskoetin.) 5'-koetinta käytettiin seulottaessa T'gt-lO-vektoriin kloonatun T-solun cDNA-kirjaston 300 000 plakkia. Hybridisointi faagi-plakkikopioille (phage plaque replicas), jotka oli tehty liikkumattomiksi nitroselluloosasuodattimilla, suoritettiin standardimenetelmin (Maniatis et ai. supra) paitsi, että hybridisointi suoritettiin 50°C:ssa, 8xSSC:ssä, 16 tunnin ajan. Sitten suodattimia pestiin 50°C:ssa 5xSSC:llä ja 0,1 piisellä SDS:llä 90353 24

Kolme positiivista plakkia eristettiin, ja ne nimitettiin Phi MS8:ksi, Phi MSl:ksi ja Phi MSlJ:ksi.

EcoRI:n avulla Phi MS8:sta ja Phi MSl:stä saadut DNA:n pilkkou-tumistuotteet ilmaisivat, että niillä molemmilla on cDNA-insert-tejä, jotka ovat noin 800 emäsparin mittaisia ja jotka hybridi-soituvat sekä 5'- että 3'-oligonukleotidikoettimiin. Phi MSlJrssä oli ainoastaan 450 emäsparin mittainen cDNA-insertti, joka hybri-disoitui ainoastaan 5'-päätteiseen koettimeen.

Kolmen faagikloonin EcoRI-insertit alakloonattiin pBR322:n EcoRI-kohtaan, mikä vastaavasti tuotti pMS8-4:n, pMSl-4:n sekä pMSlJ:n. Restriktioanalyysi ja hybridisointi 5'- ja 3'-oligo-nukleotidikoettimiin osoitti, että seka pMS8-4:llä että pMSl-4:llä on samanlaiset kaavat. Molemmille plasmideille on johdettu seuraava restriktiokartta, joka ilmaisee 5' - > 3’- suuntauksen.

5 ’

Rl PvuII PvuII Seal BamI Stul Rl 1 i 1 l II l . ίΐ- -.....i -» i :τ '1 ~— l —ro 100 200 300 400 500 600 700 800 pMS8-4:n cDNA-insertin sekvenssi esitetään kuvassa 1. Ennustettu aminohapposekvenssi eroaa julkaistusta aminohapposekvenssistä (19) siinä, että Glu on havaittavissa Gln:n tilalla kolmessa (3) asemassa ( AA 42, 88, 108) ja välillä AA10, on kaksi * 123-124 ylimääräistä aminohappoa Gly ja Trp. pMSl-4:n ja pMSlJ:n sekvenssianalyysi ilmaisi, että riippumattomasti oli johdettu kolme MnSOD-kloonia, ja varmisti nämä erot julkaistuun aminohapposekvenssiin nähden.

Valmiin MnS0D:n N-terminaalisen lysiinin yläpuolella sijaitseva sekvenssi johtaa 24 aminohapon mittaiseen esipeptidisekvenssiin.

25 90353

Esimerkki 2

D

pMSE-4:n rakenne: Amp humaani MnSODrn ekspressioplasmidi Lähtökohta pMSE-4:n rakenteelle on plasmidi pMS8-4, joka on saatu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Plasmidi pMS8-4, joka sisältää humaani MnSODrn cDNA:n EcoRI-insertillä, pilkottiin täydellisesti Ndel- ja Narl-restriktioentsyymeillä. Suuri fragmentti eristettiin ja sidottiin synteettisen oligomeerin kanssa kuvassa 2 esitetyllä tavalla. Syntyvä plasmidi, pMS8~NN sisältää kypsää MnSODra koodittavan alueen, jota edeltää ATG-aloitus-kodoni. Mainittu plasmidi pilkottiin EcoRIrllä, päät täydennettiin polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla, ja pilkottiin edelleen Ndel:llä. Pieni fragmentti, joka sisälsi MnSOD-geenin, vietiin pSOD 13:een (suoritettiin insertio), jota oli käsitelty Ndel:llä jaStuIrllä. pSOD 13 saatetaan saada, kuten on kuvattu käsittelyn alaisessa US-patenttihakemuksessa 644 245 ja joka tähän yhteyteen on sisällytetty viitteenä. Tätä muodostettua plasmi-dia pMSE-4, joka sisälsi MnSODrä koodittavan alueen, edelsi ribosomien sitoutumispaikka dl ja se oli hp -promoottorin kontrol-Iin alainen. Plasmidi pMSE-4 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-talletusnumerolla 53250. Kaikki yllä esitetyissä valmistuksissa käytetyt menetelmät olivat Maniatisin, supra, kuvaamia menetelmiä.

Esimerkki 3

Yhdistelmä humaani MnSODrn ilmentyminen

Plasmidi pMSE-4 vietiin sisään Escherichia colin kantaan A4255 tunnettuja menetelmiä käyttämällä. Sitten E. colin kantaa 4255, joka sisälsi pMSE-4:n, kasvatettiin 32°C:ssa, Luria-lihaliemi-elatusaineessa (LB), joka sisälsi ampisilliiniä 100 g/ml, optiseen tiheyteen (OD) 0,7, 600 nmrssä mitattuna. Näytteille, jotka oli otettu eri aikavälein, suoritettiin elektroforeettinen erotus natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyiiamidigeeleillä (SDS-PAGE). Geelit osoittivat lisääntymistä humaani MnSOD-tasoissa aina 120 minuutin jälki-induktioon saakka, jossa vaiheessa yhdistelmä-MnSOD-proteiini käsitti 27 % solun kokonais-proteiineista Coomassie-bluella värjätyn geelin seulonnalla 26 90 353 määritettynä. Näytteiden 90 sekunnin mittainen äänikäsittely N-375-äänikäsittelylaitteessa sekä proteiinien jakaminen liukoisiin (s) ja liukenemattomiin jakeisiin (p) sentrifugoimalla 10 OOO x g 5 minuutin ajan ilmaisi, että suurin osa valmistetusta yhdistelmä-MnSOD:stä oli liukenematonta. Indusoitu, liukoinen proteiinijae sisälsi vain vähän enemmän SOD-aktiivisuutta kuin indusoitu vastinosa, standardimenetelmin suoritetun määrityksen perusteella. Katso McCord et ai., supra. Nähtävästi MnSOD:n osa, joka on liukoisessa jakeessa, on inaktiivista.

Tämä antaa aiheen olettaa, että suurin osa humaani MnSODistä, joka on valmistettu tässä esimerkissä kuvatuissa olosuhteissa, on vaikutukseltaan tehotonta.

Esimerkki 4 +4-

Elatusaineeseen sisältyvän Mn :n vaikutus MnSOD:n liukoisuuteen ja aktiivisuuteen_

Mn++:n lisäyksellä, joka suoritettiin lisääntyvinä konsentraatioi-na aina 450 miljoonasosaan saakka, E. coli A4255:n elatusaineeseen, joka sisälsi pMSE-4:a, ennen 2 tunnin mittaista induktiota 42°C:ssa, ei ollut mitään haitallista vaikutusta humaani MnSODtn kokonaissaantoon. Liukoisten (s) sekä liukenemattomien,(p), äänikäsiteltyjen proteiinijakeiden analyysi, joka suoritettiin natriumdodekyy1isulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla (SDS-PAGE), osoitti yhdistelmäproteiinin lisääntynyttä liukoisuutta Mn++:n konsentraatioiden lisääntyessä (taulukko 1). S0D:n aktiivisuuden määrittäminen (katso McCord et ai., supra) antaa aihetta olettaa, että vallitsee korrelaatio elatusaineen lisääntyvien Mn++:n konsentraatioiden ja MnSOD:n lisääntyneen liukoisuuden välillä, elatusaineen selvän optimikonsentraation Mn++:n ollessa 150 miljoonasosaa (kuva 3). Lisäksi, lisääntyneet Mn++:n konsentraatiot aktivoivat aiemmin inaktiivista liukoista entsyymiä. Näitä Mn++:n konsentraatioita käyttäen kasvatettujen, indusoitujen viljelmien liukoiset proteiinijakeet osoittavat aina 60-kertaista lisääntymistä SOD:n aktiivisuudessa verrattuna liukoisiin proteiinijakeisiin, jotka on saatu indu-soimattomista viljelmistä, joita on kasvatettu näillä Mn++:n 27 90353 konsentraatioilla. Isoelektrisen fokusoinnin geelien (IEF) aktiivisuusvärjäys (katso Beaucham et ai., supra) ilmaisi, että yhdistelmä MnSODrn multimuodot olivat yhtäläisiä luonnonmukaisen humaani MnSODrn multimuotojen kanssa.

Tulokset, jotka on saatu humaani MnSOD:n valmistuksen suhteen E. coli A1645:n avulla, ovat samankaltaisia kuin yllä esitetyt tulokset.

Taulukko 1

Mn+ Prosentteja Prosentteja Spesifinen ak- (miljoo- liukoista hu- liukoista hu- tiivisuus yksi- nasosia) maani MnSOD:a maani MnSODra köitä/mg liu- indusoidusta liukoisista koisia proteii- kokonais- bakteeriperäi- neja humaani sistä proteii-

MnSOD:stä neistä O 30,6 7,2 30 50 72,7 15,4 241 100 78,0 16,9 356 150 82,9 18,8 606 200 82,0 20,8 338 250 79,2 20,4 380 300 80,8 20,3 381 450 89,2 22,4 323

Esimerkki 5 pMSARB4;n rakenne: Tet humaani MnS0D:n ekspressioplasmidi

Tet ekspressioplasmidi pARB valmistettiin pSOD^T-ll:sta pilkkomalla täydellisesti EcoRIrllä, jonka jälkeen suoritettiin osittainen pilkkominen BamHI-restriktioentsyymeillä. pSOD^T-11 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin talletus-numerolla 53468. Pilkottu plasmidi sidottiin synteettisen oligo-meerin kanssa, jolla oli seuraava rakenne: 5’- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3’ 3’- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5’ jolloin saatiin pARB, joka sisälsi ^P^-promoottorin.

28 9 0 353

MnSOD:n ekspressioplasmidi pMSE-4:n EcoRI-fragmentti, joka sisälsi dl ribosomien sitoutumispaikan sekä kypsän entsyymin täydellisen koodaussekvenssin, vietiin (insertoitiin) pARBin ainoaan EcoRI-kohtaan. Syntyvä plasmidi pMSA RB4 sisältää MnSOD-geenin, joka on λ-Ρ :n säätelyn alainen, sekä dl RBS:n ja antaa resistenssin tetrasykliinille (kuva 4).

Esimerkki 6

Humaani MnSQD:n ekspressio pMSARB 4:stä

Plasmidi pMSARB4 vietiin Escherichia colin kantaan A4255 tunnettuja menetelmiä käyttäen. Viljelmiä kasvatettiin 32°C:ssa, Luria-lihaliemessä (LB), joka sisälsi erilaisia konsentraatioi-ta Mn++:a, kunnes 600 muissa saavutettiin optinen tiheys (OD) 6,7. Induktio suoritettiin 42°C:ssa. Näytteille, jotka oli otettu eri aikavälein, suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE:1la. hMnSOD-tasoa nostettiin aina 120 minuutin mittaisen induktioajan avulla, jolloin hMnSOD muodosti noin 15 % solun kokonaisproteii-neista, Coomassie Bluella värjätyn geelin seulonnan avulla määritettynä.

Indusoitu MnSOD oli liukoinen elatusaineen Mn++-konsentraatios-ta riippumatta. Tämä on vastakohta Amp plasmidi pMSE-4:lla saaduille havainnoille. (Katso esimerkki 4.) SOD:n suurin aktiivisuus ja ekspressiotaso riippuivat kuitenkin Mn++:n lisäyksestä (taulukko 2).

29 90353

Taulukko 2

MnSOD:n ekspressio E. coli A4255:ssä (pMSARB4)

Miljoonas- Prosenttia liu- Spesifinen aktiivisuus osaa koista hMnSODra yksiköitä/mg liukoisia

Mn++:aa liukoisista bak- proteiineja teeriperäisistä proteiineista 42° 32° 42° O 10,9 8,0 23 50 19,8 8,0 227 100 16,0 8,0 241 200 17,0 10,0 278 300 16,0 9,3 238

Esimerkki 7

Entsymaattisesti aktiivisen yhdistelmä humaani MnS0D:n puhdistaminen_ E. Colin kantaa A4255, jossa oli plasmidi pMSARB4, fermentoi-tiin LB:ssä, jota oli täydennetty 750 miljoonasosalla Mn++:a, 32°C:ssa, 17,0:n suuruiseen absorbanssin arvoon 600 nmrssä. Humaani MnS0D:n ekspression induktio saatiin aikaan nostamalla lämpötila 42°C:een 2 tunniksi, jolloin viljelmä saavutti A600:n arvon 43,0. Solut koottiin sentrifugoiden ja ne lietettiin uudelleen 0,2:een alkuperäistä tilavuutta 50-millimolaarisessa kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,8, joka sisälsi 250 millimoolia NaCl. Bakteerit pirstottiin, siten että ne läpäisivät kaksi kertaa Dynomillin, ne sentrifugoitiin ja solupirstaleet heitet-tiin pois. Supernatanttia kuumennettiin yhden tunnin ajan 60°C:ssa, se jäähdytettiin 4°C:een, ja kirkastettu superna-tantti väkevöitiin 0,O3:een alkuperäisestä tilavuudesta ja dialy-soitiin 2-millimolaarista kaliumfosfaattipuskuria vastaan, jonka pH oli 7,8, Pelicon ultrasuodatuslaitteessa, joka oli varustettu membraanilla 10K. Raaka entsyymivalmiste pantiin DE52-pylvääseen, jota pestiin perusteellisesti 2-millimolaari-sella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,8, ja eluoitiin 20-milli-molaarisella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,8. Yhdistetyt jakeet, jotka sisälsivät entsyymin, dialysoitiin 40-millimolaa- 30 90 353 rista kaliumasetaattia, pH 5,5, vastaan, ne pantiin CM52-pylvää-seen ja niitä eluoitiin 40-200-millimolaarisen kaliumasetaatin, pH 5,5, lineaarisella gradientilla. Huippujakeet, jotka sisälsivät: humaani MnSODra, yhdistettiin, niitä dialysoitiin H20:a vastaan, palautettiin 10-millimolaariseen kaliumfosfaattipusku-riin, pH 7,8, sekä jäädytettiin -20°C:ssa.

Saatu yhdistelmä humaan MnSOD oli enemmän kuin 99 %:sesti puhdas, sen spesifinen aktiivisuus oli noin 3500 yksikköä/mg. Puhdistusmenetelmän kokonaissaanto oli noin 30 % (taulukko 3).

Puhdistetun entsyymin sekvensointi ilmaisee 1isämetioniinin läsnäolon N-terminaalisessa aminohapossa verrattuna tunnettuun humaani MnS0D:een (19).

Metallipitoisuuden analyysi, joka suoritettiin atomiabsorption avulla, antoi noin 0,77 Μη-atomia entsyymialayksikköä kohti.

Tämä on sopusoinnussa julkaistujen tietojen kanssa (23).

90353 31 O’

E

•H :ra H -P -P -H

λ: :0

ro x r- r~- O cm O

-h i—i <J\ uo no O

c ui iH ro LO

(D .V M i—i cn ro C >1

•H

cp tn •p 3 tn ρ -rt <L> CO 4-> a -h tn co > :ra S-i Q) en

•H

E

Cp :ra O ao O O ro - - - - - ro ^ O co ro co lo 4-> O cc co ro en

O «H <D

a-> tn e -h ro a 3

(OOcncN en r~ cm P

coco * « ' » · 3

m m oo in 'a* P

p Di ή m -p

en C

•h rt TO 3 s:

P -H

a -p ή

•H

ro C C id • -H <-<

O Q -H

o ra P

ϋ en -P -P

C3CO OO O ro cm 4-1 rP Σ P '' ' ' ~ φ

CO I Cl· Di O O r~ -P

m en o cm cm en

E-f -ie -H Ή *P

•H rt TO

CC -C

ra o P

ra λ; a e o p x e -C o :ra tn e -y

i—t *P O

φ -P 'ro -P 4-4

U] C I -P

•h ra >i ra >i <d

TO -P -P TO C fH

sz ra »H o >ι ή

Oh cd) 3 4-1 -H

p 4J en *j E

el) -H ·ρ ra :ra ·η ·η Op a 11)41 P TO -P-P >1 co :ra -P -p -h -p -P en en o* e «h a rara -p i ra 3 ra ra e rH ra -P i ra 3 3 a) : >p en ra e en ή tp <v -Hencotneua) -p .e E"PU<uenii o -p ouid-hcoocmcm > ra co anoera m m p > Op O 3 0)3-h w ς < Q'*DtnaJ-v--tQtj * 32 90 353

Kirjallisuusviitteet 1. McCord, J.M. ja Fridovich, I., J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969).

2. Fridovich, I. julkaisussa Advances in Inorganic Biochemistry, toimittajat Eichhorn, G.L. ja Marzilli, L.G.

(Elsevier/North Holland, New York), ss. 67-90 (1979).

3. Freeman, B.A. ja Crapo, J.D., Laboratory Investion 47:412-26 (1982).

4. Steinman, H.M. julkaisussa Superoxide Dismutase, toimittaja Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), ss. 11-68 (1982).

5. Hartz, J.W. ja Deutsch, H.F., J. Biol. Chem. 247:7043-50 (1972 ) .

6. Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. ja Deutsch, H.F., Biochemistry 19:2310-16 (1980).

7. Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. ja Bossa, F., FEBS Letters 120:53-56 (1980).

8. Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. ja Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2808-11 (1982).

9. Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. ja Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5465-69 (1983).

10. Oberley, L.W. ja Buettner, G.R., Cancer Research 39:1141-49 (1979).

11. Huber, W ja Menander-Huber, K.B., Clinics in Rheum. Dis. 6:465-98 (1980).

12. McCord, J.M. ja Roy, R.S., Can. J. Physiol. Pharma. 60:1346-52 (1982).

33

SO 35 S

13. Alvarez, J.G. ja Storey, B.T., Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983) .

14. Talmasoff, J.M., Ono, T. ja Cutler, R.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2777-81 (1980).

15. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. ja Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193:265-75 (1951).

16. Weser, U. ja Hartmann, H.J., FEBS Letters 17:78-80 (1971).

17. Jewett, S.LO., Latrenta, G.S. ja Beck, C.M., Arc. Biochem. Biophys. 215:116-128 (1982).

18. Harris, J.I. ja Steinman, H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. ja Fridovich, I. toimittajat, Academic Press, London, ss. 225-230 (1977).

19. Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M.( Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G ja Bossa, F., J. Biol. Chem. 259:12595-601 (lokakuun 25. päivänä 1984).

20. Baret, A., Jadot, G., ja Michelson, A.M., Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (syyskuun 1.päivänä 1984).

21. McCord, J.M. ja Salin, M.L., Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes, Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. (toimittajat) ss. 257-264 (1977).

22. Touati, D., Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983).

23. McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. ja Salin, M.L., Superoxide and Superoxide Dismutase,

Michaelson, A.M., McCord, J.M., ja Fridovich, I. (toimittajat) Academic Press, London ss. 129-138 (1977).

24. Eurooppalainen patenttijulkaisu 0131843 AI, julkaistu tammikuun 23. päivänä, 1985, vastaten eurooppalaista patenttihakemusta 84107717.5, joka on jätetty heinäkuun 3. päivänä 1984, joka esittää prioriteettivaatimuksia US-sarjanumeron 514 188 suhteen, joka on jätetty heinäkuun 15. päivänä 1983.

34 90 3 53 25. Hallewell, et al., Nucleic Acids Res. 5, (1985).

26. Eurooppalainen patenttijulkaisu 0138111 AI, joka on julkaistu huhtikuun 24. päivänä 1985, vastaten eurooppalaista patenttihakemusta 84111416.8, joka on jätetty syyskuun 25. päivänä 1984, joka esittää prioriteettivaatimuksia US sarjanumeron 538 607 suhteen, joka on jätetty lokakuun 3. päivänä 1983, sekä US sarjanumeron 609 412 suhteen, joka on jätetty toukokuun 11. päivänä 1984.

27. EMBO Journal, osa 4, No. 1, ss. 77-84 (tammikuu 1985).

28. Abstracts of the Fourth International Conference on Superoxide and Superoxide Dismutase, Rome, Italy, syyskuun 1.-6. päivinä 1985.

Claims (21)

90353 35

1. Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin ilmentämiseksi sopivassa prokarioottisessa isäntäsolussa, jolla analogilla on luonnollisesti esiintyvän humaani man-gaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta, tunnettu siitä, että analogi koostuu kahdesta tai neljästä ei-kovalenttisesti liittyneestä polypeptidistä kunkin sellaisen polypeptidin käsittäessä 199 aminohappoa, kussakin sellaisen polypeptidin sekvenssissä on metioniini N-päässä välittömästi lysiinin vieressä, jota lysiiniä koodaavat kuvion 1 nukleotidit 115-117, ja jatkuen lysiiniin, jota koodaavat kuvion 1 nukleotidit 706-708 ja joka on polypeptidin COOH-päässä ja että plasmidi käsittää DNA:n, joka koodaa sellaista polypeptidiä, ja sopivat säätelyelementit järjestettynä plasmidin sisään siten, että sallitaan polypeptidin ilmentyminen ja humaani mangaanisuperoksididismutaasianalo-gin muodostuminen isäntäsolussa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pMSE-4, joka on talletettu Escherichia coli -kannassa A4255 ATCC-numeroila 53250.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pMSARB4.

4. Prokarioottinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että siihen on liitetty patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Escherichia coli -kannan A4255 solu, joka sisältää pMSE-4 -plasmidin ja joka on talletettu ATCC-numerolla 53250.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Escherichia coli -solu, joka sisältää pMSÄRB4 -plasmidin.

36 S0353

7. Menetelmä humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan patenttivaatimuksen 4 mukaista isäntäplasmidisysteemiä olosuhteissa, jotka sallivat humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin tuottamisen ja otetaan siten tuotettu analogi talteen.

8. Menetelmä entsymaattisesti aktiivisen rekombinanttisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi kuvion 1 mukaisella DNA-sekvenssillä sisältäen nukleotidit 115-708, jolla on sama aminohapposekvenssi ja sama biologinen aktiivisuus kuin luonnollisesti esiintyvällä humaani mangaani-superoksididismutaasilla tai sen analogilla tai mutantilla, tunnettu siitä, että kasvatetaan bakteerisolujen viljelmää tuottoalustassa, jossa on ei kasvua rajoittava Mn++-määrä siten, että Mn++-konsentraatio alustassa on suurempi kuin 2 ppm, kun bakteerisolut kasvavat, mainittujen bakteerisolujen sisältäessä plasmidin, joka sisältää DNA:n, joka koodaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia, ja solut kykenevät ilmentämään DNA:ta, joka koodaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia ja jossa mainittua viljelmää kasvatetaan sellaisissa sopivissa olosuhteissa, että DNA ilmentyy ja humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia tuotetaan bakteerisoluissa, ja otetaan talteen siten tuotettu entsymaattisesti aktiivinen humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogi tai mutantti.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisolut käsittävät Escherichia coli -solut.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu sitä, että plasmidi sisältää DNA:n, joka koodaa humaani man-gaanisuperoksididismutaasianalogia, joka analogi käsittää kaksi tai neljä ei-kovalenttisesti liittynyttä identtistä polypeptidiä kunkin sellaisen polypeptidin käsittäessä 199 aminohappoa ja kussakin sellaisen polypeptidin sekvenssissä on metioniini N-päässä välittömästi lysiinin vieressä, jota lysiiniä koodaavat kuvion 1 nukleotidit 115-117 ja jatkuen lysiiniin, jota koodaavat kuvion 1 nukleotidit 706-708 ja joka on polypeptidin COOH-päässä. 37 30 353

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmidi on pMSE-4 ja se on talletettu Escherichia coli -kannassa A4255 ATCC-talletusnumerolla 53250.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmidi on pMSARB4.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Mn++-konsentraatio on 50-1500 ppm.

14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Escherichia coli -solut ovat Escherichia coli -kantaa A4255, joka sisältää plasmidin pMSE-4 ja joka on talletettu ATCC-talletusnumerolla 53250.

15. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Escherichia coli -solut ovat Escherichia coli -kantaa A4255, joka sisältää plasmidin pMSARB4.

16. Menetelmä seuraavan reaktion katalysoimiseksi: 202 + 2H+ -* H202 + 02 tunnettu siitä, että saatetaan reagenssit kosketuksiin sopivissa olosuhteissa patenttivaatimuksen 1 mukaisella plasmi-dilla ilmennetyn humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin kanssa.

17. Menetelmä solujen vaurioiden pienentämiseksi in vitro, .. . jotka vauriot ovat aiheuttaneet superoksidiradikaalit, tun nettu siitä, että katalysoidaan superoksidiradikaalien pelkistystä patenttivaatimuksen 16 mukaisesti.

18. Menetelmä poistettujen ja eristettyjen elinten selviy-tymisajan pidentämiseksi, tunnettu siitä, että lisätään te- 38 90353 hokas määrä patenttivaatimuksen 1 mukaisella plasmidilla tuotettua humaani mangaanisuperoksididismutaasia perfuusio-vällaineeseen.

19. Menetelmä rekombinanttisen humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin, jolla on kuvion 1 mukainen DNA-sekvenssi sisältäen nukleotidit 115-708, tai sen analogin tai mutantin tal-teenottamiseksi bakteerisoluista, jotka sisältävät humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutant-tia, tunnettu siitä, että (a) käsitellään bakteerisoluja siten, että saadaan talteen proteiinifraktiot, jotka sisältävät proteiineja, jotka ovat läsnä soluissa mukaanlukien humaani mangaanisuperoksididis-mutaasi tai sen analogi tai mutantti; ja (b) käsitellään proteiinifraktiota siten, että saadaan talteen humaani mangaanisuperoksididismutaasi tai sen analogi tai mutantti.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (a) käsitellään soluja, jotta erotetaan liukoiset proteiinit liukenemattomista proteiineista ja solunseinämän jäännöksistä; (b) otetaan talteen liukoiset proteiinit; (c) käsitellään siten talteenotettuja liukoisia proteiineja, jotta erotetaan liukoisten proteiinien fraktio, joka sisältää humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; (d) otetaan talteen liukoisten proteiinien fraktio, joka sisältää humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; ja (e) käsitellään liukoisten proteiinien fraktiota, joka sisältää hiomaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia, jotta saadaan talteen erillisesti humaani mangaanisuperoksididismutaasi tai sen analogi tai mutantti. 39 90353

21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (a) eristetään bakteerisolut tuottoalustasta; (b) suspendoidaan eristetyt bakteerisolut sopivaan liuokseen, jonka pH on 7,0 - 8,0; (c) hajotetaan suspendoidut bakteerisolut; (d) sentrifugoidaan hajotetut bakteerisolut; (e) kuumennetaan syntynyttä supernatanttia ajan, joka vaih-telee 30 minuutista 120 minuuttiin lämpötilassa, joka vaih-telee 55°C:sta 65°C:een; (f) jäähdytetään kuumennettu supernatantti alle l0°C:een; (g) poistetaan mahdollinen saostuma jäähdytetystä superna-tantista; (h) dialysoidaan jäähtynyt supernatantti sopivaa puskuria vastaan; (i) eluoidaan jäljelle jäänyt aine anioninvaihtokromatogra-fiakolonnilla sopivalla puskuroidulla liuoksella; (j) kerätään ja yhdistetään eluaattifraktiot, jotka sisältävät humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; (k) dialysoidaan yhdistetyt fraktiot 40 mM kaliumasetaattia, pH 5,5, vastaan; (l) eluoidaan dialysoidut yhdistetyt fraktiot kationinvaih-tokromatografiakolonnin läpi lineaarisella 40 - 200 mM kaliumasetaatin gradientilla, pH 5,5; ja (m) kerätään ja yhdistetään eluentin piikkifraktiot, jotka sisältävät humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. 40 9 0 3 53