DE112006001097T5

DE112006001097T5 - System für die funktionelle Analyse von Polypeptiden und Analyseverfahren für Polypeptide

Info

Publication number: DE112006001097T5
Application number: DE112006001097T
Authority: DE
Inventors: Ok-Kyu Song; Sung-Key Jang; Vit Kim; Joon-Hyun Kim
Original assignee: PAN BIONET CORP; PAN-BIONET CORP; Academy Industry Foundation of POSTECH
Current assignee: Academy Industry Foundation of POSTECH
Priority date: 2005-04-30
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2008-10-02
Anticipated expiration: 2026-04-28
Also published as: WO2006118394A1; DE112006001097B4; KR100785417B1; WO2006118394A8; US20060246417A1; KR20060113511A

Abstract

Ein System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion, wobei das System folgendes umfasst:
(a) eine nicht-Säugetierzelle, kultiviert in einem nicht-Säugetierzellkulturmedium oder einer nicht-Säugetierzellkultur, die ein heterologes Polypeptid exprimiert, welches entweder das Polypeptid ist, das vorwiegend auf der Zelloberfläche angezeigt wird, oder das sekretorische Polypeptid,
(b) eine Ziel-Säugetierzelle, die ein Reporter-Konstrukt enthält, das spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt, in einem Säugetierzellkulturmedium; und
(c) ein Detektionsmittel zum Detektieren einer Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid, das in der nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, und dem Reporter-Konstrukt,
worin das System für die Analyse der Polypeptid-Funktion durch Detektieren der Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Reporter-Konstrukt verwendet werden kann.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine systematische Herangehensweise an das Exprimieren und Analysieren von Proteinliganden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Co-Kultivierung einer Nicht-Säugetierzelle, welche ein heterologes Polypeptid exprimiert, und einer Zielsäugetierzelle, welche ein Reporterkonstrukt enthält, das auf das Polypeptid reagierend ist, um die Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Reporter, oder einem Element, welches die Expression des Reporters in der Säugetierzelle reguliert, zu detektieren.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Zelloberflächendarstellung von heterologen Proteinen wurde zunächst erzielt durch die Fusion von kleinen Proteinen an das Dockingprotein (pIII) eines Fadenphagen (Smith GP, Science 228:315–1317, 1985). Seitdem wurden andere Oberflächenanzeigesysteme entwickelt und in Bakterien verwendet.
Jedoch werden Hefezellen (d. h. Saccharomyces Cerevisiae) für Oberflächenanzeigesysteme als ideal erachtet, weil 1) Hefe im allgemeinen als sicher betrachtet wird für die Verwendung in Nahrung und pharmazeutischen Anwendungen, 2) die Hefeproteinfaltung und die Sekretionsmechanismen ähnlich zu denjenigen in Säugetierzellen sind, 3) gut entwickelte molekulare Techniken leicht auf Hefezellen anwendbar sind, 4) Hefezellen stabile Zelloberflächen haben, welche eine stabile Anzeige eines Zielproteins via einen Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Anker oder Disulfidbindungen erlauben sollten, und 5) im Gegensatz zu dem Fall in E. Coli, Polypeptide, die in Hefe produziert wurden, nach der Translation glycosyliert werden können, während der Sekretion durch den ER und Golgi-Apparat.
Die GPI Sequenzen von verschiedenen Glucanaseextrahierbaren Proteinen (z. B. die Agglutinine Sagt und Aga1, ebenso wie Flo1, Sed1, Cwp1, Cwp2, Tip1 und Tir1) wurden verwendet, um heterologe Proteine auf den Zelloberflächen der Hefe Saccharomyces Cerevisiae anzuzeigen. Zusätzlich wurden die Signalsequenzen von sezernierten Proteinen mit dem GPI Ankersignal kombiniert, um die Anzeige eines normal sezernierten Proteins auf die Oberfläche von Hefezellen zu lenken (Van der Vaart JM et al., 1997; Washida M. et al., Appl Environ Microbiol. 63 2:615–20, 2001). Ein Vergleich der Einschluß-Kapazität der GPI Ankersequenzen von verschiedenen Glucanaseextrahierbaren Proteinen enthüllte, daß die GPI Ankersequenz von Cwp2 verwendet werden kann, um das irrmobilisierte Protein wirksam auf der Oberfläche von Hefezellen auszusetzen (Van Der Vaart JM et al., 1997).
Verschiedene Peptide und Proteine, einschließlich dem Hepatitis B Virus Oberflächenantigen, Lipase, Glucamylase, α-Glactosidase, grünem fluoreszierendem Protein (GFP), und einzelkettigen Fragment (ScFv) wurden auf den Oberflächen von Hefezellen angezeigt (Schreuder, M.P. et al., Vaccine 14, 383–388, 1996, Boder, E.T., Nat. Biotechnol. 15, 553–557). Diese früheren Berichte schlagen vor, daß Hefeoberflächenanzeigesysteme verwendet werden können als Ganzzellbiokatalysatoren oder lebende orale Impfstoffe, ebenso wie als experimentelle Plattformen für die Untersuchung der Zellbiologie, der Regeneration von immobilisierten Enzymen, der Immobilisierung von Antikörpern etc.
Verschiedene Verfahren zur Analyse der Proteinfunktion wurden verwendet. Ein Verfahren ist, eine Wechselwirkung zwischen Proteinen zu analysieren. Zum Beispiel gibt es ein biochemisches Verfahren, wie zum Beispiel Maldi-TOF (A.C. Gavin, et al, Nature 415:141–147, 2002), das Hefe-Zweihybridsystem unter Verwendung der genetischen Eigenschaften von Hefe (Fields S. et al., Nature 340:245–246, 1989), oder eine intrazelluläre Lokalisierungsanalse (Kumar A. et al., Genes & Dev., 16:707–719, 2002), etc. Zweitens kann die Proteinfunktion von einer Analyse der Proteinstruktur bestimmt werden, worin die Struktur des Proteins selbst oder eines Protein-Ligandverbundwerkstoffs analysiert wird durch Exprimieren des Proteins in einem großen Maßstab. Drittens kann die Proteinfunktion analysiert werden durch die Gen-Knock-Out-Technik, zum Beispiel ein Verfahren, welches eine Zelle oder ein Tier verwendet, das mit SiRNA transformiert wurde, beschrieben in Winzeler E.A. et al., Science 285:901–906, 1999. Um die Proteinfunktion, genauer die Proteinfunktion als ein Ligand, zu analysieren, wurde im Stand der Technik der Proteinligand von einer Zelle abgetrennt, welche ursprünglich den Liganden exprimierte, oder von anderen Zellen wie zum Beispiel E. coli und Bacillus sp. mit Überexpression des Liganden. Desweiteren kann die Proteinfunktion analysiert werden durch ein Verfahren, das spezifisch für das Protein ist. Jedoch erfordert ein solches Verfahren viel Zeit und hohe Kosten für die Reinigung des Proteins.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Untersuchung der Funktion einer möglichen Ligandenaktivität eines Polypeptids ohne Reinigung des Polypeptids aus den Hefezellen, welche das heterologe Polypeptid produzieren, auf ein System zur Untersuchung der Polypeptidfunktion und auf eine Temperatur-empfindliche Hefezelle.
Um das Ziel der vorliegenden Erfindung zu erreichen, liefert die vorliegende Erfindung ein System zur Untersuchung einesr Polypeptidfunktion, in welchem das System folgendes einschließt: (a) eine Nicht-Säugetierzelle, kultiviert in einem Nicht-Säugetierzellkulturmedium oder eine Nicht-Säugetierzellkultur, die ein heterologes Polypeptid exprimiert, das entweder das Polypeptid ist, welches vorwiegend auf der Zelloberfläche gezeigt wird, oder das sekretorische Polypeptid; (b) eine Säugetierzelle, die ein Reporterkonstrukt enthält, das spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt, in einem Säugetierzellkulturmedium; und (c) ein Detektionsmittel für eine Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid, das in der Nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, und dem Reporterkonstrukt. Das System kann verwendet werden zur Analyse der Polypeptidfunktion durch Detektieren der Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Reporterkonstrukt.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptidfunktion bereitzustellen, das folgendes einschließt: Kultivieren einer Nicht-Säugetierzelle und einer Säugetierzelle zusammen in einem Säugetierzellkulturmedium, wo die Nicht-Säugetierzelle ein heterologes Polypeptid exprimiert, das entweder ein heterologes Polypeptid ist, das vorwiegend auf der Zelloberfläche oder in dem sekretorischen Polypeptid angzeigt wird, und wo die Säugetierzelle, die ein Reporterkonstrukt enthält, spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt, und Analysieren der Polypeptidfunktion durch Detektieren der Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid, das in der Nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, und dem Reporterkonstrukt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptidfunktion bereitzustellen, das folgendes einschließt: Kultivieren einer Nicht-Säugetierzelle, die ein heterologes Polypeptid exprimiert, das entweder das Polypeptid ist, das vorwiegend auf der Zelloberfläche angezeigt wird, oder das sekretorische Polypeptid, in einem Nicht-Säugetierzellkulturmedium; Kultivieren einer Säugetierzelle, die ein Reporterkonstrukt enthält, das spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt, in einem Säugetierzellkulturmedium, das mit der Nicht-Säugetierzellkultur konditioniert ist; und Analysieren der Polypeptidfunktion durch Detektieren der Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid, das in der Nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, und dem Reporterkonstrukt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A bis 1D zeigt ein schematisches Diagramm des Zymogandenanalysesystems. Ein Säugetiergen wird heterolog exprimiert in Hefezellen, entweder als eine Zellwand-gebundene Form (1A und 1B) oder eine sekretorische Form (1C und 1D).
2 zeigt die Mengen des sekretorischen Zymo TNF-α (Zymo-sTNF-α), sezerniert von Hefezellen, welche gemessen werden unter Verwendung der Western Blot Analyse mit einem Antikörper gegen TNF-α (Roche).
3 zeigt den Effekt einer Hefezellkultur, die Zymo-sTNF-α auf Expression eines Reportergens (firefly Luciferase) sezerniert, unter der Kontrolle eines NF-KB-reagierenden Elements (4A) und den Effekt einer konditionierten Hefezellkultur.
4 zeigt den Effekt eines konditionierten Hefemediums, das sezerniertes Zymo-sTNF-α enthält, auf kultivierte Säugetierzellen.
5A und 5B zeigt die Morphologie von Hefe- und Säugetierzellen, worin 5A den Vergleich von Hefe- und Säugetierzellen zeigt und 5B zeigt die Expression von Interferon-α auf der Oberfläche von Hefe, und des Interferon-α/β Rezeptors auf der Oberfläche einer HeLa Zelle.
6A bis 6D zeigt die antiviralen Effekte von Zymo-IFN-α auf HCV.
7 bis 7E zeigt die antiviralen Effekte von Hefezellen, die verschiedene Zymo-Liganden auf HCV produzieren.
8 zeigt sekretorisches Zymo-sTGF-β, das die Phosphorylierung von Erk Protein induziert.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER VERANSCHAULICHTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Bedeutungen der hiernach verwendeten Wörter sind wie unten angegeben.
Wie hierin verwendet, beziehen sich "Zelloberflächenanzeige" und "Zelloberflächenexpression" auf ein Protein oder Peptid, das an ein geeignetes Ankermotiv geknüpft ist. Die Anzeige kann auf der Expression eines heterologen Polypeptids basieren, welches an Ankermotive fusioniert ist, welche ihren Einschluß auf der Zelloberfläche lenken. Das rekombinante Proteine, das an das Ankermotiv fusioniert ist, welches in der Wirtszelle exprimiert wird, kann entlang der Zellwand und der Membran unter Führung des Ankermotivs transportiert werden. Die Zelloberflächenanzeige erlaubt, daß die Peptide und Proteine auf der äußeren Oberfläche der Zellen angezeigt werden. Das anzuzeigende Polypeptid kann an ein Ankermotiv fusioniert sein durch N-terminale Fusion, C-terminale Fusion oder durch Sandwich Fusion.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "chimer" auf die Kombination aus zwei Domains.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "konditioneller Mutant" auf eine Mutantensäugetierzelle oder Nicht-Säugetierzelle, welche nicht unter einer speziellen Umgebungsbedingung wachsen kann, in welcher normale Zellen üblicherweise nicht beeinflußt werden. Ein Beispiel für einen konditionellen Mutanten ist eine Temperatur-empfindliche Hefezelle, welche bei einer bestimmen Temperatur, die geeignet ist für das Wachstum von normalen Hefezellen, nicht wächst. Andere konditionelle Mutanten können diejenigen einschließen, die auf andere Umgebungsfaktoren empfindlich sind, wie zum Beispiel pH, Salzbedingungen und so weiter.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "angezeigt" auf das Aussetzen von Polypeptiden, welche entlang der Zellmembran zu der extrazellulären Umgebung transportiert werden durch Verankern an die Oberfläche der Zelle, welche das Gen exprimiert, das das Polypeptid kodiert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Fusionsprotein" auf ein Protein, das erhalten wird durch Exprimieren eines Hybridgens, welches hergestellt wird durch Kombinieren von zwei Gensequenzen. Typischerweise wird dies erzielt durch Klonieren von cDNA in einen Expressionsvektor im Rahmen mit einem existierenden Gen. Ein solches Fusionsgen kann ein Ankerprotein und ein heterologes Polypeptid einschließen, so daß das heterologe Polypeptid auf der äußeren Oberfläche der Zelle angezeigt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "GPI Ankersequenz" auf die Sequenzen, die in Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerten Proteinen wie zum Beispiel Agglutininen Sag1, Aga1, Flo1, Sed1, Cwp1, Cwp2, Tip1 und Tir1 gefunden werden. Das Signal für die GPI-Verankerung ist typischerweise beschränkt auf den C-Terminus des Zielproteins. GPI verankerte Proteine sind vorzugsweise an ihrem C-Terminus durch eine Phosphodiesterbindung von Phosphoethanolamin an einen Trimannosyl-nicht-acetylierten Glucosamin (Man3-GlcN) Kern verknüpft. Das reduzierende Ende von GlcN ist an Phosphatidylinositol (PI) geknüpft. PI kann dann durch eine andere Phosphodiesterbindung an die Zellmembran verankert werden durch seine hydrophobe Region. Intermediäre Formen können auch in hohen Konzentrationen in mikrosomalen Zubereitungen vorhanden sein. Die Fusion der GPI Ankersequenz mit einem Gen erlaubt, daß das fusionierte Genprodukt oder das kodierte Protein auf der Oberfläche der Zelle, welche das Fusionskonstrukt exprimiert, angezeigt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "heterologes Protein" auf ein nicht natives Protein, das durch eine Wirtszelle produziert wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Ligand" oder "Proteinligand" auf irgendein Molekül oder Polypeptidmolekül, das an seinen spezifischen Bindungspartner, einschließlich einem Rezeptorprotein, bindet. Der Ligand kann an sein Rezeptorprotein binden, um einen Komplex zu bilden. Der Ligand kann ein Agonist oder ein Antagonist sein, und er kann eine Aktivität durch seine Bindung stimulieren oder hemmen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Säugetier-" auf den allgemeinen Namen für die warmblütigen Tiere, welche Menschen einschließen und jedes andere Tier, das sein Junges mit Milch ernährt, Haare und ein muskuläres Zwerchfell (Diaphragma) hat. Säugetier schließt auch Ratten, Mäuse, Schweine und Primaten, einschließlich Menschen, ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Medium" oder "Medien" auf das Wachstumsmedium oder Kulturmedium, welches üblicherweise in Lösungsform vorliegt und durch Sterilisation frei ist von allen kontaminierenden Mikroorganismen, und das Substanzen enthält, die für das Wachstum von Zellen oder Organismen erforderlich sind, wie zum Beispiel Bakterien, Protozoen, Algen, Pilze, Pflanzen und Säugetierzellen. Einige Medien bestehen aus komplexen Inhaltsstoffen, wie zum Beispiel Extrakten Pflanzen- oder Tiergewebe (z. B., Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt); andere enthalten exakte Mengen von bekannten anorganischen Salzen und eine oder mehrere Verbindungen (synthetische oder chemisch definierte Medien). Verschiedene Typen von lebenden Zellen oder Gewebekulturen können auch als Medien verwendet werden. Sich teilende Zellen aus verschiedenen Säugetiergeweben können in vitro unter vorsichtiger Laborkontrolle wachsen.
"Säugetierzellkulturmedium" bezieht sich auf ein Medium, das hergestellt wird, um für das Wachstum von Säugetierzellen spezifisch geeignet zu sein durch Einschließen von allen Inhaltsstoffen, die für das Säugetierwachstum erforderlich sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Modulator" auf ein Polypeptid, das die Genexpression oder die Proteinregulierung in der Zielsäugetierzelle beeinflußt. Der Modulator kann seine Zielzelle über ein Rezeptormolekül auf der Zielzelloberfläche binden. Diese Wechselwirkung kann innerhalb der Zielzelle eine Kaskade von Signalen auslösen, welche die Genexpression oder Proteinregulation der Zielzelle verändert. Der Modulator kann die physiologische Aktivität hochregulieren und stimulieren oder er kann die physiologische Aktivität herunterregulieren und hemmen durch Genregulation oder auf dem Proteinlevel.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Nicht-Säugetier-" auf alle lebenden Organismen ausgenommen Säugetierorganismen. Nicht-Säugetierorganismen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Pilze und Bakterien. Pilze schließen ohne Einschränkung Hefen ein, wie zum Beispiel diejenigen, die zu dem Genus Saccharomyces gehören, einschließlich aber nicht beschränkt auf Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, und anderen Typen von Hefe, wie zum Beispiel Candida albicans. Bakterien schließen die Gattungen Pseudomona, Staphylococcus, Bacillus und Escherichia einschließlich E. coli ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Polypeptid" auf jedes Polypeptid, das durch die Nicht-Säugetierzellen angezeigt oder sezerniert wird. Jedes Polypeptid, von dem gewünscht wird, daß es auf seine Effekte auf eine Zielzelle getestet wird, kann verwendet werden. Somit ist die vorliegende Erfindung nicht auf igendein spezielles Polypeptid oder einen Typ von Polypeptid eingeschränkt, so lange das Polypeptid in der Lage ist in einer Nicht-Säugetierzelle exprimiert zu werden, und es in der Lage ist auf der Zelloberfläche angezeigt oder sezerniert zu werden. Die verschiedenen Polypeptide können einschließen, sind aber nicht begrenzt auf Virusoberflächenantigen, Lipase, Glucoamylase, α-Glactosidase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), einzelkettiges Fragment (ScFv), Cytokin, Neurotransmitter, Hormon und Antikörper.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "vorwiegend" auf eine große Menge eines heterologen Polypeptids, welches auf der Zelloberfläche exprimiert und angezeigt wird, verglichen mit den endogenen Proteinen oder Polypeptiden, welche auf der Zelloberlfäche vorhanden sein können. Mit vorwiegend wird mindestens 30% der angezeigten Polypeptide in Erwägung gezogen. Desweiteren können mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% der angezeigten Polypeptide auf der Zelloberfläche als vorwiegend erachtet werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Reporter" auf ein Gen oder Protein. In dem Fall eines Genkonstrukts ist ein transkriptionelles regulatorisches Element an das Gen, das das Reporterprotein kodiert, geknüpft. Der Reporter kann eine kodierende Sequenz sein, angeheftet an heterologe Promoter oder ein anderes Gen-regulatorisches Element und dessen Produkt leicht quantifizierbar untersucht werden kann, wenn das Reporterkonstrukt in Gewebe oder Zellen eingeführt wird. Der "Reporter" bezieht sich auch auf einen Rezeptor, an welchen ein Ligand, welcher heterolog von der Nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, binden kann, so daß der Komplex des Liganden/Reporters visualisiert werden kann, wie zum Beispiel durch Antikörperausfällung.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Zielzelle" auf die Säugetierzelle, die berichtende Elemente enthält.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Temperaturempfindlicher Mutant" auf einen Organismus, der einen Wild-Typ Phenotyp bei einer permissiven Temperatur hat, aber einen Mutantenphenotyp bei einer restriktiven oder nicht permissiven Temperatur.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Hefe-exprimierter Säugetierligand" auf ein Proteinmolekül, das von einer Hefezelle produziert wurde, mit einem Vektor, welcher ein Gen von Säugetierursprung exprimiert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Zymogand" auf den Hefeexprimierten Säugetierliganden.
In dem System zur Untersuchung der Polypeptidfunktion wird ein Zellwand-gebundenes Protein oder sekretorisches Protein als ein Ligand verwendet (Cytokin, Chemokin, Neurotransmitter, Hormon, Antikörper, oder ein Polypeptid mit einer anderen Aktivität).
In dem Fall eines Zellwand-gebundenen Proteins kann eine Temperatur-empfindliche Nicht-Säugetierzelle, wie zum Beispiel Hefe, konstruiert werden, um ein Protein von Interesse in einer Zelle in einer Wand-gebundenen Form zu produzieren (1A und 1B). Das heterologe Gen kann eine N-terminale Signalsequenz und eine GPI Ankersequenz für die Anheftung des Proteins auf der Zelloberfläche enthalten (1A). Die GPI Sequenzen von verschiedenen Glucanase-extrahierbaren Proteine (z. B., die Agglutinine Sag1 und Aga1, ebenso wie Flo1, Sed1, Cwp1, Cwp2, Tip1 und Tir1) wurden verwendet, um heterologe Proteine auf den Zelloberflächen der Hefe Saccharomyces cerevisiae anzuzeigen. Zusätzlich wurden die Signalsequenzen von sezernierten Proteinen mit dem GPI Ankersignal kombiniert, um die Anzeige eines normal sezernierten Proteins auf der Oberfläche von Hefezellen zu lenken (Van der Vaart JM et al., Appl Environ Microbiol. 63(2): 615–620, 1997; Washida M. et al., Appl Microbiol Biotechnol. 56 (5-6):681–686, 2001).
Für das sekretorische Protein kann eine Temperaturempfindliche Nicht-Säugetierzelle konstruiert werden, um ein Protein von Interesse in einer sekretorischen Form zu produzieren (1C und 1D). Säugetierzellen können co-kultiviert werden mit den Nicht-Säugetierzellen, wie zum Beispiel Hefe, oder sie können in konditionierten Medien unter Zugabe der Nicht-Säugetierzellkultur kultiviert werden. In der Verwendung des konditionierten Kulturmediums kann eine Wild-Typ Nicht-Säugetierzelle eher als der Temperatur-empfindliche Mutant verwendet werden für die Expression des sekretorischen Proteins. In diesem Fall kann das Protein von Interesse an eine C-terminale Signalsequenz, aber nicht eine Ankersequenz fusioniert werden (1C).
In der vorliegenden Erfindung wird die Nicht-Säugetierzell-Hefe als ein Beispiel präsentiert. Jedoch soll verstanden werden, daß die Erfindung nicht auf Hefe beschränkt ist. Das Hefe-exprimierte heterologe Polypeptid, das in dieser Erfindung verwendet wird, wird allgemein als ein Zymogand bezeichnet (zymogen-exprimierter Ligand) und das System, das in dieser Erfindung verwendet wird, wird als das Zymogandensystem bezeichnet. Das Zymogandensystem kann verschiedene Komponenten umfassen, einschließlich einem Expressionsvektor, der geeignet ist für die Expression eines Proteins von Interesse in Hefe, Hefezellen, die in der Lage sind, die Expressionsvektoren aufrecht zu erhalten und die kodierten heterologen Proteine zu produzieren, und Säugetierzellen, die geeignet sind zum Messen der Bioaktivität der Hefe-exprimierten Polypeptide.
Der Expressionsvektor ist entweder für die Expression eines Zellwand-gebundenen Proteins, ein Vektor, der einen Hefepromoter enthält, eine Signalsequenz für das targeting des Proteins an das ER Lumen, eine Sequenz für die Integration des sezernierten Proteins in die Hefezellwand, oder ein auxotropher Selektionsmarker (1A). Alternativ kann, für die Expression des sekretorischen Proteins, ein Vektor, der einen Hefepromoter enthält, eine Signalsequenz für das Targeting des Proteins in das ER Lumen, oder ein auxotropher Selektionsmarker verwendet werden (1C).
Die Hefezellen, die in der Lage sind, diese Expressionsvektoren aufrechtzuhalten und die kodierten heterologen Proteine zu produzieren, schließen entweder Temperatur-empfindliche (oder andere konditionell wachsende) Hefezellen, die Zellwand-gebundene Proteine produzieren (1B) oder Wild-Typ-Hefezellen, die sekretorische Proteine produzieren (1D), ein.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine systematische Analyse von Proteinligandaktivitäten von vermeintlichen Genen auf dem genomischen Level möglich. Ein sekretorisches oder Oberflächen-anzeigbares Fusionsprotein wird in kontinuierlich oder konditionell wachsenden Hefezellen (oder anderen unizellulären Organismen) durch die Verwendung eines Fusionsgens exprimiert, und auf seine Fähigkeit getestet, als ein tatsächlicher Ligand zu funktionieren, um eine Säugetierzelle zu beeinflussen über Co-Kultivierung von Hefe und Säugetierzellen, oder Kultivierung von Säugetierzellen in konditionierten Medien von den Hefezellen.
In diesem Assaysystem kann das Nicht-Säugetierzellkulturmedium nicht geeignet sein für die Kultivierung von Säugetierzellen, und das Säugetierzellkulturmedium kann geeignet sein für die Kultivierung von Säugetier- und Nicht-Säugetierzellen. Desweiteren können die Nicht-Säugetierzellen und die Säugetierzellen zusammengemischt werden. Noch weiter können die Nicht-Säugetierzellen Pilzzellen oder prokaryotische Zellen sein, und die Pilzzellen können Hefezellen sein, wie zum Beispiel diejenigen, die zu der Gattung Saccharomyces gehören.
In dem Assaysystem können die Nicht-Säugetierzellen auch ein konditioneller Mutant sein, wie zum Beispiel ein Temperaturempfindlicher Mutant. Die Säugetierzellen sind vorzugsweise menschlichen Zellen.
Um den Effekt der Hefezelle auf die Säugetierzellkultur zu minimieren, wird eine neue Temperatur-empfindliche Mutantenhefe (PBN404) konstruiert, die gut bei 30°C wachsen kann, aber nicht bei 37°C wächst [MATα, ura-52, his3-200, ade2-101::pGAL2-ADE2 trp1-901, leu2-3,112, gal4d, gal80d, met-,ura3:: kanMX6-pGAL1-URA3 :: pGAL1-lacZ.]. Somit geht dem Mutanten das spezifische Nahrungsmittel aus oder er scheidet ein toxisches Material aus, das das Säugetier nicht schädigt, während es wächst. Deshalb kann der Mutant co-kultiviert werden mit der Säugetierzelle bei 37°C für 24 Stunden. Interessanterweise kann, wenn die Mutantenhefezelle in dem Säugetierzellkulturmedium bei 37°C kutiviert wird, der sekretorische Zymogand kontinuierlich exprimiert und sezerniert werden.
Der Temperatur-empfindliche Saccharomyces cerevisiae (PBN 404), der Zymogand auf seiner Zelloberfläche exprimiert, wurde hinterlegt bei der Korean Collection for Type Culture (K.C.T.C.) in dem Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnolgy am 14. April 2006 und er erhielt die Zugangsnummer KCTC10934 BP.
Das Nicht-Säugetierzellkulturmedium ist nicht geeignet zur Kultivierung von Säugetierzellen, und das Säugetierzellkulturmedium ist geeignet für die Kultivierung von Säugetier- und Nicht-Säugetierzellen. Die Kultivierungstemperatur kann zu einem spezifischen Bereich kontrolliert werden, bei welchem die Säugetierzellen wachsen können, aber die Nicht-Säugetierzellen nicht wachsen können.
Die Zymogandenaktivität kann überwacht oder detektiert werden durch verschiedene Assaysysteme, einschließlich aber nicht beschränkt auf: i) Überwachen der hoch- oder runter-Regulierung eines Gens, das durch einen Liganden-regulierten Promoter gesteuert wird, ii) Messen der viralen Genomkopiespiegel (DNA oder RNA) oder Expression eines Reportergens unter der Kontrolle eines Virusgenexpressionssystems (zum Testen der antiviralen Wirksamkeit), iii) Überprüfung der Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines Proteins, das dafür bekannt ist, spezifisch eine Liganden-spezifische Signalkaskade zu vermitteln und iv) Untersuchen der cytosolischen Freisetzung von second messengern, d. h. Kalzium, welches durch Intensitätsveränderungen eines Kalzium-wechselwirkenden Fluoresceins gemessen werden kann.
Spezifisch ist das Detektionsmittel für die Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Reporterkonstrukt gewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Verfahren zur Detektion einer Genexpression durch Verwenden des Reporterkonstrukts, das einen Promoter, der durch das heterologe Polypeptid reguliert wird, und ein Gen, das unter dem Promoter gesteuert wird, umfaßt; (ii) einem Verfahren zur Detektion eines Replikationsspiegels eines viralen Gens, durch Verwenden des Reporterkonstrukts, umfassend ein System zur Replikation eines viralen Gens, reguliert durch das heterologe Polypeptid; (iii) einem Verfahren zur Detektion der Genexpression durch Verwenden des Reporterkonstrukts, umfassend ein System zur Expression eines viralen Gens, reguliert durch das heterologe Polypeptid; und (iv) einem Verfahren zur Detektion der Phosphorylierung/Dephosphorylierung eines Proteins durch Verwenden des Reporterkonstrukts, umfassend ein Protein, dessen Aktivität durch seine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung reguliert wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zur Bestimmung der Funktion des Zellwand-gebundenen Zymoganden, Hefezellen in einem synthetischen vollständigen Medium kultiviert (dem spezifische Aminosäuren fehlen, die für die Plasmidaufrechterhaltung notwendig sind) über Nacht bei 30°C. Das Medium, dem spezifische Aminosäuren fehlen, kann variiert werden, abhängig von dem verwendeten Plasmid. Zum Beispiel wird p423-TNF in einem Medium kultiviert, dem Histidin fehlt, und p425-IFN oder -TNF wird in einem Medium kultiviert, dem Leucin fehlt, aber dies ist nicht darauf beschränkt. Die erhaltene Kultur wird nochmal nach der Verdünnung kultiviert.
Dann werden die Hefezellen geerntet durch Zentrifugation bei 1500 × g für 5 Minuten. Hefezellen wurden in Säugetierzellkulturmedium resuspendiert (1 ml von DMEM), bei 37°C für 2 Stunden kultiviert, und dann mit Säugetierzellen kultiviert, die in der Lage sind auf den Hefe-exprimierten Liganden zu reagieren. Die Hefe- und Säugetierzellen wurden bei 37°C für 1 Minute bis verschiedene Tage co-kultiviert abhängig von dem verwendeten Reporter, und die Zymogandenaktivität wurde durch verschiedene Assaysysteme überwacht.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Funktion des sekretorischen Zymoganden durch das folgende Verfahren bestimmt werden. Wie in dem Verfahren zur Bestimmung des Zellwand-gebundenen Zymoganden beschrieben, wird die Hefezellkultur hergestellt und dann bei 37°C für 2 Stunden behandelt. Dann wird das Hefekulturmedium durch Filtration durch einen Milliporefilter (0,2 μm) wiedergewonnen. Das konditionierte Medium wird dann zu einem Säugetierzellkulturmedium hinzugefügt, welches Säugetierzellen, die das geeignete Reportergen beherbergen, enthält. Alternativ wurden Hefezellen, die die sekretorischen Proteine exprimieren, bei 37°C für 2 Stunden adaptiert und dann direkt zu der Säugetierzellkultur hinzugefügt. Die Säugetierzellen werden weiter bei 37°C für 1 Minute bis mehrere Tage kultiviert, abhängig von dem verwendeten Reporter, und die Zymogandenaktivität wurde wie oben überwacht. Um Zymoganden zu produzieren, verwendeten wir Cwp2, ein Hauptzellwandmannoprotein, als ein Trägerprotein. Hier testeten wir unsere Strategie der Hefeoberflächenpräsentation und/oder der Sekretion von Liganden und der Verwendung der gesamten Hefezelle als eine funktionelle Ligandenversorgung durch Verwenden von menschlichem IFN-α, menschlichem IFN-γ, menschlichem TGF-β3, und menschlichem TNF-α als Modell Zymoganden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß eine direkte Co-Kultivierung von Hefe- und Säugetierzellen verwendet wird, und daß keine zusätzliche Reinigung des Hefe-exprimierten Fusionsproteins erforderlich ist.
1A bis 1D zeigen ein schematische Diagramm des Zymogandenanalysesystems. Ein Säugetiergen wird heterolog in Hefezellen exprimiert, entweder als eine Zellwand-gebundene (1A und 1B) oder sekretorische (1C und 1D) Form.
1A zeigt ein schematisches Diagramm eines Fusionsgens, das einen Zellwand-gebundenen Zymoganden kodiert. Das Säugetierprotein wird in Hefe exprimiert durch Einführen eines hoch-Kopie-Hefeshuttel-Expressionsvektors, der ein Fusionsprotein kodiert, in welchem die Säugetiersequenz mit dem N-terminalen Teil des Cwp2 Proteins (Signalsequenze) und dem C-terminalen Teil des Cwp2 Proteins umgeben ist, welcher direkt das Säugetierprotein an die Hefezellwand verankert (Ram AF et al., PEMS Microbiol Lett. 162(2):249–55, 1998). Um die Fusionsproteinexpression zu erleichtern, wird das Translationsterminationscodon des Säugetiergens deletiert und as Codon, das die letzte Aminosäure des Zielproteins kodiert, wird innerhalb des Rahmens mit dem C-terminalen Teil von Cwp2 verschmolzen.
In 1B wurden empfindliche Hefezellen (PBN404) mit Oberflächenexpression von Zymoganden dann mit Säugetierzellen bei 37°C inkubiert für die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf Säugetierzellen. Der Effekt kann überwacht werden durch Verwenden einer Vielzahl von Techniken, abhängig von dem Reportersystem, welches verwendet wird. Das Reportersystem bedeutet verschiedene Detektionssysteme, die erfunden werden, oder die erfunden werden können, wie zum Beispiel Western Blot, Analyse der Luciferase, Analyse von fluoreszierendem Protein oder eine Messung der Enzymakvität etc.
1C zeigt ein schematisches Diagramm eines Fusionsgens, das einen sekretorischen Zymoganden kodiert. Der verwendete Hefeexpressionsvektor kodiert den N-terminalen Teil des Cwp2 Proteins (Signalsequenz) gefolgt von der Säugetiersequenz, in welcher das Translationsbeendigungscodon erhalten wird.
1D Zymoganden-sezernierende Hefezellen werden mit Säugetierzellen bei 37°C inkubiert, oder alternativ werden Hefezellen in einem Säugetierzellkulturmedium inkubiert, welches dann filtriert wird, und zu den kultivierten Säugetierzellen hinzugefügt wird.
2 zeigt Mengen von Zymo-sTNF-α, sezerniert von Hefezellen. Die Mengen von Zymo-sTNF-α, die in dem Medium sezerniert werden, wurden durch Western Blot Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen TNF-α (Roche) gemessen.
3 zeigt den Effekt von Zymo-sTNF-α-sezernierenden Hefen auf die Expression eines Reportergens (firefly luciferase) unter der Kontrolle eines NF-_κB-reagierenden Elements.
4 zeigt den Effekt von konditioniertem Hefemedium, das sezernierte Zymo-sTNF-α auf kultivierten Säugetierzellen enthält.
5A und 5B zeigt die Morphologie von Hefe- und Säugetierzellen.
5A ist Vergleich von Hefe- und Säugetierzellen.
6 zeigt die antiviralen Effekte von Zymo-sTNF-α gegen HCV.
7A bis 7E zeigt antivirale Effekte von Hefezellen, die verschiedene Zymo-Liganden gegen HCV produzieren.
8 zeigt, daß Zymo-sTGF-β die Phosphorylierung von Erk Protein induziert.
Die folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und nicht als Einschränkung angeboten.
BEISPIEL 1
Espression von Zymogand in Hefezellen
1-1: Konstruktion von transformierten Hefezellen
Um Zymoganden zu produzieren verwendeten wir Cwp2, ein Hauptzellwandmannoprotein, als ein Trägerprotein. Hier testeten wir unsere Strategie der Hefeoberflächenpräsentation und/oder Sekretion von Liganden und der Verwendung der gesamten Hefezelle als eine funktionelle Ligandenversorgung durch Verwenden von menschlichem IFN-α, menschlichem IFN-γ, menschlichem TGF-β3 und menschlichem TNF-α als Modell-Zymoganden.
Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß direkte Co-Kultivierung von Hefe- und Säugetierzellen verwendet wird, und daß keine zusätzliche Reinigung des Hefe-exprimierten Fusionsproteins erforderlich ist.
Um die Effekte der Hefezellen auf die Säugetierzellkulturen zu minimieren, erzeugten wir einen Temperatur-empfindlichen Hefestamm mit dem Namen PBN404 [MATα, ura-52, his3-200, ade2-101:: pGAL2-ADE2 trp1-901, leu2-3, 112, gal4d, gal80d, met-, ura3:: kanMX6-pGAL1-URA3 :: pGAL1-lacZ], welcher bei 30°C wächst, aber nicht bei 37°C, was eine Co-Inkubation der Hefe- und Säugetierzellen bei 37°C für mehr als 24 Stunden erlaubt, ohne nachteilige Effekte, wie zum Beispiel Nährstoffverarmung oder Sekretion von toxischen Materialien durch wachsende Hefezellen.
Der Temperatur-empfindliche Saccharomyces cerevisiae (PBN 404), welcher Zymogand auf seiner Zelloberfläche exprimiert, wurde hinterlegt bei der Korean Collection for Type Culture (K.C.T.C.) in dem Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology am 14. April 2006, und er erhielt die Zugangsnummer KCTC 10934 BP.
Der Hauptstamm für PBN404 ist Y187, welcher das Wild-Typ URA3 Gen trägt (Harper J.W. et al., Cell 75:805–816, 1993). Um das Wild-Typ URA3 Gen zu deletieren, wurde der Hauptstamm in einem 5-FOA-enthaltenden Medium kultiviert, um überlebende Zellen auszuwählen (PBN202).
Um einen Stamm zu erhalten, der URA3 einschließt, dessen Expression unter der Kontrolle eines GAL1 Promoters ist, wurde die genomische DNA von PBN201, welche bei der Korean Collection for Type Culture (K.C.T.C.) in dem Korea Research Institute of Bioscinece and Biotechnology am 5. Januar 2002 hinterlegt wurde, und die Zugangsnummer KCTC 10156 BP als Muster erhielt, unter Verwendung von Primer 1 und Primer OS44 amplifiziert, um den amplifizierten Selektionsmarker kan^R und das GAL1 Promoter-URA3 Gen zu erhalten.

Primer 1: 5'-GGT ATA TAT ACG CAT ATG TGG TGT TGA AGA AAC ATG AAA TTG CCC AGT ATG AAT TCG AGC TCG TTT AAA C-3' (Sequenzidentifikationsnr: 1)
Primer OS44: (5'-TAG GTT CCT TTG TTA CTT CTT CCG CCG CCT CGT TCA AAC C-3' (Sequenzidentifikationsnr: 2)

Die amplifizierte DNA wurde in den PBN202 Stamm eingeführt, und in die ura3 Position des PBN202 Stamms integriert über homologe Rekombination (PBN203).
Zusätzlich wurde, um ADE2 unter die Kontrolle des GAL2 Promoters zu setzen, ein ADE2 Gen amplifiziert unter Verwendung von Primer OS49 und Primer OS50, eingeführt in den PBN203 Stamm, und dann substituiert mit ade2 des PBN203 Stamms über homologe Rekombinanten, um den PBN404 Stamm zu produzieren.

Primer OS49: 5'-GTA AAC ACA AGA TTA ACA TAA TAA AAA AAA TAA TTC TTT CAT AAT GGA TTC TAG AAC AGT TGG-3' (Sequenzidentifikationsnr: 3)
Primer OS50: 5'-CAT GAA AAA TTA AGA GAG ATG ATG GAG CGT CTC ACT TCA AAC GCA PTA CTT GTT TTC TAG ATA AGC-3' (Sequenzidentifikationsnr: 4)

Interessanterweise dauerte die Produktion und Sekretion von Zymoganden durch die existierenden Hefezellen in dem Säugetierkulturmedium bei 37°C an (2). Zum Beispiel wurden ungefähr 0,8 ng von Zymo-TNF-α in das Kulturmedium von 6 × 10⁵ Hefezellen während einer 2 ständigen Inkubation sezerniert, wie durch Western Blot geschätzt (2).
1-2: Testen von Zellwand-qebundenen Zymoganden in Hefezellen
Hefezellen wurden in einem synthetischen vollständigen Medium kultiviert, dem die geeigneten Aminosäuren fehlten. Desweiteren wurden transformierte Hefezellen (PBN404) in einem synthetischen vollständigen Medium (dem spezifische Aminosäuren, die für die Plasmidaufrechterhaltung erforderlich sind, fehlten), über Nacht bei 30°C kultiviert.
Die Medien, denen spezifische Aminosäuren fehlen, sind vielfältig abhängig von dem verwendeten Plasmid. Zum Beispiel wird p423-TNF in einem Medium kultiviert, dem Histidin fehlt, und p425-IFn oder TNF wird in einem Medium kultiviert, dem Leucin fehlt.
Um den Zellwand-gebundenen Zymoganden zu produzieren, wurde das Cwp2 Gen amplifiziert und synthetisiert unter Verwendung des p423-GAL1 Plasmids, hergestellt durch ATCC (U.S.A.) (Mumberg D, R. Nucleic Acids Res. 22:5767–5768, 1994).
Um Restriktionsstellen von Eco RI und Sal I zwischen einem Signalpeptid an dem Amino-terminalen Teil und einem anderen Teil von Cwp2 hinzuzufügen, wurden der Amino-Terminus und ein anderer Teil von Cwp2 sequenziell kloniert. Für diesen Zweck wurden zwei Paare von Primern, OS85F und OS85NR, und OS85CF und OS85, verwendet.

Primer OS85F: 5'-AAA TGA GAA GTT GTT CTG AAC AAA GTA AAA AAA AGA AGT ATA CCT CGA GTT ATA ACA ACA TAG CAG CAG-3' (Sequenzidentifikationsnr: 5)
Primer OS85NR: 5'-CCG AAT TCA GCG GCA ACA AAG TTA GCC-3' (Sequenzidentifikationsnr: 6)
Primer OS85CF: 5'-CCG GTC GAC TCC GCT GCC GCC ATT TCT-3' (Sequenzidentifikationsnr: 7)
Primer OS85R: 5'-AAA TGA GAA GTT GTT CTG AAC AAA GTA AAA AAA AGA AGT ATA CCT CGA GTT ATA ACA ACA TAG CAG C-3' (Sequenzidentifikationsnr: 8)

Um die Expression von TNF-alpha in dem resultierenden Plasmid, p423-GAL1-CWP2 zu kontrollieren, wurde ein funktionelles TNF-alpha amplifiziert und synthetisiert unter Verwendung von menschlichem TNF-alpha als ein Muster, und den Primern TNF-F und TNF-R, und dann mit Eco RI und Sal I geschnitten, um das Plasmid p423-bTNF-alpha, das durch p423-GAL1-CWP2 kloniert wurde, zu erhalten.

Primer TNF-F: 5'-CG GAA TTC GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG-3' (Sequenzidentifikationsnr: 9)
Primer TNF-R (5'-CG GTC GAC CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC-3' (Sequenzidentifikationsnr: 10)

p425-bIFN oder bTNF wurde hergestellt durch Klonieren von IFN oder TNF in p425-GPD Plasmid (ATCC, USA), um unter der Kontrolle eines GPD Promoters zu sein (Mumberg D, R. Gene 158:119–122, 1995). Das heißt, p425-bIFN wurde erhalten durch Amplifizieren von menschlichen IFN-alpha unter Verwendung von Primer hIFNa-2F und Primer hIFNa-R, schneiden mit EcoRI und Sal1, und Klonieren. P425-bTNF wurde hergestellt durch Produzieren von Cwp2-TNF mit Behandlung von p423-bTNF wie oben dargestellt mit Bam HI und XhoI, und Klonieren in p425-GPD.

Primer hIFNa-2F: 5'-CGG AAT TCT GTG ATC TCC CTG AGA CCC ACA GCC-3' (Sequenzidentifikationsnr: 11)
Primer HIFNa-R: 5'-CGG TCG ACT TCC TTC CTC CTT AAT CTT TCT. TCG-3' (Sequenzidentifikationsnr: 12)

Die Zymoganden waren in Zellwand-gebundener Form aufgrund des GPI von Cwp2, welches als b- entwickelt wurde (zum Beispiel Zymo-bTNF-).
Das Verfahren der Herstellung eines Plasmids zum Exprimieren des sekretorischen Zymoganden (zum Beispiel Zymo-sIFN- oder Zymo-sTNF-) ist im wesentlichen dasselbe wie bei dem Plasmid für den Zellwand-gebundenen Zymoganden, außer das die Rückwärtsprimer die für die Amplifizierung von jedem IFN- und TNF- verwendet wurden, die Primer hIFNa-2R bzw. TNF-2R waren.

Primer hIFNa-2R: 5'-CGG TCG ACT TAT TCC TTC CTC CTT AAT CTT TCT TGC-3' (Sequenzidentifikationsnr: 13)
Primer TNF-2R: 5'-CGG TCG ACT TAC AGG GCA ATG ATC CCA AAG TAG AC-3' (Sequenzidentifikationsnr: 14)

Die Hefezellen wurden mit den resultierenden Plasmiden transformiert und dann kultiviert zum Testen des Effekts des Zymoganden.
Die resultierenden Kulturen wurden auf eine optische Dichte (OD)₆₀₀ von 0,4 verdünnt, weiter auf eine OD₆₀₀ = 1,3 gezüchtet, und dann durch Zentrifugation bei 1500 × g für 5 Minuten geerntet. Die erhaltenen Hefezellen wurden re-suspendiert in Säugetierzellkulturmedium (1 ml von DMEM), und bei 37°C für 2 Stunden kultiviert. Die Spur 2 der 2 zeigt das Ergebnis von Hefezellen, die Plasmid p423-bTNF-α exprimierendes Zellwandgebundenes Zymo-bTNF-α enthielten.
Dann wurden die Hefezellen co-kultiviert mit Säugetierzellen, die in der Lage sind auf den Hefe-exprimierten Liganden zu reagieren. Die Hefe- und Säugetierzellen wurden co-kultiviert bei 37°C für 1 Minute bis mehrere Tage, abhängig von dem verwendeten Reporter, und die Zymogandenaktivität wurde durch verschiedene Assaysysteme überwacht.
1-3: Testen von sekretorischen Zymoganden in Hefezellen
Transformierte Hefezellen (PBN404) wurden in synthetischem vollständigen Medium (dem spezifische Aminosäuren fehlten, die notwendig sind für die Plasmiderhaltung) über Nacht bei 30°C kultiviert.
Die Medien denen spezifische Aminosäure fehlten, können variiert werden, abhängig von dem verwendeten Plasmid. Zum Beispiel wird p423-TNF in einem Medium kultiviert, dem Histidin fehlt und p425-IFN oder TNF wird für ein Medium mit einem Leucinmangel kultiviert.
Die resultierenden Kulturen wurden auf eine OD₆₀₀ = 0,4 verdünnt, weiter auf eine OD₆₀₀ = 1,3 gezüchtet, und durch Zentrifugation bei 1500 × g für 5 Minuten geerntet.
Hefezellen (3 × 10⁷) in der Mit-Log-Phase wurden mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in 1 ml DMEM resuspendiert. Die Hefezellen-Suspension wurde bei 37°C für zwei Stunden inkubiert, und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Die Mengen an Zymo-sTNF-α, die in das Medium sezerniert wurden, wurden gemessen durch Wester-Blot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen TNF-α (Roche).
2 zeigt Mengen von sekretorischem TNF-α (Zymo-sTNF-α) sezerniert von Hefezellen. Western-Blotting wurde durchgeführt an 20 ml Aliquoten von Medium, das mit Hefezellen kultiviert wurde, welche Kontrollvektor p423GPD (Spur 1), Plasmid p423-bTNF-α, exprimierendes Zell-gebundenes Zymo-bTNF-α (Spur 2), und Plasmid p423-sTNF-α exprimierendes sekretorisches Zymo-sTNF-α (Spur 3) enthielten.
Als eine Referenz wurde gereinigtes TNF-α Protein (Roche) bei Konzentrationen von 0,2, 0,3, 0,5 und 1,0 ng in Spuren 5, 6, 7 bzw. 8 aufgetragen. Ungefähr 0,8 ng von Zymo-sTNF-α wurden von 6 × 10⁵ Hefezelle, enthaltend Plasmid p423-sTNF-alpha während zwei Stunden inkubation (Spur 3) sezerniert. Lösliches TNF-alpha-Protein wurde nicht detektiert in dem Medium, das mit Hefezellen kultiviert wurde, die Kontrollvektor (Spur 1) oder p423-bTNF-α (Spur 2) enthielten.
BEISPIEL 2
Der Effekt von Zymo-TNF-α produzierender Hefe auf die Expression eines Reportergens unter der Kontrolle eines NF-_κB-reagierenden Elements.
2-1: Co-Kultivierung von Säugetier- und Hefezellen
Um zu testen, ob eine Zymoganden-Aktivität gemessen werde kann durch Co-Kultivierung von Säugetier- und Hefezellen, Co- kultivierten wir 293T Zellen, transfiziert mit Plasmiden pNF_κB und pRLCMV mit Zymo-sTNF-α produzierenden Hefezellen bei 39°C für zwölf Stunden.
Hefezellen, die dem Kontrollvektor p423GPD enthielten und Hefezellen, die p423-sTNF-α enthielten, wurden hergestellt durch im Wesentlichen das selbe Verfahren von Beispiel 1–2.
Jede Spur von 3 wird wie folgt beschrieben:

Spur 1: Luziferase-Aktivität in Kontroll-Säugetierzelle ohne die Zugabe der Hefezellkultur;
Spur 2: Luziferase-Aktivität in Säugetierzelle 293 T (3 × 10⁵), enthaltend pNF-κB und pRL-CMV, welche mit gereinigtem TNF-α 10 ng behandelt wurde;
Spur 3: Co-Kultivierung von Hefezellen, enthaltend Kontrollplasmid p423GPD und Säugetierzellen 293 T (3 × 10⁵) enthaltend pNF-κB und pRL-CMV;
Spur 4: Co-Kultivierung von Hefezellen, enthaltend Kontrollplasmid p423GPD und Säugetierzellen 293 T (6 × 10⁵) und pRL-CMV;
Spur 5: Co-Kultivierung von Hefezellen, enthaltend p423sTNF-α und Säugetierzelle 293 T (3 × 10⁵) enthaltend pNF-κB und pRL-CMV; und
Spur 6: Co-Kultivierung von Hefezellen, enthaltend p423sTNF-α und Säugetierzelle 293 T (6 × 10⁵) enthaltend pNF-κB und pRL-CMV.

3 zeigt den Effekt von Hefezellen Zymo-TNF-α auf die Expression des Reportergens (Renella Luziferase) unter der Kontrolle von NF-κB Reaktions-Harnstoff.
Die Balken zeigen die relative Luziferase-Aktivität an, wobei die Aktivität der Kontroll-(unbehandelten) Zellen (angezeigt als Mock in der Figur) auf 1 (Spur 1) gesetzt wurde.
Wie in 3 gezeigt, induzierte die Co-Kultur der 293 T Zellen mit Hefe, die Zymo-sTNF-α produzierte, eine starke Reporter-(Luziferase)-Aktivität in Säugetierzellen (3, Spuren 5 und 6), vergleichbar mit der, welche durch 10 ng gereinigtem TNF-α induziert wurde (3, Spur2), während die Co-Kultur mit Hefezellen, welche das Kontrollplasmid beherbergten, nur eine marginale Reporteraktivierung induzierte (Spuren 3 und 4 von 3).
Dies zeigt an, dass die Effekte von Säugetierproteinen. überwacht werden können, durch Co-Kultivierung der exprimierneden Hefe mit Säugetierzellen, die ein geeignetes Reportergen enthalten.
2-2: Effekt von Zymo-sTNF-α-produzierender Hefe auf die Expression eines Reportergens unter der Kontrolle eines NE-κB-reaqierenden Elements
Die Säugeteirzellen wurden kultiviert in konditioniertem Hefemedium, wo Zymo-sTNF-α-produzierende Hefe kultiviert wurde, um den Effekt von Zymo-sTNFα auf das NF-_κB-reagierende Element zu testen.
Hefezellen, die pGAL4, p423GAL1 bzw. p423-sTNF enthielten, wurden in synthetischem vollständigem Medium (Histidin-Mangel) bis zur Mit-Log-Phase kultiviert, geerntet, resuspendiert und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert, entsprechend im Wesentlichen dem selben Verfahren von Beispiel 1–3.
Fünf μl (Spuren 2 und 7), 10 μl (Spuren 3 und 8), 20 μl (Spuren 4 und 9), 40 μl (Spuren 5 und 10), und 80 ml (Spuren 6 und 11) konditioniertes Medium, oder 0,2 ng (Spur 12), 0,4 ng (Spur 13), 0,8 ng (Spur 14), 1,6 ng (Spur 15) und 3,2 ng (Spur 16) gereinigtes TNF-α wurden zu dem Kulturmedium von 293 T Zellen (3 × 10₅ Zellen) enthaltend Plasmide pNF_κB und pRL-CMV, hinzugefügt.
Die 293 T Zellen wurden bei 37°C für zwölf Stunden inkubiert, und die Zell-Lysate wurden hergestellt und auf Firefly und Renilla-Luziferase-Aktivitäten untersucht, was eine NF_κB-Aktivierung bzw. DNA-Trasnfektions-Effizienz reflektierte. Die Spiegel der NF-_κB-Aktivierung, normalisiert gegen die Transfektions-Effizienz, sind in 4 gezeigt.
Das konditionierte Medium von Hefen, welche Zymp-sTNF-α exprimierten, aktivierte stark den Reporter in einer Dosisabhängigen Art und Weise (4), was anzeigt, das diese Strategie verwendet werden kann zur Untersuchung der Funktion eines sezernierten Zymoganden (1C). Dieses Verfahren hat den Vorteil, keine Temperatur-empfindlichen Hefezellen zu erfordern, da es keinen Co-Kultivierungs-Schritt gibt.
Die Balken von 4 zeigen die relative Luziferase-Aktivität in den Zellen nach Behandlung mit TNF-α oder konditioniertem Medium an, wobei die Luziferase-Aktivität in Kontroll (unbehandelten) Zellen (angezeigt als Mock in der Figur) auf 1 (Spur 1) gesetzt wurde.
Jede Spur in 4 wird wie folgt erklärt:

Spur 1: Luziferase-Aktivität in Kontroll-Säugetierzellen ohne die Zugabe der Hefezell-konditionierten Kultur,
Spur 2 bis Spur 6: Luziferase-Aktivität in Säugetier 293 T Zellen mit Behandlung der p423GPD-enthaltenden Hefezellkonditionierten Medien in einer Menge von 5 μl (Spur 2), 10 μl (Spur 3), 20 ml (Spur 4), 40 μl (Spur 5), bzw. 80 μl (Spur 6);
Spur 7 bis Spur 11: Luziferase-Aktivität in Säugetierzellen mit Behandlung des Zymo-sTNF-α-exprimierenden Hefezellkonditionierten Mediums in einer Menge von 5 μl (Spur 2), 10 μl (Spur 3), 20 ml (Spur 4), 40 μl (Spur 5), bzw. 80 μl (Spur 6); und
Spur 12 bis Spur 16: Luziferase-Aktivität in Säugetier 293 T Zellen (3 × 10⁵) enthaltend Plasmid pNF-_κB und pRL-CMV mit Behandlung von gereinigtem TNF-α in einer Menge von 0,2 ng (Spur 12), 0,4 ng (Spur 13), 0,8 ng (Spur 14), 1,6 ng (Spur 15) bzw. 3,2 ng (Spur 16).

BEISPIEL 3
Antivirale Effelkte von Hefezellen, die Zymoganden produzieren
Viele Zellmembran-gebundene Proteinliganden triggern Signal-Kaskaden durch Wechselwirkungen mit Rezeptoren auf der Oberfläche von Zielzellen. Wir versuchten diese Situation nachzuahmen durch Produzieren von Zymoganden in einer Zellwandgebundenen Form. Als Modell-Systeme untersuchten wir den antiviralen Effekt von Zymo-sIFN-α und Zymo-bIFN-α in einer Huh-7 menschlichen Hepatokarzinom-Zell-Linie enthaltend ein Hepatitis C virales Replikon. Dieses System ahmt den Replikations-Zyklus des Hepatitis C Virus (HCV) nach (Bartenschlager, 2002) und kann untersucht werden über ein Renilla Luziferase Reportergen (untersuchbares Replikon RNA; Bartenschlager 2002).
3-1: Die Expression von Ligand in Hefezellen und die Expression von Rezeptor in Säugetierzellen
HeLa/E-Zellen, behandelt mit Hefezellen, die auf mittleres Log-Stadium in YEPD gezüchtet wurden, wurden mit 3,5% (m/v) Paraformaldehyd (Sigma) bei Raumtemperatur für zwölf Minuten fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die Proben wurden gefärbt mit 0,5% fluoreszierendem Aufheller 28 (sigma) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Hefezellen wurden durch Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bildgebung und Hefe-spezifischer Färbung mit fluoreszierendem Aufheller 28 (Sigma) bestätigt.
5A zeigt den Vergleich von Hefe- und Säugetierzellen. Die Hefezellen sind in blau am Boden links von 5A sichtbar gemacht. 5B zeigt Expressionen von Interferon-α auf der Oberfläche von Hefe und Interferon α/β-Rezeptor auf der Oberfläche der HeLa-Zelle. HeLa/E-Zellen wurden auf Coverslips, beschichtet mit 0,2% Gelatine für 48 Stunden gezüchtet und dann dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 3,5% (m/v) Paraformaldehyd (Sigma) bei Raumtemperatur für zwölf Minuten fixiert, und dreimal mit PBS gewaschen. Die Proben wurden in einer Blockierungs-Lösung (PBS enthaltend 1% BSA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) getränkt, mit anti-IFN-α/β-Rezeptor-Antikörper (Santa Cruz Biotechnologie für eine Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und dann dreimal mit PBS gewaschen.
Die Proben wurden mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten sekundären Antikörpern (Jackson ImmunoReseach Laboratories) bei Raumtemperatur für eine Stunden behandelt. Hefezellen wurden auf mittleres Log-Stadium in YEPD gezüchtet und mit 3,5% (m/v) Paraformaldehyd (Sigma) bei Raumtemperatur für zwölf Minuten fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die Proben wurden gefärbt mit 0,5% fluoresziernedem Aufheller 28 (Sigma) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, inkubiert mit dem primären Antikörper (anti-IFN-α Antikörper; Santa Cruz Biotechnology) für eine Stunden bei Raumtemperatur, und dann mit PBS dreimal gewaschen.
Die Proben wurden dann mit TRITC-konjugiertem sekundären Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories) für eine Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Letztlich wurden die Coverslips dreimal mit PBS gewaschen, auf Glasplättchen gegeben, und mit transparentem Nagellack versiegelt. Die fluoreszierenden Bilder wurden eingefangen mit einer gekühlten CCD Kamera und einem Zeiss Axioplan Mikroskop. Die Daten wurden verarbeitet unter Verwendung der Adobe Photoshop Software. Die IFN-α-Rezeptoren und IFN-α wurden visualisiert als gründe bzw. rote Punkte. Die Hefe- und HeLa-Zell Bilder wurden separat erzeugt und dann zum Vergleich kombiniert.
Die Expression von IFN-α auf der Oberfläche von Hefezellen und IFN-α/β-Rezeptoren auf der Oberfläche von Huh-7 Zellen wurde durch Immunozytochemie überwacht.
Die Hefezellen wurden bestätigt durch DIC-Bildgebung und Hefe-spezifische Färbung mit fluoreszierndem Aufheller 28 (Sigma) (blaue Zellen in 5A). Für die Visualisierung von Hefe-Oberfläche-gebundenem IFN-α wurden unpermeabilisierte Hefezellen mit einem anti-IFN-α-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology) und einem TRITC-konjugierten sekundären Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories) (rotes Signal, linke Bodenecke von 5B) behandelt.
Die gesamte Oberfläche der Hefe glänzte rot, was anzeigte, dass heterologe Gene auf der Oberfläche von Hefezellen unter Verwendung des in 1A und 1B beschriebenen Systems exprimiert und präsentiert werden können. IFN-α/β-Rezeptoren wurden in Punkt-förmigen Clustern auf der Oberfläche von Huh-7 Zellen (grüne Punkte in 5B) beobachtet.
3-2: Antivirale Effekte von HCV in menschlichen Hepatozyten Zellen
6 zeigt die antiviralen Effekte von Zymo-IFN-α gegen den Hepatitis C Virus (HCV). Plasmide p425-sINF-α (exprimierend Zymo-sIFN-α) und p425-bINF-α (exprimierend Zymo-bIFN-α) wurden in Hefe PBN404 transformiert. Huh-7 menschliche Hepatozyten-Zellen enthaltend eine subgenomische HCV-Replikon RNA (Renilla Luziferase, untersuchtbare Replikon RNA; Gartenschlager, 2002) mit einer Reporter-Renilla-Luziferase (untersuchbare Replikon RNA), welche verwendet werden kann, um Änderungen in HCV-RNA-Spiegeln zu untersuchen (Vrolijk et al., 2003), wurden verwendet, um die anti-HCV-Effekte von Zymo-bIFN-α zu überwachen.
6A zeigt den Effekt von gereinigtem IFN-α-Protein auf das HCV-Replikon. Huh-7 Zellen (1,5 × 10⁴ Zellen) enthaltend die untersuchbare HCV subgenomische Replikon RNA wurden behandelt mit 0, 10, 20, 40, 80 und 160 internationalen Einheiten (IE) von gereinigtem IFN-α (Calbiochem); die entsprechenden Renella Luziferase-Aktivitäten sind in Spuren Mock, 10 IE, 20 IE, 40 IE, 80 IE, bzw. 160 IE gezeigt, wobei die des Mock-behandelten Lysats auf 100% gesetzt wurden.
6B zeigt den Effekt von Zymo-sIFN-α-sezernierenden Hefezellen auf die. HCV-Replikation. Huh-7 Zellen (1,5 × 10⁴ Zellen) enthaltend die untersuchbare HCV subgenomische Replikon RNA wurden mit 0,25 × 10³, 5 × 10³, 1,0 × 10⁴, 2,0 × 10⁴ und 4,0 × 10⁴ Hefezellen, enthaltend Plasmid p425-sINF-α behandelt, für 24 Stunden kultiviert und dann auf Renilla-Luziferase-Aktivität untersucht, wie gezeigt in Spuren Mock, 2,5, 5, 10, 20 bzw. 40. Die Balken zeigen relative Luziferase-Aktivitäten an, wobei die des Mock-behandelten Lysats auf 100% gesetzt wurde.
6C zeigt den Effekt von Zymo-bIFN-alpha-produzierneden Hefezellen auf die HCV-Replikation. Experimente wurden wie in 6B ausgeführt, unter Verwendung von Hefezellen, die Plasmid p425bINF-alpha enthielten. Zellewandgebundenes Zymo-bINF-alpha zeigte eine höhere antivirale Aktivität als sekretorisches Zymo-sIFN-alpha. Vergleiche Schaubild 6C mit 6B.
6D zeigt den Effekt von Kontroll-Hefezellen auf die HCV-Replikation. Experimente wurden durchgeführt wie in 6B, unter Verwendung von Hefezellen, die das negative Kontrollplasmid p425 enthielten. Keine antivirale Wirksamkeit wurde in Lysaten aus den Kontroll-Hefezellen beobachtet.
Gereinigtes INF-alpha (positive Kontrolle) hemmte die Proliferation von HCV-Replikon RNA in Huh-7 Zellen in einer Dosis-anhängigen Art und Weise (6A), was anzeigte, dass das verwendete Zell-basierte Assay-System geeignet war zum Messen der Anti-HCV-Effekte von IFN-alpha.
In ähnlicher Weise hemmten die Co-Kultur mit Hefen, welche Zymo-sIFN-alpha (6B) und Zymo-bIFN-alpha (6C) produzierten, beide die Proliferation der HCV-Replikon RNAs in Huh-7 Zellen in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Interessanter Weise zeigten Hefen, welche Zymo-bIFN-alpha. produzierten, eine höhere antivirale Wirksamkeit als diejenigen, die sekretorisches Zymo-sIFN-alpha produzierten. Die molekulare Basis dieses Unterschieds bleibt zu erklären. Jedoch hemmten Hefezellen, die das Plasmid p425 (negative Kontrolle) exprimierten, nicht die Proliferation der HCV-Replikon RNAs in Huh-7 Zellen (6D).
BEISPIEL 4
Anti-HCV-Effekte von verschiedenen Zymoganden
Um den Effekt von verschiedenen Zymoganden auf die Proliferation des HCV-Replikons zu testen, wurden Hefezellen, die Zymo-bIFN-gamma, Zymo-sIFN-gamma, Zymo-sTNF-alpha, und Zymo-sTGF-beta produzierten, erzeugt unter Verwendung der Plasmide, die in 1 beschrieben sind.
7A bis 7E zeigt die Anti-Hepatitis C Virus (HCV) Effekte von Hefezellen, die verschiedene Zymo-Liganden produzieren, einschließlich Zymo-IFN-gamma, Zymo-TNF-alpha, und Zymo-TGF-beta.
Hefezellen, die zwei Formen von Zymo-IFN-gamma und sekretorischem Zymo-TGF-beta produzieren, wurden erzeugt durch Transformieren der Hefe PBN404 mit Plasmiden p425-sINF-gamma (sezerniert), p425-bINF-gamma (Zellwand-gebunden) bzw. p425-sTGF-beta (sezerniert).
Um p425-bIFN-gamma zu produzieren, wurde IFN-gamma-Gen amplifiziert unter Verwendung des Primers hIFNg-F und des Primers hIFNg-R, geschnitten mit Eco RI und Sal I, und substituiert mit bIFN-alpha in p425-bIFN-alpha.

Primer hIFNgF: 5'CGG AAT TCT GTT ACT GCC AGG ACC CAT ATG-3' (Sequenzidentifikationsnummer: 15)
Primer hIFNg-R: 5'-CGG TCG ACC TGG GAT GCT CTT CGA CC-3' (Sequenzidentifikationsnummer 16)

Um p425-sIFN-gamma zu produzieren, wurden Plasmid p425 bIFN-gamma mit Sal I und Xhol geschnitten und selbst ligiert. Somit wurde der GPI-Anker von CWP2 entfernt, um sekretorisches IFN-gamma zu produzieren.
Um p425-bTGF-beta zu konstruieren, wurde TGF-beta-Gen amplifiziert mit Primer hTGF-F und Primer hTGF-R, geschnitten mit Eco RI und Sal I, und substituiert mit bIFN-alpha von p425-bIFN-alpha.

Primer hTGF-F: 5'-CGG AAT TCG CTT TGG ACA CCA ATT ACT GCT TC-3' (Sequenzidentifikationsnummer: 17)
Primer hTGF-R: 5'-CGG TCG ACG CTA CAT TTA CAA GAC TTC ACC ACC-3' (Sequenzidentifikationsnummer: 18)

Um p425-sTGF-beta zu produzieren, wurde Plasmid p425-bTGF-beta geschnitten mit Sal I und Xhol, und eine Selbst-Ligierung wurde ausgeführt. Somit wurde der GPI-Anker von CWP2 entfernt, um sekretorisches TGF-beta zu produzieren.
7A zeigt den Effekt von negativen Kontroll-Hefen, die Stammplasmid p425GPD enthielten.
Huh-7 Zellen (1,5 × 10⁴ Zellen), die die untersuchbare HCV subgenomische Replikon RNA enthielten, wurden Co-kultiviert mit 0, 2,5 × 10³, 5 × 10³, 1,0 × 10⁴, 2,0 × 10⁴, 4,0 × 10⁴ Hefezellen, welche das Kontroll-p425-Plasmid exprimierten, und Proben wurden auf Renilla-Luziferase-Aktivität untersucht, wie gezeigt in Spuren mock, 2,5, 5, 10, 20 bzw. 40. Die Balken zeigen die relativen Luziferase-Aktivitäten an, wobei die des Mockbehandelten Lysats auf 100% gesetzt wurde.
7B zeigt den Effekt von Hefezellen, die Zellwandgebundenes Zymo-IFn-gamma produzieren, auf die HCV-Replikation. Experimente wurden durchgeführt wie in 7A, unter Verwendung von Zellen, die das Plasmid p425-bINF-gamma beherbergten. Zellwand-gebundenes Zymo-INF-gamma zeigte eine schwache Anti-HCV-Aktivität.
7C zeigt den Effekt von Hefezellen, die Zymo-sIFN-gamma produzieren, auf die HCV-Replikation. Experimente wurden durchgeführt wie in 7A, unter Verwendung von Zellen, die das Plasmid p425-sINF-gamma beherbergten. Unter den getesteten Bedingungen wurde kein Anti-HCV-Effekt beobachtet.
7D-Experimente wurden ausgeführt wie in 7A, unter Verwendung von Zellen, die Plasmid p425-sTNF-alpha beherbergten. Kein Anti-HCV-Effekte wurde unter den getesteten Bedingungen beobachtet.
7E zeigt den Effekt von Hefezellen, die Zymo-sTGF-beta produzierten, auf die HCV-Replikation. Experimente wurden durchgeführt wie in 7A, unter Verwendung von Zellen, die Plasmid p425-sTGF-beta beherbergten. Kein Anti-HCV-Effekt wurde unter den getesteten Bedingungen beobachtet.
Hefen, welche Zellwand-gebundenes Zymo-bIFN-gamma produzierten, zeigten einen schwachen antiviralen Effekt, der viel geringer war als der von IFN-alpha (6B und 6C), aber in Übereinstimmung mit dem von gereinigtem IFN-gamma (7B).
Keine antivirale Aktivität wurde beobachtet von Kontroll-Hefen (7A) und denjenigen, die Zymo-sIFN-gamma, Zymo-sTNF-alpha und Zymo-sTGF-beta produzierten (7C, 7D bzw. 7E).
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die antiviralen Effekte von Proteinen unter Verwendung des erfinderischen Hefe-basierten Systems getestet werden können.

Anti-HCV-Aktivität

Zymo-bIFN-gamma schwach Figur 7B

Zymo-sIFN-gamma keine Figur 7C

Zymo-sTNF-alpha keine Figur 7D

Zymo-sTGF-beta keine Figur 7E
BEISPIEL 5
Messen der mitogenen Signal-Kaskaden-Aktivierung durch Beobachten der Erk-Protein-Physphorylierung
8 zeigt, dass Zymo-sTGF-beta die Phosphorylierung von Erk-Protein induziert. Hefezellen (3 × 10⁷), die das Plasmid p425 (Spur 1), p425-bTGF-beta (Spur 2) oder p425-sTGF-beta (Spur 3) in der mittleren Log-Phase enthielten, wurden geerntet und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert, und die Hitze-behandelten Hefezellen (1,0 × 10⁵) wurden auf das Kulturmedium von 3 × 10⁴ RINm5F Zellen (Ratten-Insulinom) für die angegebenen Zeiten aufgetragen.
Gereinigter epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) wurde als die positive Kontrolle (Spur 4) verwendet. Behandelte Zellen wurden geerntet und lysiert, und die Spiegel von phosphoryliertem Erk-Protein wurden untersucht durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein Phospho-Erk-Poligopeptid.
Phosphoryliertes Erk-Protein wurde in RINm5F Zellen detektiert, die mit Hefezellen behandelt wurden, welche Zymo-sTGF-beta sezernierten, für zwei und fünf Minuten.
Da viele Mitogene die Phosphorylierung von Erk-Protein auslösen, was zur Transduktion eines Aktivierungs-Signals zu Stromabwärts-Molekülen führt, kann die Messung der Phospho-Erk-Spiegel verwendet werden, um die Aktivierung von Signal-Transduktions-Kaskaden zu überwachen. Die Phosphorylierung von Erk wurde eine bis zehn Minuten nachdem RINm5F Zellen mit der positiven Kontrolle, gereinigtem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) behandelt wurden, beobachtet (8, Spur 4).
Die Phosphorylierung von Erk wurde auch beobachtet nach der Co-Kultur von RINm5F Zellen mit Hefen, welche Zymo-sTGF-beta3 exprimierten (8, Spur3). Im Gegensatz dazu wurde Erk-Phosphorylierung nicht beobachtet nach Co-Kultur von Zellen mit Hefen, welche Zymo-bTGF-beta3 exprimierten (8, Spur 2) oder der negativen Kontrolle, Plasmid p425 (8, Spur 1). Dies zeigt an, dass die kurzzeitige Behandlung von Säugetierzellen mit Hefen, welche Zymo-TGF-beta3 exprimieren, Signal-Transduktions-Kaskaden triggern kann, und dass die Messung der Protein-Phosphorylierung ein anderes Verfahren ist, für die Bewertung der Zymoganden-Aktivität in dem erfinderischen System.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung haben das System und das Verfahren zur Untersuchung der Funktion eines Liganden die Vorteile der Co-Kultivierung von Hefezellen und Säugetierzellen, und dass kein Bedürfnis besteht ein Fusionsprotein, welches durch Hefe exprimiert wurde, zu reinigen.
Sequenzliste
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Polypeptid-Untersuchungssystem, das eine nicht-Säugetierzelle umfasst, kultiviert in einem nicht-Säugetierzellkulturmedium oder in einer nicht-Säugetierzellkultur, die ein heterologes Polypeptid exprimiert, welches entweder das Polypeptid ist, das vorwiegend auf der Zelloberfläche angezeigt wird, oder das sekretorische Polypeptid, und das eine Ziel-Säugetierzelle umfasst, die ein Reporter-Konstrukt enthält, das spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt, in einem Säugetierzellkulturmedium.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Ein System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion, wobei das System folgendes umfasst: (a) eine nicht-Säugetierzelle, kultiviert in einem nicht-Säugetierzellkulturmedium oder einer nicht-Säugetierzellkultur, die ein heterologes Polypeptid exprimiert, welches entweder das Polypeptid ist, das vorwiegend auf der Zelloberfläche angezeigt wird, oder das sekretorische Polypeptid, (b) eine Ziel-Säugetierzelle, die ein Reporter-Konstrukt enthält, das spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt, in einem Säugetierzellkulturmedium; und (c) ein Detektionsmittel zum Detektieren einer Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid, das in der nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, und dem Reporter-Konstrukt, worin das System für die Analyse der Polypeptid-Funktion durch Detektieren der Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Reporter-Konstrukt verwendet werden kann.
Das System zur Untersuchung einer Popypeptid-Funktion gemäß Anspruch 1, worin das nicht-Säugetierzellkulturmedium nicht geeignet ist zum Kultivieren einer Säugetierzelle, und das Säugetierzellkulturmedium geeignet ist zum Kultivieren einer Säugetier- und einer nicht-Säugetierzelle.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 1, worin die Säugetierzelle mit der nicht-Säugetierzelle kultiviert wird, oder in einem Zellmedium kultiviert wird, das mit der nicht-Säugetierzellkultur. konditioniert wurde.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 1, worin das Detektionsmittel für die Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Reporter-Konstrukt gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus folgenden Verfahren: Detektieren einer Gen-Expression durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, das einen Promoter, der durch das heterologe Polypeptid reguliert wird, und ein Gen, das unter dem Promoter kontrolliert wird, umfasst; Detektieren eines Replikations-Spiegels eines viralen Gens durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, umfassend ein System der Replikation eines viralen Gens, das durch das heterologe Polypeptid reguliert wird; Detektieren der Gen-Expression durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, umfassend ein System zur Expression eines viralen Gens, das durch das heterologe Polypeptid reguliert wird; und Detektieren einer Phosphorylierung/Dephosphorylierung eines Proteins durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, umfassend ein Protein, dessen Aktivität durch seine Phosphorylierung oder Dephosphorlierung reguliert wird.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß irgendeinem von Anspruch 1 bis Anspruch 4, worin die nicht-Säugetierzelle ein konditioneller Mutant ist.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 5, worin die nicht-Säugetierzelle ein Temperaturempfindlicher Mutant ist.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 5, worin die nicht-Säugetierzelle ein Fungus oder eine prokaryotische Zelle ist.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 7, worin der Fungus eine Hefezelle ist.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 8, worin die Hefe zu der Temperatur-empfindlichen Gattung Saccharomyces gehört.
Das System zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 9, worin die Hefe ein Temperatur-empfindlicher Saccharomyces Cerevisiae ist, hinterlegt unter KCTC-Zugangsnummer 10934 BP.
Ein Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion, das die folgenden Schritte umfasst: Kultivieren einer nicht-Säugetierzelle und einer Säugetierzelle zusammen in einem Säugetierzellkulturmedium, worin die nicht-Säugetierzelle ein heterologes Polypeptid exprimiert, das entweder ein Polypeptid ist, welches vorwiegend auf der Zelloberfläche angezeigt wird, oder ein sekretorisches Polypeptid, und worin die Säugetierzelle ein Reporter-Konstrukt umfasst, das spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt; und Analysieren der Polypeptid-Funktion durch Detektieren einer Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid, das in der nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, und dem Reporter-Konstrukt.
Ein Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion, welches die folgenden Schritte umfasst: Kultivieren einer nicht-Säugetierzelle, die ein heterologes Polypeptid exprimiert, das entweder ein Polypeptid ist, welches vorwiegend auf der Zelloberfläche angezeigt wird, oder ein sekretorisches Polypeptid, in einem nicht-Säugetierzellkulturmedium; Kultivieren einer Säugetierzelle, die ein Reporter-Konstrukt enthält, das spezifisch mit dem heterologen Polypeptid wechselwirkt, in einem Säugetierzellkulturmedium, das mit der nicht-Säugetierzellkultur konditioniert wurde; und Analysieren der Polypeptid-Funktion durch Detektieren einer Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid, das in der nicht-Säugetierzelle exprimiert wird, und dem Reporter-Konstrukt.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 11 oder 12, worin die Wechselwirkung zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Reporter-Konstrukt durch ein Verfahren detektiert wird, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Detektieren einer Gen-Expression durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, umfassend einen Promoter, der durch das heterologe Polypeptid reguliert wird, und ein Gen, das unter dem Promoter kontrolliert wird; Detektieren eines Replikations-Spiegels eines viralen Gens durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, umfassend ein System zur Replikation eines viralen Gens, das durch das heterologe Polypeptid reguliert wird; Detektieren der Gen-Expression durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, umfassend ein System zur Expression eines viralen Gens, das durch das heterologe Polypeptid reguliert wird; und Detektieren einer Phosphorylierung/Dephosphorylierung eines Proteins durch Verwenden des Reporter-Konstrukts, umfassend ein Protein, dessen Aktivität durch seine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung reguliert wird.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 11 oder 12, worin der Schritt Kultivieren der Säugetierzelle bei einer Temperatur durchgeführt wird, die geeignet ist für die Säugetierzelle, aber nicht geeignet ist für die nicht-Säugetierzelle.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 11 oder 12, worin die nicht-Säugetierzelle ein konditioneller Mutant ist.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 15, worin die nicht-Säugetierzelle ein Temperatur-empfindlicher Mutant ist.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypepid-Funktion gemäß Anspruch 16, worin die Kultivierungs-Temperatur auf eine Temperatur eingestellt wird, bei welcher die Säugetierzelle wachsen kann, aber die nicht-Säugetierzelle nicht wachsen kann.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 16, worin die nicht-Säugetierzelle ein Fungus oder eine prokaryotische Zelle ist.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 18, worin der Fungus eine Hefezelle ist.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 19, worin die Hefezelle zu der Temperaturempfindlichen Gattung Saccharomyces gehört.
Das Verfahren zur Untersuchung einer Polypeptid-Funktion gemäß Anspruch 20, worin die Hefe ein Temperatur-empfindlicher Saccharomyces Cerevisiae ist, hinterlegt unter KCTC-Zugangsnummer 10934 BP.
Der Saccharomyces Cerevisiae, hinterlegt unter KCTC-Zugangsnummer 10934 BP, welcher Temperatur-empfindlich ist.