Die vorliegenden Unterlagen basieren auf einer continuation-in-part Anmeldung der USA Anmeldung Serial no. 801 090, die am 22. November 1985 eingereicht wurde, und es wird auf die dort gemachten Aussagen Bezug genommen.
Ferner wird Bezug genommen auf alle Offenbarungen, die in den Veröffentlichungen genannt sind, welche in der vorliegenden Beschreibung erwähnt sind.
Superoxid-dismutase, die in der Folge als SOD abgekürzt wird und das Phänomen der freien Sauerstoffradikale, also der Radikale der Formel (O2-) wurden im Jahre 1948 von McCord entdeckt und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Fridovich, I, im J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969) verwiesen.
Superoxid Radikale und andere hochreaktive Sauerstoffarten werden in jeder atmenden Zelle als Nebenprodukt eines oxidativen Stoffwechsels gebildet und es hat sich gezeigt, dass diese eine starke Schädigung bei einer grossen Anzahl von makromolekularen Komponenten und Zellkomponenten hervorrufen. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffent lichung von Fridovich, I. in "Advances in Inorganic Biochemistry", Verlag Eichhorn, G.L. und Marzilli, L.G. (Elsevier/North Holland, New York), Seiten 67-90 (1979) und auf die Veröffentlichung von Freeman, B.A. und Crapo, J.D. in "Laboratory Investion" 47:412-26 (1982) verwiesen.
Eine Gruppe an Metalloproteinen, die als Superoxid-dismutasen bekannt sind, katalisieren die oxidative Reduktionsreaktion von freien Sauerstoffradikalen nach dem folgenden Reaktionsmechanismus
2O2- + 2H<+ >-> H2O2 + O2
Diese Superoxid-dismutasen stellen also einen Abwehrmechanismus gegen die Toxizität des Sauerstoffes dar.
Es gibt verschiedene bekannte Formen von Superoxid-dismutasen, die unterschiedliche Metalle und unterschiedliche Proteine enthalten. Zu den Metallen, die in diesen Superoxid-dismutasen enthalten sind, gehören Eisen, Mangan, Kupfer und Zink. Alle bekannten Formen der Superoxid-dismutasen katalisieren die gleiche Reaktion. Diese Enzyme werden in verschiedenen Gruppen der Evolutionsreihe gefunden.
Superoxid-dismutasen, die Eisen enthalten, sind hauptsächlich in prokaryotischen Zellen anzutreffen.
Superoxid-dismutasen, die Kupfer und Zink enthalten, werden in praktisch allen eukaryotischen Organismen gefunden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Steinman, H.M. in "Superoxide Dismutase", Verlag Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), Seiten 11-68 (1982) verwiesen.
Superoxid-dismutasen, die Mangan enthalten, wurden in Organismen gefunden, die von Mikroorganismen bis zu menschlichen Lebewesen reichen.
Jedes biologische Makromolekül kann das Produkt sein, das durch überflüssige Superoxid-Radikale beschädigt wird und deshalb hat man sich für die therapeutischen Möglichkeiten der Verwendung von Superoxid dismutase bereits interessiert. In der wissenschaftlichen Literatur wird vorgeschlagen, dass Superoxid-dismutase in einem weiten Bereich von klinischen Anwendungen nützlich sein kann. Zu diesen klinischen Anwendungen gehört die Verhinderung einer Onkogenese, also die Verhinderung einer Geschwürsbildung, und die Verhinderung der Bildung von Tumoren, sowie ferner eine Verminderung der cytotoxischen und cardiotoxischen Wirkungen von Antikrebsmitteln. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Oberley, L.W. und Buettner, G.R. in Cancer Research 39:1141-49 (1979) verwiesen.
Weitere Einsatzgebiete sind die Schützung von ischämischen Geweben, also von blutleeren Geweben, und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Roy, R.S. in Can. J. Physiol. Pharma, 60:1346-52 (1982) verwiesen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Schützung von Spermatozoen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Alvarez, J.G. und Storey, B.T. in Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983) hingewiesen. Ausserdem besteht ein Interesse daran, den Einfluss von Superoxid-dismutase auf den Alterungsprozess zu untersuchen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Talmasoff, J.M., Ono, T. und Cutler, R.G. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2777-81 (1980) hingewiesen.
Die Erforschung der therapeutischen Möglichkeiten von menschlicher Superoxid-dismutase war bisher hauptsächlich durch die begrenzten, zur Verfügung stehenden Mengen dieses Produktes beschränkt.
Superoxid-dismutase ist auch deshalb von Interesse, weil sie entzündungshemmende Eigenschaften besitzt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Huber, W. und Menander-Huber, K.B. in Clinics in Rheum. Dis. 6:465-87 (1980) hingewiesen.
Es wurde festgestellt, dass von Rindern stammende Superoxid-dismutase (Orgotein) entzündungshemmende Eigenschaften besitzt und derzeit ist diese in bestimmten Teilen Europas als pharmazeutisches Präparat zur Anwendung am Menschen im Handel erhältlich. Dieses Produkt ist auch in den Vereinigten Staaten als pharmazeutisches Produkt zur veterinärmedizinischen Anwendung erhältlich und es wird insbesondere zur Behandlung von entzündeten Sehnen bei Pferden eingesetzt. Aber auch das Ausmass, in dem Orgotein zur Verfügung steht, ist begrenzt. Nach den bisher bekannten Verfahren wurde dieses Produkt aus Rinderzellen oder anderen tierischen Zellen gewonnen, aber diese Arbeitsverfahren sind drastischen Einschränkungen unterworfen und das so erhaltene Orgotein kann bei Menschen allergische Reaktionen hervorrufen, weil dieses Produkt nicht menschlichen Ursprungs ist.
Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase, die in der Folge als CuZn SOD abgekürzt wird, ist die am häufigsten untersuchte und am besten beschriebene Form der verschiedenen Formen der Superoxid-dismutase.
Die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid dismutase ist ein dimeres Metallisch-O-Protein, das aus identischen nicht kovalent gebundenen Untereinheiten aufgebaut ist, wobei jede dieser Untereinheiten ein Molekulargewicht von 16 000 Dalton aufweist und ein Atom Kupfer und ein Atom Zink enthält. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Hartz, J.W. und Deutsch, H.F. im J. Biol. Chem. 247:7043-50 (1972) verwiesen. Jede dieser Untereinheiten ist aus 153 Aminosäuren zusammengesetzt und die Aminosäuresequenz wurde ebenfalls bereits aufgeklärt.
Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. und Deutsch, H.F., in Biochemistry 19:2310-16 (1980), sowie auf die Veröffentlichung von Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. und Bossa, F. in FEBS Letters 120:53-56 (1980) hingewiesen.
Die komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, die in der Folge mit cDNA abgekürzt wird, welche die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase kodiert, wurde kloniert. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2808-11 (1982) verwiesen. Die vollständige Aminosäuresequenz der geklonten DNA wurde auch bereits aufgeklärt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5465-69 (1983) hingewiesen.
Ausserdem wurden auch schon die Expressions-vektoren beschrieben, welche eine DNA enthalten, die für Superoxid-dismutase kodiert ist und ferner wurde auch die Herstellung und Gewinnung von Superoxid-dismutase in Bakterien bereits beschrieben. Es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 131 843 A1 verwiesen, die am 23. Januar 1985 veröffentlicht wurde und die der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 107 717.5 entspricht, welche am 3. Juli 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität der am 15. Juli 1983 eingereich ten USA Anmeldung Serial No. 514 188. Des weiteren sei auf die Veröffentlichung von Hallewell, et al., in Nucleic Acids Res. 5, (1985) hingewiesen.
Des weiteren ist die Expression einer Superoxid-dismutase-DNA und die Herstellung von Superoxid dismutase in Hefe ebenfalls bereits beschrieben worden und es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung 0 138 111 A1, die am 24. April 1985 veröffentlicht wurde, hingewiesen, welche der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 111 416.8 entspricht, die am 25. September 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität vom 3. Oktober 1983 der USA Patentanmeldung Serial No. 538 607 und der Priorität vom 11. Mai 1984 der USA Patentanmeldung Serial No. 609 412.
In jüngster Zeit wurde auch die Genstelle für CuZn SOD auf dem menschlichen Chromosom 21 beschrieben und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung im EMBO Journal, Band 4, Nr. 1, Seiten 77-84 (Januar 1985) hingewiesen. Die neuesten Entwicklungen im Zusammenhang mit der Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase wurden in dem Abstract der vierten internationalen Konferenz über Superoxide und Superoxid-dismutase zusammengefasst, die in Rom, Italien, im Zeitraum vom 1.-6. September 1985 abgehalten wurde.
Wesentlich weniger ist jedoch über die Mangan Superoxid-dismutase, die in der Folge auch mit MnSOD abgekürzt werden wird, bekannt. Die MnSOD von Escherichia coli K-12 wurde kürzlich kloniert und in das Verzeichnis aufgenommen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Touati, D., im Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983) verwiesen. Barra et al. beschreiben eine Sequenz von 196 Aminosäuren für das MnSOD-Polypeptid, das aus menschlichen Leberzellen isoliert worden war. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984) verwiesen.
Die bisherigen Veröffentlichungen unterscheiden sich jedoch bezüglich der Struktur des MnSOD-Moleküls, und zwar insbesondere dahingehend, ob dieses zwei identische oder vier identische Polypeptid Untereinheiten aufweist. Es sei in diesem Zusammenhang auf die gerade oberhalb genannte Veröffentlichung von Barra hingewiesen und ferner auf die Veröffentlichung von McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. und Salin, M.L. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michaelson, A.M., McCord, J.M., und Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 129-138 (1977) verwiesen. Es ist jedoch klar, dass das MnSOD-polypeptid und das CuZn-Sod-Polypeptid nicht homolog sind und in diesem Zusammenhang sei auf die erwähnte Veröffentlichung von Barra verwiesen.
Die Homologien der Aminosäuresequenz von verschiedenen MnSOD und FeSOD, die aus verschiedenen Quellen stammten, wurden miteinander verglichen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) hingewiesen.
Baret et al. beschreiben in einem Rattenmodell, dass die Halbwertzeit von menschlichem MnSOD wesentlich länger ist, als die Halbwertzeit von menschlichem Kupfer-SOD. Diese Autoren beschreiben auch, dass in dem Rattenmodell menschliche MnSOD und Ratten-Kupfer-SOD nicht wirksam sind als entzündungshemmende Mittel, während die Kupfer-SOD von Rindern und die menschliche Kupfer-SOD vollständig aktiv sind. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Baret, A., Jadot, G., und Michelson, A.M., in Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (September 1, 1984) hingewiesen.
McCord et al. beschreiben, dass die natürlich vorkommende menschliche MnSOD, also die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase die menschlichen phagocytierenden polymorphonuklearen Leukocyten, die in der Folge als PMN-Leukocyten abgekürzt werden, gegen freie Superoxid-Radikale besser schützt, als die von Rindern stammende oder die von Schweinen stammende Kupfer-Zink-Superoxiddismutase, wobei diese Ergebnisse durch in vitro Tests gewonnen wurden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Salin, M.L., im Buch "Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes", Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. Verlag, Seiten 257-264 (1977) hingewiesen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Desoxiribonucleinsäure-Molekül, das in der Folge als cDNA-Molekül abgekürzt wird, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Kloning-vehikel, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten und welche zur Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben oder der Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet sind. Zellen, beispielsweise Zellen einzelliger Lebewesen, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten, sind zur Herstellung des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben, beziehungsweise zur Herstellung von menschlichem Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet, und bevorzugte derartige einzellige Organismen sind Bakterien.
Wenn das menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptid, komplexiert mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen vorliegt, dann stellt dieses Produkt ein Enzym dar, welches die Aktivität der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase aufweist. Die entsprechenden Enzyme können als Wirkstoff in pharmazeutischen Präparaten zur Verwendung in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin eingesetzt werden. Die entsprechenden pharmazeutischen Präparate sind in der Lage, um Schädigungen bei der Wiederdurchblutung nach einer Blutleere, also Schäden bei der Reperfusion nach einer Ischämie, zu vermindern. Mit Hilfe entsprechender pharmazeutischer Präparate kann eine verlängerte Lebenszeit von entfernten und isolierten Organen gewährleistet werden.
Des weiteren sind pharmazeutische Präparate, welche die entsprechenden Enzyme als Wirkstoff enthalten, zur Behandlung von Entzündungen geeignet.
Die Erfindungsgegenstände werden nun näher erläutert.
Ein DNA-Molekül, welches cDNA enthält, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde aus menschlichen T-Zellen-cDNA-Bruchstücken (T-cell library) isoliert. Die Aminosäuresequenz des Nucleotides eines doppelsträngigen DNA-Moleküles, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde gefunden. Die Aminosäuresequenz eines Stranges, der das Polypeptid oder ein Analoges desselben codiert, ist in Fig. 1a und 1b dargestellt, und zwar reicht sie dort vom Nucleotid 115 hinunter bis zum Nucleotid 708. Andere Sequenzen, die das Analoge oder eine Mutante codieren, können im wesentlich ähnlich dem Strang sein, der das Polypeptid codiert.
Die Nucleotid Sequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches ein 24 Aminosäuren umfassendes Prepeptid codiert, ist ebenfalls in Fig. 1a dargestellt, und zwar reicht diese Aminosäuresequenz im Nucleotid von der Aminosäure 43 bis einschliesslich zur Aminosäure 114.
Das doppelsträngige cDNA-Molekül oder irgend ein anderes doppelsträngiges DNA-Molekül, welches einen Nucleotidstrang enthält, der eine Sequenz aufweist, die das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, kann in ein Klonierungs-Vehikel einverleibt werden und als Beispiels für ein Klonierungs-Vehikel sei ein Plasmid oder ein Virus genannt. Entweder kann das DNA-Molekül in eine Zelle eingefügt werden, und zwar entweder eine procaryotische Zelle, beispielsweise eine bakterielle Zelle, oder eine eukaryotische Zelle, beispielsweise eine Hefezelle oder Säugetierzelle, indem man bekannte Methoden anwendet. Zu diesen bekannten Methoden gehört die Anwendung eines Klonierungs-Vehikels, das beide Moleküle enthält, die Erfindung sei jedoch nicht auf diese Methode beschränkt.
Vorzugsweise wird die cDNA oder die DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert in ein Plasmid einverleibt, beispiels weise in pMSE-4 oder pMS DELTA RB4, und dann in eine geeignete Wirtzelle eingefügt, in der die Expression der DNA erfolgen kann und das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben produziert wird. Die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase wird in der Folge auch als hMnSOD abgekürzt.
Zu den bevorzugten Wirtzellen gehören Escherichia coli, sind zwar insbesondere Escherichia coli A4255 und Escherichia coli A1645. Das Plasmid pMSE-4 in dem Escherichia coli Stamm A4255 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. 53250 hinterlegt.
Das Plasmid pMS DELTA RB4 kann so erhalten werden, wie dies in Fig. 4 gezeigt wird. Dieses in Fig. 4 veranschaulichte Verfahren wird später noch näher erläutert.
Zellen, in welche solche DNA-Moleküle eingeführt worden waren, können nach Verfahren gezüchtet oder kultiviert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, wobei man geeignete Bedingungen anwendet, die eine Transkription der DNA in die messenger Ribonucleinsäure, welche in der Folge mit mRNA abgekürzt wird und eine Expression der mRNA als Protein erlaubt. Das so gebildete Mangan-Superoxid-dismutase Protein kann dann gewonnen werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Anwendung in der Veterinärmedizin und in der Humanmedizin geeignet sind und die die menschliche Mangan-Superoxiddismutase, also das menschliche MnSOD oder Analoge oder Mutanten desselben enthalten, können ebenso hergestellt werden und derartige pharmazeutische Präparate enthalten im allgemeinen als weitere Komponente ein Trägermaterial. Diese pharmazeutischen Präparate, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder Mutanten derselben enthalten, können eingesetzt werden, um die folgende Reaktion zu katalysieren:
2O2- + 2H <+> -> H2O2 +O2
Durch die Katalysierung dieser Reduktion werden Zellschädigungen vermindert, die durch Superoxid Radikale hervorgerufen werden.
Insbesondere können diese Enzyme oder Analoge oder Mutanten derselben verwendet werden, um Schäden zu vermindern, welche bei einer Wiederdurchblutung nach einer Blutleere auftreten, also bei einer Reperfusion nach einer Ischämie, und um die Überlebenszeit von entnommenen isolierten Organen zu erhöhen oder um Entzündungen zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder von Analogen oder Mutanten derselben in Bakterienzellen. Die Bakterienzelle enthält die DNA-Sequenz und ist in der Lage, die Expression der DNA-Sequenz hervorzurufen, die für die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges oder eine Mutante derselben kodiert ist.
Bei diesem Verfahren stellt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen und in einem Produktionsmedium. Dieses Produktionsmedium enthält als Zusatz eine Menge an Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration an diesen Manganionen, die der Zelle in dem Medium zur Verfügung steht, höher als 2 ppm ist.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli, die ein Plasmid enthält, welches eine DNA-Sequenz enthält, welche für das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert ist, beispielsweise für pMSE-4 oder pMS RB4 in dem Escherichia coli Stamm A4255. Die Konzentration an den Manganionen in dem Produktionsmedium liegt in diesem Fall vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm, wobei Konzentrationen im Bereich von 150 bis 750 ppm speziell bevorzugt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben aus Bakterienzellen, welche diese Dismutase enthalten. Dabei werden im allgemeinen die Zellen zuerst einer Behandlung unterworfen, um eine Proteinfraktion zu erhalten, die Proteine enthält, welche in den Zellen anwesend sind, und zwar einschliesslich der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutanten derselben. Diese Proteinfraktion wird dann weiterbehandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu erhalten.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zuerst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand zu isolieren und dabei werden die löslichen Proteine gewonnen. Die löslichen Proteine werden dann weiterbehandelt um eine Fraktion des löslichen Proteins abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-oxydase, abgekürzt als hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante derselben enthält. Diese Abtrennung der gewünschten Fraktion kann beispielsweise durch Ausfällung erfolgen. Diejenige Fraktion, welche die hMnSOD oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält, wird gewonnen. Diese gewonnene Fraktion an löslichen Proteinen wird dann weiterbehandelt, um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen.
Eine speziell bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben aus Bakterienzellen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthalten. Bei diesem Verfahren werden zuerst die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium abgetrennt und dann in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist.
Anschliessend werden dann die Zellen aufgebrochen und zentrifugiert und das dabei gebildete überstehende Material wird dann während etwa 30 bis 120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von 55-65 DEG C erhitzt. Vorzugsweise erhitzt man während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C und speziell bevorzugt eine Stunde lang auf eine Temperatur von 60 DEG C. Anschliessend wird dann auf eine Temperatur von unterhalb von 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf 4 DEG C. Irgend ein Niederschlag, der sich dabei gebildet hat, muss entfernt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, und das gekühlte darüber stehende Material wird dann gegen einen geeigneten Puffer dialysiert. Als Beispiel für einen geeigneten Puffer sei ein 2 mN Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von etwa 7,8 genannt.
Vorzugsweise wird die Dialyse durch eine Ultrafiltration durchgeführt, indem man eine Filtrationsmembran von kleiner als 30K verwendet. Gleichzeitig mit der Dialyse oder nach der Dialyse kann das gekühlte darüber stehende Material gegebenenfalls bis zur Erreichung eines geeigneten und angenehm zu handhabenden Volumens konzentriert werden, beispielsweise auf 0,03 des Ausgangsvolumens.
Das Retentat wird dann auf einer Anionaustausch-chromatographiesäule mit einer geeigneten Pufferlösung eluiert, beispielsweise einer Lösung aus minde stens 20 mM Kaliumphosphatpuffer, die einen pH-Wert von 7,8 aufweist. Diejenigen Fraktionen des Eluates, welche Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt und dann gegen einen etwa 40 mM Kaliumacetatpuffer eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert.
Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden dann durch eine Kationaustauscherchromatographiesäule eluiert, die einen linearen Gradienten von etwa 40 mM bis etwa 200 mM Kaliumacetat und einen pH-Wert von 5,5 aufweist. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt.
Gegebenenfalls können die vereinigten Peakfraktionen dann gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung aus einem etwa 10mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die gereinigte enzymatisch aktive menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder Analoge derselben, beispielsweise met-hMnSOD, oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
In Fig. 1a und 1b wird die Aminosäuresequenz der komplimentären Desoxiribonucleinsäure, abgekürzt als cDNA der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht. Diese wird in der Folge auch mit MnSOD cDNA abgekürzt.
Fig. 1a und 1b zeigt die Nucleotidsequenz des einen Stranges eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert und ausserdem die 198 Aminosäuresequenz der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase, die der DNA-Sequenz entspricht. Fig. 1a zeigt auch die Nucleotidsequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welche ein Präpeptid für die reife menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, wobei dieses Präpeptid aus 24 Aminosäuren besteht und eine Aminosäuresequenz aufweist, die derjenigen der DNA-Sequenz entspricht. Es werden ferner Teile der 5 min und 3 min untranslatierten Sequenzen dargestellt.
Das Plasmid pMS8-4, welches die MnSOD auf einer mit R1 bezeichneten EcoRI Einfügung enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI abgebaut. Das grosse Fragment, das bei diesem Restriktionsabbau gebildet wurde, wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomer in der in Fig. 2 dargestellten Weise verbunden. Das grosse Fragment erstreckt sich von der NdeI Restriktionsstelle in der Stellung "8 Uhr" auf dem pMS8-4 zu der NarI Restriktionsstelle, die sich in der Stellung "3 Uhr" auf dem Plasmid pMS8-4 befindet. Dieses Restriktionsfragment enthält das Ampicillin-resistenz-gen und ausserdem die meisten der MnSOD-gene. Dieser Restriktionsabbau hat die 5 min untranslatierte Region und die Präpeptid kodierende Region des MnSOD-genes entfernt. Dieser Restriktionsabbau hat ebenfalls ungefähr 36 Basenpaare der kodierenden Region des reifen MnSOD-Polyeptides entfernt.
Diese fehlenden Basenpaare, welche das reife MnSOD kodieren, wurden durch die Ligation an den synthetischen Linker eingeführt, welcher in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das erhaltene Plasmid pMS8-NN enthält die kodierende Region für das reife MnSOD und vor dieser ein ATG-Initiationskodon.
Das oben erwähnte Plasmid pMS8-NN wurde mit EcoRI abebaut oder verdaut, die Enden wurden gefüllt indem man das Klenow-fragment der Polymerase 1 verwendete und dann weiter mit NdeI gespaltet.
Das kleine Fragment beherbergt das MnSOD-gen, angeordnet zwischen der eingefüllten EcoRI-Stelle und der NdeI-Stelle und dieses kleine Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment entspricht dem für MnSOD kodierenden Bereich.
Dieses Fragment wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI und StuI behandelt worden war.
Die Behandlung von PSOD alpha 13 mit NdeI und StuI und die nachfolgende Isolierung des grossen Fragments führt zu einem Fragment, welches die lambda PL Promoterseguenz, die cII-ribosomale Bindungsstelle, das Ampicillin-resistanz-gen und die meisten CuZn SOD-gene enthält.
Das CuZn SOD-gen fehlt jedoch in dem kodierenden Bereich für das 5 min Ende des Gens, weil dieses durch die Restriktionsspaltung und die nachfolgende Isolierung des grossen Fragmentes entfernt worden war.
Das MnSOD-gen von pMS8-NN wurde zwischen die NdeI und StuI-Stellen von pSOD alpha 13 eingefügt. Das pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 vom 5. März 1986, die der USA Patentanmeldung Serial No. 644 245 entspricht, beschrieben ist. Durch diese Ligation wurde das Plasmid pMSE-4 gebildet, das den MnSOD kodierenden Bereichen enthält und vor diesem liegen die cII-ribosomale Bindungsstelle und unter der Kontrolle des lambda Pl-Promoters. Das Plasmid pMSE-4 ist am 25. Sept. 1985 bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt worden.
In Fig. 3 wird der Einfluss der Konzentration an Manganionen auf die Aktivität der Superoxid-dismutase veranschaulicht, die in dem Mikroorganismus Escherichia coli gebildet wird.
In dieser Fig. 3 ist auf der Abszisse die Konzentration an Manganionen, nämlich an Mn<+><+> in dem Zuchtmedium in ppm angegeben. Diese reicht von 0 ppm bis 600 ppm. Auf der Ordinate der Fig. 3 sind die spezifischen Superoxid-dismutase Aktivitätseinheiten pro mg des löslichen Proteines angegeben.
Das Diagramm der Fig. 3 zeigt also den Zusammenhang zwischen der spezifischen Aktivität, angegeben in Einheiten pro mg des rekombinierten löslichen MnSOD, das von dem Escherichia coli Stamm A4255 gebildet wurde, der das Plasmid pMSE-4 enthält. In dieser Figur sind sowohl die entsprechenden Einheiten für Nichtinduktion (bei 32 DEG C) angeführt, es handelt sich dabei um die entsprechenden nicht strichlierten Säulen, und des weiteren sind in dieser Figur die Ergebnisse unter den Be dingungen einer Induktion bei 42 DEG C angeführt. Dabei handelt es sich um die entsprechenden strichlierten Flächen. Die Konzentration an den Ionen des zweiwertigen Mangans in dem Wachstumsmedium ist wie erwähnt in ppm, also in Teilen pro Million angeführt.
In Fig. 4 ist der Aufbau von pMS DELTA RB4, nämlich des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Expressionsplasmides veranschaulicht.
Der Tet<R>-Expressionsvektor, p DELTA RB wurde aus dem pSOD beta 1T-11 gebildet, indem man das pSOD beta 1T-11 vollständig mit EcoRI abbaute und anschliessend eine teilweise Spaltung mit den BamHI-Restriktionsenzymen durchführte.
Das grosse Fragment, das durch diesen Abbau gebildet worden war, wurde isoliert und an ein synthetisches Oligomer gebunden, dessen Sequenz wie folgt war:
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
Dadurch erhielt man p DELTA RB, welches den lambda Pl Promoter enthält. Das grosse EcoRI/BamHI Restriktionsfragment, das bei diesem Abbau gebildet wird, erstreckt sich von der EcoRI-Stelle, die in der pSOD beta 1T11-Restriktionskarte in Stellung "12 Uhr" dargestellt ist, in der Gegenuhrzeigerrichtung bis zu der BamHI-Stelle, die in der pSOD 1T11-Restriktionskarte in der "5 Uhr" Stellung dargestellt ist. Das pSOD beta 1T11 ist bei der American Type Culture Colection 3. März 1986 unter der Accession No. 53 468 hinterlegt worden.
Das EcoRI-Fragment vom pMSE-4 wurde erhalten, indem man pMSE-4 mit EcoRI abbaut und das kleine Fragment isoliert, das bei diesem Abbau gebildet wird. Dieses Fragment ist das Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält und es erstreckt sich auf der pMSE-4-Restriktionskarte von der Stelle EcoRI in der Stellung "1 Uhr" zu der Stelle EcoRI in der Stellung "3 Uhr" auf der pMSE-4-Restriktionskarte. Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches die cII-ribosomale Bindungsstelle und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzyms enthält, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von p DELTA RB eingeführt. Das erhaltene Plasmid pMS RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von lambda Pl und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin.
In der Folge wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen beschrieben.
Ein doppelsträngiges Desoxiribonucleinsäuremolekül, das in der Folge mit DNA-Molekül abgekürzt wird, und das komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, umfasst, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, wurde isoliert. Diese komplimentäre Desoxiribonucleinsäure wird in der Folge mit cDNA abgekürzt. Das erwähnte doppelsträngige DNA-Molekül wurde aus einem menschlichen T-Zellen-cDNA-genetischem Material oder Abschnitt mit der englischen Bezeichnung "human T-cellcDNA library" isoliert. Unter dieser englischen Bezeichnung versteht man eine Sammlung von Escherichia coli Bakterien oder Bakteriophagen lambda , welche die cDNA-Abschnitte oder Einfügungen enthält, die durch die Messenger-RNA (abgekürzt als MRNA) synthetisiert wurden, die aus menschlichen T-Zellen isoliert wurde.
Die Nucleotidsequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert oder ein Analoges oder eine Mutante desselben kodiert, wurde gefunden.
Die Sequenz des einen Stranges des DNA-Moleküls, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben kodiert, ist in Fig. 1a und b dargestellt und diese Sequenz umfasst die Nucleotide mit den Zahlen 115 bis einschliesslich 708.
Die Sequenz des einen Stranges, der ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase- Polypeptides, das in der Folge als hMnSOD-analoges bezeichnet wird oder eine Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, ist im wesentlichen ähnlich demjenigen Strang, der das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid, das in der Folge mit hMnSOD-polypeptid abgekürzt wird, kodiert.
Die Nucleotidsequenz des Präpeptides der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ist ebenfalls in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die Nucleotide der Zahlen 43 bis einschliesslich 114 kodieren dieses Präpeptid.
Die Methoden zur Herstellung der cDNA und zur Bestimmung der Sequenz der DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und sie werden in der Folge noch genauer beschrieben. Da jetzt die DNA-Sequenz aufgeklärt wurde, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, können ausserdem bekannte synthetische Verfahren angewandt werden, um DNA-Moleküle herzustellen, die Teile dieser Sequenz enthalten.
Übliche Kloning-vehikel, wie Plasmide, beispielsweise pBR322, oder Viren oder Bakteriophagen, beispielsweise lambda , können modifiziert oder hergestellt werden, indem man bekannte Arbeitsverfahren anwendet, die geeignet sind, um neue Kloning-vehikel herzustellen, welche eine cDNA enthalten, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase Polypeptid oder Analoge desselben oder Mutanten desselben, kodieren.
In ähnlicher Weise können derartige Kloning-vehikel so modifiziert oder so erzeugt werden, dass sie DNA-Moleküle enthalten, von denen ein Strang ein Segment enthält, welches die in Fig. 1a und b dargestellte Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist oder Segmente, die im wesentlichen ähnlich diesen dargestellten Segmenten sind. Die eingefügten DNA-Molekule können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden, einschliesslich einer enzymatischen oder chemischen Synthese.
Die erhaltenen Kloning-vehikel sind chemische Einheiten, die in der Natur nicht vorkommen und die nur durch moderne Technologie erzeugt werden können, die als Rekombination-DNA-Technologie bezeichnet wird. Vorzugsweise ist das Kloning-vehikel ein Plasmid, beispielsweise pMSE-4 oder pMS DELTA RB4. Diese Kloning-vehikel können in Zellen eingefügt werden, und zwar entweder in procaryotische Zellen, beispielsweise Bakterienzellen, wie zum Beispiel diejenigen von Escherichia coli, von Bacillus subtilis, und ähnliche Bakterienzellen, oder sie können in eukaryotische Zellen einverleibt werden, wie zum Beispiel in die Zellen von Hefe oder Säugetieren, indem man Arbeitstechniken anwendet, die für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, wie zum Beispiel eine Transformation, eine Transfektion und ähnliche Arbeitsweisen.
Diejenigen Zellen, in welche die Kloning-vehikel eingeführt sind, enthalten dementsprechend cDNA, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, wenn diese cDNA in dem Kloning-vehikel anwesend war oder sie werden eine DNA enthalten, welche einen Strang, und zwar einen gesamten Strang oder einen Teil des Stranges enthält, welcher die Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist, die in Fig. 1a und b dargestellt wird oder eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen ähnlich dieser Sequenz ist, wenn eine solche DNA in dem Kloning-vehikel anwesend war.
Die Zellen von Escherichia coli sind die bevorzugten Wirtzellen für die erfindungsgemässen Kloningvehikel. Als der im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugte auxotrophische Stamm der Escherichia coli ist der Stamm A1645, der bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt wurde, welcher das Plasmid pApoE-Ex2 enthält und welcher unter der ATCC Accession No. 39 787 hinterlegt ist. Alle Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection, die in den vorliegenden Unterlagen erwähnt werden, wurden in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag der International Anerkennung von hinterlegten Kulturen von Mikroorganismen durchgeführt.
Das A1645 wurde aus A1637 durch Selektion auf Gal<+>, d.h. durch Selektion auf die Fähigkeit, Galaktose abzubauen, erhalten und auch durch einen Verlust der Tetracyclin-resistenz. Es enthält immer noch Elemente der Phage lambda . Sein Phenotyp ist c600 r<-> m<+> gal<+> thr<-> leu<-> lacZ-bl ( lambda cI857 DELTA Hl DELTA BamHl N<+>).
A1637 wurde aus dem C600 erhalten, indem man Transposon, welches ein Gen für Tetracyclin-resistenz enthält, in das Galactose-Operon einführt und ausserdem Elemente der Phage lambda einfügt, einschliesslich derjenigen Elemente, die verantwortlich sind für die Synthese des cI Repressors. C600 kann bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 23 724 bezogen werden.
Die prototrophischen Stämme von Escherichia coli, welche ein hohes Ausmass der Expression des Polypeptides sogar dann ermöglichen, wenn sie in einem minimalen Medium gezüchtet werden, sind als Wirtzellen für die Expression des Gens, welches Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, noch mehr bevorzugt. Ein im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugter prototrophischer Stamm ist A4255. Der Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt.
Die erhaltenen Zellen, in die eine DNA eingefügt worden war, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, können behandelt werden, beispielsweise gezüchtet werden oder vermehrt werden, wie dies unter geeigneten Bedingungen für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, sodass die DNA die Expression der genetischen Information richtet, die durch die DNA kodiert wurde. Diese DNA dirigiert beispielsweise die Expression des hMnSOD-Polypeptides oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und die Zelle führt dementsprechend zur Expression von hMnSOD-Polypeptid oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und diese Produkte können dann gewonnen werden.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Superoxid-dismutase", bzw. die Abkürzung "SOD" ein Enzym oder ein Polypeptid, welche auf Superoxid oder freie Sauerstoffradikale als Rezeptor wirkt oder welche die folgende Dismutationsreaktion katalysiert:
2O2- + 2H<+ >-> O2 + H2O2
Der Ausdruck "Mangan-Superoxid-dismutase", bzw. die entsprechende Abkürzung "MnSOD", bedeutet in der vorliegenden Beschreibung irgend ein beliebiges Superoxid-dismutase Molekül, welches das chemische Element Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen enthält.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutase-Polypeptid", bzw. die entsprechende Abkürzung "hMnSOD" ein Polypeptid aus 198 Aminosäuren, von dem ein Teil der Aminosäuresequenz ln Fig. 1a und b dargestellt ist. Das Stickstoffende, also der N-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist.
Der Ausdruck "Polypeptid-Mangan-Komplex" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches ein menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid in einem Komplex mit Mangan in irgend einer chemischen Formel enthält und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Der Ausdruck "menschliche Mangan-Superoxid-dismutase" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptide in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Der Ausdruck "Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid umfasst, an welches an eines der beiden Enden oder an beide Enden der Aminosäuresequenz eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren gebunden sind.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "Analoges des Polypeptid-ManganKomplexes" ein Molekül, welches einen Polypeptid-Mangan-Komplex umfasst, wobei der Polypeptidanteil dieses Komplexes ein oder mehrere zusätzliche Aminosäuren umfasst, die an eines der beiden Enden oder an beide Enden des Polypeptides gebunden sind.
Unter dem Ausdruck "Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, das mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines der beiden ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, und zwar in Form eines Komplexes mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Unter dem Ausdruck "Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen identisch mit derjenigen des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, wobei sich diese Aminosäuresequenz jedoch von diesem Polypeptid durch ein oder mehrere Aminosäuren unterscheidet.
Unter dem Ausdruck "Mutante des Polypeptid-Mangan-Komplexes" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Unter dem Ausdruck "Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines dieser Polypeptide eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen ist und dabei dieser Komplex die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Die Mutanten des hMnSOD-Polypeptides und des hMnSOD, die einen Teil des Erfindungsgegenstandes darstellen, können hergestellt werden, indem man die DNA-Sequenz, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, mutiert, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 kodiert ist und das Carboxylende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz, durch die Nucleotide 706-708 kodiert ist.
Die DNA kann nach Methoden mutiert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind und es sei in diesem Zusammenhang beispielsweise auf die Veröffentlichung von Bauer et al., in Gene 37: 73-81 (1985) hingewiesen. Die mutierte Sequenz kann nach dem hier beschriebenen Verfahren in geeignete Expressions-vektoren eingefügt werden, und diese Expressions-vektoren können wieder in Zellen eingefügt werden, die dann so behandelt werden, dass die mutierte DNA die Expression der hMnSOD-Polypeptide-Mutanten und die Expression der hMnSOD-Mutanten dirigiert.
Man nimmt an, dass die enzymatisch aktive Form der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ein Protein ist, das mindestens zwei und möglicherweise vier identische Untereinheiten aufweist, von denen jede ungefähr 198 Aminosäuren in derjenigen Sequenz aufweist, die in Fig. 1a und b für die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht ist, wobei das Stickstoffende, also der N-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist.
Menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können von Zellen gebildet werden, in welche die DNA oder die cDNA, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ihre Analogen oder ihre Mutanten kodiert, eingebracht worden ist. Die menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können verwendet werden, um die Dismutation oder die einwertige Reduktion von Superoxidanionen in Anwesenheit von Protonen unter Bildung von Wasserstoffperoxid zu katalysieren und die entsprechende Reaktion ist anhand der folgenden Gleichung veranschaulicht:
EMI46.1
Pharmazeutische Präparate zur Anwendung in der Veterinärmedizin oder der Humanmedizin können auch hergestellt werden, die als Wirkstoff hMnSOD oder einen oder mehrere Analoge oder Mutanten der hMnSOD enthalten und vorzugsweise ausserdem ein geeignetes Trägermaterial. Derartige Trägermaterialien sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt.
Entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante desselben enthalten, können direkt verabreicht werden oder sie können mit Hilfe von weiteren Zusätzen zu entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die dann zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten oder tierischen Patienten geeignet sind. Entsprechende pharmazeutische Präparate können verwendet werden, um Entzündungen zu bekämpfen oder um Schäden zu vermindern, die von freien Sauerstoffradikalen bei der erneuten Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der auf eine Ischämie folgenden Reperfusion auftreten können oder bei einer Organtransplantation.
In diesen Fällen kann das hMnSOD oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben direkt, also ohne weitere Zusätze, oder in Form einer Zusammensetzung dem Durchspülungsmedium, also dem Perfusionsmedium, zugesetzt werden, mit dem ein isoliertes Organ durchspült wird, wobei dadurch Schädigungen des isolierten Organes durch sauerstoff-freie Radikale bei der Perfusion nach der Isolierung des Organes vermindert werden und somit die Überlebenszeit des isolierten Organes verlängert wird.
Des weiteren können entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben enthalten, verwendet werden, um neurologische Schäden zu vermindern, die bei der neuerlichen Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der Reperfusion anschliessend an eine Ischämie auftreten können und die entsprechenden pharmazeutischen Präparate können auch eingesetzt werden, um eine Missbildung der Bronchien und der Lunge, also eine Bronchial-pulmonar-dysplasie zu behandeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben in Bakterienzellen. Bei diesem Verfahren enthält die Bak terienzelle eine DNA Sequenz und sie ist in der Lage, eine Expression einer DNA Sequenz durchzuführen, die die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert. Bei diesem Verfahren belässt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Produktionsmedium. Das Produktionsmedium enthält als Zusatzstoff eine Menge an zweiwertigen Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration in diesen zweiwertigen Manganionen in dem Medium höher gehalten wird als 2 ppm.
Die Bakterienzelle kann irgend ein beliebiges Bakterium sein, in welches die DNA-Sequenz, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, eingefügt worden war, indem man Rekombinations-DNA-Techniken angewandt hatte. Dieses Bakterium muss zu einer Expression der DNA-Sequenz geeignet sein und zur Produktion des Proteinproduktes. Die geeigneten Bedingungen und das Produktionsmedium variieren je nach der Spezies und dem Stamm des Bakteriums.
Die Bakterienzelle kann die DNA-Sequenz, welche die Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben kodiert, in dem Körper eines Vektor-DNA-Moleküles enthalten, wie zum Beispiel eines Plasmides. Der Vektor oder das Plasmid wird durch Rekombinations-DNA-Techniken so aufgebaut oder konstruiert, dass er die Sequenz, welche die Superoxid-dismutase kodiert, an einer geeigneten Stelle in dem Molekül einverleibt hat.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli. Ein bevorzugter auxotrophischer Stamm von Escherichia coli ist A1645.
Ein bevorzugter prototrophischer Stamm von Escherichia coli ist A4255. Die erfindungsgemässen Zellen von Escherichia coli enthalten ein Plasmid, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMSE-4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmids wird in der Beschreibung der Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 2 beschrieben. Dieses Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No.53 250 hinterlegt.
Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMS DELTA RB4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmides ist in der Beschreibung und in den Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Plasmid kann ausgehend von pSOD beta T-11, welches bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt ist, aufgebaut werden.
Gemäss speziellen Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung wird ein enzymatisch aktives Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, der das Plasmid pMSE-4 enthält, sowie durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, die das Plasmid pMS DELTA RB4 enthalten.
Das geeignete Produktionsmedium für die Bakterienzelle kann irgend eine Art eines annehmbaren Zuchtmediums sein, wie zum Beispiel ein Casein-hydrolysat-Medium oder ein Luria-Brühe-Medium, welches in der Folge auch als LB-Medium abgekürzt wird. Das letztgenannte Medium ist dabei bevorzugt.
Die geeigneten Züchtungsbedingungen hängen von dem Stamm der Escherichia coli und dem Plasmid, das diese enthält, ab. Beispielsweise wird der Stamm Escherichia coli A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 42 DEG C induziert und bei dieser Temperatur während etwa 1-5 Stunden belassen. Die geeigneten Bedingungen bezüglich der Züchtungstemperatur, der Züchtungszeit, des Rührens und der Belüftung, sowohl bei der Anzucht des Züchtungsmateriales als auch für die Züchtung der Kulturen auf eine geeignete Zelldichte vor der Produktionsphase, sowie ferner auch für die Aufrechterhaltung der Züchtung während des Produktionszeitraumes können variieren und all diese möglichen Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend.
Die Konzentration der zweiwertigen Manganionen, also der Mn<+><+> in dem Medium, die nötig ist, um die enzymatisch aktive Mangan-Superoxid-dismutase herzustellen, variiert mit der Art des angewandten Mediums.
Es zeigte sich, dass bei einem Zuchtmedium des LB-Typs Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen im Bereich von 150 ppm bis 750 ppm wirksam sind. Es ist bevorzugt, dass in allen komplexen Typen der Wachstumsmedien die Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Medium im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm liegt.
Die speziellen Bestandteile für einen geeigneten Stamm, das Züchtungsmedium, das Impfmedium und das Produktionsmedium können variieren und all diese Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben oder eines Mutanten derselben, und zwar ausgehend von Bakterienzellen, welche diese enthalten. Die Zellen werden zuerst behandelt, um eine Proteinfraktion zu gewinnen, welche Proteine enthält, die in den Zellen anwesend sind und zu diesen Proteinen gehört die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben. Dann wird die Proteinfraktion entsprechend behandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zunächst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand abzutrennen und die löslichen Proteine werden dann gewonnen. Die so gewonnenen löslichen Proteine werden dann behandelt um eine Fraktion der löslichen Proteine abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält und diese Fraktion wird gewonnen. Die entsprechende Behandlung kann beispielsweise eine Ausfällung sein. Die Fraktion wird dann weiterbehandelt um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen.
In der Folge werden speziell bevorzugte Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Zuerst werden die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium isoliert und in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist. Die Zellen werden dann aufgebrochen und abzentrifugiert.
Das überstehende Material wird abgetrennt und während 30 bis 120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von etwa 55-65 DEG C erhitzt, vorzugsweise während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C, und speziell bevorzugt während einer Stunde auf 60 DEG C. Anschliessend an diese Erhitzungsphase wird dann auf eine Temperatur von weniger als 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 4 DEG C. Wenn sich während dieses Kühlvorganges ein Niederschlag gebildet hat, dann wird dieser entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren und dann wird das gekühlte überstehende Material gegen einen geeigneten Puffer dialysiert.
Vorzugsweise wird das gekühlte überstehende Material durch eine Ultrafiltration dialysiert, indem man eine Filtrationsmembran verwendet, die kleiner als 30K ist, und speziell bevorzugt 10K ist. Als Beispiele für einen geeigneten Puffer sei ein 2 MM Kaliumphosphatpuffer genannt, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Nach dieser Dialyse oder gleichzeitig mit dieser Dialyse kann das gekühlte überstehende Material gegebenenfalls auf ein geeignetes Volumen konzentriert werden. Beispielsweise hat sich eine Konzentration auf 0,03 des ursprünglichen Volumens des überstehenden Materiales als geeignet herausgestellt.
Anschliessend wird das Material auf eine Anionenaustauscher enthaltende Chromatographiesäule aufgebracht, und man eluiert dieses Retentat mit einer geeigneten Pufferlösung, beispielsweise einer Lösung eines 20 mM Phosphatpuffers, die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Die Fraktionen des eluierten Materiales, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen, miteinander vereinigt und gegen eine etwa 40 mM Kaliumacetatlösung eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert.
Diese vereinigten und dialysierten Fraktionen werden dann auf eine mit Kationenaustauscher gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen und man eluiert mit einem linearen Gradienten von etwa 40 mM Kaliumacetatlösung bis etwa 200 mM Kaliumacetatlösung, wobei diese Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufweisen. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt. Gegebenenfalls können dann die vereinigten Peakfraktionen gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung, die etwa 10 mM an Kaliumphosphat ist und die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gereinigte menschliche Mangan-superoxid-dismutase oder Analoge derselben oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind und wobei man im vorliegenden Zusammenhang unter dem Ausdruck "gereinigt" versteht, dass die fraglichen Produkte im wesentlichen frei von anderen Substanzen menschlichen Ursprungs sind.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Analoges der menschlichen Mangan-superoxiddismutase, das mindestens zwei Polypeptide aufweist, von denen mindestens eines der Polypeptide diejenige Aminosäuresequenz besitzt, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert wird und das Carboxylatende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert wird und wobei in dieser Aminosäuresequenz ein zusätzlicher Methioninrest an das Stickstoffende der Aminosäuresequenz gebunden ist. Dieses Analoge der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase wird in der Folge mit Met-hMnSOD abgekürzt, wobei in dieser Abkürzung "Met" den zusätzlich gebundenen Methioninrest veranschaulicht.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart dieses Produktes weist dieses gereinigte Met-hMnSOD eine spezifische Aktivität von mindestens 3500 Einheiten/mg auf.
Die vorliegende Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert.
Diese Beispiele sollen lediglich zu einem noch besseren Verständnis des Erfindungsgegenstandes führen, sie sollen jedoch den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Es sei ferner darauf hingewiesen, dass diese Beispiele keine detaillierten Erläuterungen der üblichen Methoden enthalten, die bei dem Aufbau von Vektoren, der Einfügung von Genen, die für Polypeptide kodiert sind, in derartige Vektoren oder die Einführung der entsprechenden Plasmide in Wirte, bzw. Wirtzellen, betreffen. Die Beispiele enthalten ferner auch keine detaillierte Beschreibung üblicher Methoden, die angewandt werden, um Polypeptide zu testen, die durch derartige Wirt-Vektorsysteme produziert werden oder um die Identität derartiger Polypeptide durch Aktivitäts-Färbeverfahren von isoelektrisch fokussierenden Gelen, die in der Folge als IEF Gele bezeichnet werden, zu bestimmen.
Derartige Arbeitsmethoden sind nämlich für den Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt und sie sind in vielen Publikationen näher beschrieben, wobei hier als Beispiel auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen sei:
T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sombrook, "Molecular Cloning", ein Laboratoriumshandbuch des Cold Spring Harbor Laboratoriums, New York, 1982.
J.M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969), sowie C. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971).
Beispiel 1
Um die MnSOD-cDNA-Klone zu identifizieren, wurden gemischte Oligormerproben synthetisiert, und zwar in Übereinstimmung mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz, die in zwei weiter vorne bereits genannten Veröffentlichungen beschrieben ist, und zwar in der Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M., in dem Buch Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) und in der Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984).
5 min -Probe - 30-mer-sequenz von AA15-AA24 (siehe diese beiden Veröffentlichungen.
EMI58.1
EMI59.1
3 min -Probe - 32-mer-sequenz von AA179-AA189 (siehe die zweite der beiden genannten Veröffentlichungen)
EMI59.2
Die 5 min -Probe besteht aus 30 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 15-24 des reifen MnSOD.
Die 3 min -Probe besteht aus 32 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 179-189 des reifen MnSOD.
Die 5 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 36 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben veranschaulicht wird.
Die 3 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 16 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben gezeigt ist.
Wenn in dem oben angegebenen Schema mehr als ein Nucleotid in einer vorgegebenen Position gezeigt wird, dann wurde der entsprechende DNA-Strang unter Ver wendung von äquimolaren Mengen jedes der beiden dargestellten Nucleotide synthetisiert und es handelt sich dementsprechend um eine gemischte Probe.
Die 5 min -Probe wurde verwendet um 300 000 Plaques einer T-Zelle-cDNA-genetischen Abschnittes (mit der englischen Bezeichnung T-cell cDNA library), der in einer lambda -gt-10-Vector kloniert ist, zu screenen. Die Hybridisierung an Phagen-plaque-replicas, die auf Nitrozellulosefiltern immobilisiert sind, wurde nach Standard Arbeitsverfahren durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die unmittelbar vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von Maniatis et al. hingewiesen, wobei der Unterschied zu dem dort beschriebenen Verfahren darin bestand, dass die Hybridisierung bei 50 DEG C in 8 x SSC während 16 Stunden durchgeführt wurde. Die Filter wurden dann bei 50 DEG C mit 5 x SSC und 0,1% SDS gewaschen. Drei positive Plaques wurden isoliert und diese wurden als Phi MS8, bzw. als Phi MS1, bzw. als Phi MSlJ bezeichnet.
Das EcoRI verdaut die DNA von Phi MS8 und die DNA von Phi MSL und daraus sieht man, dass diese beiden Produkte cDNA-Einfügungen, die auch als cDNA-Inserts bezeichnet werden, aufweisen, die etwa 800 bp lang sind und die beide mit dem 5 min und dem 3 min Oligonucleotid-proben hydridisieren.
Das Phi MSlJ trug nur die cDNA-Einfügung oder das cDNA-Insert einer Menge von 450 bp, welches nur mit der 5 min -Endprobe hybridisiert.
Die EcoRI-Inserts der drei Phagen-klone wurden in die EcoRI Stelle von pBR322 subkloniert und man erhielt dabei jeweils pMS8-4, bzw. pMS1-4, bzw. pMS1J.
Die Restriktionsanalyse und die Hybridisierung mit den 5 min und den 3 min Oligonucleotid-proben ergaben ähnliche Muster, die auch als Pattern bezeichnet werden, für die beiden Produkte pMS8-4 und pMS1-4.
Die in Fig. 5 veranschaulichte Restriktions-karte zeigt die 5 min -> 3 min Orientierung, und diese wurde für beide Plasmide deduziert.
Die Sequenz des cDNA-Inserts von pMS8-4 ist in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die vorher-gesagte Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der Aminosäuresequenz der am Beginn dieses Beispiels genannten Veröffentlichung von Barra et al. dahingehend, dass an drei Stellen Glu anstelle von Gln aufscheint, und zwar an den Stellen AA 42, 88, 108 und dahingehend, dass zwei zusätzliche Aminosäuren, nämlich Gly und Trp zwischen AA123-124 aufscheinen.
Die Sequenzanalyse von pMS1-4 und pMS1J zeigte, dass drei MnSOD-Klone unabhängig abgeleitet wurden und diese Sequenzanalyse bestätigte die Unterschiede zu der früher veröffentlichten Aminosäuresequenz.
Die Sequenz oberhalb des Lysines der Stickstoffendgruppe, also des N-terminalen Lysines der reifen MnSOD ermöglicht die Vorhersage einer Präpeptid Sequenz von 24 Aminosäuren.
Beispiel 2
Aufbau des Plasmides, das die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt.
Das Plasmid, welches die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt, wird in der Folge auch als Amp<R>-menschliche MnSOD-Expression Plasmid bezeichnet und als pMSE-4 abgekürzt.
Das Ausgangsprodukt für den Aufbau oder die Konstruktion dieses pMSE-4 ist das Plasmid pMS8-4, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Das Plasmid pMS8-4, welches menschliche MnSOD-cDNA auf einer EcoRI-Einfügung, die auch als EcoRI-Insert bezeichnet wird, enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI verdaut. Das grosse Fragment wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomeren verbunden, wie dies in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das dabei erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS8-NN, das ebenfalls in Fig. 2 dargestellt ist, enthält den kodierenden Bereich für die reife oder endgültige MnSOd, die in der englischsprachigen Literatur als mature MnSOD bezeichnet wird, und vor diesem Bereich befindet sich ein ATG-Initiations-codon. Das oben genannte Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, die Enden wurden mit dem Klenow-fragment der Polymerase I gefüllt und weiter mit NdeI gespalten.
Das kleine Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält, wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI und StuI behandelt wurde.
Das genannte pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 beschrieben ist, die am 5. März 1986 veröffentlicht wurde. Alles was dort geoffenbart ist, trifft auch im vorliegenden Fall zu.
Dadurch wurde das Plasmid pMSE-4 erzeugt, welches einen die MnSOD kodierenden Bereich enthält, vor dem sich die cII-riosomale Bindungsstelle befindet und unter der Kontrolle des lambda PL-Promoters.
Das Plasmid pMSE-4 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt. Alle Arbeitsmethoden, die bei dem oben beschriebenen Verfahren angewandt werden, sind im wesentlichen die gleichen, wie diejenigen, die in der Veröffentlichung von Maniatis et al., die vor dem Beispiel 1 genannt ist, beschrieben sind.
Beispiel 3
Expression der rekombinanten menschlichen MnSOD
Das Plasmid pMSE-4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingefügt. Anschliessend wurde der Escherichia coli Stamm 4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 32 DEG C in einem Luria-Brühe-Medium gezüchtet, wobei das Medium 100 mu g/ml Medium an Ampicillin enthielt. Diese Züchtung wurde so lange durchgeführt, bis die optische Dichte, abgekürzt als "OD" bei 600 nm 0,7 betrug.
Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeitabständen wurden Proben genommen und diese wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelen getrennt. Diese Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel Electrophorese wird in der Folge mit "SDS-PAGE" abgekürzt. Aus dieser Gel Electrophorese war ersichtlich, dass der Spiegel an dem gebildeten menschlichen MnSOD bis zu 120 Minuten nach der Induktion anstieg. Zu diesem Zeitpunkt machte das recombinante MnSOD-Protein 27% der gesamten Zellproteine aus. Die entsprechende Bestimmung der Zellproteine wurde durch ein Scanning mit Gel durchgeführt, das mit Coomassie-Blau gefärbt war.
Die Ultraschallbehandlung der Proben während 90 Sekunden mit einem W-375-Ultraschallgerät und die Aufteilung der Proteine in lösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als s-Fraktionen bezeichnet werden und in unlösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als p-Fraktionen bezeichnet werden, erfolgte durch Zentrifugieren unter Anwendung von 10 000 g während eines Zeitraumes von 5 Minuten. Dabei zeigte es sich, dass die geprüfte Menge der gebildeten rekombinanten MnSOD nicht löslich war.
Die induzierte lösliche Proteinfraktion enthielt nur etwas mehr an der MnSOD-Aktivität als die Proteinfraktion des nicht induzierten Parallelversuches. Diese Tests wurden nach den Standardmethoden durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von McCord et al. hingewiesen.
Offensichtlich ist ein Teil der MnSOD, die sich in der löslichen Fraktion befindet, inaktiv. Dies legt nahe, dass die grösste Menge der menschlichen MnSOD, die unter den Bedingungen dieses Beispiels produziert wird, tatsächlich inaktiv ist.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird der Einfluss der Konzentration an zweiwertigen Manganionen auf die Löslichkeit und die Aktivität der gebildeten MnSOD untersucht.
Es wurden zweiwertige Manganionen, also Ionen Mn<+><+> in ansteigenden Konzentrationen zugegeben, bis ein Gehalt von 450 ppm (450 Teilen pro Million) in dem Wachstumsmedium erreicht war, in welchem der Escherichia coli Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, gezüchtet wurde. Die Zugabe der Manganionen erfolgte vor einer zwei Stunden dauernden Induktion bei 42 DEG C bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,7 und der Zusatz der Manganionen hatte keinen nachteiligen Einfluss auf die Gesamtausbeute an dem menschlichen MnSOD.
Nach der Ultraschallbehandlung wurden die löslichen Proteinfraktionen (s) und die nicht löslichen Proteinfraktionen (p) einer Gelelektrophorese auf eine Natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamidgel unterworfen. Diese Gelelektrophorese zeigte, dass die Löslichkeit des rekombinanten Proteines anstieg, wenn die Löslichkeit der zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium gesteigert wurde.
Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 1
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Mn<++> in ppm im Zuchtmedium:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an gebildeter menschlicher MnSOD:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge des löslichen bakteriellen Proteines:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Pro-
teine:
<tb> <SEP>0 <SEP>30,6 <SEP>7,2 <SEP>30
<tb> <SEP>50 <SEP>72,7 <SEP>15,4 <SEP>241
<tb> <SEP>100 <SEP>78,0 <SEP>16,9 <SEP>356
<tb> <SEP>150 <SEP>82,9 <SEP>18,8 <SEP>606
<tb> <SEP>200 <SEP>82,0 <SEP>20,8 <SEP>338
<tb> <SEP>250 <SEP>79,2 <SEP>20,4 <SEP>380
<tb> <SEP>300 <SEP>80,8 <SEP>20,3 <SEP>381
<tb> <SEP>450 <SEP>89,2 <SEP>22,4 <SEP>323
<tb></TABLE>
Die in der Tabelle 1 angeführte MnSOD-Aktivität wurde nach demjenigen Verfahren getestet, das in der Veröffentlichung von McCord et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Wie man aus den in der Tabelle 1 angeführten Daten sieht, ist ein Zusammenhang zwischen ansteigenden Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium und der ansteigenden Löslichkeit der MnSOD festzustellen. Man sieht aus der Tabelle ferner, dass offensichtlich die optimale Konzentration in dem Medium bei 150 ppm an zweiwertigen Manganionen liegt. Die entsprechenden Werte sind auch graphisch in Fig. 3 veranschaulicht und auch dort ist sehr deutlich zu sehen, dass die höchste spezifische Aktivität pro mg des löslichen Proteines erreicht wird, wenn die Konzentration an Manganionen in dem Medium 150 ppm beträgt.
Ausserdem aktivierten erhöhte Mangankonzentrationen in dem Zuchtmedium das früher inaktive lösliche Enzym. Lösliche Proteinfraktionen von induzierten Kulturen, die bei diesen Mangangehalten gezüchtet wurden, zeigten einen bis zu 60-fachen Anstieg in der SOD Aktivität im Vergleich zu löslichen Proteinfraktionen von nicht induzierten Kulturen, die bei gleichen Mangangehalten in der Kultur gezüchtet wurden.
Die Aktivitätsfärbung von isoelektrisch fokussierenden Gelen, also sogenannten IEF Gelen, wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in der Veröffentlichung von Beauchamp et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Diese Färbetechnik zeigte, dass viele Formen der rekombinanten MnSOD identisch mit denjenigen der nativen menschlichen Leber-MnSOD waren.
Die Ergebnisse, die für die Produktion von menschlicher MnSOD durch den Escherichia coli Stamm A1645, der das Plasmid pMSE-4 enthielt, erzielt wurden, waren ähnlich denjenigen Ergebnissen, die oben beschrieben sind.
Beispiel 5
Herstellung des Tet<R>-menschlichen MnSOD-Expressions- Plasmides.
Das Tet<R>-menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Expressions-Plasmid wird in der Folge mit pMS DELTA RB4 abgekürzt. Der Tet<R>-Expressionsvektor mit der Bezeichnung p DELTA RB, wurde aus pSOD beta 1T-11 hergestellt, indem man dieses einer vollständigen Verdauung mit dem Restriktionsenzym EcoRI unterwarf, worauf dann eine teilweise Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI erfolgte.
Das pSOD beta 1-T-11 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt worden.
Das verdaute Plasmid wurde mit dem synthetischen Oligomer der Struktur
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
gebunden und man erhielt so das p DELTA RB des lambda PL Promoters.
Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches cII-ribosomale Bindungsstellen und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzymes enthält, wurde in die einzige EcoRI Stelle von p DELTA RB eingefügt, also insertiert. Das so erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von lambda PL und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin.
Das hier beschriebene Verfahren ist durch Fig. 4 veranschaulicht, in welcher oben links das Ausgangsprodukt pSOD beta 1T-11 veranschaulicht wird, einschliesslich der Stellen, wo die Spaltung mit den Restriktionsenzymen erfolgt, wobei das dabei entstehende grosse Fragment dann an den synthetischen Linker, nämlich das oben genannte synthetische Oligomere, gebunden wird. Auch das so hergestellte Endprodukt, nämlich das Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 ist in dieser Fig. 4 unten in der Mitte dargestellt.
Beispiel 6
Expression von menschlichem MnSOD durch das Plasmid PMS DELTA RB4
Das Plasmid pMS DELTA RB4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingeführt.
Man liess die Kulturen bei 32 DEG C in einer Luria-Brühe wachsen, welche verschiedene Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen enthielt, bis eine optische Dichte bei 600 nm von 0,7 erreicht wurde.
Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeiträumen wurden Proben genommen und diese Proben wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen untersucht.
Es zeigte sich, dass der Gehalt an menschlichem MnSOD in der Induktionszeit bis zum Zeitraum von 120 Minuten anstieg. Zu diesem Zeitpunkt betrug das menschliche MnSOD etwa 15% der gesamten Zellproteine, wie dies durch ein Scanning festgestellt werden konnte, das unter Verwendung von einem mit Coomassie-Blau gefärbtem Gel durchgeführt wurde.
Unabhängig von der Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Wachstumsmedium war das indu zierte MnSOD löslich. Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen, die im Beispiel 4 im Zusammenhang mit der Untersuchung des Amp<R>-Plasmides mit der Bezeichnung pMSE-4 gemacht wurden.
Auch in diesem Beispiel waren jedoch die maximale SOD Aktivität und das Ausmass der Expression, also der Expressionsspiegel, abhängig von der Menge an zweiwertigen Manganionen, die zur Verfügung gestellt wurden.
Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 2
<tb>SubHead Col 01 to 04 AL=L: MnSOD-Expression in E.Coli A4255 (pMS DELTA RB4)
<tb>
<tb>Title: Gehalt an Mn<++> im Zuchtmedium in ppm
<tb>Title: Prozentsatz an löslichem menschlichen MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an löslichen Bakterienproteinen
<tb>Title:
Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Proteine
<tb> <SEP>42 DEG DEG <SEP>32 DEG DEG <SEP>42 DEG DEG
<tb> <SEP>0 <SEP>10,9 <SEP>8,0 <SEP>23
<tb> <SEP>50 <SEP>19,8 <SEP>8,0 <SEP>227
<tb> <SEP>100 <SEP>16,0 <SEP>8,0 <SEP>241
<tb> <SEP>200 <SEP>17,0 <SEP>10,0 <SEP>278
<tb> <SEP>300 <SEP>16,0 <SEP>9,3 <SEP>238
<tb></TABLE>
Beispiel 7
Reinigung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-superoxid-dismutase, die durch die rekombinante Gentechnologie hergestellt wurde.
Der Escherichia coli Stamm A4255 in dessen Zellen das Plasmid pMS DELTA RB4 aufgenommen worden war, wurde in Luria-Brühe gezüchtet, der 750 ppm an Mangan ionen, bezogen auf diese Brühe, zugesetzt worden waren. Die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 32 DEG C bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 17,0 erreicht hatte. Die Induktion der Expression der menschlichen MnSOD wurde durchgeführt, indem man während zwei Stunden lang eine Temperaturerhöhung auf 42 DEG C vornahm. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 43,0 erreicht. Die Zellen wurden aus der Kultur gewonnen, indem man zentrifugierte und die so isolierten Zellen wurden dann in 0,2 des ursprünglichen Volumens an einem 50 mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,8 aufwies und 250 mM an Natriumchlorid enthielt, erneut suspendiert.
Die Bakterien wurden dann durch ein zweimaliges Hindurchleiten durch eine Vorrichtung mit der Bezeichnung Dynomill aufgebrochen und dann wurde zentrifugiert und die Zellbruchstücke wurden verworfen.
Das so gewonnene überstehende Material wurde eine Stunde lang auf 60 DEG C erhitzt und dann auf 4 DEG C abgekühlt und das darüber stehende Material einer Klärung unterworfen. Das geklärte überstehende Material wurde dann auf 0,03 seines ursprünglichen Volumens konzentriert und gegen einen 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 dialysiert, und zwar unter Ver wendung einer Ultrafiltrationseinrichtung der Bezeichnung Pelicon-Ultrafiltration Unit, die mit einer 10K Membran ausgestattet war.
Das so erhaltene rohe Enzympräparat wurde auf eine DE52-Säule aufgebracht, gründlich mit einem 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 gewaschen und dann erfolgte die Elution mit einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8.
Diejenigen Fraktionen, welche das Enzym enthielten, wurden miteinander vereinigt und dann gegen eine 40 mM Lösung von Kaliumacetat eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. Anschliessend wurde das Material auf eine CM52-Säule aufgebracht und die Elution wurde durchgeführt, indem man einen Lineargradienten von 40 mM Kaliumacetat bis 200 mM Kaliumacetat anwandte, wobei die Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufwiesen.
Diejenigen Peakfraktionen, die das menschliche MnSOD enthielten, wurden miteinander vereinigt und man dialysierte gegen Wasser. Anschliessend wurde das Enzympräparat so eingestellt, dass es sich in einem 10 mM Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 befand und dieses Produkt wurde dann bei -20 DEG C gefroren.
Das durch diese rekombinante Gentechnologie gewonnene menschliche MnSOD war reiner als 99%ig und die spezifische Aktivität dieses Produktes betrug etwa 3500 Einheiten/mg.
Die Gesamtausbeute bei diesem Reinigungsverfahren betrug etwa 30%.
Diese Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellt.
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Tabelle 3
<tb>SubHead Col 01 to 05 AL=L: Reinigung des durch rekombinante Gentechnologie gewonnenen menschlichen MnSOD
<tb>Title: Reinigungsstufe
<tb>Title: Gesamtmenge an Proteinen in g
<tb>Title: Ausbeute in g
<tb>Title: an MnSOD in %
<tb>Title:
Spezifische
Aktivität in
Einheiten/mg
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der Behandlung mit der Dynomill <SEP>100,0 <SEP>11,9 <SEP>100,0 <SEP>417
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der
Erhitzung auf 60 DEG C <SEP>24,0 <SEP>8,2 <SEP>68,9 <SEP>1197
<tb> <SEP>Retentat nach der Ultrafiltration mit der Peliconvorrichtung <SEP>20,0 <SEP>7,5 <SEP>63,0 <SEP>1350
<tb> <SEP>Eluat aus der DE52-Säule <SEP>7,3 <SEP>5,7 <SEP>48,0 <SEP>2732
<tb> <SEP>Eluat aus der CM52-Säule <SEP>4,2 <SEP>4,2 <SEP>35,3 <SEP>3500
<tb></TABLE>
Die in der Tabelle 3 angegebenen Werte beziehen sich auf das gereinigte Enzym, das unter Verwendung eines 15 Liter fassenden Gärbehälters hergestellt wurde.
Die Untersuchung der Aminosäuresequenz des gereinigten Enzymes zeigte, dass ein zusätzlicher Methioninrest am Stickstoffende der Aminosäuresequenz anwesend war, und zwar im Vergleich zu der bekannten Aminosäuresequenz des aus menschlichen Zellen gewonnenen MnSOD, die in der im Beispiel 1 zitierten Veröffentlichung von Barra et al. beschrieben ist.
Der Metallgehalt des durch die rekombinante Gentechnologie hergestellten MnSOD wurde durch Atomabsorption bestimmt und es zeigte sich, dass etwa 0,77 Atome an Mangan pro Enzymuntereinheit vorhanden sind. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit den entsprechenden Ergebnissen, die von McCord et al. in dem weiter vorne genannten Buch "Superoxide und Superoxid-dismutase" veröffentlicht sind.
Die vorliegenden Unterlagen basieren auf einer continuation-in-part Anmeldung der USA Anmeldung Serial no. 801 090, die am 22. November 1985 eingereicht wurde, und es wird auf die dort gemachten Aussagen Bezug genommen.
Ferner wird Bezug genommen auf alle Offenbarungen, die in den Veröffentlichungen genannt sind, welche in der vorliegenden Beschreibung erwähnt sind.
Superoxid-dismutase, die in der Folge als SOD abgekürzt wird und das Phänomen der freien Sauerstoffradikale, also der Radikale der Formel (O2-) wurden im Jahre 1948 von McCord entdeckt und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Fridovich, I, im J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969) verwiesen.
Superoxid Radikale und andere hochreaktive Sauerstoffarten werden in jeder atmenden Zelle als Nebenprodukt eines oxidativen Stoffwechsels gebildet und es hat sich gezeigt, dass diese eine starke Schädigung bei einer grossen Anzahl von makromolekularen Komponenten und Zellkomponenten hervorrufen. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffent lichung von Fridovich, I. in "Advances in Inorganic Biochemistry", Verlag Eichhorn, G.L. und Marzilli, L.G. (Elsevier/North Holland, New York), Seiten 67-90 (1979) und auf die Veröffentlichung von Freeman, B.A. und Crapo, J.D. in "Laboratory Investion" 47:412-26 (1982) verwiesen.
Eine Gruppe an Metalloproteinen, die als Superoxid-dismutasen bekannt sind, katalisieren die oxidative Reduktionsreaktion von freien Sauerstoffradikalen nach dem folgenden Reaktionsmechanismus
2O2- + 2H<+ >-> H2O2 + O2
Diese Superoxid-dismutasen stellen also einen Abwehrmechanismus gegen die Toxizität des Sauerstoffes dar.
Es gibt verschiedene bekannte Formen von Superoxid-dismutasen, die unterschiedliche Metalle und unterschiedliche Proteine enthalten. Zu den Metallen, die in diesen Superoxid-dismutasen enthalten sind, gehören Eisen, Mangan, Kupfer und Zink. Alle bekannten Formen der Superoxid-dismutasen katalisieren die gleiche Reaktion. Diese Enzyme werden in verschiedenen Gruppen der Evolutionsreihe gefunden.
Superoxid-dismutasen, die Eisen enthalten, sind hauptsächlich in prokaryotischen Zellen anzutreffen.
Superoxid-dismutasen, die Kupfer und Zink enthalten, werden in praktisch allen eukaryotischen Organismen gefunden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Steinman, H.M. in "Superoxide Dismutase", Verlag Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), Seiten 11-68 (1982) verwiesen.
Superoxid-dismutasen, die Mangan enthalten, wurden in Organismen gefunden, die von Mikroorganismen bis zu menschlichen Lebewesen reichen.
Jedes biologische Makromolekül kann das Produkt sein, das durch überflüssige Superoxid-Radikale beschädigt wird und deshalb hat man sich für die therapeutischen Möglichkeiten der Verwendung von Superoxid dismutase bereits interessiert. In der wissenschaftlichen Literatur wird vorgeschlagen, dass Superoxid-dismutase in einem weiten Bereich von klinischen Anwendungen nützlich sein kann. Zu diesen klinischen Anwendungen gehört die Verhinderung einer Onkogenese, also die Verhinderung einer Geschwürsbildung, und die Verhinderung der Bildung von Tumoren, sowie ferner eine Verminderung der cytotoxischen und cardiotoxischen Wirkungen von Antikrebsmitteln. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Oberley, L.W. und Buettner, G.R. in Cancer Research 39:1141-49 (1979) verwiesen.
Weitere Einsatzgebiete sind die Schützung von ischämischen Geweben, also von blutleeren Geweben, und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Roy, R.S. in Can. J. Physiol. Pharma, 60:1346-52 (1982) verwiesen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Schützung von Spermatozoen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Alvarez, J.G. und Storey, B.T. in Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983) hingewiesen. Ausserdem besteht ein Interesse daran, den Einfluss von Superoxid-dismutase auf den Alterungsprozess zu untersuchen und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Talmasoff, J.M., Ono, T. und Cutler, R.G. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2777-81 (1980) hingewiesen.
Die Erforschung der therapeutischen Möglichkeiten von menschlicher Superoxid-dismutase war bisher hauptsächlich durch die begrenzten, zur Verfügung stehenden Mengen dieses Produktes beschränkt.
Superoxid-dismutase ist auch deshalb von Interesse, weil sie entzündungshemmende Eigenschaften besitzt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Huber, W. und Menander-Huber, K.B. in Clinics in Rheum. Dis. 6:465-87 (1980) hingewiesen.
Es wurde festgestellt, dass von Rindern stammende Superoxid-dismutase (Orgotein) entzündungshemmende Eigenschaften besitzt und derzeit ist diese in bestimmten Teilen Europas als pharmazeutisches Präparat zur Anwendung am Menschen im Handel erhältlich. Dieses Produkt ist auch in den Vereinigten Staaten als pharmazeutisches Produkt zur veterinärmedizinischen Anwendung erhältlich und es wird insbesondere zur Behandlung von entzündeten Sehnen bei Pferden eingesetzt. Aber auch das Ausmass, in dem Orgotein zur Verfügung steht, ist begrenzt. Nach den bisher bekannten Verfahren wurde dieses Produkt aus Rinderzellen oder anderen tierischen Zellen gewonnen, aber diese Arbeitsverfahren sind drastischen Einschränkungen unterworfen und das so erhaltene Orgotein kann bei Menschen allergische Reaktionen hervorrufen, weil dieses Produkt nicht menschlichen Ursprungs ist.
Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase, die in der Folge als CuZn SOD abgekürzt wird, ist die am häufigsten untersuchte und am besten beschriebene Form der verschiedenen Formen der Superoxid-dismutase.
Die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid dismutase ist ein dimeres Metallisch-O-Protein, das aus identischen nicht kovalent gebundenen Untereinheiten aufgebaut ist, wobei jede dieser Untereinheiten ein Molekulargewicht von 16 000 Dalton aufweist und ein Atom Kupfer und ein Atom Zink enthält. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Hartz, J.W. und Deutsch, H.F. im J. Biol. Chem. 247:7043-50 (1972) verwiesen. Jede dieser Untereinheiten ist aus 153 Aminosäuren zusammengesetzt und die Aminosäuresequenz wurde ebenfalls bereits aufgeklärt.
Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. und Deutsch, H.F., in Biochemistry 19:2310-16 (1980), sowie auf die Veröffentlichung von Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. und Bossa, F. in FEBS Letters 120:53-56 (1980) hingewiesen.
Die komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, die in der Folge mit cDNA abgekürzt wird, welche die menschliche Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase kodiert, wurde kloniert. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2808-11 (1982) verwiesen. Die vollständige Aminosäuresequenz der geklonten DNA wurde auch bereits aufgeklärt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. und Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5465-69 (1983) hingewiesen.
Ausserdem wurden auch schon die Expressions-vektoren beschrieben, welche eine DNA enthalten, die für Superoxid-dismutase kodiert ist und ferner wurde auch die Herstellung und Gewinnung von Superoxid-dismutase in Bakterien bereits beschrieben. Es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 131 843 A1 verwiesen, die am 23. Januar 1985 veröffentlicht wurde und die der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 107 717.5 entspricht, welche am 3. Juli 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität der am 15. Juli 1983 eingereich ten USA Anmeldung Serial No. 514 188. Des weiteren sei auf die Veröffentlichung von Hallewell, et al., in Nucleic Acids Res. 5, (1985) hingewiesen.
Des weiteren ist die Expression einer Superoxid-dismutase-DNA und die Herstellung von Superoxid dismutase in Hefe ebenfalls bereits beschrieben worden und es sei in diesem Zusammenhang auf die europäische Patentveröffentlichung 0 138 111 A1, die am 24. April 1985 veröffentlicht wurde, hingewiesen, welche der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 111 416.8 entspricht, die am 25. September 1984 eingereicht wurde, und zwar unter Beanspruchung der Priorität vom 3. Oktober 1983 der USA Patentanmeldung Serial No. 538 607 und der Priorität vom 11. Mai 1984 der USA Patentanmeldung Serial No. 609 412.
In jüngster Zeit wurde auch die Genstelle für CuZn SOD auf dem menschlichen Chromosom 21 beschrieben und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung im EMBO Journal, Band 4, Nr. 1, Seiten 77-84 (Januar 1985) hingewiesen. Die neuesten Entwicklungen im Zusammenhang mit der Kupfer-Zink-Superoxid-dismutase wurden in dem Abstract der vierten internationalen Konferenz über Superoxide und Superoxid-dismutase zusammengefasst, die in Rom, Italien, im Zeitraum vom 1.-6. September 1985 abgehalten wurde.
Wesentlich weniger ist jedoch über die Mangan Superoxid-dismutase, die in der Folge auch mit MnSOD abgekürzt werden wird, bekannt. Die MnSOD von Escherichia coli K-12 wurde kürzlich kloniert und in das Verzeichnis aufgenommen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Touati, D., im Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983) verwiesen. Barra et al. beschreiben eine Sequenz von 196 Aminosäuren für das MnSOD-Polypeptid, das aus menschlichen Leberzellen isoliert worden war. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984) verwiesen.
Die bisherigen Veröffentlichungen unterscheiden sich jedoch bezüglich der Struktur des MnSOD-Moleküls, und zwar insbesondere dahingehend, ob dieses zwei identische oder vier identische Polypeptid Untereinheiten aufweist. Es sei in diesem Zusammenhang auf die gerade oberhalb genannte Veröffentlichung von Barra hingewiesen und ferner auf die Veröffentlichung von McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. und Salin, M.L. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michaelson, A.M., McCord, J.M., und Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 129-138 (1977) verwiesen. Es ist jedoch klar, dass das MnSOD-polypeptid und das CuZn-Sod-Polypeptid nicht homolog sind und in diesem Zusammenhang sei auf die erwähnte Veröffentlichung von Barra verwiesen.
Die Homologien der Aminosäuresequenz von verschiedenen MnSOD und FeSOD, die aus verschiedenen Quellen stammten, wurden miteinander verglichen und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M. in dem Buch "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) hingewiesen.
Baret et al. beschreiben in einem Rattenmodell, dass die Halbwertzeit von menschlichem MnSOD wesentlich länger ist, als die Halbwertzeit von menschlichem Kupfer-SOD. Diese Autoren beschreiben auch, dass in dem Rattenmodell menschliche MnSOD und Ratten-Kupfer-SOD nicht wirksam sind als entzündungshemmende Mittel, während die Kupfer-SOD von Rindern und die menschliche Kupfer-SOD vollständig aktiv sind. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Baret, A., Jadot, G., und Michelson, A.M., in Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (September 1, 1984) hingewiesen.
McCord et al. beschreiben, dass die natürlich vorkommende menschliche MnSOD, also die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase die menschlichen phagocytierenden polymorphonuklearen Leukocyten, die in der Folge als PMN-Leukocyten abgekürzt werden, gegen freie Superoxid-Radikale besser schützt, als die von Rindern stammende oder die von Schweinen stammende Kupfer-Zink-Superoxiddismutase, wobei diese Ergebnisse durch in vitro Tests gewonnen wurden. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von McCord, J.M. und Salin, M.L., im Buch "Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes", Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. Verlag, Seiten 257-264 (1977) hingewiesen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Desoxiribonucleinsäure-Molekül, das in der Folge als cDNA-Molekül abgekürzt wird, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Kloning-vehikel, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten und welche zur Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben oder der Expression des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet sind. Zellen, beispielsweise Zellen einzelliger Lebewesen, welche diese Desoxiribonucleinsäuremoleküle enthalten, sind zur Herstellung des menschlichen Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptides, einer Mutante oder eines Analogen desselben, beziehungsweise zur Herstellung von menschlichem Mangan-superoxid-dismutase-Präpolypeptides oder einer Mutante oder eines Analogen desselben geeignet, und bevorzugte derartige einzellige Organismen sind Bakterien.
Wenn das menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Polypeptid, komplexiert mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen vorliegt, dann stellt dieses Produkt ein Enzym dar, welches die Aktivität der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase aufweist. Die entsprechenden Enzyme können als Wirkstoff in pharmazeutischen Präparaten zur Verwendung in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin eingesetzt werden. Die entsprechenden pharmazeutischen Präparate sind in der Lage, um Schädigungen bei der Wiederdurchblutung nach einer Blutleere, also Schäden bei der Reperfusion nach einer Ischämie, zu vermindern. Mit Hilfe entsprechender pharmazeutischer Präparate kann eine verlängerte Lebenszeit von entfernten und isolierten Organen gewährleistet werden.
Des weiteren sind pharmazeutische Präparate, welche die entsprechenden Enzyme als Wirkstoff enthalten, zur Behandlung von Entzündungen geeignet.
Die Erfindungsgegenstände werden nun näher erläutert.
Ein DNA-Molekül, welches cDNA enthält, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde aus menschlichen T-Zellen-cDNA-Bruchstücken (T-cell library) isoliert. Die Aminosäuresequenz des Nucleotides eines doppelsträngigen DNA-Moleküles, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert, wurde gefunden. Die Aminosäuresequenz eines Stranges, der das Polypeptid oder ein Analoges desselben codiert, ist in Fig. 1a und 1b dargestellt, und zwar reicht sie dort vom Nucleotid 115 hinunter bis zum Nucleotid 708. Andere Sequenzen, die das Analoge oder eine Mutante codieren, können im wesentlich ähnlich dem Strang sein, der das Polypeptid codiert.
Die Nucleotid Sequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches ein 24 Aminosäuren umfassendes Prepeptid codiert, ist ebenfalls in Fig. 1a dargestellt, und zwar reicht diese Aminosäuresequenz im Nucleotid von der Aminosäure 43 bis einschliesslich zur Aminosäure 114.
Das doppelsträngige cDNA-Molekül oder irgend ein anderes doppelsträngiges DNA-Molekül, welches einen Nucleotidstrang enthält, der eine Sequenz aufweist, die das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, kann in ein Klonierungs-Vehikel einverleibt werden und als Beispiels für ein Klonierungs-Vehikel sei ein Plasmid oder ein Virus genannt. Entweder kann das DNA-Molekül in eine Zelle eingefügt werden, und zwar entweder eine procaryotische Zelle, beispielsweise eine bakterielle Zelle, oder eine eukaryotische Zelle, beispielsweise eine Hefezelle oder Säugetierzelle, indem man bekannte Methoden anwendet. Zu diesen bekannten Methoden gehört die Anwendung eines Klonierungs-Vehikels, das beide Moleküle enthält, die Erfindung sei jedoch nicht auf diese Methode beschränkt.
Vorzugsweise wird die cDNA oder die DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben codiert in ein Plasmid einverleibt, beispiels weise in pMSE-4 oder pMS DELTA RB4, und dann in eine geeignete Wirtzelle eingefügt, in der die Expression der DNA erfolgen kann und das menschliche Mangan Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben produziert wird. Die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase wird in der Folge auch als hMnSOD abgekürzt.
Zu den bevorzugten Wirtzellen gehören Escherichia coli, sind zwar insbesondere Escherichia coli A4255 und Escherichia coli A1645. Das Plasmid pMSE-4 in dem Escherichia coli Stamm A4255 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. 53250 hinterlegt.
Das Plasmid pMS DELTA RB4 kann so erhalten werden, wie dies in Fig. 4 gezeigt wird. Dieses in Fig. 4 veranschaulichte Verfahren wird später noch näher erläutert.
Zellen, in welche solche DNA-Moleküle eingeführt worden waren, können nach Verfahren gezüchtet oder kultiviert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, wobei man geeignete Bedingungen anwendet, die eine Transkription der DNA in die messenger Ribonucleinsäure, welche in der Folge mit mRNA abgekürzt wird und eine Expression der mRNA als Protein erlaubt. Das so gebildete Mangan-Superoxid-dismutase Protein kann dann gewonnen werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Anwendung in der Veterinärmedizin und in der Humanmedizin geeignet sind und die die menschliche Mangan-Superoxiddismutase, also das menschliche MnSOD oder Analoge oder Mutanten desselben enthalten, können ebenso hergestellt werden und derartige pharmazeutische Präparate enthalten im allgemeinen als weitere Komponente ein Trägermaterial. Diese pharmazeutischen Präparate, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder Mutanten derselben enthalten, können eingesetzt werden, um die folgende Reaktion zu katalysieren:
2O2- + 2H <+> -> H2O2 +O2
Durch die Katalysierung dieser Reduktion werden Zellschädigungen vermindert, die durch Superoxid Radikale hervorgerufen werden.
Insbesondere können diese Enzyme oder Analoge oder Mutanten derselben verwendet werden, um Schäden zu vermindern, welche bei einer Wiederdurchblutung nach einer Blutleere auftreten, also bei einer Reperfusion nach einer Ischämie, und um die Überlebenszeit von entnommenen isolierten Organen zu erhöhen oder um Entzündungen zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder von Analogen oder Mutanten derselben in Bakterienzellen. Die Bakterienzelle enthält die DNA-Sequenz und ist in der Lage, die Expression der DNA-Sequenz hervorzurufen, die für die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges oder eine Mutante derselben kodiert ist.
Bei diesem Verfahren stellt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen und in einem Produktionsmedium. Dieses Produktionsmedium enthält als Zusatz eine Menge an Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration an diesen Manganionen, die der Zelle in dem Medium zur Verfügung steht, höher als 2 ppm ist.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli, die ein Plasmid enthält, welches eine DNA-Sequenz enthält, welche für das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert ist, beispielsweise für pMSE-4 oder pMS RB4 in dem Escherichia coli Stamm A4255. Die Konzentration an den Manganionen in dem Produktionsmedium liegt in diesem Fall vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm, wobei Konzentrationen im Bereich von 150 bis 750 ppm speziell bevorzugt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben aus Bakterienzellen, welche diese Dismutase enthalten. Dabei werden im allgemeinen die Zellen zuerst einer Behandlung unterworfen, um eine Proteinfraktion zu erhalten, die Proteine enthält, welche in den Zellen anwesend sind, und zwar einschliesslich der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutanten derselben. Diese Proteinfraktion wird dann weiterbehandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu erhalten.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zuerst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand zu isolieren und dabei werden die löslichen Proteine gewonnen. Die löslichen Proteine werden dann weiterbehandelt um eine Fraktion des löslichen Proteins abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-oxydase, abgekürzt als hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante derselben enthält. Diese Abtrennung der gewünschten Fraktion kann beispielsweise durch Ausfällung erfolgen. Diejenige Fraktion, welche die hMnSOD oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält, wird gewonnen. Diese gewonnene Fraktion an löslichen Proteinen wird dann weiterbehandelt, um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen.
Eine speziell bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben aus Bakterienzellen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthalten. Bei diesem Verfahren werden zuerst die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium abgetrennt und dann in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist.
Anschliessend werden dann die Zellen aufgebrochen und zentrifugiert und das dabei gebildete überstehende Material wird dann während etwa 30 bis 120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von 55-65 DEG C erhitzt. Vorzugsweise erhitzt man während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C und speziell bevorzugt eine Stunde lang auf eine Temperatur von 60 DEG C. Anschliessend wird dann auf eine Temperatur von unterhalb von 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf 4 DEG C. Irgend ein Niederschlag, der sich dabei gebildet hat, muss entfernt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, und das gekühlte darüber stehende Material wird dann gegen einen geeigneten Puffer dialysiert. Als Beispiel für einen geeigneten Puffer sei ein 2 mN Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von etwa 7,8 genannt.
Vorzugsweise wird die Dialyse durch eine Ultrafiltration durchgeführt, indem man eine Filtrationsmembran von kleiner als 30K verwendet. Gleichzeitig mit der Dialyse oder nach der Dialyse kann das gekühlte darüber stehende Material gegebenenfalls bis zur Erreichung eines geeigneten und angenehm zu handhabenden Volumens konzentriert werden, beispielsweise auf 0,03 des Ausgangsvolumens.
Das Retentat wird dann auf einer Anionaustausch-chromatographiesäule mit einer geeigneten Pufferlösung eluiert, beispielsweise einer Lösung aus minde stens 20 mM Kaliumphosphatpuffer, die einen pH-Wert von 7,8 aufweist. Diejenigen Fraktionen des Eluates, welche Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt und dann gegen einen etwa 40 mM Kaliumacetatpuffer eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert.
Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden dann durch eine Kationaustauscherchromatographiesäule eluiert, die einen linearen Gradienten von etwa 40 mM bis etwa 200 mM Kaliumacetat und einen pH-Wert von 5,5 aufweist. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt.
Gegebenenfalls können die vereinigten Peakfraktionen dann gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung aus einem etwa 10mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die gereinigte enzymatisch aktive menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder Analoge derselben, beispielsweise met-hMnSOD, oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
In Fig. 1a und 1b wird die Aminosäuresequenz der komplimentären Desoxiribonucleinsäure, abgekürzt als cDNA der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht. Diese wird in der Folge auch mit MnSOD cDNA abgekürzt.
Fig. 1a und 1b zeigt die Nucleotidsequenz des einen Stranges eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert und ausserdem die 198 Aminosäuresequenz der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase, die der DNA-Sequenz entspricht. Fig. 1a zeigt auch die Nucleotidsequenz des einen Stranges des doppelsträngigen DNA-Moleküls, welche ein Präpeptid für die reife menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, wobei dieses Präpeptid aus 24 Aminosäuren besteht und eine Aminosäuresequenz aufweist, die derjenigen der DNA-Sequenz entspricht. Es werden ferner Teile der 5 min und 3 min untranslatierten Sequenzen dargestellt.
Das Plasmid pMS8-4, welches die MnSOD auf einer mit R1 bezeichneten EcoRI Einfügung enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI abgebaut. Das grosse Fragment, das bei diesem Restriktionsabbau gebildet wurde, wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomer in der in Fig. 2 dargestellten Weise verbunden. Das grosse Fragment erstreckt sich von der NdeI Restriktionsstelle in der Stellung "8 Uhr" auf dem pMS8-4 zu der NarI Restriktionsstelle, die sich in der Stellung "3 Uhr" auf dem Plasmid pMS8-4 befindet. Dieses Restriktionsfragment enthält das Ampicillin-resistenz-gen und ausserdem die meisten der MnSOD-gene. Dieser Restriktionsabbau hat die 5 min untranslatierte Region und die Präpeptid kodierende Region des MnSOD-genes entfernt. Dieser Restriktionsabbau hat ebenfalls ungefähr 36 Basenpaare der kodierenden Region des reifen MnSOD-Polyeptides entfernt.
Diese fehlenden Basenpaare, welche das reife MnSOD kodieren, wurden durch die Ligation an den synthetischen Linker eingeführt, welcher in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das erhaltene Plasmid pMS8-NN enthält die kodierende Region für das reife MnSOD und vor dieser ein ATG-Initiationskodon.
Das oben erwähnte Plasmid pMS8-NN wurde mit EcoRI abebaut oder verdaut, die Enden wurden gefüllt indem man das Klenow-fragment der Polymerase 1 verwendete und dann weiter mit NdeI gespaltet.
Das kleine Fragment beherbergt das MnSOD-gen, angeordnet zwischen der eingefüllten EcoRI-Stelle und der NdeI-Stelle und dieses kleine Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment entspricht dem für MnSOD kodierenden Bereich.
Dieses Fragment wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI und StuI behandelt worden war.
Die Behandlung von PSOD alpha 13 mit NdeI und StuI und die nachfolgende Isolierung des grossen Fragments führt zu einem Fragment, welches die lambda PL Promoterseguenz, die cII-ribosomale Bindungsstelle, das Ampicillin-resistanz-gen und die meisten CuZn SOD-gene enthält.
Das CuZn SOD-gen fehlt jedoch in dem kodierenden Bereich für das 5 min Ende des Gens, weil dieses durch die Restriktionsspaltung und die nachfolgende Isolierung des grossen Fragmentes entfernt worden war.
Das MnSOD-gen von pMS8-NN wurde zwischen die NdeI und StuI-Stellen von pSOD alpha 13 eingefügt. Das pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 vom 5. März 1986, die der USA Patentanmeldung Serial No. 644 245 entspricht, beschrieben ist. Durch diese Ligation wurde das Plasmid pMSE-4 gebildet, das den MnSOD kodierenden Bereichen enthält und vor diesem liegen die cII-ribosomale Bindungsstelle und unter der Kontrolle des lambda Pl-Promoters. Das Plasmid pMSE-4 ist am 25. Sept. 1985 bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt worden.
In Fig. 3 wird der Einfluss der Konzentration an Manganionen auf die Aktivität der Superoxid-dismutase veranschaulicht, die in dem Mikroorganismus Escherichia coli gebildet wird.
In dieser Fig. 3 ist auf der Abszisse die Konzentration an Manganionen, nämlich an Mn<+><+> in dem Zuchtmedium in ppm angegeben. Diese reicht von 0 ppm bis 600 ppm. Auf der Ordinate der Fig. 3 sind die spezifischen Superoxid-dismutase Aktivitätseinheiten pro mg des löslichen Proteines angegeben.
Das Diagramm der Fig. 3 zeigt also den Zusammenhang zwischen der spezifischen Aktivität, angegeben in Einheiten pro mg des rekombinierten löslichen MnSOD, das von dem Escherichia coli Stamm A4255 gebildet wurde, der das Plasmid pMSE-4 enthält. In dieser Figur sind sowohl die entsprechenden Einheiten für Nichtinduktion (bei 32 DEG C) angeführt, es handelt sich dabei um die entsprechenden nicht strichlierten Säulen, und des weiteren sind in dieser Figur die Ergebnisse unter den Be dingungen einer Induktion bei 42 DEG C angeführt. Dabei handelt es sich um die entsprechenden strichlierten Flächen. Die Konzentration an den Ionen des zweiwertigen Mangans in dem Wachstumsmedium ist wie erwähnt in ppm, also in Teilen pro Million angeführt.
In Fig. 4 ist der Aufbau von pMS DELTA RB4, nämlich des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Expressionsplasmides veranschaulicht.
Der Tet<R>-Expressionsvektor, p DELTA RB wurde aus dem pSOD beta 1T-11 gebildet, indem man das pSOD beta 1T-11 vollständig mit EcoRI abbaute und anschliessend eine teilweise Spaltung mit den BamHI-Restriktionsenzymen durchführte.
Das grosse Fragment, das durch diesen Abbau gebildet worden war, wurde isoliert und an ein synthetisches Oligomer gebunden, dessen Sequenz wie folgt war:
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
Dadurch erhielt man p DELTA RB, welches den lambda Pl Promoter enthält. Das grosse EcoRI/BamHI Restriktionsfragment, das bei diesem Abbau gebildet wird, erstreckt sich von der EcoRI-Stelle, die in der pSOD beta 1T11-Restriktionskarte in Stellung "12 Uhr" dargestellt ist, in der Gegenuhrzeigerrichtung bis zu der BamHI-Stelle, die in der pSOD 1T11-Restriktionskarte in der "5 Uhr" Stellung dargestellt ist. Das pSOD beta 1T11 ist bei der American Type Culture Colection 3. März 1986 unter der Accession No. 53 468 hinterlegt worden.
Das EcoRI-Fragment vom pMSE-4 wurde erhalten, indem man pMSE-4 mit EcoRI abbaut und das kleine Fragment isoliert, das bei diesem Abbau gebildet wird. Dieses Fragment ist das Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält und es erstreckt sich auf der pMSE-4-Restriktionskarte von der Stelle EcoRI in der Stellung "1 Uhr" zu der Stelle EcoRI in der Stellung "3 Uhr" auf der pMSE-4-Restriktionskarte. Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches die cII-ribosomale Bindungsstelle und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzyms enthält, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von p DELTA RB eingeführt. Das erhaltene Plasmid pMS RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von lambda Pl und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin.
In der Folge wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen beschrieben.
Ein doppelsträngiges Desoxiribonucleinsäuremolekül, das in der Folge mit DNA-Molekül abgekürzt wird, und das komplimentäre Desoxiribonucleinsäure, umfasst, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben enthält, wurde isoliert. Diese komplimentäre Desoxiribonucleinsäure wird in der Folge mit cDNA abgekürzt. Das erwähnte doppelsträngige DNA-Molekül wurde aus einem menschlichen T-Zellen-cDNA-genetischem Material oder Abschnitt mit der englischen Bezeichnung "human T-cellcDNA library" isoliert. Unter dieser englischen Bezeichnung versteht man eine Sammlung von Escherichia coli Bakterien oder Bakteriophagen lambda , welche die cDNA-Abschnitte oder Einfügungen enthält, die durch die Messenger-RNA (abgekürzt als MRNA) synthetisiert wurden, die aus menschlichen T-Zellen isoliert wurde.
Die Nucleotidsequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid kodiert oder ein Analoges oder eine Mutante desselben kodiert, wurde gefunden.
Die Sequenz des einen Stranges des DNA-Moleküls, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben kodiert, ist in Fig. 1a und b dargestellt und diese Sequenz umfasst die Nucleotide mit den Zahlen 115 bis einschliesslich 708.
Die Sequenz des einen Stranges, der ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase- Polypeptides, das in der Folge als hMnSOD-analoges bezeichnet wird oder eine Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, ist im wesentlichen ähnlich demjenigen Strang, der das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid, das in der Folge mit hMnSOD-polypeptid abgekürzt wird, kodiert.
Die Nucleotidsequenz des Präpeptides der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ist ebenfalls in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die Nucleotide der Zahlen 43 bis einschliesslich 114 kodieren dieses Präpeptid.
Die Methoden zur Herstellung der cDNA und zur Bestimmung der Sequenz der DNA, die das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und sie werden in der Folge noch genauer beschrieben. Da jetzt die DNA-Sequenz aufgeklärt wurde, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, können ausserdem bekannte synthetische Verfahren angewandt werden, um DNA-Moleküle herzustellen, die Teile dieser Sequenz enthalten.
Übliche Kloning-vehikel, wie Plasmide, beispielsweise pBR322, oder Viren oder Bakteriophagen, beispielsweise lambda , können modifiziert oder hergestellt werden, indem man bekannte Arbeitsverfahren anwendet, die geeignet sind, um neue Kloning-vehikel herzustellen, welche eine cDNA enthalten, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase Polypeptid oder Analoge desselben oder Mutanten desselben, kodieren.
In ähnlicher Weise können derartige Kloning-vehikel so modifiziert oder so erzeugt werden, dass sie DNA-Moleküle enthalten, von denen ein Strang ein Segment enthält, welches die in Fig. 1a und b dargestellte Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist oder Segmente, die im wesentlichen ähnlich diesen dargestellten Segmenten sind. Die eingefügten DNA-Molekule können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden, einschliesslich einer enzymatischen oder chemischen Synthese.
Die erhaltenen Kloning-vehikel sind chemische Einheiten, die in der Natur nicht vorkommen und die nur durch moderne Technologie erzeugt werden können, die als Rekombination-DNA-Technologie bezeichnet wird. Vorzugsweise ist das Kloning-vehikel ein Plasmid, beispielsweise pMSE-4 oder pMS DELTA RB4. Diese Kloning-vehikel können in Zellen eingefügt werden, und zwar entweder in procaryotische Zellen, beispielsweise Bakterienzellen, wie zum Beispiel diejenigen von Escherichia coli, von Bacillus subtilis, und ähnliche Bakterienzellen, oder sie können in eukaryotische Zellen einverleibt werden, wie zum Beispiel in die Zellen von Hefe oder Säugetieren, indem man Arbeitstechniken anwendet, die für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, wie zum Beispiel eine Transformation, eine Transfektion und ähnliche Arbeitsweisen.
Diejenigen Zellen, in welche die Kloning-vehikel eingeführt sind, enthalten dementsprechend cDNA, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, wenn diese cDNA in dem Kloning-vehikel anwesend war oder sie werden eine DNA enthalten, welche einen Strang, und zwar einen gesamten Strang oder einen Teil des Stranges enthält, welcher die Sequenz des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides aufweist, die in Fig. 1a und b dargestellt wird oder eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen ähnlich dieser Sequenz ist, wenn eine solche DNA in dem Kloning-vehikel anwesend war.
Die Zellen von Escherichia coli sind die bevorzugten Wirtzellen für die erfindungsgemässen Kloningvehikel. Als der im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugte auxotrophische Stamm der Escherichia coli ist der Stamm A1645, der bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt wurde, welcher das Plasmid pApoE-Ex2 enthält und welcher unter der ATCC Accession No. 39 787 hinterlegt ist. Alle Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection, die in den vorliegenden Unterlagen erwähnt werden, wurden in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag der International Anerkennung von hinterlegten Kulturen von Mikroorganismen durchgeführt.
Das A1645 wurde aus A1637 durch Selektion auf Gal<+>, d.h. durch Selektion auf die Fähigkeit, Galaktose abzubauen, erhalten und auch durch einen Verlust der Tetracyclin-resistenz. Es enthält immer noch Elemente der Phage lambda . Sein Phenotyp ist c600 r<-> m<+> gal<+> thr<-> leu<-> lacZ-bl ( lambda cI857 DELTA Hl DELTA BamHl N<+>).
A1637 wurde aus dem C600 erhalten, indem man Transposon, welches ein Gen für Tetracyclin-resistenz enthält, in das Galactose-Operon einführt und ausserdem Elemente der Phage lambda einfügt, einschliesslich derjenigen Elemente, die verantwortlich sind für die Synthese des cI Repressors. C600 kann bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 23 724 bezogen werden.
Die prototrophischen Stämme von Escherichia coli, welche ein hohes Ausmass der Expression des Polypeptides sogar dann ermöglichen, wenn sie in einem minimalen Medium gezüchtet werden, sind als Wirtzellen für die Expression des Gens, welches Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, noch mehr bevorzugt. Ein im gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugter prototrophischer Stamm ist A4255. Der Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt.
Die erhaltenen Zellen, in die eine DNA eingefügt worden war, welche das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben kodiert, können behandelt werden, beispielsweise gezüchtet werden oder vermehrt werden, wie dies unter geeigneten Bedingungen für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, sodass die DNA die Expression der genetischen Information richtet, die durch die DNA kodiert wurde. Diese DNA dirigiert beispielsweise die Expression des hMnSOD-Polypeptides oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und die Zelle führt dementsprechend zur Expression von hMnSOD-Polypeptid oder eines Analogen oder eines Mutanten desselben, und diese Produkte können dann gewonnen werden.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Superoxid-dismutase", bzw. die Abkürzung "SOD" ein Enzym oder ein Polypeptid, welche auf Superoxid oder freie Sauerstoffradikale als Rezeptor wirkt oder welche die folgende Dismutationsreaktion katalysiert:
2O2- + 2H<+ >-> O2 + H2O2
Der Ausdruck "Mangan-Superoxid-dismutase", bzw. die entsprechende Abkürzung "MnSOD", bedeutet in der vorliegenden Beschreibung irgend ein beliebiges Superoxid-dismutase Molekül, welches das chemische Element Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen enthält.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutase-Polypeptid", bzw. die entsprechende Abkürzung "hMnSOD" ein Polypeptid aus 198 Aminosäuren, von dem ein Teil der Aminosäuresequenz ln Fig. 1a und b dargestellt ist. Das Stickstoffende, also der N-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz ist das Lysin, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist.
Der Ausdruck "Polypeptid-Mangan-Komplex" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches ein menschliches Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid in einem Komplex mit Mangan in irgend einer chemischen Formel enthält und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Der Ausdruck "menschliche Mangan-Superoxid-dismutase" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptide in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Der Ausdruck "Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches das menschliche Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptid umfasst, an welches an eines der beiden Enden oder an beide Enden der Aminosäuresequenz eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren gebunden sind.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ferner der Ausdruck "Analoges des Polypeptid-ManganKomplexes" ein Molekül, welches einen Polypeptid-Mangan-Komplex umfasst, wobei der Polypeptidanteil dieses Komplexes ein oder mehrere zusätzliche Aminosäuren umfasst, die an eines der beiden Enden oder an beide Enden des Polypeptides gebunden sind.
Unter dem Ausdruck "Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, das mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines der beiden ein Analoges des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, und zwar in Form eines Komplexes mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen und welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Unter dem Ausdruck "Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen identisch mit derjenigen des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides ist, wobei sich diese Aminosäuresequenz jedoch von diesem Polypeptid durch ein oder mehrere Aminosäuren unterscheidet.
Unter dem Ausdruck "Mutante des Polypeptid-Mangan-Komplexes" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen umfasst und welches die enzymatische Aktivität der Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Unter dem Ausdruck "Mutante der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein Molekül, welches mindestens zwei Polypeptide umfasst, wobei mindestens eines dieser Polypeptide eine Mutante des menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase-Polypeptides in einem Komplex mit Mangan in irgend einer seiner chemischen Formen ist und dabei dieser Komplex die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase aufweist.
Die Mutanten des hMnSOD-Polypeptides und des hMnSOD, die einen Teil des Erfindungsgegenstandes darstellen, können hergestellt werden, indem man die DNA-Sequenz, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, mutiert, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 kodiert ist und das Carboxylende, also der COOH-Terminus dieser Sequenz, durch die Nucleotide 706-708 kodiert ist.
Die DNA kann nach Methoden mutiert werden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind und es sei in diesem Zusammenhang beispielsweise auf die Veröffentlichung von Bauer et al., in Gene 37: 73-81 (1985) hingewiesen. Die mutierte Sequenz kann nach dem hier beschriebenen Verfahren in geeignete Expressions-vektoren eingefügt werden, und diese Expressions-vektoren können wieder in Zellen eingefügt werden, die dann so behandelt werden, dass die mutierte DNA die Expression der hMnSOD-Polypeptide-Mutanten und die Expression der hMnSOD-Mutanten dirigiert.
Man nimmt an, dass die enzymatisch aktive Form der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase ein Protein ist, das mindestens zwei und möglicherweise vier identische Untereinheiten aufweist, von denen jede ungefähr 198 Aminosäuren in derjenigen Sequenz aufweist, die in Fig. 1a und b für die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase veranschaulicht ist, wobei das Stickstoffende, also der N-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert ist und das Carboxylatende, also der COOH-Terminus der Sequenz das Lysin ist, das durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert ist.
Menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können von Zellen gebildet werden, in welche die DNA oder die cDNA, die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ihre Analogen oder ihre Mutanten kodiert, eingebracht worden ist. Die menschliche MnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben können verwendet werden, um die Dismutation oder die einwertige Reduktion von Superoxidanionen in Anwesenheit von Protonen unter Bildung von Wasserstoffperoxid zu katalysieren und die entsprechende Reaktion ist anhand der folgenden Gleichung veranschaulicht:
EMI46.1
Pharmazeutische Präparate zur Anwendung in der Veterinärmedizin oder der Humanmedizin können auch hergestellt werden, die als Wirkstoff hMnSOD oder einen oder mehrere Analoge oder Mutanten der hMnSOD enthalten und vorzugsweise ausserdem ein geeignetes Trägermaterial. Derartige Trägermaterialien sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt.
Entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder ein Analoges oder eine Mutante desselben enthalten, können direkt verabreicht werden oder sie können mit Hilfe von weiteren Zusätzen zu entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die dann zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten oder tierischen Patienten geeignet sind. Entsprechende pharmazeutische Präparate können verwendet werden, um Entzündungen zu bekämpfen oder um Schäden zu vermindern, die von freien Sauerstoffradikalen bei der erneuten Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der auf eine Ischämie folgenden Reperfusion auftreten können oder bei einer Organtransplantation.
In diesen Fällen kann das hMnSOD oder ein Analoges desselben oder eine Mutante desselben direkt, also ohne weitere Zusätze, oder in Form einer Zusammensetzung dem Durchspülungsmedium, also dem Perfusionsmedium, zugesetzt werden, mit dem ein isoliertes Organ durchspült wird, wobei dadurch Schädigungen des isolierten Organes durch sauerstoff-freie Radikale bei der Perfusion nach der Isolierung des Organes vermindert werden und somit die Überlebenszeit des isolierten Organes verlängert wird.
Des weiteren können entsprechende pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff hMnSOD oder Analoge derselben oder Mutanten derselben enthalten, verwendet werden, um neurologische Schäden zu vermindern, die bei der neuerlichen Durchblutung nach einer Blutleere, also bei der Reperfusion anschliessend an eine Ischämie auftreten können und die entsprechenden pharmazeutischen Präparate können auch eingesetzt werden, um eine Missbildung der Bronchien und der Lunge, also eine Bronchial-pulmonar-dysplasie zu behandeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen oder einer Mutante derselben in Bakterienzellen. Bei diesem Verfahren enthält die Bak terienzelle eine DNA Sequenz und sie ist in der Lage, eine Expression einer DNA Sequenz durchzuführen, die die menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert. Bei diesem Verfahren belässt man die Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Produktionsmedium. Das Produktionsmedium enthält als Zusatzstoff eine Menge an zweiwertigen Manganionen, also an Mn<+><+>, sodass die Konzentration in diesen zweiwertigen Manganionen in dem Medium höher gehalten wird als 2 ppm.
Die Bakterienzelle kann irgend ein beliebiges Bakterium sein, in welches die DNA-Sequenz, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase kodiert, eingefügt worden war, indem man Rekombinations-DNA-Techniken angewandt hatte. Dieses Bakterium muss zu einer Expression der DNA-Sequenz geeignet sein und zur Produktion des Proteinproduktes. Die geeigneten Bedingungen und das Produktionsmedium variieren je nach der Spezies und dem Stamm des Bakteriums.
Die Bakterienzelle kann die DNA-Sequenz, welche die Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben kodiert, in dem Körper eines Vektor-DNA-Moleküles enthalten, wie zum Beispiel eines Plasmides. Der Vektor oder das Plasmid wird durch Rekombinations-DNA-Techniken so aufgebaut oder konstruiert, dass er die Sequenz, welche die Superoxid-dismutase kodiert, an einer geeigneten Stelle in dem Molekül einverleibt hat.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung ist die Bakterienzelle eine Zelle von Escherichia coli. Ein bevorzugter auxotrophischer Stamm von Escherichia coli ist A1645.
Ein bevorzugter prototrophischer Stamm von Escherichia coli ist A4255. Die erfindungsgemässen Zellen von Escherichia coli enthalten ein Plasmid, welches die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben kodiert.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMSE-4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmids wird in der Beschreibung der Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 2 beschrieben. Dieses Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No.53 250 hinterlegt.
Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMS DELTA RB4. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasmides ist in der Beschreibung und in den Figuren erläutert und das Plasmid selbst wird in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Plasmid kann ausgehend von pSOD beta T-11, welches bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt ist, aufgebaut werden.
Gemäss speziellen Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung wird ein enzymatisch aktives Analoges der menschlichen Mangan-Superoxid-dismutase durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, der das Plasmid pMSE-4 enthält, sowie durch Zellen des Escherichia coli Stammes A4255 produziert, die das Plasmid pMS DELTA RB4 enthalten.
Das geeignete Produktionsmedium für die Bakterienzelle kann irgend eine Art eines annehmbaren Zuchtmediums sein, wie zum Beispiel ein Casein-hydrolysat-Medium oder ein Luria-Brühe-Medium, welches in der Folge auch als LB-Medium abgekürzt wird. Das letztgenannte Medium ist dabei bevorzugt.
Die geeigneten Züchtungsbedingungen hängen von dem Stamm der Escherichia coli und dem Plasmid, das diese enthält, ab. Beispielsweise wird der Stamm Escherichia coli A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 42 DEG C induziert und bei dieser Temperatur während etwa 1-5 Stunden belassen. Die geeigneten Bedingungen bezüglich der Züchtungstemperatur, der Züchtungszeit, des Rührens und der Belüftung, sowohl bei der Anzucht des Züchtungsmateriales als auch für die Züchtung der Kulturen auf eine geeignete Zelldichte vor der Produktionsphase, sowie ferner auch für die Aufrechterhaltung der Züchtung während des Produktionszeitraumes können variieren und all diese möglichen Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend.
Die Konzentration der zweiwertigen Manganionen, also der Mn<+><+> in dem Medium, die nötig ist, um die enzymatisch aktive Mangan-Superoxid-dismutase herzustellen, variiert mit der Art des angewandten Mediums.
Es zeigte sich, dass bei einem Zuchtmedium des LB-Typs Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen im Bereich von 150 ppm bis 750 ppm wirksam sind. Es ist bevorzugt, dass in allen komplexen Typen der Wachstumsmedien die Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Medium im Bereich von etwa 50 bis etwa 1500 ppm liegt.
Die speziellen Bestandteile für einen geeigneten Stamm, das Züchtungsmedium, das Impfmedium und das Produktionsmedium können variieren und all diese Variationen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegend.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxid-dismutase oder eines Analogen derselben oder eines Mutanten derselben, und zwar ausgehend von Bakterienzellen, welche diese enthalten. Die Zellen werden zuerst behandelt, um eine Proteinfraktion zu gewinnen, welche Proteine enthält, die in den Zellen anwesend sind und zu diesen Proteinen gehört die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben. Dann wird die Proteinfraktion entsprechend behandelt, um die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden die Zellen zunächst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Bruchstücken der Zellwand abzutrennen und die löslichen Proteine werden dann gewonnen. Die so gewonnenen löslichen Proteine werden dann behandelt um eine Fraktion der löslichen Proteine abzutrennen, welche die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben enthält und diese Fraktion wird gewonnen. Die entsprechende Behandlung kann beispielsweise eine Ausfällung sein. Die Fraktion wird dann weiterbehandelt um getrennt die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder ein Analoges derselben oder eine Mutante derselben zu gewinnen.
In der Folge werden speziell bevorzugte Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Zuerst werden die Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium isoliert und in einer geeigneten Lösung suspendiert, die einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis 8,0 aufweist. Die Zellen werden dann aufgebrochen und abzentrifugiert.
Das überstehende Material wird abgetrennt und während 30 bis 120 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von etwa 55-65 DEG C erhitzt, vorzugsweise während 45-75 Minuten auf eine Temperatur von 58-62 DEG C, und speziell bevorzugt während einer Stunde auf 60 DEG C. Anschliessend an diese Erhitzungsphase wird dann auf eine Temperatur von weniger als 10 DEG C gekühlt, vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 4 DEG C. Wenn sich während dieses Kühlvorganges ein Niederschlag gebildet hat, dann wird dieser entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren und dann wird das gekühlte überstehende Material gegen einen geeigneten Puffer dialysiert.
Vorzugsweise wird das gekühlte überstehende Material durch eine Ultrafiltration dialysiert, indem man eine Filtrationsmembran verwendet, die kleiner als 30K ist, und speziell bevorzugt 10K ist. Als Beispiele für einen geeigneten Puffer sei ein 2 MM Kaliumphosphatpuffer genannt, der einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Nach dieser Dialyse oder gleichzeitig mit dieser Dialyse kann das gekühlte überstehende Material gegebenenfalls auf ein geeignetes Volumen konzentriert werden. Beispielsweise hat sich eine Konzentration auf 0,03 des ursprünglichen Volumens des überstehenden Materiales als geeignet herausgestellt.
Anschliessend wird das Material auf eine Anionenaustauscher enthaltende Chromatographiesäule aufgebracht, und man eluiert dieses Retentat mit einer geeigneten Pufferlösung, beispielsweise einer Lösung eines 20 mM Phosphatpuffers, die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Die Fraktionen des eluierten Materiales, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen, miteinander vereinigt und gegen eine etwa 40 mM Kaliumacetatlösung eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert.
Diese vereinigten und dialysierten Fraktionen werden dann auf eine mit Kationenaustauscher gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen und man eluiert mit einem linearen Gradienten von etwa 40 mM Kaliumacetatlösung bis etwa 200 mM Kaliumacetatlösung, wobei diese Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufweisen. Diejenigen Peakfraktionen, welche die Superoxid-dismutase enthalten, werden aufgefangen und miteinander vereinigt. Gegebenenfalls können dann die vereinigten Peakfraktionen gegen eine geeignete Lösung dialysiert werden, beispielsweise gegen Wasser oder eine Pufferlösung, die etwa 10 mM an Kaliumphosphat ist und die einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gereinigte menschliche Mangan-superoxid-dismutase oder Analoge derselben oder Mutanten derselben, wobei diese Produkte nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt sind und wobei man im vorliegenden Zusammenhang unter dem Ausdruck "gereinigt" versteht, dass die fraglichen Produkte im wesentlichen frei von anderen Substanzen menschlichen Ursprungs sind.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Analoges der menschlichen Mangan-superoxiddismutase, das mindestens zwei Polypeptide aufweist, von denen mindestens eines der Polypeptide diejenige Aminosäuresequenz besitzt, die in Fig. 1a und b dargestellt ist, wobei das Stickstoffende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1a kodiert wird und das Carboxylatende dieser Sequenz das Lysin ist, welches durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1b kodiert wird und wobei in dieser Aminosäuresequenz ein zusätzlicher Methioninrest an das Stickstoffende der Aminosäuresequenz gebunden ist. Dieses Analoge der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase wird in der Folge mit Met-hMnSOD abgekürzt, wobei in dieser Abkürzung "Met" den zusätzlich gebundenen Methioninrest veranschaulicht.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart dieses Produktes weist dieses gereinigte Met-hMnSOD eine spezifische Aktivität von mindestens 3500 Einheiten/mg auf.
Die vorliegende Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert.
Diese Beispiele sollen lediglich zu einem noch besseren Verständnis des Erfindungsgegenstandes führen, sie sollen jedoch den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Es sei ferner darauf hingewiesen, dass diese Beispiele keine detaillierten Erläuterungen der üblichen Methoden enthalten, die bei dem Aufbau von Vektoren, der Einfügung von Genen, die für Polypeptide kodiert sind, in derartige Vektoren oder die Einführung der entsprechenden Plasmide in Wirte, bzw. Wirtzellen, betreffen. Die Beispiele enthalten ferner auch keine detaillierte Beschreibung üblicher Methoden, die angewandt werden, um Polypeptide zu testen, die durch derartige Wirt-Vektorsysteme produziert werden oder um die Identität derartiger Polypeptide durch Aktivitäts-Färbeverfahren von isoelektrisch fokussierenden Gelen, die in der Folge als IEF Gele bezeichnet werden, zu bestimmen.
Derartige Arbeitsmethoden sind nämlich für den Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt und sie sind in vielen Publikationen näher beschrieben, wobei hier als Beispiel auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen sei:
T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sombrook, "Molecular Cloning", ein Laboratoriumshandbuch des Cold Spring Harbor Laboratoriums, New York, 1982.
J.M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969), sowie C. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971).
Beispiel 1
Um die MnSOD-cDNA-Klone zu identifizieren, wurden gemischte Oligormerproben synthetisiert, und zwar in Übereinstimmung mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz, die in zwei weiter vorne bereits genannten Veröffentlichungen beschrieben ist, und zwar in der Veröffentlichung von Harris, J.I. und Steinman, H.M., in dem Buch Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, Seiten 225-230 (1977) und in der Veröffentlichung von Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G. und Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259:12595-601 (Oktober 25, 1984).
5 min -Probe - 30-mer-sequenz von AA15-AA24 (siehe diese beiden Veröffentlichungen.
EMI58.1
EMI59.1
3 min -Probe - 32-mer-sequenz von AA179-AA189 (siehe die zweite der beiden genannten Veröffentlichungen)
EMI59.2
Die 5 min -Probe besteht aus 30 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 15-24 des reifen MnSOD.
Die 3 min -Probe besteht aus 32 Nucleotiden und sie entspricht den Aminosäuren 179-189 des reifen MnSOD.
Die 5 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 36 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben veranschaulicht wird.
Die 3 min -Probe ist eine gemischte Probe, die aus 16 unterschiedlichen Sequenzen besteht, wie dies oben gezeigt ist.
Wenn in dem oben angegebenen Schema mehr als ein Nucleotid in einer vorgegebenen Position gezeigt wird, dann wurde der entsprechende DNA-Strang unter Ver wendung von äquimolaren Mengen jedes der beiden dargestellten Nucleotide synthetisiert und es handelt sich dementsprechend um eine gemischte Probe.
Die 5 min -Probe wurde verwendet um 300 000 Plaques einer T-Zelle-cDNA-genetischen Abschnittes (mit der englischen Bezeichnung T-cell cDNA library), der in einer lambda -gt-10-Vector kloniert ist, zu screenen. Die Hybridisierung an Phagen-plaque-replicas, die auf Nitrozellulosefiltern immobilisiert sind, wurde nach Standard Arbeitsverfahren durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die unmittelbar vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von Maniatis et al. hingewiesen, wobei der Unterschied zu dem dort beschriebenen Verfahren darin bestand, dass die Hybridisierung bei 50 DEG C in 8 x SSC während 16 Stunden durchgeführt wurde. Die Filter wurden dann bei 50 DEG C mit 5 x SSC und 0,1% SDS gewaschen. Drei positive Plaques wurden isoliert und diese wurden als Phi MS8, bzw. als Phi MS1, bzw. als Phi MSlJ bezeichnet.
Das EcoRI verdaut die DNA von Phi MS8 und die DNA von Phi MSL und daraus sieht man, dass diese beiden Produkte cDNA-Einfügungen, die auch als cDNA-Inserts bezeichnet werden, aufweisen, die etwa 800 bp lang sind und die beide mit dem 5 min und dem 3 min Oligonucleotid-proben hydridisieren.
Das Phi MSlJ trug nur die cDNA-Einfügung oder das cDNA-Insert einer Menge von 450 bp, welches nur mit der 5 min -Endprobe hybridisiert.
Die EcoRI-Inserts der drei Phagen-klone wurden in die EcoRI Stelle von pBR322 subkloniert und man erhielt dabei jeweils pMS8-4, bzw. pMS1-4, bzw. pMS1J.
Die Restriktionsanalyse und die Hybridisierung mit den 5 min und den 3 min Oligonucleotid-proben ergaben ähnliche Muster, die auch als Pattern bezeichnet werden, für die beiden Produkte pMS8-4 und pMS1-4.
Die in Fig. 5 veranschaulichte Restriktions-karte zeigt die 5 min -> 3 min Orientierung, und diese wurde für beide Plasmide deduziert.
Die Sequenz des cDNA-Inserts von pMS8-4 ist in Fig. 1a und b veranschaulicht. Die vorher-gesagte Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der Aminosäuresequenz der am Beginn dieses Beispiels genannten Veröffentlichung von Barra et al. dahingehend, dass an drei Stellen Glu anstelle von Gln aufscheint, und zwar an den Stellen AA 42, 88, 108 und dahingehend, dass zwei zusätzliche Aminosäuren, nämlich Gly und Trp zwischen AA123-124 aufscheinen.
Die Sequenzanalyse von pMS1-4 und pMS1J zeigte, dass drei MnSOD-Klone unabhängig abgeleitet wurden und diese Sequenzanalyse bestätigte die Unterschiede zu der früher veröffentlichten Aminosäuresequenz.
Die Sequenz oberhalb des Lysines der Stickstoffendgruppe, also des N-terminalen Lysines der reifen MnSOD ermöglicht die Vorhersage einer Präpeptid Sequenz von 24 Aminosäuren.
Beispiel 2
Aufbau des Plasmides, das die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt.
Das Plasmid, welches die Expression der menschlichen Mangan-superoxid-dismutase bewirkt, wird in der Folge auch als Amp<R>-menschliche MnSOD-Expression Plasmid bezeichnet und als pMSE-4 abgekürzt.
Das Ausgangsprodukt für den Aufbau oder die Konstruktion dieses pMSE-4 ist das Plasmid pMS8-4, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Das Plasmid pMS8-4, welches menschliche MnSOD-cDNA auf einer EcoRI-Einfügung, die auch als EcoRI-Insert bezeichnet wird, enthält, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen NdeI und NarI verdaut. Das grosse Fragment wurde isoliert und mit einem synthetischen Oligomeren verbunden, wie dies in Fig. 2 veranschaulicht ist. Das dabei erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS8-NN, das ebenfalls in Fig. 2 dargestellt ist, enthält den kodierenden Bereich für die reife oder endgültige MnSOd, die in der englischsprachigen Literatur als mature MnSOD bezeichnet wird, und vor diesem Bereich befindet sich ein ATG-Initiations-codon. Das oben genannte Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, die Enden wurden mit dem Klenow-fragment der Polymerase I gefüllt und weiter mit NdeI gespalten.
Das kleine Fragment, welches das MnSOD-Gen enthält, wurde in pSOD alpha 13 eingefügt, welches mit NdeI und StuI behandelt wurde.
Das genannte pSOD alpha 13 kann so erhalten werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 173 280 beschrieben ist, die am 5. März 1986 veröffentlicht wurde. Alles was dort geoffenbart ist, trifft auch im vorliegenden Fall zu.
Dadurch wurde das Plasmid pMSE-4 erzeugt, welches einen die MnSOD kodierenden Bereich enthält, vor dem sich die cII-riosomale Bindungsstelle befindet und unter der Kontrolle des lambda PL-Promoters.
Das Plasmid pMSE-4 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 250 hinterlegt. Alle Arbeitsmethoden, die bei dem oben beschriebenen Verfahren angewandt werden, sind im wesentlichen die gleichen, wie diejenigen, die in der Veröffentlichung von Maniatis et al., die vor dem Beispiel 1 genannt ist, beschrieben sind.
Beispiel 3
Expression der rekombinanten menschlichen MnSOD
Das Plasmid pMSE-4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingefügt. Anschliessend wurde der Escherichia coli Stamm 4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, bei 32 DEG C in einem Luria-Brühe-Medium gezüchtet, wobei das Medium 100 mu g/ml Medium an Ampicillin enthielt. Diese Züchtung wurde so lange durchgeführt, bis die optische Dichte, abgekürzt als "OD" bei 600 nm 0,7 betrug.
Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeitabständen wurden Proben genommen und diese wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelen getrennt. Diese Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel Electrophorese wird in der Folge mit "SDS-PAGE" abgekürzt. Aus dieser Gel Electrophorese war ersichtlich, dass der Spiegel an dem gebildeten menschlichen MnSOD bis zu 120 Minuten nach der Induktion anstieg. Zu diesem Zeitpunkt machte das recombinante MnSOD-Protein 27% der gesamten Zellproteine aus. Die entsprechende Bestimmung der Zellproteine wurde durch ein Scanning mit Gel durchgeführt, das mit Coomassie-Blau gefärbt war.
Die Ultraschallbehandlung der Proben während 90 Sekunden mit einem W-375-Ultraschallgerät und die Aufteilung der Proteine in lösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als s-Fraktionen bezeichnet werden und in unlösliche Proteinfraktionen, die in der Folge als p-Fraktionen bezeichnet werden, erfolgte durch Zentrifugieren unter Anwendung von 10 000 g während eines Zeitraumes von 5 Minuten. Dabei zeigte es sich, dass die geprüfte Menge der gebildeten rekombinanten MnSOD nicht löslich war.
Die induzierte lösliche Proteinfraktion enthielt nur etwas mehr an der MnSOD-Aktivität als die Proteinfraktion des nicht induzierten Parallelversuches. Diese Tests wurden nach den Standardmethoden durchgeführt und es sei in diesem Zusammenhang auf die vor dem Beispiel 1 erwähnte Veröffentlichung von McCord et al. hingewiesen.
Offensichtlich ist ein Teil der MnSOD, die sich in der löslichen Fraktion befindet, inaktiv. Dies legt nahe, dass die grösste Menge der menschlichen MnSOD, die unter den Bedingungen dieses Beispiels produziert wird, tatsächlich inaktiv ist.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird der Einfluss der Konzentration an zweiwertigen Manganionen auf die Löslichkeit und die Aktivität der gebildeten MnSOD untersucht.
Es wurden zweiwertige Manganionen, also Ionen Mn<+><+> in ansteigenden Konzentrationen zugegeben, bis ein Gehalt von 450 ppm (450 Teilen pro Million) in dem Wachstumsmedium erreicht war, in welchem der Escherichia coli Stamm A4255, der das Plasmid pMSE-4 enthält, gezüchtet wurde. Die Zugabe der Manganionen erfolgte vor einer zwei Stunden dauernden Induktion bei 42 DEG C bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,7 und der Zusatz der Manganionen hatte keinen nachteiligen Einfluss auf die Gesamtausbeute an dem menschlichen MnSOD.
Nach der Ultraschallbehandlung wurden die löslichen Proteinfraktionen (s) und die nicht löslichen Proteinfraktionen (p) einer Gelelektrophorese auf eine Natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamidgel unterworfen. Diese Gelelektrophorese zeigte, dass die Löslichkeit des rekombinanten Proteines anstieg, wenn die Löslichkeit der zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium gesteigert wurde.
Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 1
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Mn<++> in ppm im Zuchtmedium:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an gebildeter menschlicher MnSOD:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>% an löslicher menschlicher MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge des löslichen bakteriellen Proteines:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Pro-
teine:
<tb> <SEP>0 <SEP>30,6 <SEP>7,2 <SEP>30
<tb> <SEP>50 <SEP>72,7 <SEP>15,4 <SEP>241
<tb> <SEP>100 <SEP>78,0 <SEP>16,9 <SEP>356
<tb> <SEP>150 <SEP>82,9 <SEP>18,8 <SEP>606
<tb> <SEP>200 <SEP>82,0 <SEP>20,8 <SEP>338
<tb> <SEP>250 <SEP>79,2 <SEP>20,4 <SEP>380
<tb> <SEP>300 <SEP>80,8 <SEP>20,3 <SEP>381
<tb> <SEP>450 <SEP>89,2 <SEP>22,4 <SEP>323
<tb></TABLE>
Die in der Tabelle 1 angeführte MnSOD-Aktivität wurde nach demjenigen Verfahren getestet, das in der Veröffentlichung von McCord et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Wie man aus den in der Tabelle 1 angeführten Daten sieht, ist ein Zusammenhang zwischen ansteigenden Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen in dem Zuchtmedium und der ansteigenden Löslichkeit der MnSOD festzustellen. Man sieht aus der Tabelle ferner, dass offensichtlich die optimale Konzentration in dem Medium bei 150 ppm an zweiwertigen Manganionen liegt. Die entsprechenden Werte sind auch graphisch in Fig. 3 veranschaulicht und auch dort ist sehr deutlich zu sehen, dass die höchste spezifische Aktivität pro mg des löslichen Proteines erreicht wird, wenn die Konzentration an Manganionen in dem Medium 150 ppm beträgt.
Ausserdem aktivierten erhöhte Mangankonzentrationen in dem Zuchtmedium das früher inaktive lösliche Enzym. Lösliche Proteinfraktionen von induzierten Kulturen, die bei diesen Mangangehalten gezüchtet wurden, zeigten einen bis zu 60-fachen Anstieg in der SOD Aktivität im Vergleich zu löslichen Proteinfraktionen von nicht induzierten Kulturen, die bei gleichen Mangangehalten in der Kultur gezüchtet wurden.
Die Aktivitätsfärbung von isoelektrisch fokussierenden Gelen, also sogenannten IEF Gelen, wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in der Veröffentlichung von Beauchamp et al. beschrieben ist, die unmittelbar vor dem Beispiel 1 genannt ist. Diese Färbetechnik zeigte, dass viele Formen der rekombinanten MnSOD identisch mit denjenigen der nativen menschlichen Leber-MnSOD waren.
Die Ergebnisse, die für die Produktion von menschlicher MnSOD durch den Escherichia coli Stamm A1645, der das Plasmid pMSE-4 enthielt, erzielt wurden, waren ähnlich denjenigen Ergebnissen, die oben beschrieben sind.
Beispiel 5
Herstellung des Tet<R>-menschlichen MnSOD-Expressions- Plasmides.
Das Tet<R>-menschliche Mangan-superoxid-dismutase-Expressions-Plasmid wird in der Folge mit pMS DELTA RB4 abgekürzt. Der Tet<R>-Expressionsvektor mit der Bezeichnung p DELTA RB, wurde aus pSOD beta 1T-11 hergestellt, indem man dieses einer vollständigen Verdauung mit dem Restriktionsenzym EcoRI unterwarf, worauf dann eine teilweise Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI erfolgte.
Das pSOD beta 1-T-11 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Accession No. 53 468 hinterlegt worden.
Das verdaute Plasmid wurde mit dem synthetischen Oligomer der Struktur
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
gebunden und man erhielt so das p DELTA RB des lambda PL Promoters.
Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmides pMSE-4, welches cII-ribosomale Bindungsstellen und die vollständige kodierende Sequenz des reifen Enzymes enthält, wurde in die einzige EcoRI Stelle von p DELTA RB eingefügt, also insertiert. Das so erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Kontrolle von lambda PL und cII RBS und es verleiht die Resistenz gegenüber Tetracyclin.
Das hier beschriebene Verfahren ist durch Fig. 4 veranschaulicht, in welcher oben links das Ausgangsprodukt pSOD beta 1T-11 veranschaulicht wird, einschliesslich der Stellen, wo die Spaltung mit den Restriktionsenzymen erfolgt, wobei das dabei entstehende grosse Fragment dann an den synthetischen Linker, nämlich das oben genannte synthetische Oligomere, gebunden wird. Auch das so hergestellte Endprodukt, nämlich das Plasmid mit der Bezeichnung pMS DELTA RB4 ist in dieser Fig. 4 unten in der Mitte dargestellt.
Beispiel 6
Expression von menschlichem MnSOD durch das Plasmid PMS DELTA RB4
Das Plasmid pMS DELTA RB4 wurde in den Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Arbeitsverfahren eingeführt.
Man liess die Kulturen bei 32 DEG C in einer Luria-Brühe wachsen, welche verschiedene Konzentrationen an zweiwertigen Manganionen enthielt, bis eine optische Dichte bei 600 nm von 0,7 erreicht wurde.
Die Induktion wurde bei 42 DEG C durchgeführt. Nach verschiedenen Zeiträumen wurden Proben genommen und diese Proben wurden durch Electrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen untersucht.
Es zeigte sich, dass der Gehalt an menschlichem MnSOD in der Induktionszeit bis zum Zeitraum von 120 Minuten anstieg. Zu diesem Zeitpunkt betrug das menschliche MnSOD etwa 15% der gesamten Zellproteine, wie dies durch ein Scanning festgestellt werden konnte, das unter Verwendung von einem mit Coomassie-Blau gefärbtem Gel durchgeführt wurde.
Unabhängig von der Konzentration an zweiwertigen Manganionen in dem Wachstumsmedium war das indu zierte MnSOD löslich. Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen, die im Beispiel 4 im Zusammenhang mit der Untersuchung des Amp<R>-Plasmides mit der Bezeichnung pMSE-4 gemacht wurden.
Auch in diesem Beispiel waren jedoch die maximale SOD Aktivität und das Ausmass der Expression, also der Expressionsspiegel, abhängig von der Menge an zweiwertigen Manganionen, die zur Verfügung gestellt wurden.
Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Tabelle 2
<tb>SubHead Col 01 to 04 AL=L: MnSOD-Expression in E.Coli A4255 (pMS DELTA RB4)
<tb>
<tb>Title: Gehalt an Mn<++> im Zuchtmedium in ppm
<tb>Title: Prozentsatz an löslichem menschlichen MnSOD, bezogen auf die Gesamtmenge an löslichen Bakterienproteinen
<tb>Title:
Spezifische Aktivität in Einheiten/mg der löslichen Proteine
<tb> <SEP>42 DEG DEG <SEP>32 DEG DEG <SEP>42 DEG DEG
<tb> <SEP>0 <SEP>10,9 <SEP>8,0 <SEP>23
<tb> <SEP>50 <SEP>19,8 <SEP>8,0 <SEP>227
<tb> <SEP>100 <SEP>16,0 <SEP>8,0 <SEP>241
<tb> <SEP>200 <SEP>17,0 <SEP>10,0 <SEP>278
<tb> <SEP>300 <SEP>16,0 <SEP>9,3 <SEP>238
<tb></TABLE>
Beispiel 7
Reinigung der enzymatisch aktiven menschlichen Mangan-superoxid-dismutase, die durch die rekombinante Gentechnologie hergestellt wurde.
Der Escherichia coli Stamm A4255 in dessen Zellen das Plasmid pMS DELTA RB4 aufgenommen worden war, wurde in Luria-Brühe gezüchtet, der 750 ppm an Mangan ionen, bezogen auf diese Brühe, zugesetzt worden waren. Die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 32 DEG C bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 17,0 erreicht hatte. Die Induktion der Expression der menschlichen MnSOD wurde durchgeführt, indem man während zwei Stunden lang eine Temperaturerhöhung auf 42 DEG C vornahm. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 43,0 erreicht. Die Zellen wurden aus der Kultur gewonnen, indem man zentrifugierte und die so isolierten Zellen wurden dann in 0,2 des ursprünglichen Volumens an einem 50 mM Kaliumphosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,8 aufwies und 250 mM an Natriumchlorid enthielt, erneut suspendiert.
Die Bakterien wurden dann durch ein zweimaliges Hindurchleiten durch eine Vorrichtung mit der Bezeichnung Dynomill aufgebrochen und dann wurde zentrifugiert und die Zellbruchstücke wurden verworfen.
Das so gewonnene überstehende Material wurde eine Stunde lang auf 60 DEG C erhitzt und dann auf 4 DEG C abgekühlt und das darüber stehende Material einer Klärung unterworfen. Das geklärte überstehende Material wurde dann auf 0,03 seines ursprünglichen Volumens konzentriert und gegen einen 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 dialysiert, und zwar unter Ver wendung einer Ultrafiltrationseinrichtung der Bezeichnung Pelicon-Ultrafiltration Unit, die mit einer 10K Membran ausgestattet war.
Das so erhaltene rohe Enzympräparat wurde auf eine DE52-Säule aufgebracht, gründlich mit einem 2 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 gewaschen und dann erfolgte die Elution mit einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8.
Diejenigen Fraktionen, welche das Enzym enthielten, wurden miteinander vereinigt und dann gegen eine 40 mM Lösung von Kaliumacetat eines pH-Wertes von 5,5 dialysiert. Anschliessend wurde das Material auf eine CM52-Säule aufgebracht und die Elution wurde durchgeführt, indem man einen Lineargradienten von 40 mM Kaliumacetat bis 200 mM Kaliumacetat anwandte, wobei die Kaliumacetatlösungen einen pH-Wert von 5,5 aufwiesen.
Diejenigen Peakfraktionen, die das menschliche MnSOD enthielten, wurden miteinander vereinigt und man dialysierte gegen Wasser. Anschliessend wurde das Enzympräparat so eingestellt, dass es sich in einem 10 mM Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 befand und dieses Produkt wurde dann bei -20 DEG C gefroren.
Das durch diese rekombinante Gentechnologie gewonnene menschliche MnSOD war reiner als 99%ig und die spezifische Aktivität dieses Produktes betrug etwa 3500 Einheiten/mg.
Die Gesamtausbeute bei diesem Reinigungsverfahren betrug etwa 30%.
Diese Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellt.
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Tabelle 3
<tb>SubHead Col 01 to 05 AL=L: Reinigung des durch rekombinante Gentechnologie gewonnenen menschlichen MnSOD
<tb>Title: Reinigungsstufe
<tb>Title: Gesamtmenge an Proteinen in g
<tb>Title: Ausbeute in g
<tb>Title: an MnSOD in %
<tb>Title:
Spezifische
Aktivität in
Einheiten/mg
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der Behandlung mit der Dynomill <SEP>100,0 <SEP>11,9 <SEP>100,0 <SEP>417
<tb> <SEP>Überstehendes Material nach der
Erhitzung auf 60 DEG C <SEP>24,0 <SEP>8,2 <SEP>68,9 <SEP>1197
<tb> <SEP>Retentat nach der Ultrafiltration mit der Peliconvorrichtung <SEP>20,0 <SEP>7,5 <SEP>63,0 <SEP>1350
<tb> <SEP>Eluat aus der DE52-Säule <SEP>7,3 <SEP>5,7 <SEP>48,0 <SEP>2732
<tb> <SEP>Eluat aus der CM52-Säule <SEP>4,2 <SEP>4,2 <SEP>35,3 <SEP>3500
<tb></TABLE>
Die in der Tabelle 3 angegebenen Werte beziehen sich auf das gereinigte Enzym, das unter Verwendung eines 15 Liter fassenden Gärbehälters hergestellt wurde.
Der Metallgehalt des durch die rekombinante Gentechnologie hergestellten MnSOD wurde durch Atomabsorption bestimmt und es zeigte sich, dass etwa 0,77 Atome an Mangan pro Enzymuntereinheit vorhanden sind. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit den entsprechenden Ergebnissen, die von McCord et al. in dem weiter vorne genannten Buch "Superoxide und Superoxid-dismutase" veröffentlicht sind.
The present documents are based on a continuation-in-part application of US application serial no. 801 090, which was filed on November 22, 1985, and reference is made to the statements made there.
Furthermore, reference is made to all disclosures mentioned in the publications mentioned in the present description.
Superoxide dismutase, which is subsequently abbreviated to SOD, and the phenomenon of free oxygen radicals, i.e. the radicals of the formula (O2-), were discovered by McCord in 1948, and it was in this context due to the publication by McCord, J.M. and Fridovich, I, in J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969).
Superoxide radicals and other highly reactive types of oxygen are generated in every breathing cell as a by-product of an oxidative metabolism and have been shown to cause severe damage to a large number of macromolecular components and cell components. In this context, reference is made to the publication by Fridovich, I. in "Advances in Inorganic Biochemistry", Verlag Eichhorn, G.L. and Marzilli, L.G. (Elsevier / North Holland, New York), pages 67-90 (1979) and on the publication by Freeman, B.A. and Crapo, J.D. in "Laboratory Investments" 47: 412-26 (1982).
A group of metalloproteins known as superoxide dismutases catalyze the oxidative reduction reaction of free oxygen radicals by the following reaction mechanism
2O2- + 2H <+> -> H2O2 + O2
These superoxide dismutases therefore represent a defense mechanism against the toxicity of oxygen.
There are several known forms of superoxide dismutases that contain different metals and different proteins. The metals contained in these superoxide dismutases include iron, manganese, copper and zinc. All known forms of superoxide dismutases catalyze the same reaction. These enzymes are found in different groups in the evolutionary series.
Superoxide dismutases containing iron are mainly found in prokaryotic cells.
Superoxide dismutases containing copper and zinc are found in practically all eukaryotic organisms. In this connection, it is due to the publication by Steinman, H.M. in "Superoxide Dismutase", Oberley Verlag, L.W. (CRC Press, Florida), pages 11-68 (1982).
Superoxide dismutases containing manganese have been found in organisms ranging from microorganisms to human beings.
Any biological macromolecule can be the product that is damaged by superfluous superoxide radicals and therefore the therapeutic possibilities of using superoxide dismutase have already been interested. The scientific literature suggests that superoxide dismutase can be useful in a wide range of clinical applications. These clinical applications include preventing oncogenesis, that is, preventing ulceration and preventing the formation of tumors, as well as reducing the cytotoxic and cardiotoxic effects of anti-cancer agents. It is in this context due to the publication by Oberley, L.W. and Buettner, G.R. in Cancer Research 39: 1141-49 (1979).
Further areas of application are the protection of ischemic tissues, i.e. bloodless tissues, and in this connection it is to the publication of McCord, J.M. and Roy, R.S. in Can. J. Physiol. Pharma, 60: 1346-52 (1982). Another area of application is the protection of spermatozoa and in this context reference should be made to the publication by Alvarez, J.G. and Storey, B.T. in Biol. Reprod. 28: 1129-36 (1983). There is also an interest in investigating the influence of superoxide dismutase on the aging process and in this context reference is made to the publication by Talmasoff, J.M., Ono, T. and Cutler, R.G. in proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2777-81 (1980).
Research into the therapeutic possibilities of human superoxide dismutase has so far been limited mainly by the limited amounts of this product available.
Superoxide dismutase is also of interest because it has anti-inflammatory properties. In this connection it is to the publication of Huber, W. and Menander-Huber, K.B. in Clinics in Rheum. Dis. 6: 465-87 (1980).
Bovine superoxide dismutase (orgotein) has been found to have anti-inflammatory properties and is currently commercially available in certain parts of Europe as a pharmaceutical preparation for human use. This product is also available in the United States as a pharmaceutical product for veterinary use and is particularly used to treat inflamed tendons in horses. But the extent to which orgotein is available is also limited. This product has been obtained from bovine cells or other animal cells according to the processes known to date, but these working methods are subject to drastic restrictions and the organotein obtained in this way can cause allergic reactions in humans because this product is not of human origin.
Copper-zinc superoxide dismutase, hereinafter abbreviated to CuZn SOD, is the most widely studied and best described form of the various forms of superoxide dismutase.
The human copper-zinc superoxide dismutase is a dimeric metallic-O-protein, which is made up of identical non-covalently bound subunits, each of which has a molecular weight of 16,000 Daltons and contains one atom of copper and one atom of zinc. In this connection, it is to the publication of Hartz, J.W. and German, H.F. in J. Biol. Chem. 247: 7043-50 (1972). Each of these subunits is composed of 153 amino acids and the amino acid sequence has also already been elucidated.
In this connection it is to the publication of Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. and Deutsch, H.F., in Biochemistry 19: 2310-16 (1980), and on the publication by Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. and Bossa, F. in FEBS Letters 120: 53-56 (1980).
The complementary deoxiribonucleic acid, subsequently abbreviated to cDNA encoding human copper-zinc superoxide dismutase, has been cloned. In this connection it is to the publication of Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. and Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2808-11 (1982). The full amino acid sequence of the cloned DNA has also already been elucidated. In this connection, reference is made to the publication by Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. and Groner, Y. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5465-69 (1983).
In addition, the expression vectors which contain a DNA which is encoded for superoxide dismutase have also been described, and the preparation and recovery of superoxide dismutase in bacteria have also been described. In this connection, reference is made to European Patent Publication No. 0 131 843 A1, which was published on January 23, 1985 and which corresponds to European Patent Application No. 84 107 717.5, which was filed on July 3, 1984, under stress the priority of United States application filed on July 15, 1983 Serial No. 514 188. Reference is also made to the publication by Hallewell, et al. In Nucleic Acids Res. 5, (1985).
Furthermore, the expression of a superoxide dismutase DNA and the production of superoxide dismutase in yeast have also already been described and reference should be made in this connection to the European patent publication 0 138 111 A1, which was published on April 24, 1985, which corresponds to European Patent Application No. 84 111 416.8, which was filed on September 25, 1984 and claims priority from October 3, 1983 of the United States patent application Serial No. 538,607 and U.S. May 11, 1984 priority patent application serial no. 609 412.
Recently, the gene location for CuZn SOD on human chromosome 21 has also been described and in this connection reference should be made to the publication in the EMBO Journal, Volume 4, No. 1, pages 77-84 (January 1985). The latest developments related to the copper-zinc superoxide dismutase have been summarized in the abstract of the fourth international conference on superoxides and superoxide dismutase, which took place in Rome, Italy, in the period from 1-6. September 1985.
However, much less is known about the manganese superoxide dismutase, which will subsequently also be abbreviated to MnSOD. The MnSOD of Escherichia coli K-12 has recently been cloned and included in the directory and in this connection reference is made to the publication by Touati, D., in the Journal of Bacteriology 155: 1078-87 (1983). Barra et al. describe a sequence of 196 amino acids for the MnSOD polypeptide isolated from human liver cells. In this connection it is to the publication of Barra, D., Schinina, ME, Simmaco, M., Bannister, JV, Bannister, WH, Rotilio, G. and Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259: 12595-601 (October 25, 1984).
However, the previous publications differ with regard to the structure of the MnSOD molecule, in particular as to whether it has two identical or four identical polypeptide subunits. In this connection, reference should be made to the publication by Barra just mentioned and also to the publication by McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. and Salin, M.L. in the book "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michaelson, A.M., McCord, J.M., and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, pages 129-138 (1977). However, it is clear that the MnSOD polypeptide and the CuZn-Sod polypeptide are not homologous and in this connection reference is made to the Barra publication mentioned.
The homologies of the amino acid sequence of different MnSOD and FeSOD, which originated from different sources, were compared with one another and in this connection it is to the publication by Harris, J.I. and Steinman, H.M. in the book "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Academic Press, London, pp. 225-230 (1977).
Baret et al. describe in a rat model that the half-life of human MnSOD is significantly longer than the half-life of human copper SOD. These authors also describe that in the rat model, human MnSOD and rat copper SOD are not effective as anti-inflammatory agents, while bovine copper SOD and human copper SOD are fully active. In this connection, reference is made to the publication by Baret, A., Jadot, G., and Michelson, A.M. in Biochemical Pharmacology 33: 2755-60 (September 1, 1984).
McCord et al. describe that the naturally occurring human MnSOD, i.e. the human manganese superoxide dismutase, protects the human phagocytic polymorphonuclear leukocytes, which are subsequently abbreviated as PMN leukocytes, better against free superoxide radicals than those derived from cattle or from Pig-derived copper-zinc superoxide dismutase, these results being obtained by in vitro tests. In this connection, reference is made to the publication by McCord, J.M. and Salin, M.L., in the book "Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes", Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. Verlag, pp. 257-264 (1977).
The present invention relates to a deoxiribonucleic acid molecule, hereinafter abbreviated as a cDNA molecule, which encodes the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof.
The present invention further relates to cloning vehicles which contain these deoxiribonucleic acid molecules and which are used for the expression of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, a mutant or an analog thereof or the expression of the human manganese superoxide dismutase prepolymer or a mutant or one Analogues of the same are suitable. Cells, for example cells of unicellular organisms, which contain these deoxiribonucleic acid molecules are for the production of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, a mutant or an analog thereof, or for the production of human manganese superoxide dismutase prepolypeptide or a mutant or an analog suitable, and preferred such unicellular organisms are bacteria.
If the human manganese superoxide dismutase polypeptide complexed with manganese is in any of its chemical forms, then this product is an enzyme that has the activity of human manganese superoxide dismutase. The corresponding enzymes can be used as active ingredients in pharmaceutical preparations for use in human medicine and in veterinary medicine. The corresponding pharmaceutical preparations are able to reduce damage during reperfusion after an emptiness, i.e. damage during reperfusion after ischemia. With the help of appropriate pharmaceutical preparations, an extended lifespan of removed and isolated organs can be guaranteed.
Furthermore, pharmaceutical preparations which contain the corresponding enzymes as an active ingredient are suitable for the treatment of inflammation.
The subject matter of the invention will now be explained in more detail.
A DNA molecule containing cDNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof was isolated from human T-cell cDNA fragments (T-cell library). The amino acid sequence of the nucleotide of a double-stranded DNA molecule encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof has been found. The amino acid sequence of a strand encoding the polypeptide or an analog thereof is shown in FIGS. 1a and 1b, and it extends from nucleotide 115 down to nucleotide 708. Other sequences which encode the analog or a mutant can be found in FIGS be substantially similar to the strand encoding the polypeptide.
The nucleotide sequence of the one strand of the double-stranded DNA molecule, which encodes a prepeptide comprising 24 amino acids, is also shown in FIG. 1a, specifically this amino acid sequence in the nucleotide ranges from amino acid 43 to amino acid 114 inclusive.
The double-stranded cDNA molecule or any other double-stranded DNA molecule that contains a nucleotide strand that has a sequence that contains the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof can be incorporated into a cloning vehicle and an example of a cloning vehicle is a plasmid or a virus. Either the DNA molecule can be inserted into a cell, either a procaryotic cell, such as a bacterial cell, or a eukaryotic cell, such as a yeast or mammalian cell, using known methods. These known methods include the use of a cloning vehicle that contains both molecules, but the invention is not limited to this method.
Preferably, the cDNA or the DNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof is incorporated into a plasmid, for example in pMSE-4 or pMS DELTA RB4, and then inserted into a suitable host cell in which the expression of the DNA can take place and the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof is produced. The human manganese superoxide dismutase is subsequently abbreviated as hMnSOD.
The preferred host cells include Escherichia coli, in particular Escherichia coli A4255 and Escherichia coli A1645. The plasmid pMSE-4 in the Escherichia coli strain A4255 was deposited with the American Type Culture Collection under ATCC No. 53250.
The plasmid pMS DELTA RB4 can be obtained as shown in FIG. 4. This method illustrated in FIG. 4 will be explained in more detail later.
Cells into which such DNA molecules have been introduced can be grown or cultured by methods known to those skilled in the art using appropriate conditions that require transcription of the DNA into the messenger ribonucleic acid, which subsequently is abbreviated with mRNA and allows expression of the mRNA as a protein. The manganese superoxide dismutase protein thus formed can then be obtained.
Pharmaceutical compositions which are suitable for use in veterinary medicine and in human medicine and which contain the human manganese superoxide dismutase, that is to say the human MnSOD or analogs or mutants thereof, can also be prepared and such pharmaceutical preparations generally contain a carrier material as a further component . These pharmaceutical preparations containing human manganese superoxide dismutase or an analog thereof or mutants thereof can be used to catalyze the following reaction:
2O2- + 2H <+> -> H2O2 + O2
By catalyzing this reduction, cell damage caused by superoxide radicals is reduced.
In particular, these enzymes or analogs or mutants thereof can be used to reduce damage which occurs when blood is re-circulated after an emptiness, i.e. reperfusion after ischemia, and to increase the survival time of isolated organs or to treat inflammation.
The present invention relates to a method for producing enzymatically active human manganese superoxide dismutase or analogs or mutants thereof in bacterial cells. The bacterial cell contains the DNA sequence and is capable of inducing expression of the DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase or an analogue or a mutant thereof.
In this method, the bacterial cell is placed under suitable conditions and in a production medium. This production medium contains a lot of manganese ions, i.e. Mn <+> <+> so that the concentration of these manganese ions available to the cell in the medium is higher than 2 ppm.
According to a preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell is an Escherichia coli cell which contains a plasmid which contains a DNA sequence which is encoded for the human manganese superoxide dismutase polypeptide, for example for pMSE-4 or pMS RB4 in the Escherichia coli strain A4255. The concentration of the manganese ions in the production medium in this case is preferably in the range from about 50 to about 1500 ppm, with concentrations in the range from 150 to 750 ppm being particularly preferred.
The present invention further relates to a method for obtaining manganese superoxide dismutase or an analogue thereof from bacterial cells which contain this dismutase. Generally, the cells are first subjected to treatment to obtain a protein fraction that contains proteins present in the cells, including human manganese superoxide dismutase or an analog or a mutant thereof. This protein fraction is then processed to obtain the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
According to a preferred embodiment of the invention, the cells are first treated in order to isolate soluble proteins from insoluble proteins and fragments of the cell wall, and the soluble proteins are obtained in the process. The soluble proteins are then further processed to separate a fraction of the soluble protein which contains the human manganese superoxide oxidase, abbreviated as hMnSOD or an analog or a mutant thereof. This separation of the desired fraction can take place, for example, by precipitation. The fraction which contains the hMnSOD or an analog thereof or a mutant thereof is obtained. This recovered fraction of soluble proteins is then processed to separately recover the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
A particularly preferred embodiment of the method according to the invention relates to a method for obtaining human manganese superoxide dismutase or an analog or a mutant thereof from bacterial cells which contain the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof. In this method, the bacterial cells are first separated from the production medium and then suspended in a suitable solution which has a pH of approximately 7.0 to 8.0.
The cells are then broken up and centrifuged, and the resulting supernatant material is then heated to a temperature in the range from 55-65 ° C. for about 30 to 120 minutes. The mixture is preferably heated to a temperature of 58-62 ° C. for 45-75 minutes and particularly preferably for one hour to a temperature of 60 ° C. Then the mixture is then cooled to a temperature below 10 ° C., preferably to 4 ° C. Any precipitate that has formed must be removed, for example by centrifugation, and the cooled material above it is then dialyzed against an appropriate buffer. An example of a suitable buffer is a 2 mN potassium phosphate buffer with a pH of about 7.8.
Dialysis is preferably carried out by ultrafiltration using a filtration membrane of less than 30K. Simultaneously with the dialysis or after the dialysis, the cooled material above it can, if necessary, be concentrated until a suitable and comfortable volume has been reached, for example to 0.03 of the initial volume.
The retentate is then eluted on an anion exchange chromatography column with a suitable buffer solution, for example a solution of at least 20 mM potassium phosphate buffer, which has a pH of 7.8. Those fractions of the eluate which contain superoxide dismutase are collected and combined and then dialyzed against an approximately 40 mM potassium acetate buffer with a pH of 5.5.
The dialyzed pooled fractions are then eluted through a cation exchange chromatography column which has a linear gradient from about 40 mM to about 200 mM potassium acetate and a pH of 5.5. Those peak fractions which contain the superoxide dismutase are collected and combined with one another.
If necessary, the combined peak fractions can then be dialyzed against a suitable solution, for example against water or a buffer solution from an approximately 10 mM potassium phosphate buffer which has a pH of approximately 7.8.
Another object of the present invention is the purified enzymatically active human manganese superoxide dismutase or analogues thereof, for example met-hMnSOD, or mutants thereof, these products being produced by the processes according to the invention.
Brief description of the figures
The amino acid sequence of the complementary deoxiribonucleic acid, abbreviated as cDNA of the human manganese superoxide dismutase, is illustrated in FIGS. 1a and 1b. This is subsequently abbreviated to MnSOD cDNA.
1a and 1b show the nucleotide sequence of the one strand of a double-stranded DNA molecule which encodes the human manganese superoxide dismutase and also the 198 amino acid sequence of the human manganese superoxide dismutase which corresponds to the DNA sequence. Figure 1a also shows the nucleotide sequence of one strand of the double-stranded DNA molecule which encodes a prepeptide for the mature human manganese superoxide dismutase, which prepeptide consists of 24 amino acids and has an amino acid sequence which corresponds to that of the DNA sequence. Parts of the 5 min and 3 min untranslated sequences are also shown.
The plasmid pMS8-4, which contains the MnSOD on an EcoRI insert labeled R1, was completely digested with the restriction enzymes NdeI and NarI. The large fragment formed during this restriction degradation was isolated and linked to a synthetic oligomer in the manner shown in FIG. 2. The large fragment extends from the NdeI restriction site at "8 o'clock" on pMS8-4 to the NarI restriction site at "3 o'clock" on plasmid pMS8-4. This restriction fragment contains the ampicillin resistance gene and also most of the MnSOD genes. This restriction degradation removed the 5 min untranslated region and the prepeptide coding region of the MnSOD gene. This restriction degradation also removed approximately 36 base pairs from the coding region of the mature MnSOD polyeptide.
These missing base pairs encoding the mature MnSOD were introduced by ligation to the synthetic linker illustrated in FIG. 2. The plasmid pMS8-NN obtained contains the coding region for the mature MnSOD and before it an ATG initiation codon.
The plasmid pMS8-NN mentioned above was digested or digested with EcoRI, the ends were filled using the Klenow fragment of polymerase 1 and then further digested with NdeI.
The small fragment harbors the MnSOD gene located between the filled EcoRI site and the NdeI site and this small fragment was isolated. This fragment corresponds to the region coding for MnSOD.
This fragment was inserted into pSOD alpha 13 which had been treated with NdeI and StuI.
Treatment of PSOD alpha 13 with NdeI and StuI and subsequent isolation of the large fragment results in a fragment that contains the lambda PL promoter sequence, the cII ribosomal binding site, the ampicillin resistance gene and most of the CuZn SOD genes.
However, the CuZn SOD gene is missing in the coding region for the 5 min end of the gene because this was removed by the restriction cleavage and the subsequent isolation of the large fragment.
The MnSOD gene from pMS8-NN was inserted between the NdeI and StuI sites of pSOD alpha 13. The pSOD alpha 13 can be obtained as described in European Patent Publication No. 0 173 280 of March 5, 1986, U.S. Patent Application Serial No. 644 245 corresponds to that described. This ligation formed the plasmid pMSE-4, which contains the regions coding for MnSOD and in front of which the cII-ribosomal binding site is located and under the control of the lambda PI promoter. The plasmid pMSE-4 was released on September 25, 1985 at the American Type Culture Collection under the ATCC Accession No. 53 250 has been deposited.
FIG. 3 illustrates the influence of the concentration of manganese ions on the activity of the superoxide dismutase that is formed in the microorganism Escherichia coli.
In this FIG. 3, the concentration of manganese ions, namely Mn, is on the abscissa <+> <+> given in the growth medium in ppm. This ranges from 0 ppm to 600 ppm. The ordinate of FIG. 3 shows the specific superoxide dismutase activity units per mg of the soluble protein.
The diagram of FIG. 3 thus shows the relationship between the specific activity, expressed in units per mg of the recombined soluble MnSOD, which was formed from the Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSE-4. In this figure, both the corresponding units for non-induction (at 32 ° C.) are listed, these are the corresponding columns not shown in broken lines, and furthermore the results are shown in this figure under the conditions of induction at 42 ° C. These are the corresponding dashed areas. As mentioned, the concentration of the ions of the divalent manganese in the growth medium is given in ppm, ie in parts per million.
4 shows the structure of pMS DELTA RB4, namely the human manganese superoxide dismutase expression plasmid.
The tet <R> expression vector, p DELTA RB was formed from the pSOD beta 1T-11 by completely degrading the pSOD beta 1T-11 with EcoRI and then performing a partial cleavage with the BamHI restriction enzymes.
The large fragment created by this degradation was isolated and bound to a synthetic oligomer, the sequence of which was as follows:
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
This gave p DELTA RB, which contains the lambda Pl promoter. The large EcoRI / BamHI restriction fragment formed in this degradation extends counterclockwise from the EcoRI site shown in the pSOD beta 1T11 restriction map to the "12 o'clock" position to the BamHI site that is shown in the pSOD 1T11 restriction map in the "5 o'clock" position. The pSOD beta 1T11 is with the American Type Culture Colection March 3, 1986 under Accession No. 53 468 have been deposited.
The EcoRI fragment from pMSE-4 was obtained by digesting pMSE-4 with EcoRI and isolating the small fragment that is formed during this degradation. This fragment is the fragment containing the MnSOD gene and extends on the pMSE-4 restriction map from the EcoRI site at the 1 o'clock position to the EcoRI site at the 3 o'clock position on the pMSE-4 - restriction card. The EcoRI fragment of the MnSOD expression plasmid pMSE-4, which contains the cII ribosomal binding site and the complete coding sequence of the mature enzyme, was introduced into the only EcoRI site of p DELTA RB. The plasmid pMS RB4 obtained contains the MnSOD gene under the control of lambda PI and cII RBS and it confers resistance to tetracycline.
The present invention will now be described in detail.
A double-stranded deoxiribonucleic acid molecule, which is subsequently abbreviated to DNA molecule, and which comprises complementary deoxiribonucleic acid, which contains human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof, has been isolated. This complementary deoxiribonucleic acid is subsequently abbreviated to cDNA. The double-stranded DNA molecule mentioned was isolated from a human T-cell cDNA genetic material or section with the English name "human T-cellcDNA library". This English designation means a collection of Escherichia coli bacteria or bacteriophage lambda, which contains the cDNA sections or inserts which were synthesized by the messenger RNA (abbreviated as MRNA), which was isolated from human T cells.
The nucleotide sequence of a double-stranded DNA molecule that encodes human manganese superoxide dismutase polypeptide or that encodes an analog or a mutant thereof has been found.
The sequence of the one strand of the DNA molecule encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof is shown in FIGS. 1a and b and this sequence comprises the nucleotides with the numbers 115 through 708 inclusive.
The sequence of the one strand encoding an analog of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, hereinafter referred to as hMnSOD analog, or a mutant of the human manganese superoxide dismutase, is essentially similar to that strand which encoded human manganese superoxide dismutase polypeptide, which is subsequently abbreviated to hMnSOD polypeptide.
The nucleotide sequence of the prepeptide of human manganese superoxide dismutase is also illustrated in Figures 1a and b. The nucleotides of numbers 43 through 114 encode this prepeptide.
The methods for producing the cDNA and for determining the sequence of the DNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof are known to a person skilled in the art and will become more detailed below described. In addition, now that the DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase has been elucidated, known synthetic methods can be used to produce DNA molecules that contain portions of this sequence.
Conventional cloning vehicles, such as plasmids, for example pBR322, or viruses or bacteriophages, for example lambda, can be modified or produced using known working methods which are suitable for producing new cloning vehicles which contain a cDNA which contains the human Manganese superoxide dismutase polypeptide or analogs thereof or mutants thereof.
Similarly, such cloning vehicles can be modified or created to contain DNA molecules, one strand of which contains a segment having the sequence of the human manganese superoxide dismutase polypeptide shown in Figures 1a and b or segments that are substantially similar to the segments shown. The inserted DNA molecules can be made by various methods, including enzymatic or chemical synthesis.
The cloning vehicles obtained are chemical entities that do not occur in nature and that can only be produced by modern technology called recombination DNA technology. The cloning vehicle is preferably a plasmid, for example pMSE-4 or pMS DELTA RB4. These cloning vehicles can be inserted into cells, either in procaryotic cells such as bacterial cells such as those from Escherichia coli, Bacillus subtilis, and similar bacterial cells, or they can be incorporated into eukaryotic cells such as in Yeast or mammalian cells using techniques well known to those skilled in the art, such as transformation, transfection, and the like.
Accordingly, those cells into which the cloning vehicle is introduced contain cDNA which encodes the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof, if this cDNA was present in the cloning vehicle or they become one Contain DNA containing one strand, all or part of the strand, which has the sequence of the human manganese superoxide dismutase polypeptide shown in Figures 1a and b or a sequence which essentially is similar to this sequence if such DNA was present in the cloning vehicle.
The cells of Escherichia coli are the preferred host cells for the cloning vehicles according to the invention. The currently preferred auxotrophic strain of Escherichia coli is strain A1645, which was deposited with the American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, which contains the plasmid pApoE-Ex2 and which is under the ATCC accession no. 39 787 is deposited. All deposits with the American Type Culture Collection, which are mentioned in the present documents, were carried out in accordance with the Budapest Treaty of International Recognition of deposited cultures of microorganisms.
The A1645 was made from A1637 by selection on Gal <+>, i.e. by selection for the ability to degrade galactose and also by loss of tetracycline resistance. It still contains elements of the phage lambda. Its phenotype is c600 r <-> m <+> gal <+> thr <-> leu <-> lacZ-bl (lambda cI857 DELTA Hl DELTA BamHl N <+>).
A1637 was obtained from the C600 by introducing transposon, which contains a gene for tetracycline resistance, into the galactose operon and also inserting elements of the phage lambda, including those elements which are responsible for the synthesis of the cI repressor. C600 can be obtained from the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 23 724 can be obtained.
The prototrophic strains of Escherichia coli, which allow a high level of expression of the polypeptide even when grown in a minimal medium, are even more preferred as host cells for the expression of the gene encoding manganese superoxide dismutase. A currently preferred prototrophic strain is A4255. The A4255 strain, which contains the plasmid pMSE-4, was obtained from the American Type Culture Collection under the ATCC Accession No. 53 250 deposited.
The resulting cells, into which a DNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof, has been inserted, can be treated, for example grown or expanded, as is appropriate for one It is known to those skilled in the art that the DNA directs the expression of the genetic information encoded by the DNA. For example, this DNA directs expression of the hMnSOD polypeptide or an analog or mutant thereof, and the cell accordingly expresses hMnSOD polypeptide or an analog or a mutant thereof, and these products can then be recovered.
In the present description, the term “superoxide dismutase” or the abbreviation “SOD” means an enzyme or a polypeptide which acts as a receptor on superoxide or free oxygen radicals or which catalyzes the following dismutation reaction:
2O2- + 2H <+> -> O2 + H2O2
The term "manganese superoxide dismutase", or the corresponding abbreviation "MnSOD", means in the present description any superoxide dismutase molecule which contains the chemical element manganese in any of its chemical forms.
In the present description, the expression "human manganese superoxide dismutase polypeptide", or the corresponding abbreviation "hMnSOD", means a polypeptide of 198 amino acids, part of which is shown in FIGS. 1a and b. The nitrogen end, that is the N-terminus of this sequence, is the lysine which is encoded by nucleotides 115-117 of FIG. 1a and the carboxylate end, that is the COOH terminus of this sequence is the lysine which is encoded by nucleotides 706-708 of Fig. 1b is coded.
The term "polypeptide-manganese complex" in the present specification means a molecule which contains a human manganese superoxide dismutase polypeptide in a complex with manganese in any chemical formula and which has the enzymatic activity of the naturally occurring human manganese superoxide -dismutase.
The term "human manganese superoxide dismutase" in the present specification means a molecule which comprises at least two human manganese superoxide dismutase polypeptides complexed with manganese in any of its chemical forms and which has the enzymatic activity of the naturally occurring human Has manganese superoxide dismutase.
The term "analog of human manganese superoxide dismutase polypeptide" in the present specification means a polypeptide comprising the human manganese superoxide dismutase polypeptide to which one or more is attached to either end or both ends of the amino acid sequence additional amino acids are bound.
In the present specification, the term "analog of the polypeptide-manganese complex" also means a molecule which comprises a polypeptide-manganese complex, the polypeptide portion of this complex comprising one or more additional amino acids which are located on one of the two ends or on both ends of the Polypeptides are bound.
In the present description, the expression “analogue of the human manganese superoxide dismutase” means a molecule which comprises at least two polypeptides, at least one of which is an analogue of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, in the form a complex with manganese in any of its chemical forms and which has the enzymatic activity of the naturally occurring human manganese superoxide dismutase.
In the present description, the expression "mutant of the human manganese superoxide dismutase polypeptide" means a polypeptide which has an amino acid sequence which is essentially identical to that of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, this amino acid sequence however differs from this polypeptide by one or more amino acids.
In the present description, the term “mutant of the polypeptide-manganese complex” is understood to mean a molecule which comprises a mutant of the human manganese superoxide dismutase polypeptide in a complex with manganese in any of its chemical forms and which has the enzymatic activity which has manganese superoxide dismutase.
In the present description, the expression “mutant of the human manganese superoxide dismutase” means a molecule which comprises at least two polypeptides, at least one of these polypeptides being a mutant of the human manganese superoxide dismutase polypeptide in a complex with manganese in is any of its chemical forms and this complex exhibits the enzymatic activity of the naturally occurring human manganese superoxide dismutase.
The mutants of the hMnSOD polypeptide and hMnSOD, which form part of the subject of the invention, can be made by mutating the DNA sequence shown in Figures 1a and b, the nitrogen end of this sequence being the lysine which is encoded by nucleotides 115-117 and the carboxyl end, that is the COOH terminus of this sequence, is encoded by nucleotides 706-708.
The DNA can be mutated according to methods which are known to a person skilled in the art and in this connection reference is made, for example, to the publication by Bauer et al., In Gene 37: 73-81 (1985). The mutated sequence can be inserted into suitable expression vectors according to the method described here, and these expression vectors can be inserted again into cells, which are then treated in such a way that the mutant DNA expresses the expression of the hMnSOD polypeptide mutants and the expression who conducts hMnSOD mutants.
The enzymatically active form of human manganese superoxide dismutase is believed to be a protein that has at least two and possibly four identical subunits, each of which has approximately 198 amino acids in the sequence shown in Figures 1a and b for the Human manganese superoxide dismutase is illustrated, wherein the nitrogen end, that is the N-terminus of the sequence, is the lysine which is encoded by nucleotides 115-117 of FIG. 1a and the carboxylate end, that is the COOH terminus of the sequence is the lysine which is encoded by nucleotides 706-708 of Figure 1b.
Human MnSOD or analogs thereof or mutants thereof can be formed from cells into which the DNA or cDNA encoding human manganese superoxide dismutase or its analogs or mutants has been introduced. The human MnSOD or analogues thereof or mutants thereof can be used to catalyze the dismutation or monovalent reduction of superoxide anions in the presence of protons to form hydrogen peroxide and the corresponding reaction is illustrated by the following equation:
EMI46.1
Pharmaceutical preparations for use in veterinary medicine or human medicine can also be produced which contain hMnSOD or one or more analogs or mutants of hMnSOD as the active ingredient and preferably also a suitable carrier material. Such support materials are well known to those skilled in the art.
Corresponding pharmaceutical preparations which contain hMnSOD as an active ingredient or an analogue or a mutant thereof can be administered directly or they can be formulated with the aid of further additives to corresponding pharmaceutical compositions which are then suitable for administration to a human patient or animal patient. Corresponding pharmaceutical preparations can be used to combat inflammation or to reduce damage that can occur from free oxygen radicals when the blood is re-supplied after an anemia, that is to say during reperfusion following ischemia, or during an organ transplant.
In these cases, the hMnSOD or an analogue of the same or a mutant thereof can be added directly, that is to say without any further additions, or in the form of a composition to the flushing medium, that is to say the perfusion medium, with which an isolated organ is flushed out, thereby damaging the isolated organ can be reduced by oxygen-free radicals in the perfusion after the isolation of the organ and thus the survival time of the isolated organ is extended.
In addition, corresponding pharmaceutical preparations containing hMnSOD as the active ingredient or analogs thereof or mutants thereof can be used to reduce neurological damage which can occur when the blood is re-supplied after an emptiness, i.e. when reperfusion is followed by ischemia, and the corresponding Pharmaceutical preparations can also be used to treat bronchial and lung malformations, i.e. bronchial pulmonary dysplasia.
Another object of the present invention is a method for producing the enzymatically active human manganese superoxide dismutase or an analog or a mutant thereof in bacterial cells. In this method, the bacterial cell contains a DNA sequence and is capable of expressing a DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof. In this method, the bacterial cell is left in a suitable production medium under suitable conditions. The production medium contains an amount of divalent manganese ions, i.e. Mn <+> <+> so that the concentration in these divalent manganese ions in the medium is kept higher than 2 ppm.
The bacterial cell can be any bacterium into which the DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase has been inserted using recombinant DNA techniques. This bacterium must be suitable for expression of the DNA sequence and for the production of the protein product. The appropriate conditions and the production medium vary depending on the species and the strain of the bacterium.
The bacterial cell can contain the DNA sequence encoding the superoxide dismutase or an analog thereof in the body of a vector DNA molecule, such as a plasmid. The vector or plasmid is constructed or constructed by recombinant DNA techniques so that it has incorporated the sequence encoding the superoxide dismutase at an appropriate location in the molecule.
According to a preferred embodiment of the invention, the bacterial cell is an Escherichia coli cell. A preferred auxotrophic strain of Escherichia coli is A1645.
A preferred prototrophic strain of Escherichia coli is A4255. The cells of Escherichia coli according to the invention contain a plasmid which encodes the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
According to a preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell contains the plasmid pMSE-4. A method for producing this plasmid is explained in the description of the figures and the plasmid itself is described in Example 2. This plasmid was deposited with the American Type Culture Collection under ATCC Accession No.53 250.
According to another preferred embodiment of this invention, the bacterial cell contains the plasmid pMS DELTA RB4. A method for producing this plasmid is explained in the description and in the figures, and the plasmid itself is described in Example 5. This plasmid can be derived from pSOD beta T-11, which is available from the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53 468 is stored.
According to special embodiments of the present invention, an enzymatically active analog of human manganese superoxide dismutase is produced by cells of the Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSE-4, and by cells of the Escherichia coli strain A4255, which produces the plasmid pMS DELTA RB4 included.
The suitable production medium for the bacterial cell can be any type of acceptable growth medium, such as a casein hydrolyzate medium or a Luria broth medium, which is subsequently abbreviated as LB medium. The latter medium is preferred.
Suitable breeding conditions depend on the strain of Escherichia coli and the plasmid containing it. For example, the strain Escherichia coli A4255, which contains the plasmid pMSE-4, is induced at 42 ° C. and left at this temperature for about 1-5 hours. The appropriate conditions with regard to the cultivation temperature, the cultivation time, the stirring and the aeration, both in the cultivation of the cultivation material and for the cultivation of the cultures to a suitable cell density before the production phase, and also for the maintenance of the cultivation during the production period, may vary and all of these possible variations are obvious to one skilled in the art.
The concentration of the divalent manganese ions, i.e. the Mn <+> <+> in the medium required to produce the enzymatically active manganese superoxide dismutase varies with the type of medium used.
It was found that concentrations of divalent manganese ions in the range from 150 ppm to 750 ppm are effective with a growth medium of the LB type. It is preferred that in all complex types of growth media the concentration of divalent manganese ions in the medium is in the range from about 50 to about 1500 ppm.
The specific ingredients for a suitable strain, growth medium, inoculation medium and production medium can vary and all of these variations are obvious to a person skilled in the art.
The present invention also relates to a method for obtaining human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof, starting from bacterial cells which contain them. The cells are first treated to obtain a protein fraction containing proteins present in the cells, and these proteins include human manganese superoxide dismutase or an analog thereof or a mutant thereof. The protein fraction is then treated appropriately to obtain the human manganese superoxide dismutase or an analog thereof or a mutant thereof.
According to a preferred embodiment of the invention, the cells are first treated in order to separate soluble proteins from insoluble proteins and fragments of the cell wall, and the soluble proteins are then obtained. The soluble proteins thus obtained are then treated to separate a fraction of the soluble proteins containing the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof, and this fraction is obtained. The corresponding treatment can, for example, be a precipitation. The fraction is then further processed to separately obtain the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
Particularly preferred embodiments of the present invention are described below.
First, the bacterial cells are isolated from the production medium and suspended in a suitable solution which has a pH in the range from about 7.0 to 8.0. The cells are then broken up and centrifuged.
The supernatant is separated and heated to a temperature in the range of about 55-65 ° C. for 30 to 120 minutes, preferably to a temperature of 58-62 ° C. for 45-75 minutes, and particularly preferably to 60 ° for one hour C. Following this heating phase, the mixture is then cooled to a temperature of less than 10 ° C., preferably to a temperature of approximately 4 ° C. If a precipitate has formed during this cooling process, it is removed, for example by centrifugation and then dialyzed the cooled supernatant against an appropriate buffer.
Preferably, the cooled supernatant is dialyzed by ultrafiltration using a filtration membrane that is less than 30K and more preferably 10K. A 2 MM potassium phosphate buffer with a pH of about 7.8 may be mentioned as an example of a suitable buffer.
After this dialysis or at the same time as this dialysis, the cooled supernatant can optionally be concentrated to a suitable volume. For example, a concentration of 0.03 of the original volume of the protruding material has been found to be suitable.
The material is then applied to a chromatography column containing anion exchangers, and this retentate is eluted with a suitable buffer solution, for example a solution of a 20 mM phosphate buffer, which has a pH of about 7.8.
The fractions of the eluted material which contain the superoxide dismutase are collected, combined and dialyzed against an approximately 40 mM potassium acetate solution with a pH of 5.5.
These combined and dialyzed fractions are then applied to a chromatography column filled with a cation exchanger and eluted with a linear gradient from about 40 mM potassium acetate solution to about 200 mM potassium acetate solution, these potassium acetate solutions having a pH of 5.5. Those peak fractions which contain the superoxide dismutase are collected and combined with one another. If necessary, the combined peak fractions can then be dialyzed against a suitable solution, for example against water or a buffer solution which is approximately 10 mM potassium phosphate and has a pH of approximately 7.8.
The present invention further relates to purified human manganese superoxide dismutase or analogues thereof or mutants thereof, these products being produced by the processes according to the invention and in the present context being understood as "purified" to mean that the products in question are essentially free of other substances of human origin.
In particular, the present invention relates to an analog of human manganese superoxide dismutase, which has at least two polypeptides, of which at least one of the polypeptides has the amino acid sequence shown in FIGS. 1a and b, the nitrogen end of this sequence being the lysine, which is characterized by 1a and the carboxylate end of this sequence is the lysine which is encoded by nucleotides 706-708 of FIG. 1b and in which amino acid sequence an additional methionine residue is bound to the nitrogen end of the amino acid sequence. This analogue of human manganese superoxide dismutase is subsequently abbreviated to Met-hMnSOD, in which abbreviation "Met" illustrates the additionally bound methionine residue.
According to a preferred embodiment of this product, this purified Met-hMnSOD has a specific activity of at least 3500 units / mg.
The present invention will now be explained in more detail by means of examples.
These examples are only intended to provide an even better understanding of the subject matter of the invention, but are not intended to limit the scope of the present invention in any way. It should also be pointed out that these examples do not contain any detailed explanations of the customary methods involved in the construction of vectors, the insertion of genes which code for polypeptides into such vectors or the introduction of the corresponding plasmids into hosts or host cells , affect. The examples also do not include a detailed description of common methods used to test polypeptides produced by such host vector systems, or to identify such polypeptides by activity staining methods of isoelectric focusing gels, hereinafter referred to as IEF gels be designated.
Such working methods are namely well known to the person skilled in the art in this field and are described in more detail in many publications, reference being made here to the following publications as examples:
T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sombrook, "Molecular Cloning", a laboratory handbook from the Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.
J.M. McCord and I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969), and C. Beauchamp and I. Fridovich, Anal. Biochem. 44: 276-87 (1971).
example 1
To identify the MnSOD cDNA clones, mixed oligomer samples were synthesized in accordance with the published amino acid sequence described in two publications mentioned earlier in the Harris, J.I. and Steinman, H.M., in the book Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, pages 225-230 (1977) and in the publication by Barra, D., Schinina, ME, Simmaco, M., Bannister, JV, Bannister, WH, Rotilio, G. and Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259: 12595-601 (October 25, 1984).
5 min sample - 30-mer sequence of AA15-AA24 (see these two publications.
EMI58.1
EMI59.1
3 min sample - 32-mer sequence of AA179-AA189 (see the second of the two publications mentioned)
EMI59.2
The 5 min sample consists of 30 nucleotides and corresponds to amino acids 15-24 of the mature MnSOD.
The 3 min sample consists of 32 nucleotides and corresponds to amino acids 179-189 of the mature MnSOD.
The 5 min sample is a mixed sample consisting of 36 different sequences, as illustrated above.
The 3 min sample is a mixed sample consisting of 16 different sequences as shown above.
If more than one nucleotide is shown in a given position in the scheme above, then the corresponding DNA strand was synthesized using equimolar amounts of each of the two nucleotides shown and is accordingly a mixed sample.
The 5 min sample was used to screen 300,000 plaques of a T-cell cDNA genetic section (with the English name T-cell cDNA library) cloned in a lambda-gt-10 vector. The hybridization to phage-plaque-replicas, which are immobilized on nitrocellulose filters, was carried out according to standard working methods and in this connection it should be referred to the publication by Maniatis et al. Mentioned immediately before Example 1. pointed out, the difference to the method described therein was that the hybridization was carried out at 50 ° C. in 8 × SSC for 16 hours. The filters were then washed at 50 ° C. with 5 × SSC and 0.1% SDS. Three positive plaques were isolated and these were called Phi MS8 or Phi MS1 or Phi MSlJ.
The EcoRI digested the DNA from Phi MS8 and the DNA from Phi MSL, and from this one can see that these two products have cDNA inserts, also known as cDNA inserts, which are approximately 800 bp long and both with the 5th min and the 3 min oligonucleotide samples hydride.
The Phi MSlJ carried only the cDNA insert or the cDNA insert in an amount of 450 bp, which hybridized only with the 5 min final sample.
The EcoRI inserts of the three phage clones were subcloned into the EcoRI site of pBR322 and pMS8-4, pMS1-4 and pMS1J were obtained in each case.
Restriction analysis and hybridization with the 5 min and 3 min oligonucleotide samples gave similar patterns, also referred to as patterns, for the two products pMS8-4 and pMS1-4.
The restriction map illustrated in Fig. 5 shows the 5 min -> 3 min orientation, and this was deduced for both plasmids.
The sequence of the cDNA insert of pMS8-4 is illustrated in Figures 1a and b. The predicted amino acid sequence differs from the amino acid sequence of the publication by Barra et al. Mentioned at the beginning of this example. in that Glu appears instead of Gln at three positions, namely at positions AA 42, 88, 108 and in that two additional amino acids, namely Gly and Trp, appear between AA123-124.
Sequence analysis of pMS1-4 and pMS1J showed that three MnSOD clones were derived independently and this sequence analysis confirmed the differences from the previously published amino acid sequence.
The sequence above the lysine of the nitrogen end group, ie the N-terminal lysine of the mature MnSOD, enables the prediction of a prepeptide sequence of 24 amino acids.
Example 2
Construction of the plasmid which causes the expression of the human manganese superoxide dismutase.
The plasmid which causes the expression of the human manganese superoxide dismutase is subsequently also called Amp <R> human MnSOD expression called plasmid and abbreviated as pMSE-4.
The starting product for the construction or construction of this pMSE-4 is the plasmid pMS8-4, which was produced by the method described in Example 1.
The plasmid pMS8-4, which contains human MnSOD cDNA on an EcoRI insert, which is also referred to as an EcoRI insert, was completely digested with the restriction enzymes NdeI and NarI. The large fragment was isolated and linked to a synthetic oligomer as illustrated in FIG. 2. The resulting plasmid, called pMS8-NN, which is also shown in FIG. 2, contains the coding region for the mature or final MnSOd, which is referred to in the English-language literature as mature MnSOD, and an ATG is located in front of this region Initiation codon. The above plasmid was digested with EcoRI, the ends were filled with the Klenow fragment of polymerase I and further digested with NdeI.
The small fragment containing the MnSOD gene was inserted into pSOD alpha 13, which was treated with NdeI and StuI.
Said pSOD alpha 13 can be obtained as described in European Patent Publication No. 0 173 280, which was published on March 5, 1986. Everything that is disclosed there also applies in the present case.
This produced the plasmid pMSE-4, which contains a region coding for the MnSOD, in front of which the cII-riosomal binding site is located and under the control of the lambda PL promoter.
The plasmid pMSE-4 was published by the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53 250 deposited. All of the working methods used in the process described above are essentially the same as those described in the Maniatis et al. Publication prior to Example 1.
Example 3
Expression of the recombinant human MnSOD
The plasmid pMSE-4 was inserted into the Escherichia coli strain A4255 using known working methods. The Escherichia coli strain 4255, which contains the plasmid pMSE-4, was then grown at 32 ° C. in a Luria broth medium, the medium containing 100 μg / ml medium of ampicillin. This growth was carried out until the optical density, abbreviated as "OD" at 600 nm, was 0.7.
The induction was carried out at 42 ° C. Samples were taken at various intervals and these were separated by electrophoresis on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. This sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis is subsequently abbreviated to "SDS-PAGE". From this gel electrophoresis, it was seen that the level of the human MnSOD formed increased up to 120 minutes after induction. At this point, the recombinant MnSOD protein made up 27% of the total cell proteins. The corresponding determination of the cell proteins was carried out by scanning with gel stained with Coomassie blue.
The samples were sonicated for 90 seconds with a W-375 ultrasound device and the proteins were divided into soluble protein fractions, which are subsequently referred to as s fractions, and into insoluble protein fractions, which are subsequently referred to as p fractions by centrifugation using 10,000 g for 5 minutes. It was found that the tested amount of the recombinant MnSOD formed was not soluble.
The induced soluble protein fraction contained only slightly more of the MnSOD activity than the protein fraction of the uninduced parallel experiment. These tests were carried out according to the standard methods and in this connection it should be referred to the McCord et al. Publication mentioned before Example 1. pointed out.
Obviously, part of the MnSOD that is in the soluble fraction is inactive. This suggests that most of the human MnSOD produced under the conditions of this example is actually inactive.
Example 4
In this example the influence of the concentration of divalent manganese ions on the solubility and the activity of the MnSOD formed is examined.
Divalent manganese ions, i.e. ions Mn <+> <+> added in increasing concentrations until a level of 450 ppm (450 parts per million) was reached in the growth medium in which the Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSE-4, was grown. The addition of the manganese ions took place before a two-hour induction at 42 ° C. with an optical density at 600 nm of 0.7, and the addition of the manganese ions had no adverse effect on the overall yield on the human MnSOD.
After the ultrasound treatment, the soluble protein fractions (s) and the insoluble protein fractions (p) were subjected to gel electrophoresis on a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel. This gel electrophoresis showed that the solubility of the recombinant protein increased when the solubility of the divalent manganese ions in the growth medium was increased.
The corresponding results are summarized in Table 1 below.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Head Col 01 to 04 AL = L: Table 1
<tb> SubHead Col 01 AL = L> Mn <++> in ppm in the culture medium:
<tb> SubHead Col 02 AL = L>% of soluble human MnSOD, based on the total amount of human MnSOD formed:
<tb> SubHead Col 03 AL = L>% of soluble human MnSOD, based on the total amount of soluble bacterial protein:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> Specific activity in units / mg of the soluble pro
lines:
<tb> <SEP> 0 <SEP> 30.6 <SEP> 7.2 <SEP> 30
<tb> <SEP> 50 <SEP> 72.7 <SEP> 15.4 <SEP> 241
<tb> <SEP> 100 <SEP> 78.0 <SEP> 16.9 <SEP> 356
<tb> <SEP> 150 <SEP> 82.9 <SEP> 18.8 <SEP> 606
<tb> <SEP> 200 <SEP> 82.0 <SEP> 20.8 <SEP> 338
<tb> <SEP> 250 <SEP> 79.2 <SEP> 20.4 <SEP> 380
<tb> <SEP> 300 <SEP> 80.8 <SEP> 20.3 <SEP> 381
<tb> <SEP> 450 <SEP> 89.2 <SEP> 22.4 <SEP> 323
<tb> </TABLE>
The MnSOD activity shown in Table 1 was tested by the method described in the McCord et al. is described, which is mentioned immediately before Example 1. As can be seen from the data listed in Table 1, a relationship can be established between increasing concentrations of divalent manganese ions in the growth medium and the increasing solubility of MnSOD. It can also be seen from the table that the optimal concentration in the medium is obviously 150 ppm of divalent manganese ions. The corresponding values are also illustrated graphically in FIG. 3 and it can also be seen very clearly there that the highest specific activity per mg of the soluble protein is achieved when the concentration of manganese ions in the medium is 150 ppm.
In addition, increased manganese concentrations in the growth medium activated the previously inactive soluble enzyme. Soluble protein fractions from induced cultures grown at these manganese levels showed up to a 60-fold increase in SOD activity compared to soluble protein fractions from non-induced cultures grown at the same manganese levels in the culture.
The activity staining of isoelectric focusing gels, so-called IEF gels, was carried out according to the method described in the Beauchamp et al. is described, which is mentioned immediately before Example 1. This staining technique showed that many forms of recombinant MnSOD were identical to those of native human liver MnSOD.
The results obtained for the production of human MnSOD by Escherichia coli strain A1645, which contained plasmid pMSE-4, were similar to the results described above.
Example 5
Production of the tet <R> human MnSOD expression plasmids.
The tet <R> human manganese superoxide dismutase expression plasmid is subsequently abbreviated to pMS DELTA RB4. The tet <R> expression vector, designated p DELTA RB, was prepared from pSOD beta 1T-11 by subjecting it to complete digestion with the restriction enzyme EcoRI, followed by partial cleavage with the restriction enzyme BamHI.
The pSOD beta 1-T-11 is available from the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53 468 have been deposited.
The digested plasmid was constructed using the synthetic oligomer
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
bound and you got the p DELTA RB of the lambda PL promoter.
The EcoRI fragment of the MnSOD expression plasmid pMSE-4, which contains cII-ribosomal binding sites and the complete coding sequence of the mature enzyme, was inserted into the only EcoRI site of p DELTA RB. The resulting plasmid, called pMS DELTA RB4, contains the MnSOD gene under the control of lambda PL and cII RBS and confers resistance to tetracycline.
The process described here is illustrated by FIG. 4, in which the starting product pSOD beta 1T-11 is illustrated at the top left, including the locations where the cleavage with the restriction enzymes takes place, the resulting large fragment then being attached to the synthetic linker, namely the above-mentioned synthetic oligomer. The end product thus produced, namely the plasmid with the designation pMS DELTA RB4, is shown in the bottom center of this FIG. 4.
Example 6
Expression of human MnSOD by the plasmid PMS DELTA RB4
The plasmid pMS DELTA RB4 was introduced into the Escherichia coli strain A4255 using known working methods.
The cultures were allowed to grow at 32 ° C. in a Luria broth which contained different concentrations of divalent manganese ions until an optical density at 600 nm of 0.7 was reached.
The induction was carried out at 42 ° C. Samples were taken after various periods of time and these samples were examined by electrophoresis on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels.
It was shown that the content of human MnSOD increased in the induction time up to a period of 120 minutes. At this point, the human MnSOD was approximately 15% of the total cell proteins, as could be seen from a scan performed using a gel stained with Coomassie blue.
Regardless of the concentration of divalent manganese ions in the growth medium, the induced MnSOD was soluble. This is in contrast to the observations made in Example 4 in connection with the examination of the amp <R> plasmids with the designation pMSE-4 were made.
In this example too, however, the maximum SOD activity and the extent of the expression, that is to say the expression level, were dependent on the amount of divalent manganese ions which were made available.
The corresponding results are summarized in Table 2 below.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Head Col 01 to 04 AL = L: Table 2
<tb> SubHead Col 01 to 04 AL = L: MnSOD expression in E. Coli A4255 (pMS DELTA RB4)
<tb>
<tb> Title: Mn content <++> in the breeding medium in ppm
<tb> Title: Percentage of soluble human MnSOD based on the total amount of soluble bacterial proteins
<tb> Title:
Specific activity in units / mg of soluble proteins
<tb> <SEP> 42 DEG DEG <SEP> 32 DEG DEG <SEP> 42 DEG DEG
<tb> <SEP> 0 <SEP> 10.9 <SEP> 8.0 <SEP> 23
<tb> <SEP> 50 <SEP> 19.8 <SEP> 8.0 <SEP> 227
<tb> <SEP> 100 <SEP> 16.0 <SEP> 8.0 <SEP> 241
<tb> <SEP> 200 <SEP> 17.0 <SEP> 10.0 <SEP> 278
<tb> <SEP> 300 <SEP> 16.0 <SEP> 9.3 <SEP> 238
<tb> </TABLE>
Example 7
Purification of the enzymatically active human manganese superoxide dismutase produced by the recombinant genetic engineering.
The Escherichia coli strain A4255, in whose cells the plasmid pMS DELTA RB4 had been taken up, was grown in Luria broth to which 750 ppm of manganese ions, based on this broth, had been added. The cultivation was carried out at a temperature of 32 ° C. until the culture had an optical density at 600 nm of 17.0. Induction of human MnSOD expression was carried out by raising the temperature to 42 ° C. over two hours. At this point the culture had reached an optical density at 600 nm of 43.0. The cells were obtained from the culture by centrifugation and the cells thus isolated were then resuspended in 0.2 of the original volume in a 50 mM potassium phosphate buffer which had a pH of 7.8 and contained 250 mM in sodium chloride .
The bacteria were then broken up by passing them twice through a device called Dynomill and then centrifuged and the cell debris discarded.
The supernatant material thus obtained was heated to 60 ° C. for one hour and then cooled to 4 ° C. and the material above it was subjected to clarification. The clarified supernatant was then concentrated to 0.03 of its original volume and dialyzed against a 2 mM potassium phosphate buffer at pH 7.8 using an Pelaf-Ultrafiltration Unit ultrafiltration device equipped with a 10K membrane was.
The crude enzyme preparation thus obtained was applied to a DE52 column, washed thoroughly with a 2 mM potassium phosphate buffer of pH 7.8 and then eluted with a 20 mM potassium phosphate buffer of pH 7.8.
Those fractions containing the enzyme were pooled together and then dialyzed against a 40 mM solution of potassium acetate pH 5.5. The material was then applied to a CM52 column and the elution was carried out using a linear gradient from 40 mM potassium acetate to 200 mM potassium acetate, the potassium acetate solutions having a pH of 5.5.
Those peak fractions containing the human MnSOD were pooled and dialyzed against water. The enzyme preparation was then adjusted so that it was in a 10 mM phosphate buffer with a pH of 7.8 and this product was then frozen at -20 ° C.
The human MnSOD obtained by this recombinant genetic engineering was purer than 99% and the specific activity of this product was about 3500 units / mg.
The overall yield from this cleaning process was about 30%.
These results are summarized in Table 3 below.
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Head Col 01 to 05 AL = L: Table 3
<tb> SubHead Col 01 to 05 AL = L: Purification of human MnSOD obtained by recombinant genetic engineering
<tb> Title: cleaning level
<tb> Title: total amount of proteins in g
<tb> Title: Yield in g
<tb> Title: an MnSOD in%
<tb> Title:
Specific
Activity in
Units / mg
<tb> <SEP> Surplus material after treatment with the Dynomill <SEP> 100.0 <SEP> 11.9 <SEP> 100.0 <SEP> 417
<tb> <SEP> Surplus material after the
Heating to 60 ° C. <SEP> 24.0 <SEP> 8.2 <SEP> 68.9 <SEP> 1197
<tb> <SEP> Retentate after ultrafiltration with the Pelicon device <SEP> 20.0 <SEP> 7.5 <SEP> 63.0 <SEP> 1350
<tb> <SEP> eluate from the DE52 column <SEP> 7.3 <SEP> 5.7 <SEP> 48.0 <SEP> 2732
<tb> <SEP> Eluate from the CM52 column <SEP> 4.2 <SEP> 4.2 <SEP> 35.3 <SEP> 3500
<tb> </TABLE>
The values given in Table 3 refer to the purified enzyme, which was produced using a 15 liter fermentation tank.
Examination of the amino acid sequence of the purified enzyme showed that an additional methionine residue was present at the nitrogen end of the amino acid sequence, in comparison to the known amino acid sequence of MnSOD obtained from human cells, which was described in the publication by Barra et al. is described.
The metal content of the MnSOD produced by recombinant genetic engineering was determined by atomic absorption and it was found that there are approximately 0.77 atoms of manganese per enzyme subunit. This value is in good agreement with the corresponding results published by McCord et al. in the book "Superoxide und Superoxid-dismutase" mentioned above.
The present documents are based on a continuation-in-part application of US application serial no. 801 090, which was filed on November 22, 1985, and reference is made to the statements made there.
Furthermore, reference is made to all disclosures mentioned in the publications mentioned in the present description.
Superoxide dismutase, which is subsequently abbreviated to SOD, and the phenomenon of free oxygen radicals, i.e. the radicals of the formula (O2-), were discovered by McCord in 1948, and it was in this context due to the publication by McCord, J.M. and Fridovich, I, in J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969).
Superoxide radicals and other highly reactive types of oxygen are generated in every breathing cell as a by-product of an oxidative metabolism and have been shown to cause severe damage to a large number of macromolecular components and cell components. In this context, reference is made to the publication by Fridovich, I. in "Advances in Inorganic Biochemistry", Verlag Eichhorn, G.L. and Marzilli, L.G. (Elsevier / North Holland, New York), pages 67-90 (1979) and on the publication by Freeman, B.A. and Crapo, J.D. in "Laboratory Investments" 47: 412-26 (1982).
A group of metalloproteins known as superoxide dismutases catalyze the oxidative reduction reaction of free oxygen radicals by the following reaction mechanism
2O2- + 2H <+> -> H2O2 + O2
These superoxide dismutases therefore represent a defense mechanism against the toxicity of oxygen.
There are several known forms of superoxide dismutases that contain different metals and different proteins. The metals contained in these superoxide dismutases include iron, manganese, copper and zinc. All known forms of superoxide dismutases catalyze the same reaction. These enzymes are found in different groups in the evolutionary series.
Superoxide dismutases containing iron are mainly found in prokaryotic cells.
Superoxide dismutases containing copper and zinc are found in practically all eukaryotic organisms. In this connection, it is due to the publication by Steinman, H.M. in "Superoxide Dismutase", Oberley Verlag, L.W. (CRC Press, Florida), pages 11-68 (1982).
Superoxide dismutases containing manganese have been found in organisms ranging from microorganisms to human beings.
Any biological macromolecule can be the product that is damaged by superfluous superoxide radicals and therefore the therapeutic possibilities of using superoxide dismutase have already been interested. The scientific literature suggests that superoxide dismutase can be useful in a wide range of clinical applications. These clinical applications include preventing oncogenesis, that is, preventing ulceration and preventing the formation of tumors, as well as reducing the cytotoxic and cardiotoxic effects of anti-cancer agents. It is in this context due to the publication by Oberley, L.W. and Buettner, G.R. in Cancer Research 39: 1141-49 (1979).
Further areas of application are the protection of ischemic tissues, i.e. bloodless tissues, and in this connection it is to the publication of McCord, J.M. and Roy, R.S. in Can. J. Physiol. Pharma, 60: 1346-52 (1982). Another area of application is the protection of spermatozoa and in this context reference should be made to the publication by Alvarez, J.G. and Storey, B.T. in Biol. Reprod. 28: 1129-36 (1983). There is also an interest in investigating the influence of superoxide dismutase on the aging process and in this context reference is made to the publication by Talmasoff, J.M., Ono, T. and Cutler, R.G. in proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2777-81 (1980).
Research into the therapeutic possibilities of human superoxide dismutase has so far been limited mainly by the limited amounts of this product available.
Superoxide dismutase is also of interest because it has anti-inflammatory properties. In this connection it is to the publication of Huber, W. and Menander-Huber, K.B. in Clinics in Rheum. Dis. 6: 465-87 (1980).
Bovine superoxide dismutase (orgotein) has been found to have anti-inflammatory properties and is currently commercially available in certain parts of Europe as a pharmaceutical preparation for human use. This product is also available in the United States as a pharmaceutical product for veterinary use and is particularly used to treat inflamed tendons in horses. But the extent to which orgotein is available is also limited. This product has been obtained from bovine cells or other animal cells according to the processes known to date, but these working methods are subject to drastic restrictions and the organotein obtained in this way can cause allergic reactions in humans because this product is not of human origin.
Copper-zinc superoxide dismutase, hereinafter abbreviated to CuZn SOD, is the most widely studied and best described form of the various forms of superoxide dismutase.
The human copper-zinc superoxide dismutase is a dimeric metallic-O-protein, which is made up of identical non-covalently bound subunits, each of which has a molecular weight of 16,000 Daltons and contains one atom of copper and one atom of zinc. In this connection, it is to the publication of Hartz, J.W. and German, H.F. in J. Biol. Chem. 247: 7043-50 (1972). Each of these subunits is composed of 153 amino acids and the amino acid sequence has also already been elucidated.
In this connection it is to the publication of Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. and Deutsch, H.F., in Biochemistry 19: 2310-16 (1980), and on the publication by Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. and Bossa, F. in FEBS Letters 120: 53-56 (1980).
The complementary deoxiribonucleic acid, subsequently abbreviated to cDNA encoding human copper-zinc superoxide dismutase, has been cloned. In this connection it is to the publication of Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. and Groner, Y., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2808-11 (1982). The full amino acid sequence of the cloned DNA has also already been elucidated. In this connection, reference is made to the publication by Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. and Groner, Y. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5465-69 (1983).
In addition, the expression vectors which contain a DNA which is encoded for superoxide dismutase have also been described, and the preparation and recovery of superoxide dismutase in bacteria have also been described. In this connection, reference is made to European Patent Publication No. 0 131 843 A1, which was published on January 23, 1985 and which corresponds to European Patent Application No. 84 107 717.5, which was filed on July 3, 1984, under stress the priority of United States application filed on July 15, 1983 Serial No. 514 188. Reference is also made to the publication by Hallewell, et al. In Nucleic Acids Res. 5, (1985).
Furthermore, the expression of a superoxide dismutase DNA and the production of superoxide dismutase in yeast have also already been described and reference should be made in this connection to the European patent publication 0 138 111 A1, which was published on April 24, 1985, which corresponds to European Patent Application No. 84 111 416.8, which was filed on September 25, 1984 and claims priority from October 3, 1983 of the United States patent application Serial No. 538,607 and U.S. May 11, 1984 priority patent application serial no. 609 412.
Recently, the gene location for CuZn SOD on human chromosome 21 has also been described and in this connection reference should be made to the publication in the EMBO Journal, Volume 4, No. 1, pages 77-84 (January 1985). The latest developments related to the copper-zinc superoxide dismutase have been summarized in the abstract of the fourth international conference on superoxides and superoxide dismutase, which took place in Rome, Italy, in the period from 1-6. September 1985.
However, much less is known about the manganese superoxide dismutase, which will subsequently also be abbreviated to MnSOD. The MnSOD of Escherichia coli K-12 has recently been cloned and included in the directory and in this connection reference is made to the publication by Touati, D., in the Journal of Bacteriology 155: 1078-87 (1983). Barra et al. describe a sequence of 196 amino acids for the MnSOD polypeptide isolated from human liver cells. In this connection it is to the publication of Barra, D., Schinina, ME, Simmaco, M., Bannister, JV, Bannister, WH, Rotilio, G. and Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259: 12595-601 (October 25, 1984).
However, the previous publications differ with regard to the structure of the MnSOD molecule, in particular as to whether it has two identical or four identical polypeptide subunits. In this connection, reference should be made to the publication by Barra just mentioned and also to the publication by McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. and Salin, M.L. in the book "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michaelson, A.M., McCord, J.M., and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, pages 129-138 (1977). However, it is clear that the MnSOD polypeptide and the CuZn-Sod polypeptide are not homologous and in this connection reference is made to the Barra publication mentioned.
The homologies of the amino acid sequence of different MnSOD and FeSOD, which originated from different sources, were compared with one another and in this connection it is to the publication by Harris, J.I. and Steinman, H.M. in the book "Superoxide and Superoxide Dismutase", Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Academic Press, London, pp. 225-230 (1977).
Baret et al. describe in a rat model that the half-life of human MnSOD is significantly longer than the half-life of human copper SOD. These authors also describe that in the rat model, human MnSOD and rat copper SOD are not effective as anti-inflammatory agents, while bovine copper SOD and human copper SOD are fully active. In this connection, reference is made to the publication by Baret, A., Jadot, G., and Michelson, A.M. in Biochemical Pharmacology 33: 2755-60 (September 1, 1984).
McCord et al. describe that the naturally occurring human MnSOD, i.e. the human manganese superoxide dismutase, protects the human phagocytic polymorphonuclear leukocytes, which are subsequently abbreviated as PMN leukocytes, better against free superoxide radicals than those derived from cattle or from Pig-derived copper-zinc superoxide dismutase, these results being obtained by in vitro tests. In this connection, reference is made to the publication by McCord, J.M. and Salin, M.L., in the book "Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes", Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. Verlag, pp. 257-264 (1977).
The present invention relates to a deoxiribonucleic acid molecule, hereinafter abbreviated as a cDNA molecule, which encodes the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof.
The present invention further relates to cloning vehicles which contain these deoxiribonucleic acid molecules and which are used for the expression of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, a mutant or an analog thereof or the expression of the human manganese superoxide dismutase prepolymer or a mutant or one Analogues of the same are suitable. Cells, for example cells of unicellular organisms, which contain these deoxiribonucleic acid molecules are for the production of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, a mutant or an analog thereof, or for the production of human manganese superoxide dismutase prepolypeptide or a mutant or an analog suitable, and preferred such unicellular organisms are bacteria.
If the human manganese superoxide dismutase polypeptide complexed with manganese is in any of its chemical forms, then this product is an enzyme that has the activity of human manganese superoxide dismutase. The corresponding enzymes can be used as active ingredients in pharmaceutical preparations for use in human medicine and in veterinary medicine. The corresponding pharmaceutical preparations are able to reduce damage during reperfusion after an emptiness, i.e. damage during reperfusion after ischemia. With the help of appropriate pharmaceutical preparations, an extended lifespan of removed and isolated organs can be guaranteed.
Furthermore, pharmaceutical preparations which contain the corresponding enzymes as an active ingredient are suitable for the treatment of inflammation.
The subject matter of the invention will now be explained in more detail.
A DNA molecule containing cDNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof was isolated from human T-cell cDNA fragments (T-cell library). The amino acid sequence of the nucleotide of a double-stranded DNA molecule encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof has been found. The amino acid sequence of a strand encoding the polypeptide or an analog thereof is shown in FIGS. 1a and 1b, and it extends from nucleotide 115 down to nucleotide 708. Other sequences which encode the analog or a mutant can be found in FIGS be substantially similar to the strand encoding the polypeptide.
The nucleotide sequence of the one strand of the double-stranded DNA molecule, which encodes a prepeptide comprising 24 amino acids, is also shown in FIG. 1a, specifically this amino acid sequence in the nucleotide ranges from amino acid 43 to amino acid 114 inclusive.
The double-stranded cDNA molecule or any other double-stranded DNA molecule that contains a nucleotide strand that has a sequence that contains the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof can be incorporated into a cloning vehicle and an example of a cloning vehicle is a plasmid or a virus. Either the DNA molecule can be inserted into a cell, either a procaryotic cell, such as a bacterial cell, or a eukaryotic cell, such as a yeast or mammalian cell, using known methods. These known methods include the use of a cloning vehicle that contains both molecules, but the invention is not limited to this method.
Preferably, the cDNA or the DNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof is incorporated into a plasmid, for example in pMSE-4 or pMS DELTA RB4, and then inserted into a suitable host cell in which the expression of the DNA can take place and the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof is produced. The human manganese superoxide dismutase is subsequently abbreviated as hMnSOD.
The preferred host cells include Escherichia coli, in particular Escherichia coli A4255 and Escherichia coli A1645. The plasmid pMSE-4 in the Escherichia coli strain A4255 was deposited with the American Type Culture Collection under ATCC No. 53250.
The plasmid pMS DELTA RB4 can be obtained as shown in FIG. 4. This method illustrated in FIG. 4 will be explained in more detail later.
Cells into which such DNA molecules have been introduced can be grown or cultured by methods known to those skilled in the art using appropriate conditions that require transcription of the DNA into the messenger ribonucleic acid, which subsequently is abbreviated with mRNA and allows expression of the mRNA as a protein. The manganese superoxide dismutase protein thus formed can then be obtained.
Pharmaceutical compositions which are suitable for use in veterinary medicine and in human medicine and which contain the human manganese superoxide dismutase, that is to say the human MnSOD or analogs or mutants thereof, can also be prepared and such pharmaceutical preparations generally contain a carrier material as a further component . These pharmaceutical preparations containing human manganese superoxide dismutase or an analog thereof or mutants thereof can be used to catalyze the following reaction:
2O2- + 2H <+> -> H2O2 + O2
By catalyzing this reduction, cell damage caused by superoxide radicals is reduced.
In particular, these enzymes or analogs or mutants thereof can be used to reduce damage which occurs when blood is re-circulated after an emptiness, i.e. reperfusion after ischemia, and to increase the survival time of isolated organs or to treat inflammation.
The present invention relates to a method for producing enzymatically active human manganese superoxide dismutase or analogs or mutants thereof in bacterial cells. The bacterial cell contains the DNA sequence and is capable of inducing expression of the DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase or an analogue or a mutant thereof.
In this method, the bacterial cell is placed under suitable conditions and in a production medium. This production medium contains a lot of manganese ions, i.e. Mn <+> <+> so that the concentration of these manganese ions available to the cell in the medium is higher than 2 ppm.
According to a preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell is an Escherichia coli cell which contains a plasmid which contains a DNA sequence which is encoded for the human manganese superoxide dismutase polypeptide, for example for pMSE-4 or pMS RB4 in the Escherichia coli strain A4255. The concentration of the manganese ions in the production medium in this case is preferably in the range from about 50 to about 1500 ppm, with concentrations in the range from 150 to 750 ppm being particularly preferred.
The present invention further relates to a method for obtaining manganese superoxide dismutase or an analogue thereof from bacterial cells which contain this dismutase. Generally, the cells are first subjected to treatment to obtain a protein fraction that contains proteins present in the cells, including human manganese superoxide dismutase or an analog or a mutant thereof. This protein fraction is then processed to obtain the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
According to a preferred embodiment of the invention, the cells are first treated in order to isolate soluble proteins from insoluble proteins and fragments of the cell wall, and the soluble proteins are obtained in the process. The soluble proteins are then further processed to separate a fraction of the soluble protein which contains the human manganese superoxide oxidase, abbreviated as hMnSOD or an analog or a mutant thereof. This separation of the desired fraction can take place, for example, by precipitation. The fraction which contains the hMnSOD or an analog thereof or a mutant thereof is obtained. This recovered fraction of soluble proteins is then processed to separately recover the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
A particularly preferred embodiment of the method according to the invention relates to a method for obtaining human manganese superoxide dismutase or an analog or a mutant thereof from bacterial cells which contain the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof. In this method, the bacterial cells are first separated from the production medium and then suspended in a suitable solution which has a pH of approximately 7.0 to 8.0.
The cells are then broken up and centrifuged, and the resulting supernatant material is then heated to a temperature in the range from 55-65 ° C. for about 30 to 120 minutes. The mixture is preferably heated to a temperature of 58-62 ° C. for 45-75 minutes and particularly preferably for one hour to a temperature of 60 ° C. Then the mixture is then cooled to a temperature below 10 ° C., preferably to 4 ° C. Any precipitate that has formed must be removed, for example by centrifugation, and the cooled material above it is then dialyzed against an appropriate buffer. An example of a suitable buffer is a 2 mN potassium phosphate buffer with a pH of about 7.8.
Dialysis is preferably carried out by ultrafiltration using a filtration membrane of less than 30K. Simultaneously with the dialysis or after the dialysis, the cooled material above it can, if necessary, be concentrated until a suitable and comfortable volume has been reached, for example to 0.03 of the initial volume.
The retentate is then eluted on an anion exchange chromatography column with a suitable buffer solution, for example a solution of at least 20 mM potassium phosphate buffer, which has a pH of 7.8. Those fractions of the eluate which contain superoxide dismutase are collected and combined and then dialyzed against an approximately 40 mM potassium acetate buffer with a pH of 5.5.
The dialyzed pooled fractions are then eluted through a cation exchange chromatography column which has a linear gradient from about 40 mM to about 200 mM potassium acetate and a pH of 5.5. Those peak fractions which contain the superoxide dismutase are collected and combined with one another.
If necessary, the combined peak fractions can then be dialyzed against a suitable solution, for example against water or a buffer solution from an approximately 10 mM potassium phosphate buffer which has a pH of approximately 7.8.
Another object of the present invention is the purified enzymatically active human manganese superoxide dismutase or analogues thereof, for example met-hMnSOD, or mutants thereof, these products being produced by the processes according to the invention.
Brief description of the figures
The amino acid sequence of the complementary deoxiribonucleic acid, abbreviated as cDNA of the human manganese superoxide dismutase, is illustrated in FIGS. 1a and 1b. This is subsequently abbreviated to MnSOD cDNA.
1a and 1b show the nucleotide sequence of the one strand of a double-stranded DNA molecule which encodes the human manganese superoxide dismutase and also the 198 amino acid sequence of the human manganese superoxide dismutase which corresponds to the DNA sequence. Figure 1a also shows the nucleotide sequence of one strand of the double-stranded DNA molecule which encodes a prepeptide for the mature human manganese superoxide dismutase, which prepeptide consists of 24 amino acids and has an amino acid sequence which corresponds to that of the DNA sequence. Parts of the 5 min and 3 min untranslated sequences are also shown.
The plasmid pMS8-4, which contains the MnSOD on an EcoRI insert labeled R1, was completely digested with the restriction enzymes NdeI and NarI. The large fragment formed during this restriction degradation was isolated and linked to a synthetic oligomer in the manner shown in FIG. 2. The large fragment extends from the NdeI restriction site at "8 o'clock" on pMS8-4 to the NarI restriction site at "3 o'clock" on plasmid pMS8-4. This restriction fragment contains the ampicillin resistance gene and also most of the MnSOD genes. This restriction degradation removed the 5 min untranslated region and the prepeptide coding region of the MnSOD gene. This restriction degradation also removed approximately 36 base pairs from the coding region of the mature MnSOD polyeptide.
These missing base pairs encoding the mature MnSOD were introduced by ligation to the synthetic linker illustrated in FIG. 2. The plasmid pMS8-NN obtained contains the coding region for the mature MnSOD and before it an ATG initiation codon.
The plasmid pMS8-NN mentioned above was digested or digested with EcoRI, the ends were filled using the Klenow fragment of polymerase 1 and then further digested with NdeI.
The small fragment harbors the MnSOD gene located between the filled EcoRI site and the NdeI site and this small fragment was isolated. This fragment corresponds to the region coding for MnSOD.
This fragment was inserted into pSOD alpha 13 which had been treated with NdeI and StuI.
Treatment of PSOD alpha 13 with NdeI and StuI and subsequent isolation of the large fragment results in a fragment that contains the lambda PL promoter sequence, the cII ribosomal binding site, the ampicillin resistance gene and most of the CuZn SOD genes.
However, the CuZn SOD gene is missing in the coding region for the 5 min end of the gene because this was removed by the restriction cleavage and the subsequent isolation of the large fragment.
The MnSOD gene from pMS8-NN was inserted between the NdeI and StuI sites of pSOD alpha 13. The pSOD alpha 13 can be obtained as described in European Patent Publication No. 0 173 280 of March 5, 1986, U.S. Patent Application Serial No. 644 245 corresponds to that described. This ligation formed the plasmid pMSE-4, which contains the regions coding for MnSOD and in front of which the cII-ribosomal binding site is located and under the control of the lambda PI promoter. The plasmid pMSE-4 was released on September 25, 1985 at the American Type Culture Collection under the ATCC Accession No. 53 250 has been deposited.
FIG. 3 illustrates the influence of the concentration of manganese ions on the activity of the superoxide dismutase that is formed in the microorganism Escherichia coli.
In this FIG. 3, the concentration of manganese ions, namely Mn, is on the abscissa <+> <+> given in the growth medium in ppm. This ranges from 0 ppm to 600 ppm. The ordinate of FIG. 3 shows the specific superoxide dismutase activity units per mg of the soluble protein.
The diagram of FIG. 3 thus shows the relationship between the specific activity, expressed in units per mg of the recombined soluble MnSOD, which was formed from the Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSE-4. In this figure, both the corresponding units for non-induction (at 32 ° C.) are listed, these are the corresponding columns not shown in broken lines, and furthermore the results are shown in this figure under the conditions of induction at 42 ° C. These are the corresponding dashed areas. As mentioned, the concentration of the ions of the divalent manganese in the growth medium is given in ppm, ie in parts per million.
4 shows the structure of pMS DELTA RB4, namely the human manganese superoxide dismutase expression plasmid.
The tet <R> expression vector, p DELTA RB was formed from the pSOD beta 1T-11 by completely degrading the pSOD beta 1T-11 with EcoRI and then performing a partial cleavage with the BamHI restriction enzymes.
The large fragment created by this degradation was isolated and bound to a synthetic oligomer, the sequence of which was as follows:
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
This gave p DELTA RB, which contains the lambda Pl promoter. The large EcoRI / BamHI restriction fragment formed in this degradation extends counterclockwise from the EcoRI site shown in the pSOD beta 1T11 restriction map to the "12 o'clock" position to the BamHI site that is shown in the pSOD 1T11 restriction map in the "5 o'clock" position. The pSOD beta 1T11 is with the American Type Culture Colection March 3, 1986 under Accession No. 53 468 have been deposited.
The EcoRI fragment from pMSE-4 was obtained by digesting pMSE-4 with EcoRI and isolating the small fragment that is formed during this degradation. This fragment is the fragment containing the MnSOD gene and extends on the pMSE-4 restriction map from the EcoRI site at the 1 o'clock position to the EcoRI site at the 3 o'clock position on the pMSE-4 - restriction card. The EcoRI fragment of the MnSOD expression plasmid pMSE-4, which contains the cII ribosomal binding site and the complete coding sequence of the mature enzyme, was introduced into the only EcoRI site of p DELTA RB. The plasmid pMS RB4 obtained contains the MnSOD gene under the control of lambda PI and cII RBS and it confers resistance to tetracycline.
The present invention will now be described in detail.
A double-stranded deoxiribonucleic acid molecule, which is subsequently abbreviated to DNA molecule, and which comprises complementary deoxiribonucleic acid, which contains human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof, has been isolated. This complementary deoxiribonucleic acid is subsequently abbreviated to cDNA. The double-stranded DNA molecule mentioned was isolated from a human T-cell cDNA genetic material or section with the English name "human T-cellcDNA library". This English designation means a collection of Escherichia coli bacteria or bacteriophage lambda, which contains the cDNA sections or inserts which were synthesized by the messenger RNA (abbreviated as MRNA), which was isolated from human T cells.
The nucleotide sequence of a double-stranded DNA molecule that encodes human manganese superoxide dismutase polypeptide or that encodes an analog or a mutant thereof has been found.
The sequence of the one strand of the DNA molecule encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof is shown in FIGS. 1a and b and this sequence comprises the nucleotides with the numbers 115 through 708 inclusive.
The sequence of the one strand encoding an analog of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, hereinafter referred to as hMnSOD analog, or a mutant of the human manganese superoxide dismutase, is essentially similar to that strand which encoded human manganese superoxide dismutase polypeptide, which is subsequently abbreviated to hMnSOD polypeptide.
The nucleotide sequence of the prepeptide of human manganese superoxide dismutase is also illustrated in Figures 1a and b. The nucleotides of numbers 43 through 114 encode this prepeptide.
The methods for producing the cDNA and for determining the sequence of the DNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analogue thereof or a mutant thereof are known to a person skilled in the art and will become more detailed below described. In addition, now that the DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase has been elucidated, known synthetic methods can be used to produce DNA molecules that contain portions of this sequence.
Conventional cloning vehicles, such as plasmids, for example pBR322, or viruses or bacteriophages, for example lambda, can be modified or produced using known working methods which are suitable for producing new cloning vehicles which contain a cDNA which contains the human Manganese superoxide dismutase polypeptide or analogs thereof or mutants thereof.
Similarly, such cloning vehicles can be modified or created to contain DNA molecules, one strand of which contains a segment having the sequence of the human manganese superoxide dismutase polypeptide shown in Figures 1a and b or segments that are substantially similar to the segments shown. The inserted DNA molecules can be made by various methods, including enzymatic or chemical synthesis.
The cloning vehicles obtained are chemical entities that do not occur in nature and that can only be produced by modern technology called recombination DNA technology. The cloning vehicle is preferably a plasmid, for example pMSE-4 or pMS DELTA RB4. These cloning vehicles can be inserted into cells, either in procaryotic cells such as bacterial cells such as those from Escherichia coli, Bacillus subtilis, and similar bacterial cells, or they can be incorporated into eukaryotic cells such as in Yeast or mammalian cells using techniques well known to those skilled in the art, such as transformation, transfection, and the like.
Accordingly, those cells into which the cloning vehicle is introduced contain cDNA which encodes the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof, if this cDNA was present in the cloning vehicle or they become one Contain DNA containing one strand, all or part of the strand, which has the sequence of the human manganese superoxide dismutase polypeptide shown in Figures 1a and b or a sequence which essentially is similar to this sequence if such DNA was present in the cloning vehicle.
The cells of Escherichia coli are the preferred host cells for the cloning vehicles according to the invention. The currently preferred auxotrophic strain of Escherichia coli is strain A1645, which was deposited with the American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, which contains the plasmid pApoE-Ex2 and which is under the ATCC accession no. 39 787 is deposited. All deposits with the American Type Culture Collection, which are mentioned in the present documents, were carried out in accordance with the Budapest Treaty of International Recognition of deposited cultures of microorganisms.
The A1645 was made from A1637 by selection on Gal <+>, i.e. by selection for the ability to degrade galactose and also by loss of tetracycline resistance. It still contains elements of the phage lambda. Its phenotype is c600 r <-> m <+> gal <+> thr <-> leu <-> lacZ-bl (lambda cI857 DELTA Hl DELTA BamHl N <+>).
A1637 was obtained from the C600 by introducing transposon, which contains a gene for tetracycline resistance, into the galactose operon and also inserting elements of the phage lambda, including those elements which are responsible for the synthesis of the cI repressor. C600 can be obtained from the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 23 724 can be obtained.
The prototrophic strains of Escherichia coli, which allow a high level of expression of the polypeptide even when grown in a minimal medium, are even more preferred as host cells for the expression of the gene encoding manganese superoxide dismutase. A currently preferred prototrophic strain is A4255. The A4255 strain, which contains the plasmid pMSE-4, was obtained from the American Type Culture Collection under the ATCC Accession No. 53 250 deposited.
The resulting cells, into which a DNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog thereof or a mutant thereof, has been inserted, can be treated, for example grown or expanded, as is appropriate for one It is known to those skilled in the art that the DNA directs the expression of the genetic information encoded by the DNA. For example, this DNA directs expression of the hMnSOD polypeptide or an analog or mutant thereof, and the cell accordingly expresses hMnSOD polypeptide or an analog or a mutant thereof, and these products can then be recovered.
In the present description, the term “superoxide dismutase” or the abbreviation “SOD” means an enzyme or a polypeptide which acts as a receptor on superoxide or free oxygen radicals or which catalyzes the following dismutation reaction:
2O2- + 2H <+> -> O2 + H2O2
The term "manganese superoxide dismutase", or the corresponding abbreviation "MnSOD", means in the present description any superoxide dismutase molecule which contains the chemical element manganese in any of its chemical forms.
In the present description, the expression "human manganese superoxide dismutase polypeptide", or the corresponding abbreviation "hMnSOD", means a polypeptide of 198 amino acids, part of which is shown in FIGS. 1a and b. The nitrogen end, that is the N-terminus of this sequence, is the lysine which is encoded by nucleotides 115-117 of FIG. 1a and the carboxylate end, that is the COOH terminus of this sequence is the lysine which is encoded by nucleotides 706-708 of Fig. 1b is coded.
The term "polypeptide-manganese complex" in the present specification means a molecule which contains a human manganese superoxide dismutase polypeptide in a complex with manganese in any chemical formula and which has the enzymatic activity of the naturally occurring human manganese superoxide -dismutase.
The term "human manganese superoxide dismutase" in the present specification means a molecule which comprises at least two human manganese superoxide dismutase polypeptides complexed with manganese in any of its chemical forms and which has the enzymatic activity of the naturally occurring human Has manganese superoxide dismutase.
The term "analog of human manganese superoxide dismutase polypeptide" in the present specification means a polypeptide comprising the human manganese superoxide dismutase polypeptide to which one or more is attached to either end or both ends of the amino acid sequence additional amino acids are bound.
In the present specification, the term "analog of the polypeptide-manganese complex" also means a molecule which comprises a polypeptide-manganese complex, the polypeptide portion of this complex comprising one or more additional amino acids which are located on one of the two ends or on both ends of the Polypeptides are bound.
In the present description, the expression “analogue of the human manganese superoxide dismutase” means a molecule which comprises at least two polypeptides, at least one of which is an analogue of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, in the form a complex with manganese in any of its chemical forms and which has the enzymatic activity of the naturally occurring human manganese superoxide dismutase.
In the present description, the expression "mutant of the human manganese superoxide dismutase polypeptide" means a polypeptide which has an amino acid sequence which is essentially identical to that of the human manganese superoxide dismutase polypeptide, this amino acid sequence however differs from this polypeptide by one or more amino acids.
In the present description, the term “mutant of the polypeptide-manganese complex” is understood to mean a molecule which comprises a mutant of the human manganese superoxide dismutase polypeptide in a complex with manganese in any of its chemical forms and which has the enzymatic activity which has manganese superoxide dismutase.
In the present description, the expression “mutant of the human manganese superoxide dismutase” means a molecule which comprises at least two polypeptides, at least one of these polypeptides being a mutant of the human manganese superoxide dismutase polypeptide in a complex with manganese in is any of its chemical forms and this complex exhibits the enzymatic activity of the naturally occurring human manganese superoxide dismutase.
The mutants of the hMnSOD polypeptide and hMnSOD, which form part of the subject of the invention, can be made by mutating the DNA sequence shown in Figures 1a and b, the nitrogen end of this sequence being the lysine which is encoded by nucleotides 115-117 and the carboxyl end, that is the COOH terminus of this sequence, is encoded by nucleotides 706-708.
The DNA can be mutated according to methods which are known to a person skilled in the art and in this connection reference is made, for example, to the publication by Bauer et al., In Gene 37: 73-81 (1985). The mutated sequence can be inserted into suitable expression vectors according to the method described here, and these expression vectors can be inserted again into cells, which are then treated in such a way that the mutant DNA expresses the expression of the hMnSOD polypeptide mutants and the expression who conducts hMnSOD mutants.
The enzymatically active form of human manganese superoxide dismutase is believed to be a protein that has at least two and possibly four identical subunits, each of which has approximately 198 amino acids in the sequence shown in Figures 1a and b for the Human manganese superoxide dismutase is illustrated, wherein the nitrogen end, that is the N-terminus of the sequence, is the lysine which is encoded by nucleotides 115-117 of FIG. 1a and the carboxylate end, that is the COOH terminus of the sequence is the lysine which is encoded by nucleotides 706-708 of Figure 1b.
Human MnSOD or analogs thereof or mutants thereof can be formed from cells into which the DNA or cDNA encoding human manganese superoxide dismutase or its analogs or mutants has been introduced. The human MnSOD or analogues thereof or mutants thereof can be used to catalyze the dismutation or monovalent reduction of superoxide anions in the presence of protons to form hydrogen peroxide and the corresponding reaction is illustrated by the following equation:
EMI46.1
Pharmaceutical preparations for use in veterinary medicine or human medicine can also be produced which contain hMnSOD or one or more analogs or mutants of hMnSOD as the active ingredient and preferably also a suitable carrier material. Such support materials are well known to those skilled in the art.
Corresponding pharmaceutical preparations which contain hMnSOD as an active ingredient or an analogue or a mutant thereof can be administered directly or they can be formulated with the aid of further additives to corresponding pharmaceutical compositions which are then suitable for administration to a human patient or animal patient. Corresponding pharmaceutical preparations can be used to combat inflammation or to reduce damage that can occur from free oxygen radicals when the blood is re-supplied after an anemia, that is to say during reperfusion following ischemia, or during an organ transplant.
In these cases, the hMnSOD or an analogue of the same or a mutant thereof can be added directly, that is to say without any further additions, or in the form of a composition to the flushing medium, that is to say the perfusion medium, with which an isolated organ is flushed out, thereby damaging the isolated organ can be reduced by oxygen-free radicals in the perfusion after the isolation of the organ and thus the survival time of the isolated organ is extended.
In addition, corresponding pharmaceutical preparations containing hMnSOD as the active ingredient or analogs thereof or mutants thereof can be used to reduce neurological damage which can occur when the blood is re-supplied after an emptiness, i.e. when reperfusion is followed by ischemia, and the corresponding Pharmaceutical preparations can also be used to treat bronchial and lung malformations, i.e. bronchial pulmonary dysplasia.
Another object of the present invention is a method for producing the enzymatically active human manganese superoxide dismutase or an analog or a mutant thereof in bacterial cells. In this method, the bacterial cell contains a DNA sequence and is capable of expressing a DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof. In this method, the bacterial cell is left in a suitable production medium under suitable conditions. The production medium contains an amount of divalent manganese ions, i.e. Mn <+> <+> so that the concentration in these divalent manganese ions in the medium is kept higher than 2 ppm.
The bacterial cell can be any bacterium into which the DNA sequence encoding the human manganese superoxide dismutase has been inserted using recombinant DNA techniques. This bacterium must be suitable for expression of the DNA sequence and for the production of the protein product. The appropriate conditions and the production medium vary depending on the species and the strain of the bacterium.
The bacterial cell can contain the DNA sequence encoding the superoxide dismutase or an analog thereof in the body of a vector DNA molecule, such as a plasmid. The vector or plasmid is constructed or constructed by recombinant DNA techniques so that it has incorporated the sequence encoding the superoxide dismutase at an appropriate location in the molecule.
According to a preferred embodiment of the invention, the bacterial cell is an Escherichia coli cell. A preferred auxotrophic strain of Escherichia coli is A1645.
A preferred prototrophic strain of Escherichia coli is A4255. The cells of Escherichia coli according to the invention contain a plasmid which encodes the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
According to a preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell contains the plasmid pMSE-4. A method for producing this plasmid is explained in the description of the figures and the plasmid itself is described in Example 2. This plasmid was deposited with the American Type Culture Collection under ATCC Accession No.53 250.
According to another preferred embodiment of this invention, the bacterial cell contains the plasmid pMS DELTA RB4. A method for producing this plasmid is explained in the description and in the figures, and the plasmid itself is described in Example 5. This plasmid can be derived from pSOD beta T-11, which is available from the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53 468 is stored.
According to special embodiments of the present invention, an enzymatically active analog of human manganese superoxide dismutase is produced by cells of the Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSE-4, and by cells of the Escherichia coli strain A4255, which produces the plasmid pMS DELTA RB4 included.
The suitable production medium for the bacterial cell can be any type of acceptable growth medium, such as a casein hydrolyzate medium or a Luria broth medium, which is subsequently abbreviated as LB medium. The latter medium is preferred.
Suitable breeding conditions depend on the strain of Escherichia coli and the plasmid containing it. For example, the strain Escherichia coli A4255, which contains the plasmid pMSE-4, is induced at 42 ° C. and left at this temperature for about 1-5 hours. The appropriate conditions with regard to the cultivation temperature, the cultivation time, the stirring and the aeration, both in the cultivation of the cultivation material and for the cultivation of the cultures to a suitable cell density before the production phase, and also for the maintenance of the cultivation during the production period, may vary and all of these possible variations are obvious to one skilled in the art.
The concentration of the divalent manganese ions, i.e. the Mn <+> <+> in the medium required to produce the enzymatically active manganese superoxide dismutase varies with the type of medium used.
It was found that concentrations of divalent manganese ions in the range from 150 ppm to 750 ppm are effective with a growth medium of the LB type. It is preferred that in all complex types of growth media the concentration of divalent manganese ions in the medium is in the range from about 50 to about 1500 ppm.
The specific ingredients for a suitable strain, growth medium, inoculation medium and production medium can vary and all of these variations are obvious to a person skilled in the art.
The present invention also relates to a method for obtaining human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof, starting from bacterial cells which contain them. The cells are first treated to obtain a protein fraction containing proteins present in the cells, and these proteins include human manganese superoxide dismutase or an analog thereof or a mutant thereof. The protein fraction is then treated appropriately to obtain the human manganese superoxide dismutase or an analog thereof or a mutant thereof.
According to a preferred embodiment of the invention, the cells are first treated in order to separate soluble proteins from insoluble proteins and fragments of the cell wall, and the soluble proteins are then obtained. The soluble proteins thus obtained are then treated to separate a fraction of the soluble proteins containing the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof, and this fraction is obtained. The corresponding treatment can, for example, be a precipitation. The fraction is then further processed to separately obtain the human manganese superoxide dismutase or an analogue thereof or a mutant thereof.
Particularly preferred embodiments of the present invention are described below.
First, the bacterial cells are isolated from the production medium and suspended in a suitable solution which has a pH in the range from about 7.0 to 8.0. The cells are then broken up and centrifuged.
The supernatant is separated and heated to a temperature in the range of about 55-65 ° C. for 30 to 120 minutes, preferably to a temperature of 58-62 ° C. for 45-75 minutes, and particularly preferably to 60 ° for one hour C. Following this heating phase, the mixture is then cooled to a temperature of less than 10 ° C., preferably to a temperature of approximately 4 ° C. If a precipitate has formed during this cooling process, it is removed, for example by centrifugation and then dialyzed the cooled supernatant against an appropriate buffer.
Preferably, the cooled supernatant is dialyzed by ultrafiltration using a filtration membrane that is less than 30K and more preferably 10K. A 2 MM potassium phosphate buffer with a pH of about 7.8 may be mentioned as an example of a suitable buffer.
After this dialysis or at the same time as this dialysis, the cooled supernatant can optionally be concentrated to a suitable volume. For example, a concentration of 0.03 of the original volume of the protruding material has been found to be suitable.
The material is then applied to a chromatography column containing anion exchangers, and this retentate is eluted with a suitable buffer solution, for example a solution of a 20 mM phosphate buffer, which has a pH of about 7.8.
The fractions of the eluted material which contain the superoxide dismutase are collected, combined and dialyzed against an approximately 40 mM potassium acetate solution with a pH of 5.5.
These combined and dialyzed fractions are then applied to a chromatography column filled with a cation exchanger and eluted with a linear gradient from about 40 mM potassium acetate solution to about 200 mM potassium acetate solution, these potassium acetate solutions having a pH of 5.5. Those peak fractions which contain the superoxide dismutase are collected and combined with one another. If necessary, the combined peak fractions can then be dialyzed against a suitable solution, for example against water or a buffer solution which is approximately 10 mM potassium phosphate and has a pH of approximately 7.8.
The present invention further relates to purified human manganese superoxide dismutase or analogues thereof or mutants thereof, these products being produced by the processes according to the invention and in the present context being understood as "purified" to mean that the products in question are essentially free of other substances of human origin.
In particular, the present invention relates to an analog of human manganese superoxide dismutase, which has at least two polypeptides, of which at least one of the polypeptides has the amino acid sequence shown in FIGS. 1a and b, the nitrogen end of this sequence being the lysine, which is characterized by 1a and the carboxylate end of this sequence is the lysine which is encoded by nucleotides 706-708 of FIG. 1b and in which amino acid sequence an additional methionine residue is bound to the nitrogen end of the amino acid sequence. This analogue of human manganese superoxide dismutase is subsequently abbreviated to Met-hMnSOD, in which abbreviation "Met" illustrates the additionally bound methionine residue.
According to a preferred embodiment of this product, this purified Met-hMnSOD has a specific activity of at least 3500 units / mg.
The present invention will now be explained in more detail by means of examples.
These examples are only intended to provide an even better understanding of the subject matter of the invention, but are not intended to limit the scope of the present invention in any way. It should also be pointed out that these examples do not contain any detailed explanations of the customary methods involved in the construction of vectors, the insertion of genes which code for polypeptides into such vectors or the introduction of the corresponding plasmids into hosts or host cells , affect. The examples also do not include a detailed description of common methods used to test polypeptides produced by such host vector systems, or to identify such polypeptides by activity staining methods of isoelectric focusing gels, hereinafter referred to as IEF gels be designated.
Such working methods are namely well known to the person skilled in the art in this field and are described in more detail in many publications, reference being made here to the following publications as examples:
T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sombrook, "Molecular Cloning", a laboratory handbook from the Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.
J.M. McCord and I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969), and C. Beauchamp and I. Fridovich, Anal. Biochem. 44: 276-87 (1971).
example 1
To identify the MnSOD cDNA clones, mixed oligomer samples were synthesized in accordance with the published amino acid sequence described in two publications mentioned earlier in the Harris, J.I. and Steinman, H.M., in the book Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I., Verlag Academic Press, London, pages 225-230 (1977) and in the publication by Barra, D., Schinina, ME, Simmaco, M., Bannister, JV, Bannister, WH, Rotilio, G. and Bossa, F., in J. Biol. Chem. 259: 12595-601 (October 25, 1984).
5 min sample - 30-mer sequence of AA15-AA24 (see these two publications.
EMI58.1
EMI59.1
3 min sample - 32-mer sequence of AA179-AA189 (see the second of the two publications mentioned)
EMI59.2
The 5 min sample consists of 30 nucleotides and corresponds to amino acids 15-24 of the mature MnSOD.
The 3 min sample consists of 32 nucleotides and corresponds to amino acids 179-189 of the mature MnSOD.
The 5 min sample is a mixed sample consisting of 36 different sequences, as illustrated above.
The 3 min sample is a mixed sample consisting of 16 different sequences as shown above.
If more than one nucleotide is shown in a given position in the scheme above, then the corresponding DNA strand was synthesized using equimolar amounts of each of the two nucleotides shown and is accordingly a mixed sample.
The 5 min sample was used to screen 300,000 plaques of a T-cell cDNA genetic section (with the English name T-cell cDNA library) cloned in a lambda-gt-10 vector. The hybridization to phage-plaque-replicas, which are immobilized on nitrocellulose filters, was carried out according to standard working methods and in this connection it should be referred to the publication by Maniatis et al. Mentioned immediately before Example 1. pointed out, the difference to the method described therein was that the hybridization was carried out at 50 ° C. in 8 × SSC for 16 hours. The filters were then washed at 50 ° C. with 5 × SSC and 0.1% SDS. Three positive plaques were isolated and these were called Phi MS8 or Phi MS1 or Phi MSlJ.
The EcoRI digested the DNA from Phi MS8 and the DNA from Phi MSL, and from this one can see that these two products have cDNA inserts, also known as cDNA inserts, which are approximately 800 bp long and both with the 5th min and the 3 min oligonucleotide samples hydride.
The Phi MSlJ carried only the cDNA insert or the cDNA insert in an amount of 450 bp, which hybridized only with the 5 min final sample.
The EcoRI inserts of the three phage clones were subcloned into the EcoRI site of pBR322 and pMS8-4, pMS1-4 and pMS1J were obtained in each case.
Restriction analysis and hybridization with the 5 min and 3 min oligonucleotide samples gave similar patterns, also referred to as patterns, for the two products pMS8-4 and pMS1-4.
The restriction map illustrated in Fig. 5 shows the 5 min -> 3 min orientation, and this was deduced for both plasmids.
The sequence of the cDNA insert of pMS8-4 is illustrated in Figures 1a and b. The predicted amino acid sequence differs from the amino acid sequence of the publication by Barra et al. Mentioned at the beginning of this example. in that Glu appears instead of Gln at three positions, namely at positions AA 42, 88, 108 and in that two additional amino acids, namely Gly and Trp, appear between AA123-124.
Sequence analysis of pMS1-4 and pMS1J showed that three MnSOD clones were derived independently and this sequence analysis confirmed the differences from the previously published amino acid sequence.
The sequence above the lysine of the nitrogen end group, ie the N-terminal lysine of the mature MnSOD, enables the prediction of a prepeptide sequence of 24 amino acids.
Example 2
Construction of the plasmid which causes the expression of the human manganese superoxide dismutase.
The plasmid which causes the expression of the human manganese superoxide dismutase is subsequently also called Amp <R> human MnSOD expression called plasmid and abbreviated as pMSE-4.
The starting product for the construction or construction of this pMSE-4 is the plasmid pMS8-4, which was produced by the method described in Example 1.
The plasmid pMS8-4, which contains human MnSOD cDNA on an EcoRI insert, which is also referred to as an EcoRI insert, was completely digested with the restriction enzymes NdeI and NarI. The large fragment was isolated and linked to a synthetic oligomer as illustrated in FIG. 2. The resulting plasmid, called pMS8-NN, which is also shown in FIG. 2, contains the coding region for the mature or final MnSOd, which is referred to in the English-language literature as mature MnSOD, and an ATG is located in front of this region Initiation codon. The above plasmid was digested with EcoRI, the ends were filled with the Klenow fragment of polymerase I and further digested with NdeI.
The small fragment containing the MnSOD gene was inserted into pSOD alpha 13, which was treated with NdeI and StuI.
Said pSOD alpha 13 can be obtained as described in European Patent Publication No. 0 173 280, which was published on March 5, 1986. Everything that is disclosed there also applies in the present case.
This produced the plasmid pMSE-4, which contains a region coding for the MnSOD, in front of which the cII-riosomal binding site is located and under the control of the lambda PL promoter.
The plasmid pMSE-4 was published by the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53 250 deposited. All of the working methods used in the process described above are essentially the same as those described in the Maniatis et al. Publication prior to Example 1.
Example 3
Expression of the recombinant human MnSOD
The plasmid pMSE-4 was inserted into the Escherichia coli strain A4255 using known working methods. The Escherichia coli strain 4255, which contains the plasmid pMSE-4, was then grown at 32 ° C. in a Luria broth medium, the medium containing 100 μg / ml medium of ampicillin. This growth was carried out until the optical density, abbreviated as "OD" at 600 nm, was 0.7.
The induction was carried out at 42 ° C. Samples were taken at various intervals and these were separated by electrophoresis on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. This sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis is subsequently abbreviated to "SDS-PAGE". From this gel electrophoresis, it was seen that the level of the human MnSOD formed increased up to 120 minutes after induction. At this point, the recombinant MnSOD protein made up 27% of the total cell proteins. The corresponding determination of the cell proteins was carried out by scanning with gel stained with Coomassie blue.
The samples were sonicated for 90 seconds with a W-375 ultrasound device and the proteins were divided into soluble protein fractions, which are subsequently referred to as s fractions, and into insoluble protein fractions, which are subsequently referred to as p fractions by centrifugation using 10,000 g for 5 minutes. It was found that the tested amount of the recombinant MnSOD formed was not soluble.
The induced soluble protein fraction contained only slightly more of the MnSOD activity than the protein fraction of the uninduced parallel experiment. These tests were carried out according to the standard methods and in this connection it should be referred to the McCord et al. Publication mentioned before Example 1. pointed out.
Obviously, part of the MnSOD that is in the soluble fraction is inactive. This suggests that most of the human MnSOD produced under the conditions of this example is actually inactive.
Example 4
In this example the influence of the concentration of divalent manganese ions on the solubility and the activity of the MnSOD formed is examined.
Divalent manganese ions, i.e. ions Mn <+> <+> added in increasing concentrations until a level of 450 ppm (450 parts per million) was reached in the growth medium in which the Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSE-4, was grown. The addition of the manganese ions took place before a two-hour induction at 42 ° C. with an optical density at 600 nm of 0.7, and the addition of the manganese ions had no adverse effect on the overall yield on the human MnSOD.
After the ultrasound treatment, the soluble protein fractions (s) and the insoluble protein fractions (p) were subjected to gel electrophoresis on a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel. This gel electrophoresis showed that the solubility of the recombinant protein increased when the solubility of the divalent manganese ions in the growth medium was increased.
The corresponding results are summarized in Table 1 below.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Head Col 01 to 04 AL = L: Table 1
<tb> SubHead Col 01 AL = L> Mn <++> in ppm in the culture medium:
<tb> SubHead Col 02 AL = L>% of soluble human MnSOD, based on the total amount of human MnSOD formed:
<tb> SubHead Col 03 AL = L>% of soluble human MnSOD, based on the total amount of soluble bacterial protein:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> Specific activity in units / mg of the soluble pro
lines:
<tb> <SEP> 0 <SEP> 30.6 <SEP> 7.2 <SEP> 30
<tb> <SEP> 50 <SEP> 72.7 <SEP> 15.4 <SEP> 241
<tb> <SEP> 100 <SEP> 78.0 <SEP> 16.9 <SEP> 356
<tb> <SEP> 150 <SEP> 82.9 <SEP> 18.8 <SEP> 606
<tb> <SEP> 200 <SEP> 82.0 <SEP> 20.8 <SEP> 338
<tb> <SEP> 250 <SEP> 79.2 <SEP> 20.4 <SEP> 380
<tb> <SEP> 300 <SEP> 80.8 <SEP> 20.3 <SEP> 381
<tb> <SEP> 450 <SEP> 89.2 <SEP> 22.4 <SEP> 323
<tb> </TABLE>
The MnSOD activity shown in Table 1 was tested by the method described in the McCord et al. is described, which is mentioned immediately before Example 1. As can be seen from the data listed in Table 1, a relationship can be established between increasing concentrations of divalent manganese ions in the growth medium and the increasing solubility of MnSOD. It can also be seen from the table that the optimal concentration in the medium is obviously 150 ppm of divalent manganese ions. The corresponding values are also illustrated graphically in FIG. 3 and it can also be seen very clearly there that the highest specific activity per mg of the soluble protein is achieved when the concentration of manganese ions in the medium is 150 ppm.
In addition, increased manganese concentrations in the growth medium activated the previously inactive soluble enzyme. Soluble protein fractions from induced cultures grown at these manganese levels showed up to a 60-fold increase in SOD activity compared to soluble protein fractions from non-induced cultures grown at the same manganese levels in the culture.
The activity staining of isoelectric focusing gels, so-called IEF gels, was carried out according to the method described in the Beauchamp et al. is described, which is mentioned immediately before Example 1. This staining technique showed that many forms of recombinant MnSOD were identical to those of native human liver MnSOD.
The results obtained for the production of human MnSOD by Escherichia coli strain A1645, which contained plasmid pMSE-4, were similar to the results described above.
Example 5
Production of the tet <R> human MnSOD expression plasmids.
The tet <R> human manganese superoxide dismutase expression plasmid is subsequently abbreviated to pMS DELTA RB4. The tet <R> expression vector, designated p DELTA RB, was prepared from pSOD beta 1T-11 by subjecting it to complete digestion with the restriction enzyme EcoRI, followed by partial cleavage with the restriction enzyme BamHI.
The pSOD beta 1-T-11 is available from the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53 468 have been deposited.
The digested plasmid was constructed using the synthetic oligomer
5 min - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 min
3 min - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5 min
bound and you got the p DELTA RB of the lambda PL promoter.
The EcoRI fragment of the MnSOD expression plasmid pMSE-4, which contains cII-ribosomal binding sites and the complete coding sequence of the mature enzyme, was inserted into the only EcoRI site of p DELTA RB. The resulting plasmid, called pMS DELTA RB4, contains the MnSOD gene under the control of lambda PL and cII RBS and confers resistance to tetracycline.
The process described here is illustrated by FIG. 4, in which the starting product pSOD beta 1T-11 is illustrated at the top left, including the locations where the cleavage with the restriction enzymes takes place, the resulting large fragment then being attached to the synthetic linker, namely the above-mentioned synthetic oligomer. The end product thus produced, namely the plasmid with the designation pMS DELTA RB4, is shown in the bottom center of this FIG. 4.
Example 6
Expression of human MnSOD by the plasmid PMS DELTA RB4
The plasmid pMS DELTA RB4 was introduced into the Escherichia coli strain A4255 using known working methods.
The cultures were allowed to grow at 32 ° C. in a Luria broth which contained different concentrations of divalent manganese ions until an optical density at 600 nm of 0.7 was reached.
The induction was carried out at 42 ° C. Samples were taken after various periods of time and these samples were examined by electrophoresis on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels.
It was shown that the content of human MnSOD increased in the induction time up to a period of 120 minutes. At this point, the human MnSOD was approximately 15% of the total cell proteins, as could be seen from a scan performed using a gel stained with Coomassie blue.
Regardless of the concentration of divalent manganese ions in the growth medium, the induced MnSOD was soluble. This is in contrast to the observations made in Example 4 in connection with the examination of the amp <R> plasmids with the designation pMSE-4 were made.
In this example too, however, the maximum SOD activity and the extent of the expression, that is to say the expression level, were dependent on the amount of divalent manganese ions which were made available.
The corresponding results are summarized in Table 2 below.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Head Col 01 to 04 AL = L: Table 2
<tb> SubHead Col 01 to 04 AL = L: MnSOD expression in E. Coli A4255 (pMS DELTA RB4)
<tb>
<tb> Title: Mn content <++> in the breeding medium in ppm
<tb> Title: Percentage of soluble human MnSOD based on the total amount of soluble bacterial proteins
<tb> Title:
Specific activity in units / mg of soluble proteins
<tb> <SEP> 42 DEG DEG <SEP> 32 DEG DEG <SEP> 42 DEG DEG
<tb> <SEP> 0 <SEP> 10.9 <SEP> 8.0 <SEP> 23
<tb> <SEP> 50 <SEP> 19.8 <SEP> 8.0 <SEP> 227
<tb> <SEP> 100 <SEP> 16.0 <SEP> 8.0 <SEP> 241
<tb> <SEP> 200 <SEP> 17.0 <SEP> 10.0 <SEP> 278
<tb> <SEP> 300 <SEP> 16.0 <SEP> 9.3 <SEP> 238
<tb> </TABLE>
Example 7
Purification of the enzymatically active human manganese superoxide dismutase produced by the recombinant genetic engineering.
The Escherichia coli strain A4255, in whose cells the plasmid pMS DELTA RB4 had been taken up, was grown in Luria broth to which 750 ppm of manganese ions, based on this broth, had been added. The cultivation was carried out at a temperature of 32 ° C. until the culture had an optical density at 600 nm of 17.0. Induction of human MnSOD expression was carried out by raising the temperature to 42 ° C. over two hours. At this point the culture had reached an optical density at 600 nm of 43.0. The cells were obtained from the culture by centrifugation and the cells thus isolated were then resuspended in 0.2 of the original volume in a 50 mM potassium phosphate buffer which had a pH of 7.8 and contained 250 mM in sodium chloride .
The bacteria were then broken up by passing them twice through a device called Dynomill and then centrifuged and the cell debris discarded.
The supernatant material thus obtained was heated to 60 ° C. for one hour and then cooled to 4 ° C. and the material above it was subjected to clarification. The clarified supernatant was then concentrated to 0.03 of its original volume and dialyzed against a 2 mM potassium phosphate buffer at pH 7.8 using an Pelaf-Ultrafiltration Unit ultrafiltration device equipped with a 10K membrane was.
The crude enzyme preparation thus obtained was applied to a DE52 column, washed thoroughly with a 2 mM potassium phosphate buffer of pH 7.8 and then eluted with a 20 mM potassium phosphate buffer of pH 7.8.
Those fractions containing the enzyme were pooled together and then dialyzed against a 40 mM solution of potassium acetate pH 5.5. The material was then applied to a CM52 column and the elution was carried out using a linear gradient from 40 mM potassium acetate to 200 mM potassium acetate, the potassium acetate solutions having a pH of 5.5.
Those peak fractions containing the human MnSOD were pooled and dialyzed against water. The enzyme preparation was then adjusted so that it was in a 10 mM phosphate buffer with a pH of 7.8 and this product was then frozen at -20 ° C.
The human MnSOD obtained by this recombinant genetic engineering was purer than 99% and the specific activity of this product was about 3500 units / mg.
The overall yield from this cleaning process was about 30%.
These results are summarized in Table 3 below.
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Head Col 01 to 05 AL = L: Table 3
<tb> SubHead Col 01 to 05 AL = L: Purification of human MnSOD obtained by recombinant genetic engineering
<tb> Title: cleaning level
<tb> Title: total amount of proteins in g
<tb> Title: Yield in g
<tb> Title: an MnSOD in%
<tb> Title:
Specific
Activity in
Units / mg
<tb> <SEP> Surplus material after treatment with the Dynomill <SEP> 100.0 <SEP> 11.9 <SEP> 100.0 <SEP> 417
<tb> <SEP> Surplus material after the
Heating to 60 ° C. <SEP> 24.0 <SEP> 8.2 <SEP> 68.9 <SEP> 1197
<tb> <SEP> Retentate after ultrafiltration with the Pelicon device <SEP> 20.0 <SEP> 7.5 <SEP> 63.0 <SEP> 1350
<tb> <SEP> eluate from the DE52 column <SEP> 7.3 <SEP> 5.7 <SEP> 48.0 <SEP> 2732
<tb> <SEP> Eluate from the CM52 column <SEP> 4.2 <SEP> 4.2 <SEP> 35.3 <SEP> 3500
<tb> </TABLE>
The values given in Table 3 refer to the purified enzyme, which was produced using a 15 liter fermentation tank.
The metal content of the MnSOD produced by recombinant genetic engineering was determined by atomic absorption and it was found that there are approximately 0.77 atoms of manganese per enzyme subunit. This value is in good agreement with the corresponding results published by McCord et al. in the book "Superoxide und Superoxid-dismutase" mentioned above.