JPS6377822A

JPS6377822A - 臓器機能改善剤

Info

Publication number: JPS6377822A
Application number: JP61218127A
Authority: JP
Inventors: Norio Otsu; 紀夫大津; Nobuo Akiyama; 秋山　暢夫; Isashi Mita; 三田　勲司; Shinji Tomikawa; 富川　伸二; Osamu Otsubo; 大坪　修; Hiroshi Fujiwara; 寛藤原; Ichiro Nakakoshi; 中越　一郎
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1986-09-18
Filing date: 1986-09-18
Publication date: 1988-04-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は臓器機能改善剤に関する。さらに詳しくは、Ｊ
ＩＩＬｌｉｌｌ胞微生物特にヒト銅、亜鉛型スーツ（−
オキシ−ディスムターゼ構造遺伝子を有する組換えＤＮ
Ａで形質転換された単細胞微生物中で産生されたヒトス
ーパーオキシドディスムターゼと実質的に同一のアミノ
酸配列を有するポリペプチドを活性成分とする臓器機能
改善剤に関する。

スーパーオキシドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド（
・０□−）を消失させる酵素である。

・０２″″士・Ｑ、−＋２Ｈ＋→０２　＋　Ｈ２０２ス
ーパーオキシドは、生体における酸素毒性の中で最も毒
性の高い分子種で、炎症、未熟児酸素網膜症、放射球障
害、ガンなどの疾病を引き起こすと言われている。

また、カタラーゼ（ｃａｔａｌａＳＣ）は、上記反応に
より生成する生体に有害なことの知られているＨ２０□
を下記反応により消失させる酵素である。

Ｈ２Ｏ２″　　Ｈ２Ｏ＋　　’／２０２ところで、近年
、心臓、腎臓、肝臓、膵臓などの臓器移植が行なわれる
ようになっているが、これらの！ｌｌ器の移植において
は移植臓器の血流を一時的に遮断し、血液凝固防止のた
めヘパリンがリンデル液などで潅流する必要がある。

しかして、潅流された移植臓器は生体へ移植される虫で
血液の供給を受けることが出来ないので、酸素不足とな
り、この際に電子伝達系から自由電子が放出され、移植
臓器中に活性酸素がつくられることになるという不都合
が生じる。

また、生体へ移植された臓器は、移植手術終了後血流の
再開により血液供給を受けるので、その際に移ｔａ臓器
は急激に酸素加されて細胞内のＰＯ□（酸素分圧）が上
昇し、活性酸素の産生が高まり組ｍ障害を起こす問題も
ある。臓器移植後に起こる拒絶反応もこの活性酸素に関
係しているとさえ云われている。

現在、臓器保存については保存剤というものはなく、ま
た拒絶反応については免疫抑制剤が使用されているが種
々の副作用が問題とされている。

一方、特開昭５７−１４１，２８８号公報には、ヒト細
胞スーパーオキシドディスムターゼの特異抗体結合担体
な用いて、ヒト細胞からスーパーオキシドディスムター
ゼを該担体に結合させて単離する方法が開示されている
。

特開昭５７−１５５，９９１号公報には、ヒト・胎盤の
水抽出液から４０〜５０％飽和硫安沈殿画分を除去した
後の７０〜８０％飽和硫安上清から、硫安分画、陰イオ
ンクロマトグラフィー、ゲルろ過等によってスーパーオ
キシドディスムターゼを取得する方法が開示されている
。

また、特開昭５９−９１，８８１号公報には、不純な銅
亜鉛スーパーオキシドディスムターゼを含有する溶液を
、非極性ノ１イボーラスポリマー系樹脂と接触させ、次
いで該樹脂を洗浄し、さらに該樹脂に吸着した銅、亜鉛
スーパーオキシドディスムターゼを溶出して精製する方
法が開示されている。

〈発明が解決しようとする問題点〉しかしながら、前記した方法は原料を多量に入手するこ
とが困難であるし、また比較的入手し易い原料であるヒ
ト胎盤ではＳＯＤ含有量が低いなどの欠、αがあり、工
業生産に適したものとは言い難い。

この点を解決するため、本願出願人は、先に、遺伝子組
換え法によるヒ）　ＳＯＤの製造法を提案した。

残された問題は、か（して製造されたヒトＳＯＤが実際
に酵素活性および薬理活性を持つか否かを明らかにする
ことであった。

それ故、本発明の目的は、上記残された問題を明らかに
することにある。

本発明の他の目的は、ヒト・スーパーオキシドディスム
ターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含有する臓器機能改善剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、遺伝子組換え技術によって
製造した上記構造を持つポリペプチドを含有する臓器機
能改善剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、上記ポリペプチドをカタラ
ーゼと共に含有する臓器機能改善剤を提供することにあ
る。

本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。

〈問題点を解決するための手段及び作用〉本発明によれ
ば、本発明の上記目的及び利点はヒトスーパーオキシド
ディスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを活性成分とする臓器８！能改善剤によっ
て、基本的に達成されろ。

上記ポリペプチドは、例えばポジティブレギュレーショ
ンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、
亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有
する組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培
養物中に蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドデ
ィスムターゼ（以下ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤという）を
採取することによって製造される。

上記ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤのｃＤＮＡ合成の鋳型とし
て用いられる輸ＲＮＡは正常なヒト組ｍ＜肝臓、胎盤、
腎臓など）から分離される。組織からのＤＮＡの分離は
、７エ７−ルークロロホルム法、グアニジニウム−熱７
エ／−ル法、グアニジニウム−塩化セシウム法などの公
知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、らｗＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇｓ　　
１８７　１９８　＊１９８２、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が利用でき
る。次いでオリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セフ
ァロースなどを用いてポリ（Ａ）テイルをもつｍＲＮＡ
を分離する。

このようにして得られたｍＲＮＡは、ヒ）Ｃｕ。

Ｚｎ−３ＯＤのｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ混合物で
あるが、これをそのままｃＤＮＡ合成に用いる。まず、
逆転写酵素を泪い１ＩＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラー
ゼを用いて二本＄１ｃＤＮＡを合成した後、適当なベク
ターに組込まれた形でｃＤＮＡを得る。これにはｄＧ−
ｄＣまたはｄＡ−ｄＴホモポリマー結合法（Ｎｅｌｓｏ
ｎｔＴ、　ｓ、　、Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｙ６８ｗ４１ｔ
１９７９ｙＡｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐ　ｒｅｓｓ　　Ｉ　
ｎｃ、　）やＯｋａｙａＩＩｌａ　−Ｂ　ｅｒｇ法（Ｏ
ｋａｙａｍａ、Ｈ，ａｎｄ　　Ｂｅｒｇ、Ｐ、、　　Ｍ
ｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｆ、　、２，１６１．１９８２
）が利用できる。

この場合のようにｍＲＮＡ混合物中の目的ｍＲＮＡ含量
が低い場合は、効率の高いＯｋａｙａｍａ　　Ｂ　ｅｒ
ｇ法が好ましい。この方法に必要なりＮＡおよび宿主菌
はファルマシアＰ、Ｌ、バイオケミカルズ社カタログＮ
ｏ、２７−４７５０−０１として入手できる。

このようにして得られる組換えＤＮＡをたとえばエシェ
リヒア−コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
Ｘ　１７７６株あるいはＤＨＩ株（Ｌｏｗ、Ｂ、　、Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、旦−
〇＋１６０，１９６８：ＭｅｓｅｌｓｏｎｗＭ、　ａｎ
ｄ　　Ｙｕａｎ、Ｒ，、Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｌ　７．１１
１０．１９６８　；Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、　、Ｊ、　Ｍ
ｏｌ、Ｂｉｏｌ。

１６６．５５７．１９８３）に導入して形質転換させる
。形質転換法は公知の方法（重定勝哉、細胞工学、Ｖｏ
ｌ、　　２．Ｎｏ、　３，８１６，１９８３）またはそ
れに準する方法で行うことができる。アンピシリン耐性
などの薬剤耐性によりまず形ｆｆ転換体を選別したのち
、ヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ遺伝子に対応すると考
えられる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合
成しこれをｆｆ２ｐで標識してプローブとして用い、公
知のコロニーハイブリダイゼーシ３７法（Ｈａｎａｈａ
ｎ、　Ｄ　、　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙｙｌ　ＯＯ，３３３，１９Ｂ　３　）に
よりポジティブなシグナルを示した形質転換体を選択す
る。

これらの形質転換体より常法に従ってプラスミドＤＮＡ
を単離し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列をＭａｘａｈａ　−
Ｇ　１ｌｂｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ＊Ａ、　Ｍ、　　ａｎ
ｄ　　　Ｇ　１ｌｂｅｒｔ＊Ｗ、　＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、７４，５６０＋１９
７７）またはジデオキシ法（Ｍ　ｅｓｓｉｎｇ＋　Ｊ　
、　　ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　、９，３
０９．１９８１）によって決定し、ヒトＣｕ、Ｚｎ−８
ＯＤ　ｃＤＮＡの存在を確認する。確認には、ヒト赤血
球より単離されたＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤのアミノ酸配列（
Ｊ　ａｂｕｓｃｈｖＪ、　Ｒ，ｖＢｉｏｃｈｅｎ＋１ｓ
ｔｒｙｅ１９，２３１０．１９８０）またはダウン症候
群患者に由来する樹立細胞株より分離されたｍＲＮＡか
ら得られたｃＤＮＡの塩基配列（Ｓ　ｈｅｒｍａｎ、　
Ｌ　、ら＋　Ｐ　ｒｏＣ，Ｎ　ａ口、Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　＊影０．５４６５．１９８３）を参考にすること
ができる。

次に、得られたヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤのｃＤＮＡを適
当な形質発現調節遺伝子の下流に連結する。

これにはトリプトファンオペロンプロモーター（ｔｒｐ
プロモーター）、ラクトースオペロンプロモーター（Ｉ
ａｃプロモーター）、λファージのＰＬプロモーター、
ｔａｃプロモーターなどの公知のプロモーターが利用で
きる。

しかし、ここで注目すべきことは、生体内には０２−を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦、スー
パーオキサイドと医学、５８．１９８１、共立出版）、
従って、０２　を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量に産生させることが好ましい。

エシェリヒア・コリから分離されたプラスミドＣｏｌ　
　Ｅｌ　　上に存在するコリシンＥ１遺伝子はコリシン
Ｅ１タンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常
の状態においてはリプレッサータンパクがオペレーター
に結合することにより遺伝子の発現は抑制されているが
、ＤＮＡに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線照
射、マイトマイシンＣ処理、ナリノキシン酸処理などに
よりこの抑制が解除されて誘発が起り、コリシンＥ１タ
ンパクが多量につくられる。これはいわゆる負の制御と
呼ばれる調節機構である。これに加えて、コリシンＥ１
遺伝子には正の制御も存在しており（調恒明ら、生化学
、Ｖｏｌ、　　５６．Ｎｏ、８．１０８２．１９８４）
、ユニークな形質発現調Ｓ磯構を持つ遺伝子であって、
誘発時には正の制御の効果も加わってきわめて多量のコ
リシンＥ１タンパク質が産生される。さらにコリシンＥ
１タンパク質はエシェリヒア・コリに対する抗菌性を機
能とするタンパク質であって、通常時の細胞の成育には
必要ないタンパク質とみなし得るものであり、その性質
上、通常時のコリシンＥ１遺伝子の発現が厳密に抑制さ
れていることからも、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調
節遺伝子の利用は本発明にとってきわめて有利である。

Ｃｏｌ　　ＥＩ　　ＤＮＡはたとえば７アル’？ンアＰ
。

Ｌ、バイオケミカルズ社のカタログＮｏ、２７−４９１
４−０１として入手することが可能である。

また、正の制御に関与する領域、プロモーター・オペレ
ーター領域、リポソーム結合領域からなるコリシンＥ１
遺伝子の形質発現調節遺伝子の塩基配列は既に報告され
でいる（Ｅｂｉｎａ、Ｙ、らｒ　Ｇ　ｅｎｅｔＬ影、１
１９．１９８１）。なお、本発明におけるコリシンＥ１
遺伝子の形質発現調節遺伝子とは、第１図の−１４０か
ら７８番目までの塩基配列の存在を必須とするものであ
る。

コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤ　　ｅＤＮＡを連結する際に、いわ
ゆる融合タンパク質を産生するような形での連結は、適
当な制限酵素の切断部位を利用することにより比較的容
易に行うことができる。しかし、コリシンＥ１タンパク
質に白米する部分がある程度以上の長さを持っている場
合、この融合タンパク質を人体に投与した際に免疫原性
（抗原性）を発揮する危険性が充分に考えられる。従っ
て、コリシンＥ１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の
直後にヒトＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤのＮ末端アミノ酸コド
ンが連結される形が好ましい。しかし、これを満足させ
てくれるような適当な制限酵素の切断部位はどちらの遺
伝子にも存在しない。そこで、制限酵素を用いて両方の
ＤＮＡ断片を必要部分が欠失した形で切り出し、欠失し
た部分は合成りＮＡ断片により補間することができる。

合成りＮＡ断片は、たとえば同相トリエステル法（Ｍ　
１ｙｏｓｈｉｔ　Ｋ　、　　ら、Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１
ｄｓＲｅｓ、　＋８　＋５５０７．１９８０）によりオ
リゴヌクレオチドを化学合成し、これらをたとえばＴ４
ＤＮＡす〃−ゼでつなぎ合せることにより得られる。合
成り　ＮＡ断片は、もとの塩基配列を再現するものであ
る必要は必ずしもない。アミノ酸コドンにはｌ＠重が存
在し、かつ生物の種によってコドンの使用頻度が異なる
ことは良（知られている。従って、アミノ酸の配列を変
えない限りにおいては、合成りＮＡ断片の作製時にどの
ようなコドンを選んでも自由であるが、宿主菌中で使用
頻度の高いコドンを選択すると、遺伝子の発現量の増大
が期待できる。

コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域に関して
は、もとの塩基配列を再現する方が好ましいが、結果と
して遺伝子の発現量の増加につながるような塩基配列の
変更は採用できる。

自律複製できるベクターに、コリシンＥ１遺伝子の形質
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成りＮＡ断片、ヒ
トＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤｖＩ造遺伝子断片を正しく組込む
二とにより目的の組換えＤＮＡが得られる。これらのＤ
ＮＡ断片は、たとえばＴ４ＤＮＡす〃−ゼにより連結す
ることができ、最終的に得られる組換えＤＮＡの構造が
目的とするものである限り、ＤＮＡ断片の連結１項序に
制限はない。使用するベクターは宿主微生物内で複製可
能なものであれば特に制限はなく、宿主がエシエリビア
・フリの場合はｐＢＲ３２２が良く用いられている。

得られた組換えＤＮＡをベクターの宿主微生物内に導入
し形質転換させる０本発明では宿主微生物としてエシェ
リヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、
特にフリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子がｆｉ能
する限りにおいては、バチルス・ズブチリス（Ｂ　ａｅ
ｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、サツカロミセス−
セレビシェ（Ｓ　ａｅｃｈａｒｏ＋５ｙｃｅｓ　　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）等の他の微生物も使用でｂる。エシ
ェリヒア・コリの場合はＷ３１１０株、２Ｏ８Ｏ株、Ｃ
（３００３株などの名前があげられる。°特にＷ３１１
０株が好ましい、Ｗ３１１０株はニジエリア・７１７　
Ｋ　１２株の野性株（λ“、Ｆ＋）から誘導されたλ−
２Ｆ−株であり、栄１！要求性などその他の点では野性
株と同一である（Ｂ　ａｅｈｍａｎｎ、　Ｂ　。

Ｊ　、、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅｖｉ
ｅｗｓｖ３６　ｖ５２５　。

１９７２）。

テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのち、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
酵素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う、
さらに誘発時のヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤの産生能によっ
て目的の形質転換体を選択する。

ＳＯＤ活性の測定法としては、千トクロームＣ−キサン
チンーキサンチンオキシグーゼを用いる方法（ＭｃＣｏ
ｒｄ、　Ｊ　、　Ｍ、　ａｎｄ　　Ｆ　ｒｉｄｏｖｉｃ
ｈ、　Ｉ　、　ｔＪ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｕｒ、
　、３土ｊ、６０４９．１９６９）、ニトロブルーテト
ラゾリウム（ＮＢＴ）−リボフラビンを用いる方法（Ｂ
ｅａｕｃｈａｍｐ、Ｃ，ａｎｄ　　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ
、Ｉ、　、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、４４，２
７６．１９７１）等が利用できる。ＮＢＴ−リボフラビ
ン法は簡便であり、電気泳動後のタンパクの活性染色に
も利用できるため便利である。エシェリヒア・コリの場
合について言うと、組換えＤＮＡから産生されるヒ）Ｃ
ｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤに加えて、宿主染色体から産生され
るＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤおよびＦｅ−６゜Ｄが混在してい
る。これらのＳＯＤの酵素としての作用は同一であるが
、Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤは１〜２ｍＭのＣＮ″″イオンに
よって活性が阻害されるのに対し、Ｍｎ−８ＯＤ％Ｆｅ
−８ＯＤは同条件下での阻害を受けないことから区別で
きる。また、これら３梯のＳＯＤは分子量や等電点が互
いに異なるため、電気泳動、イオン交換またはデル濾過
カラムクロマトグラフィーによって分離することができ
る。

このようにして得られた、形質発現調節遺伝子持にはコ
リシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）Ｃ
ｕ、Ｚｎ−８ＯＤ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形
質転換された微生物を、その宿主微生物の増殖に適した
条件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を行わせ
てヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤを大量に産生させる。エシェ
リヒア・コリの場合、たとえばＬ培地、グルコースおよ
びカザミノ酸を含むＭ９培地などの公知の培地により培
養を行う。培養は通常１５〜４３℃の温度で２〜２４時
間行う。必要により通気、攪拌を加えることができる。

対数増殖期にある培１！物にマイトマイシンＣ、ナリジ
キシン酸などの薬剤を添加したり、紫外線を照射するこ
とによすｆ１発合成を行わせることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパク質の精製法に従ってヒ）Ｃｕ、Ｚｎ
−３ＯＤ活性を持つタンパク質を単離することによりヒ
トＣｕ、Ｚｎ−６ＯＤが製造できる。精製は、たとえば
熱処理、塩析、濃縮、透析、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲルｔ濾過クロマトグラフィー、クロマトフオー
カシング、電気泳動、高束液体クロマトグラフィー、ア
フイニテイクロマトグラフイーなどの操作を適宜組合せ
て行うことができる。

かくして製造されたヒトスーパーオキシドディスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、例えば腸管、肝臓、腎臓、心臓等の臓器の機能を改
善する活性を示す。

本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って注射剤、
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソーム製剤などの９１
剤とすることができる。

本発明のポリペプチドは、生体から取出した臓器を生き
たまま保存するためシュあるいは生体に投与して臓器機
能を改善するために使用される。臓器の保存には、例え
ば１〜ＩＯＨの量が好適に用いられ、あるいは１日０．
０１７〜０．１７ｍｇ／ｋｇ・体重の投与量で１回〜数
回に分けて例えば各種腎疾患の治療を目的として、経口
的また非経口的に投与し得る。

以下に実施例および参考例を示す。

参考例１　ヒトＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤのｃＤＮＡを組込
んだプラスミドｐｓ　ＯＤ　２の作製：正常分娩によっ
て得られたヒト胎盤からグアニジウム−塩化セシウム法
によってＲＮＡを分離し、ついでオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースを用いてポリ＜Ａ）テイルをもったｍＲＮＡを分離
した。

得られたｍＲＮＡより、Ｏｋａｙａｍａ　　Ｂ　ｅｒｇ
法に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。宿主菌
として大腸菌ＤＨＩ株を用いた。

コロニーハイプリグイゼーション法にて、ヒトＣｕ、Ｚ
ｎ−８ＯＤのｃＤＮＡが組込まれたプラスミドｐｓ　Ｏ
Ｄ　２を保持した大腸菌ＤＨＩ（ｐｓＯＤ２）株を得た
。この菌株より常法に従ってプラスミドｐＳＯＤ２を単
離した。

参考例２　ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ産生用組換えＤＮＡ
の作ｇ１：コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）
Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤ購造遺伝子を連結して、ヒ）　Ｃｕ
、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤを産生させるためのプラスミドは、
＄３図に示すストラテジーに従って作製した。

（１）　コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子断片
を組込んだプラスミド、ＡＯＫｌの作製：フリシンＥＩ
ＤＮＡをＤｒａＩで切断し、ついで、５ｔｕＩで切断し
た後、５％ポリアクリルアミドデル電気泳動法で３４０
ｂｐの５ｔｕＩ−ＤｒａＩ断片を得た。この断片をプラ
スミドｐＢＲ３２２のＤｒａ■サイトに挿入し、プラス
ミドｐＡＯＫ１を作製した。

（２）　ヒトＣｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤｌｌｌ造遺伝子断
片の作製ニプラスミドｐｓＯＤ２をＡｌｕｌで切断し、ついでＴａ
ｑｒで切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で４４０ｂｐ断片を得た。

（３）合成りＮＡの作製：コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）
Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤ構造遺伝子を連結するために、コリ
シンＥｌ　　３４０ｂｐ断片およびＳＯＤ構造遺伝子の
４４０＆、断片で欠失している部分８４ｂｐを第４図に
示すように１２個のオリゴペプチドに分割して合成した
。

（４）　ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ産生用組換えＤＮＡの
作９ＩニプラスミドｐＡＯＫ１のＤ　ｒａ　Ｉサイトに、８４ｂ
ｐの合成りＮＡと、４４０ｂｐのＳＯＤ構造遺伝子断片
を挿入し、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の
下流に、ヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤ構造遺伝子が連結した
ヒ）Ｃｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ産生産生用比ＤＮＡｐＵＢＥ
２を得た。

参考例３　ヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤを産生ずる組換え大
腸菌５４５ＫＨＲ（ｐＵＢＥ２）株の作９Ｉ：ＳＯＢ培地でＯＤ　５ｓｏ＝　０　、　５５まで培養し
た大腸菌５４５ｆｆＨＲ株をＴｆｂＩ　ついでＴｆｂ■
で処理したのち、処理液にプラスミド、Ｕ　Ｂ　Ｅ　２
を加え、０℃で３０分間、ついで４２℃で９０秒間熱処
理しで、プラスミドｐＵ　Ｂ　Ｅ　２を保持する大腸菌
５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株を得た。

参考例４　ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤと寅質上同−のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの製造：カザミノ酸３００ｇ、グルコース４００ｇ、テトラサイ
クリン１　ｇ−ＮａｚＨＰ　Ｏ＜　６００　ｇ、　Ｋ１
１２ＰＯ４３００１１、ＮａＣｌ３０ｇ１ＮＨ，Ｃ１１
００ｇ％ＣｕＣｌ、争２ＨｚＯＯ，５ｇ％　Ｚｎ５Ｏ＜
・７ｔ（２００，９Ｈを含む培地１００Ｊ２に大腸菌５
４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）を接種し、クレット１１６ま
で３７″Ｃで攪拌（２００Ｏｒｐｍ）培豊後、培養液に
Ｎ　ａ２ＨＰ　Ｏ４６００ｇ、ＫＨｚＰＯ４３００ｇ、
ＮａＣｌ３０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ１００ｇを含む水２２、グ
ルコース４５０ｇを含む水１１とマイトマイシンＣ２Ｃ
２０Ｏを含む水５００ｍ！を加えて誘発合成を３７“Ｃ
ｌ２Ｉ＋！間行わせた。シャープレス型遠心分離磯での
遠心（２０００ｒｐＨ，３時間）により３４４ｇの湿菌
体を得た。

集菌した菌体な３２の１０ｍＭ）リエタノールアミン緩
衝！（ｐＨ７，０）に懸濁しで、ダイノミルで破砕した
。破砕液を遠心（９００Ｏｒｐｍ、６０分間）し、得ら
れた粗抽出液の全量を３．５２とした。粗抽出液にＩ　
Ｍ　Ｃｕ　Ｃ＋　２水溶液０．３５１を加え、−晩攪袢
したのち６０℃で５分間加熱処理した。生じた沈殿を９
０００ｒｐｍ、２０分間の遠心により除去した。上清か
ら硫安沈殿によって７０〜９５％飽和画分を回収し、透
析後イオン交換セルロースＤＥ５２カラムクａマドグラ
フイーにかけて、２０ｍＭ　　ＮａＣｌ濃度（１０ｍＭ
）リエタノールアミン緩衝液）で溶出しＳＯＤ活性画分
を得た。この画分から１００％飽和硫安で分離した硫安
沈殿を遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分）で得、透析後
、凍結乾燥してヒ）Ｃｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤと天貿上同−
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得た（９９０輸
ｇ）。

実施例１（腸管保存試験）モルモットを撲殺し、放血させたのち、回腸を摘出し、
マグヌス試験装置を用いてｉ管収縮能を測定した（コン
トロール値）その後、生理食塩？ｌＩ５０ｍｌを入れたシャーレ（コ
ントロール群）と本物質１０＋ｏｇを生理食塩ｆｉ５０
ｍ２の入ったシャーレ（本物質投与群）にそれぞれ収縮
能測定後の腸管を入れ、室温で２時間保存した。

保存後、再び腸管の収縮能を測定した結果、フントロー
ル群では２時間の保存により、収縮能の低下率は９２．
４％であったのに対し、投与群では２９．７％の低下率
しか示さなかった（第１表参照）。

第１表実施例２（ウサギの腎虚血に対する効果）体重２．３〜
３．６ｋｇのニューシーラント白ウサギ（雄）をコント
ロール群１８例、ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ投与群１３例
用いた。

ウサギをベンドパルビタールＮａの静脈内投与により麻
酔し、正中切開により開腹した。右および左腎臓を周囲
組總から遊離したのち、ヘパリンＮａ１ＯＯＵ／ｋｇを
静脈内投与した０次いで生理食ｔＭｎで１％に溶解した
ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ溶液をＳＬＩ１ｇ／ｋｇ静脈内
投与したのち、左腎臓、静脈、尿管を１ｇＩ！１ｉＬ１
時間放置した。遮断解除（血流再開）２分前に再びヒト
Ｃｕ、Ｚｎ−５ＯＤを５　ｍｇ７　ｋｇ静脈内投与し、
その後、経日的に血液を採取し血清クレアチニン値を測
定した。

その結果、クレアチニンの上昇はコントロール群に比較
し、ヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ投与群では有意に低
いことが認められた（第２表および第５図参照）。

＼、− なお、第２表の値（平均値上標準偏差）および第５図の
縦紬の値は血清中のクレアチニンの濃度（ＩＩ１ｇ／ｄ
ｌ）ｔ’ある。また第５図の黒丸はｈ−Ｓ　ＯＤ投与群
（ｎ＝１３）であり、白丸はコントロール群（ｎ＝１８
）である、このなお書は以下についても同様である。

実施例３ニューシーラント白ウサギ（雄）をコントロール群１８
例、ヒトＣＬｌｌ　Ｚ　ｎ　−Ｓ　ＯＤ　＋　Ｃａｔａ
ｌａｓｅ投与群６例の計２４例を用いた。実験方法は実
施例２と同様で、左腎動静脈、尿管を遮断する直前にヒ
）　　Ｃｕ、Ｚｎ−９ＯＤ　　５　ｍｇ／ｋｇ（２５０
００Ｕ／ｋｇ）およびＣａｔａｌａｓｅ９　ｍｇ／ｋｇ
（２５０００Ｕ　／　ｋｇ）、さらに血流再開直前にヒ
トＣｕ＋Ｚｎ−５ＯＤ５Ｂ／ｋｇ（２５０００Ｕ／ｋｇ
）およびＣａｔａｌａｓｅ（２５０００Ｕ　／　ｋｇ）
　９１６ｇ／　ｋｇを静脈内投与した。

その結果、クレアチニン値の上昇はコントロール群に比
較し、ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤおよびＣａｔａＩａｓｅ
投与群では有意に抑制された（第３表および第６図参照
）。

比較例１ニューシーラント白ウサギ（雄）をコントロール群１８
例、Ｃａｔａｌａｓｅ投与群６例の計投与側６例いた。

実験方法は実施例２と同様で、左腎動静脈、尿管を遮断
する直前にＣａｔａｌａｓｅ　９　ｍｇ／　ｋＦｉ（２
５０００Ｕ／ｋｇ）、さらに血流再開直前にＣｎｔａｌ
ａｓｅ９翔ｑ／ｋｇ（２５０００Ｕ／ｋｇ）を静脈内投
与した。

その結果、クレアチニン値の上昇はコントロール群に比
較し、有意な差は認められなかった（第４表およびｆｊ
Ｓ７図参照）。

実施例４（マウスにおける急性毒性試験）ｄｄＹ系雄系
中マウス重３２±２ｇ）１群８匹を用いて、本物質を生
理食塩液に溶解し、静脈内（ｉ。

ｖ、　）投与した。投与量は３０　ｓｂｇ／　ｋｇ、　
　１００　ｍｇ／ｋｇ、３００　ｒａｇ／　ｋｇの３群
である。投与後２週間中毒症状について観察したが、各
群ともに異常な（生存した。屠殺後の解剖所見において
も、生理食塩液のみを投与したコントロール群と何ら変
わるところがなかった。従って、マウスにおける本物質
の静脈内投与におけるＬＤ、。値は３００　ｍｇｌ　ｋ
ｇ以上である（第５表参照）。

第５表

【図面の簡単な説明】

ｔ５１図はコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領
域の塩基配列を示したものである。ＰＢはＲＮＡポリメ
ラーゼの結合部位、Ｒ９はＲＮＡポリメラーゼの認Ｒ部
位である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示して
いる。破線による下線部はリポソーム結合部位を示し、
Ｍｅｔが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所存
在する実線下Ｍ部は正の制御に関与する領域である。ま
た制限酵素Ｄ　ｒａ　Ｉの切断位置を示した。第２図は胎盤のｍＲＮＡかち得られたヒ）Ｃｕ。Ｚｎ−８ＯＤ　　ｃＤＮＡの構造遺伝子領域の塩基配列
と、塩基配列から決定されるアミノ酸配列を示した。２
カ所の下線部はコロニーハイブリグイゼーションに用い
た２８類の合成りＮＡがハイブリダイズする領域である
。ｔｊＳａ図は組換えＤＮＡ　　ｐＵＢＥ２が作製される
までの経過の概略を図示したものである。第４図は合成りＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合して得られる合成りＮＡ断片は、
５′端はＤｒａＩ断端、３′端はＴａｑｌ切断端となっ
ている０本印は第２図の塩基配列を変更した個所で２カ
所存在している。但しアミノ酸配列は変わっていない。第５図は本発明のポリペプチドの臓器機能改善活性を示
す図である。ｆｌＲｅ図は、本発明のポリペプチドとカタラーゼの組
合せの臓器機能改善活性を示す図である。第７図は、カタラーゼのみの臓器機能改善活性を示す図
である。第３図第７図＃漣日教　（１１１）

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質的に同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを活性成分とす
る臓器機能改善剤。２、上記ポリペプチドが単細胞微生物中で産生されたも
のである特許請求の範囲第１項に記載の臓器機能改善剤
。３、上記単細胞微生物がポジティブレギュレーションサ
イトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛
型スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する
組換えＤＮＡで形質転換されたものである特許請求の範
囲第２項に記載の臓器機能改善剤。４、対象とする臓器が腸管、腎臓又は心臓である特許請
求の範囲第１項に記載の臓器機能改善剤。５、ヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質的に同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびカタラー
ゼを活性成分とする臓器機能改善剤。