DE60131261T2

DE60131261T2 - Verbesserte verfahren und zellen zur expression von rekombinanter proteinprodukte

Info

Publication number: DE60131261T2
Application number: DE60131261T
Authority: DE
Inventors: Marc D. Oakland BETTER
Original assignee: Xoma Technology Ltd USA
Current assignee: Xoma Technology Ltd USA
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-19
Publication date: 2008-09-04
Anticipated expiration: 2021-03-20
Also published as: US20020037552A1; US6803210B2; CA2404046C; EP1268823B1; EP1268823A2; DE60131261D1; DK1268823T3; WO2001073082A2; ATE377649T1; AU4926501A; AU2001249265B2; JP2003528616A; PT1268823E; ES2295151T3; WO2001073082A3; CA2404046A1; CY1107173T1; US20050260705A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein verbesserte Verfahren zur Expression rekombinanter Proteinprodukte unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, in bakteriellen Wirtszellen, die in einem oder mehreren aktiven Transportsystemen für einen Induktor defizient sind. Im Fall des araB Promotors ist der Induktor L-Arabinose. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner verbesserte bakterielle Wirtszellen, die in einem oder mehreren aktiven Transportsystemen für einen Induktor, wie zum Beispiel L-Arabinose, defizient sind, und die einen Expressionsvektor enthalten, deren rekombinantes Proteinprodukt unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, kodiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Obwohl in mikrobiellen Systemen viele Systeme zur Expression rekombinanter Proteine einschließlich von Peptiden und Polypeptiden beschrieben wurden, beruhten die meisten Genexpressionssysteme in gram-negativen Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli, ausschließlich auf einer begrenzten Anzahl bakterieller Promotoren. Die am meisten verwendeten bakteriellen Promotoren umfassten den Lactose[lac]-Promotor (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33: 103–109), den Tryptophan[trp]-Promotor (Goeddel et al., 1980, Nature (London) 287: 411–416) sowie die Hybridpromotoren [tac und trc], die von diesen beiden abgeleitet sind (Brosius, 1984, Gene 27: 161–172; und Amanna and Brosius, 1985, Gene 40: 183–190). Weitere häufig verwendete bakterielle Promotoren umfassen die lambda- Phagenpromotoren P_L und P_R (Elvin et al., 1990, Gene 37: 123–126), den T7-Phagenpromotor (Tabor and Richardson, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 1074–1078), und den alkalischen Phosphatase-Promotor [pho] (Chang et al., 1986, Gene 44: 121–125). Jeder dieser Promotoren weist wünschenswerte Merkmale auf. Der ideale Promotor zur Expression einer Vielzahl rekombinanter Proteine würde jedoch bestimmte Merkmale aufweisen, welche in diesen üblicherweise verwendeten Systemen nicht vorliegen. Beispielsweise können viele rekombinante Produkte toxisch für die Expression im Wirt sein. Daher wird es häufig bevorzugt, dass der Promotor während des Propagierens der Kultur, wenn eine Genexpression unerwünscht ist, die Genexpression strikt reguliert. Wenn dagegen eine Genexpression erwünscht ist, muss der Promotor einfach zu kontrollieren sein, da häufig ein hohes Expressionsniveau bevorzugt ist. Das Agens oder die Umweltbedingung, welche die Genexpression initiiert, sollte einfach anzuwenden sein und idealerweise wenig kosten. Im Allgemeinen ist ein strikt reguliertes System am erstrebenswertesten. Die Merkmale eines Promotors sowie eines allgemeinen Expressionssystems, die am meisten bevorzugt werden, umfassen eine strikt reprimierte Genexpression bei Fehlen eines Induktors sowie eine stark dereprimierte Genexpression in der Gegenwart eines Induktors. Ebenfalls wünschenswert wäre ein System, das ein Expressionsniveau eines rekombinanten Produkts ermöglicht, welches proportional zur Menge des induzierenden Agens ist, das zur Zellkultur zugegeben wird.
Hahn et al., 1983, J. Bacteriol. 155 (2) : 593–600 beschreiben die in vivo-Regulation des Escherichia coli araC Promotors. Insbesondere beschreiben Hahn et al. die Derepression und anschließende Wiederherstellung der P_C-Repression nach Zugabe von Arabinose.
Ein bakterielles Promotorsystem, von dem gezeigt wurde, dass es besonders vorteilhaft zur Bereitstellung einer strikt reprimierten Genexpression bei Fehlen des Induktors Arabinose und einer stark dereprimierten Genexpression in der Gegenwart des Induktors Arabinose ist, ist der araB Promotor der Familie der Enterobacteriaceae. Von Interesse ist das US-Patent Nr. 5,028,530 , das die Verwendung des araB Expressionssystems zur Herstellung von Polypeptiden einschließlich von Cecropinen mit Hilfe mikrobiologischer Techniken beschreibt. Zwei Merkmale des ara Systems machen dieses besonders geeignet zur Expression rekombinanter Produkte in Bakterien, wie zum Beispiel in E. coli. Zunächst ist es einfach anzuwenden, da die Kontrollelemente des araB Promotors günstigerweise innerhalb einer ungefähr 300 Basenpaare langen regulatorischen Region enthalten sind, und nur eine funktionelle kodierende Sequenz für das araC Gen zusätzlich erforderlich ist. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die Regulation des Systems besonders strikt ist, d. h. das Verhältnis der vom araB Promotor auf Multicopy-Expressionsplasmiden abgelesenen Menge an Produkt im induzierten Zustand (mit Arabinose) im Verhältnis zu der im reprimierten Zustand (ohne Arabinose) relativ hoch ist, am häufigsten im Bereich von > 200 bis 75.000 (Retter et al., 1999, in: Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Academic Press, New York, S. 95–107). Zusätzlich ist das Niveau an nicht-induzierter Proteinexpression des ara-Systems sehr gering. Dieses Merkmal ist besonders wichtig und zweckmäßig, wenn Proteinprodukte einschließlich rekombinanter Peptide und Polypeptide exprimiert werden sollen, die für den Wirt toxisch sind.
Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, weisen zwei bekannte Systeme zum aktiven Transport von Arabinose in die Zelle auf. Das erste dieser Systeme stellt einen induzierbaren, energieabhängigen Akkumulationsprozess dar, der durch das Produkt des araE Gens katalysiert wird. Das araE Genprodukt ist ein ungefähr 52.000 Da großes membranassoziiertes Protein, welches das niederaffine Arabinose-Transportsystem darstellt (Maiden et al., 1988, Journal of Biol. Chem. 263: 8003–8101). Das zweite L-Arabinose-Transportsystem weist eine größere Affinität für L-Arabinose auf und ist von der Aktivität des L-Arabinose-Bindeproteins AraF abhängig. Der Locus, welcher dieses Arabinose-Bindeprotein araF kodiert, ist Teil eines Operons mit araG und araH. Die Proteinprodukte dieser drei Gene, araFGH, stellen das hochaffine L-Arabinose-Transportsystem dar (Horazdovsky and Hogg, 1989, Jour. of Bacter. 171: 3053–3059). Arabinosetransportdefiziente mutierte E. coli-Stämme wurden hergestellt (siehe z. B. Maiden et al., supra; Harazdovsky and Hogg, supra).
Von Interesse sind die Offenbarungen der nachfolgenden Referenzen, welche die Verwendung des araB Promotors zur Expression von Polypeptiden in Bakterien betreffen.
Johnston et al., 1985, Gene 34: 137–145 beschrieben den Vektor pING1, der die ara regulatorische Region, das vollständige araC Gen und einen Teil des araB Gens aus S. typhimurium enthielt. Restriktionsschnittstellen wurden in die kodierende Region des araB Gens eingeführt, so dass eine Genfusion oder eine multigene Transkriptionseinheit unter Arabinose-Kontrolle exprimiert werden konnte. Dieses System wurde verwendet, um homologe (bakterielle) Proteine zu exprimieren, welche normalerweise in E. coli unter bestimmten Umständen exprimiert werden, nämlich die Proteine des M13 Gens II (Johnson et al., 1985) und des Gens 8 (Kuhn and Wickner, 1985, J. Biol. Chem. 260: 15907–15918). Ein ähnlicher Vektor wurde verwendet, um das RepE Protein vom E. coli F-Plasmid zu exprimieren (Masson et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14: 5693–5711). Jedes dieser Proteine wurde im Cytoplasma von E. coli-Zellen erzeugt, und zumindest ein Teil des exprimierten Proteins war löslich und konnte in aktiver Form entweder in vivo oder in Zellextrakten detektiert werden.
Retter et al., 1988, Science 240: 1041–1043 beschrieben ein von pING1 abgeleitetes araB Expressionssystem, das in der Folge konstruiert wurde, um die Expression heterologer (nicht-bakterieller) rekombinanter Proteine zu regulieren. Heterologe Proteine, die erfolgreich mit dem araB Expressionssystem in E. coli erzeugt werden konnten, umfassen Immunglobulin Fab-Domänen. In diesem Fall wurde das araB Expressionssystem verwendet, um die Produktion von direkt mit hydrophoben Signalsequenzen verbundenen Polypeptiden durch die bakterielle Cytoplasmamembran zu lenken, an der die Fab in korrekt gefalteter, vollständig aktiver Konfiguration akkumulierten und direkt aus dem Kulturüberstand gewonnen werden konnten. Die Expression von Fab-Domänen unter der transkriptionellen Kontrolle des araB Promotors war der erste Nachweis, dass ein heterodimeres, heterologes Protein in E. coli erzeugt werden konnte. Die anfangs berichteten Expressionsniveaus lagen ungefähr bei 1–2 μg/ml, aber in darauffolgenden Untersuchungen konnten die Proteinexpressions-Niveaus nahezu um das 1000fache gesteigert werden, indem die Bakterien zu einer hohen Zelldichte in einem Fermenter angezogen wurden (Retter et al., 1990, ICSU Short Rep. 10: 105). Im Gegensatz dazu fanden Clark et al., 1997, Immunotechnology 3: 217–226, dass die Fab-Gene unter lac Kontrolle bakterielles Wachstum hemmen können, und dass die Fab-Expression ausgehend von P_BAD strikter reprimiert war als die ausgehend von P_lac.
Retter et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 16712–16718; Nolan et al., 1993, Gene 134: 223–227; und Bernhard et al., 1994, Bioconjugate Chem. 5: 126–132 zeigten, dass das araB Expressionssystem erfolgreich für die Herstellung anderer Proteine verwendet werden konnte. Mehrere Ribosomen-inaktivierende Proteine aus Pflanzen und Pilzen wurden unter der direkten Kontrolle von Arabinose in E. coli exprimiert. Eines dieser Proteine, Gelonin, wurde als ein sekretiertes Protein in E. coli exprimiert und akkumulierte als vollständig aktives Protein im zellfreien Kulturüberstand in einer Konzentration von mehr als 1 g/l. Fusionsproteine aus Antikörperdomänen, welche gegen Antigene auf humanen Zellen gerichtet sind, und cytotoxischen Molekülen, wie zum Beispiel Gelonin, wurden ebenfalls unter der transkriptionellen Kontrolle von Arabinose exprimiert (Retter et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 14951–14957). Diese Immunfusionsproteine akkumulierten im zellfreien Kulturüberstand von Arabinose-induzierten Zellen in einer Konzentration von mehr als 400 mg/l. Mitglieder der Familie von Immunfusionsproteinen, die unter der transkriptionellen Kontrolle des araB Promotors in E. coli exprimiert wurden, behielten sowohl in vitro als auch in vivo eine biologische Aktivität, die mit der chemisch erzeugter Immunkonjugate vergleichbar war, die aus ganzen Antikörpern, welche in tierischen Zellen erzeugt wurden, und Ribosomeninaktivierenden Proteinen, welche direkt aus Pflanzen gereinigt wurden, erzeugt wurden.
Jacobs et al., 1989, Gene 83: 95–103 und Romeyer et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56: 2748–2754 verwendeten ebenfalls von pING1 abgeleitete Plasmide, um Säugetierproteine zu kodieren, welche in der äußeren Zellmembran von Bakterien lokalisiert werden können. In einem Beispiel wurde ein humanes Metallothionein II-Gen mit dem Leader- und Membranassoziations-Fragment des E. coli Lipoproteins Lpp verknüpft (Jacobs et al., 1989). Bei Induktion mit Arabinose wurde in den Bakterien, welche diesen Expressionsvektor enthielten, ein aktives Metallothionein-Protein an der äußeren Zellmembran synthetisiert. Das rekombinante Protein wurde gegenüber dem nicht-induzierten Niveau in einer ungefähr 75.000-fach höheren Menge erzeugt. Dieses System wurde verwendet, um ein aktives heterologes Protein zu exprimieren, das zuvor in E. coli einigermaßen toxisch und instabil war.
Cagnon et al., 1991, Protein Eng. 4: 843–847 beschrieben eine Reihe von Expressionsvektoren, die das ara Expressionssystem aus pING1 im Vektor pKK233.2 zusammen mit einer Reihe anderer optionaler Merkmale enthielten. In der Cagnon-Reihe von Expressionsvektoren folgte der Promotor/Operator-Region von araB eine Polylinker-Region zum einfachen Klonieren von Genen. Zusätzlich enthielten einige Vektoren synthetische Signalsequenzen, einen Origin of replication aus dem f1 Phagen und mutierte araB Promotorsequenzen. Der mutierte araB Promotor enthielt Veränderungen in der -10-Region, die den Promotor ähnlicher einem E. coli-Konsensuspromotor machten. Die Promotor mutationen resultierten in einem höheren Niveau an induzierbarer Expression für ein Markergen (2fach), wobei jedoch auch das nicht-induzierte Expressionsniveau anstieg. Mit Hilfe dieser Familie von ara Expressionsvektoren wurden mehrere rekombinante Proteine exprimiert einschließlich des vollständigen Tat Proteins aus dem HIV-Virus (Armengaud et al., 1991, FEBS Lett. 282: 157–160) und der bakteriellen Proteine β-Galactosidase (Cagnon et al., 1991), Bleomycin-Bindeprotein aus Streptoalloteichus hindustanus (Cagnon et al., 1991) und Untereinheit B des Choleratoxins (Slos et al., 1994, Protein Express. Purif. 5: 518–526). Die Untereinheit B des Choleratoxins (CT-B) wurde mit der ompA Signalsequenz verknüpft und als sekretiertes Protein exprimiert. CT-B akkumulierte bis zu einer Konzentration von annähernd 60% des gesamten periplasmatischen Proteins. In einer Pilotstudie wurde CT-B in einer Konzentration von etwa 1 g/Liter erzeugt. Der Großteil von CT-B wurde in das Kulturmedium freigesetzt und konnte aus dem zellfreien Kulturmedium mit einer Effizienz von mehr als 80% gewonnen werden.
Perez-Perez and Gutierrez, 1995, Gene 158: 141–142 beschrieben ein ara Expressionssystem in pACYC184, das mit von ColE1 abgeleiteten Plasmiden in einem Wirtsexpressionssystem kompatibel bleibt.
Guzman et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 4121–4130 beschrieben eine Reihe von araB Expressionsvektoren, die verschiedene Selektionsmarker und Multiklonierungsstellen enthielten. Diese Reihe von Vektoren wurde extensiv im Zusammenhang mit der Expression nativer E. coli Proteine untersucht. Guzman et al. (1995) lieferten ebenfalls den Nachweis, dass das araB-System verwendet werden kann, "um sehr niedrige Niveaus an uninduzierter Expression zu erzielen, moderat hohe Niveaus an Expression in Gegenwart eines Induktors zu erhalten und die Expression über einen weiten Bereich an Induktor-Konzentrationen zu modulieren." Es wurde die Möglichkeit erwogen, dass das Ausmaß der Arabinose-Induktion durch die Menge an Induktor reguliert werden kann, die zur Kultur gegeben wird.
Andere haben berichtet, dass die Genexpression unter der Kontrolle des araB-Promotors direkt durch die Arabinose-Konzentration reguliert zu werden scheint, die in das Kulturmedium eingebracht wird (Lutz and Bujard, 1997, Nucleic Acids Research 25: 1203–1210; und Carrier et al., 1998, Biotechnol. Bioengineering 59: 666–672). Im Gegensatz dazu demonstrierten jedoch Siegele and Hu, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 8168–8172, dass die Genexpression von Plasmiden, die den araB Promotor enthalten, bei nicht-gesättigten Arabinose-Konzentrationen tatsächlich den Populationsdurchschnitt einer gemischten Population induzierter und nicht-induzierter Zellen repräsentiert. Folglich reflektierten die intermediären Expressionsniveaus in den Kulturen den Durchschnitt der induzierten und nicht-induzierten Zellen in der Population, jedoch keine direkte Regulation. Siegele and Hu, supra, konstruierten Plasmide, die ein Reportergen für ein mutiertes Green Fluorescent Protein (gfp) enthielten, und diese Plasmide exprimierten eine sich schnell faltende Mutante des Aequorea victoria Green Fluorescent Protein unter der transkriptionellen Kontrolle des araB Promotors. Eine mikroskopische Überprüfung von Zellen, die bei niedrigen Arabinose-Konzentrationen angezogen wurden, zeigte eine Mischung hell fluoreszierender und dunkler Zellen, was suggeriert, dass die intermediären Expressionsniveaus in den Kulturen einen Populationsdurchschnitt reflektieren. Da der Induktor Arabinose aktiv in die Zelle transportiert wird, würde man erwarten, dass das Ausmaß an Induktion in einer vorliegenden Zelle mit der Menge an Arabinose variiert, die aktiv in diese Zelle transportiert wird. Folglich würde das durchschnittliche Ausmaß an Induktion in einer Zellpopulation wiederum der durchschnittlichen Menge an Arabinose entsprechen, die aktiv in diese Zellpopulation transportiert wird. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass diejenigen Zellen, die hohe Konzentrationen an Arabinose enthalten, voll induziert sind. Ein ähnliches Phänomen wurde ebenfalls mit Bezug auf Lactose-Transport und die Induktion des lac Operons berichtet (Novick and Weiner, 1957, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 43: 553 und Maloney and Rotman, 1973, J. Mol. Biol. 73: 71–91). Diese Referenzen einschließlich von Siegele and Hu, supra, kommen somit zum Schluss, dass, obwohl araB Vektoren im Vergleich zu Plasmiden, die durch den lac Repressor reguliert werden, die Vorteile einer schnellen Regulation und niedriger basaler Expressionsniveaus aufweisen, der araB Promotor aufgrund von Abweichungen in der Arabinose-Aufnahme zwischen Zellen nicht gut geeignet ist, um die Expression klonierter Gene zu modulieren.
Die oben zitierten Referenzen zeigen, dass das araB Expressionssystem für die kontrollierte Expression rekombinanter Proteine in bakteriellen Systemen geeignet ist. Diese Referenzen zeigen weiterhin, dass das araB System Vorteile aufweist, die man in anderen bakteriellen Expressionssystemen nicht findet. Man ist jedoch nach wie vor mit dem Problem konfrontiert, direkt regulierte Zellkulturen zu generieren, in denen das Ausmaß an Proteinexpression in den Zellen tatsächlich proportional zur Menge an Induktor (z. B. Arabinose) ist, die im Kulturmedium vorliegt. Da die Induktion rekombinanter Produkte in bakteriellen Zellen häufig das nachfolgende Zellwachstum hemmt, wäre es wünschenswert, Zellkulturen zu generieren, in denen die Genexpression direkt und proportional zur Menge an Induktor reguliert werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Expression rekombinanter Proteinprodukte einschließlich von Peptiden und Polypeptiden unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors. In diesem Zusammenhang werden bakterielle Wirtszellen genetisch mit Defizienzen in aktiven Transportsystemen für einen Induktor eines Promotors ausgestattet (engineered) und enthalten Vektoren zur Expression von rekombinanten Proteinprodukten unter der Transkriptionskontrolle eines induzierbaren Promotors. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere neue genetisch modifizierte bakterielle Wirtszellen, die in einem oder beiden der zwei bekannten L-Arabinose-Transportsysteme von E. coli oder verwandten Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae, einschließlich der Spezies Salmonella, Pseudomonas, Proteus und Enterobacter, defizient sind und zur Expression rekombinanter Proteinprodukte in der Lage sind. Die Verwendung solch Transport-defizienter bakterieller Wirtszellen einschließlich Arabinose-Transport-defizienter bakterieller Wirtszellen zur Expression rekombinanter Proteinprodukte unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, sorgt für eine erhöhte Expression des rekombinanten Proteinprodukts, eine geringere Hemmung des Zellwachstums der Wirtszelle nach Induktion und/oder eine direkte und synchrone Induktion der Expression in solchen Wirtszellen im Vergleich zu der in Transport-kompetenten Zellen. Demzufolge können rekombinante Proteinprodukte einschließlich von Proteinprodukten, die als therapeutische, prophylaktische und/oder diagnostische Agenzien verwendbar sind, in effizienter und ökonomischer Weise mit Hilfe der Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert werden.
Hierin offenbart ist ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteinprodukts unter der induzierbaren Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, das umfasst: (a) Einbringen eines rekombinanten Expressionsvektors, der ein rekombinantes Proteinprodukt unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors (z. B. araB) kodiert, in eine bakterielle Wirtszelle, die in mindestens einem System zum aktiven Transport des Induktors (z. B. Arabinose) in die Wirtszelle genetisch defizient ist; und (b) Induzieren der Expression des rekombinanten Proteinprodukts mit dem Induktor (z. B. Arabinose).
Wie hierin offenbart, stellt ein verbessertes Verfahren eine direkte Regulation einschließlich einer synchronen Induktion bakterieller Zellkulturen bereit, bei dem die Expression rekombinanter Proteinprodukte proportional zur Konzentration des Induktors (z. B. Arabinose) in der Kultur ist. In genetisch konstruierten Wirtszellen, die einen Vektor zur Expression eines Proteinprodukts unter der transkriptionellen Kontrolle des induzierbaren Promotors (z. B. araB) enthalten, und die defizient bezüglich des Transports des Induktors (z. B. Arabinose) sind, ist die intrazelluläre Konzentration des Induktors (z. B. Arabinose) proportional zur Konzentration des Induktors (z. B. Arabinose) in Kulturmedium, da die passive Diffusion der einzige Mechanismus zur intrazellulären Akkumulation des Induktors (z. B. Arabinose) über die bakteriellen Membranen ist. Dies stellt eine direkte Regulation der Expression dar und führt zur synchronen Induktion der Expression des rekombinanten Proteinprodukts in den Wirtszellen. Demzufolge weisen die Verfahren der vorliegenden Erfindung Vorteile auf, die man bei Expression ausgehend von einem induzierbaren Promotor, wie zum Beispiel dem araB Promotor, in Transport-kompetenten bakteriellen Wirtszellen nicht findet, wenn eine gemischte Population induzierter und nicht-induzierten Zellen vorliegt, und wenn das anscheinende Verhältnis zwischen der Menge des rekombinanten Produkts und der Konzentration des induzierenden Agens bei nicht-gesättigten Mengen des Induktors, wie zum Beispiel Arabinose, den Populationsdurchschnitt in der Expression sowohl induzierter als auch nicht-induzierter Zellen reflektiert.
Hierin ebenfalls offenbart ist eine bakterielle Wirtszelle, die in einem oder mehreren aktiven Transportsystemen für einen Induktor, wie zum Beispiel L-Arabinose, defizient ist, und die einen Expressionsvektor enthält, der ein rekombinantes Proteinprodukt unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, kodiert. Solche Zellen sind für die Herstellung einer Vielzahl von Proteinprodukten verwendbar.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteinprodukts unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors bereitgestellt, wobei der induzierbare Promotor ein araB Promotor ist, das umfasst: (a) Einbringen eines Expressionsvektors, der ein rekombinantes Proteinprodukt unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors kodiert, in eine bakterielle Wirtszelle, die in einem System für den aktiven Transport eines Arabinose-Induktors des Promotors in die Wirtszelle genetisch defizient ist, wobei das System ein niederaffines Arabinose-Transportsystem ist, das durch ein araE Gen kodiert wird, oder ein hochaffines Arabinose-Transportsystem, das durch ein araFGH Gen kodiert ist; und (b) Induzieren der Expression des Produkts mit dem Induktor.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteinprodukts unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors bereitgestellt, wobei der induzierbare Promotor ein araB Promotor ist, das umfasst: (a) Kultivieren einer bakteriellen Wirtszelle, die in einem System für den aktiven Transport eines Arabinose-Induktors des induzierbaren Promotors in die Wirtszelle genetisch defizient ist, wobei das System ein niederaffines Arabinose-Transportsystem ist, das durch ein araE Gen kodiert wird, oder ein hochaffines Arabinose-Transportsystem, das durch ein araFGH Gen kodiert wird, und wobei die Wirtszelle einen Expressionsvektor enthält, der ein rekombinantes Proteinprodukt unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors kodiert; und (b) Induzieren der Expression des Produkts mit dem Induktor.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine bakterielle Wirtszelle bereitgestellt, die in einem aktiven Transportsystem für einen Arabinose-Induktor eines induzierbaren Promotors defizient ist, wobei der induzierbare Promotor ein araB Promotor ist und wobei das System ein niederaffines Arabinose-Transportsystem ist, das durch ein araE Gen kodiert wird, oder ein hochaffines Arabinose-Transportsystem, das durch ein araFGH Gen kodiert wird, wobei die Wirtszelle einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, der ein rekombinantes Proteinprodukt unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors kodiert.
Die rekombinanten Proteinprodukte können therapeutische, prophylaktische und/oder diagnostische Agenzien sein. Solche rekombinanten Produkte können Proteinprodukte umfassen, vorzugsweise aus Tieren und Pflanzen abgeleitete Produkte, einschließlich von Genprodukten aus Säugetieren, wie zum Beispiel humane oder human-ähnliche Proteinprodukte, die keine Reporter- oder Markergenprodukte sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein silber-gefärbtes Polyacrylamidgel, das Proteinmuster nach Induktion von E220(pING3825)-, E226(pING3825)- und E229(pING3825)-Transformanten nach Induktion mit 0,01 und 1,0% Arabinose für 4,5 Stunden vergleicht.
2 zeigt mit Coomassie-Blau (Coomassie colloidal blue) gefärbte Polyacrylamidgele, die zellfreie Kulturüberstände aus bakteriellen Wirtszellen vergleichen, die mit Arabinose induziert sind. 2A zeigt die Induktion nach 4 Stunden; 2B zeigt die Induktion nach 18 Stunden.
3 zeigt einen Western-Blot induzierter und nicht-induzierter Proben, der zellfreie Kulturüberstände aus bakteriellen Wirtszellen vergleicht, die mit Arabinose induziert sind.
4 zeigt eine schematische Darstellung des araB Promotorsystems (siehe auch Retter et al., 1999, supra).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung basieren auf der überraschenden Entdeckung, dass das Expressionsniveau rekombinanter Proteinprodukte, die unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, exprimiert werden, in bakteriellen Zellen höher sein kann, welche in mindestens einem aktiven Transportsystem für den Induktor des Promotors, wie zum Beispiel in einem oder beiden der Arabinose-Transportsysteme von E. coli, defizient sind. Ebenfalls überraschend werden mit solch Transport-defizienten Wirtszellen im Vergleich zu Transport-kompetenten Zellen substantielle Verminderungen in der Hemmung des bakteriellen Zellwachstums erhalten. Beispielsweise mit Arabinose können mit solch Transport-defizienten Zellen derartige Verminderungen in der Wachstums-Hemmung aufgrund der Arabinose unter Verwendung einer annähernd 10–100fach höheren Arabinose-Konzentration erreicht werden, wobei das Ausmaß der rekombinanten Proteinexpression annähernd dasselbe oder höher ist. Zusätzlich wurde in solchen Wirtszellen überraschenderweise eine direkte Regulation und synchrone Induktion rekombinanter Proteinexpression mit einem Induktor, wie zum Beispiel Arabinose, nachgewiesen. Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein verbesserte Verfahren zur Expression rekombinanter Proteinprodukte unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, in bakteriellen Wirtszellen, die in einem oder mehreren aktiven Transportsystemen für einen Induktor, wie zum Beispiel L-Arabinose, defizient sind, wobei die Genexpression unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors direkt durch die Konzentration des im Kulturmedium vorhandenen Induktors, wie zum Beispiel Arabinose, reguliert werden kann. Die Arabinose-Konzentrationen, die zur Induktion von Wirtszellen verwendet werden können, umfassen einen Bereich von etwa 0,00001% bis etwa 10% (v/v). Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ebenfalls bakterielle Wirtszellen, die in einem oder mehreren der aktiven Transportsysteme für einen Induktor eines Promotors, wie zum Beispiel L-Arabinose, defizient sind, und die einen Expressionsvektor enthalten, der ein rekombinantes Proteinprodukt unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, kodiert. Eine erhöhte Expression eines rekombinanten Proteinprodukts wird durch solch eine bakterielle Wirtszelle gemäß der Erfindung erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt demzufolge verbesserte Verfahren für die Expression rekombinanter Proteinprodukte unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie zum Beispiel des araB Promotors, in bakteriellen Wirtszellen bereit, die in einem oder mehreren aktiven Transportsystemen für einen Induktor, wie zum Beispiel L-Arabinose, defizient sind. Die Genexpression unter der Kontrolle solch eines induzierbaren Promotors (z. B. araB) kann direkt durch die Konzentration eines Induktors (z. B. Arabinose), der im Kulturmedium vorliegt, reguliert werden. Insbesondere stellt das Verfahren die spezifische Entwicklung und die Verwendung bakterieller Wirtszellen bereit, die Expressionsvektoren enthalten, welche rekombinante Proteinprodukte kodieren, wobei die Zellen in einem oder in beiden der zwei bekannten L-Arabinose-Transportsysteme von E. coli oder für ähnliche Arabinose-Transportsysteme in beliebigen verwandten Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae genetisch defizient sind. Die Verwendung Arabinose-Transport-defizienter Stämme für die Expression rekombinanter Proteinprodukte unter der transkriptionellen Kontrolle des araB Promotors sorgt verglichen mit den Expressionsniveaus in Arabinose-Transport-kompetenten Zellen für eine erhöhte Expression an rekombinantem Produkt und/oder eine geringere Hemmung des Wachstums der Wirtszelle nach Induktion. Somit ist das Verfahren der Erfindung zur Erhöhung der Ausbeute an Zellen und/oder an rekombinantem Proteinprodukt aus induzierten bakteriellen Wirtszellen verwendbar. Das verbesserte Verfahren stellt ferner ein Mittel bereit, um die Menge an rekombinantem Proteinprodukt in einer Wirtszelle durch Kontrolle der Menge an induzierbarem Agens, wie zum Beispiel L-Arabinose, welches in die bakterielle Kultur eingebracht wird, direkt zu regulieren.
"Vektor" bezeichnet eine Plasmid-DNA oder virale DNA, die rekombinantes genetisches Material enthält, das ein rekombinantes Proteinprodukt (rekombinante Proteinprodukte) kodiert und zur autonomen Replikation in Bakterien in der Lage sein kann. Vektor bezeichnet hierin auch einen "rekombinanten Expressionsvektor" oder einen "Expressionsvektor".
"Transformation" oder "transformiert" bezeichnet ein Einbringen rekombinanten genetischen Materials, wie zum Beispiel eines Vektors (z. B. ein Plasmid) in eine bakterielle Zelle mit Hilfe eines beliebigen, im Stand der Technik bekannten Transformationsverfahrens. Eine bakterielle Zelle oder diejenigen Kolonien, die von einer bakteriellen Zelle abstammen, welche solch rekombinantes genetisches Material aufgenommen hat, werden als "Transformanten" bezeichnet.
"Transduktion" oder "transduziert" bezeichnet das Einbringen genetischen Materials von einem Bakteriophagen in eine bakterielle Wirtszelle mit Hilfe eines beliebigen, im Stand der Technik bekannten Transduktionsverfahrens. Eine bakterielle Zelle oder diejenigen Kolonien, die von einer bakteriellen Zelle abstammen, welche solch ein Segment genetischen Materials von einem Bakteriophagen aufgenommen hat, werden als "Transduktanten" bezeichnet.
"Genetisch defizient" bezeichnet einen Mangel oder die Defizienz eines Genprodukts aufgrund der Mutation der DNA einschließlich Substitution, Deletion und/oder Addition.
"Rekombinantes Proteinprodukt" bezeichnet ein beliebiges Proteinprodukt, das kein Reporter- oder Markergenprodukt ist (wie zum Beispiel ein Green Fluorescent Protein), das von rekombinantem genetischen Material exprimiert wird, welches Aminosäuren kodiert, einschließlich von Peptiden, Polypeptiden, Proteinen, Oligoproteinen und/oder Fusionsproteinen. Ein rekombinantes Proteinprodukt ist vorzugsweise ein von Tieren oder Pflanzen abstammendes Produkt, das kein Reporter- oder Markergenprodukt ist, wie zum Beispiel ein Green Fluorescent Protein. Ein rekombinantes Proteinprodukt ist vorzugsweise ein von Säugetieren oder Pflanzen abstammendes rekombinantes Produkt. Ein rekombinantes Proteinprodukt ist ferner vorzugsweise ein humanes oder human-ähnliches Proteinprodukt. Ein rekombinantes Proteinprodukt ist vorzugsweise ein therapeutisches, prophylaktisches oder diagnostisches Produkt. "Reportergenprodukt" oder "Markergenprodukt" bezeichnen Forschungswerkzeuge, die einfach detektierbare Proteinprodukte darstellen, welche üblicherweise verwendet werden, um zu untersuchen, ob eine Genexpression stattgefunden hat (d. h. sie fungieren als Reporter oder Marker ihrer Expression). Repräsentative Reporter- oder Markergenprodukte umfassen Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), bovinen pankreatischen Trypsin-Inhibitor (BPTI), B-Lactamase (B-lac), B-Galactosidase (B-gal) und verschiedene Formen des Green Fluorescent Protein (gfp).
Das Protein "Gelonin" bezeichnet das Ribosomen inaktivierende Protein Gelonin, das hierin als rekombinantes Produkt unter der transkriptionellen Kontrolle des araB Promotors exprimiert wird. Das rekombinante Protein Gelonin wurde aus dem Saatgut der Pflanze Gelonium multiflorum kloniert, wie in Nolan et al., 1993, Gene 134: 223–227 und in den ebenfalls eigenen US-Patenten Nr. 5,376,546 und Nr. 5,837,491 beschrieben. Gelonin wurde als sekretiertes Protein in E. coli unter Verwendung der pelB Leadersequenz exprimiert, wobei die Leadersequenz in den ebenfalls eigenen US-Patenten Nr. 5,576,195 und Nr. 5,846,818 beschrieben wurde.
Das rekombinante Gelonin-Proteinprodukt, das gemäß der Erfindung exprimiert wird, stellt ein exemplarisches rekombinantes Proteinprodukt dar, das in einer exemplarischen bakteriellen Wirtszelle (E. coli) unter der transkriptionellen Kontrolle eines exemplarischen induzierbaren Promotors (der araB Promotor) exprimiert wurde. Exprimierte rekombinante Proteinprodukte der Erfindung können beliebige, im Stand der Technik für solche rekombinanten Proteinprodukte bekannte Aminosäuresequenzen unter der transkriptionellen Kontrolle eines induzierbaren Promotors, vorzugsweise des araB Promotors, umfassen, die keine Reporter- oder Markergenprodukte darstellen, wie zum Beispiel ein Green Fluorescent Protein. Die Erfindung stellt rekombinante Proteinprodukte bereit, die nach Induktion des induzierbaren Promotors (z. B. araB) in einem beliebigen bakteriellen Kompartiment akkumulieren oder in den zellfreien Kulturüberstand sekretiert werden. Demzufolge betrifft die Erfindung diejenigen rekombinanten Proteinprodukte, die nach Induktion entweder im Periplasma oder Cytoplasma mit den bakteriellen Wirtszellen assoziiert bleiben, oder die nach Induktion in das Kulturmedium sekretiert werden.
Der gemäß der Erfindung verwendbare araB Promotor ist ein beispielhafter induzierbarer Promotor. Ein Induktor dieses induzierbaren Promotors ist Arabinose, ein Zucker mit fünf Kohlenstoffatomen, der in der Natur verbreitet vorkommt, und in vielen Bakterien als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum dient. Dieses induzierbare Promotorsystem wird in Retter et al., 1999, supra, besprochen. Die Proteinprodukte der drei Gene (araB, araA und araD) werden für den Arabinose-Abbau in Mitgliedern der Familie der Enterobacteriaceae benötigt, wie zum Beispiel E. coli und S. typhimurium. Diese Gene bilden ein Cluster, das als araBAD abgekürzt wird. Diese Gene sind in einem einzelnen Operon angeordnet und kodieren die Enzyme Ribulokinase (AraA), L-Arabinose-Isomerase (AraA) und L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase (AraD). Angrenzend an das araBAD Operon findet sich eine komplexe Promotorregion sowie das regulatorische Gen araC. Die araBAD und araC Gene werden in entgegen gesetzten Richtungen transkribiert. Innerhalb und um die Promotoren für araBAD (P_BAD) und araC (P_C) liegen Bindungsstellen für das AraC Protein, das cyclische AMP-Rezeptor-Protein (CRP) und die RNA-Polymerase. Alleine oder in Kombination regulieren die an diese Regionen gebundenen Proteine sowohl in der Gegenwart als auch der Abwesenheit des Induktors L-Arabinose strikt die Expression von beiden Promotoren. 4 veranschaulicht die räumliche Anordnung der regulatorischen Regionen innerhalb dieser komplexen araBAD und araC Promotorregion.
Die Transkription ausgehend von P_BAD ist mit L-Arabinose induzierbar. In der Gegenwart von Arabinose stimuliert das an die araI Stelle unmittelbar angrenzend an die DNA-Polymerase Bindestelle des P_BAD Promotors gebundene AraC Protein die Transkription des araBAD Operons. Bei Fehlen von Arabinose reprimiert das AraC Protein jedoch die mRNA-Synthese ausgehend von P_BAD durch einen Mechanismus, der die Bildung eines DNA-Loops beinhaltet. Ohne Arabinose enthalten die meisten Kopien der ara regulatorischen Region zwischen den araO₂ und araI Stellen einen DNA-Loop, der durch das an beide dieser Stellen gebundene AraC Protein vermittelt wird. Dieser Loop hält das an araI gebundene AraC Protein vom Eintritt in den induzierten Zustand ab und hält das uninduzierte Expressionsniveau von P_BAD niedrig. Nach der Zugabe von Arabinose öffnet sich der araO₂/araI Loop und die an das AraC Protein an der araI Stelle gebundene Arabinose treibt AraC in die induzierte Konformation, wobei P_BAD induziert wird. Die Regulation dieses Operons ist ferner einer Katabolitrepression unterworfen, sogar in der Gegenwart von Arabinose, wobei eine signifikant geringere Induktion erfolgt, wenn die intrazellulären cyclischen AMP (cAMP)-Niveaus gering sind, als wenn die Zellen in der Gegenwart von Glukose angezogen werden.
Die Transkription ausgehend von P_C wird ebenfalls durch Arabinose reguliert. Bei Fehlen von Arabinose ist der Zugriff der RNA-Polymerase auf PC durch Bildung des AraC vermittelten araI/araO₂ Loops limitiert, und die araC Expression bleibt gering. In der Gegenwart von Arabinose vermindert das an araI gebundene AraC in seiner induzierten Konformation die sterische Beschränkung, und die RNA-Polymerase hat einen erhöhten Zugriff auf P_C. Die transkriptionelle Aktivität von P_C ist jedoch transient, da AraC an araO₁ binden kann und AraC vermittelte DNA-Loops zwischen araO₁ und araO₂ gebildet werden können, welche die Transkription ausgehend von P_C letztendlich limitieren. Zusätzlich ist P_C ebenfalls einer Katabolitrepression unterworfen.
Obwohl dem Anschein nach komplex, erlauben diese regulatorischen Vorkehrungen den Bakterien, die Enzyme für den Arabinose-Metabolismus nur dann zu erzeugen, wenn diese benötigt werden. Es hat sich ein System entwickelt, das zwei positiv regulatorische Proteine (AraC + Arabinose; CRP), ein negativ regulatorisches Element (AraC – Arabinose), einen Mechanismus zur Kontrolle der Genexpression durch DNA-Loop Bildung und ein System umfasst, das die Interaktion mit der RNA-Polymerase verhindern oder fördern kann. Alle Merkmale dieser gesamten regulatorischen Region sind vorteilhafterweise innerhalb eines DNA-Bereichs von etwa 300 Basenpaaren enthalten, wie in 4 gezeigt.
Somit bezeichnet ein "araB Promotor" eine DNA-Kontrollregion, die mindestens eine Bindungsstelle für eine RNA-Polymerase und eine assoziierte Bindungsstelle (assoziierte Bindungsstellen) für das AraC Protein oder sein funktionelles Äquivalent enthält. Essentielle Kontrollelemente eines araB Promotors aus der Familie der Enterobacteriaceae, wie am Promotor von E. coli beispielhaft veranschaulicht, werden in der DNA gefunden, die der Region von annähernd +1 bis –100 des in 4 schematisch dargestellten Promotors entspricht. Zusätzliche bevorzugte Kontrollelemente, wie zum Beispiel eine weitere Bindungsstelle (weitere Bindungsstellen) für araC oder sein funktionelles Äquivalent (z. B. AraO₂), werden in der DNA gefunden, die der Region von annähernd –100 bis –300 des in
4 schematisch dargestellten Promotors entspricht. Am meisten bevorzugt bezeichnet ein araB Promotor die DNA-Kontrollregion, die annähernd der Region von +1 bis –300 des in 4 schematisch dargestellten Promotors entspricht.
Bakterielle Wirtszellen der Erfindung können durch ein beliebiges, im Stand der Technik bekanntes Verfahren vermehrt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Wachstum in Kulturröhrchen, Schüttelflaschen oder in Bakterien-Fermentern. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Vermehrung von Wirtszellen, die einen rekombinanten Expressionsvektor enthalten, in einem Fermenter, wie im ebenfalls eigenen US-Patent Nr. 5,851,802 und der eigenen US-Patentanmeldung Nr. 09/271,970 beschrieben, oder mit Hilfe eines anderen im Stand der Technik bekannten Verfahrens.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Betrachtung der nachfolgenden illustrativen Beispiele ersichtlich, wobei Beispiel 1 die Konstruktion neuer isogener Arabinose-Transport-defizienter Stämme betrifft, die in Beispiel 2 mit einem Vektor transformiert werden, der ein rekombinantes Proteinprodukt kodiert. Beispiel 2 betrifft die Expressionsanalyse eines exemplarischen rekombinanten Proteinprodukts, Gelonin, in W3110, E220, E224 und E226 nach Arabinose-Induktion mittels SDS-PAGE und ELISA. Beispiel 3 betrifft die Analyse des Zellwachstums und der Expression des Gelonin-Proteinprodukts in E104, E221, E225 und E227 nach Induktion mit Arabinose.
Beispiel 1
Konstruktion Arabinose-Transport-defizienter Stämme

Isogene ΔaraFGH::kan und araE201-Stämme wurden ausgehend von E. coli W3110 (ATCC 27325) und E. coli E104 konstruiert (hinterlegt als ATCC 69009; ATCC 69008; ATCC 69101; ATCC 69102; ATCC 69103; ATCC 69104; ATCC 69331; ATCC 69332 und ATCC 69333, von denen jeder ein Gelonin-kodierendes Plasmid enthält). Die erhaltenen Stämme sind zusammen mit den intermediären Stämmen in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1. Arabinose-kompetente und -defiziente Stämme

Stamm	Elternstamm oder Referenz	Relevanter Genotyp
CW2553	Horazdovsky and Hogg (1989) Jour. of Bacter. 171: 3053–3059	ΔaraFGH::kan araE201
E104	W3110/siehe Beispiel 1	Δ(araBC)768
W3110	ATCC 27325
E220	W3110/PTA-1524^A	ΔaraFGH::kan
E221	E104/PTA-1525^A	ΔaraFGH::kan
E222	W3310	thyA
E223	E104	thyA
E224	E222/PTA-1526^A	araE201
E225	E223/PTA-1527^A	araE201
E226	E224/E228/PTA-1528^A	ΔaraFGH::kan araE201
E227	E229/PTA-1529^A	ΔaraFGH::kan araE201
E228	E220	ΔaraFGH::kan thyA
E229	E221	ΔaraFGH::kan thyA

^AHinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 21. März 2000.

Konstruktion von E220 und E221
E220 und E221 wurden mittels P1-Transduktion mit dem Bakteriophagen P1vir, der auf E. coli CW2553 (Horazdovsky anda Hogg, supra) angezogen wurde, aus W3310 bzw. E104 konstruiert. Für die Herstellung der P1-Phagenstammlösung auf E. coli CW2553 wurden bakterielle Zellen in TYE-Medium (15 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl) inokuliert und für 6 Stunden angezogen. Die Zellen wurden 1:50 in mit 5 mM CaCl₂ supplementiertem TYE verdünnt und für weitere 90 Minuten angezogen. Eine P1vir-Phagenstammlösung wurde 1:1000 in eine Salz-Minimallösung verdünnt (pro Liter: 21,4 g K₂HPO₄, 10,4 g KH₂PO₄, 13,6 g (NH₄)₂SO₄ und 0,3 g MgSO₄·7H₂O), und 0,1 ml der Phagen wurden mit 0,2 ml Zellen gemischt. Die Phagen und Zellen wurden bei 37°C für 30 Minuten ohne Schütteln inkubiert, anschließend wurden 3 ml R-Softagar (Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, 1992) zugegeben, und die Mischung wurde auf R-Agar plattiert und über Nacht angezogen. Es wurde 3 ml TYE auf die Oberfläche der Platte gegeben, und das Gemisch aus TYE und Softagar wurde von der Plattenoberfläche gekratzt.
Es wurden drei Tropfen Chloroform zugefügt, das Gemisch wurde gevortext und die Phagenstammlösung wurde vom Agar mittels Zentrifugation getrennt. Der Titer der erhaltenen Phagenstammlösung lag ungefähr bei 4 × 10⁹ Phagen/ml.
Für die Transduktion von W3110 und E104 wurde jeder Stamm über Nacht in TYE + 5 mM CaCl₂ angezogen. Die Zellen aus 2 ml jeder Kultur wurden mittels Zentrifugation abgetrennt, in 2 ml 0,1 M MgSO₄, 0,005 mM CaCl₂ suspendiert und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen (0,3 ml) und 0,2 mL TYE + 5 mM CaCl₂ wurden mit 0,1 ml unverdünnter Phagen, 1:10 oder 1:100 verdünnter Phagen oder Verdünnungspuffer allein gemischt. Die Zellen und Phagen wurden 20 Minuten bei 37°C inkubiert, anschließend wurden 0,6 ml 1 M Natriumcitrat zugegeben, gefolgt von 6 mL TYE. Die Transduktanten wurden 4 Stunden bei 37°C angezogen, bevor sie auf mit Kanamycin (50 mg/l) supplementierten TYE-Platten ausplattiert wurden. Kolonien erschienen auf den Platten mit den Phagen, die 1:10 und 1:100 verdünnt wurden. Keine Kolonien erschienen auf den Kontrollplatten. Ein Kanamycin-resistenter Transduktant von W3110 als E220 selektiert, und ein Kanamycin-resistenter Transkuktant von E104 wurde als E221 selektiert.
Konstruktion von E222, E223, E228 und E229
Da das araE201-Allel mit dem thyA-Gen co-transduziert werden kann, wurden thyA-Derivate von W3110, E104, E220 und E221 durch Selektion auf Trimethoprim-Platten (Miller, supra) identifiziert. Glucose/Trimethoprim-Minimalplatten wurden mit 10 mg/l Trimethoprim hergestellt, und jeder Stamm wurde ausplattiert. Kleine Kolonien, die nach ungefähr 4 Tagen erschienen, wurden erneut auf Trimethoprim-Platten ausgestrichen, und einzelne Kolonien wurden selektiert. Diese Einzelkolonien wurden im Anschluss auf Minimalplatten erneut ausgestrichen, wobei die Minimalplatten mit Thymidin und Trimethoprim supplementiert waren. Ein thyA-Derivat eines jeden Stamms wurde auf diese Weise identifiziert, wie in Tabelle 1 dargestellt.
Khonstruktion von E224
E. coli E222 wurde mit P1vir, der auf CW2553 angezogen wurde, zu einem ThyA+-Gentyp transduziert. Die Zellen wurden über Nacht in TYE + 5 mM CaCl₂ angezogen, in 0,1 M MgSO₄, 0,005 M CaCl₂ suspendiert und mit seriellen Verdünnungen von Phagen in 0,6 ml inkubiert. Die Zellen und Phagen wurden für 20 Minuten bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 0,6 ml 1 M Natriumcitrat und 6 mL TYE. Die Transduktanten wurden 1 Stunde bei 37°C angezogen, anschließend mittels Zentrifugation abgetrennt und in 1 ml einer Salzlösung suspendiert (pro Liter: 21,4 g K₂HPO₄, 10,4 g KH₂PO₄, 13,6 g (NH₄)₂SO₄ und 0,3 g MgSO₄·7H₂O). Die Zellen wurden auf Glucose-Minimalplatten ausplattiert und bei 37°C angezogen. Zehn mögliche Transduktanten wurden auf Minimalplatten erneut ausgestrichen. Kolonien, die aus diesen Ausstrichen hervorgingen, wurden in Bezug auf ihren Phänotyp auf Arabinose/Tetrazolium-Platten getestet. E222 erschien auf Arabinose/Tetrazolium-Platten weiß (Ara⁺), während sieben der zehn Transduktanten rosa gefärbt waren. Ara^–-Stämme erscheinen auf Tetrazolium-Platten rot. Eine rosa gefärbte Kolonie wurde als E224 ausgewählt. Diese Daten zeigen, dass die araE201-Stämme einen teilweise Ara^–-Phänotyp aufweisen. Diese phänotypische Unterscheidung konnte ebenfalls auf mit 0,25% Arabinose supplementierten MacConkey-Platten erkannt werden, auf denen E224 als schwach pink gefärbte Kolonien wuchs.
Konstruktion von E226
Ein bakterieller Stamm, der araE201 und ΔaraFGH ist, wurde ausgehend von E224 oder E228 konstruiert, wobei Stämme mit identischen Genotypen erhalten wurden. E224 wurde auf Kanamycin-Resistenz mit Hilfe eines P1vir-Lysats aus CW2553 transduziert, und ein einzelner Transduktant wurde als E226 selektiert. In ähnlicher Weise wurde E228 mit einem P1vir-Lysat aus CW2553 zu ThyA⁺ transduziert. Von den beiden ThyA⁺-Transduktanten von E228 wies ein Kandidatenklon auf Arabinose/Tetrazolium-Platten den partiellen Ara^–-Phänotyp auf, d. h. rosa gefärbte Kolonien. Dieser Kandidat wurde ebenfalls als E226 selektiert. Der Stamm E226, der entweder aus E224 oder E228 hergestellt wurde, wies einen identischen Phänotyp auf und zeigte den gleichen Phänotyp auf Tetrazolium/Arabinose-Platten.
Konstruktion von E227
Während ein araE201-Derivat von E222 oder E228 unter den ThyA⁺-Transduktanten mittels phänotypischer Selektion auf Indikatorplatten selektiert werden konnte, konnte dieser Ansatz zur Selektion eines araE201-Derivats von Stämmen, die aus E104 hervorgehen, nicht angewandt werden, da dieser Stamm aufgrund einer Deletion der araBC-Region, Δ(araBC)768, bereits Ara^– ist. Daher war ein unterschiedlicher Ansatz notwendig, um diese Arabinose-Transport-Mutante in einem Arabinose-negativen Hintergrund zu selektieren. Zu diesem Zweck wurde E229 mit dem Plasmid pING3825 transformiert, welches das Gelonin-Protein unter der induzierbaren Kontrolle des araB Promotors kodiert, und es wurden Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert. E229 (pING3825) wurde im Anschluss mit P1vir, der in CW2553 progagiert wurde, zu ThyA⁺ transduziert, und Transduktanten wurden auf Glucose-Minimalplatten, die mit Tetracyclin supplementiert waren, selektiert. ThyA^–-Transduktanten wurden zusammen mit E220 (pING3825) und E226 (pING3825) in TYE + Tetracyclin inokuliert und über Nacht angezogen. Die Transduktanten und die Kontrollen wurden im Anschluss in 10 ml Medium verdünnt und für ungefähr zwei Stunden bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,4 angezogen. 3 ml jeder Kultur wurden in ein Röhrchen überführt, das entweder 0,15 ml 0,2% Arabinose oder 0,15 ml 20% Arabinose enthielt, um eine Arabinose-Endkonzentration von 0,01% bzw. 1% zu erreichen. Jede Kultur wurde 4,5 Stunden angezogen, und die Zellen wurden mittels Zentrifugation entfernt. Fünfzehn Mikroliter des zellfreien Kulturüberstands von fünf Transduktanten sowie die E220- und E226-Kontrollen wurden mittels SDS-PAGE überprüft. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt, photographiert und anschließend mit Silber gefärbt (1). Zwei der Transduktanten produzierten, ebenso wie die E226-Kontrolle, nach vier Stunden Induktion mit 0,01% Arabinose sehr wenig rekombinantes Gelonin, während drei andere nahezu so viel Gelonin erzeugten wie die E220-Kontrolle. In den mit 1,0% Arabinose induzierten Kulturen wurden keine Unterschiede zwischen den Expressionsniveaus der Transduktanten detektiert. Die zur Generierung der in 1, Spur 3 dargestellten Probe verwendeten Zellen wurden als E. coli E227 (pING3825) selektiert. Um einen Stamm zu selektieren, der das Plasmid verloren hatte, wurde eine Kultur von E227 (pTNG3825) 3 Tage bei 37°C in TYE angezogen, und anschließend auf TYE-Platten ausplattiert, um Einzelkolonien zu isolieren. Die Kolonien wurden auf Platten mit und ohne Tetracyclin gepickt, und es wurde eine Kolonie identifiziert, die das Plasmid verloren hatte. Dieser Stamm wurde als E227 bezeichnet.
Konstruktion von E225
E. coli E223 wurde mit dem Plasmid pING3825 transformiert, und auf Tetracyclin-haltigen Platten wurden Kolonien selektiert, die das Plasmid enthielten. E223 (pING3825) wurde mit auf CW2553 angezogenem P1vir transduziert, und es wurden Transduktanten selektiert, die zum Wachstum auf Minimalplatten imstande waren. Einzelne Kolonien wurden nach Induktion mit 0,01% Arabinose auf ihre Gelonin-Produktion untersucht, wie für die Selektion von E227 oben dargestellt. Eine Zelllinie, die im Vergleich zu E220 (pING3825) und E104 (pING3825) nur eine geringe Menge Gelonin und eine ähnliche Menge wie E227 (pING3825) produzierte, wurde als E225 (pING3825) selektiert. Um eine Zelllinie zu identifizieren, die das pING3825 Plasmid verloren hatte, wurde E227 (pING3825) 24 Stunden bei 37°C angezogen, und im Anschluss drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Lebensfähige Zellen in der Kultur wurden anschließend auf TYE-Medium ausplattiert, und die erhaltenen Kolonien wurden in der Folge auf Platten mit und ohne Tetracyclin gepickt, und es wurde eine Kolonie identifiziert, die das Plasmid verloren hatte. Dieser Stamm wurde als E225 bezeichnet.
Beispiel 2
SDS-PAGE und ELISA-Analyse der Gelonin-Expression in W3110, E220, E224 und E226 nach Arabinose-Induktion
Vier isogene Stämme (W3310, E220, E224 und E226) wurden mit pING3825 transformiert. Jede Zelllinie wurde bis zu einer OD₆₀₀ von ungefähr 0,4 angezogen, und anschließend wurden 2 ml Aliquots jeder Kultur in Röhrchen transferiert, welche mit 0, 0,01, 0,1 oder 1% Arabinose supplementiert waren. Es wurden achtundzwanzig Röhrchen hergestellt, so dass die mit 0, 0,01, 0,1 oder 1% Arabinose induzierten Zellen 4 Stunden nach der Induktion geerntet werden konnten, und die mit 0,01, 0,1 und 1% Arabinose induzierten Zellen 18 Stunden nach der Induktion geerntet werden konnten. Nach der entsprechenden Inkubationsperiode von 4 oder 18 Stunden wurden die Zellen mittels Zentrifugation aus dem Kulturüberstand entfernt, und jeder Überstand wurde vor der Lagerung bei 4°C durch einen 0,2 μm Filter filtriert. Zehn Mikroliter jedes Überstands wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelekrophorese (SDS-PAGE) überprüft. Proben eines jeden Überstandes wurden mit Coomassie-Blau gefärbt (2). Einige Proben wurden ferner auf eine PVDF-Membran transferiert und mit einem Kaninchen-Antikörper gegen Gelonin, gefolgt von einem Ziege/anti-Kaninchen Peroxidase-Konjugat detektiert (3). Nach Induktion mit 0,01% Arabinose für 4 Stunden war eine Gelonin-Expression mittels Coomassie-Blau in W3310 und E220 detektierbar (schwache Bande; 2A, Spuren 1 und 2), und Gelonin war in E220 einfach mittels Western Blot-Analyse detektierbar, konnte jedoch in den E224- oder E226-Proben nach 4 Stunden mit keiner der Techniken detektiert werden. Vier Stunden nach Induktion mit 0,1% Arabinose konnte in keiner der Proben, in denen eine Bande der erwarteten Größe für Gelonin klar erkennbar war, ein Unterschied in der Menge der Gelonin-Expression detektiert werden (2A, Spuren 5 bis 8, und 3, Spuren 7 bis 9). Vier Stunden nach Inkubation mit 1% Arabinose war jedoch in den Proben der Stämme E224 und E226 eine höhere Expression nachweisbar als in den Stämmen W3110 oder E220 (2A, Spuren 9 bis 12, und 3, Spuren 10 bis 12).
In den Proben mit 18 Stunden Induktion war in keiner der vier mit 0,01% Arabinose induzierten Proben augenscheinlich ein Unterschied in der Menge des vorhandenen Gelonins detektierbar (2B, Spuren 1 bis 4). Im direkten Gegensatz dazu war in den mit 0,1 oder 1,0% Arabinose induzierten Proben von E224 und E226 sehr viel mehr Gelonin vorhanden als in den Proben von W3110 oder E220. Die erhöhte Expression von Gelonin bei 1,0% Arabinose nach vier Stunden und bei 0,1% (2B, Spuren 5 bis 8; vgl. die Spuren 7 und 8 mit den Spuren 5 und 6) oder bei 1,0% (2B, Spuren 9 bis 12; vgl. die Spuren 11 und 12 mit den Spuren 9 und 10) Arabinose nach 18 Stunden in E224 und E226 zeigt eine vorteilhafte rekombinante Genexpression in Transport-defizienten bakteriellen Wirtszellen. Eine geringere Hemmung des bakteriellen Wachstums nach Arabinose-Induktion war in E224- und E226-Kulturen nachweisbar und resultierte wahrscheinlich in einer erhöhten Akkumulation der rekombinanten Proteine in den Zellen. Mehr Zellen in den erhaltenen Proben resultierten daher in einer erhöhten Gelonin-Expression in der Kultur. Diese Daten zeigen, dass ein intaktes AraE Transportsystem für eine geringe Induktion eines rekombinanten Proteins ausgehend von einem Plasmid in moderater Kopienzahl durch 0,01% Arabinose innerhalb von 4 Stunden erforderlich ist, während die Expression nach 18 Stunden sowohl in araE^– und araE⁺ Stämmen identisch ist. Diese Daten zeigen weiterhin, dass unter allen getesteten experimentellen Bedingungen AraF-defiziente Zellen das rekombinante Proteinprodukt in ähnlicher Weise induzieren wie der Wildtyp-Stamm.
Die gleichen Proben, die mittels SDS-PAGE überprüft wurden, wurden ebenfalls mit Hilfe eines ELISAs analysiert. Vor Zugabe der induzierten Proben wurden Wells mit einem Kaninchen-Antikörper gegen Gelonin beschichtet. Das in jedem Well gebundene Gelonin wurde mit einem biotinylierten Kaninchen-Antikörper gegen Gelonin detektiert, und das Biotin in jedem Well wurde mit einem Streptavidin/Meerrettichperoxidase-Konjugat detektiert. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse dieses ersten ELISA-Assays. Tabelle 2. Mittels ELISA bestimmtes Gelonin nach 4 Stunden Induktion (ng/ml)

Arabinose-Konzentration

Stamm 0,01% 0,1% 1,0%

W3110 44,7 101 165

E220 42 81 124

E224 3,6 254 121

E226 2,6 141 219
E220 und W3310 sprechen in ähnlicher Weise auf die Arabinose-Induktion an, während die araE201- und araE201 ΔaraFGH-Stämme E224 bzw. E226 bei 0,01% Arabinose sehr viel weniger Gelonin produzieren, bei 0,1% und 1,0% Arabinose jedoch annähernd so viel oder mehr Gelonin. Die ELISA-Daten zeigen ferner, dass der araF^–-Stamm E220 etwas weniger rekombinantes Protein produziert als W3110.
In einem gesonderten Experiment wurden E. coli E220 und E226 in Bezug auf den zeitlichen Verlauf der Expression von Gelonin nach Induktion mit 0,01% und 1,0% Arabinose untersucht. Nach Induktion mit einer Arabinose-Konzentration von 0,1% oder 1,0% wurden Proben nach 1,25, 3 und 4,5 Stunden nach Induktion entfernt, und die Menge an Gelonin im zellfreien Kulturüberstand wurde mittels ELISA analysiert. Die Daten dieses Experiments sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3. Mittels ELISA bestimmtes Gelonin nach Induktion mit Arabinose (ng/ml)

Zeit nach der Induktion 0,01% Arabinose 1,0% Arabinose

E220 E226 E220 E226

1,25 Stunden < 1,05^† < 1,05^† 2,6 4,8

3,0 Stunden 8,6 1,4 35,6 131

4,5 Stunden 9,5 2,1 126 156

^†Das Detektionslimit dieses Assays lag bei 1,05 ng/ml.

Diese Daten zeigen weiter, dass bei einer geringen Arabinose-Konzentration (0,01%) E226 weniger induzierbar ist als E220. Nach Induktion bei einer höheren Arabinose-Konzentration akkumuliert E226 jedoch mehr Produkt als E220. Diese Daten zeigen weiterhin, dass E226 Gelonin schneller akkumuliert als E220. Die in Tabelle 3 beschriebenen Proben wurden ebenfalls mit Hilfe von Western-Blotting analysiert. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Menge an Gelonin in jeder Spur wurde mit einem Kaninchen-Antikörper gegen Gelonin, gefolgt von einem Ziege/anti-Kaninchen Peroxidase-Konjugat detektiert. Bei 0,01% Arabinose bestätigten die Western-Daten die ELISA-Daten und zeigten, dass durch Arabinose in E226 keine oder nur eine sehr geringe Induktion von Gelonin erfolgte. Bei einer Induktion mit 1,0% Arabinose trat nach 3 und 4,5 Stunden im Stamm E226 mehr Produkt auf als in E220, und selbst in der 1,0% Arabinose-Probe nach 1,25 Stunden war eine geringe Menge Gelonin detektierbar.
Beispiel 3
Analyse des Zellwachstums und der Gelonin-Expression in E104, E221, E225 und E227 nach Arabinose-Induktion

Vier Δ(araBD)768 bakterielle Zelllinien (E104, E221, E225 und E227), die jeweils pING3825 enthielten, wurden in TYE-Medium bis zu einer OD von etwa 0,4 angezogen und in 2,15 ml Aliquots mit 0, 0,1, 1 und 10 mM Arabinose induziert (10 mM 0,15%; 1 mM 0,015%; 0,1 mM 0,0015%). Vier Stunden nach der Induktion wurde die OD₆₀₀ einer 1:5-Verdünnung einer jeden Kultur bestimmt. Anschließend wurde die Kultur zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und der filtrierte Überstand wurde bei –20°C für die weitere Analyse mittels ELISA aufbewahrt. In ähnlicher Weise wurde 17 Stunden nach der Induktion die OD₆₀₀ einer 1:10-Verdünnung einer jeden Kultur bestimmt. Im Anschluss wurde die Kultur zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und der filtrierte Überstand wurde bei –20°C für die weitere Analyse mittels ELISA aufbewahrt. Tabelle 4 veranschaulicht für jede Probe die OD₆₀₀-Werte der Kulturen. Tabelle 4. Optische Dichte von mit Arabinose induzierten E104-, E221-, E225- und E227-Kulturen

Stamm	mM Arabinose	OD (4 Stunden)	OD (17 Stunden)
E104	0	1,795	ND
	0,1	1,565	3,27
	1,0	0,745	0,91
	10	0,825	0,74
E221	0	1,815	ND
	0,1	1,975	3,32
	1,0	0,815	1,23
	10	0,665	0,93
E225	0	2,19	ND
	0,1	1,78	4,34
	1,0	1,55	2,3
	10	0,905	1,04
E227	0	2,12	ND
	0,1	1,89	3,56
	1,0	1,615	3,26
	10	1,025	1,25

ND = nicht bestimmt

Jede Probe wurde mittels ELISA analysiert, um die Menge an Gelonin zu bestimmen, die nach Induktion mit Arabinose im Kulturüberstand akkumuliert wurde. Die Ergebnisse dieser ELISA-Analyse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5. Mittels ELISA bestimmtes Gelonin nach Induktion mit Arabinose (ng/ml)

Stamm	mM Arabinose	Gelonin ng/ml
Stamm	mM Arabinose	4 Stunden	17 Stunden
E104	0	0,019	ND
	0,1	0,67	1,1
	1,0	44,5	115,8
	10	30,2	111,6
E221	0	0,014	ND
	0,1	0,022	0,266
	1,0	26,2	103,6
	10	20,6	77
E225	0	0,016	ND
	0,1	0,067	2,45
	1,0	8,2	122
	10	29,4	101,6
E227	0	0,011	ND
	0,1	0,015	0,131
	1,0	7,0	85
	10	34	103,8

ND = nicht bestimmt

Die Daten in den Tabellen 4 und 5 zeigen, dass die Arabinose-Transport-defizienten Stämme nach Induktion mit Arabinose in ihrem Wachstum weniger gehemmt werden als E104, aber bei 10 mM Arabinose sowohl nach 4 als auch nach 17 Stunden zu einer Gelonin-Expression in nahezu dem selben oder einem größeren Ausmaß als E104 im Stande sind. Da die passive Diffusion von Arabinose in die Wirtszellen der einzig verbliebene Mechanismus für die intrazelluläre Akkumulation von Arabinose in E227 ist, ist dieser Stamm bei geringen Arabinose-Konzentrationen anscheinend in seinem Wachstum weniger gehemmt als E104 und erzeugt bei geringen Arabinose-Konzentrationen weniger Gelonin. Die phänotypischen Effekte der AraFGH-Deletion und der AraE-Mutation sind in dieser Reihe induzierter bakterieller Wirtszellen unabhängig voneinander ersichtlich. E225 (araE201) produziert bei 0,1 mM Arabinose sowohl nach 4 als auch nach 18 Stunden mehr Gelonin als E221 oder E227 (beide sind ΔaraFGH), wodurch gezeigt wird, dass das AraFGH-Transportsystem bei sehr geringen Arabinose-Konzentrationen am besten anspricht. In ähnlicher Weise erzeugen E225 und E227 bei 1,0 mM Arabinose nach 4 Stunden weniger Gelonin, wodurch die Bedeutung des AraE-Transportsystems bei diesen höheren Arabinose-Konzentrationen gezeigt wird. Zusätzlich erscheint es, dass die Effekte der Arabinose-Transport-Defizienz in Bezug auf die AraFGH- und AraE-Transporter additiv sind. Die Doppelmutante ist bei hohen Arabinose-Konzentrationen weniger in ihrem Zellwachstum gehemmt als jede der Einzelmutanten, obwohl die AraE^–- und AraEFGH^–-Stämme bei 1–10 mM Arabinose etwa gleiche Mengen an Gelonin produzieren. Bei einer geringen Arabinose-Konzentration (0,1 mM) produziert die Doppelmutante jedoch nur etwas weniger Gelonin als die araF Einzelmutante. Alle Stämme zeigen eine ähnliche, vollständige und schnelle Induktion bei 10 mM Arabinose, wobei vermutlich das Transportsystem für die Akkumulation intrazellulärer Arabinose nicht essentiell ist. Bei den geringeren Arabinose-Konzentrationen im Medium treten jedoch zwischen dem Wildtyp und den Mutanten-Stämmen Unterschiede auf. Die AraE-Stämme werden nach 4 Stunden nicht so vollständig induziert wie der Wildtyp oder die AraFGH-Stämme.
Die Daten in den Beispielen zeigen, dass Arabinose-Transport-defiziente Stämme, die Vektoren enthalten, welche rekombinante Proteinprodukte kodieren, insbesondere als Wirte für die Expression rekombinanter Proteinprodukte unter der induzierbaren Kontrolle des araB Promotors verwendbar sind. Eine geringere Hemmung des bakteriellen Zellwachstums (z. B. höhere Zellzahlen), eine höhere Expression des rekombinanten Proteinprodukts und eine direkte regulierbare Expression des rekombinanten Proteinprodukts einschließlich einer synchronen Induktion der Expression durch Arabinose sind verschiedene Aspekte und überraschende Vorteile der vorliegenden Erfindung. Es wird erwartet, dass während des Wachstums Transport-defizienter Wirtszellen, die einen rekombinanten Expressionsvektor enthalten, in einem Fermenter die Bolus-Zugabe eines Induktors, wie zum Beispiel Arabinose, um die Kultur zu induzieren, das Zellwachstum weniger hemmt als in einer ansonsten äquivalenten oder vergleichbaren Kultur Transport-kompetenter Wirtszellen. Demzufolge ist bei Verwendung der Verfahren und bakteriellen Wirtszellen der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Produktion rekombinanter Proteinprodukte einschließlich höherer Erträge an Zellen und/oder Produkt zu erwarten.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteinprodukts unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wobei der induzierbare Promotor der araB Promotor ist, umfassend: (a) das Einbringen eines Expressionsvektors, der für ein rekombinantes Proteinprodukt unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors kodiert, in eine bakterielle Wirtszelle, die in einem System für den aktiven Transport eines Arabinose-Induktors des Promotors in die Wirtszelle genetisch defizient ist, wobei das System ein Arabinose-Transportsystem mit niedriger Affinität ist, welches durch ein araE Gen kodiert wird, oder das System ein Arabinose-Transportsystem mit hoher Affinität ist, welches durch ein araFGH Gen kodiert wird; und (b) das Induzieren der Expression des Produkts mit dem Induktor.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteinprodukts unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wobei der induzierbare Promotor der araB Promotor ist, umfassend: (a) das Kultivieren einer bakteriellen Wirtszelle, die in einem System für den aktiven Transport eines Arabinose-Induktors des induzierbaren Promotors in die Wirtszelle genetisch defizient ist, wobei das System ein Arabinose-Transportsystem mit niedriger Affinität ist, welches durch ein araE Gen kodiert wird, oder das System ein Arabinose-Transportsystem mit hoher Affinität ist, welches durch ein araFGH Gen kodiert wird, und wobei die Wirtszelle einen Expressionsvektor enthält, der für ein rekombinantes Proteinprodukt unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors kodiert; und (b) das Induzieren der Expression des Produkts mit dem Induktor.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei sich das rekombinante Proteinprodukt im Periplasma oder Zytoplasma der bakteriellen Wirtszelle akkumuliert oder in das Kulturmedium sekretiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Expression des rekombinanten Proteinprodukts proportional zur Induktorkonzentration im Kulturmedium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Induktor L-Arabinose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Wirtszelle nicht auf Arabinose wachsen kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Konzentration von Arabinose 0,00001% bis 10% (v/v) beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Wirtszelle E. coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Wirtszelle in dem Arabinose-Transportsystem mit niedriger Affinität, welches durch das araE Gen kodiert wird, defizient ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Wirtszelle in dem Arabinose-Transportsystem mit hoher Affinität, welches durch die araFGH Gene kodiert wird, defizient ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Wirtszelle sowohl in dem Arabinose-Transportsystem mit hoher Affinität, welches durch die araFGH Gene kodiert wird, als auch in dem Arabinose-Transportsystem mit niedriger Affinität, welches durch das araE Gen kodiert wird, defizient ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Transportsystem aus E. coli oder der Enterobacteriaceae-Familie, einschließlich Salmonella-, Pseudomonas-, Proteus- und Enterobacter-Arten ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, ferner umfassend einen Schritt der Gewinnung des Produkts aus den induzierten Wirtszellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das rekombinante Proteinprodukt ein aus Tieren oder Pflanzen stammendes Proteinprodukt, ein Säugetier-Proteinprodukt, oder ein menschliches Proteinprodukt ist, welches kein Reporter- oder Markergenprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das rekombinante Proteinprodukt ein therapeutisches, prophylaktisches oder diagnostisches Agens ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das rekombinante Proteinprodukt Gelonin ist.
Bakterielle Wirtszelle, die in einem aktiven Transportsystem für einen Arabinose-Induktor eines induzierbaren Promotors defizient ist, wobei der induzierbare Promotor der araB Promotor ist, und wobei das System ein Arabinose-Transportsystem mit niedriger Affinität ist, welches durch ein araE Gen kodiert wird, oder das System ein Arabinose-Transportsystem mit hoher Affinität ist, welches durch ein araFGH Gen kodiert wird, wobei die Wirtszelle einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, der für ein rekombinantes Proteinprodukt unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors kodiert.
Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei der Induktor L-Arabinose ist.
Wirtszelle nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Wirtszelle nicht auf Arabinose wachsen kann.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Wirtszelle E. coli ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Wirtszelle in dem Arabinose-System mit niedriger Affinität, welches durch das araE Gen kodiert wird, defizient ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Wirtszelle in dem Arabinose-Transportsystem mit hoher Affinität, welches durch die araFGH Gene kodiert wird, defizient ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Wirtszelle sowohl im Arabinose-Transportsystem mit hoher Affinität, welches durch die araFGH Gene kodiert wird, als auch im Arabinose-Transportsystem mit niedriger Affinität, welches durch das araE Gen kodiert wird, defizient ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei das Transportsystem aus E. coli oder der Familie der Enterobacteriaceae, einschließlich von Salmonella-, Pseudomonas-, Proteus- und Enterobacter-Arten ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei das rekombinante Proteinprodukt ein aus Tieren oder Pflanzen stammendes Proteinprodukt, ein Saugetier-Proteinprodukt oder ein menschliches Proteinprodukt ist, welches kein Reporter- oder Markergenprodukt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 25, wobei das rekombinante Proteinprodukt ein therapeutisches, prophylaktisches oder diagnostisches Agens ist.
Wirtszelle nach Anspruch 25, wobei das rekombinante Proteinprodukt Gelonin ist.