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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung von rekombinanten
Proteinen, insbesondere von eukaryontischen Proteinen. Insbesondere
stellt die Erfindung verbesserte Neurospora-Wirte bereit, die exprimierte
Proteine nicht mit der selben Geschwindigkeit wie Wildtyp-Neurospora
abbauen, sowie Verfahren zur Isolierung derartiger Wirte.
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Technischer Hintergrund
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Man
hat erkannt, dass die Klonierung und Expression von heterologen
Genen in Bakterien, Hefen und Pilzen als potentielle Systeme zur
Herstellung einer Vielzahl von wertvollen Proteinen in Frage kommen.
Beispielsweise beschreibt das US-Patent 4 486 533 (Lambowitz) die
autonome Replikation von DNA-Vektoren für filamentöse Pilze durch mitochondrielle
Plasmid-DNA und die Einführung
und Expression von heterologen Genen in Neurospora. Das US-Patent
4 816 405 (Yelton et al.) beschreibt Werkzeuge und Systeme, die
die Modifikation von wichtigen Stämmen von filamentösen Ascomyceten
ermöglichen,
um große
Mengen an erwünschten
heterologen Proteinen herzustellen und zu sezernieren. Das US-Patent
4 885 249 (Buxton et al.) beschreibt die Transformation von Aspergillus
niger durch einen DNA-Vektor, der einen selektierbaren Marker enthält, der
zur Einverleibung in A. niger-Wirtszellen befähigt ist. Das US-Patent 4 935
349 (McKnight et al.) beschreibt ein Verfahren zur Expression von
höheren eukaryontischen
Genen in Aspergillus unter Beteiligung von Promotoren, die dazu
befähigt
sind, die Expression eines heterologen Gens in Aspergillus und anderen
filamentösen
Pilzen zu dirigieren. Ähnliche Techniken
wurden dazu herangezogen, das mtr-Gen, das am Aminosäuretransport
in Neurospora crassa ("N.
crassa") beteiligt
ist, zu klonieren und die enge Verknüpfung der klonierten DNA mit
genomischen Markern, die dieses Gen in vivo flankieren, zu verifizieren;
W. D. Stuart et al., Genome, Bd. 30 (1988), S. 198-203; K. Koo und
W. D. Stuart, Genome, Bd. 34 (1991), S. 644-651.
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Bennett
et al., More Genetic Manipulation of Filamentous Fungi, Orlando
Florida, Academic Press, (1991), S. 396-428, bietet einen Überblick über die
heterologe Genexpression in filamentösen Pilzen.
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Filamentöse Pilze
besitzen zahlreiche Eigenschaften, aufgrund derer sie hochwertige
Kandidaten zur Verwendung bei der Herstellung von eukaryontischen
Proteinen darstellen. Filamentöse
Pilze können
komplexe Proteine sezernieren; dreidimensionale Proteine korrekt
falten, einschließlich
der Bildung von Disulfidbindungen; proteolytisch Proteine im Anschluss
an die Translation schneiden; und Proteine unter Anwendung von n-verknüpften und
o-verknüpften
Glycosylierungsreaktionen glycosylieren. Aufgrund dieser Fähigkeiten
stellt diese Gruppe von Organismen attraktive Wirte für die Herstellung
von sezernierten, rekombinanten Proteinen dar (D. A. MacKenzie et
al., J. Gen. Microbiol., Bd. 139 (1993), S. 2295-2307; J. F. Peberdy,
Trends in BioTechnology, Bd. 12 (1994), S. 50-57). In den meisten
Fällen
konnte bisher bei der gewerblichen Herstellung von rekombinanten
(heterologen) Proteinen in filamentösen Pilzen das hohe Produktionsniveau
von natürlichen (homologen)
fungalen Proteinen nicht erreicht werden. Dies wurde einer Vielzahl
von Ursachen zugeschrieben, wozu auch hohe Konzentrationen an sezernierten
Proteasen gehören.
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In
letzter Zeit wurde Neurospora crassa als Wirtszelle für die rekombinante
homologe und heterologe Proteinerzeugung verwendet (A. Carattoli
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 92 (1995), S. 6612-6616; R. A. Yamashita
et al., Fungal Genetics Newsletter, (1995 Suppl.), 42A; E. Kato
et al., Fungal Genetics Newsletter, (1995 Suppl.) 42A; S. Buczynski
et al., Fungal Genetics Newsletter, (1995 Suppl.) 42A). Jedoch weist
Neurospora crassa mindestens 5 verschiedene extrazelluläre Proteasen
auf, von denen 3 als saure Proteasen, mindestens eine als neutrale
Protease und mindestens eine als alkalische Protease charakterisiert
wurden (R. A. Lindberg et al., J. Bacteriol., Bd. 150 (3) (1982),
S. 1103-1108). Diese Proteasen werden bei Mangelbedingungen in Bezug
auf einen oder mehrere essentielle Nährstoffe, z. B. Kohlenstoff,
Stickstoff und Schwefel, in starkem Maße exprimiert und können zu
einem hochgradigen Proteinabbau eines exprimierten rekombinanten
Proteins führen
(R. A. Lindberg et al., J. Bacteriol., Bd. 150(3) (1982), S. 1103-1108; L. Cohen et
al., Archiv. Biochem. Biophys., Bd. 169 (1975), S. 324-330; R. A. Abbott
et al., J. Bacteriol., Bd. 159(2) (1984), S. 505-510; M. A. Hanson
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 72(4) (1975), S. 1240-1294.
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Ideale
Wirtszellen zur Verwendung bei der Herstellung von rekombinanten
Proteinen weisen folgende Eigenschaften auf:
- 1)
sie lassen sich leicht und kostengünstig in Laboratoriumskulturen
züchten;
- 2) sie sind zur Sezernierung hoher Konzentrationen des rekombinanten
Produkts in flüssige
Medien befähigt,
wodurch die Notwendigkeit zum Aufbrechen der Wirtszelle zur Gewinnung
des Produkts entfällt
und die nachgeordneten Bearbeitungsverfahren vereinfacht werden;
- 3) sie sind dazu befähigt,
das rekombinante Produkt auf ähnliche
oder identische Weise, wie die Zelle, aus denen das Produkt in der
Natur ursprünglich
erzeugt worden ist, zu falten, zu schneiden, zu glycosylieren oder
anderweitig nach der Translation zu prozessieren;
- 4) sie weisen einen genetischen Marker oder Marker zum einfachen
Identifizieren von transformierten Zellen auf; und
- 5) sie bieten eine stabile, nicht-denaturierende, nicht abbauende
Umgebung im Produktionsmedium, so dass das rekombinante Produkt
sich im Laufe der Zeit in sicherer Weise anreichern kann.
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Stämme des
filamentösen
Pilzes Neurospora crassa, die in der Natur auftreten, weisen einige, jedoch
nicht sämtliche
der vorstehenden Eigenschaften auf. Derartige Stämme sind von Sammelstellen erhältlich,
beispielsweise vom Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, Kansas.
Erhältliche
Stämme weisen
folgende Eigenschaften auf:
- 1) sie sind leicht
und kostengünstig
in Laboratoriumskulturen zu züchten;
- 2) sie sind dazu befähigt,
bis zu 250 mg/Liter ihrer eigenen, endogenen Proteine zu sezernieren;
- 3) sie sind dazu befähigt,
ihre eigenen endogenen Proteine zu falten, zu spalten, zu glycosylieren oder
anderweitig posttranslational zu prozessieren;
- 4) sie weisen genetische Marker auf, die durch Transformation
gewonnen werden können
und die sich für
eine einfache Identifizierung von transformierten Zellen eignen.
Die einfachsten derartigen Marker sind Mutationen, die einen einzigen Nährstoffbedarf
hervorrufen und die von diesem Nährstoffbedarf
durch Transformation mit dem entsprechenden Wildtyp-Gen (z. B. his-2,
his-3, inl, trp-2) befreit werden können;
- 5) sie weisen bekannte Mutationen auf, die die Sekretionsrate
von einigen oder sämtlichen
extrazellulären,
endogenen Proteinen erhöhen
(z. B. exo-1, nicht-identifizierte Allele in inlts 498).
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Jedoch
finden sich weder in der Natur noch unter gesammelten Stämmen (einschließlich Stämme mit
einem Gehalt durch im Labor induzierte Mutationen) irgendwelche
Mutationen, die die Konzentration an extrazellulären Proteasen, die normalerweise von
Neurospora crassa in das Medium sezerniert werden, verringern, und
es finden sich auch keine Stämme,
bei denen sämtliche
der übrigen
beschriebenen, erstrebenswerten genetischen Eigenschaften auftreten,
wobei sich diese Eigenschaften auch in keiner Untergruppe oder einer
partiellen Kombination davon finden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt verbesserte Stämme von Neurospora crassa,
Verfahren zur Erzeugung derartiger Stämme und Anwendungsmöglichkeiten
hierfür
bereit, z. B. bei der Verwendung bei der Expression von rekombinanten
Proteinprodukten. Die Konstruktion eines spezifischen Stammes wird
beispielsweise dargelegt, jedoch soll die spezifische Erläuterung
des Verfahrens keine Beschränkung
des Schutzumfangs der Erfindung darstellen.
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Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt verbesserte Neurospora-Wirtszelllinien zur
Verwendung bei der Erzeugung von rekombinanten Proteinen bereit. Speziell
stellt die vorliegende Erfindung Neurospora-Wirte mit einer verringerten extrazellulären Protease-Aktivität bereit.
Derartige Wirte sind dadurch charakterisiert, dass sie auf Sorbose-Gelatine-Agar (SGA)
nach einer mindestens 8-tägigen
Inkubation bei 30°C
keinen Halo (Hof) bilden und isoliert werden, indem man 2 oder mehr
Runden einer Mutagenese und Selektion durchführt. Es wurde festgestellt,
dass nach jeder Runde der Mutagenese und Selektion die Bildung der
sezernierten rekombinanten Proteine um ein Vielfaches zunahm.
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Somit
wird erfindungsgemäß ein mutierter Neurospora-Stamm
bereitgestellt, wobei der mutierte Stamm eine Verringerung der Aktivität von sezernierter
Protease aufweist, und zwar bei Bestimmung durch die Tatsache, dass
der mutierte Stamm nach 8-tägiger
Züchtung
bei 30°C
auf Sorbose-Agar-Gelatine (SGA)-Platten keine Halos erzeugt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner verbesserte Verfahren zur Erzeugung
von Neurospora-Wirtszelllinien zur Verwendung bei der Herstellung von
rekombinanten Proteinen bereit. Die verbesserten Verfahren wenden
zwei oder mehr Runden der Mutagenese/Selektion an, um Zelllinien
mit verringerter extrazellulärer
Protease-Aktivität
zu identifizieren.
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Somit
wird erfindungsgemäß ferner
ein Verfahren zum Isolieren eines mutierten Neurospora-Stammes der
Erfindung aus einem parentalen Neurospora-Stamm bereitgestellt,
wobei das Verfahren die Anwendung von zwei oder mehr Runden der Mutagenese
und Selektion zum Identifizieren des mutierten Neurospora-Stammes
umfasst, wobei Neurospora-Zellen nach jeder Mutageneserunde in Bezug
auf die Eigenschaft ausgewählt
werden, dass sie mehr Inkubationstage zur Erzeugung eines Halos auf
Sorbose-Protease-Substrat-Platten
als der der Mutagenese unterzogene Stamm benötigen, wobei mindestens eine
der Runden der Mutagenese und Selektion nach Einführung einer
exogenen DNA in den Wirt, die für
ein rekombinantes Protein kodiert, durchgeführt wird.
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In
einem Beispiel wurde eine exo 1/his-3-Neurospora-Zellinie mit UV-Licht mutagenisiert
und Kolonien mit einer verringerten Fähigkeit zur Erzeugung eines
Halos auf SGA-Platten nach 4-tätigem
Wachstum bei 30°C
wurden ausgewählt
und weiteren Runden der Mutagenese und Selektion unterworfen. In
einem Beispiel wurde festgestellt, dass nach 3 Runden der Mutagenese
die Zelllinien etwa das 27- bis 125-fache der Menge an sezerniertem, rekombinantem
Protein, verglichen mit der vom Ausgangsstamm erzeugten Menge, bildeten.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner verbesserte Verfahren zur Erzeugung
von rekombinanten Proteinen bereit, wobei die Verbesserung in der Verwendung
von Neurospora-Wirtszelllinien besteht, die unter Anwendung der
hier beschriebenen Verfahren selektiert werden. Die Erfindung stellt
somit ein Verfahren zur Erzeugung eines rekombinanten Proteins bereit,
wobei das Verfahren die Verwendung eines erfindungsgemäßen mutierten
Neurospora-Stammes umfasst. In einem Beispiel wurde gezeigt, dass
derartige Stämme
etwas das 27- bis 125-fache der Menge an sezerniertem, rekombinantem
Protein, verglichen mit der vom Ausgangsstamm erzeugten Menge, bilden.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, dass mehrfache
Runden einer Mutagenese und Selektion dazu herangezogen werden, Stämme von
Neurospora zu isolieren, die sezernierte rekombinante Proteine in
einem wesentlich geringeren Ausmaß abbauen, als dies bei Wildtyp-Neurospora-Stämmen und
Stämmen
von Neurospora, die nur einer einzigen Runde der Mutagenese und
Selektion unterzogen worden sind, der Fall ist. In einem Beispiel
wurden Stämme
erzeugt, die gewinnbare, rekombinante Proteine in einer Menge erzeugen,
die etwa dem 27- bis 125-fachen der vom Ausgangsstamm erzeugten
Menge entspricht. Auf der Grundlage dieser Feststellung stellt die
vorliegende Erfindung Verfahren zum Isolieren von verbesserten Neurospora-Wirtszelllinien
bereit, die für
die gewerbliche Herstellung von Proteinen verwendet werden können, sowie
verbesserte Neurospora-Wirtszelllinien, die nach dem beschriebenen
Verfahren isoliert worden sind. Speziell lässt sich eine verbesserte Neurospora-Wirtslinie
mit einer verringerten Fähigkeit
zum Abbau von sezernierten, rekombinanten Proteinen durch Mutagenese
eines Neurospora-Stammes, Auswählen
von klonalen Kolonien mit einer verringerten sezernierten Protease-Aktivität und anschließendes Wiederholen
des Mutagenese/Selektionsvorgangs für eine oder mehrere Runden
isolieren.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Neurospora-Stamm" bezieht sich auf
filamentöse
Pilze der Gattung Neurospora. Zu Beispielen für Neurospora-Spezies, die gemäß den hier
gemachten Angaben modifiziert werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf)
Neurospora crassa, N. africana, N. celata, N. discreta, N. dodgei,
N. galapagosensis, N. intermedia, N. lineolata, N. pannonica, N.
sitophila, N. sublineolata, N. terricola und N. tetraserma.
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Beliebige
Neurospora-Stämme
können
als Ausgangsmaterial für
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden. Geeignete Stämme
sind beim Fungal Genetics Stock Center (FGSC), Department of Microbiology,
University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas 66103,
oder bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn
Drive, Rockville, MD 20852, erhältlich.
Ein bevorzugter Ausgangsstamm trägt
eine nährstoffbezogene
auxotrophe Mutation, die durch ein einzelnes Gen korrigiert werden
kann. Eine komplementierbare auxotrophe Mutation sorgt für einen
selektierbaren Marker zur Verwendung bei der Transformation des
erzeugten Wirts. In den folgenden Beispielen wurde ein in Bezug
auf Histidin auxotropher Stamm als Ausgangsmaterial verwendet. Der
Stamm enthielt eine his-3-Mutation, die leicht mit einem klonierten
Wildtyp-his-3-Gen
komplementierbar ist. Eine Erörterung verschiedener
selektierbarer Marker findet sich nachstehend.
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Eine
Vielzahl von Verfahren kann zur Mutagenese des Neurospora-Ausgangsstammes herangezogen
werden, um einen Wirt mit einem verbesserten Vermögen zur
Proteinerzeugung zu bilden. Mutationen lassen sich als nicht-zielgerichtete
oder zielgerichtete Verfahren durchführen. Eine Mutation wird als
nicht-zielgerichtet bezeichnet, wenn das verwendete Mutageneseverfahren
nicht auf eine spezifische Gensequenz oder eine chromosomale Position
abzielt. Zu nicht-zielgerichteten Mutageneseverfahren, die zur Erzeugung
von verbesserten Neurospora-Wirten verwendet werden können, gehören chemische
und physikalische Mutageneseverfahren und Kombinationen davon. Zu
Beispielen für
physikalische Mutageneseverfahren gehören (ohne Beschränkung hierauf)
eine UV-Bestrahlung (Davis et al., Methods of Enzymology, Bd. 17A
(1971), S. 79-143). In den folgenden Beispielen wurde Neurospora
unter Anwendung von UV-Bestrahlung mutagenisiert. Für den Fachmann
ist es leicht ersichtlich, dass physikalische Modifikationsverfahren
durch Verwendung von chemischen Sensibilisierungsmitteln verstärkt werden
können.
Zu Beispielen für
chemische Mittel zur Verwendung bei der nicht-zielgerichteten Mutagenese gehören (ohne
Beschränkung hierauf)
EMS.
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Eine
Mutagenese wird als zielgerichtet bezeichnet, wenn das Mutageneseverfahren
auf eine spezifische Zielsequenz oder Zielregion abzielt. Zu zielgerichteten
Mutageneseverfahren gehören
(ohne Beschränkung
hierauf) eine ortsgerichtete in vitro-Mutagenese, homologe Rekombinationstechniken
und die Verwendung von transponierbaren Elementen. Der Fachmann
kann leicht knockout-Mutageneseverfahren so anpassen, dass selektiv
auf Gene abgezielt wird, die bei der Erzeugung von sezernierten
Proteasen beteiligt sind. Zahlreiche Gene, die bei der Erzeugung
von sezernierten Proteasen beteiligt sind, wurden in Neurospora
kloniert. Zwei oder mehr Runden einer knockout-Mutagenese können herangezogen
werden, um den erfindungsgemäßen verbesserten
Wirt zu erzeugen. Ferner können Kombinationen
einer zielgerichteten und einer nicht-zielgerichteten Mutagenese
eingesetzt werden.
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Als
Mutageneseverfahren werden die nicht-zielgerichteten Verfahren bevorzugt.
Derartige Verfahren ermöglichen
eine willkürliche
Erzeugung von Mehrfachmutationen innerhalb eines oder mehrerer Gene,
die für
die Erzeugung und Sekretion von aktiven Proteasen verantwortlich
sind, ohne dass es notwendig ist, die Identität oder die chromosomale Position
des oder der mutagenisierten Gene zu kennen. Ferner ermöglicht eine
nicht-zielgerichtete
Mutagenese ein wirksames Screening einer großen Anzahl von individuellen
klonalen Populationen von mutagenisierten Neurospora.
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Erfindungsgemäß werden
Neurospora-Stämme
mutagenisiert, um einen Wirtsstamm zu erzeugen, der verringerte
Aktivitätsgrade
von sezernierten Proteasen, verglichen mit Wildtypstämmen, aufweist.
Eine Verringerung der Aktivität
von sezernierten Proteasen kann eine Folge folgender Ereignisse
sein: Mutationen mit einem Protease-Gen, Beseitigung oder Verringerung
der Aktivität
einer bestimmten Protease, z. B. durch Erzeugung einer Punkt- oder
Rasterverschiebungsmutation innerhalb der Protease-Kodierungs- oder
Regulationsregion; Veränderungen
der Wege, die zur Sekretion der Protease führen; z. B. Mutationen innerhalb
von Genen, die für
den Transport der Protease verantwortlich sind; und Veränderungen
der Wege, die für
die Induktion der Protease-Expression verantwortlich sind.
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Eine
Vielzahl von Verfahren kann zum Identifizieren von Stämmen herangezogen
werden, bei denen das eingesetzte Mutageneseverfahren zur Verringerung
von exogenen Proteasen führt.
Das bevorzugte Selektionsverfahren beruht auf der Fähigkeit
von Neurospora zum Abbau eines extrazellulären Proteinsubstrats.
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Wildtyp-Neurospora
wächst
bei Züchtung auf
festen Medien mit einem Gehalt an Sorbose und einem undurchsichtigen
Protein-Proteasesubstrat, z. B. auf Sorbose-Agar-Gelatine-Platten
(SGA), in Form von Kolonien und erzeugt einen die wachsende Kolonie
umgebenden Halo (eine Klärungszone).
Der Halo tritt innerhalb von 1 bis 4 Tagen nach dem Ausstreichen
auf und ist ein Anzeichen für
den Abbau von extrazellulären
Proteinen durch sezernierte Proteasen. Nach einer Runde der Mutagenese
sind Neurospora mit einem Gehalt an Mutationen, die die Aktivität von sezernierten
Proteasen verändern,
entweder durch das Ausbleiben von derartigen Halos oder durch vorhandene
geringere Halos nach 4-tägiger
Inkubation identifizierbar. Nach einer oder mehreren weiteren Runden
der Mutagenese und Selektion können Stämme identifiziert
werden, denen nach 8-tägiger Inkubation
derartige Halos fehlen oder die geringere Halos aufweisen. Alle
verbesserten Wirte der Erfindung sind leicht aufgrund des Fehlens
zur Erzeugung eines Halos nach 8-tägigem Wachstum bei 30°C auf Sorbose-Agar-Gelatine-Platten
identifizierbar.
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Vor
der vorliegenden Erfindung wurde kein Neurospora-Stamm beschrieben,
der nach 8-tägiger Kultur
keinen Halo erzeugt. Nach drei Runden der Mutagenese/Selektion isolierte
Stämme
führen
zu einer multiplikativen Zunahme der Proteinerzeugung, verglichen
mit dem Ausgangsstamm. Stämme,
die nach drei Mutageneserunden das 20-, 30-, 60-, 90-, 120- und
sogar 125-fache an gewinnbarem sezerniertem Protein erzeugen, lassen
sich isolieren.
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Eine
Vielzahl von Medien zum Ausstreichen können verwendet werden, um die
verbesserten Wirtsstämme
der Erfindung zu selektieren. Eine wesentliche Komponente des Mediums
ist Sorbose. Sorbose ermöglicht
das Wachstum von Neurospora bei Ausstreichen auf festen Medien in
Form von Einzelkolonien.
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Das
Plattierungsmedium enthält
zusätzlich ein
Proteasesubstrat, das leicht bis weitgehend undurchsichtig ist.
Zu Beispielen für
derartige Proteasesubstrate gehören
(ohne Beschränkung
hierauf) Gelatine-Agar, Albumin, Magermilchfeststoffe, Casein und
Cytochrom c.
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Das
bevorzugte Medium enthält
eine geringe Menge eines essentiellen Nährstoffes, z. B. Kohlenstoff,
Stickstoff oder Schwefel, oder es enthält eine oder mehrere dieser
Komponenten in einer Form, die vor dem Eintritt (oder Transport)
in eine Neurospora-Zelle abgebaut werden muss. Es wurde gezeigt, dass
derartige Medien die Produktivität/Aktivität von sezernierten
Proteasen aus Neurospora erhöhen
(R. A. Abbott et al., J. Bacteriol., Bd. 159(2) (1984), S. 505-510;
M. A. Hanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 72(4) (1975),
S. 1240-1244.
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Der
pH-Wert des Mediums kann ebenfalls als eine Maßnahme zur Identifizierung
von Mutationen innerhalb spezieller Klassen von Proteasen variiert
werden. Proteasen lassen sich entsprechend ihrem pH-Bedürfnis für ihre Aktivität klassifizieren,
z. B. in saure, basische und neutrale Proteasen. Durch Ausstreichen
von mutagenisiertem Neurospora auf Medien mit einem bestimmten pH-Wert
lassen sich Mutationen, die diese Klasse von Proteasen beeinflussen,
identifizieren.
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Das
in den Beispielen eingesetzte Ausstreich-Selektionsverfahren ermöglicht ein
Screening einer großen
Anzahl von klonalen Kolonien im Anschluss an eine Mutagenese. Es
können
alternative Verfahren herangezogen werden, um die erfindungsgemäßen verbesserten
Wirte zu identifizieren. Beispielsweise können Tests, die direkt die
Anwesenheit von sezernierten Proteasen nachweisen, zum Identifizieren
von erfindungsgemäßen Neurospora-Wirten verwendet
werden. Die Protease-Aktivität kann direkt aus
den Kulturüberständen unter
Anwendung herkömmlicher
Verfahren bestimmt werden. Alternativ kann die Anwesenheit einer
bestimmten Protease unter Anwendung von immunologischen Tests, z.
B. einem ELISA-Test, bestimmt werden.
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Erfindungsgemäß werden
zwei oder mehr Runden der Mutagenese eingesetzt. Es wurde festgestellt,
dass zwei oder mehr Runden der Mutagenese erforderlich sind, um
Wirtszelllinien zu Identifizieren, die nach 8-tägiger Züchtung bei 30°C auf SGA-Platten
keine Halos erzeugen. Eine derartige Selektion identifiziert Stämme mit
einer mehrfachen Zunahme der Erzeugung von gewinnbarem, sezerniertem
Protein, verglichen mit den Ausgangsstämmen. Bei einer Anwendung des
vorliegenden Verfahrens wird ein Stamm isoliert, indem man zwei
oder mehr Runden der Mutagenese/Selektion anwendet, bevor eine exogene
DNA in die Zelle zur Verwendung bei der Erzeugung eines heterologen
Proteins eingeführt
wird.
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Alternativ
wird vor der Einführung
einer exogenen DNA in die Zelle nur eine einzige Runde der Mutagenese/Selektion
angewendet und im Anschluss an die Einführung der exogenen DNA werden
eine oder mehrere weitere Mutagenese/Selektionsrunden durchgeführt.
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Nach
der Isolierung kann der verbesserte Neurospora-Wirt der vorliegenden
Erfindung zur Erzeugung von rekombinanten Proteinen verwendet werden.
Die Proteinerzeugung wird signifikant erhöht, was auf die Verringerung
der Aktivität
von sezernierten Proteasen im Vergleich zu Wildtypstämmen zurückzuführen ist.
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Standardtechniken
zur Transformation von filamentösen
Pilzen und zur Züchtung
der Pilze sind aus dem Stand der Technik bekannt und können zur Transformation
der erfindungsgemäßen verbesserten
Wirte zur Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet werden.
Ein ausführlicher Übersichtsartikel über Techniken
zur Anwendung auf N. crassa stammt von Davis et al., Methods Enzymol.,
Bd. 17A (1971), S. 79-143. Standardverfahren werden im allgemeinen
für die
Aufrechterhaltung der Stämme
und für
die Erzeugung von Conidien verwendet. Myzel wird typischerweise
etwa 14 Stunden (25°C)
in flüssigen
Kulturen gemäß den Angaben
von Lambowitz et al., J. Cell. Biol., Bd. 82 (1979), S. 17-31, gezüchtet. Wirtsstämme können im
allgemeinen in Vogel- oder Fries-Minimalmedium,
das mit dem oder den entsprechenden Nährstoffen, z. B. mit Histidin;
Arginin; phe, tyr, und/oder trp (jeweils etwa 80 μg/ml); p-Aminobenzoesäure (etwa
2 μg pro
ml); und Inosit (etwa 0,2 mg pro ml) ergänzt ist, gezüchtet werden.
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Wenn
die Expression aktiviert worden ist und das angestrebte Protein
erzeugt worden ist, kann das Protein aus der Kultur unter Anwendung
von Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, gewonnen werden.
Da das Protein in das Medium sezerniert wird, kann das Medium entfernt
und das sezernierte Protein unter Anwendung herkömmlicher Techniken, wie Größenausschlusschromatographie,
Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, differentielle
Zentrifugation und dergl., gereinigt werden. Geeignete Verfahren
hängen
von der Art des Proteinprodukts ab.
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Der
erfindungsgemäße verbesserte
Wirt dient zur Verwendung bei der Erzeugung eines sezernierten,
rekombinanten Proteins. Um diese Anwendung zu unterstützen, kann
der Ausgangsstamm einen auxotrophen Marker enthalten, der durch
ein einzelnes Gen komplementiert werden kann, oder es kann ein selektierbarer
Marker/Selektionsmittel verwendet werden. Die geeignete Wahl eines
selektierbaren Markers hängt
von der Art des Proteins, das zu erzeugen ist, und von der Art des
Ausgangsstammes ab. Grundsätzlich
kann beispielsweise ein Expressionssystem gewählt werden, das ein Enzym erzeugt, das
für eine
Resistenz gegen ein Antibiotikum, gegen das der Wirt empfindlich
ist, wie Benomyl, verantwortlich ist. Alternativ kann dann, wenn
ein Wirt, der beispielsweise einen nährstoffbezogenen Defekt aufweist,
gewählt
wird, ein Wildtypgen zum Ausgleich dieses Mangels verwendet werden.
Um dies durchzuführen,
ist eine geeignete Mutante erforderlich.
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Obgleich
allgemein ein Ausgangsstamm hergestellt werden kann, sind zahlreiche
Mutanten von Neurospora leicht zugänglich, die die Konstruktion von
Transformationsvektoren mit einem Gehalt an Selektionsmitteln vielfältiger gestalten.
Beispielsweise bedient sich ein sehr einfaches Selektionsverfahren
eines Stammes mit einem Bedarf nach einem speziellen Nährstoff,
wobei eine selektive Markereinrichtung bereitgestellt wird, indem
man das defekte Gen, das für
diesen Nährstoffbedarf
erforderlich ist, ersetzt. Wenn beispielsweise ein Stamm, der zum Wachstum
in Abwesenheit von Histidin unfähig
ist, als Ausgangsstamm verwendet wird, lassen sich erfolgreiche
Transformanten unter Verwendung einer Nucleinsäure, die den Wildtyp des Gens,
das in der Mutante defekt ist, enthält, als "Marker" selektieren, wobei man die transformierten
Zellen auf Minimalmedium züchtet.
Nur die erfolgreichen Transformanten sind zum Wachstum in Abwesenheit
von Histidin befähigt. Ähnliche
Mutationen, die zur Abhängigkeit von
der Anwesenheit anderer Aminosäuren
oder anderer Nährstoffe
im Medium führen,
sind ebenfalls bekannt. Bei N. crassa umfassen beispielsweise bekannte
Mutanten solche, die spezifische Nährstofferfordernisse aufweisen.
Zu Beispielen für
geeignete Nährstofferfordernisse
und die entsprechenden Mutanten gehören:
- (1)
Aminosäuren,
wie Histidin (his-1 bis -7-Mutanten), Prolin (aga-Mutanten), Arginin
(arg-11-Mutanten), Citrullin (arg-11-Mutanten), Asparagin (asn-Mutanten),
Cholin (chol-1- und chol-2-Mutanten), Cystein (cys-1-Mutanten),
Glutamin (gln-1-Mutanten), Leucin (leu-1 bis -4), Lysin (lys-2,
-4 und -5), Methionin (mac-Mutanten und met-6, -9 und -10-Mutanten) und Threonin
(thr-2- und -3-Mutanten);
- (2) Gemische von aromatischen Aminosäuren, wie ein Gemisch von p-Aminobenzoesäure, Tyrosin,
Tryptophan und Phenylalanin (erforderlich für sämtliche aro-Stämme mit
Ausnahme von aro-6, aro-7 und aro-8), ein Gemisch aus Tryptophan und
Phenylalanin (erforderlich für
aro-6- Mutanten),
ein Gemisch aus Isoleucin und Valin (erforderlich für ilv-1,
-2 und -3) und ein Gemisch aus Phenylalanin und Tyrosin (erforderlich
für pt-Mutanten).
- (3) Vitamine, wie Pantothensäure
(pan-1-Mutanten) und Thiamin (thi-2- und thi-4-Mutanten);
- (4) Purinbasen, wie Adenin (ad-2- bis ad-4- und ad-8-Mutanten),
Hypoxanthin (ad-2- und ad-3-Mutanten), Inosin und Guanin oder Guanosin
(gua-1- oder -2-Mutanten);
- (5) Pyrimidinbasen, wie Uracil (pyr-1 bis pyr-6);
- (6) gesättigte
Fettsäuren
(cel-Mutanten) oder ungesättigte
Fettsäuren,
wie C16- oder C18-Fettsäuren mit
einer Doppelbindung in der cis-Konformation entweder in der 9- oder
der 11-Position, Fettsäuren
mit einer Doppelbindung in der trans-Konfiguration in der 9-Position
und Fettsäuren
mit mehrfachen cis-Doppelbindungen, die durch Methylenbrücken unterbrochen
sind (ufa-1 und -2);
- (7) physiologisch wichtige Ionen, wie Kalium (trk);
- (8) Zuckeralkohole, wie Inosit (acu-Mutanten und inl-Mutanten)
und Glycerin; und
- (9) weitere organische Einheiten, wie Acetat (ace-Mutanten),
1-Ketoglutarat,
Succinat, Malat, Formiat oder Formaldehyd (for-Mutanten), p-Aminobenzoesäure (pab-1-,
-2 und -3-Mutanten) und Sulfonamid (sfo-Mutanten bei 35°C).
-
Es
können
auch andere selektierbare Markersysteme verwendet werden, z. B.
der Einbau von Genen, die Resistenz gegenüber toxischen Substanzen oder
gegenüber
anderen schädlichen
Züchtungsbedingungen
verleihen. Beispielsweise können Gene,
die für
Proteine kodieren, die Resistenz gegen Antibiotika verleihen, verwendet
werden, wobei eine Selektion auf Medien mit einem Gehalt an diesem Antibiotikum
durchgeführt
wird. Im Fall von filamentösen
Pilzen gehören
zu derartigen Antibiotika Benomyl.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ferner einen Wirt bereit, der nach
den hier beschriebenen Verfahren isoliert worden ist. Ein Beispiel
für einen
Wirt, der mit den vorliegenden Verfahren isoliert worden ist, wird
als Hep25/24 bezeichnet und wurde bei der American Type Culture
Collection am 14. Dezember 1995 unter den Bestimmungen des Budapester
Vertrags hinterlegt. Die Erzeugung des Hep25/24-Wirtes wird ausführlich in
den Beispielen beschrieben.
-
Die
folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, stellen
aber keine Beschränkung dar.
-
Beispiel 1
-
Methoden und Materialien
-
Sämtliche
Ausgangsstämme
wurden vom Fungal Genetics Stock Center (FGSC), Department of Microbiology,
University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas 66103,
erhalten. Die Stämme werden
durch ihren Locus-Namen
und ihre FGSC-Nummer gemäß den Angaben
in "Catalog of Strains" (erhältlich vom
Stock Center) identifiziert.
-
Sämtliche
Techniken zum Züchten,
Paaren und Gewinnen von Nachkommen von Neurospora-Kulturen erfolgen
nach eingeführten
Verfahren, die in "Genetic
and Microbiological Research Techniques for Neurospora crassa", R. H. Davis und
F. J. DeSerres, Methods in Enzymology, Bd. 17A (1970), S. 79-143,
ausführlich
beschrieben sind.
-
Spezielle
Techniken zum Identifizieren von rekombinanten Produkten bedienen
sich üblicher Tests,
die für
jedes spezielle Produkt entwickelt worden sind. Hierzu gehören (ohne
Beschränkung
hierauf) übliche
enzymgebundene Immunosorbenstests (ELISA) und Aktivitätstests.
-
Beschreibung der Konstruktion eines Expressionsstammes
von Neurospora crassa
-
Genetische Kreuzungen
-
Der
Stamm exo-1 (FGSC# 2256) bewirkt eine Überproduktion von extrazellulären Enzymen, einschließlich Amylase
und Invertase (H. Gratzner und D. N. Sheehan, J. Bact., Bd. 97 (1969),
S. 544-549). Der Stamm his-3 (FGSC# 2278) benötigt eine Ergänzung von
Histidin im Medium, und zwar aufgrund einer Mutation in einem komplexen
Gen, das für
mehrfache enzymatische Aktivitäten
im Histidin-Biosyntheseweg von Neurospora kodiert (D. D. Perkins
et al., Microbiological Reviews, Bd. 46 (1982), S. 926-570).
-
Der
Stamm exo-1 wurde mit dem Stamm his-3 gekreuzt und eine doppelt
mutierte Nachkommenschaft, exo-1; his-3, wurde gewonnen. Diese Nachkommen
wurden als hisexo bezeichnet und Beispiele für beide Neurospora-Paarungstypen, A
und a, wurden gewonnen.
-
Ein
Isolat mit der Bezeichnung hisexo-1a wurde auf festem Medium, von
dem bekannt ist, dass es die extrazelluläre Proteaseproduktion induziert, gezüchtet (R.
A. Lindberg et al., J. Biol. Chem., Bd. 256(2) (1981), S. 811-814).
Dieser Stamm erzeugte sichtbare Halos auf Sorbose-Agar-Gelatine-Platten nach
4-tägigem
Wachstum bei 30°C.
-
Mutagenese des Wirtsstammes
-
Eine
Mutagenese des Stammes hisexo-1a wurde erreicht, indem eine Suspension
von Conidiaphoren, die aus einer festen Schrägkultur von hisexo-1a erhalten
worden waren, ausreichend lange (20 Sekunden) einer UV-Lichtquelle
(W. Crosslinker, FB-UVX-1000 Fisher Scientific) ausgesetzt wurde, um
durch die UV-Belichtung eine Abtötung
von 60-80 % zu erreichen. Die überlebenden
Zellen wurden auf festes Proteaseinduktionsmedium in üblichen
Petri-Schalen in einer so berechneten Verdünnung ausgestrichen, dass sich
50 bis 100 Kolonien pro Platte ergaben. Die erhaltenen Kolonien
wurden nach 4-tägigem
Wachstum bewertet. Kolonien ohne sichtbare Halos wurden aufgenommen
und zum weiteren Testen auf Agar-Schrägkulturen mit Vogel-Minimalmedium
(Davis und DeSerres) übertragen.
Etwa 20 000 Kolonien wurden bewertet und 67 davon wurden für weitere
Tests ausgewählt.
Eine ausgewählte
Kolonie ergab einen stabilen und reproduzierbaren Phänotyp, der
nach 4 Tagen keinen Halo bildete. Der Stamm erhielt die Bezeichnung
Hep-25 (Histidin – exoextrazelluläre Protease).
Kolonien von Hep-25 entwickelten bei 8-tägiger Züchtung sichtbare Halos.
-
Eine
zweite Runde der Mutagenese wurde gemäß den vorstehenden Angaben
unter Verwendung von Hep-25 als Ausgangsstamm durchgeführt. Eine
Bewertung auf erhaltene Kolonien, die nach 8 Tagen keine Halos zeigten,
wurde durchgeführt.
Es wurden wieder etwa 20 000 Kolonien bewertet und 52 davon für die weitere
Untersuchung ausgewählt. Einer
dieser Stämme
ergab einen stabilen und reproduzierbaren Phänotyp und erhielt die Bezeichnung Hep-25/24.
-
Selektion von Transformanten, die ein
rekombinantes Protein erzeugen
-
Hep-25/24
wurde durch übliche
Verfahren (S. J. Vollmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83
(1986), S. 4869-4873) mit einer DNA-Probe transformiert, die das
Plasmid pNH60 (erhalten von FGSC) mit einem Gehalt an der Wildtyp-his-3-Gensequenz
und ein Plasmid enthielt, das folgendes aufwies: einen Neurospora-Expressionsvektor,
gesteuert durch den Neurospora-Glucoamylase-Gen-RNA-Polymerase-Promotor
(PTC-Patentanmeldung, Alan Radford und University of Leeds, UK), mit
einem Gehalt an einem cDNA-Gen, das für die humane kappa-Kettenuntereinheit
von humanem Immunoglobulin G (IgG) kodiert, unter Einschluss des Aminoterminus,
der für
die Signalerkennungs-Teilchenerkennungsstelle kodiert und ein Sekretionssignal,
terminiert durch die Glucoamylase-Transkriptionsstoppstelle und die Polyadenylierungsstelle
(Redford a.a.O.). Transformanten wurden in Bezug auf das Kolonienwachstum
auf festem Minimalmedium, ergänzt
mit Sorbose, jedoch ohne Ergänzung
mit Histidin ausgewählt.
-
Transformierte
Zellkolonien wurden mit sterilen Glas-Einwegpipetten aufgenommen,
auf sterile Mikrotiterplatten mit einem Gehalt an 0,45 μm-Filtern am Boden
der Vertiefungen (Millipore), die mit einer sterilen Kunststoffverkleidung
zur Vermeidung einer Leckage bedeckt waren, übertragen und in flüssigem Vogel-Medium
(Davis und DeSerres, a.a.O.), das mit 2 % Sorbose ergänzt war,
unter Schütteln
mit 150 U/min bei 30°C
gezüchtet.
Nach 48 Stunden wurde die Kunststoffverkleidung entfernt und das
Medium wurde durch die Filter am Boden abgezogen und in einer üblichen
Mikrotiterplatte unter Verwendung eines für eine derartige Gewinnung
konzipierten Verteilers (Millipore) gesammelt. Die Platte mit einem
Gehalt an den Zellen wurde bei 4°C
aufbewahrt, während
das Medium auf die Anwesenheit von humanem kappa-Kettenprotein durch
einen Sandwich-ELISA-Test
getestet wurde.
-
Kulturen,
bei denen durch den Test festgestellt wurde, dass sie hohe Konzentrationen
an kappa-Protein im Medium erzeugt hatten, wurden von der Mikrotiter-Kulturplatte
auf feste Agar-Schrägkulturen übertragen.
In zahlreichen Serien von parallelen Experimenten variierte der
prozentuale Anteil an transformierten Kolonien, die ebenfalls das
rekombinante Protein erzeugten, von 10-30 % sämtlicher aufgenommenen Transformanten.
Als allgemeine Praxis wurden die sechs Kulturen mit den höchsten Werten im
allgemeinen für
die weitere Untersuchung übertragen.
Kulturen, die in stabiler Weise eine starke Produktion zeigten,
ließ man
sodann eine Mikroconidien-Wachstumsstufe durchlaufen, um das Vorliegen von
homokaryontischen Kernen im Produktionsstamm sicherzustellen (D.
Ebbole et al., Fungal Genetics Newsletter, Bd. 37 (1990), S. 17-18).
Mikroconidien-Subkulturen wurden aus Koloniemedien in Petri-Schalen
aufgenommen und auf einen neuen Satz von Mikrotiter-Kulturplatten
mit Filtern am Boden übertragen
und gemäß den vorstehenden
Angaben für
das ursprüngliche
Selektionsverfahren gezüchtet und
getestet. Die Kolonien, die die höchste Menge an rekombinantem
Produkt (in diesem Beispiel humane kappa-Kette, identifiziert durch
ELISA) erzeugten, wurden auf festes Minimalmedium in schräggestellten
Röhrchen übertragen.
-
Mutagenese und Selektion von Überproduktionsstämmen
-
Mikroconidien-Stämme, die
sich als stabile Erzeuger erwiesen hatten, wurden einer weiteren Runde
des Mutageneseverfahrens unterzogen und auf festes Minimal-Kolonienmedium übertragen.
Bei diesem Verfahren wurden die Kolonien, die nach 2-3 Tagen auftraten,
auf Mikrotiter-Wachstums/Filterplatten übertragen
und nach 2-tägigem
Wachstum einer Selektion auf erhöhte
Produktion des rekombinanten Proteins (in diesem Fall humane kappa-Kette,
identifiziert durch ELISA) unterzogen. Zwischen 1 und 2 % sämtlicher
geprüfter
Kolonien zeigten eine erhöhte Produktion.
Die sechs Kolonien mit der höchsten
Produktion wurden auf die Stabilität der Produktionshöhe in 25
ml umfassenden flüssigen
Schüttelkulturen getestet.
Der Stamm mit der höchsten
stabilen Produktion wurde als Ausgangsstamm für eine zweite Runde der Mutagenese
ausgewählt
und die Selektion wurde auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt.
-
Experimente
wurden unter Durchführung von
drei Runden dieses Selektionsverfahrens durchgeführt. Es wurde festgestellt,
dass auf jedem Niveau eine Verbesserung der Produktionsgrade um
den Faktor 3 bis 5 für
die Mutanten mit der höchsten
Produktion typisch war. Diese Verbesserungen sind nicht additiv,
sondern multiplikativ, so dass nach drei Runden der Mutation und
Selektion die Zunahme der Produktionsgrade des rekombinanten Proteins
routinemäßig im Bereich
des 27- bis 125-fachen lag. Eine Obergrenze für die nach diesem Verfahren
erzielbare mögliche
Verbesserung wurde nicht erreicht, obgleich eine solche mit Sicherheit
existieren muss, da die Anzahl und der Typ von Genen, die die Produktion
und Sekretion von Proteasen und rekombinanten Proteinen steuern,
notwendigerweise durch die Größe und die
Komplexizität
des Neurospora-Genoms beschränkt ist.
-
Verwertung der entwickelten Stämme als
allgemeine Expressionswirte
-
Nach
dem vorstehend beschriebenen Verfahren entwickelte Stämme können als
Wirte für
rekombinante Proteine, die von dem ursprünglich beim Selektionsverfahren
verwendeten rekombinanten Protein abweichen, eingesetzt werden.
Dies kann auf folgende Weise geschehen.
-
Wenn
die transformierende DNA für
den his-3-Locus (oder einen anderen selektiven Locus) in der ursprünglichen
transformierten Ziellinie spezifisch auf diesen Locus ausgerichtet
wird, indem man sich üblicher
Verfahren der Transformation nur einer partiellen Sequenz des Markergens
(d. h. his-3), jedoch einer partiellen Sequenz, die die Stelle der
Genommutation im Markergen abdeckt, bedient, so ist es wahrscheinlich,
dass die transformierte Zelle nur eine einzige intakte, funktionelle,
rekombinante Marker-Gensequenz trägt. Gleichermaßen ist
es dann, wenn die rekombinante cDNA-Gen-Expressionskassette durch
lange Sequenzen der Neurospora-Genom-DNA flankiert wird, hochgradig
wahrscheinlich, dass die Insertion der Expressionsskassette als
ein einziges Ereignis an der Stelle der DNA, die das rekombinante
Gen flankiert, erfolgt. Diese beiden Möglichkeiten lassen sich leicht
durch einfache Southern-Blots der genomischen DNA der ursprünglichen
Transformante unter Verwendung des Markers und der Expressionskassetten-DNA
als Sonden verifizieren. Wenn die flankierende DNA-Sequenz sorgfältig so
ausgewählt
wird, dass eine Insertion eine Mutagenese eines nicht-essentiellen,
jedoch selektierbaren Gens bewirkt (z. B. am (Nitrat-reductase) oder
mtr (Transport von neutralen Aminosäuren) oder caf (Coffein-Resistenz),
um nur drei mögliche potentielle
Stellen zu erwähnen
(vergl. Perkins et al., a.a.O.)), so kann die Insertion in Bezug
auf einen Verlust der Funktion der flankierenden Gensequenz selektiert
werden.
-
Modifizierte
Wirtsstämme
mit den vorstehenden Eigenschaften können sodann mit einem DNA-Gemisch
cotransformiert werden, das die Markergen-Plasmidsequenz (z. B. his-3), die so
konstruiert worden ist, dass sie eine kleine interne Deletion in
der Kodierungsregion trägt
und daher für
ein nicht-funktionelles Polypeptid kodiert, und die Wildtyp-Genom-DNA-Sequenz am Locus
der flankierenden Sequenz um die ursprüngliche cDNA (z. B. humane
kappa-Kette)-Genexpressions-Kassettensequenz herum enthält.
-
Transformanten
werden zunächst
in Bezug auf die Wiederherstellung des Phänotyps der flankierenden Gensequenz
(d. h. Rückkehr
zu am+) bei Züchtung auf mit Histidin ergänztem Medium
selektiert, sodann in Bezug auf den Verlust der his-3-Wildtypfunktion
durch Testen in Bezug auf den Verlust der Fähigkeit zu Wachstum auf Medium,
das nicht mit Histidin ergänzt
ist, getestet und schließlich
auf den Verlust der Fähigkeit
zur Erzeugung des ursprünglichen
rekombinanten Produkts getestet. Von einer derartigen Transformante
ist zu erwarten, dass sie mit dem modifizierten Wirtszellstamm identisch
ist, ausgenommen, dass sie nunmehr erneut ihr Wildtyp-Markergen
(z. B. his-3) verloren hat und das cDNA-Expressionskonstrukt, das die Sequenz
des ursprünglichen
rekombinanten Proteins (humane kappa-Kette) enthält, durch eine normale Neurospora-Wildtyp-DNA-Genomsequenz
ersetzt worden ist. Erneut wird diese Erwartung durch Southern-Blots unter
Verwendung der entsprechenden DNA-Sonden bestätigt.
-
Diese
neue Wirtszelle steht nun zur Transformation mit einem zweiten cDNA-Expressionskonstrukt
bereit, das ähnlich
wie das vorstehend beschriebene erste Konstrukt ist, jedoch eine
unterschiedliche cDNA-Sequenz
für die
Expression enthält
(z. B. humanen gamma-Ketten- Antikörper, humanen
tPA, humanes Insulin und dergl.). Erneut lassen sich anfängliche
Transformanten durch Selektion für
die Cotransformation mit einer funktionellen Wildtyp-Markersequenz
(z. B. his-3), wie vorstehend beschrieben, einem Screening unterziehen.