DE69727160T2

DE69727160T2 - Assay unter verwendung von markierten mikrobiellen wirtzellen

Info

Publication number: DE69727160T2
Application number: DE69727160T
Authority: DE
Inventors: C. Nancy McFARLAND; R. James SWARTZ
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2017-10-11
Also published as: ATE331036T1; ES2268241T3; DE69736210D1; IL129357A0; AU5001997A; DK1021556T5; US5962252A; DK1398385T3; CA2267655A1; DE69727160D1; DE69736210T2; EP1021556B9; IL184248A0; CA2267655C; WO1998018955A1; PT1021556E; NZ335026A; EP1021556B1; JP2001502917A; ZA979496B

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft einen Test, der genetisch markierte Produktionswirtsstämme umfasst, die routinemäßig die Quelle zur Fertigung rekombinant produzierter Proteine in einer Fermenteranlage für mehrere Produkte sind. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Mischkulturen in einem Fermenter.
Stand der Technik
Das Potential für genetische Marker bei der Identifizierung von Hefestämmen ist erkannt worden, und es wurden gezielt markierte önologische Stämme von Vezinhet und Lacroix, Bull. O. I. V. 643–644, 759–773 (1984), entwickelt. Petering et al., Am. J. Enol. Vitic. 42, 6 (1991), offenbaren ein Verfahren, das rekombinante DNA-Technologie einsetzt, um das β-Glucuronidase-(GUS-) Gen von E. coli als Genmarker in einen beliebigen gewünschten Hefestamm einzuführen. Die Fertigung neuer Mikroorganismenstämme, die auf Mikroorganismen anwendbar ist, in denen die Reproduktion normalerweise asexuell ist, wird in US-Patent Nr. 2.820.742 beschrieben. Die Rolle der Luciferase gemeinsam mit ihren Verwendungen in Lumineszenz-Tests und als Markergen werden von Ugariva et al., Biokhimiva 58, 1351–1372 (1993), im Überblick behandelt. Das Luciferase-Gen kann in verunreinigenden Bakterien mittels Bakteriophagen insertiert werden, und Luciferase-Gene können als Marker in rekombinanten DNA-Untersuchungen verwendet werden, um Promotor- und andere Aktivitäten zu testen. Prosser et al., Critical Reviews in Biotechnology 16, 157–183 (1995), offenbaren die Entwicklung von Techniken zum Detektieren und Verfolgen von Mikroorganismen in natürlichen Umgebungen und die Entwicklung molekularer Markersysteme für solche Untersuchungen. In der Önologie besteht das Problem, einen bestimmten Stamm von einer großen Vielfalt möglicher Verunreinigungen zu unterscheiden. Es können zwei Ansätze verwendet werden: die Verwendung eines erworbenen Charakteristikums und die genetische Implantation einer unterscheidenden und leicht lokalisierbaren Eigenschaft. Ersterer ist auf die Weinkelterung schlecht anwendbar. Die in der obigen Publikation beschriebene genetische Markierung besteht aus dem Erwerb einer Antibiotikaresistenz (Chloramphenicol und Oligomycin) durch den Stamm. Der genetische Determinismus dieser Resistenz befindet sich im Mitochondrien-Genom der Zelle. Die Markierung weist die folgenden Charakteristika auf:
das Kerngenom ist nicht modifiziert; folglich ist das Risiko der Modifizierung des önologischen Potentials des Stamms minimal; die erworbenen Charakteristika sind leicht erkennbar (Wachstum auf speziellen Medien); und kein Selektionsnachteil für den markierten Stamm im natürlichen Wettstreit.
Das Aufkommen der Biotechnologie hat alleine in den Vereinigten Staaten zur klinischen Verwendung und Zulassung von mehr als zehn rekombinant produzierten Proteinen, einschließlich Gamma-Interferon, Beta-Interferon, Alpha-Interferon, Insulin, Faktor VIII, Gewebeplasminogenaktivator, Human-Wachstumshormon, koloniestimulierende Faktoren, Erythropoietin und DNase geführt. Weiters werden derzeit viele Medikamente entwickelt oder befinden sich im klinischen Stadium für die künftige Zulassung. Die Kapazität in Fermentationsanlagen ist beschränkt, so dass derselbe Fermenter für die Herstellung verschiedener Produkte verwendet werden muss. Ein Beispiel ist die Herstellung verschiedener Antikörper im selben Fermenter. Gleichermaßen kann ein benachbarter Fermenter gleichzeitig ein anderes Produkt produzieren. Zu den Maßnahmen, die zur Verhinderung der Kreuzkontamination amtlich zugelassener biologischer Produkte eingesetzt werden, die in einer Mehrzweckanlage gefertigt werden, und zu den behördlichen Vorschriften, die mit der Verwendung von Anlagen zur Fertigung von mehr als einem Produkt verbunden sind, siehe Bader et al., „Multiuse Manufacturing Facilities for Biologicals", BioPharm 5, 32–40 (Sept. 1992).
Es besteht ohne Zweifel ein Bedarf daran, imstande zu sein, eine Kontamination der gewünschten Produktionskultur durch ein andersartiges Produkt produzierende Organismen, wann auch immer sie auftritt, zu detektieren. In einer Anlage für mehrere Produkte kann die Verunreinigung ein beliebiger von mehreren sehr ähnlichen Orga nismen sein. Der Test muss einfach auszuführen sein und muss jegliche der möglichen Verunreinigungen empfindlich detektieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Testen auf mögliche Verunreinigungen in einem Kultivierungsgefäß, das zur Herstellung mehrerer Polypeptidprodukte verwendet wird, worin die möglichen Verunreinigungen Bakterien-, Hefe- oder Pilzwirtszellen sind, die in nativer Form Kohlenhydrate verwerten, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) das Kultivieren eines Wirtszellstamms im Gefäß, der mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwertet, der aber genetisch so markiert ist, dass ihm seine natürliche Fähigkeit fehlt, zumindest ein Kohlenhydrat als Substrat zu verwerten, und der Nucleinsäure umfasst, die für das gerade erzeugte Polypeptidprodukt kodiert;
(b) das Ausplattieren einer isolierten Probe der Kultur aus Schritt (a) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle, die vom Wirtszellenstamm nicht als Substrat verwertet wird, und mit keinen anderen Kohlenhydratquellen ergänzt ist;
(c) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichen, damit jegliche positive Kolonien bis zu einem detektierbaren Ausmaß wachsen; sowie
(d) das Detektieren, ob auf dem ergänzten Kulturmedium irgendwelche Kolonien wachsen.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung einen Test zum Identifizieren verunreinigender mikrobieller Wirtszellen in einem Kultivierungsgefäß bereit, das einen mikrobiellen Wirtszellenstamm enthält, der mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwertet, worin jegliche verunreinigenden mikrobiellen Wirtszellen und der mikrobielle Wirtszellenstamm aufgrund ihrer speziellen Kohlenhydratverwertungseigenschaften einzigartig genetisch markiert sind, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) das Kultivieren des mikrobiellen Wirtszellenstamms im Gefäß, wobei der Stamm Nucleinsäure umfasst, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, und genetisch markiert ist, so dass er eine Kohlenhydratquelle als Substrat nicht verwertet;
(b) das Ausplattieren der isolierten Probe der Kultur aus Schritt (a) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle ergänzt ist, die vom Wirtszellenstamm nicht als Substrat verwertet wird;
(c) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichen, damit jegliche positive Kolonien bis zu einem detektierbaren Ausmaß wachsen;
(d) das Detektieren, ob auf dem ergänzten Kulturmedium irgendwelche Kolonien wachsen;
(e) das Gewinnen jeglicher auf dem ergänzten Kulturmedium wachsender Kolonien; sowie
(f) das Ausplattieren der gewonnenen Kolonien auf einem Feld verschiedener Kohlenhydrate, um jegliche verunreinigenden Wirtszellen durch ihre speziellen Kohlenhydratverwertungseigenschaften zu identifizieren. Typischerweise wird in diesem Test ein verunreinigendes Proteinprodukt aufgrund der Identifizierung der verunreinigenden Wirtszellen identifiziert. Jeder Produktionsorganismus, der in die Anlage eingeführt werden muss, wäre durch einen einzigartigen Marker oder eine Kombination von Markern genetisch markiert.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Produzieren mehrerer Polypeptide von Interesse in einem einzigen Kultivierungsgefäß aus mikrobiellen Wirtszellenstämmen bereit, die mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwerten, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) das Kultivieren eines ersten mikrobiellen Wirtszellenstamms im Gefäß, der Nucleinsäure umfasst, die für ein erstes Polypeptid von Interesse kodiert und der genetisch markiert ist, so dass er eine erste Kohlenhydratquelle nicht als Substrat verwertet;
(b) das Ausplattieren einer isolierten Probe der Kultur aus Schritt (a) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle ergänzt ist, die vom Wirtszellenstamm nicht verwertet wird;
(c) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichen, damit jegliche positive Kolonien bis zu einem detektierbaren Ausmaß wachsen;
(d) das Detektieren, ob auf dem ergänzten Kulturmedium irgendwelche Kolonien wachsen;
(e) Das Entfernen des Inhalts des Kulturgefäßes und Reinigen und Sterilisieren des Gefäßes, nachdem das Kultivieren des ersten mikrobiellen Wirtsstamms beendet ist;
(f) das Kultivieren eines zweiten mikrobiellen Wirtszellenstamms im Gefäß, der Nucleinsäure umfasst, die für ein zweites Polypeptid von Interesse kodiert und der genetisch markiert ist, so dass er eine zweite Kohlenhydratquelle nicht als Substrat verwertet, wobei der Stamm die erste Kohlenhydratquelle als Substrat verwerten kann;
(g) das Ausplattieren einer isolierten Probe der Kultur aus Schritt (f) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle ergänzt ist, die vom zweiten Wirtszellenstamm nicht verwertet wird;
(h) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichen, damit jegliche positive Kolonien bis zu einem detektierbaren Ausmaß wachsen; sowie
(i) das Detektieren, ob auf dem ergänzten Kulturmedium irgendwelche Kolonien wachsen, um zu ermitteln, ob eine Kontamination durch den ersten Wirtzellenstamm vorliegt.

Mehrere Eigenschaften dieses Tests machen diesen attraktiv. Es ist ein einfacher Test, der sehr empfindlich für die Erkennung unerwünschter, fremder Mikroorganismen sein kann. Die Empfindlichkeit kann auch zur Anpassung an die Eigenschaften der verwendeten Markermutationen eingestellt werden. Es gibt eine große Zahl von Wirten, die markiert werden könnten, da beispielsweise E. coli ein weites Spektrum von Kohlenhydraten verwerten kann. Die Anzahl von Falsch-Positiven ist gering, besonders wenn Deletionsmutanten eingesetzt werden.
Außerdem ist die GMP-Produktion in der Vergangenheit eingeschränkt gewesen, da Produkt-Kreuzverunreinigungsereignisse nicht detektiert werden konnten. Daher musste, auch wenn nur eine geringe Überschreitung der Gesamtverunreinigung auftrat, der gesamte Fermentationsansatz verworfen werden, um das Risiko einer unannehmbaren Produkt-Kreuzverunreinigungsereignisse zu vermeiden. Diese Erfindung ermöglicht die Messung von früher nicht detektierbaren Mengen von Wirts-Kreuzverunreinigung, so dass ermittelt werden kann, ob die Verunreinigungsmengen sich innerhalb annehmbarer Grenzen befinden und daher, ob der Ansatz zu verwerfen ist. Dies vermeidet das unnötige Verwerfen von Ansätzen, die sich innerhalb erlaubter Grenzen befunden haben könnten, jedoch nicht definitiv als annehmbar beurteilt werden konnten.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Wie hierin verwendet, sind „verunreinigende" Zellen und „Verunreinigungen" jene Materialien, deren Anwesenheit in einer bestimmten Kultur von Interesse nicht erwünscht sind.
Für die Zwecke hierin ist ein „Kultivierungsgefäß" ein Gefäß, das verwendet wird, um den/die mikrobiellen Wirtszellenstamm/stämme zu kultivieren. Dies umfasst üblicherweise Schüttelkolben sowie Fermenter, wie z. B. jene, die für die Polypeptid-Produktion im Großmaßstab vorgesehen sind.
Der Fermenter ist zweckdienlicherweise von jeder Größe, einschließlich 1-L-, 10-L-, 1.000-L-, 10.000-L- und 100.000-L-Tanks.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Polypeptid" oder „Polypeptid von Interesse" allgemein auf Peptide und Proteine, die mehr als ungefähr zehn Aminosäuren aufweisen.
Vorzugsweise sind die Polypeptide „exogen", was bedeutet, dass sie „heterolog", d. h. der eingesetzten Wirtszelle fremd sind, wie z. B. ein von E. coli produziertes Human-Protein.
Beispiele von Säugetier-Polypeptiden umfassen Moleküle, wie z. B. Renin, ein Wachstumshormon, einschließlich Human-Wachstumshormon; Rinder-Wachstumshormon; Wachstumshormon-freisetzender Faktor; Nebenschilddrüsenhormon; schilddrüsenstimulierendes Hormon; Lipoproteine; α1-Antitrypsin; Insulin-A-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; Thrombopoietin; follikelstimulierendes Hormon; Calcitonin; Luteinisierungshormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren, wie z. B. Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von-Willebrand-Faktor; Anti-Gerinnungsfaktoren, wie z. B. Protein C; atrialer natriuretischer Faktor; Lungensurfactant; ein Plasminogenaktivator, wie z. B. Urokinase oder Human-Harn- oder Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Thrombin; hämopoetischer Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor-Alpha und -Beta; Enkephalinase; ein Serumalbumin, wie z. B. Human-Serumalbumin; Müller-hemmende Substanz; Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; ein mikrobielles Protein, wie z. B. Beta-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; ein neurotropher Faktor, wie z. B. Hirn-hergeleiteter neurotropher Faktor (BDNF); Neurotrophin-3, -4, -5, oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder ein Nerven-Wachstumsfaktor, wie z. B. NGF-β; Cardiotrophine (Herzhypertrophiefaktor), wie z. B. Cardiotrophin-1 (CT-1); Blutplättchen-hergeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF); Fibroblasten-Wachstumsfaktor, wie z. B. aFGF und bFGF; epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); transformierender Wachstumsfaktor (TGF), wie z. B. TGF-Alpha und TGF-Beta, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; Insulin-artiger Wachstumsfaktor I und II (IGF-I und IGF-II); des(1,3)-IGF-I (Hirn-IGF-I); Insulin-artige Wachstumsfaktor-bindende Proteine; CD-Proteine, wie z. B. CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein Knochen-morphogenetisches Protein (BMP); ein Interferon, wie z. B. Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma; koloniestimulierende Faktoren (CFSs), z. B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z. B. IL-1 bis IL-10; Anti-HER-2-Antikörper; Superoxiddismutase; T-Zellen-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; Abbau-beschleunigender Faktor; Virus-Antigen, wie z. B. ein Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Adressine; Regulationsproteine; Antikörper; und Fragmente beliebiger der oben aufgezählten Polypeptide.
Die bevorzugten exogenen Polypeptide von Interesse sind Säugetier-Polypeptide. Beispiele solcher Säugetier-Polypeptide umfassen Enzyme, Hormone, Cytokine, Chemokine, Immunotoxine, Virus-Komponenten, Antikörper, Neurotrophine und Antigene. Geeignete solche Proteine umfassen Human-Polypeptide, wie z. B. t-PA, gp120, Anti-CD11a, Anti-CD18, Anti-VEGF, VEGF, TGF-Beta, Activin, Inhibin, Anti-HER-2, DNase, IGF-I, IGF-II, Hirn-IGF-I, Wachstumshormon, Relaxin-Ketten, Wachstumshormon-freisetzender Faktor, Insulin-Ketten oder Proinsulin, NGF, NT-3, BDNF und Urokinase. Insbesondere bevorzugte Säugetier-Polypeptide umfassen z. B. t-PA, gp120(IIIb), Anti-HER-2, Anti-CD11a, Anti-CD18, Anti-VEGF, VEGF, DNAse, IGF-I, IGF-II, TGF-Beta, IGFBP-3, IGFBP-2, IGFBP-1, Wachstumshormon, NGF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6. Das Polypeptid ist bevorzugter IGF, insbesondere bevorzugt IGF-I.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „IGF-I" auf Insulin-artigen Wachstumsfaktor aus irgendeiner Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd und vorzugsweise Mensch, in nativer Sequenz oder in Variantenform und rekombinant produziert. In einem bevorzugten Verfahren wird das IGF-I kloniert und seine DNA in Bakterien exprimiert, z. B. durch ein in EP 128.733 , veröffentlicht am 19. Dezember 1984, beschriebenes Verfahren.
Wie hierin verwendet, wird unter „genetisch markiert" das Aufweisen von einem oder mehreren genetischen Markern oder chromosomalen Markern verstanden, die bewirken, dass ein Stamm, in dem der/die Marker vorhanden ist/sind, eine Kohlenhydratquelle nicht als Substrat verwendet.
Unter dem Begriff „Kohlenhydratquelle" wird jegliche Quelle eines Kohlenhydrats verstanden, einschließlich beispielsweise Ribose, Xylose, Mannose, Maltose, Glucose, Saccharose, Fucose, Fructose, Lactose und Rhamnose. Vorzugsweise ist die Kohlenhydratquelle hierin nicht eine, die in Verbindung mit der Induktion eines Produktions-Promotors des Wirtszellstammes verwendet wird, wie z. B. Lactose oder Arabinose. Insbesondere bevorzugt ist die Kohlenhydratquelle Maltose, Ribose, Fucose oder Rhamnose.
„Kohlenhydratverwertungsrückmutanten oder -suppressoren" sind als jene mutierten Stämme definiert, die in ihren nicht-mutierten Zustand rückmutiert sind oder eine Suppressormutation an einer anderen Stelle erworben haben, typischerweise durch spontane Modifizierung des Wirtsorganismus. Für rückmutierende Genotypen umfasst das im Stamm mutierte Gen einen Kohlenhydratverwertungsweg, der die Fähigkeit hat, das Gen in seine Wildform rückzumutieren. Eine „nicht rückmutierende" Veränderung ist eine genetische Veränderung, die keine Rückmutation des Stamms in dessen nicht-mutierten Zustand bewirkt. Eine „nicht supprimierende" Veränderung ist eine, bei der der Organismus keine Suppressormutation an einer anderen Stelle erwirbt.
„Mikrobielle Wirtszellenstämme, die mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwerten" sind jene Mikroorganismen, die eine normale oder native Fähigkeit zur Verwertung von zwei oder mehreren Kohlenhydraten als Substrate aufweisen, wie z. B. die meisten Bakterien und zumindest einige Pilze und Hefe, einschließlich und nicht einschränkend Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces und Pichia, bevorzugter A. awamori, S. cerevisiae, S. dairensis, Schizosaccharomyces pombe, K. marxianus, K. thermotolerans, C. albicans, C. anatomiae und P. pastoris.
Eine „Probe" von Kultur ist ein kleiner Teil der entnommenen Zellkultur, um den Test hierin durchzuführen.
Der Begriff „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operativ gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die für Mikroorganismen geeignet sind, umfassen einen Promotor, wie z. B. den Alkalische Phosphatase-Promotor für Bakterien, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle.
Eine Nucleinsäure ist „operativ gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Prä-Sequenz oder einen Sekretionsleader operativ an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Prä-Protein exprimiert wird, das sich an der Sekretion des Polypeptids beteiligt; ein Promotor oder Enhancer ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, das die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operativ gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Wenn solche Stellen nicht vorkommen, werden die synthetischen Oligonucleotid-Adaptoren oder -Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" wechselseitig verwendet, und alle solchen Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Folglich umfassen die Ausdrücke „Transformanten" und „transformierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und davon hergeleitete Kulturen ohne Berücksichtigung der Anzahl von Transfers. Es versteht sich weiters, dass wegen beabsichtigter oder unbeabsichtigter Mutationen nicht alle Nachkommen hinsichtlich des DNA-Gehalts genau identisch sein müssen. Mutierte Nachkommen, die dieselbe Funktion oder biologische Aktivität wie diejenige aufweisen, auf die hin in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden ist, sind umfasst. Wo eindeutige Bezeichnungen beabsichtigt sind, wird es aus dem Zusammenhang klar sein.
Die Technik der „Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" bezieht sich, wie hierin verwendet, im Allgemeinen auf ein Verfahren, worin geringste Mengen eines speziellen Stücks Nucleinsäure, RNA und/oder DNA wie im US-Patent Nr. 4.683.195, erteilt am 28. Juli 1987, beschrieben amplifiziert werden. Im Allgemeinen muss Sequenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus verfügbar sein, so dass Oligonucleotidprimer konstruiert werden können; diese Primer sind üblicherweise bezüglich der Sequenz entgegengesetzten Strängen des zu amplifizierenden Templats ähnlich oder mit ihnen identisch. Die 5'-terminalen Nucleotide der beiden Primer können sich mit den Enden des amplifizierten Materials decken. PCR kann verwendet werden, um spezielle RNA-Sequenzen, spezielle DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA und cDNA, transkribiert aus zellulärer Gesamt-RNA, Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen usw. zu amplifizieren. Siehe im Allgemeinen Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987); Erlich (Hrsg.), PCR Technology, Stockton Press, NY (1989). Für einen neueren Überblick über PCR-Fortschritte, siehe Erlich et al., Science 252, 1643–1650 (1991).
Wie hierin verwendet wird PCR als ein, jedoch nicht als das einzige Beispiel eines Nucleinsäurepolymerasereaktionsverfahrens zur Amplifikation einer Nucleinsäure-Testprobe betrachtet, das die Verwendung einer bekannten Nucleinsäure als Primer und eine Nucleinsäurepolymerase verwendet, um ein spezielles Stück Nucleinsäure zu amplifizieren oder zu erzeugen.
„Minimalmedium" bezieht sich auf für Platten ausgelegtes Kulturmedium, das eine minimal notwendige Menge von Mediumsinhaltsstoffen aufweist, um Kolonien von Zellen zu züchten. Typischerweise ist ein solches Medium Minimalagarmedium. Ein Beispiel ist Medium, das pro Liter ungefähr 0,1–0,2 g MgSO₄-Heptahydrat, ungefähr 15 g Bacto-Agar, ungefähr 10 mM NH₄Cl, ungefähr 10–12 g K₂HPO₄, ungefähr 4–5 g KHP₂O₄ und ungefähr 0,5 g Natriumcitratdihydrat enthält.
Art und Weisen der Durchführung der Erfindung
Der Test dieser Erfindung umfasst ein Mehrschrittverfahren zum Identifizieren verunreinigender Mikroorganismen in einer Kultur. In einem ersten Schritt wird ein mikrobieller Wirtszellenstamm, der mehr als eine Kohlenhydratquelle wie oben definiert verwertet, in Kulturmedium in einem geeigneten Gefäß zum Aufzüchten der Zellen kultiviert. Dieser Stamm enthält Nucleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, dessen Produktion erwünscht ist. Er ist weiters genetisch markiert, so dass der Stamm eine Kohlenhydratquelle als Substrat nicht verwertet.
Auf herkömmliche Weise werden Fermentationsparameter verwendet und die Polypeptidproduktion durchgeführt, wie z. B. nach den unten beschriebenen Verfahren. Während des Verfahrens zur Produktion des Polypeptids von Interesse ist/sind der/die genetische(n) Marker, falls es sich um eine Mutation oder Veränderung handelt, stumm, da der Mikroorganismus das Kohlenhydrat während des Fermentationsprozesses nicht antrifft.
I. Fermentation
A. Insertion von Nucleinsäure in einen replizierbaren Vektor
Die für das Polypeptid von Interesse kodierende Nucleinsäure ist geeigneterweise cDNA oder genomische DNA aus irgendeiner Quelle unter der Voraussetzung, dass sie für das/die Polypeptid(e) von Interesse kodiert, und ist im Allgemeinen eine native Sequenz.
Die heterologe Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA) wird in geeigneter Weise in einen replizierbaren Vektor zur Expression im Mikroorganismus unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors insertiert. Es sind viele Vektoren für diesen Zweck verfügbar, und die Wahl des geeigneten Vektors hängt üblicherweise von der Größe der in den Vektor zu insertierenden Nucleinsäure und von der mit dem Vektor zu transformierenden speziellen Wirtszelle ab. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten in Abhängigkeit von der speziellen Wirtszelle, mit der er kompatibel ist. In Abhängigkeit von der speziellen Art des Wirten umfassen Vektorkomponenten im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies hergeleitet sind, in Verbindung mit mikrobiellen Wirten verwendet. Der Vektor trägt für gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die fähig sind, für eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E.-coli-Spezies hergeleitet ist (siehe z. B. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein Phage enthält im Allgemeinen auch Promotoren oder ist so modifiziert, dass er solche Promotoren enthält, die vom mikrobiellen Organismus zur Expression der selektierbaren Markergene verwendet werden können.
(i) Signalsequenz-Komponente
Die DNA, die für das Polypeptid von Interesse hierin kodiert, kann nicht nur direkt, sondern auch als Fusion mit einem anderen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid, das eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Polypeptids aufweist, exprimiert werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil der Polypeptid-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die gewählte heterologe Signalsequenz sollte eine sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d. h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird.
Für prokaryotische Wirtszellen, die die native Polypeptidsignalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz substituiert, die beispielsweise aus einer aus Alkalischem Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzstabilem Enterotoxin-II-Leader bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Für die Hefesekretion kann die native Signalsequenz z. B. durch die Hefe-Invertase-, Alpha-Faktor- oder Saure Phosphatase-Leader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal substituiert werden.
(ii) Replikationsstartpunkt-Komponente
Expressionsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Reihe von Bakterien und Hefe wohl bekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien und der 2μ-Plasmid-Startpunkt für Hefe geeignet.
(iii) Selektionsgen-Komponente
Expressionsvektoren enthalten im Allgemeinen ein Selektionsgen, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder Wachstum transformierter, in einem selektiven Kulturmedium gezüchteter Wirtszellen notwendig ist. Nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformierte Wirtszellen werden im Kulturmedium nicht überleben. Dieser selektierbare Marker ist von den genetischen Markern, wie sie in dieser Erfindung eingesetzt werden und definiert sind, getrennt. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren, die nicht jene sind, die von der Gegenwart des/der genetischen Marker(s) verur sacht sind, oder (3) kritische Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodierende Gen.
Ein Beispiel eines Selektionsschemas setzt ein Arzneimittel ein, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. In diesem Fall produzieren jene Zellen, die erfolgreich mit der Nucleinsäure von Interesse transformiert sind, ein Polypeptid, das Arzneimittelresistenz verleiht, und überleben folglich das Selektionsregime. Beispiele solch dominanter Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin (Southerm et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sudgen et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985)). Die drei oben angegebenen Beispiele setzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle ein, um Resistenz gegen das geeignete Arzenimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum auf Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellgenom stellt dann eine effektive Umgebung zur Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. Gleichermaßen werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide komplementiert.
(iv) Promotor-Komponente
Der Expressionsvektor zum Produzieren des Polypeptids von Interesse enthält einen geeigneten Promotor, der vom mikrobiellen Wirtsorganismus erkannt wird und operativ an die für das Polypeptid von Interesse kodierende Nucleinsäure gebunden ist.
Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), das Arabinose-Promotorsystem (Guzman et al., J. Bacteriol. 174, 7716–7728 (1992)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) und EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Es sind jedoch auch andere bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind publiziert worden, wodurch es einem Fachkundigen möglich ist, sie operativ an DNA zu ligieren, die für das Polypeptid von Interesse kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), wobei Linker oder Adaptoren verwendet werden, um irgendwelche erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen.
Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten im Allgemeinen auch eine Shine-Dalgarno-(S. D.-) Sequenz, die operativ an die für das Polypeptid von Interesse kodierende DNA gebunden ist. Der Promotor kann von der bakteriellen Quell-DNA durch Restriktionsenzymverdau entfernt und in den die gewünschte DNA enthaltenden Vektor insertiert werden.
Promotorsequenzen sind für Eukaryoten, wie z. B. Hefe und Pilze, bekannt. Nahezu alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich ungefähr 25 bis 30 Basen stromauf der Stelle befindet, wo die Transkription initiiert wird. Eine andere, 70 bis 80 Basen stromauf des Transkriptionsstarts befindliche Sequenz vieler Gene ist eine CXCAAT-Region, wobei X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein könnte. Alle diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukanotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind in Hitzeman et al., EP 73.657 A , weitergehend beschrieben.
Hefe-Enhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefepromotoren verwendet. Siehe beispielsweise Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), über Enhancer-Elemente zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann in einer Position 5' oder 3' zur Polypeptid-kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich aber vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
(v) Transkriptionsterminations-Komponente
In eukaryotischen Wirtszellen einschließlich Hefe und Pilze verwendete Expressionsvektoren enthalten üblicherweise auch Sequenzen, die für die Termination der Transkription und zum Stabilisieren der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind allgemein aus untranslatierten 5'- und gelegentlich untranslatierten 3'-Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich.
(vi) Konstruktion und Analyse von Vektoren
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form neu ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
Zur Analyse, um korrekte Sequenzen in konstruierten Plasmiden zu bestätigen, werden die Ligationsgemische verwendet, um E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) oder andere Stämme zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert. Es werden Plasmide aus den Transformanten hergestellt, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder nach dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977), oder Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
B. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Geeignete mikrobielle Wirtszellen zum Exprimieren der Vektoren hierin sind Prokaryoten, Hefe und Pilze unter der Voraussetzung, dass sie die oben angeführten Kriterien für Kohlenhydratverwertung erfüllen und wie hierin definiert genetisch markiert sind. Geeignete Prokaryoten umfassen Bakterien, wie z. B. Archaebakterien und Eubakterien, die Gram-negative oder Gram-positive Organismen umfassen. Bevorzugte Bakterien für diesen Zweck sind Eubakterien und bevorzugter Enterobacteriaceae. Beispiele zweckdienlicher Bakterien umfassen jene der Spezies Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla und Paracoccus, z. B. E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa, S. thyphimurium oder Serratia marcescans.
E.-coli-Wirte, die als zu markierende Ausgangswirte geeignet sind, umfassen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31.537). Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Mutierte Zellen irgendwelcher der oben erwähnten Bakterien können ebenfalls als Ausgangswirte eingesetzt werden, die dann markiert werden. Es ist selbstverständlich notwendig, die geeigneten Bakterien unter Berücksichtigung der Replizierbarkeit des Replikons in den Zellen eines Bakteriums zu wählen. Beispielsweise können E.-coli-, Serratia- oder Salmonella-Spezies geeigneterweise als Wirt verwendet werden, wenn wohl bekannte Plasmide, wie z. B. pBR322, pBR325, pACYC177 oder pKN410 verwendet werden, um das Replikon bereitzustellen.
E.-coli-Stamm W3110 ist ein bevorzugter zu markierender Wirt, da er ein gebräuchlicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen sekretieren. Beispiele von zu markierenden bakteriellen Anfangswirten sind gemeinsam mit ihren Genotypen in der unten stehenden Tabelle umfasst:
Ebenfalls geeignet sind die Zwischenglieder bei der Herstellung von Stamm 36F8, 27B4 (US-Patent Nr. 5.304.472) und 35E7 (einem spontanen temperaturresistenten Kolonie-Isolat, der besser als 27B4 wächst) sowie das Zwischenglied bei der Herstellung von Stamm 48A4, Stamm 46H9, in Beispiel III unten beschrieben. Ein weiterer geeigneter Stamm ist der E.-coli-Stamm, der die in US-Patent Nr. 4.946.783, erteilt am 7. August 1990, offenbarte(n) mutierte(n) periplasmatische(n) Protease(n) aufweist.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z. B. filamentöse Pilze oder Hefe, hierin geeignete Wirte unter der Voraussetzung, dass sie die Kohlenhydratverwertungskriterien erfüllen. Saccharomyces cerevisiae oder gemeine Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Jedoch ist eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämmen allgemein erhältlich und hierin zweckdienlich, wie z. B. Saccharomyces dairensis, Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US 4.943.529 ), wie z. B. K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida-Wirte, wie z. B. Candida albicans und Candida anatomiae; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); und filamentöse Pilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)).
In einem bevorzugten Aspekt dieser Erfindung wird der genetische Marker durch Ändern des Genotyps des Stamms erzeugt. Diese Änderung kann nicht-rückmutierend und/oder nicht-supprimierend, rückmutierend oder supprimierend oder eine Kombination davon sein. Außerdem wird der Stamm geeigneterweise mehrere Male mar kiert. Die Fähigkeit des Stamms, mehr als einen Marker aufzuweisen, kann wegen der Ermöglichung einer größeren Sammlung von einzusetzenden Wirten vorteilhaft sein. Der mehrfach markierte Stamm kann Veränderungen in zwei oder mehreren verschiedenen Kohlenhydratverwertungswegen enthalten, wobei beispielsweise Stoffwechselwegenzyme, Transportkomponenten und Regulationskomponenten eingesetzt werden.
Wenn zwei verschiedene Kohlenhydratverwertungswege verwendet werden, kann der Stamm in einer nicht rückmutierenden, nicht supprimierenden Mutation und einer rückmutierenden oder supprimierenden Mutation markiert sein. Ein Beispiel ist jenes, wo die nicht rückmutierende Mutation in der Ribose-Verwertung liegt und die rückmutierende Mutation eine Punktmutation in der Rhamnose-Verwertung ist, wie z. B. eine Δ(rbs7)-Mutation und eine rhaR-Mutation.
Der Stamm kann auch mit zwei nicht rückmutierenden (und nicht supprimierenden) Kohlenhydratmutationen markiert sein. Beispielsweise befindet sich eine nicht rückmutierende Mutation in der Maltose-Verwertung und die andere nicht rückmutierende Mutation in der Ribose-Verwertung, wie z. B. eine Δ(malE)-Mutation und eine Δ(rbs7)-Mutation.
Die Gesamtzahl unabhängig markierter Stämme (TMS), die hergeleitet werden kann, ist eine Funktion der Gesamtzahl von Markern (TM) und der Anzahl von Markern je Stamm (MPS), wie in der folgenden Gleichung dargelegt ist: TMS = (TM)!/(MPS)!(TM – MPS)!
Folglich beträgt die Gesamtzahl unabhängig markierter Stämme mit zwei Markern pro Stamm:
Mit drei Markern pro Stamm beträgt die Gesamtzahl unabhängig markierter Stämme:
Folglich muss ein Bedarf für mehr als zehn markierte Stämme vorhanden sein, bevor es lohnenswert ist, drei Marker in jeden Stamm zu insertieren.
Beispiele markierter, hierin geeigneter Bakterienstämme sind in der unten stehenden Tabelle angegeben.
Von den oben angegebenen sind die Stämme 46D5 und 48A4 bevorzugt.
Die für das Polypeptid kodierende Nucleinsäure wird in die Wirtszelle insertiert. Vorzugsweise wird dies durch Transfizieren und vorzugsweise Transformieren der Wirtszellen mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren und Kultivieren in herkömmlichen, zur Induktion der verschiedenen Promotoren geeignet modifizierten Nährmedien erzielt.
Transfektion bezieht sich auf das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob irgendwelche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Der Begriff „Transfektion" umfasst solche Techniken wie z. B. Transformation, Konjugation und Transduktion. Zahlreiche Verfahren der Transfektion sind dem gewöhnlich Fachkundigen bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation sowie unten beschriebene Transformationsverfahren. Eine erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Tätigkeit dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
Transformation bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, so dass die DNA entweder als extrachromosomales Element oder als chromosomaler Integrant replizierbar ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird Transformation unter Anwendung von für solche Zellen geeigneten Standardtechniken durchgeführt. Die Calciumchlorid verwendende Calciumbehandlung, wie sie im Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben ist, wird im Allgemeinen für prokaryotische Zellen oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Ein weiteres Verfahren zur Transformation setzt Polyethylenglykol/DMSO ein, wie in Chung und Miller, Nucleic Acids Res. 16, 3580 (1988), beschrieben wird. Noch ein weiteres Verfahren ist die Verwendung der als Elektroporation bezeichneten Technik. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt.
C. Kultivieren der Wirtszellen
Zur Produktion des Polypeptids von Interesse verwendete prokaryotische Zellen werden in geeigneten Medien wie allgemein in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben kultiviert. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die mit der für die Expression gewählten Wirtszelle früher verwendet worden sind, und sind dem gewöhnlich Fachkundigen üblicherweise offensichtlich.
Wo Alkalische Phosphatase als Promotor eingesetzt wird, werden die zur Produktion des Polypeptids von Interesse dieser Erfindung verwendeten Bakterienzellen in geeigneten Medien kultiviert, in denen der Alkalische Phosphatase-Promotor partiell oder vollständig wie allgemein z. B. in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben induziert werden kann. Die Kultivierung muss nie in Abwesenheit von anorganischem Phosphat oder bei Phosphatmangelkonzentrationen stattfinden. Zunächst enthält das Medium anorganisches Phosphat in einer Menge, die über der Konzentration für die Induktion der Proteinsynthese liegt und für das Wachstum des Bakteriums ausreicht. Während die Zellen wachsen und Phosphat verwerten, erniedrigen sie die Phosphatkonzentration im Medium, wodurch die Induktion der Synthese des Polypeptids bewirkt wird.
Jegliche weitere notwendigen Mediumskomponenten neben Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganischen Phosphatquellen können in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die für sich alleine oder als Gemisch mit einem anderen Inhaltsstoffen oder Medium, wie z. B. einer komplexen Stickstoffquelle, eingebracht werden. Der pH des Mediums kann ein beliebiger pH von ungefähr 5–9 sein und hängt hauptsächlich vom Wirtsorganismus ab.
Wenn der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, werden die Zellen, damit Induktion eintritt, typischerweise bis zum Erreichen einer optischen Dichte, z. B. einer A₅₅₀ von ungefähr 60–80, kultiviert und die Induktion zu diesem Zeitpunkt initiiert (z. B. durch Zugabe eines Induktors, durch Verarmung einer Mediumskomponente usw.), um die Expression eines für das Polypeptid von Interesse kodierenden Gens zu induzieren.
D. Detektion der Expression
Genexpression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zum Quantifizieren der mRNA- Transkription (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der Sequenzen des Polypeptids. Es können verschiedenste Marker eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P. Jedoch können auch andere Techniken eingesetzt werden, wie z. B. das Verwenden von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer breiten Vielfalt von Markern, wie z. B. Radionukliden, Fluoreszierern, Enzymen oder dergleichen, markiert sein können. Alternativ dazu können Tests oder Gele zur Detektion des Proteins eingesetzt werden.
Zur Sekretion eines exprimierten Genprodukts wird die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die zur Sekretion des Genprodukt hinlänglich sind. Solche Bedingungen umfassen z. B. Temperatur-, Nährstoff- und Zelldichtebedingungen, die die Sekretion durch die Zelle erlauben. Darüber hinaus sind solche Bedingungen jene, unter denen die Zelle grundlegende Zellfunktionen der Transkription, Translation und Passage von Proteinen von einem Zellkompartiment in ein anderes erfüllen kann, wie sie dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
II. Test
Bei der Anwendung dieses Tests bezieht man eine Probe aus der mikrobiellen Fermentationskultur. Wenn die Kultur eine Hochdichte-Fermentationskultur ist, enthält die Probe vorzugsweise ungefähr 10⁸ bis 10¹⁰ koloniebildende Einheiten (CFU) pro ml Kultur. Typischerweise wird die Probe am Ende der Fermentation entnommen, sie kann jedoch zu jedem Zeitpunkt während der Kultivierung entnommen werden. Die Zellen aus der isolierten Probe werden auf eine oder mehrere Platten ausplattiert, die Kulturmedien enthalten, die mit einer der Kohlenhydratquellen ergänzt sind, die von markierten Wirt nicht verwertet werden. Vorzugsweise werden zwei Platten eingesetzt, wobei beide mit einer der vom markierten Wirt nicht verwerteten Kohlenhydratquellen ergänzt sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Platten Minimalmediumsplatten, insbesondere bevorzugt sind sie Minimalagarplatten.
Wenn ein Hochdichte-Fermenter als Kulturgefäß verwendet wird, werden Zellen hauptsächlich in Abhängigkeit von der Art der genetischen Markierung am Wirtszellstamm entweder direkt ausplattiert (vorzugsweise ungefähr 10⁸ bis 10¹¹ CFU/ml Kultur) oder auf ein ausreichendes Maß verdünnt, um die Detektion von Kohlenhydratverwertungs-Rückmutanten oder -Suppressoren zu vermeiden, und auf die Platte(n) aufgetragen. Bei Verdünnung werden die Zellen vorzugsweise reihenverdünnt, beginnend mit ungefähr 10⁸ bis 10¹¹ CFU/ml Kultur und endend mit ungefähr 10⁵ bis 10⁸ CFU/ml Kultur, beispielsweise in Kulturmedium oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Eine Verdünnung ist beispielsweise dann angebracht, wenn die Markermutation eine rückmutierende Mutation ist oder supprimiert werden kann, z. B. durch eine spontane Modifizierung des Wirtsorganismus, so dass eine) Kohlenhydratverwertungs-Rückmutante oder -Suppressor erzeugt wird oder darin resultiert. Die Verdünnung wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Rückmutation oder Suppression der Markermutante nicht die Ergebnisse stört (Falsch-Positive). Die Verdünnung der Probe, so dass ungefähr 10⁶ koloniebildende Einheiten pro ml ausplattiert werden, liefert einen zufrieden stellenden Empfindlichkeitsgrad mit einem adäquaten Sicherheitsspielraum zur Eliminierung von falsch-positiven Ergebnissen. Ein weiterer Grund für die Verdünnung ist einfach die Verminderung der Empfindlichkeit des Tests, falls gewünscht.
Das Kulturmedium auf den Platten kann einzeln oder in Kombination mit Aminosäuren, Spurenelementen, Vitaminen oder Nucleotidbasen in einer Konzentration ergänzt werden, um das Wachstum jeglicher auxotropher Stämme, deren Detektion erwünscht ist, zu ermöglichen. Jeglicher Bestandteil, der von einem Bakterium, wie z. B. E. coli, als alleinige Kohlenstoffquelle verwertet werden könnte, sollte in ausreichend niedriger Konzentration zugegeben werden, so dass sie nicht die Koloniebildung des markierten Stamms ermöglicht.
Danach wird/werden die Platte(n) bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeit inkubiert, um zu ermöglichen, dass eine positive Kolonie für die Detektion, d. h. zuverlässige, genaue Detektion, ausreichend wächst. Die erforderliche Zeitdauer der Inkubation hängt beispielsweise von der Inkubationstemperatur, der Art des Markers und der Art des mikrobiellen Stamms ab. Typischerweise reicht die Temperatur von ungefähr 20 bis 40°C, bevorzugter ungefähr 30–38°C und insbesondere bevorzugt ungefähr 37°C; und die Inkubationszeit reicht von ungefähr 24 bis 120 Stunden, bevorzugter ungefähr 35–90 Stunden, wenn die Temperatur ungefähr 30–38°C beträgt, insbesondere ungefähr 48–72 Stunden, wenn die Temperatur ungefähr 37°C beträgt.
Schließlich wird ein Detektionsschritt eingesetzt, um zu ermitteln, ob irgendeine/irgendwelche Kolonie(n) auf der/den Platte(n) wachsen. Die Gegenwart von Kolonien, die durch visuelle Prüfung leicht ermittelt werden kann, zeigt die Gegenwart verunreinigender mikrobieller Stämme an, da sie üblicherweise auf derjenigen Kohlenhydratquelle wachsen, mit der die Platte(n) ergänzt wurde(n). Im Rahmen der oben dargelegten Richtlinien bezüglich der CFUs der Probe beim Ausstreichen beträgt die Empfindlichkeit des Tests die Detektion von ungefähr 1 von 10⁶ bis 1 von 10¹⁰ Wirtskreuzverunreinigenden Organismen.
Als weiterer Schritt können jegliche detektierten Kolonien als vom kultivierten mikrobiellen Wirtszellstamm oder von einem anderen Stamm stammend identifiziert werden. Wenn beispielsweise der gewünschte Wirtsstamm ein E. coli ist, könnten diese Organismen als E.-coli- oder Nicht-E.-coli-Verunreinigungen weiter identifiziert werden. Wenn die Kolonien von einem E.-coli-Wirtsstamm herrühren, kann man durch seine einzigartige Kohlenhydratverwertungsfähigkeit festlegen, um welchen Wirtsstamm es sich handelt. Daher kann man festlegen, welches verunreinigende, vermutlich heterologe Polypeptid vom gewünschten Produkt abgetrennt werden muss, da das Polypeptid üblicherweise vom verunreinigenden Stamm produziert wird und daher mit ihm assoziiert ist oder identifiziert wird.
In einem Aspekt dieses Identifizierungsprozesses, werden nach dem Detektionsschritt lediglich auf dem ergänzten Kulturmedium wachsende Kolonien aus dem ergänzten Kulturmedium gewonnen oder entfernt und auf einem Feld oder Test verschiedener Arten von Kohlenhydraten ausplattiert, um jegliche kontaminierenden Wirtszellen über ihre speziellen, einzigartigen Kohlenhydratverwertungsdefizienzen zu identifizieren.
Der Test hierin ist auch besonders in einem Verfahren zum Fertigen mehrerer Polypeptide in einem einzigen Kulturgefäß oder in einer einzigen Analage zweckdienlich, so dass verbleibende Wirtszellen, die eine Art von Polypeptid produzieren, eine Wirtszellkultur, die eine andere Art von Polypeptid produzieren, nicht verunreinigen. Der Test wird wie oben beschrieben über den Detektionsschritt durchgeführt. Falls irgendwelche positive Kolonien auf der/den Platte(n) wachsen, wird der Operator dann üblicherweise ermitteln, ob der Ansatz verworfen werden muss oder weiter verwendet werden kann. Nachdem der erste mikrobielle Wirtszellstamm vollständig kultiviert worden ist, wird der Inhalt des Kultivierungsgefäßes entleert und das Gefäß gereinigt und sterilisiert. Dann wird ein zweiter mikrobieller Wirtszellstamm eingebracht und im selben oder in einem benachbarten Kultivierungsgefäß kultiviert. Dieser zweite Stamm enthält Nucleinsäure, die für ein zweites Polypeptid kodiert, und ist durch (einen) andere(n) Marker genetisch markiert als derjenige/diejenigen, der/die beim Kultivieren des ersten Stamms verwendet worden ist/sind. (Ein) solcher) Marker bewirkt/bewirken, dass der Stamm keine andere Kohlenhydratquelle als Substrat verwertet. Dieser zweite Stamm ist fähig, die erste Kohlenhydratquelle als Substrat zu verwerten.
Das Verfahren zum Herstellen von mehr als einem Polypeptid im selben Fermenter umfasst weiters die Schritte des Isolierens und Ausstreichens einer Probe der das zweite Polypeptid produzierenden Zellkultur auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle ergänzt ist, die vom zweiten Wirtszellstamm nicht verwertet wird; das Inkubieren der Platte(n) bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichen, damit jegliche positive Kolonien zur vollen Größe anwachsen; sowie das Detektieren, ob auf der/den Platte(n) irgendwelche Kolonien wachsen. Alle diese Schritte werden wie oben beschrieben durchgeführt.
Nach dem Entleeren, Reinigen und Sterilisieren des Kultivierungsgefäßes können die obigen Schritte beginnend mit dem Kultivierungsschritt unter Verwendung eines dritten oder weiteren Stamms, der eine dritte Kohlenhydratquelle nicht als Substrat verwertet, jedoch zur Verwertung der ersten und zweiten Kohlenhydratquelle als Substrat fähig ist, wobei alle Substrate verschieden sind, unbegrenzt wiederholt werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration bereitgestellt und schränken die Erfindung nicht ein.
III. Beispiele
Konstruktion von Stämmen
Genetisch markierte Stämme wurden durch Einführen einer Deletionsmutation in einen Kohlenhydratverwertungsweg in den Wirt konstruiert. Deletionsmutationen wurden (1) durch PCR in vitro konstruiert und in das Chromosom rekombiniert oder (2) aus einer äußeren Quelle erlangt und durch P1-Transduktion in den E.-coli-Wirt eingeführt. Die mittels PCR konstruierten Gendeletionen wurden erzeugt, indem Oligonucleotide verwendet wurden, um die beiden Enden des Gens zu erzeugen, und indem ungefähr 500 bp im inneren Abschnitt des Gens entfernt wurden. Die beiden Enden des Gens wurden über eine SpeI-Verbindung miteinander ligiert. Das die Deletion enthaltende Fragment wurde in pS1080 subkloniert. pS1080 weist einen RK6-oriR-Replikationsstartpunkt, die multiple Klonierungsstelle und die intergenetische Region des Bakteriophagen f1, das β-Lactamase-Gen aus PBR322 und das sacB-Gen aus Bacillus subtilis auf. Mittels M13-Transduktion und Carbenicillin-Selektion wurde das gesamte Plasmid in das Chromosom eines W3110-Abkömmlings rekombiniert, der üblicherweise die unabhängige Replikation des Plasmidvektors nicht un terstützt. Anschließende P1-Transduktion wurde verwendet, um das in das Chromosom integrierte Deletionsplasmid in andere E.-coli-Wirts-Hintergründe mittels Carbenicillin-Selektion zu integrieren. Um Plasmid-Lösemittel zu erhalten, wurden Saccharose-resistente Abkömmlinge bei Raumtemperatur selektiert und dann auf Verlust von Carbenicillin-Resistenz hin gescreent. Es wurde mittels PCR bestätigt, das chromosomale DNA aus Saccharose-resistenten Carbenicillin-empfindlichen Kolonien die beabsichtigte Deletion tragen. Der Kohlenhydrat-negative Phänotyp wurde auf MacConkey-Agar mit 1% des gewünschten Zuckers ebenfalls bestätigt.
BEISPIEL I
Mit einer einzigen nicht rückmutierenden Kohlenhydratmutation markierter Stamm
In diesem Beispiel wird ein empfindlicher Test zur Detektion verunreinigender Organismen in einer Produktionsanlage für mehrfache Verwendung beschrieben. Der Produktionsorganismus war mit einer einzigen nicht rückmutierenden Mutation in einem Kohlenhydratverwertungsweg markiert. Die Auswirkung der Mutation war in der rekombinanten Proteinproduktionsphase stumm; jedoch konnte beim anschließenden Testen der markierte Organismus durch einen einfachen Kohlenhydratverwertungstest von anderen potentiellen kreuzverunreinigenden E.-coli-Organismen unterschieden werden.
Stamm 37D6, der von E.-coli-K-12 W3110 hergeleitet war, trägt ein Plasmid, das rekombinantes Protein produziert. Mit dem Genotyp W3110 IN(rrnD-rrnE)1 ΔfhuA phoA ΔE15 Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41(kan^R) ΔompT ilvG2096^R Δ(rbs7) ist 37D6 vom in der Patent-Nr. 5.288.931 beschriebenen Stamm 27C7 hergeleitet und hat die Nr. 55.244 der American Type Culture Collection. Die Δ(rbs7)-Mutation (Lopilato et al., J. Bacteriol. 158, 665–673 (1984)) wurde durch P1-Cotransduktion eingeführt, so dass dieser Wirt von anderen rekombinanten Wirten durch einen einfachen Kohlenhydratverwertungstest unterschieden werden konnte. Die rbs-Deletion wurde mittels Cotransduktion mit einer verbundenen Tn10-Insertion in das ilv-Gen eingeführt. Die Isoleucin/Valin-Auxotrophie wurde zur Prototrophie transduziert, indem der P1-Phage verwendet wurde, der auf einem Stamm gezüchtet wurde, der die ilvG2096^R-Mutation (Lawther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 922–925 (1981)) trägt, die eine Rasterverschiebung repariert, die die Valin-Empfindlichkeit des E.-coli-Stamms K-12 der Wildform verursacht. Die Anwesenheit des Riboseverwertungsdefekts im resultierenden 37D6 wurde unter Verwendung von Ribose als Kohlenstoftquelle enthaltendem Minimalmedium bestätigt.
Eine Probe vom Ende einer (im Wesentlichen wie im US-Patent Nr. 5.288.931 beschrieben durchgeführten) 10-L-Fermentation wurde mittels aseptischer Technik erhalten und vor dem Ausstreichen bei 4°C gelagert. 10fach-Reihenverdünnungen in PBS wurden bereitet. Insgesamt 0,1 ml Probe wurde auf 0,2%–0,4% Ribose als Kohlenstoffquelle enthaltendes Minimalmedium ausplattiert. Die Zusammensetzung des Mediums enthält pro Liter: 10 mM NH₄Cl; 11,27 Gramm K₂HPO₄; 4,83 Gramm KH₂PO₄; 0,5 Gramm Natriumcitrat-Dihydrat; 0,123 Gramm MgSO₄-Heptahydrat; 15 Gramm Bacto-Agar; und 0,2%–0,4% der gewünschten Kohlenstoftquelle. Die Platten wurden bei 37°C für ungefähr 48–72 Stunden inkubiert. Diese Zeitspanne reicht aus, damit eine positive Kolonie auf eine Größe anwächst, die leicht detektierbar ist. Eine Kontrollkultur, die Ribose verwerten konnte, wurde verwendet, um positives Wachstum auf diesem Medium zu bestätigen.

Koloniebildende Einheiten, d. h. die Zellpopulationsdichte (CFU/ml), wurde für zwei Fermentationen bestimmt. Der Fermentationslauf SI275 wies 1,0 × 10¹⁰ CFU/ml auf, und der Fermentationslauf SI276 wies 4,0 × 10¹⁰ CFU/ml auf. Es wurden CFU von ungefähr 10⁹ bis 10⁴ pro Platte ausplattiert. Es wurden keine Kolonien beobachtet, wie in Tabelle 1 angegeben ist. Die Kontrollkultur wuchs auf den Riboseplatten wie erwartet. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Δ(rbs7)-Mutation nicht rückmutierend und nicht supprimierend ist. Kompensationsmutationen, die ein Wachstum auf Ribose ermöglichen könnten, wurden ebenfalls nicht detektiert. Folglich könnte eine 10⁹ CFU/Platte des gewünschten Organismus enthaltende Kultur ausplattiert wer den, und die Empfindlichkeit des Tests mit einer nicht rückmutierenden Mutation, wie z. B. dieser einen, wäre ungefähr ein verunreinigender Organismus auf 10⁹ ausplattierte Zellen. Tabelle 1

37D6 CFU	Detektierte Kolonien
Fermentation SI275
1 × 10⁹	keine Kolonien
1 × 10⁸	keine Kolonien
1 × 10⁷	keine Kolonien
1 × 10⁶	keine Kolonien
1 × 10⁵	keine Kolonien
1 × 10⁴	keine Kolonien
Fermentation SI276
4,0 × 10⁹	keine Kolonien
4,0 × 10⁸	keine Kolonien
4,0 × 10⁷	keine Kolonien
4,0 × 10⁶	keine Kolonien
4,0 × 10⁵	keine Kolonien
4,0 × 10⁴	keine Kolonien

BEISPIEL II
Mehrfach markierter Stamm mit einer nicht rückmutierenden und einer rückmutierenden (Punktmutation) Kohlenhydratmutation
Um die Anzahl von markierbaren Produktionsstämmen zu erhöhen, können die Stämme mehrfach markiert werden. Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung doppelt markierter Stämme. Jeder Produktionsorganismus enthielt Mutationen in zwei Kohlenhydratverwertungswegen. In diesem Beispiel wurde der Produktionsorganismus mit einer nicht rückmutierenden Mutation (Riboseverwertung) und einer rückmutierenden Mutation (Punktmutation der Rhamnoseverwertung) markiert. Die Rückmutation der Punktmutation wurde im Ausmaß von ungefähr einer Rückmutante auf 10⁸ ausplattierte Zellen festgestellt. In diesem Fall wurde die Verdünnung des Produktionsstammes auf ein ausreichendes Maß unter der Detektion von Rückmutanten bevorzugt. Spiking-Untersuchungen mit Organismen, die entweder Ribose oder Rhamnose und Ribose verwerten können, zeigten an, dass dieser Test genauso empfindlich ist, wie man aus der Anzahl von auf die Unterlage des nicht verwertenden Organismus ausplattierten, gespikten Organismen erwarten kann.
Der in diesem Beispiel verwendete Stamm war ein Abkömmling von E.-coli-K-12 W3110 (der ein Plasmid trägt, das ein rekombinantes Protein produziert).
Stamm 46D5, W3110 IN(rrnD-rrnE)1 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 (ΔPst1-kan^S) ΔompT phoS*(T10Y) cyo::kan^R rhaR Δ(rbs7) ilvG2096^R wurde vom Stamm 27C7 hergeleitet (siehe oben). Die zusätzlichen Schritte der Konstruktion des Stamms 46D5 sind unten dargelegt.
Die Tn10-Insertion im ilv-Gen wurde mittels P1-Transduktion in 27C7 eingeführt. Die Isoleucin/Valin-Auxotrophie wurde zur Prototrophie transduziert, indem der P1-Phage verwendet wurde, der auf einem Stamm gezüchtet wurde, der die ilvG2096^R-Mutation (Lawther et al., siehe oben) trägt, die eine Rasterverschiebung repariert, die die Valin-Empfindlichkeit des E.-coli-Stamms K-12 der Wildform verursacht. Der resultierende Stamm war 43D3. Der ilvG2096^R-Locus wurde durch die Resistenz des 43D3-Wirts gegen 40 μg/ml Valin (0,3 mM) bestätigt.
Die degP41(ΔPst1-kan^R)-Mutation wurde mittels P1-Transduktion durch eine degP41(ΔPst1-kan^S)-Mutation ersetzt. Ein proAB::Tn10, das mit degP verbunden ist, wurde in 43D3 eingeführt. Der Prolin-Auxotroph wurde unter Verwendung eines auf einem die degP-kan^S-Mutation tragenden Stamm gezüchteten P1-Phagen zur Prototrophie transduziert. Da degP durch Cotransduktion an fhuA gebunden ist, wurde vom neuen Stamm 43E7 bestätigt, dass er die Resistenz gegen den Bakteriophagen T1 beibehält.
Das Gen der Alkalischen Phosphatase der Wildform wurde in diesen Wirts-Hintergrund neu eingeführt, um aus den Vorteilen Nutzen zu ziehen, die aus der unten beschriebenen phoS*-Mutation erlangt worden sind. Es wurde P1-Cotransuktion einer Tn5-Insertion in das proC-Gen mit PhoA⁺ eingesetzt, um das Alkalische Phosphatase-Gen der Wildform in diesen Wirts-Hintergrund neu einzuführen. Die P1-Transduktion zur Prolin-Prototrophie stellt das proC-Gen wieder her. Der resultierende Stamm, 44D6, erlangte die Expression der Alkalischen Phosphatase wieder und behielt die für den Lac-Phänotyp verantwortliche Δ(argF-lac)-Mutation bei.
Es wurde eine Mutation eingeführt, die in einem veränderten Phosphatbindungsprotein resultiert, phoS*(T10Y) (US-Patent Nr. 5.304.472). Das phoS*-Protein hatte eine verminderte Affinität für Phosphat im Medium. Das Ergebnis ist, dass die Induktion des Promotors der Alkalischen Phosphatase bei höherer Phosphatkonzentration als in der Wildform auftritt. Dies ermöglicht die Produktexpression aus dem APase-Promotor, ohne die Kultur ernstlich an Phosphat zu verarmen. PhoS ist durch P1-Cotransduktion an ilv gebunden. Eine Tn10-Insertion in das ilv-Gen wurde durch P1-Transduktion neu eingeführt. Die Isoleucin/Valin-Auxotrophie wurde unter Verwendung des auf einem die phoS*(T10Y)- und ilvG2096^R-Mutationen tragenden Stamm gezüchteten P1-Phagen zur Prototrophie transduziert. Die Gegenwart der phoS*-Mutation resultiert in blauen Kolonien auf Agarmedium mit hohem Phosphatgehalt, die das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat enthalten. Der resultierende Stamm war 45F8.
Die cyo::kan^R-Mutation (Oden et al., Gene 96, 29–36 (1990)) im Gen für Cytochromo-oxidase wurde durch Transduktion eingeführt. Die Mutation wurde in vitro durch Ersetzen eines Abschnitts des cyo-Gens durch ein Kanamycin-Resistenzgen konstruiert. Die Einführung dieser Mutation verhindert das Umschalten zwischen den niedrig- und hochaffinen Cytochrom-Oxidasen, cyo bzw. cyd (US-Patent Nr. 5.342.763).
Das Phänomen der Cytochrom-Umschaltung kann zu Instabilitäten des Gelöstsauerstoffs und zu erfolglosen Fermentationsläufen führen. Der resultierende Stamm war 45F9.
Schließlich wurden zwei Mutationen in Kohlenhydratverwertungswegen eingeführt, um die Unterscheidung dieses Wirts von anderen rekombinanten Wirten durch einen einfachen Kohlenhydratverwertungstest zu ermöglichen. Die rhaR-Mutation (Moralejo et al., J. Bacteriol. 175, 5585–5594 (1993)) wurde durch P1-Cotransduktion mit argE eingeführt. Eine agrE::Tn10-Mutation wurde eingeführt. Der Stamm wurde unter Verwendung des am die rhaR-Mutation tragenden Stamm gezüchteten P1-Phagen auf Prototrophie wiederhergestellt. Vom resultierenden Stamm, 46F1 wurde bestätigt, dass er zur Verwertung von Rhamnose als Kohlenstoftquelle unfähig ist.
Die Δrbs7-Mutation (Zitat siehe oben) wurde durch P1-Cotransduktion mit einer verbundenen Tn10-Insertion im ilv-Gen eingeführt. Die Isoleucin/Valin-Auxotrophie wurde unter Verwendung des P1-Phagen an einem die ilvG2096^R-Mutation tragenden Stamm zur Prototrophie transduziert. Die Gegenwart des Riboseverwertungsdefekts im resultierenden Stamm 46D5 wurde unter Verwendung von Minimalmedium bestätigt, das Ribose als Kohlenstoftquelle enthielt. Die Retention von phoS*(T10Y) wurde ebenfalls wie oben beschrieben bestätigt.
Eine Probe vom Ende einer 100-L-Fermentation wurde mittels aseptischer Technik erlangt und wie in Beispiel 1 beschrieben ausplattiert. Die CFU/ml für den Produktionsorganismus betrug 8,5 × 10¹⁰. Wie in Tabelle 2 angegeben, wurden an Ribose enthaltenden Platten für 10⁹ ausplattierte Zellen oder für alle weiteren ausplattierten Verdünnungen keine Kolonien detektiert. Es wurden jedoch Kolonien auf Rhamnose enthaltendem Minimalmedium bei einer Konzentration von 8,2 × 10² CFU/ml detektiert. Rückmutation der Rhamnose-Punktmutation wurde zu ungefähr einer Rückmutante auf 10⁸ ausplattierte Zellen beobachtet.
Tabelle 2 Testen der Wirts-Kreuzverunreinigung für einen IGF-I-Produktionsorganismus
Die Ergebnisse einer Spiking-Untersuchung sind in Tabelle 3 gezeigt. Für den 46D5-Wirt wurden entweder 10⁶ oder 10⁷ CFU auf Rhamnose-Minimalmedium oder Ribose-Minimalmedium ausplattiert. 10fach-Reihenverdünnungen des gespikten Organismus wurden in PBS bereitet. Der gespikte Organismus war entweder ein Rha⁺ Δrbs Δmal (mehrfach markierter Stamm) oder ein Organismus der Wildform (Rha⁺ Rbs⁺ Mal⁺). 0,1 ml der 10^–6-, 10^–7-, 10^–8- und 10^–9-Verdünnungen wurden gemeinsam mit dem Produktionsorganismus ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C 48–72 Stunden lang inkubiert. Die erwarteten Ergebnisse für die Detektion der gespikten Organismen entsprachen den beobachteten Ergebnissen für die Detektion der gespikten Organismen innerhalb der normalen Versuchsfehler. In diesem Beispiel, wo der Produktionsorganismus verdünnt werden muss, um die Detektion von Falsch-Positiven (Rückmutanten oder Suppressoren) zu vermeiden, beträgt die Empfindlichkeit des Tests ungefähr ein verunreinigender Organismus auf 10⁶ oder 10⁷ ausplattierte Zellen.
Tabelle 3 Gespikte Organismen
BEISPIEL III
Mehrfach markierter Stamm mit zwei nicht rückmutierenden Kohlenhydratmutationen
Ein höchst empfindlicher Test kann verwirklicht werden, wenn man einen doppelt markierten Stamm mit zwei nicht rückmutierenden Mutationen verwendet. Der Stamm ist ein 48A4 genannter Abkömmling des E.-coli-Stamms K-12 mit dem Genotyp W3110 ΔfhuA ΔmalE Δ(rbs7). Der Ausgangsstamm E. coli W3110 ist ein Abkömmling von E. coli K-12, der F^– und Lambda ist. Es ist gezeigt worden, dass er eine Inversion des Chromosoms zwischen rrnD und rrnE trägt. Das fhuA-Gen (US-Patent Nr. 5.304.472) wurde aus W3110 durch ungenaues Herausschneiden von Tn10 im Anschluss an seine Insertion in das fhuA-Gen deletiert. Der resultierende Stamm IA2 ist gegen Bakteriophagen T1, T5 und 80 resistent. Zwei Mutationen in Kohlenhydratverwertungswegen wurden eingeführt. Eine Deletion von malE wurde mittels PCR konstruiert und in einen Plasmidvektor, pS1080, eingebaut, der Beta-Lactamase und Levan-Sucrase enthielt. Bass et al., J. Bacteriol. 178, 1154–1161 (1996). Das Plasmid wurde mittels M13-Transduktion und Carbenicillin-Resistenz in das Chromosom eines W3110-Abkömmlings rekombiniert, der die unabhängige Replikation des Plasmidvektors (BW16824) üblicherweise nicht unterstützt. Metcalf et al., Gene 138, 1–7 (1994); Bass et al., siehe oben. Stamm IA2 wurde dann mit dem P1-Phagen auf Carbenicillin-Resistenz transduziert, wobei der P1-Phage auf einem Stamm gezüchtet wurde, der das malE-Deletionsplasmid in sein Chromosom integriert trug. Es wurden Saccharose-resistente Abkömmlinge auf Verlust der Carbenicillin-Resistenz und Unfähigkeit zur Verwertung von Maltose selektiert und gescreent. Vom resultierenden Stamm 46H9 wurde mittels PCR bestätigt, dass er die vorgesehene mal-Deletion trug.
Die Δ(rbs7)-Mutation (Zitat siehe oben) wurde mittels P1-Cotransduktion mit einer verbundenen Tn10-Insertion im ilv-Gen eingeführt. Es wurde ein spontaner Ilv⁺-Prototroph durch Ausstreichen auf Glucose-Minimalmedium erhalten. Der resultierende Stamm wurde 48A4 genannt.
Eine Probe aus einer LB-Übernachtkultur wurde zentrifugiert und mittels aseptischer Technik ungefähr 10fach konzentriert. Es wurden 10fach-Reihenverdünnungen in PBS bereitet. 0,1 ml wurde auf Minimalmedium (oben beschrieben) ausplattiert, das 0,2%–0,4% der in Tabelle 4 angegebenen Kohlenstoffquelle enthielt. Die Platten wurden bei 37°C ungefähr 48 Stunden lang inkubiert.
Die CFU/ml für den Testorganismus 48A4 wurde mit 2,2 × 10¹⁰ CFU/ml ermittelt. Es wurden CFU von 10⁹ bis 10⁵ pro Platte ausplattiert. Wie in Tabelle 4 angegeben, wurden keine Kolonien beobachtet. Die Ergebnisse zeigen die Abwesenheit von Rückmutation oder Suppression der beiden Kohlenhydratmarker an. Folglich konnte eine 10⁹ CFU/Platte enthaltende Kultur des gewünschten Organismus ausplattiert werden, und die Empfindlichkeit des Tests für einen doppelt markierten, nicht rückmutierenden Organismus, wie z. B. 48A4, wäre ungefähr ein verunreinigender Organismus auf 10⁹ ausplattierte Zellen.
Tabelle 4
BEISPIEL IV
Detektion eines verunreinigenden auxotrophen Organismus
Ein Wirts-kreuzverunreinigender Organismus, der eine Aminosäure- oder andere Auxotrophie-Bedingung aufweist, könnte durch Einstellen der Mediumszusammensetzung ebenfalls detektiert werden. In diesem Beispiel wird gezeigt, dass ein Leucin-Auxotroph unter Verwendung der unten beschriebenen Medien detektiert werden kann. 26G5 ist ein Abkömmling von E.-coli-K-12 W3110 ΔfhuA-Stamm, der eine Deletion im leuA enthält. Dieser Organismus, der die Aminosäure Leucin benötigt, wurde für die unten gezeigten Spiking-Versuche verwendet. Leucin wurde dem Minimalmedium in einer Endkonzentration von 0,3 mM zugegeben oder wurde als Teil eines Gemisches von Komponenten (vollständige Ergänzungen) zugegeben, die üblicherweise das Wachstum der meisten auxotrophen E.-coli-Stämme fördern. Die vollständige Ergänzung ist aus Komponenten zusammengesetzt, die vom E.-coli-Organismus bekanntermaßen nicht als alleinige Kohlenstoffquelle verwertet werden. Die Komponenten der vollständigen Ergänzung umfassen: 0,3 mM der Aminosäuren L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glycin, L-Histidin, L-Valin, L-Leucin, L-Methionin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Glutaminsäure, L-Tryptophan, L-Phenylalanin und L-Lysin; 15 μg/ml (0,1 mM) Hypoxanthin, Vitamine (0,2 μg/ml Myo-Inositol, 0,1 μg/ml Pantothenat, 0,1 μg/ml Niacinamid, 0,1 μg/ml Pyridoxal-HCl; 0,1 μg/ml Cholinchlorid; 0,1 μg/ml Folsäure, 0,01 μg/ml Riboflavin, 0,34 μg/ml Para-Aminobenzoesäure und 0,5 μg/ml Thiamin); und Spurenelemente (27 μg/ml Eisen(III)chlorid-Hexahydrat, 8 μg/ml Zinksulfat, 7 μg/ml Cobaltchlorid-Hexahydrat, 7 μg/ml Natriummolybdat, 8 μg/ml Kupfer(II)sulfat-Pentahydrat, 2 μg/ml Borsäure und 5 μg/ml Mangansulfat-Monohydrat).
Die Stammkonstruktionsverfahren für 46D5 und 48A4 sind in Beispielen II bzw. III ausführlich beschrieben. Eine Probe aus einer LB-Übernachtkultur wurde zentrifugiert und mittels aseptischer Technik ungefähr 10fach konzentriert. Es wurden 10fach-Reihenverdünnungen in PBS bereitet. Für den 46D5-Wirt wurden entweder 10⁶ oder 10⁷ CFU auf Rhamnose-Minimalmedium, das nur mit Leucin ergänzt war, oder Rhamnose-Minimalmedium mit vollständigen Ergänzungen ausplattiert.
Für den 48A4-Wirt wurden 10⁹ CFU auf Maltose-Minimalmedium, das nur mit Leucin ergänzt war, oder Maltose-Minimalmedium mit vollständigen Ergänzungen ausplattiert. Es wurden für beide Organismen keine Kolonien in Abwesenheit der gespikten Kultur detektiert.
10fach-Reihenverdünnungen des Leucin-auxotrophen Organismus 26G5 wurden in PBS bereitet, um eine mutmaßliche Verunreinigung zu repräsentieren. Insgesamt 0,1 ml der 10^–6-, 10^–7-, 10^–8- und 10^–9-Verdünnungen wurden gemeinsam mit dem Produktionsorganismus ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C 48–72 Stunden lang inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Spiking-Untersuchungen mit einem Leucin-Auxotrophen zeigen an, dass der Test genauso empfindlich ist, wie man aus der Anzahl gespikter Organismen erwarten kann, die auf einer Unterlage eines nicht verwertenden Organismus ausplattiert worden sind. In dem Fall, wo der Produktionsorganismus nicht verdünnt werden muss, beträgt die Empfindlichkeit ungefähr ein verunreinigender Organismus auf 10⁹ ausplattierte Zellen. Wo erforderlich, muss der Produktionsorganismus verdünnt werden, um die Detektion von Falsch-Positiven (Rückmutanten und Suppressoren) zu verhindern, und in diesem Fall liegt die Empfindlichkeit in der Größenordnung von einem verunreinigendem Organismus auf 10⁶ bis 10⁷ ausplattierten Zellen. Die individuelle Ergänzung mit einer Aminosäure, wie z. B. Leucin, oder eine breitere Ergänzung, die üblicherweise die meisten auxotrophen E.-coli-Stämme detektiert, lieferte ähnliche Ergebnisse.
Tabelle 5

Claims

Verfahren zum Testen auf mögliche Verunreinigungen in einem Kultivierungsgefäß, das zur Herstellung mehrerer Polypeptidprodukte verwendet wird, worin die möglichen Verunreinigungen bakterielle, Hefe- oder Pilz-Wirtszellen sind, die in nativer Form Kohlenhydrate verwerten, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Kultivieren eines Wirtszellenstamms im Gefäß, der mehr als eine Kohlenhydratquelle als Substrat verwertet, der aber genetisch so markiert ist, dass ihm seine native Fähigkeit fehlt, zumindest ein Kohlenhydrat als Substrat zu verwerten, und der Nucleinsäure umfasst, die für das gerade erzeugte Polypeptidprodukt kodiert; (b) das Ausplattieren einer isolierten Probe der Kultur aus Schritt (a) auf Kulturmedium, das mit einer Kohlenhydratquelle, die vom Wirtszellenstamm nicht als Substrat verwertet wird, und mit keinen anderen Kohlenhydratquellen ergänzt ist; (c) das Inkubieren der ausplattierten Zellen bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichen, damit jegliche positive Kolonien bis zu einem detektierbaren Ausmaß wachsen; sowie (d) das Detektieren, ob auf dem ergänzten Kulturmedium irgendwelche Kolonien wachsen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtszellenverunreinigungen und der Wirtszellenstamm bakteriell sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Wirtszellenverunreinigungen und der Wirtszellenstamm E. coli sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Empfindlichkeit etwa eine Verunreinigung in 10⁶ ausplattierten Zellen beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Empfindlichkeit etwa eine Verunreinigung in 10⁷ ausplattierten Zellen beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Empfindlichkeit etwa eine Verunreinigung in 10⁹ ausplattierten Zellen beträgt.