DE69736210T2

DE69736210T2 - Fermentationsverfahren unter Verwendung von markierten mikrobiellen Wirtszellen

Info

Publication number: DE69736210T2
Application number: DE69736210T
Authority: DE
Inventors: Nancy C. Hillsborough McFarland; James R. Menlo Park SWARTZ
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2017-10-11
Also published as: DK1398385T3; WO1998018955A1; AU5001997A; IL184248A0; DE69727160D1; EP1398385A1; ES2214614T3; CA2267655A1; DK1021556T5; AU716496B2; NZ335026A; PT1021556E; US5962252A; ZA979496B; DE69736210D1; EP1746166A1; EP1021556A1; IL129357A; CA2267655C; EP1021556B9

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren, das genetisch markierte Produktionswirtszellstämme einbindet, die üblicherweise das Ausgangsmaterial zur Herstellung rekombinant produzierter Proteine in einer Mehrprodukt-Fermentationsanlage darstellen.
Hintergrund der Erfindung
Das Potenzial für genetische Marker zur Hefestammidentifikation wurde bereits erkannt, und absichtlich markierte önologische Stämme wurden von Vezinhet & Läcroix, Bull. O.I.V., 643–644 (1984), entwickelt. Petering et al., Am. J. Enol. Vitic. 42, 6 (1991), offenbaren ein Verfahren, das DNA-Rekombinationstechnologie verwendet, um das E.-coli-β-Glucuronidase- (GUS-) Gen als Marker in jeglichen erwünschten Hefestamm einzuführen. Die Herstellung neuer Stämme von Mikroorganismen, die auf Mikroorganismen anwendbar sind, in denen die Fortpflanzung normalerweise ungeschlechtlich erfolgt, wird im US-Patent Nr. 2.820.742 beschrieben. Die Rolle von Luciferase wurde zusammen mit ihren Verwendungen in Lumineszenztests und als Markergen von Ugarova et al., Biokhimiva 58, 1351–1372 (1993), erläutert. Das Luciferasegen kann in verunreinigende Bakterien unter Verwendung von Bakteriophagen insertiert werden, und Luciferasegene können als Marker in DNA-Rekombinationsstudien eingesetzt werden, um auf Promotor- und andere Aktivität zu testen. Prosser et al., Critical Reviews in Biotechnology 16, 157–183 (1996), offenbaren die Entwicklung von Verfahren zum Nachweisen und Nachverfolgen von Mikroorganismen in natürlicher Umgebung sowie die Entwicklung molekularer Markersysteme für solche Studien. Auf dem Gebiet der Önologie besteht das Problem, einen Stamm von unzähligen verschiedenen, möglicherweise verunreinigenden Stämmen zu unterscheiden. Zwei Ansätze können hierbei verwendet werden: die Verwendung einer erworbenen Eigenschaft und die genetische Implantation einer unterscheidenden und leicht zu lokalisierenden Eigenschaft. Der erste Ansatz ist auf dem Gebiet der Weinerzeugung kaum geeignet. Das im oben genannten Dokument beschriebene geneti sche Markieren besteht in der Erzielung von Antibiotikaresistenz (Chloramphenicol und Oligomycin) des Stammes. Der genetische Hinweis auf diese Resistenz liegt im Mitochondriengenom der Zelle. Die Markierung weist die folgenden Eigenschaften auf: Die erworbenen Charakteristika werden leicht erkannt (Wachstum auf spezifischem Medium), und es gibt keine selektiven Nachteil bei natürlicher Konkurrenz um den markierten Stamm.
Das Aufkommen der Biotechnologie führte zur klinischen Verwendung und darauf folgenden Zulassung (alleine in den USA) von mehr als zehn rekombinant produzierten Proteinen, umfassend γ-Interferon, β-Interferon, α-Interferon, Insulin, Faktor VIII, Gewebeplasminogenaktivator, menschliches Wachstumshormon, Koloniewachstum stimulierenden Faktor, Erythropoietin und DNase. Darüber hinaus werden zur Zeit zahlreiche Arzneimittel entwickelt oder befinden sich bereits in der klinischen Testphase, um in weiterer Folge zugelassen zu werden. Die Kapazität ist durch die vorhandenen Fermentationsanlagen limitiert, sodass ein und derselbe Fermentor zur Herstellung verschiedener Produkte verwendet werden muss. Ein Beispiel hierfür ist die Herstellung verschiedener Antikörper im selben Fermentor. In ähnlicher Weise kann ein benachbarter Fermentor gleichzeitig ein anderes Produkt produzieren. Messungen, die verwendet werden, um die Kreuzkontamination lizenzierter biologischer Produkte zu vermeiden, die in einer Mehrzweckanlage hergestellt werden, und Regulationsgewebe, die eingebunden sind, wenn Vorrichtungen zur Herstellung von mehr als einem Produkt verwendet werden, werden von Bader et al., "Multiuse Manufacturing Facilities for Biologicals", BioPharm. 5, 32–40 (September 1992), beschrieben.
Es gibt einen eindeutigen Bedarf an der Entwicklung der Fähigkeit nachzuweisen, wann immer Organismen, die unterschiedliche Produkte produzieren, die gewünschte Produktionskultur verunreinigt haben. In einer Mehrproduktanlage könnte die Verunreinigung jeder beliebige von sehr ähnlichen Organismen sein. Der Test muss einfach durchzuführen sein und muss jegliche mögliche Verunreinigung genau detektieren.
Die internationale Patentanmeldung WO 94/12630 beschreibt ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids von Interesse mittels Fermentation von Bakterienwirtszellen, die Nucleinsäure umfassen, die für das Polypeptid kodiert, wobei dieses Verfahren das Durchführen der Fermentation unter Verwendung von Bakterienwirtszellen umfasst, die eine deaktivierte Elektronentransportkette aufweisen. Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine bestimmte Bakterienzellkultur eine Neigung zu Gelöstsauerstoffinstabilität aufweist, wenn sie im großen Maßstab fermentiert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion mehrerer Polypeptidprodukte aus Mikrobenwirtszellstämmen, die mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwerten, in einem einzigen Kulturgefäß bereit, worin die Mikrobenwirtszellstämme Bakterien-, Hefe- oder Pilzwirtszellstämme sind, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) das Kultivieren eines ersten Wirtszellstamms, der Nucleinsäure umfasst, die für ein erstes Polypeptidprodukt kodiert, das gerade erzeugt wird, und der genetisch so markiert ist, dass ihm die native Fähigkeit fehlt, eine erste Kohlenhydratquelle als Substrat zu verwerten, in einem Gefäß;
(b) das Ausplattieren einer isolierten Kulturprobe aus Schritt (a) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle, die vom Wirtszellstamm nicht als Substrat verwertet wird, und mit keinen anderen Kohlenhydratquellen ergänzt ist;
(c) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und über eine Zeitspanne hinweg, die ausreicht, damit jegliche positive Kolonie auf ein detektierbares Ausmaß anwachsen kann;
(d) das Detektieren, ob Kolonien auf dem ergänzten Kulturmedium wachsen;
(e) das Entfernen des Inhalts des Kulturgefäßes und das Säubern und Sterilisieren des Gefäßes, nachdem das Kultivieren des ersten Mikrobenwirtszellstamms abgeschlossen ist;
(f) das Kultivieren eines zweiten Mikrobenwirtszellstamms, der Nucleinsäure umfasst, die für ein zweites Polypeptidprodukt kodiert, das gerade erzeugt wird, und der genetisch so markiert ist, dass ihm die native Fähigkeit fehlt, eine zweite Kohlenhydratquelle als Substrat zu verwerfen, worin der Stamm die erste Kohlenhydratquelle als Substrat verwerten kann, im Gefäß;
(g) das Ausplattieren einer isolierten Kulturprobe aus Schritt (f) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle, die vom zweiten Wirtszellstamm nicht als Substrat verwertet wird, und mit keinen anderen Kohlenhydratquellen ergänzt ist;
(h) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und über eine Zeitspanne hinweg, die ausreicht, damit jegliche positive Kolonie auf ein detektierbares Ausmaß anwachsen kann; und
(i) das detektieren, ob Kolonien auf dem ergänzten Kulturmedium wachsen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
Wie hierin verwendet, sind "verunreinigende" Zellen und "Verunreinigungen" jene Materialien, deren Gegenwart in einer bestimmten Kultur von Interesse unerwünscht ist.
Für die vorliegenden Zwecke ist ein "Kulturgefäß" ein Gefäß, das verwendet wird, um den Mikrobenwirtszellstamm oder die Mikrobenwirtszellstämme zu kultivieren. Dies umfasst Schüttelkolben sowie Fermentoren, wie z.B. jene, die für die großtechnische Produktion von Polypeptiden konzipiert sind.
Der Fermentor weist geeigneterweise eine beliebige Größe auf und umfasst Tanks mit einem Fassungsvermögen von 1 l, 10 l, 1.000 l, 10.000 l und 100.000 l.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Polypeptid" oder "Polypeptid von Interesse" im Allgemeinen auf Peptide und Proteine aus mehr als etwa zehn Aminosäuren. Vorzugsweise sind die Polypeptide "exogen", was bedeutet, dass sie "heterolog" sind, d.h. für die verwendete Wirtszelle fremd, wie z.B. ein menschliches Protein, das von E. coli produziert wird.
Beispiele für Säugetier-Polypeptide umfassen Moleküle wie etwa Renin, ein Wachstumshormon, einschließlich menschlichen Wachstumshormons; bovines Wachstumshormon; Wachstumshormon freisetzenden Faktor, Parathormon, die Schilddrüse stimulierendes Hormon; Lipoproteine; α-1-Antitrypsin, Insulin-A-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; Thrombopoietin; Follikel-stimulierendes Hormon; Calcitonin; Luteinisierungshormon; Glucagon; Blutgerinnungsfaktoren, wie z.B. Faktor VIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von-Willebrand-Faktor; Antikoagulationsfaktoren, wie z.B. Protein C, ANP; Lungentensid; einen Plasminogenaktivator, wie z.B. Urokinase oder Plasminogenaktivator aus menschlichem Urin oder Gewebeplasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Thrombin; blutbildenden Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor-α und -β; Enkephalinase; ein Serumalbumin, wie z.B. menschliches Serumalbumin; Müllersche Inhibierungssubstanz, Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; ein mikrobielles Protein, wie z.B. β-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; einen neurotrophen Faktor, wie z.B. aus dem Gehirn stammenden, neurotrophen Faktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6), oder einen Nervenwachstumsfaktor wie z.B. NGF-β; Cardiotrophine (HerzhypertrophieFaktor), wie z.B. Cardiotrophin-1 (CT-1); aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF); Fibroblasten-Wachstumsfaktor wie z.B. aFGF und bFGF; Epidermiswachstumsfaktor (EGF); von transformierten Zellen gebildeten Wachstumsfaktor (TGF) wie z.B. TGF-α und TGF-β, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I und IGF-II); des(1-3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I), Bindungsproteine für insulinähnlichen Wachstumsfaktor; CD-Proteine wie CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein knochenmorphogenetisches Protein (BMP); ein Interferon wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; Koloniewachstum stimulierenden Faktor (CSFs), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z.B. IL-1 bis IL-10; Anti-HER-2-Antikörper; Superoxid-Dismutase; T-Zellrezeptoren; Oberflächenmembranproteine; Zerfallsbeschleunigungsfaktor; virales Antigen, wie z.B. einen Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Addressine; Regulationsproteine; Antikörper; und Fragmente jeglicher der oben genannten Polypeptide.
Die bevorzugten exogenen Polypeptide von Interesse sind Säugetier-Polypeptide. Beispiele für solche Säugetier-Polypeptide umfassen Enzyme, Hormone, Cytokine, Chemokine, Immunotoxine, Viruskomponenten, Antikörper, Neurotrophine und Antigene. Geeignete Proteine von diesen umfassen menschliche Polypeptide wie z.B. t-PA, gp120, Anti-CD11a, Anti-CD18, Anti-VEGF, VEGF, TGF-β, Activin, Inhibin, Anti-HER-2, DNase, IGF-I, IGF-II, Gehirn-IGF-I, Wachstumshormon, Relaxinketten, Wachstumshormon freisetzenden Faktor, Insulinketten oder Pro-Insulin, NGF, NT-3, BDNF und Urokinase. Besonders bevorzugte Säugetier-Polypeptide umfassen z.B. t-PA, gp120(IIIb), Anti-HER-2, Anti-CD11a, Anti-CD18, Anti-VEGF, VEGF, DNase, IGF-I, IGF-II, TGF-β, IGFBP-3, IGFBP-2, IGFBP-1, Wachstumshormon, NGF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6. Das Polypeptid ist noch bevorzugter IGF, am meisten bevorzugt IGF-I.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "IGF-I" auf insulinähnlichen Wachstumsfaktor aus jeder beliebigen Spezies, einschließlich bovinen, ovinen, porcinen, equinen und vorzugsweise menschlichen Faktors, in Form der nativen Sequenz oder einer Variante oder auch rekombinant produziert. In einem bevorzugten Verfahren wird der IGF-I kloniert und seine DNA in Bakterien exprimiert, z.B. durch das in der EP-A-128.733, veröffentlicht am 19. Dezember 1984, beschriebene Verfahren.
Wie hierin verwendet, bedeutet "genetisch markiert", dass das betreffende Element einen oder mehrere genetische Marker oder auch chromosomale Marker aufweist, die den Stamm, in dem der/die Marker vorhanden ist/sind, dazu bringen, eine Kohlenhydratquelle nicht als Substrat zu verwerten.
Die Bezeichnung "Kohlenhydratquelle" bezieht sich auf jegliche Quelle eines Kohlenhydrats, einschließlich beispielsweise Ribose, Xylose, Mannose, Glucose, Saccharose, Fucose, Fructose, Lactose und Rhamnose. Vorzugsweise ist die Kohlenhydratquelle hierin keine, die in Verbindung mit der Induktion eines Promotors zur Produktion des Wirtszellstamms verwendet wird, wie z.B. Lactose oder Arabinose. Am meisten bevorzugt ist die Kohlenhydratquelle Maltose, Ribose, Fucose oder Rhamnose.
"Kohlenhydratverwertungs-Revertanten oder -Suppressoren" sind definiert als jene mutierten Stämme, die zu ihrem nichtmutierten Zustand zurückgekehrt sind oder eine Suppressormutation an einer anderen Stelle erworben haben, typischerweise durch spontane Modifikation des Wirtsorganismus. Bei revertierenden Genotypen umfasst das Gen, das im Stamm mutiert wird, einen Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselweg, der die Fähigkeit besitzt, das Gen in seine Wildtypform zurückzuführen. Eine "nichtrevertierende" Veränderung ist eine genetische Veränderung, die den Stamm nicht dazu bringt, in seinen nichtmutierten Zustand zurückzukehren. Eine "nichtsupprimierende" Veränderung ist eine, in der der Organismus keine Suppressormutation an einer anderen Stelle erfordert.
"Mikrobenwirtszellstämme, die mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwerten", sind jene Mikroorganismen, die die normale, oder native, Fähigkeit besitzen, zwei oder mehr Kohlenhydrate als Substrate zu verwerten, wie z.B. die meisten Bakterien und zumindest manche Pilz- und Hefearten, einschließlich, jedoch ohne eine Einschränkung darzustellen, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces und Pichia, noch bevorzugter A. awamori, S. cerevisiae, S. dairensis, Schizosaccharomyces pombe, K. marxianus, K. thermotolerans, C. albicans, C. anatomiae und P. pastoris.
Eine Kultur-"Probe" ist ein geringer Anteil der Zellkultur, der herangezogen wird, um den Test der vorliegenden Erfindung durchzuführen.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die für Mikroorganismen geeigneten Kontrollsequenzen umfassen einen Promotor, wie z.B. den alkalische-Phosphatase-Promotor für Bakterien, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosomenbindungsstelle.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt ist. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Existieren solche Stellen nicht, so werden synthetische Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Wie hierin verwendet werden die Bezeichnungen "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" synonym verwendet, und alle diese Bezeichnungen beziehen Nachkommenschaft mit ein. Somit umfassen die Termini "Transformanten" und "transformierte Zellen" die primär bearbeitete Zelle und die davon abgeleiteten Kulturen, ohne Berücksichtigung der Anzahl der Transfers. Es gilt auch zu verstehen, dass die gesamte Nachkommenschaft aufgrund von beabsichtigen oder unbeabsichtigten Mutationen nicht genau identisch bezüglich DNA-Gehalt sein kann. Mutierte Nachkommenschaft, die gewisse Funktionen oder biologische Aktivität, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurden, aufweisen, sind eingeschlossen. Sind spezifische Bezeichnungen beabsichtigt, so geht dies aus dem Zusammenhang hervor.
Das Verfahren der „Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" wie hierin verwendet bezieht sich allgemein auf ein Verfahren, in dem geringe Mengen eines spezifischen Teils einer Nucleinsäure, RNA und/oder DNA amplifiziert werden, wie im US-Patent Nr. 4.683.195, ausgegeben am 28. Juli 1987, beschrieben wird. Im Allgemeinen muss Sequenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus verfügbar sein, sodass Oligonucleotidprimer entworfen werden können; diese Primer weisen eine identische oder ähnliche Sequenz wie die gegenüberliegenden Stränge der zu amplifizierenden Matrize auf. Die 5'-terminalen Nucleotide der zwei Primer können mit den Enden des amplifizierten Materials zusammenfallen. PCR kann eingesetzt werden, um spezifische RNA-Sequenzen, spezifische DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA und cDNA, die aus zellulärer Gesamt-RNA transkribiert ist, Bakteriophagen oder Plasmidsequenzen und dergleichen zu amplifizieren. Für allgemeine Informationen siehe Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987); Erlich et al., PCR Technology, Stockton Press, NY (1989). Einen aktuelleren Bericht zu Fortschritten auf dem Gebiet der PCR liefern Erlich et al., Science 252, 1643–1650 (1991).
Wie hierin verwendet wird PCR als ein, jedoch nicht als das einzige Beispiel für eine Nucleinsäure-Polymerasereaktionsverfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure-Testprobe betrachtet, das die Verwendung einer bekannten Nucleinsäure als Primer und einer Nucleinsäurepolymerase zur Amplifikation oder Bildung eines spezifischen Teils von Nucleinsäure umfasst.
"Minimales Medium" bezieht sich auf Kulturmedium, das für Platten konzipiert ist und die minimale Menge an Mediumbestandteilen enthält, die für das Wachstum von Zellkolonien erforderlich sind. Typischerweise ist solch ein Medium minimales Agarmedium. Ein Beispiel hierfür ist Medium, das pro Liter etwa 0,1–0,2 g MgSO₄-Heptahydrat, etwa 15 g Bacto-Agar, etwa 10 mM NH₄Cl, etwa 10–12 g K₂HPO₄, etwa 4–5 g KH₂PO₄ und etwa 0,5 g Natriumcitratdihydrat enthält.
Ausführungsformen der Erfindung
Es werden herkömmliche Fermentationsparameter verwendet, und Polypeptidproduktion wird auf herkömmliche Weise wie beispielsweise unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Während des Verfahrens zur Herstellung des Polypeptids von Interesse ist der/sind die genetische(n) Marker, sofern es sich um eine Mutation oder Veränderung handelt, stumm, da der Mikroorganismus während des Fermentationsprozesses nicht mit dem Kohlenhydrat in Kontakt kommt.
I. Fermentation
A. Insertion von Nucleinsäure in einen replizierbaren Vektor
Die für das Polypeptid von Interesse kodierende Nucleinsäure ist geeigneterweise cDNA oder genomische DNA aus jeder beliebigen Quelle – vorausgesetzt, sie kodiert für das/die Polypeptid(e) von Interesse – und ist im Allgemeinen die native Sequenz.
Die heterologe Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) wird in geeigneter Weise zur Expression im Mikroorganismus unter der Steuerung eines geeigneten Promotors in einen replizierbaren Vektor insertiert. Zahlreiche Vektoren sind zu diesem Zweck verfügbar, und Selektion des geeigneten Vektors hängt hauptsächlich von der Größe der in den Vektor zu insertierenden Nucleinsäure und von der jeweiligen mit dem Vektor zu transformierenden Wirtselle ab. Jeder Vektor enthält je nach der Wirtszelle, mit der er kompatibel ist, verschiedene Komponenten. Je nach Wirtstyp umfassen die Vektorkomponenten im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf eines oder mehrere der folgenden Elemente: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replicon- und Kontrollsequenzen enthalten, die aus Spezies stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbin dung mit Mikrobenwirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die in der Lage sind, für phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen. So wird etwa E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem Plasmid, das von einer E.-coli-Spezies herrührt, transformiert (siehe z.B. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit ein Mittel zur Identifikation transformierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid, oder ein anderes Mikrobenplasmid oder ein anderer Mikrobenphage, enthält im Allgemeinen auch Promotoren, die vom Mikrobenorganismus zur Expression der selektierbaren Markergene verwendet werden können, oder wird so modifiziert, dass es diese enthält.
(i) Signalsequenzkomponente
Die für das Polypeptid von Interesse hierin kodierende DNA kann nicht nur direkt exprimiert werden, sondern auch als Fusion mit einem anderen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid, das eine spezifische Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der Polypeptid-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die heterologe Signalsequenz sollte eine sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird.
Bei prokaryotischen Wirtszellen, die die native Polypeptidsignalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz, die beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ersetzt. Im Fall von Hefesekretion kann die native Signalsequenz durch beispielsweise Hefeinvertase, α-Faktor oder saure Phosphatase-Leader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader (EP-A-362.179, veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal ersetzt werden.
(ii) Replikationsursprungskomponente
Expressionsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien- und Hefearten bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, und der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet.
(iii) Selektionsgenkomponente
Expressionsvektoren enthalten im Allgemeinen ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder Wachstum transformierter Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden, erforderlich ist. Wirtszellen, die nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformiert sind, überleben im Kulturmedium nicht. Dieser selektierbare Marker ist von den genetischen Markern, wie sie in dieser Erfindung verwendet werden und definiert sind, getrennt. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen-Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel, die nicht jene sind, die durch die Gegenwart des/der genetischen Marker(s) verursacht werden, komplementieren oder (c) maßgebliche Nährstoffe, die aus Komplexmedium nicht erhältlich sind, z.B. das Gen, das für D-Alaninracemase für Bacilli kodiert, liefert.
Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. In diesem Fall produzieren jene Zellen, die erfolgreich mit der Nucleinsäure von Interesse transformiert wurden, ein Polypeptid, das Arzneimittelresistenz verleiht, und überleben somit das Selektionsschema. Beispiele für eine solche dominante Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985)). Die drei oben angeführten Beispiele verwenden Bakteriengene unter euka ryotischer Steuerung, um Resistenz gegen das geeignete Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 enthalten ist (Stinchomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellengenom stellt dann eine wirksame Umgebung zur Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. In ähnlicher Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen in sich tragen, komplementiert.
(iv) Promotorkomponente
Der Expressionsvektor zur Produktion des Polypeptids von Interesse enthält einen geeigneten Promotor, der vom Wirtsmikrobenorganismus erkannt wird, und ist operabel an die für das Polypeptid von Interesse kodierende Nucleinsäure gebunden. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), das Arabinose-Promotorsystem (Guzman et al., J. Bacteriol. 174, 7716–7728 (1992)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980)) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Es sind jedoch auch andere bekannte Bakterienpromotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen wurden bereits veröffentlicht, wodurch Fachleuten nun die Möglichkeit gegeben ist, sie unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren zur Bereitstellung jeglicher erforderlichen Restriktionsstellen operabel an DNA zu ligieren, die für das Polypeptid von Interesse kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)).
Promotoren zur Verwendung in Bakteriensystemen enthalten im Allgemeinen auch eine Shine-Dalgamo- (S.D.-) Sequenz, die operabel an die DNA gebunden ist, die für das Polypeptid von Interesse kodiert. Der Promotor kann aus der Bakterienquellen-DNA mittels Restriktionsenzymverdau entfernt und in den die erwünschte DNA enthaltenden Vektor insertiert werden.
Promotorsequenzen sind für Eukaryoten wie Hefe und Pilze bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle, an der Transkription initiiert wird, liegt. Eine andere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf von der Transkriptionsstelle zahlreicher Gene zu finden ist, ist eine CXCAAT-Region, worin X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene liegt eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Hinzufügung des Poly-A-Schwanzes am 3'-Ende der Kodiersequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)) wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil sind, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden von Hitzeman et al. (EP-A-73.657) näher beschrieben.
Hefe-Enhancer werden auch günstigerweise mit Hefepromotoren verwendet. Siehe beispielsweise Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), bezüglich Enhancer-Elemente zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur für das Polypeptid kodierenden Sequenz gespleißt werden, liegt jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
(v) Transkriptionsterminationskomponente
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen einschließlich Hefe und Pilze verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zur Transkriptionstermination und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind im Allgemeinen aus untranslatierten 5'- und gegebenenfalls 3'-Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich.
(vi) Konstruktion und Analyse von Vektoren
Zur Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben genannten Komponenten enthalten, werden Standard-Ligationsverfahren zum Einsatz gebracht. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und neuerlich in der erwünschten Form ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
Bei der Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) oder andere Stämme zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden, sofern geeignet, anhand von Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert. Plasmide werden aus den Transformanten präpariert, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder durch das Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977), oder Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
B. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Geeignete Mikrobenwirtszellen zur Expression der Vektoren hierin sind Prokaryoten, Hefearten und Pilze, vorausgesetzt, sie entsprechen den oben genannten Kriterien zur Kohlenhydratverwertung und sind allgemein wie hierin definiert markiert. Geeignete Prokaryoten umfassen Bakterien wie z.B. Archaebakterien und Eubakterien einschließlich gramnegativer oder grampositiver Organismen. Bevorzugte Bakterien für diesen Zweck sind Eubakterien und noch bevorzugter Enterobacteriaceae. Beispiele für nützliche Bakterien umfassen jene aus den Spezies Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla und Paracoccus, z.B. E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa, S. typhimurium oder Serratia marcescans.
E.-coli-Wirte, die als Ausgangswirte geeignet sind, die es zu markieren gilt, umfassen E. coli W3110 (ATCC 27.235), E. coli 294 (ATCC31.466), E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31.537). Diese Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung. Mutierte Zellen von beliebigen der oben genannten Bakterien können ebenfalls als Ausgangswirte verwendet werden, die anschließend markiert werden. Es ist natürlich erforderlich, die geeigneten Bakterien auszuwählen, wobei die Replizierbarkeit des Replicons in den Zellen eines Bakteriums berücksichtigt werden muss. E.-coli-, Serratia- oder Salmonella-Spezies können beispielsweise in geeigneter Weise als Wirt verwendet werden, wenn gut bekannte Plasmide wie z.B. pBR322, pBR325, pACYC177 oder pKN410 zur Bereitstellung des Replicons verwendet werden.
E.-coli-Stamm W3110 ist ein bevorzugter Wirt zur genetischen Markierung, da er ein üblicher Wirtsstamm für DNA-Rekombinationsprodukt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen sekretie ren. Beispiele für Ausgangs-Bakterienwirte, die es zu markieren gilt, finden sich zusammen mit ihren Genotypen in nachstehender Tabelle:
Ebenfalls geeignet sind die Zwischenprodukte aus der Erzeugung von Stamm 36F8, 27B4 (US-Patent Nr. 5.304472) und 35E7 (ein spontanes, temperaturresistentes Kolonieisolat, das besser als 27B4 wächst) sowie das Zwischenprodukt aus der Herstellung von Stamm 48A4, Stamm 46H9, der in Beispiel III unten beschrieben wird. Ein zusätzlicher geeigneter Stamm ist der E.-coli-Stamm mit der/n mutierten periplasmatischen Protease(n), offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, das am 7. August 1990 ausgegeben wurde.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind hierin eukaryotische Mikroben wie z.B. Fadenpilze oder Hefearten geeignete Wirte, vorausgesetzt, sie entsprechen den Kohlenhydratverwertungskriterien. Saccharomyces cerevisiae, oder gewöhnliche Bäckerhefe, ist der am häufigsten verwendete unter den niedereukaryotischen Wirtsorganismen.
Zahlreiche andere Arten, Spezies und Stämme sind jedoch ebenfalls allgemein erhältlich und hierin nützlich, wie z.B. Saccharomyces dairensis; Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP-A-139.383, veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-A-4.943.529) wie z.B. K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia (EP-A-402.226); Pichia pastoris (EP-A-183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida-Wirte wie z.B. Candida albicans und Candida anatomiae; Trichoderma reesia (EP-A-244.234); Neurospora crassa (Case et al., -Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)).
In einem bevorzugten Aspekt dieser Erfindung wird der genetische Marker durch Verändern des Genotyps des Stamms erzeugt. Diese Veränderung kann nichtrevertierend und/oder nicht-supprimierend, revertierend oder supprimierend oder eine Kombination davon sein. Darüber hinaus wird der Stamm mehrere Male in geeigneter Weise markiert. Die Fähigkeit des Stamms, mehr als einen genetischen Marker aufzuweisen, kann bei der Ermöglichung einer größeren Sammlung an zu verwendenden Wirten von Vorteil sein. Der mehrfach markierte Stamm kann Veränderungen in zwei oder mehr verschiedenen Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselwegen enthalten, wozu beispielsweise Stoffwechselwegenzyme, Transportkomponenten und Regulationskomponenten verwendet werden.
Werden zwei verschiedene Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselwege verwendet, so kann der Stamm mit einer nichtrevertierenden, nichtsupprimierenden Mutation und einer revertierenden oder supprimierenden Mutation markiert werden. Ein Beispiel hierfür wäre, dass die nichtrevertierende Mutation bei Riboseverwertung vorhanden ist und die revertierende Mutation eine Punktmutation bei Rhamnoseverwertung ist, wie z.B. eine Δ(rbs7)-Mutation und eine rhaR-Mutation.
Der Stamm kann auch mit zwei nichtrevertierenden (und nichtsupprimierenden) Kohlenhydratmutationen markiert sein. Eine nichtrevertierende Mutation liegt beispielsweise bei Maltoseverwertung vor, und die andere, nichtrevertierende Mutation ist bei Riboseverwertung vorhanden, wie z.B. eine Δ(malE)-Mutation und eine Δ(rbs7)-Mutation.
Die Gesamtanzahl an unabhängigen markierten Stämmen (TMS), die abgeleitet werden können, ist eine Funktion der Gesamtanzahl an Markern (TM) und der Anzahl an Markern pro Stamm (MPS), wie durch die folgende Gleichung ausgedrückt werden kann: TMS = (TM)!/(MPS)!(TM – MPS)!
Somit beträgt bei zwei Markern pro Stamm die Gesamtanzahl an unabhängigen markierten Stämmen:
Bei drei Markern pro Stamm beträgt die Gesamtanzahl an unabhängigen markierten Stämmen:
Es muss also einen Bedarf an mehr als zehn markierten Stämmen geben, bevor es sich rentiert, drei Marker in jeden Stamm zu insertieren.
Beispiele für markierte Bakterienstämme, die hierin geeignet sind, sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
Unter den oben angegebenen Stämmen sind die bevorzugten Stämme 46D5 und 48A4.
Die für das Polypeptid kodierende Nucleinsäure wird in die Wirtszellen insertiert. Vorzugsweise erfolgt dies durch Transfizieren, sowie vorzugsweise Transformieren, der Wirtszellen mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren und Kultivieren in herkömmlichem Nährstoffmedium auf geeignete Weise, sodass die verschiedenen Promotoren induziert werden.
Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob letztendlich tatsächlich eine Kodiersequenz exprimiert wird. Die Bezeichnung "Transfektion" umfasst Verfahren wie Transformation, Konjugation und Transduktion. Zahlreiche Verfahren zur Transfektion sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation sowie nachstehend beschriebene Transformationsverfahren. Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Hinweis auf das Wirken dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
Transformation bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodass die DNA replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integranten. Je nach verwendeter Wirtszelle erfolgt Transformation unter Anwendung von herkömmlichen Verfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben, wird im Allgemeinen für prokaryotische Zellen oder andere Zellen, die wesentliche Zellwandbarrieren aufweisen, verwendet. Ein anderes Verfahren zur Transformation verwendet Polyethylenglykol/DMSO, wie von Chung & Miller, Nucleic Acids Res. 16, 3580 (1988), beschrieben. Wiederum ein anderes Verfahren umfasst die Verwendung der als Elektroporation bezeichneten Technik. Transformationen zu Hefe erfolgen typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979).
C. Kultivieren der Wirtszellen
Prokaryotische Zellen, die verwendet werden, um das Polypeptid von Interesse zu produzieren, werden in geeigneten Medien kultiviert, wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben wird. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, entsprechen jenen, die bereits vorher im Zusammenhang mit der für Expression selektierten Wirtszelle verwendet wurden, und sind durchschnittlichen Fachleuten sicherlich bekannt.
Wird der alkalische-Phosphatase-Promotor verwendet, so werden Bakterienzellen, die das Polypeptid von Interesse dieser Erfindung produzieren, in geeignetem Medium kultiviert, in dem der alkalische Phosphatase-Promotor teilweise oder gänzlich induziert werden kann, wie allgemein z.B. von Sambrook et al., s.o., beschrieben wird. Das Kultivieren darf nie in Abwesenheit von anorganischem Phosphat oder bei zu geringen Phosphatkonzentrationen stattfinden. Zuerst enthält das Medium anorganisches Phosphat in einer Menge über dem Induktionsniveau der Proteinsynthese, die für das Wachstum des Bakteriums ausreicht. Wenn die Zellen wachsen und Phosphat verwerten, senken sie die Phosphatkonzentration im Medium und verursachen dadurch die Induktion der Synthese des Polypeptids.
Jegliche andere erforderliche Mediumbestandteile neben Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Phosphatquellen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen al leine oder im Gemisch mit anderen Bestandteilen oder Medium, wie z.B. mit einer komplexen Stickstoffquelle, eingebunden werden. Der pH des Mediums kann im Bereich von etwa 5–9 liegen und hängt hauptsächlich vom Wirtsorganismus ab.
Ist der Promotor ein induzierbarer Promotor, so werden für das Eintreten von Induktion die Zellen typischerweise kultiviert, bis eine bestimmte optische Dichte, z.B. eine Asso von etwa 60–80, an einem Punkt, an dem Induktion initiiert wird (z.B. durch Zusatz eines Induktors, durch Verarmung einer Mediumkomponente, usw.), erreicht ist, um Expression des für das Polypeptid von Interesse kodierenden Gens zu induzieren.
D. Detektion von Expression
Genexpression kann in einer Probe beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Sonde basierend auf den Sequenzen des Polypeptids direkt gemessen werden. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P. Es können jedoch auch andere Verfahren verwendet werden, wie z.B. die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als die Bindungsstelle für die Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit zahlreichen verschiedenen Markierungen markiert werden können, wie z.B. mit Radionucliden, Fluoreszenzmitteln, Enzymen und dergleichen. Alternativ dazu können Tests oder Gele zur Detektion von Protein verwendet werden.
Zur Sekretion eines exprimierten Genprodukts wird die Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Sekretion des Genprodukts ausreichen, kultiviert. Solche Bedingungen umfassen beispielsweise Temperatur-, Nährstoff- und Zelldichte-Bedingungen, die die Sekretion durch die Zelle ermöglichen. Darüber hinaus sind solche Bedingungen jene, unter denen die Zelle grundlegende Zellfunktionen wie Transkription, Translation und Passage von Proteinen aus einem Zellkompartiment in ein anderes, wie sie Fachleuten bekannt sind, erfüllen kann.
II. Test
Bei der Anwendung dieses Tests wird eine Probe aus der Mikrobenfermentationskultur gezogen. Ist die Kultur eine Fermentationskultur mit hoher Dichte, so enthält die Probe vorzugsweise etwa 10⁸ bis 10¹⁰ koloniebildende Einheiten (CFU) pro ml Kultur. Typischerweise wird diese Probe am Ende der Fermentation gezogen, sie kann jedoch auch zu jedem anderen Zeitpunkt während des Kultivierens gezogen werden. Die Zellen aus der isolierten Probe werden auf einer oder mehreren Platten ausplattiert, die Kulturmedium, ergänzt mit einer der Kohlenhydratquellen, die vom markierten Wirt nicht verwertet wird, aufweisen. Vorzugsweise werden zwei Platten verwendet, wobei jede mit einer der Kohlenhydratquellen ergänzt ist, die vom markierten Wirt nicht verwertet wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Platten Minimalmediumplatten, und am meisten bevorzugt Minimal-Agarplatten.
Wird ein Fermentor bei hoher Dichte als Kulturgefäß verwendet, so werden, je nach dem Typ der genetischen Markierung am Wirtszellenstamm, die Zellen entweder direkt (vorzugsweise bei etwa 10⁸ bis 10¹¹ CFU/ml Kultur) ausplattiert oder auf eine Konzentration verdünnt, die ausreicht, um die Detektion von Kohlenhydratverwertungs-Revertanten oder -Suppressoren zu vermeiden, und auf die Platte(n) aufgetragen. Werden die Zellen verdünnt, so werden sie vorzugsweise beginnend bei etwa 10⁸ bis 10¹¹ CFU/ml Kultur und endend bei etwa 10⁵ bis 10⁸ CFU/ml Kultur in beispielsweise Kulturmedium oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) reihenverdünnt. Ein Beispiel für eine Situation, in der Verdünnung angebracht ist, ist, wenn die Markermutation eine revertierende Mutation ist oder z.B. durch eine spontane Modifikation des Wirtsorganismus supprimiert werden kann, sodass eine Kohlenhydratverwertungs-Revertante oder ein Kohlenhydratverwertungs-Suppressor erzeugt wird oder daraus resultiert. Die Verdünnung erfolgt in einer Weise, die sicherstellt, dass Reversion oder Suppression der Markermutation die Resultate nicht beeinträchtigt (d.h. falsche Positive ergibt). Eine solche Verdünnung der Probe, dass et wa 10⁶ koloniebildende Einheiten pro ml ausplattiert werden, ergibt einen zufrieden stellenden Empfindlichkeitsgrad mit einem adäquaten Sicherheitsrahmen bezüglich der Entfernung falsch-positiver Resultate. Ein anderer Grund für das Verdünnen der Probe ist einfach das Herabsetzen der Empfindlichkeit des Tests, sofern dies erwünscht ist.
Das Kulturmedium auf den Platten kann individuell oder in Kombination mit Aminosäuren, Spurenelementen, Vitaminen oder Nucleotidbasen in einer Konzentration vermehrt werden, die das Wachstum jeglicher auxotropher Stämme, die es zu detektieren gilt, ermöglicht. Jeglicher Bestandteil, der von einem Bakterium wie E. coli als einzige Kohlenstoffquelle verwertet werden könnte, sollte in einer ausreichend geringen Konzentration zugesetzt werden, sodass er keine Koloniebildung des markierten Stamms ermöglicht.
Anschließend wird/werden die Platte(n) bei einer geeigneten Temperatur über einen ausreichend langen Zeitraum hinweg inkubiert, um für die Detektion, d.h. für zuverlässige und genaue Detektion, ein ausreichendes Wachstum einer positiven Kolonie zu ermöglichen. Die erforderliche Inkubationszeit hängt beispielsweise von der Inkubationstemperatur, dem Typ des Markers und dem Typ des Mikrobenstamms ab. Typischerweise liegt die Temperatur in einem Bereich von etwa 20–40 °C, noch bevorzugter von etwa 30–38 °C, und beträgt insbesondere etwa 37 °C; und die Inkubationszeit liegt im Bereich von etwa 24–120 h, noch bevorzugter etwa 35–90 h, sofern die Temperatur etwa 30–38 °C beträgt, und am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 48–72 h, wenn die Temperatur etwa 37 °C beträgt.
Schließlich wird ein Detektionsschritt eingesetzt, um zu bestimmen, ob irgendwelche Kolonien auf der/den Platte(n) wachsen. Das leicht mittels Sichtprüfung feststellbare Vorliegen von Kolonien weist auf die Gegenwart verunreinigender Mikrobenstämme hin, da diese auf der Kohlenhydratquelle wachsen würden, mit der die Platte(n) ergänzt wurde(n). Im Rahmen der oben festgesetzten Richtlinien bezüglich der CFUs der Probe beim Plattieren liegt die Empfindlichkeit des Tests bei einer Detektion von etwa 1 von 10⁶ bis 1 von 10¹⁰ den Wirt kreuzverunreinigenden Organismen.
Im Zuge eines weiteren Schritts können jegliche nachgewiesene Kolonien als solche identifiziert werden, die vom Mikrobenwirtszellstamm, der kultiviert wurde, oder von einem anderen Stamm abstammen. Ist der erwünschte Wirtsstamm beispielsweise ein E. coli, so könnten diese Organismen weiter als E.-coli- oder Nicht-E.-coli-Verunreinigungen identifiziert werden. Stammen die Kolonien aus einem E.-coli-Wirtsstamm, so kann anhand seiner einzigartigen Kohlenhydratverwertungs-Fähigkeit erkannt werden, von welchem Wirtsstamm sie genau abstammen. So kann also erkannt werden, welches verunreinigende Polypeptid – angenommen, es handelt sich um ein heterologes Polypeptid, – vom erwünschten Produkt getrennt werden muss, da das Polypeptid vom verunreinigenden Stamm produziert wird und daher damit assoziiert ist oder identifiziert wird.
In einem Aspekt dieses Identifikationsverfahrens werden nach dem Detektionsschritt jegliche Kolonien, die auf dem ergänzten Kulturmedium wachsen, aus dem ergänzten Kulturmedium gewonnen oder daraus entfernt und auf Reihenuntersuchungsfeldern für verschiedenartige Kohlenhydratquellen ausplattiert, um jegliche verunreinigende Wirtszellen anhand ihrer spezifischen einzigartigen Kohlenhydratverwertungsmängel zu identifizieren.
Der Test hierin ist besonders in einem Verfahren zur Herstellung von Mehrfach-Polypeptiden in einem einzelnen Kulturgefäß oder in einer einzelnen Vorrichtung nützlich, sodass die restlichen Wirtszellen, die einen Typ von Polypeptid produzieren, eine Wirtszellkultur, die einen anderen Typ von Polypeptid produziert, nicht verunreinigen. Der Test wird wie oben beschrieben bis hin zum Detektionsschritt durchgeführt. Wachsen irgendwelche positive Kolonien auf der/den Platte(n), so würde die den Test durchführende Person anschließend bestimmen, ob die Charge verworfen werden muss oder weiterhin verwendet werden kann. Nachdem der erste Mikrobenwirtszellstamm vollständig kultiviert wurde, wird der Inhalt der Kulturgefäße geleert und das Gefäß wird gereinigt und sterilisiert. Anschließend wird ein zweiter Mikrobenwirtszellstamm in dasselbe oder ein benachbartes Kulturgefäß eingebracht und kultiviert. Dieser zweite Stamm enthält Nucleinsäure, die für ein zweites Polypeptid kodiert und genetisch mit (einem) andere(n) Marker(n) markiert ist, als beim Kultivieren des ersten Stamms. Solche) (ein) Marker bewirkt, dass der Stamm keine andere Kohlenhydratquelle als Substrat verwertet. Dieser zweite Stamm ist in der Lage, die erste Kohlenhydratquelle als Substrat zu verwerten.
Das Verfahren zur Herstellung von mehr als einem Polypeptid im selben Fermentor umfasst ferner die Schritte des Isolierens und Ausplattierens einer Probe der das zweite Polypeptid produzierenden Zellkultur auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle ergänzt ist, die vom zweiten Wirtszellstamm nicht verwertet wird; des Inkubierens der Platte(n) bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreicht, dass jegliche positive Kolonien zu vollständiger Größe anwachsen können; und des Detektierens, ob irgendwelche Kolonien auf der/den Platte(n) wachsen. Diese-Schritte werden alle wie oben beschrieben durchgeführt.
Nachdem das Kulturgefäß entleert, gesäubert und sterilisiert wurde, können die obigen Schritte, beginnend mit dem Kultivierungsschritt, unter Verwendung eines dritten oder eines weiteren Stamms, der eine dritte Kohlenhydratquelle nicht als Substrat verwertet, jedoch in der Lage ist, die erste und zweite Kohlenhydratquelle als Substrat zu verwerten, wobei sich alle Quellen voneinander unterscheiden, unbegrenzt wiederholt werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung bereitgestellt.
III. Beispiele
Konstruktion von Stämmen
Genetisch markierte Stämme wurden durch Einführen einer Deletionsmutation in den Wirt in einem Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselweg konstruiert. Deletionsmutationen wurden (1) durch PCR in vitro konstruiert und im Chromosom rekombiniert oder (2) aus einer äußeren Quelle erhalten und in den E.-coli-Wirt durch P1-Transduktion eingeführt. Die durch PCR konstruierten Gendeletionen wurden unter Ver wendung von Oligonucleotiden, um zwei Enden des Gens zu bilden, wobei etwa 500 bp im inneren Abschnitt des Gens entfernt wurden, geschaffen. Die zwei Enden des Gens wurden über eine Spel-Verbindung miteinander ligiert. Das die Deletion enthaltende Fragment wurde in pS1080 subkloniert. pS1080 wies einen R6K-oriR-Replikationsursprung, die Mehrfachklonierungsstelle und die Zwischengenregion von Bakteriophagen f1, das β-Lactamase-Gen aus PBR322 und das sacB-Gen aus Bacillus subtilis auf. Unter Verwendung von M13-Transduktion und Carbenicillin-Selektion wurde das gesamte Plasmid in das Chromosom eines W3110-Derivats rekombiniert, das unabhängige Replikation des Plasmidvektors nicht unterstützt. Darauf folgende P1-Transduktion wurde verwendet, um das in das Chromosom integrierte Deletionsplasmid unter Verwendung von Carbenicillin-Selektion in andere E.-coli-Wirtshintergründe zu verlagern. Um Plasmid-Resolventen zu erhalten, wurden Saccharoseresistente Derivate bei Raumtemperatur selektiert und dann auf den Verlust von Carbenicillinresistenz gescreent. Für chromosomale DNA aus Saccharose-resistenten, Carbenicillin-empfindlichen Kolonien wurde bestätigt, dass sie die geplante Deletion unter Verwendung von PCR in sich trug. Der Kohlenhydrat-negative Phänotyp wurde ebenfalls auf MacConkey-Agar mit 1 % des erwünschten Zuckers bestätigt.
BEISPIEL I
Stamm, der mit einer einzigen, nichtrevertierenden Kohlenhydratmutation markiert ist
In diesem Beispiel wird ein empfindlicher Test zur Detektion von verunreinigenden Organismen in einer Mehrzweckherstellungsanlage beschrieben. Der Produktionsorganismus wurde mit einer einzigen, nichtrevertierenden Mutation in einem Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselweg markiert. Die Auswirkung der Mutation war in der Rekombinationsprotein-Produktionsphase still; im darauf folgenden Testen konnte jedoch der markierte Organismus durch einen einfachen Kohlenhydratverwertungstest von anderen potenziellen kreuzverunreinigenden E.-coli-Organismen unterschieden werden.
Stamm 37D6, abgeleitet von E. coli K-12 W3110, trägt ein Plasmid in sich, das rekombinantes Protein produziert. Mit dem Genotyp W3110 IN(rrnD-rrnE)1 ΔfhuA phoA ΔE15 Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 (kan^R) ΔompT ilvG2096^R Δ(rbs7) wird 37D6 von Stamm 27C7, der im Patent Nr. 5.288.931 beschrieben wird, mit der American Type Culture Collection Nr. 55.244, abgeleitet. Die Δ(rbs7)-Mutation (Lopilato et al., J. Bacteriol. 158, 665–673 (1984)) wurde durch P1-Cotransduktion eingeführt, sodass dieser Wirt von anderen rekombinanten Wirten durch einen einfachen Kohlenhydratverwertungstest unterschieden werden konnte. Die rbs-Deletion wurde durch P1-Cotransduktion mit einer verbundenen Tn10-Insertion in das ilv-Gen eingeführt. Die Iso-leucin/Valin-Auxotrophie wurde unter Verwendung von P1-Phagen, gezüchtet an einem Stamm, der die ilvG2096^R-Mutation trägt, zu Prototrophie transduziert (Lawther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 922–925 (1981)), wodurch eine Rasterverschiebung behoben wird, die den Wildtyp-E.-coli-K-12-Stamm für Valin empfindlich macht. Der Riboseverwertungsmangel wurde unter Verwendung von minimalem Medium, das Ribose als Kohlenstoffquelle enthielt, als im resultierenden Stamm 37D6 vorhanden bestätigt.
Eine Probe vom Ende einer 10-l-Fermentation (im Wesentlichen wie im US-Patent Nr. 5.288.931 beschrieben durchgeführt) wurde unter Verwendung eines aseptischen Verfahrens erhalten und bei 4 °C vor dem Ausplattieren gelagert. Zehnfach-Reihenverdünnungen in PBS wurden angefertigt. Insgesamt 0,1 ml Probe wurden auf minimalem Medium, das 0,2 % bis 0,4 % Ribose als Kohlenstoffquelle enthielt, ausplattiert. Die Zusammensetzung des Mediums enthielt pro Liter: 10 mM NH₄Cl; 11,27 g K₂HPO₄, 4,83 g·KH₂PO₄; 0,5 g Natriumcitrat-dihydrat; 0,123 g MgSO₄-Heptahydrat; 15 g Bacto-Agar; und 0,2 %–0,4 % der erwünschten Kohlenstoffquelle. Die Platten wurden bei 37 °C etwa 48–72 h lang inkubiert. Dies bietet ausreichend Zeit, damit eine positive Kolonie auf eine Größe anwachsen kann, die leicht zu detektieren ist. Eine zweite Kultur, die Ribose verwerten konnte, wurde verwendet, um positives Wachstum auf diesem Medium zu bestätigen.
Koloniebildende Einheiten, d.h. die Zellpopulationsdichte (CFU/ml), wurden für zwei Fermentationen bestimmt. Fermentationsdurchgang S1275 ergab 1,0 × 10¹⁰ CFU/ml, und Fermentationsdurchgang S1276 ergab 4,0 × 10¹⁰ CFU/ml. Es wurden CFU von etwa 10⁹ bis 10⁴ pro Platte ausplattiert. Keine Kolonien wurden beobachtet, wie in Tabelle 1 angegeben. Die Kontrollkultur wuchs wie erwartet auf den Riboseplatten. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die Δ(rbs7)-Mutation nichtrevertierend und nichtsupprimierend ist. Kompensationsmutationen, die Wachstum auf Ribose zulassen könnten, wurden ebenfalls nicht nachgewiesen. Somit konnte eine Kultur, die 10⁹ CFU des erwünschten Organismus pro Platte enthielt, ausplattiert werden, und die Empfindlichkeit des Tests mit einer nichtrevertierenden Mutation wie dieser ist etwa ein verunreinigender Organismus pro 10⁹ ausplattierten Zellen.
Tabelle 1
BEISPIEL II
Mehrfach markierter Stamm mit einer nichtrevertierenden und einer revertierenden (Punktmutation) Kohlenhydratmutation
Um die Anzahl an Produktionsstämmen zu steigern, die markiert werden können, können die Stämme mehrfach markiert werden. Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von doppelt markierten Stämmen. Jeder Produktionsorganismus enthielt Mutationen in zwei Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselwegen. In diesem Beispiel wurde der Produktionsorganismus mit einer nichtrevertierenden Mutation (Riboseverwertung) und einer revertierenden Mutation (Punktmutation in der Rhamnoseverwertung) markiert. Die Umkehrung der Punktmutation wurde bei etwa einer Revertante pro 10⁸ ausplattierten Zellen beobachtet. In diesem Fall wurde eine Verdünnung des Produktionsorganismus auf eine ausreichende Konzentration unter der Nachweisgrenze für Revertanten bevorzugt. Spick-Untersuchungen mit Organismen, die entweder Ribose oder Rhamnose und Ribose verwerten können, zeigten, dass der Test so empfindlich ist, wie von der Anzahl an gespickter Organismen, die auf einem Rasen des nichtverwertenden Organismus ausplattiert werden, zu erwarten ist.
Der in dieser Probe verwendete Stamm war ein Derivat von E. coli K-12 W3110 (das ein rekombinantes Protein produzierendes Plasmid trug).
Stamm 46D5, W3110 IN(rrnD-rrnE)1 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 (ΔPst1-kan^s) ΔompT phoS*(T10Y) cyo::kan^R rhaR Δ(rbs7) ilvG2096^R stammte von Stamm 27C7 (siehe oben) ab. Die zusätzlichen Schritte bei der Konstruktion von Stamm 46D5 werden nachstehend erläutert.
Eine Tn10-Insertion in das ilv-Gen wurde in 27C7 durch P1-Transduktion eingeführt. Die Isoleucin/Valin-Auxotrophie wurde unter Verwendung von P1-Phagen, gezüchtet auf einem Stamm, der die ilvG2096^R-Mutation trug (Lawther et al., s.o.) zu Prototrophie transduziert, wodurch eine Rasterverschiebung behoben wird, die den Wildtyp-E.-coli-K-12-Stamm für Valin empfindlich macht. Der resultierende Stamm war 43D3.
Der ilvG2096^R-Locus wurde anhand der Resistenz des 43D3-Wirts gegen 40 μg/ml Valin (0,3 mM) bestätigt.
Die degP41(ΔPst1-kan^R)-Mutation wurde unter Verwendung von P1-Transduktion durch eine degP41(ΔPst1-kan^S)-Mutation ersetzt. Eine proAB::Tn10, die an degP gebunden ist, wurde in 43D3 eingeführt. Der Prolin-Auxotrophe wurde unter Verwendung von P1-Phagen, gezüchtet auf einem Stamm, der die degP-kan^S-Mutation trug, transduziert. Da degP durch Cotransduktion an fhuA gebunden ist, wurde für den neuen Stamm 43E7 bestätigt, dass er die Resistenz gegen Bakteriophagen T1 beibehielt.
Das alkalische-Phosphatase-Gen vom Wildtyp wurde in diesen Wirtshintergrund neuerlich eingeführt, um die Vorteile auszunützen, die aus der nachstehend beschriebenen phoS-Mutation gewonnen wurden. P1-Cotransduktion einer Tn5-Insertion in das proC-Gen mit phoA⁺ wurde verwendet, um das alkalische-Phosphatase-Gen vom Wildtyp in diesen Wirtshintergrund neuerlich einzuführen. P1-Transduktion zu Prolin-Prototrophie stellte das proC-Gen wieder her. Der resultierende Stamm 44D6 gewann wieder Expression von alkalischer Phosphatase und behielt die Δ(argF-lac)-Mutation, die für den Lac-Phänotyp verantwortlich war, bei.
Eine Mutation, die zu einem veränderten Phosphatbindungsprotein, phoS*(T10Y) (US-Patent Nr. 5.304.472), führt, wurde eingeführt. Das phoS*-Protein wies reduzierte Affinität für Phosphat im Medium auf. Das Resultat dessen ist, dass eine Induktion des alkalische-Phosphatase-Promotors bei höherer Phosphatkonzentration auftritt als im Fall des Wildtyps. Dies ermöglicht Produktexpression aus dem APase-Promotor, ohne dabei der Kultur nennenswert Phosphat zu entziehen. PhoS wird durch P1-Cotransduktion an ilv gebunden. Eine Tn10-Insertion in das ilv-Gen wurde neuerlich mittels P1-Transduktion eingeführt. Die Isoleucin/Valin-Auxotrophie wurde unter Verwendung von P1-Phagen, gezüchtet auf einem Stamm, der die phoS*(T10Y)- und die ilvG2096^R-Mutation trug, zu Prototrophie transduziert. Die Gegenwart der phoS*-Mutation führt zu blauen Kolonien auf phosphatreichem Agarmedium, welches das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat enthielt. Der resultierende Stamm war 45F8.
Die cyo::kan^R-Mutation (Oden et al., Gene 96,29–36 (1990)) im Gen für Cytochrom-o-Oxidase wurde durch Transduktion eingeführt. Diese Mutation wurde in vitro durch Ersetzen eines Teils des cyo-Gens durch ein Kanamycinresistenz-Gen durchgeführt. Das Einführen dieser Mutation unterbindet ein Wechseln zwischen den nieder- und hochaffinen Cytochrom-Oxidasen cyo bzw. cyd (US-Patent Nr. 5.342.763). Das Phänomen des Cytochromwechsels kann zu Gelöstsauerstoffinstabilitäten und erfolglosen Fermentationsdurchgängen führen. Der resultierende Stamm war 45F9.
Schließlich wurden zwei Mutationen in Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselwege eingeführt, um zu ermöglichen, dass dieser Wirt von anderen rekombinanten Wirten durch einen einfachen Kohlenhydratverwertungstest unterschieden werden kann. Die rhaR-Mutation (Moralejo et al., J. Bacteriol. 175, 5585–5594 (1993)) wurde durch P1-Cotransduktion mit argE eingeführt. Eine argE:Tn10-Mutation wurde eingeführt. Der Stamm wurde unter Verwendung von P1-Phagen, gezüchtet auf einem Stamm, der die rhaR-Mutation trug, neuerlich auf Prototrophie eingestellt. Es wurde bestätigt, dass der resultierende Stamm 46F1 nicht in der Lage war, Rhamnose als Kohlenstoffquelle zu verwerten.
Die Δrbs7-Mutation (s.o.) wurde durch P1-Cotransduktion mit einer gebundenen Tn10-Insertion im ilv-Gen eingeführt. Die Isoleucin/Valin-Auxotrophie wurde unter Verwendung von P1-Phagen auf einem Stamm, der die ilvG2096^R-Mutation trug, zu Prototrophie transduziert. Der vorhandene Riboseverwertungsdefekt im resultierenden Stamm 46D5 wurde unter Verwendung von minimalem Medium, das Ribose als Kohlenstoffquelle enthielt, bestätigt. Die Beibehaltung von phoS*(T10Y) wurde ebenfalls, wie bereits oben beschrieben, bestätigt.
Eine Probe vom Ende einer 100-l-Fermentation wurde unter Verwendung eines aseptischen Verfahrens erhalten und wie in Beispiel I beschrieben ausplattiert. Die CFU/ml für den Produktionsorganismus betrugen 8,5 × 10¹⁰. Wie in Tabelle 2 ange geben wurden keine Kolonien auf Ribose-hältigen Platten für 10⁹ ausplattierte Zellen oder für jegliche weitere ausplattierte Verdünnungen nachgewiesen. Es wurden jedoch Kolonien auf minimalem, Rhamnose-hältigem Medium bei einer Konzentration von 8,2 × 10² CFU/ml nachgewiesen. Eine Umkehrung der Rhamnose-Punktmutation wurde bei etwa einer Revertante pro 10⁸ ausplattierten Zellen beobachtet.
Tabelle 2 Testen von Kreuzverunreinigung des Wirts für einen IGF-I-Produktionsorganismus
Die Resultate einer Spick-Untersuchung werden in Tabelle 3 gezeigt. Für den 46D5-Wirt wurden entweder 10⁶ oder 10⁷ CFU auf minimalem Rhamnosemedium oder minimalem Ribosemedium ausplattiert. Zehnfache-Reihenverdünnungen des gespickten Organismus wurden in PBS durchgeführt. Der gespickte Organismus war entweder ein Rha⁺-Δrbs-Δmal- (mehrfach markierter Stamm) oder ein Wildtyp-Organismus (Rha⁺ Rbs⁺ Mal⁺). 0,1 ml der 10^–6-, 10^–7-, 10^–8 und 10^–9-Verdünnungen wurden zusammen mit dem Produktionsorganismus ausplattiert. Die Platten wurden bei 37 °C 48–72 h lang inkubiert. Die erwarteten Resultate zur Detektion von gespickten Organismen entsprachen den beobachteten Resultaten zur Detektion der gespickten Organismen im Rahmen der normalen Versuchsfehlerbandbreite. In diesem Beispiel, in dem der Produktionsorganismus verdünnt werden muss, um die Detektion falscher Positiver (Revertanten oder Suppressoren) zu vermeiden, liegt die Empfindlichkeit des Tests bei etwa einem verunreinigenden Organismus pro 10⁶ oder 10⁷ ausplattierten Zellen.
Tabelle 3 Gespickte Organismen
BEISPIEL III
Mehrfach markierter Stamm mit zwei nichtrevertierenden Kohlenhydratmutationen
Ein hochempfindlicher Test kann erzielt werden, wenn ein doppelt markierter Stamm mit zwei nichtrevertierenden Mutationen verwendet wird. Dieser Stamm ist ein Derivat des E.-coli-K-12-Stamms, bezeichnet als 48A4, mit Genotyp W3110 ΔfhuA ΔmalE Δ(rbs7). Der Ausgangsstamm E. coli W3110 ist ein Derivat von E. coli K-12, der F^– und lambda^– ist. Für diesen Stamm wurde gezeigt, dass er eine Inversion des Chromosoms zwischen rrnD und rrnE aufwies. Das fhuA-Gen (US-Patent Nr. 5.304.472) wurde aus W3110 durch ungenaues Ausschneiden von Tn10 nach dessen Insertion in das fhuA-Gen deletiert. Der resultierende Stamm 1A2 ist gegen Bakteriophagen T1, T5 und 80 resistent. Zwei Mutationen in Kohlenhydratverwertungs-Stoffwechselwegen wurden eingeführt. Eine Deletion von malE wurde durch PCR eingeführt und in einen Plasmidvektor pS1080, der β-Lactamase und Lävansaccharase enthielt, eingebaut. Bass et al., J. Bacteriol. 178, 1154–1161 (1996). Das Plasmid wurde durch M13-Transduktion und Carbenicillin-Resistenz in das Chromosom eines W3110-Derivats, das keine unabhängige Replikation des Plasmidvektors unterstützen würde, rekombiniert (BW16824). Metcalf et al., Gene 138, 1–7 (1994); Bass et al., s.o. Stamm 1A2 wurde dann mit P1-Phagen, gezüchtet auf einem Stamm, der das malE-Deletionsplasmid in sein Chromosom integriert trug, zu Carbenicillin-Resistenz transduziert. Saccharose-resistente Derivate wurden selektiert und auf den Verlust von Carbenicillin-Resistenz und Unfähigkeit, Maltose zu verwerten, gescreent. Für den resultierenden Stamm 46H9 wurde unter Verwendung von PCR bestätigt, dass er die geplante mal-Deletion trug.
Die Δ(rbs7)-Mutation (s.o.) wurde durch P1-Cotransduktion mit einer gebundenen Tn10-Insertion in das ilv-Gen eingeführt. Ein spontaner ilv⁺-Prototroph wurde durch Ausplattieren auf minimalem Glucosemedium erhalten. Der resultierende Stamm wurde als 48A4 bezeichnet.
Eine Probe aus einer Übernacht-LB-Kultur wurde zentrifugiert und etwa 10fach unter Verwendung eines aseptischen Verfahrens eingeengt. Zehnfach-Reihenverdünnungen wurden in PBS vorgenommen. 0,1 ml wurden auf minimalem Medium (oben beschrieben), das 0,2 % bis 0,4 % der in Tabelle 4 angegebenen Kohlenstoffquelle enthielt, ausplattiert. Die Platten wurden bei 37 °C etwa 48 h lang inkubiert.
Die CFU/ml für den Testorganismus 48A4 wurden auf 2,2 × 1010 CFU/ml bestimmt. CFU von 10⁹ bis 10⁵ pro Platte wurden ausplattiert. Wie in Tabelle 4 angegeben wurden keine Kolonien beobachtet. Die Resultate weisen auf die Abwesenheit von Reversion oder Suppression der zwei Kohlenhydratmarker hin. Somit konnte eine Kultur, die 10⁹ CFU/Platte des erwünschten Organismus enthielt, ausplattiert werden, und die Empfindlichkeit des Tests für einen doppelt markierten, nichtrevertierenden Organismus wie z.B. 48A4 umfasste etwa einen verunreinigenden Organismus pro 10⁹ ausplattierten Zellen.
Tabelle 4
BEISPIEL IV
Detektion eines kontaminierenden auxotrophen Organismus
Ein den Wirt kreuzverunreinigender Organismus, der einen Aminosäure- oder einen anderen auxotrophen Bedarf aufweist, konnte auch durch Einstellen der Zusammensetzung des Mediums nachgewiesen werden. In diesem Beispiel wird gezeigt, dass ein Leucin-Auxotroph unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Mediums detektiert werden kann. 26G5 ist ein Derivat von E.-coli-K-12-W3110-ΔfhuA-Stamm, der eine Deletion in leuA enthält. Dieser Organismus, der einen Bedarf an der Aminosäure Leucin aufweist, wurde für die nachstehend beschriebenen Spick-Untersuchungen verwendet. Leucin wurde zu minimalem Medium in einer Endkonzentration von 0,3 mM zugesetzt oder wurde als Teil eines Komponentengemisches (vollständige Ergänzungen), welches das Wachstum der meisten auxotrophen E.-coli-Stämme unterstützen konnte, zugesetzt. Die vollständige Ergänzung setzt sich aus Komponenten zusammen, die dafür bekannt sind, vom E.-coli-Organismus als einzige Kohlenstoffquelle verwertet zu werden. Die Komponenten der vollständigen Ergänzung umfassten: 0,3 mM der Aminosäuren L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glycin, L-Histidin, L-Valin, L-Leucin, L-Methionin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Glutamin, L-Tryptophan, L-Phenylalanin und L-Lysin; 15 μg/ml (0,1 mM) Hypoxanthin, Vitamine (0,2 μg/ml Myoinositol, 0,1 μg/ml Pantothenat, 0,1 μg/ml Nicotinsäureamid, 0,1 μg/ml Pyridoxal-HCl, 0,1 μg/ml Cholinchlorid, 0,1 μg/ml Folsäure, 0,01 μg/ml Riboflavin, 0,34 μg/ml p-Aminobenzoesäure und 0,5 μg/ml Thiamin); und Spurenelemente (27 μg/ml Eisenchloridhexahydrat, 8 μg/ml Zinksulfat, 7 μg/ml Cobaltchloridhexahydrat, 7 μg/ml Natriummolybdat, 8 μg/ml Kupfer(II)-sulfat-pentahydrat, 2 μg/ml Borsäure und 5 μg/ml Mangansulfatmonohydrat).
Die Stammkonstruktionsverfahren für 46D5 und 48A4 sind im Detail in den Beispielen II bzw. III beschrieben. Eine Probe aus einer Übernacht-LB-Kultur wurde zentrifugiert und unter Verwendung eines aseptischen Verfahrens etwa 10fach eingeengt. Reihenverdünnungen wurden in PBS vorgenommen. Für den 46D5-Wirt wurden entweder 10⁶ oder 10⁷ CFU auf minimalem Rhamnosemedium, das nur mit Leucin ergänzt war, oder auf minimalem Rhamnosemedium mit vollständigen Ergänzungen ausplattiert.
Für den 48A4-Wirt wurden 10⁹ CFU auf dem minimalen Maltosemedium, das nur mit Leucin ergänzt war, oder auf minimalem Maltosemedium mit vollständigen Ergänzungen ausplattiert. Für beide Organismen wurden in Abwesenheit von Spickkultur keine Kolonien nachgewiesen.
Zehnfach-Reihenverdünnungen des auxotrophen 26G5-Leucinorganismus wurden in PBS vorgenommen, sodass dieser eine mutmaßliche Verunreinigung aufwies. Insgesamt wurden 0,1 ml der 10^–6-, 10^–7-, 10^–8- und 10^–9-Verdünnungen zusammen mit dem Produktionsorganismus ausplattiert. Die Platten wurden bei 37 °C 48–72 h lang inkubiert. Die Resultate werden in Tabelle 5 gezeigt.
Spick-Untersuchungen mit einem Leucin-Auxotrophen zeigen, dass der Test so empfindlich ist, wie von der Anzahl an gespickten Organismen, die auf einem Rasen eines nichtverwertenden Organismus ausplattiert werden, erwartet werden kann. In dem Fall, in dem der Produktionsorganismus nicht verdünnt werden muss, umfasst die Empfindlichkeit etwa einen verunreinigenden Organismus pro 10⁹ ausplattierten Zellen. Sofern erforderlich kann der Produktionsorganismus eventuell verdünnt wer den müssen, um die Detektion falscher Positiver (Revertanten oder Suppressoren) zu vermeiden, und in diesem Fall liegt die Empfindlichkeit im Bereich von einem verunreinigendem Organismus pro 10⁶ oder 10⁷ ausplattierten Zellen. Die individuelle Ergänzung einer Aminosäure, wie z.B. Leucin, oder eine umfassendere Ergänzung, welche die meisten auxotrophen E.-coli-Stämme nachweisen kann, ergab ähnliche Resultate.
Tabelle 5

Claims

Verfahren zur Herstellung, in einem einzelnen Kulturgefäß, mehrfacher Polypeptidprodukte aus Mikrobenwirtszellstämmen, die mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwerten, worin die Mikrobenwirtszellstämme Bakterien-, Hefe- oder Pilzwirtszellstämme sind, worin das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) das Kultivieren eines ersten Wirtszellstamms in einem Gefäß, der Nucleinsäure umfasst, die für ein erstes Polypeptidprodukt kodiert, das gleichzeitig hergestellt wird, und der genetisch markiert ist, dass ihm die native Fähigkeit fehlt, eine erste Kohlenhydratquelle als Substrat zu verwenden; (b) das Ausplattieren einer isolierten Kulturprobe aus Schritt (a) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle, die vom Wirtszellstamm nicht als Substrat verwertet wird, und mit keinen anderen Kohlenhydratquellen ergänzt ist; (c) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und über eine Zeitspanne hinweg, die ausreichend ist, dass jegliche positive Kolonie auf ein nachweisbares Niveau anwachsen kann; (d) das Nachweisen, ob Kolonien auf dem ergänzten Kulturmedium wachsen; (e) das Entfernen des Inhalts des Kulturgefäßes und das Säubern und Sterilisieren des Gefäßes, nachdem das Kultivieren des ersten Mikrobenwirtszellstamms abgeschlossen ist; (f) das Kultivieren eines zweiten Mikrobenwirtszellstamms im Gefäß, der Nucleinsäure umfasst, die für ein zweites Polypeptidprodukt kodiert, das gleichzeitig hergestellt wird, und der genetisch markiert ist, dass ihm die native Fähigkeit fehlt, eine zweite Kohlenhydratquelle als Substrat zu verwenden, worin der Stamm die erste Kohlenhydratquelle als Substrat verwenden kann; (g) das Ausplattieren einer isolierten Kulturprobe aus Schritt (f) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle, die vom zweiten Wirtszellstamm nicht als Substrat verwertet wird, und mit keinen anderen Kohlenhydratquellen ergänzt ist; (h) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und über eine Zeitspanne hinweg, die ausreichend ist, dass jegliche positive Kolonie auf ein nachweisbares Niveau anwachsen kann; (i) das Nachweisen, ob Kolonien auf dem ergänzten Kulturmedium wachsen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikrobenwirtszellstämme Hefe- oder prokaryotische Wirtszellstämme sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Mikrobenwirtszellstämme prokaryotische Wirtszellstämme sind.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die prokaryotischen Wirtszellstämme Bakterienwirtszellstämme sind.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Bakterienwirtszellstämme gramnegativ sind.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Bakterienwirtszellstämme Enterobacteriaceae-Stämme sind.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Bakterienwirtszellstämme E. coli sind.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Polypeptide gegenüber dem Mikrobenwirtszellstamm exogen sind.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Polypeptide aus Säugetieren stammen.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Polypeptide aus Menschen stammen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kohlenhydratquellen Maltose, Rhamnose oder Ribose sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikrobenwirtszellstämme durch Veränderung ihres Genotyps genetisch markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Veränderung eine nicht-umkehrende und nicht-unterdrückende Veränderung ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Veränderung in einer Kohlenhydratverwertungs-Revertante oder einem Kohlenhydratverwertungs-Suppressor resultiert.