DE3639725C2

DE3639725C2 - Human-Mangansuperoxiddismutase-cDNA, ihre Expression in Bakterien und Verfahren zur Reindarstellung enzymatischer aktiver Human-Mangansuperoxiddismutase sowie Arzneimittel

Info

Publication number: DE3639725C2
Application number: DE3639725A
Authority: DE
Inventors: Jacob R Hartman; Yaffa Beck
Original assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1985-11-22
Filing date: 1986-11-21
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2006-11-22
Also published as: IL106449A0; DK534686A; IE59498B1; AU6497586A; FI90353B; ATA308986A; GB8627294D0; CH676990A5; FR2590591A1; BE905796A; JPH08289792A; GB2183658B; LU86676A1; JPS62289187A; IE862851L; JP2609449B2; GB2183658A; AU607897B2; ES2003518A6; SE8604884L

Description

In der folgenden Beschreibung wird auf die verschieden sten Publikationen mit arabischen Zahlen in Klammern Be zug genommen. Die vollständigen Zitate der betreffenden Publikationen finden sich am Ende der Beschreibung.

Superoxiddismutase (SOD) und das Phänomen freier Sauer stoffradikale (O₂∸) wurden 1968 von McCord und Fridovich (1) beschrieben. Superoxidradikale und andere hochaktive Sauerstoffarten entstehen in jeder atmenden Zelle als Nebenprodukte eines oxidativen Angriffs auf die ver schiedensten Makromoleküle und Zellkomponenten (vgl. 2, 3). Eine Gruppe von Metalloproteinen, die als Super oxiddismutasen bekannt sind, katalysiert die Redox reaktion 20₂∸ + ₂H⁺ → H₂O₂ + O₂ und liefert folglich einen Abwehrmechanismus gegen eine Sauerstofftoxizität.

Es gibt eine Reihe bekannter Formen von SOD mit unter schiedlichen Metallen und unterschiedlichen Proteinen. In SOD enthaltene Metalle sind beispielsweise Eisen, Mangan, Kupfer und Zink. Sämtliche bekannten Formen von SOD katalysieren dieselbe Reaktion. Diese Enzyme werden in verschiedenen evolutionären Gruppen aufgefunden. Eisen haltige Superoxiddismutasen finden sich vornehmlich in prokaryotischen Zellen. Kupfer- und zinkhaltige Super oxiddismutasen finden sich in praktisch sämtlichen eukaryotischen Organismen (4). Manganhaltige Superoxid dismutasen wurden in Mikroorganismen bis Menschen auf gefunden.

Da jedes biologische Makromolekül ein Ziel für die schädigende Wirkung überschüssiger Superoxidradikale sein kann, wurde das therapeutische Potential von SOD untersucht. Die wissenschaftliche Literatur glaubt, daß SOD auf den verschiedensten klinischen Anwendungsgebie ten zum Einsatz gebracht werden könnte. Hierzu gehört die Verhinderung einer Oncogenese und eines Tumorwachs tums, die Verminderung der zytotoxischen und kardiotoxi schen Wirkungen von Antikrebsmitteln (10), der Schutz ischemischer Gewebe (12) und der Schutz von Spermatozoen (13). Darüber hinaus wurde auch bereits der Einfluß von SOD auf den Alterungsprozeß untersucht (14).

Die Untersuchung des therapeutischen Potentials von Human-SOD stößt hauptsächlich aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Human-SOD an Grenzen.

Superoxiddismutase ist auch wegen ihrer entzündungs hemmenden oder -widrigen Eigenschaften von Interesse (11). Rinder-Superoxiddismutase (Orgotein) hat sich als ent zündungshemmend oder -widrig erwiesen und wird derzeit als Human-Arzneimittel benutzt. In der Veterinärmedizin dient es hauptsächlich zur Behandlung von Sehnenent zündungen bei Pferden. Orgotein steht jedoch nur begrenzt zur Verfügung. Den bekannten Maßnahmen zur Darstellung von Orgotein aus Rinderzellen oder den Zellen sonstiger Tiere sind Grenzen gesetzt, darüber hinaus kann das da bei erhaltene Orgotein wegen seines nicht-menschlichen Ursprungs allergische Reaktionen hervorrufen.

Kupferzinksuperoxiddismutase (CuZn-SOD) ist von den ver schiedenen Superoxiddismutase die am weitesten unter suchte und am besten charakterisierte Form.

Human-CuZn-SOD ist ein dimeres Metallprotein aus identi schen nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten jeweils eines Molekulargewichts von 16 000 Dalton mit einem Atom Kupfer und einem Atom Zink (5). Jede Untereinheit besteht aus 153 Aminosäuren, deren Sequenz geklärt ist (6, 7).

Die cDNA mit Codierung für Human-CuZn-Superoxiddismutase wurde geklont (8). Die vollständige Sequenz der geklonten DNA ist geklärt (9). Darüber hinaus wurden auch Expres sionsvektoren mit DNA mit Codierung für Superoxiddis mutase für die Gewinnung und Reindarstellung von Super oxiddismutase in Bakterien beschrieben (24, 25). Die Expression einer Superoxiddismutase-DNA und die Produk tion von SOD in Hefe wurde ebenfalls beschrieben (26).

Kürzlich wurde die CuZn-SOD-Genstelle auf dem Human chromosom 21 charakterisiert (27). Eine Zusammenfas sung jüngster Entwicklungen betreffend CuZn-Superoxid dismutase findet sich in (28).

Weit weniger ist über die Mangansuperoxiddismutase (MnSOD) bekannt. Die MnSOD von E. coli K-12 wurde jüngst geklont und kartiert (22). Barra und Mitarbeiter be schreiben eine 196 Aminosäuresequenz für das aus Human-Leberzellen isolierte MnSOD-Polypeptid (19). Einschlägige Publikationen sind jedoch über die Struktur des MnSOD-Moleküls uneins, insbesondere dahingehend, ob es zwei oder vier identische Polypeptiduntereinheiten enthält (19, 23). Es ist jedoch klar, daß das MnSOD-Polypeptid und das CuZn-SOD-Polypeptid nicht homolog sind (19). Es wurden auch die Aminosäuresequenzhomologien verschie dener MnSOD und von FeSOD aus verschiedenen Quellen ver glichen (18).

Baret und Mitarbeiter erläutern an einem Rattenmodell, daß die Halbwertszeit von Human-MnSOD wesentlich länger ist als die Halbwertszeit von Human-Kupfer-SOD. Ferner zeigen sie anhand des Rattenmodells auch, daß Human-MnSOD und Ratten-Kupfer-SOD als entzündungshemmende oder -widri ge Mittel im Gegensatz zu Rinder-Kupfer-SOD und Human- Kupfer-SOD unwirksam sind (20).

McCord und Mitarbeiter weisen darauf hin, daß natürlich vorkommende Human-Mangansuperoxiddismutase menschliche als Phagozyten wirkende polymorphonukleare (PMN) Leuko zyten im Rahmen von "in vitro"-Tests besser gegen freie Superoxidradikale schützt als Rinder- oder Schweine-CuZn-Superoxiddismutase (21).

Die Erfindung betrifft nun die Herstellung eines DNA-Mole küls mit Codierung für das Human-Mangansuperoxiddismutasepo lypeptid gemäß der Definition in Anspruch 1. Ferner betrifft die Erfindung die Einfügung dieser DNA in effiziente bakte rielle Expressionsvektoren zur Herstellung von Human-MnSOD-Po lypeptid in Bakterien und zur Reindarstellung des bakteri ell produzierten Human-MnSOD-Polypeptids. Schließlich be trifft die Erfindung auch noch die derart reindargestellten Human-MnSOD-Polypeptide und deren Verwendung.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstel lung von enzymatisch aktivem Human-MnSOD in Bakterien sowie ein Verfahren zur Gewinnung solcher enzymatisch aktiver Human-MnSOD gemäß Anspruch 11 bzw. 13.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine bakteriell produzierte MnSOD als veterinärmedizinisches Mittel, insbesondere zur Behebung von Reperfusionsverletzun gen nach einer Ischämie und zur Verlängerung der Überlebens dauer exzidierter isolierter Organe. Letztendlich betrifft dies die Verwendung von bakteriell produzierter MnSOD zur Behandlung von Entzündungen.

Ein DNA-Molekül, das eine cDNA mit Codierung für das Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon enthält, wurde aus einer Human-T-Zellenbibliothek isoliert. Auch die Nukleotidsequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls mit Codierung für Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon wurde aufgeklärt. Die Sequenz des einen Strangs mit Codierung für das Polypeptid oder dessen Analoges ist in Fig. 1 vom Nukleotid 115 stromab wärts bis einschließlich zum Nukleotid 708 dargestellt. Andere Sequenzen mit Codierung für das Analoge oder die Mutante können dem Strang mit Codierung für das Poly peptid praktisch ähnlich sein. Die Nukleotidsequenz des einen Strangs eines doppelsträngigen DNA-Moleküls mit Codierung für ein 24-Aminosäurepräpeptid ist ebenfalls in Fig. 1 vom Nukleotid Nr. 43 bis einschließlich zum Nukleotid Nr. 114 abgebildet.

Das doppelsträngige DNA-Molekül oder irgendein sonstiges doppelsträngiges DNA-Molekül mit einem Nukleotidstrang mit der Sequenz mit Codierung für das Human-Mangansuper oxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon kann in ein Klonierungsvehikel, z. B. ein Plasmid oder einen Virus, eingebaut werden. Jedes DNA-Molekül kann in üblicher bekannter Weise in eine Zelle, und zwar eine prokaryotische, beispielsweise bakterielle, oder eukaryotische, beispielsweise Hefe- oder Säugetierzelle, eingebaut werden. Zu diesen be kannten Verfahren gehören auch mit Klonierungsvehikeln mit jedem Molekül arbeitende Verfahren.

Vorzugsweise wird die DNA mit Codierung für das Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon in ein Plasmid, bei spielsweise pMSE-4 oder pMSΔRB4 eingebaut und dann in eine geeignete Wirtzelle, in der die DNA ausgedruckt und das Human-Mangansuperoxiddismutase (hMnSOD)-Polypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon produziert werden können, eingeführt. Bevorzugte Wirtzellen sind Escherichia coli, insbesondere E. coli A4255.

Das Plasmid pMSE-4 in dem E. coli-Stamm A4255 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53250 hinterlegt. Das Plasmid pMSΔRB4 erhält man, wie in Fig. 4 dargestellt und später noch beschrieben.

Zellen, in die solche DNA-Moleküle eingeschleust wurden, können unter geeigneten Bedingungen, die eine Trans kription der DNA zu mRNA und eine Expression des mRNA als Protein gestatten, in üblicher bekannter Weise kultiviert oder wachsengelassen werden. Danach kann das gebildete Mangansuperoxiddismutaseprotein gewonnen bzw. reindargestellt werden.

Es können auch veterinärmedizinische Mittel mit Human-MnSOD oder Analogen oder Mutanten hiervon und geeigneten Trägern zubereitet werden.

Die Erfindung ist mit einem Verfahren zur Herstellung enzymatisch aktiver Human-Mangansuperoxiddismutase oder von deren Analogen oder Mutanten in einer Bakterienzelle befaßt. Die Bakterienzelle enthält eine DNA-Sequenz mit Codierung für die Mangansuperoxiddismutase oder ein Analoges oder eine Mutante derselben und ist zur Ex pression derselben fähig. Das Verfahren besteht darin, die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen und in einem geeigneten Produktionsmedium aufzubewahren. Das Produktionsmedium wird mit einer solchen Menge Mn⁺⁺ er gänzt, daß die für die Zelle in dem Medium verfügbare Mn⁺⁺-Konzentration größer als etwa 2 ppm ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die Bakterienzelle aus einer Escherichia coli-Zelle mit einem Plasmid mit einer DNA-Sequenz mit Codie rung für das Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid, z. B. pMSE-4 oder pMSΔRB4 in dem E. Coli-Stamm A4255. Die Konzentration von Mn⁺⁺ in dem Produktionsmedium reicht von etwa 50 bis etwa 1500 ppm, vorzugsweise von 150-750 ppm.

Gegenstand der Erfindung sind auch gereinigte enzymatisch aktive Human-Mangansuperoxiddismutase oder Analoge der selben, beispielsweise met-hMnSOD, oder Mutanten der selben, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren her gestellt wurden.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigen:

Fig. 1 die Sequenz von Human-MnSOD DNA.

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz eines Strangs eines doppelsträngigen DNA-Moleküls mit Codierung für die Human-Mangansuperoxiddismutase sowie die 198 Aminosäure sequenz von Human-MnSOD entsprechend der DNA-Sequenz. Ferner zeigt Fig. 1 die Nukleotidsequenz eines Strangs eines doppelsträngigen DNA-Moleküls mit Codierung für ein Präpeptid für die fertige Human-MnSOD, bestehend aus 24 Aminosäuren, sowie die Aminosäuresequenz ent sprechend dieser DNA-Sequenz. Dargestellt sind auch die 5′- und 3′-untranslatierten Sequenzen.

Fig. 2 Aufbau von pMSE-4: Human-MnSOD-Expressionsplasmid.

Das Plasmid pMS8-4 mit MnSOD an einer EcoRI (R₁)-Ein fügung wird mit NdeI- und NarI-Restriktionsenzymen vollständig verdaut. Das große Fragment wird isoliert und entsprechend Fig. 2 mit einem synthetischen Oligo meren verbunden. Das gebildete Plasmid, pMS8-NN, enthält den Codierbereich für die "reife" bzw. fertige MnSOD mit vorhergehendem ATG-Initiationscodon. Obiges Plasmid wird mit EcoRI verdaut, die Enden werden mit Klenow-Fragment von Polymerase I gefüllt und weiter mit NdeI gespalten. Das kleine Fragment, welches das MnSOD-Gen beherbergt, wird in mit NdeI und StuI behandeltes pSOD-13 eingefügt. pSODα-13 erhält man gemäß der US-Patentanmeldung 644 245. Hierdurch entstand das Plasmid pMSE-4 mit dem MnSOD-Codierbereich mit der davor liegenden cII ribosomalen Bindestelle und unter der Kontrolle des λ P_L-Promotors. Das Plasmid pMSE-4 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53250 hinterlegt.

Fig. 3 Einfluß der Mn⁺⁺ -Konzentration auf die Aktivität von in E. coli produzierter SOD.

Die Darstellung von Fig. 3 zeigt die Beziehung zwischen der spezifischen Aktivität in Einheiten/mg rekombinanter löslicher MnSOD, die sowohl unter nicht-induzierenden Be dingungen (32°C) als auch unter induzierenden Bedingungen (42°C) durch den E. coli-Stamm A4255 mit dem Plasmid pMSE-4 produziert wurde, und der Konzentration an Mn⁺⁺ (ppm) im Wachstumsmedium.

Fig. 4 Aufbau von Δ pMS-RB4:
Human-MnSOD-Expressionsplasmid.

Tet^R-Expressionsvektor, pΔRB, wurde aus pSODβ₁T-11 durch vollständige Verdauung mit EcoRI und anschließende Teil spaltung mit BamHI-Restriktionsenzymen hergestellt. pSODβ₁T-11 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53468 hinterlegt. Das verdaute Plasmid wurde mit dem synthetischen Oligomeren

verbunden, wobei man pΔRB mit dem λP_L-Promotor erhält.

Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmid pMSE-4 mit der cII ribosomalen Bindestelle und der kompletten Codiersequenz für das reife bzw. fertige Enzym wurde in die einzige EcoRI-Stelle von pΔRB eingefügt. Das erhaltene Plasmid pMSΔRB4 enthält das MnSOD-Gen unter Kontrolle von λ P_L und cII RBS und ist tetracyclinbe ständig geworden.

Ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit Codierung für Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon wurde aus einer Human-T-Zellen-DNA-Bibliothek isoliert. Die Nukleotid sequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls mit Codie rung für Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon wurde aufge klärt. Die Sequenz eines Strangs eines DNA-Moleküls mit Codierung für das Human-Mangansuperoxiddismutase polypeptid oder ein Analoges desselben ist in Fig. 1 dargestellt und umfaßt die Nukleotidzahlen 115 bis einschließlich 708. Die Sequenz des einen Strangs mit Codierung für ein hMnSOD-Analoges oder eine Mutante ähnelt im wesentlichen der Sequenz des Strangs mit Codierung für das hMnSOD-Polypeptid. Die Nukleotid sequenz des Präpeptids von Human-Mangansuperoxid dismutase ist ebenfalls in Fig. 1 dargestellt. Die Nukleotide Nr. 43 bis einschließlich 114 codieren dieses Präpeptid.

Die Verfahren zur Herstellung der cDNA und zur Auf klärung der Sequenz der DNA mit Codierung für das Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder dessen Analoges oder Mutante sind dem Fachmann bekannt und werden später noch näher erläutert werden. Da nunmehr die DNA-Sequenz mit Codierung für die Human-Mangansuperoxiddismutase aufgeklärt ist, kann man sich bekannter Synthesever fahren zur Herstellung von DNA-Molekülen mit Teilen dieser Sequenz bedienen.

Übliche Klonierungsvehikel, wie Plasmide, beispiels weise pBR322, Viren oder Bakteriophagen, beispiels weise λ-Phagen, können in üblicher bekannter Weise modifiziert oder manipuliert werden, um neue Klonie rungsvehikel mit cDNA mit Codierung für Human-Mangan superoxiddismutasepolypeptid oder Analoge oder Mutanten hiervon herzustellen. In ähnlicher Weise können solche Klonierungsvehikel modifiziert oder manipuliert werden, damit sie DNA-Moleküle beinhalten, von denen ein Strang ein Segment der in Fig. 1 dargestellten Sequenz für Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder dazu im wesentlichen ähnliche Segmente enthält. Das eingebaute DNA-Molekül läßt sich auf verschiedenen Wegen ein schließlich einer enzymatischen oder chemischen Synthese herstellen.

Die erhaltenen Klonierungsvehikel stellen chemische Bausteine dar, die in der Natur nicht vorkommen und lediglich durch rekombinante DNA-Technologie herstell bar sind. Vorzugsweise besteht das Klonierungsvehikel aus einem Plasmid, beispielsweise pMSE-4 oder pMSΔRB4. Diese Klonierungsvehikel können in Zellen, entweder prokaryotische, z. B. bakterielle (Escherichia coli, B. subtilis und dergl.) oder eukaryotische, beispiels weise Hefe- oder Säugetierzellen, in dem Fachmann be kannter Weise, z. B. durch Transformation, Transfektion und dergleichen, eingeschleust werden. Die Zellen, in die die Klonierungsvehikel eingeschleust wurden, enthal ten damit eine cDNA mit Codierung für Human-Mangansuper oxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon, wenn die cDNA in dem Klonierungsvehikel enthalten war, oder eine DNA mit einem Strang, der voll ständig oder ein Teil desselben die in Fig. 1 darge stellte Sequenz für Human-MnSOD-Polypeptid oder eine dazu im wesentlichen ähnliche Sequenz aufweist, wenn eine solche DNA in dem Klonierungsvehikel vorhanden war.

Escherichia coli-Zellen sind die bevorzugten Wirtzellen für die erfindungsgemäßen Klonierungsvehikel.

Prototrophe Stämme von Escherichia coli, die eine hochgradige Polypeptidexpression selbst bei Züchtung in einem Minimalmedium ermöglichen, werden als Wirte für die Expression von Genen mit Codierung für Mangan superoxiddismutase bevorzugt. Ein derzeit bevorzugter prototropher Stamm ist A4255. Der Stamm A4255 - enthaltend das Plasmid pMSE-4 - ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hin terlegungsnummer 53250 hinterlegt.

Die erhaltenen Zellen, in die eine DNA mit Codierung für Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon eingeschleust wurde, läßt sich in üblicher bekannter Weise behandeln, beispielsweise unter dem Fachmann bekannten geeigneten Bedingungen züchten oder kultivieren, so daß die DNA die Expression der durch die DNA codierten genetischen Information, beispielsweise die Expression des hMnSOD-Polypeptids oder des Analogen oder der Mutante hiervon, dirigiert und die Zelle das hMnSOD-Polypeptid oder ein Analoges oder eine Mutante hiervon ausdruckt. Das Expressionsprodukt kann dann reindargestellt werden.

Der Ausdruck "Superoxiddismutase" (SOD) steht für ein Enzym oder ein Polypeptid, das als Rezeptor für Super oxid- oder sauerstofffreie Radikale wirkt oder die folgende Dismutationsreaktion:

katalysiert.

Der Ausdruck "Mangansuperoxiddismutase" (MnSOD) steht für ein beliebiges Superoxiddismutasemolekül mit dem Element Mangan in einer beliebigen seiner chemischen Formen.

Der Ausdruck "Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid" steht für ein Polypeptid aus 198 Aminosäuren, wobei ein Teil von dessen Aminosäuresequenz in Fig. 1 dargestellt ist. Der N-Terminus der Sequenz ist das durch die Nukleo tide 115-117 von Fig. 1 codierte Lysin. Der COOH-Terminus der Sequenz ist das durch die Nukleotide 706-708 von Fig. 1 codierte Lysin.

Der Ausdruck "Polypeptid-Mangankomplex" bezeichnet ein Molekül, das ein Human-Mangansuperoxiddismutasepoly peptid in einem Komplex mit Mangan in einer beliebigen seiner chemischen Formen enthält und die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommender Human-Mangan superoxiddismutase aufweist.

Der Ausdruck "Human-Mangansuperoxiddismutase" bezeich net ein Molekül mit mindestens zwei Human-Mangansuper oxiddismutasepolypeptiden in einem Komplex mit Mangan in einer beliebigen seiner chemischen Formen, das die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommender Human-Mangansuperoxiddismutase aufweist.

Der Ausdruck "Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid-Analoges" bezeichnet ein Polypeptid mit einem Human-Mangan superoxiddismutasepolypeptid, an dessen eines oder beide Enden eine oder mehrere zusätzliche Amino säure(n) angehängt ist (sind).

Der Ausdruck "Polypeptid-Mangankomplex-Analoges" be zeichnet ein Molekül mit einem Polypeptid-Mangankomplex bei welchem der Polypeptidteil eine oder mehrere zu sätzliche Aminosäure(n) an eines oder beide seiner Enden angehängt aufweist.

Der Ausdruck "Human-Mangansuperoxiddismutase-Analoges" bezeichnet ein Molekül mit mindestens zwei Polypeptiden, von denen mindestens eines ein Human-Mangansuperoxid dismutasepolypeptid-Analoges ist, in einem Komplex mit Mangan in einer beliebigen seiner chemischen Formen, das die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommen der Human-Mangansuperoxiddismutase aufweist.

Der Ausdruck "Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid-Mutante" bezeichnet ein Polypeptid mit einer Aminosäure sequenz, die mit der Aminosäuresequenz des Human-Mangan superoxiddismutasepolypeptids praktisch identisch ist, sich davon jedoch durch eine oder mehrere Aminosäure(n) unterscheidet.

Der Ausdruck "Polypeptid-Mangankomplex-Mutante" steht für ein Molekül, das eine Human-Mangansuperoxiddismutase polypeptid-Mutante in einem Komplex mit Mangan in einer beliebigen seiner chemischen Formen enthält und die enzymatische Aktivität von Mangansuperoxiddismutase aufweist.

Der Ausdruck "Human-Mangansuperoxiddismutase-Mutante" bezeichnet ein Molekül mit mindestens zwei Polypeptiden, von denen mindestens eines eine Human-Mangansuperoxid dismutasepolypeptid-Mutante in einem Komplex mit Mangan in einer beliebigen seiner chemischen Formen ist, und das die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommen der Human-Mangansuperoxiddismutase aufweist.

Die Mutanten von hMnSOD-Polypeptid und hMnSOD, die einen Teil der Erfindung bilden, erhält man durch Mutation der in Fig. 1 dargestellten DNA-Sequenz, deren N-Terminus das durch die Nukleotide 115-117 codierte Lysin ist und deren COOH-Terminus durch die Nukleotide 706-708 codiert ist.

Die DNA kann in üblicher bekannter Weise mutiert werden, vgl. Bauer und Mitarbeiter in "Gene" 37: 73-81 (1985). Die mutierte Sequenz kann - wie noch beschrieben wird - in geeignete Expressionsvektoren eingebaut werden. Nach der Einschleusung in Zellen werden diese dann derart behandelt, daß die mutierte DNA die Expression der hMnSOD-Polypeptid-Mutanten und der hMnSOD-Mutanten dirigiert.

Die enzymatisch aktive Form der Human-Mangansuperoxid dismutase besteht vermutlich aus einem Protein mit mindestens zwei und möglicherweise vier identischen Untereinheiten, von denen jede etwa 198 Aminosäuren in der in Fig. 1 dargestellten Sequenz für Human-Mangan superoxiddismutase aufweist. Der N-Terminus dieser Sequenz ist das durch die Nukleotide 115-117 von Fig. 1 codierte Lysin, der COOH-Terminus dieser Sequenz ist das durch die Nukleotide 706-708 von Fig. 1 codierte Lysin.

Human-MnSOD oder Analoge oder Mutanten hiervon sind aus Zellen, in die DNA oder cDNA mit Codierung für Human-Mangansuperoxiddismutase oder deren Analoge oder Mutanten eingeschleust wurden, erhältlich. Diese Human-MnSOD oder deren Analoge oder Mutanten eignen sich zur Katalyse der Dismutation oder einwertigen Reduktion des Superoxidanions in Gegenwart von Protonen unter Bildung von Wasserstoffperoxid gemäß der folgenden Gleichung:

Es lassen sich veterinärmedizinische Mittel mit wirksamen Mengen an hMnSOD oder einem (einer) oder mehreren hMnSOD-Analogen oder Mutante(n) und einem geeigneten Träger zubereiten. Geeignete Träger sind dem Fachmann bekannt. Die hMnSOD oder deren Analoges oder deren Mutante kann dem Tier oder dem Patienten direkt oder in Form eines Arzneimittels beispielsweise zur Bekämpfung von Entzündungen oder zur Behebung von Ver letzungen durch sauerstofffreie Radikale bei der Reperfusion nach einer Ischämie oder Organtransplanta tion verabreicht werden. Die hMnSOD oder deren Analo ges oder deren Mutante kann auch direkt oder in Form einer Zubereitung dem Perfusionsmedium eines isolierten Organs zur Verminderung von Verletzungen des betreffen den isolierten Organs durch sauerstofffreie Radikale bei der Perfusion nach der Exzision zugesetzt werden, um auf diese Weise die Überlebensdauer des Organs zu verlängern. Zusätzlich können die hMnSOD oder deren Analoges oder deren Mutante zur Verminderung neurologi scher Verletzungen bei der Reperfusion nach einer Ischämie und zur Behandlung von bronchialer Lungen dysplasie herangezogen werden.

Es wurde auch ein Verfahren zur Herstellung von enzyma tisch aktiver Human-Mangansuperoxiddismutase oder eines Analogen oder einer Mutante hiervon in einer Bakterien zelle entwickelt. Die Bakterienzelle enthält eine DNA-Sequenz mit Codierung für die Human-Mangansuperoxid dismutase oder ein Analoges oder eine Mutante derselben und ist zur Expression dieser DNA-Sequenz fähig. Das Verfahren besteht darin, die Bakterienzelle unter ge eigneten Bedingungen in einem geeigneten Produktions medium zu halten. Das Produktionsmedium ist mit einer solchen Menge an Mn⁺⁺ ergänzt, daß die Mn⁺⁺-Konzentra tion im Medium größer als etwa 2 ppm ist.

Bei der Bakterienzelle kann es sich um ein beliebiges Bakterium handeln, in das eine DNA-Sequenz mit Codierung für Human-Mangansuperoxiddismutase durch rekombinante DNA-Techniken eingebaut werden kann. Das Bakterium muß die Fähigkeit zur Expression der DNA-Sequenz und zur Herstellung des Proteinprodukts besitzen. Die geeigneten Bedingungen und das Produktionsmedium variieren ent sprechend der Bakteriumspezies und dem Bakterienstamm.

Die Bakterienzelle kann die DNA-Sequenz mit Codierung für die Superoxiddismutase oder ein Analoges im Körper eines Vektor-DNA-Moleküls, z. B. eines Plasmids, enthal ten. Der Vektor oder das Plasmid wird durch rekombinante DNA-Techniken derart konstruiert, daß er die Sequenz mit Codierung für die SOD an einer geeigneten Stelle im Molekül eingebaut enthält.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die Bakterienzelle aus einer Escherichia coli-Zelle.

Ein bevorzugter prototropher Stamm von E. coli ist A4255. Die E. coli-Zelle gemäß der Erfindung enthält ein Plasmid mit Codierung für Human-Mangan superoxiddismutase oder ein Analoges oder eine Mutante derselben.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMSE-4. Ein Verfahren zur Konstruktion dieses Plasmids ist bei der Figurenbeschreibung erläutert. Das Plasmid selbst wird in Beispiel 2 beschrieben. Dieses Plasmid ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hinter legungsnummer 53250 hinterlegt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMSΔRB4. Ein Verfahren zur Konstruktion dieses Plasmids ist in der Figurenbeschreibung erläutert. Das Plasmid selbst wird in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Plasmid erhält man aus pSODβ₁T-11, das bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53468 hinterlegt ist.

Gemäß vorteilhaften Ausführungsformen des erfindungs gemäßen Verfahrens erhält man ein enzymatisch aktives Human-Mangansuperoxiddismutase-Analoges mit Hilfe einer das Plasmid pMSE-4 enthaltenden Zelle des E. coli-Stamms A4255 oder mit Hilfe einer das Plasmid pMSΔRB4 enthaltenden Zelle des E. coli-Stamms A4255.

Ein geeignetes Produktionsmedium für die Bakterienzelle kann aus einem beliebigen Wachstumsmedium, z. B. Caseinhydrolysat oder LB (Luria Broth)-Medium bestehen. Letzteres wird bevorzugt. Geeignete Wachstumsbedingungen variieren mit dem E. coli-Stamm und dem darin enthaltenen Plasmid. E. coli A4255 mit dem Plasmid pMSE-4 wird bei 42°C induziert und etwa 1 bis etwa 5 h lang bei dieser Temperatur gehalten. Die geeigneten Bedingungen für Temperatur, Dauer, Bewegen und Belüften für das Wachsen lassen des Inokulats und für das Wachsenlassen der Kultur bis zu einer gewünschten Dichte vor der Produktions phase sowie für die Aufbewahrung der Kultur in der Produktionsperiode können sehr verschieden sein und sind dem Fachmann bekannt.

Die Konzentration an Mn⁺⁺-Ionen in dem Medium, die zur Produktion von enzymatisch aktiver MnSOD erforderlich ist, variiert mit der Art des verwendeten Mediums.

In LB-Wachstumsmedien haben sich Mn⁺⁺-Konzentrationen von 150-750 ppm als wirksam erwiesen. In sämtlichen komplexen Arten von Wachstumsmedien sollte die Mn⁺⁺-Konzentration im jeweiligen Medium vorzugsweise etwa 50 bis etwa 1500 ppm betragen.

Die geeigneten Bestandteile einer geeigneten Vorrats lösung, der Kultur, der Beimpfungsmedien und der Pro duktionsmedien können sehr verschieden sein und sind dem Fachmann bekannt.

Schließlich betrifft die Erfindung auch noch gereinigte, beispielsweise von sonstigen Substanzen menschlichen Ursprungs vollständig freie Human-Mangansuperoxiddis mutase oder Analoge oder Mutanten derselben, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Human-Mangan superoxiddismutase-Analoges mit mindestens zwei Poly peptiden, von denen mindestens eines die in Fig. 1 dar gestellte Aminosäuresequenz, deren N-Terminus das durch die Nukleotide 115-117 von Fig. 1 codierte Lysin und deren COOH-Terminus das durch die Nukleotide 706-708 von Fig. 1 codierte Lysin sind, wobei am N-Terminus ein zusätzlicher Methioninrest vorhanden ist, aufweist (Met-hMnSOD). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besitzt das gereinigte Met-hMnSOD eine spezifische Aktivität von 3 500 Ein heiten/mg.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher er läutern. Sie enthalten keine detaillierte Beschreibung üblicher Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, zur Insertion von Genen mit Codierung von Polypeptiden in solche Vektoren oder die Einschleusung der gebildeten Plasmide in Wirte. Ferner enthalten sie keine detaillier te Beschreibung üblicher Verfahren zum Testen bzw. zur Bestimmung der durch solche Wirt/Vektor-Systeme produ zierten Polypeptide oder zur Ermittlung der Identität solcher Polypeptide durch Aktivitätsfärbung iso elektrischer fokussierender bzw. konzentrierender Gele (IEF). Solche Verfahren sind dem Fachmann be kannt und werden in zahlreichen Publikationen, z. B. in:
T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sombrook, Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982);
J. M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969) und
C. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44: 276-87 (1971)
beschrieben.
mM bedeutet mmol/l.

Beispiel 1

Zur Identifizierung von MnSOD-cDNA-Klonen werden ent sprechend der publizierten Aminosäuresequenz (18, 19) gemischte Oligomerensonden synthetisiert.

Die 5′-Sonde besteht aus 30 Nukleotiden und entspricht den Aminosäuren 15 bis 24 von reifer bzw. fertiger MnSOD. Die 3′-Sonde besteht aus 32 Nukleotiden und entspricht den Aminosäuren 179 bis 189 von reifer bzw. fertiger MnSOD. Die 5′-Sonde besteht aus einer Misch sonde aus 36 unterschiedlichen Sequenzen (vgl. oben). Die 3′-Sonde besteht aus einer Mischsonde aus 16 un terschiedlichen Sequenzen (vgl. oben). Ist mehr als ein Nukleotid an einer gegebenen Stelle dargestellt, wurde der DNA-Strang mit äquimolarer Menge jeder der dargestellten Nukleotide synthetisiert, wodurch die Mischsonde erhalten wird.

Die 5′-Sonde dient zur Sichtung von 300 000 Plaquen einer T-Zellen-cDNA-Bibliothek, die in den λ gt-10-Vektor kloniert ist. Die Hybridisierung zu Phagen plaquereplikas, die auf Nitrocellulosefiltern immo bilisiert sind, erfolgt nach Standardverfahren (Maniatis und Mitarbeiter - vgl. oben), jedoch mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 50°C 16 h lang in 8×SSC erfolgte. Danach werden die Filter bei 50°C mit 5×SSC und 0,1% SDS gewaschen. Drei positive Plaquen werden isoliert und als Phi MS8, Phi MS1 und Phi MS1J bezeichnet.

EcoRI-Aufschlüsse von DNA aus Phi MS8 und Phi MS1 zei gen, daß beide etwa 800 bp lange cDNA-Inserte, die zu den 5′- und 3′-Oligonukleotidsonden hybridisieren, enthalten. Phi MS1J trägt lediglich ein 450 bp cDNA-Insert, das lediglich zu der 5′-Endsonde hybridisiert.

Die EcoRI-Inserte der drei Phagenklone werden in die EcoRI-Stelle von pBR322 subgeklont, wobei pMS8-4, pMS1-4 bzw. pMS1J entstehen. Eine Restriktionsanalyse und die Hybridisierung zu den 5′- und 3′-Oligonukleo tidsonden zeigen ähnliche Muster für pMS8-4 und pMS1-4. Die folgende Restriktionskarte, welche die 5′ → 3′-Orien tierung zeigt, wurde für beide Plasmide herge leitet.

Die Sequenz des cDNA-Inserts von pMS8-4 ist in Fig. 1 dargestellt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz unter scheidet sich von der publizierten Aminosäuresequenz (19) darin, daß an drei (3) Stellen (AA 42, 88, 108) anstelle von Gln Glu erscheint und daß zwischen AA_123-124 zusätzliche zwei Aminosäuren Gly und Trp auftreten. Die Sequenzanalyse von pMS1-4 und pMS1J zeigt, daß die drei MnSOD-Klone unabhängig abgeleitet wurden, und bestätigt diese Unterschiede von der publizierten Aminosäuresequenz.

Die Sequenz stromaufwärts zum N-terminalen Lysin der reifen oder fertigen MnSOD sagt eine Präpeptidsequenz von 24 Aminosäuren voraus.

Beispiel 2 Konstruktion von pMSE-4: Amp^R Human-MnSOD-Expressionsplasmid

Der Ausgangspunkt für die Konstruktion von pMSE-4 ist das gemäß Beispiel 1 erhaltene Plasmid pMS8-4. Das Plasmid pMS8-4 mit Human-MnSOD-cDNA an einem EcoRI- Insert wird vollständig mit NdeI- und NarI-Restriktions enzymen verdaut. Das große Fragment wird isoliert und entsprechend Fig. 2 mit einem synthetischen Oligomeren verbunden. Das hierbei erhaltene Plasmid pMS8-NN enthält den Codierbereich für die reife bzw. fertige MnSOD mit vorgeschaltetem ATG-Initiationscodon. Obiges Plasmid wird mit EcoRI verdaut, die Enden werden mit Klenow-Fragment von Polymerase I gefüllt und weiter mit NdeI gespalten. Das kleine Fragment mit dem MnSOD-Gen wird in mit NdeI und StuI behandeltes pSOD 13 eingebaut. pSOD 13 erhält man gemäß der U.S.-Patentanmeldung mit der Serial Number 644 245. Hierdurch erhielt man das Plasmid pMSE-4 mit dem MnSOD-Codierbereich mit vorgeschalteter cII-ribosomaler Bindestelle und unter Kontrolle von λ P_L-Promotor. Das Plasmid pMSE-4 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hinterlegungs nummer 53250 hinterlegt. Sämtliche angewandten Ver fahrensmaßnahmen entsprechen im wesentlichen den von Maniatis (vgl. oben) beschriebenen Verfahrensmaßnahmen.

Beispiel 3 Expression der rekombinanten Human-MnSOD

Das Plasmid pMSE-4 wird in üblicher bekannter Weise in den Escherichia coli-Stamm A4255 eingeschleust. Danach wird der pMSE-4 enthaltende E. coli-Stamm A4255 in einem Luria Broth (LB)-Medium mit 100 g/ml Ampicillin bei 32°C so lange wachsen gelassen, bis die optische Dichte (OD) bei 600 nm 0,7 beträgt. Die Induktion er folgt bei 42°C. Zu verschiedenen Zeitpunkten entnommene Proben werden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel elektrophorese (SDS-PAGE) einer elektrophoretischen Trennung unterworfen. Die Gele zeigen eine Zunahme an Human-MnSOD-Gehalt bis zu 120 min nach der Induktion.

Zu diesem Zeitpunkt macht das rekombinante MnSOD-Protein 27% der Gesamtzellproteine (ermittelt durch Abtastung von mit Coomassie-Blau gefärbtem Gel) aus. Eine 90 s dauernde Beschallung der Proben in einem handelsüblichen Beschallungsgerät und eine Verteilung der Proteine in lösliche (s) und nicht-lösliche (p) Fraktionen durch Zentrifugieren bei 10 000 g während 5 min zeigt, daß der Hauptteil der produzierten rekombinanten MnSOD unlöslich ist. Die induzierte lösliche Proteinfraktion zeigt lediglich eine schwach stärkere SOD-Aktivität als die nicht-induzierte Gegen probe (getestet nach Standardverfahren). (Vgl. McCord und Mitarbeiter, s. oben). Offensichtlich ist ein Teil der in der löslichen Fraktion gefundenen MnSOD in aktiv. Dies legt nahe, daß der Hauptteil der unter den in diesem Beispiele beschriebenen Bedingungen produzier ten Human-MnSOD tatsächlich inaktiv ist.

Beispiel 4 Einfluß von Mn⁺⁺ im Wachstumsmedium auf die MnSOD-Löslichkeit und -Aktivität

Der Zusatz von Mn⁺⁺ in steigenden Konzentrationen bis zu 450 ppm zum Wachstumsmedium von pMSE-4 enthaltendem E. coli A4255 vor einer 2stündigen Induktion bei 42°C beeinträchtigt die Gesamtausbeute an Human-MnSOD nicht. Eine Analyse der beschallten löslichen (s) und unlös lichen (p) Proteinfraktionen durch Natriumdodecylsulfat-Poly acrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zeigt eine verstärkte Löslichkeit des rekombinanten Proteins mit steigenden Mn⁺⁺-Konzentrationen (vgl. die folgende Tabelle I). Ein Test bezüglich der SOD-Aktivität (vgl. McCord und Mitarbeiter, s. oben) legt eine Beziehung zwischen steigenden Mn⁺⁺ -Konzentrationen im Wachstums medium und einer besseren Löslichkeit des MnSOD mit einem deutlichen Optimum bei 150 ppm Mn⁺⁺-Konzentra tionen im Medium nahe (Fig. 3). Weiterhin aktivieren steigende Mn⁺⁺-Konzentrationen vorher inaktives lös liches Enzym. Lösliche Proteinfraktionen von bei diesen Mn⁺⁺-Konzentrationen gewachsenen induzierten Kulturen zeigen eine bis zu 60fache Zunahme der SOD-Aktivität gegenüber löslichen Proteinfraktionen von bei diesen Mn⁺⁺-Konzentrationen gewachsenen nicht-induzierten Kulturen. Eine Aktivitätsfärbung isoelektrischer fokussierender bzw. konzentrierender Gele (IEF) (vgl. Beauchamp und Mitarbeiter, s. oben) zeigt, daß Multiformen der rekombinanten MnSOD identisch sind mit denen nativer Humanleber-MnSOD.

Die Ergebnisse einer Human-MnSOD-Produktion durch pMSE-4 enthaltenden E. coli A-1645 sind ähnlich wie die geschilderten Ergebnisse.

TABELLE I

Beispiel 5 Konstruktion von pMSΔRB4: Tet^R Human-MnSOD-Expressionsplasmid

Tet^R-Expressionsvektor, pΔRB, entsteht aus pSODβ₁T-11 durch komplette Verdauung mit EcoRI und anschließende Teilspaltung mit BamHI-Restriktionsenzymen. pSODβ₁T-11 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53468 hinterlegt. Das ver daute Plasmid wird mit einem synthetischen Oligomeren

verbunden, wobei man pΔRB mit dem P_L-Promotor er hält.

Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmids pMSE-4 mit der cII ribosomalen Bindestelle und der vollständi gen Codiersequenz für das reife oder fertige Enzym wird in die einzige EcoRI-Stelle von pΔRB eingefügt. Das erhaltene Plasmid pMSΔRB4 enthält das MnSOD-Gen unter Kontrolle von XP_L und cII RBS und hat Tetracyclin resistenz erhalten (Fig. 4).

Beispiel 6 Expression von Human-MnSOD aus pMSΔRB4

Das Plasmid pMSΔRB4 wird in üblicher bekannter Weise in den Escherichia coli-Stamm A4255 eingeschleust.

Kulturen werden bei 32°C in Luria Broth (LB) mit ver schiedenen Konzentrationen an Mn⁺⁺ wachsengelassen, bis die optische Dichte (OD) bei 600 nm 6,7 erreicht hat. Die Induktion erfolgt bei 42°C. Zu verschiedenen Zeitpunkten entnommene Proben werden mittels SDS-PAGE einer Elektrophorese unterworfen. Der hMNSOD-Gehalt steigt während der Induktionsdauer bis zu 120 min. Zu diesem Zeitpunkt macht er etwa 15% der Gesamtzell proteine aus (bestimmt durch Abtasten eines mit Coomassieblau gefärbten Gels).

Die induzierte MnSOD ist löslich, und zwar ungeachtet der Mn⁺⁺-Konzentration im Wachstumsmedium. Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen des Amp^R-Plasmids pMSE-4 (vgl. Beispiel 4). Die maximale SOD-Aktivität und der Expressionsgrad hängen jedoch von der Mn⁺⁺-Ergänzung ab (Tabelle II).

TABELLE II

Beispiel 7 Reinigung von enzymatisch aktiver rekombinanter Human-MnSOD

Der E. coli-Stamm A4255 mit dem darin befindlichen Plasmid pMSΔRB4 wird in mit 750 ppm Mn⁺⁺ ergänzter LB bei 32°C bis zu A600 von 17,0 fermentiert. Die Induk tion der Human-MnSOD-Expression erfolgt durch Temperaturerhöhung auf 42°C während 2 h. Zu diesem Zeitpunkt erreicht die Kultur einen A600-Wert von 43,0. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet und im 0,2fachen Originalvolumen in 50 mM Kaliumphosphat puffer eines pH-Werts von 7,8 mit 250 mM NaCl re suspendiert.

Bakterien werden durch Doppelpassage durch eine handels übliche Mühle aufgebrochen. Nach dem Zentrifugieren werden Zellbruchstücke verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wird 1 h lang auf 60°C erwärmt, auf 4°C abgekühlt und nach dem Klären auf das 0,03fache des Originalvolumens eingeengt. Danach wird gegen 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7,8 auf einer handelsüblichen Ultrafiltrationsvorrichtung mittels einer 10K-Membran dialysiert. Das rohe Enzympräparat wird auf eine DE52-Säule aufgegeben, gründlich mit 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7,8 gewaschen und mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7,8 eluiert. Die gesammelten enzymhaltigen Fraktionen werden gegen 40 mM Kaliumphosphatacetat eines pH-Werts von 5,5 dialysiert, auf eine CM52-Säule aufgegeben und mit einem linearen Gradienten von 40-200 mn Kalium acetat eines pH-Werts von 5,5 eluiert. Die Human-MnSOD enthaltenden Peakfraktionen werden gesammelt, gegen H₂O dialysiert, mit einem 10 mM Kaliumphosphatpuffer auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt und bei -20°C gefroren.

Die erhaltene rekombinante Human-MnSOD zeigt eine größere Reinheit als 99% bei einer spezifischen Aktivi tät von etwa 3500 Einheiten/mg. Die Gesamtausbeute des Reinigungsverfahrens beträgt etwa 30% (Tabelle III).

Eine Sequenzanalyse des gereinigten Enzyms zeigt die Anwesenheit von zusätzlichem Methionin an der N-termi nalen Aminosäure im Vergleich zu der bekannten Human-MnSOD (19).

Eine Analyse des Metallgehalts durch Atomabsorption zeigt etwa 0,77 Atome Mn pro Enzymuntereinheit. Dies stimmt mit den publizierten Daten überein (23).

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Claims

1. Doppelsträngiges DNA-Molekül mit Codierung für Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid, von welchem ein Strang im wesentlichen die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz vom Nukleotid Nr. 115 stromabwärts bis einschließlich zum Nukleotid Nr. 708 aufweist, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Klonierungsvehikel, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 1.

3. Klonierungsvehikel nach Anspruch 2, mit der Bezeichnung pMSE-4, dem die in Fig. 2 dargestellte Restriktionskarte zukomme und das unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53250 in dem E. coli-Stamm A4255 hinterlegt ist, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

4. Klonierungsvehikel nach Anspruch 2, mit der Bezeichnung pMSΔRB4, dem die in Fig. 4 dargestellte Restriktionskarte zukommt, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

5. Zelle, in welche die DNA nach Anspruch 1 eingefügt ist.

6. Prokaryontische Zelle nach Anspruch 5.

7. Bakterienzelle nach Anspruch 5.

8. Zelle nach Anspruch 7, enthaltend das Plasmid pMSE-4, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53250.

9. Zelle nach Anspruch 7, enthaltend das Plasmid pMSΔRB4 gemäß Fig. 4, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

10. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 5.

11. Verfahren zur Herstellung eines Human-Mangansuperoxid dismutasepolypeptids, umfassend den Teil der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz, deren N-Terminus das durch die Nukleotide 115-117 von Fig. 1 codierte Lysin und deren COOH-Terminus das durch die Nukleotide 706-708 von Fig. 1 codierte Lysin sind, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Zelle nach Anspruch 5 derart behandelt, daß die DNA die Expression des Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptids steuert und die Zelle das Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid exprimiert und daß man aus der Zelle das exprimierte Human-Mangansuperoxiddismutasepolypeptid gewinnt, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

12. Gereinigtes Polypeptid, umfassend 222 Aminosäuren der in Fig. 1 dargestellten Sequenz, deren N-Terminus das durch die Nukleotide 43-45 von Fig. 1 codierte Methionin und deren COOH-Terminus das durch die Nukleotide 706-708 von Fig. 1 codierte Lysin sind, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

13. Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver Human-Mangansuperoxiddismutase in einer Bakterienzelle, die eine DNA-Sequenz, im wesentlichen umfassend die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz vom Nukleotid Nr. 115 stromabwärts bis einschließlich zum Nukleotid Nr. 708, mit Codierung für die Superoxiddismutase enthält und zur Expression dieser DNA-Sequenz fähig ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen und in einem geeigneten Produktionsmedium, das mit einer solchen Menge Mn⁺⁺ ergänzt ist, daß die Mn⁺⁺-Konzentration in dem Medium über etwa 2 ppm liegt, aufbewahrt, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzelle eine Escherichia coli-Zelle ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzelle ein Plasmid enthält, in das die DNA-Sequenz mit Codierung für die Mangansuperoxiddismutase eingebaut ist.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als geeignetes Produktionsmedium ein Caseinhydro lysatmedium verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als geeignetes Produktionsmedium LB-Medium verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Mn⁺⁺-Konzentration etwa 50 bis etwa 1500 ppm beträgt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Mn⁺⁺-Konzentration etwa 150 ppm beträgt.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Mn⁺⁺-Konzentration etwa 750 ppm beträgt.

21. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzelle aus dem Escherichia coli-Stamm A4255 mit dem Plasmid pMSE-4 besteht und unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53250 hinterlegt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pMSE-4 mit der in Fig. 2 dargestellten Restriktionskarte ist und unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53250 hinterlegt ist, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

23. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzelle aus dem Escherichia coli-Stamm A4255 mit dem Plasmid pMSΔRB4 mit der in Fig. 4 dargestellten Restriktionskarte besteht, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

24. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid aus pMSΔRB4 mit der in Fig. 4 dargestellten Restriktionskarte besteht, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

25. Polypeptid praktisch derselben Aminosäuresequenz wie sie ein Human-Superoxiddismutasepolypeptid aufweist, umfassend den Teil der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz, deren N-Terminus das durch die Nukleotide 115-117 von Fig. 1 codierte Lysin und deren COOH-Terminus das durch die Nukleotide 706-708 von Fig. 1 codierte Lysin sind, hergestellt in einem einzelligen Mikroorganismus, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

26. Polypeptid-Mangankomplex, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 25 in einem Komplex mit Mangan in einer beliebigen seiner chemischen Formen, der die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommender Human-Mangansuperoxiddismutase aufweist, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

27. Human-Mangansuperoxiddismutase-Analoges, umfassend mindestens zwei Polypeptide, von denen mindestens eines demjenigen von Anspruch 25 plus einem weiteren Methioninrest am N-Terminus entspricht, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

28. Gereinigtes Human-Superoxiddismutase-Analoges nach Anspruch 27, mit einer spezifischen Aktivität über etwa 3500 Einheiten/mg.

29. Human-Mangansuperoxiddismutase, umfassend mindestens zwei Polypeptide jeweils gemäß Anspruch 25.

30. Arzneimittel mit einer wirksamen Menge einer Human-Mangansuperoxiddismutase nach Anspruch 29 und einem geeigneten Träger.

31. Arzneimittel nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein veterinärmedizinisches Mittel handelt.