Blut
bzw. Blutkomponenten (Zellkonzentrate und Plasma) sowie Zelltherapeutika
(z.B. Stammzellen, modifizierte Zellen, gentechnisch veränderte Zellen,
künstliche
Organe) können
während
Spende, Lagerung, Transport und Vorbereitung zur Anwendung sowie
durch Behältnisse,
zusätzlich
vor allem während
der Bearbeitung, verunreinigt werden, was zu schweren, gegebenenfalls
tödlichen
Komplikationen bei den Empfängern
dieser Präparate
führen kann.
Verunreinigungen durch Viren werden zwar fast vollständig durch
verschiedene Verfahren erkannt. Am häufigsten treten heute jedoch
Komplikationen durch bakterielle Verunreinigungen, Pilze und Parasiten,
sowie durch biologisch aktive Verunreinigungen nicht belebter Natur
auf. Weiterhin können sich
insbesondere Bakterien und Pilze in den Präparaten stark vermehren.
Die
Bestimmung der klinischen Relevanz von Verunreinigungen in Blut
bzw. Blutkom ponenten und Zelltherapeutika wird durch verschiedene
Umstände
erschwert. Die Zahl kontaminierender Mikroorganismen pro Volumeneneinheit
ist in der Regel initial sehr gering, so dass die Testprobe steril
sein kann, obwohl das Präparat
verunreinigt ist. Somit ist die Nachweisgrenze mancher Verfahren
vom Testvolumen einerseits sowie von der Zahl der Kontaminanten
andererseits abhängig.
Weiterhin können
kontaminierende Mikroorganismen durch Effektoren der Immunabwehr,
durch zugesetzte Stoffe (z. B Antibiotika) oder Behandlungsverfahren
(z. B. Pathogen-Inaktivierung) in den Präparaten abgetötet werden. Ihre
Bestandteile, Überreste
oder Stoffwechselprodukte können
jedoch zu klinischen Nebenwirkungen durch die Anwendung der Präparate führen.
Es
ist somit zumindest problematisch, wenn bekannte oder in Entwicklung
befindliche Verfahren zur Erkennung von Verunreinigungen in Blut
den direkten Nachweis von Pathogenen oder deren Bestandteilen zum
Ziel haben. Beispielsweise werden Proben von Blut, Blutkomponenten
oder Zelltherapeutika in mikrobiologisch-kulturellen, auch automatisierten
Verfahren auf mikrobielle Verunreinigungen überprüft. Andere Verfahren zielen
auf den Nachweis von Genen der Pathogene mittels Nukleinsäure-Amplifitions-Techniken
wie Polymerase Chain Reaktion (PCR). Ein weiteres Prinzip besteht
in der Markierung verunreinigender Pathogene oder ihrer Bestandteile mit
Fluoreszenz-Farbstoffen,
gegebenenfalls mit Hilfe von Antikörpern, und dem anschließenden Nachweis
mit Hilfe von Zytofluorometrie, Fluoreszenz-Scanning oder anderen üblichen
Verfahren.
Einen
völlig
anderen Weg geht das sogenannte Pyrogen-Verfahren. Stoffe wie beispielsweise Medikamente,
einschließlich
Blutersatz- und Blutaustauschstoffe, medizinische Membranen, Prothesen und
dergleichen, werden auf biologisch nachteilige Kontaminationen untersucht
unter Verwendung von Blut als Testmedium, wobei als Meßparameter
endogene Pyrogene, d. h. Zytokine bzw. Wachstumsfaktoren, wie Interleukine
1 oder 6 (IL-1, IL-6), Tumor-Necrosis-Factor (TNF), Prostaglandin
E
2 usw. dienen (
EP 0 741 294 ). Die endogenen Pyrogene
werden im Vollblut überwiegend
durch bestimmte weiße
Blutzellen, die Monozoyten, erzeugt. Dieses Verfahren erlaubt die
in vitro-Feststellung pyrogener, d. h. pathogener Verunreinigungen,
unabhängig
von ihrer Ursache.
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist, ein weiteres, diesem Prinzip folgendes
Verfahren zur Verfügung
zu stellen. Belebte und nicht belebte Ursachen pathogener Wirkun gen
sollen unabhängig
vom Testvolumen erkennbar werden. Die schnelle Durchführbarkeit
wäre ein
besonderer, auch für
die Praxis wesentlicher Vorteil.
Die
Lösung
der gestellten Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen, erläutert durch
die nachfolgenden Ausführungen
und das Fachwissen.
Als
zu untersuchendes Material kommen insbesondere Blut, vorzugsweise
menschliches Blut bzw. menschliche Blutkomponenten, und Zelltherapeutika,
vorzugsweise für
die Anwendung am Menschen, in Betracht. Unter Blutkomponenten werden insbesondere
menschliche Blutplasmen und Blutzellen, unabhängig von Quelle und Eigenschaften,
verstanden. Die Blutzellen können
beispielsweise aus Blut, aus blutbildenden Organen wie dem Knochenmark
oder auch der Nabelschnur gewonnen werden. Sie können in ihrem natürlichen
Zustand belassen oder verändert
(z.B. auch gentechnisch manipuliert) sein. Unter Zelltherapeutika
werden insbesondere medizinischen Anwendungen verstanden, welche sich
der natürlichen
direkten oder indirekten Wirkung von Zellen bedienen (z.B. Stammzellen
und ihre Weiterentwicklungen oder Modifikate, bereits differenzierte
Zellen aus Organen), modifizierte Zellen selbst (z. B. für die Krebstherapie)
oder auch modifizierte Zellen als Träger anderer Therapeutika (z.
B. für
die Gentherapie) und Prophylaktika (z. B. für Impfstoffe). Wenn auch das
erfindungsgemäße Verfahren
die Feststellung pathogener Wirkungen im weitesten Sinne zulässt, so
sind ganz bevorzugt jene pathogenen Wirkungen von Interesse, die
bei der Anwendung von Blut und Blutkomponenten sowie von Zelltherapeutika,
vor allem beim Menschen, auftreten können, wie Fieber, Schüttelfrost,
Schock und Tod. Es handelt sich vorrangig um die pathogenen Wirkungen
von Verunreinigungen mit Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze und
Parasiten, und deren Bestandteilen, Zersetzungs- und Metabolisierungsprodukten
einschließlich
Exo- und Endotoxinen sowie einer Vielzahl weiterer bekannter oder
unbekannter Stoffe.
Als
monozytenhaltiges Testmaterial ist Vollblut ganz bevorzugt, insbesondere
menschliches Vollblut, welches alle weiteren, die pathogenen Wirkungen
gegebenenfalls beeinflussenden Komponenten enthält. Ferner, wenn auch wegen
möglicherweise
aufbereitungsbedingter Artefakte nicht besonders bevorzugt, sind
isolierte weiße
Blutzellen (z. B. buffy coat), isolierte Monozyten, kultivierte
Monozyten und monozytenartige Zellen, insbesondere aus menschlichem
Blut; Zelllinien und genetisch oder anderweitig modifizierte Zelllinien,
insbesondere menschlichen Ursprungs. Den Zellen kann Plasma, Serum
oder ein Serumersatzstoff zugesetzt werden. Vorzugsweise wer den
auch hier menschliche Monozyten oder Zellen mit Eigenschaften menschlicher
Monozyten eingesetzt, da Zellen anderer Spezies typischerweise keine
zuverlässige
Aussage über
Nebenwirkungen beim Menschen, z. B. bei Transfusionen oder Anwendungen
von Zelltherapeutika, erlauben. Es können auch konservierte Monozyten,
isoliert oder in Mischungen (z. B. in Vollblut) eingesetzt werden.
Durch
das Inkontaktbringen des zu untersuchenden Blutes, der Blutkomponenten
oder der Zelltherapeutika mit einem monozytenhaltigen oder monozytenartige
Zellen enthaltenden Testmittel wird durch die im Untersuchungsmaterial
gegebenenfalls enthaltenen Kontaminanten die Bildung von Boten-Ribonukleinsäure (messenger
Ribo Nuleic Acid, mRNA) induziert. Bevorzugt wird die Induktion
regelmäßig durch
Inkubation gefördert,
z. B. unter den bekannten üblichen
Bedingungen. Zur Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse, z. B. bei
der Verwendung von Vollblut, als Untersuchungsmaterial, aber auch als
Testmittel, kann es zweckmäßig sein,
eine verfälschende
Koagulation durch Zugaben von koagulationsinhibierenden Zusätzen wie
Heparin oder Zitrat zu unterbinden.
Die
Aktivierung des monozytenhaltigen oder monozytenartige Zellen enthaltenden
Testmittels wird vorzugsweise über
die induzierten, für
inflammatorische Zytokine (z. B. TNF, IL-1 und IL-6) codierenden
mRNA nachgewiesen. Ebenso können
direkte oder indirekte Gene für
die Induktion anderer Marker der Zellaktivierung (wie beispielsweise
Nicht-Zytokin-Proteine oder auch Prostaglandine, Neopterin) oder
auch Reportergene als Meßparameter
verwendet werden. Der Nachweis von mRNA erfolgt an sich in bekannter
Weise.
So
kann der Nachweis dieser mRNA z. B. nach kurzzeitiger, etwa 60-minütiger oder
kürzerer, Inkubation
des Untersuchungsmaterials mit Vollblut oder einem anderen monozytenhaltigen
oder monozytenartige Zellen enthaltenden Testmaterial, notwendigenfalls
unter Isolation der RNA, gegebenenfalls unter gleichzeitiger Hemmung
von RNasen, erfolgen. Die Sequenzen der nachzuweisenden Gene können mit
Hilfe spezifischer Primer amplifiziert werden (z. B. mittels NASBA
oder TMA), sie können auch
durch reverse Transkription in eine c-DNA umgeschrieben und anschließend mittels
PCR amplifiziert werden. Die mRNA können auch beispielsweise mit
Hilfe von Gen-Chips
oder Signalverstärker-Verfahren
und Bindung der spezifischen Sequenzen, mit oder ohne Amplifikation
der Nukleinsäure-Sequenzen,
mit oder ohne Modifikation der Nukleinsäure-Sequenzen, nachgewiesen
werden. Die mRNA können auch
quantifiziert werden (z. B. mittels Real-Time PCR). Auf diese Weise
gelingt, erforderlichenfalls in kurzer Zeit und erforderlichenfalls
quantitativ, der Nachweis einschlägiger mRNA und damit der Nachweis
der Kontamination des Untersuchungsmaterials.