ES2283006T3 - Anfitriones de neurospora mejorados para la produccion de proteinas recombinantes y metodos para su produccion. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE CELULAS HUESPED MEJORADAS PARA SU UTILIZACION EN LA PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES SEGREGADAS, PROCEDIMIENTOS PARA PREPARAR LOS HUESPEDES MEJORADOS Y USOS DE LOS MISMOS. LA INVENCION DESCRIBE DE FORMA ESPECIFICA CEPAS DE NEUROSPORA CRASSA QUE PRODUCEN UNOS NIVELES REDUCIDOS DE PROTEASAS EXTRACELULARES, CUANDO SE COMPARAN CON NEUROSPORA CRASSA DE TIPO SALVAJE.
Description
Anfitriones de Neurospora mejorados para
la producción de proteínas recombinantes y métodos para su
producción.
La invención hace referencia al campo de la
producción de proteínas recombinantes, especialmente proteínas
eucarióticas. En particular, la presente invención proporciona
Neurosporas anfitrionas mejoradas que no degradan las
proteínas expresadas a la misma velocidad que la Neurospora
de tipo salvaje y métodos para aislar tales anfitriones.
La clonación y expresión de genes heterólogos en
bacterias, levaduras y hongos han sido reconocidas como sistemas
potenciales para producir una variedad de proteínas útiles. Por
ejemplo: Lambowitz, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.486.533,
describe la replicación autónoma de vectores de ADN para hongos
filamentosos por medio de ADN plasmídico mitocondrial y la
introducción y expresión de genes heterólogos en Neurospora;
Yelton et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.405,
describen herramientas y sistemas que permiten la modificación de
importantes cepas de ascomicetos filamentosos para producir y
secretar grandes cantidades de proteínas heterólogas deseadas;
Buxton et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.885.249,
describen la transformación de Aspergillus niger por un
vector de ADN que contiene un marcador seleccionable susceptible de
ser incorporado a células de A. niger anfitrionas; y
McKnight et al., Patente de los Estados Unidos Núm.
4.935.349, describen un método para expresar genes eucarióticos
superiores en Aspergillus que implica promotores capaces de
dirigir la expresión de un gen heterólogo en Aspergillus y
otros hongos filamentosos. Se han utilizado técnicas similares para
clonar el gen mtr implicado en el transporte de aminoácidos en
Neurospora crassa ("N. crassa") y para verificar
la estrecha conexión del ADN clonado con los marcadores genómicos
que flanquean este gen in vivo. Stuart, W.D. et al.,
Genome (1988) 30:198-203; Koo, K. and Stuart,
W.D. Genome (1991) 34:644-651.
Bennett et al., (1991) More Genetic
Manipulation of Filamentous Fungi, Orlando Florida, Academic Press,
páginas 396 a 428 revisan la expresión de genes heterólogos en
hongos filamentosos.
Los hongos filamentosos poseen muchas
características que hacen de ellos buenos candidatos para su uso en
la producción de proteínas eucarióticas. Los hongos filamentosos
pueden secretar proteínas complejas; proteínas tridimensionales
correctamente plegadas que incluyen la formación de puentes
disulfuro; proteínas cortadas proteolíticamente después de la
traducción; y proteínas glicosiladas utilizando reacciones de
N-glicosilación y O-glicosilación.
Estas capacidades han hecho de este grupo de organismos anfitriones
atractivos para la producción de proteínas recombinantes secretadas
(MacKenzie, D.A. et al., J. Gen. Microbiol. (1993)
139:2295-2307; Peberdy, J.F., Trends in
Biotechnology (1994) 12:50-57). En la mayoría de
los casos hasta la fecha, los niveles de producción viables
comercialmente de proteínas recombinantes (heterólogas) en hongos
filamentosos no han logrado alcanzar los niveles elevados de
producción de proteínas fúngicas naturales (homólogas). Esto se ha
atribuido a una amplia variedad de causas potenciales incluyendo los
elevados niveles de proteasas secretadas.
Recientemente se ha utilizado Neurospora
crassa como célula anfitriona para la producción de proteínas
homólogas y heterólogas recombinantes (Carattoli, A., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:6612-6616;
Yamashita, R.A. et al., Fungal Genetics Newsletter (1995
Supl.) 42A; Kato, E. et al., Fungal Genetics
Newsletter (1995 Supl.) 42A; Buczynski, S. et al.,
Fungal Genetics Newsletter (1995 Supl.) 42A). No
obstante, Neurospora crassa tiene al menos 5 (cinco)
proteasas extracelulares distintas, tres caracterizadas como
proteasas ácidas, al menos una proteasa neutra y al menos una
proteasa alcalina. (Lindberg, R.A. et al. J. Bacteriol (1982)
150(3):1103-1108). Estas proteasas
son altamente expresadas en condiciones de adulteración de uno o más
nutrientes esenciales, v.g., carbono, nitrógeno, azufre y pueden
producir un elevado nivel de degradación proteica de una proteína
recombinante expresada (Lindberg, R.A. et al. J. Bacteriol.
(1982) 150(3):1103-1108; Cohen, L.
et al., Archiv. Biochem. Biophys. (1975)
169:324-330; Abbott, R.A. et al., J.
Bacteriol. (1984) 159(2):505-510;
Hanson, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
72(4):1240-1244 (1975).
Las células anfitrionas ideales para su uso en
la producción de proteínas recombinantes tendrían las
características de:
1) ser simples y poco costosas de
desarrollar en cultivos de laboratorio;
2) ser capaces de secretar elevados
niveles del producto recombinante en medio líquido eliminando de
este modo la necesidad de romper la célula anfitriona para recuperar
el producto, simplificando de este modo los protocolos de
tratamiento aguas abajo;
3) ser capaces de plegar, cortar,
glicosilar o tratar de otro modo
post-traduccionalmente el producto recombinante de
una manera similar o idéntica a la célula en la cual se producía
originalmente en la naturaleza el producto;
4) tener uno o más marcadores genéticos
para la fácil identificación de las células transformadas; y;
5) proporcionar un entorno estable, no
desnaturalizante, no degradativo en el medio de producción de
manera que el producto recombinante se pueda acumular de forma
segura con el tiempo.
Las cepas del hongo filamentoso Neurospora
crassa que se encuentran en la naturaleza poseen algunas, pero
no todas, las características anteriores. Tales cepas son asequibles
de depósitos de partida tales como Fungal Genetics Stock Center,
Kansas City, Kansas. Las cepas disponibles poseen las
características de:
1) ser simples y poco costosas de
desarrollar en cultivos en laboratorio;
2) ser capaces de secretar hasta 250 mg
por litro de sus propias proteínas endógenas y;
3) ser capaces de plegar, unir,
glicosilar y tratar de otro modo
post-traduccionalmente sus propias proteínas
endógenas;
4) tener marcadores genéticos conocidos
que pueden ser rescatados mediante transformación y que son
adecuados para la fácil identificación de las células transformadas.
Los más simples de estos marcadores son las mutaciones que causan
un requerimiento nutricional individual y que pueden ser rescatadas
del requerimiento nutricional mediante transformación con el gen de
tipo salvaje apropiado (p. ej., his-2,
his-3, inl, trp-2);
5) tener mutaciones conocidas que
incrementan la velocidad de secreción de algunas o todas de las
proteínas endógenas extracelulares (p. ej., exo-1,
alelo no identificado en inl^{ts} 498).
No obstante, en ninguna parte en la naturaleza o
en las cepas recolectadas, incluyendo las cepas que contienen
mutaciones inducidas en el laboratorio, se encuentra ninguna
mutación que reduzca el nivel de proteasas extracelulares
secretadas normalmente por Neurospora crassa al medio ni hay
ninguna cepa o cepas en las que se puedan encontrar todas las demás
características genéticas deseables descritas ni se encuentran en
ningún subgrupo o combinación parcial de los mismos.
La presente invención proporciona cepas
mejoradas de Neurospora crassa, métodos de generar tales
cepas, y usos de las mismas, por ejemplo, para su uso en la
expresión de productos proteicos recombinantes. La construcción de
una cepa específica se utiliza a modo de ejemplo pero no se pretende
que esta ilustración específica del método limite el alcance de la
invención.
La presente invención proporciona líneas
celulares anfitrionas mejoradas de Neurospora para su uso en
la producción de proteínas recombinantes. Específicamente, la
presente invención proporciona Neurospora anfitrionas que
tienen reducida la actividad proteasa extracelular. Tales
anfitriones se caracterizan por no producir un halo en agar
gelatina sorbosa (SGA) después de al menos ocho días de incubación a
30ºC y se aíslan utilizando dos o más rondas de mutagénesis y
selección. Se descubrió que tales cepas producen proteínas
recombinantes secretadas a tasas multiplicativas después de cada
ronda de mutagénesis y selección.
De este modo, la presente invención proporciona
una cepa mutante de Neurospora, donde la cepa mutante
presenta una reducción de la actividad de la proteasa secretada
determinada mediante el fracaso de dicha cepa mutante para producir
halos después del crecimiento durante 8 días a 30ºC en placas de
agar gelatina sorbosa (SGA).
La presente invención proporciona adicionalmente
métodos mejorados de generación de líneas celulares de
Neurospora anfitrionas para su uso en la producción de
proteínas recombinantes. Los métodos mejorados utilizan dos o más
rondas de mutagénesis/selección para identificar líneas celulares
con reducción de la actividad proteasa extracelular.
Por lo tanto la invención también proporciona un
método para aislar una cepa mutante de Neurospora de la
invención a partir de una cepa parental de Neurospora,
comprendiendo el método utilizar dos o más rondas de mutagénesis y
selección para identificar la cepa mutante de Neurospora,
donde las células de Neurospora se seleccionan después de
cada ronda de mutagénesis por requerimiento de más días de
incubación para producir un halo en placas con sustrato de proteasa
de sorbosa que los requeridos por la cepa sometida a la mutagénesis,
donde al menos una de las rondas de mutagénesis y selección se
realiza después de introducir en el anfitrión un ADN exógeno que
codifica una proteína recombinante.
En un ejemplo, se mutagenizó una línea celular
de Neurospora exo 1/his-3 con luz UV y las
colonias con una disminución de capacidad para producir un halo en
placas de SGA al cabo de cuatro días a 30ºC se seleccionaron y se
sometieron a rondas adicionales de mutagénesis y selección. En un
ejemplo, después de tres rondas de mutagénesis, se encontró que las
líneas celulares producían de aproximadamente 27 a 125 veces la
cantidad de proteína recombinante secretada que la producida por la
cepa de partida.
La presente invención proporciona adicionalmente
métodos mejorados para producir proteínas recombinantes, siendo la
mejora el uso de líneas celulares de Neurospora anfitrionas
seleccionadas utilizando los métodos descritos en la presente
memoria. Por lo tanto la invención comprende un método para producir
una proteína recombinante, comprendiendo el método utilizar una
cepa mutante de Neurospora de la invención. En un ejemplo,
se demostró que tales cepas producen de aproximadamente 27 a 125
veces la cantidad de proteína recombinante secretada producida por
la cepa de partida.
La presente invención se basa en la observación
de que se pueden utilizar múltiples rondas de mutagénesis y
selección para aislar cepas de Neurospora que degradan
proteínas recombinantes seleccionadas a una velocidad menor que las
cepas de Neurospora de tipo salvaje y cepas de
Neurospora sometidas a una única ronda de mutagénesis y
selección. En un ejemplo, se produjeron cepas que secretaban
proteínas recombinantes recuperables a una velocidad de
aproximadamente 27 a 125 veces la observada en la cepa de partida.
Basándose en esta observación, la presente invención proporciona
métodos para aislar líneas celulares de Neurospora
anfitrionas mejoradas que se pueden utilizar para la producción
comercial de proteínas y líneas celulares de Neurospora
anfitrionas mejoradas aisladas mediante el método descrito. En
detalle, se puede aislar una línea de Neurospora anfitriona
mejorada que tiene una reducción de la capacidad para degradar
proteínas recombinantes secretadas sometiendo a mutagénesis una
cepa de Neurospora, seleccionando colonias clónicas que
tienen reducida la actividad proteasa secretada, y repitiendo
después el procedimiento de mutagénesis/selección durante una o más
rondas.
Según se utiliza en la presente memoria, una
cepa de Neurospora hace referencia a hongos filamentosos del
género Neurospora. Los ejemplos de las especies de
Neurospora que pueden ser modificadas como se describe en la
presente memoria incluyen, pero no están limitados a, Neurospora
crassa, N. africana, N. celata, N. discreta, N. dodgei, N.
galapagosensis, N. intermedia, N. lineolata, N. pannonica, N.
sitophila, N. sublineolata, N. terricola, y N. tetraserma.
Se puede utilizar cualquier cepa de
Neurospora como material de partida para el presente método.
Las cepas adecuadas son asequibles del Fungal Genetics Stock Center
(FGSC), Department of Microbiology, University of Kansas Medical
Center, Kansas City, Kansas 66103, o la Colección Americana de
Cultivos Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. La
cepa de partida preferida portará una mutación auxotrófica
nutricional que puede ser corregida por un único gen. Una mutación
auxotrófica complementable proporciona un marcador seleccionable
para su uso en la transformación del anfitrión generado. En los
siguientes Ejemplos, se utilizó una cepa auxotrófica de histidina
como material de partida. La cepa contenía una mutación
his-3 que es fácilmente complementable con un gen
his-3 de tipo salvaje clonado. Más abajo se
proporciona un estudio de diversos marcadores seleccionables.
Se pueden utilizar una variedad de métodos para
mutagenizar la cepa de partida de Neurospora para producir
un anfitrión con capacidades de producción de proteína mejoradas.
Las mutaciones se pueden realizar utilizando métodos dirigidos o no
dirigidos. Se dice que una mutación es no dirigida cuando el método
de mutagénesis empleado no se dirige a una secuencia génica o
localización cromosómica específica. Los procedimientos de
mutagénesis no dirigida que se pueden utilizar para producir
Neurospora anfitrionas mejoradas incluyen, métodos de
mutagénesis química y física, y combinaciones de los mismos. Los
ejemplos de los métodos de mutagénesis física incluyen, pero no
están limitados a irradiación UV, Davis et al., Methods of
Enzymology 17A:79-143 (1971). En los siguientes
Ejemplos, se sometieron a mutagénesis Neurospora utilizando
irradiación ultravioleta. Un experto en la técnica puede apreciar
fácilmente que los métodos de modificación física se pueden mejorar
utilizando agentes sensibilizadores químicos. Los ejemplos de los
agentes químicos para su uso en la mutagénesis no dirigida
incluyen, pero no están limitados a EMS.
Se dice que la mutagénesis es dirigida cuando el
método de mutagénesis está dirigido a una secuencia diana o región
diana específica. Los métodos de mutagénesis dirigida incluyen, pero
no están limitados a la mutagénesis dirigida al sitio in
vitro, las técnicas de recombinación homóloga y el uso de
elementos transponibles. Un experto en la técnica puede adaptar
fácilmente los procedimientos de mutagénesis para la inactivación de
genes para genes diana selectivamente implicados en la producción
de proteasas secretadas. Muchos de los genes implicados en la
producción de proteasas secretadas han sido clonados en
Neurospora. Se pueden utilizar dos o más rondas de
mutagénesis para la inactivación de genes para producir el anfitrión
mejorado de la presente invención. Adicionalmente, se pueden
utilizar combinaciones de mutagénesis dirigida y no dirigida.
Los métodos de mutagénesis preferidos son los
métodos no dirigidos. Tales métodos permiten generar múltiples
mutaciones al azar en uno o más de los genes responsables de la
producción y secreción de proteasas activas sin necesidad de
conocer la identidad o la localización cromosómica del gen o los
genes mutagenizados. Adicionalmente, la mutagénesis no dirigida
permite rastrear eficazmente un gran número de poblaciones clónicas
individuales de Neurospora mutagenizada.
En la presente invención, las cepas de
Neurospora son mutagenizadas para producir una cepa
anfitriona que tiene reducidos los niveles de actividad proteasa
secretada cuando se comparan con las cepas de tipo salvaje. Una
reducción en la actividad de las proteasas secretadas puede ser el
resultado de mutaciones en un gen de la proteasa, eliminando o
reduciendo la actividad de una proteasa concreta, por ejemplo
generando una mutación puntual o por desplazamiento del marco en la
región codificadora o reguladora de la proteasa; alteraciones en
las rutas que conducen a la secreción de la proteasa; por ejemplo
mutaciones en genes responsables del transporte de la proteasa; y
alteraciones en las rutas responsables de la inducción de la
expresión de la proteasa.
\newpage
Se puede utilizar una variedad de métodos para
identificar cepas en las cuales el método de mutagénesis empleado
produce la reducción de las proteasas exógenas. El método de
selección preferido cuenta con la capacidad de Neurospora
para degradar un sustrato de la proteína extracelular.
La Neurospora de tipo salvaje
desarrollada sobre medio sólido que contiene sorbosa y un sustrato
de proteasa proteico opaco, por ejemplo placas de
agar-gelatina con sorbosa (SGA), crece en forma de
colonias y produce un halo que rodea la colonia en crecimiento
(zona de aclaramiento). El halo aparece a los uno a cuatro días de
cultivo en placa y representa la degradación de las proteínas
extracelulares por las proteasas secretadas. Después de una ronda
de mutagénesis, las Neurospora que contienen mutaciones que
alteran la actividad de las proteasas secretadas serán
identificables o bien por la carencia de tales halos, o bien por
tener presentes halos más pequeños, después de cuatro días de
incubación. Después de una o más rondas adicionales de mutagénesis
y selección, se pueden identificar cepas que o bien carecen de tales
halos, o bien tienen presentes halos más pequeños, después de ocho
días de incubación. Todos los anfitriones mejorados de la presente
invención serán fácilmente identificables por su ineficacia
producir un halo después de crecer durante 8 días a 30ºC en placas
de agar-gelatina con sorbosa.
Antes de la presente invención, no ha habido
ninguna descripción de una cepa de Neurospora que no produzca
un halo después de ocho días de cultivo. Las cepas aisladas después
de tres rondas de mutagénesis/selección producirán incrementos
multiplicativos en la producción de proteína cuando se comparan con
la cepa de partida. Las cepas que producen 20, 30, 60, 90, 120 y
hasta 125 veces la proteína secretada recuperable pueden ser
aisladas después de tres rondas de mutagénesis.
Se pueden emplear una variedad de medios de
cultivo en placa para seleccionar las cepas anfitrionas mejoradas
de la presente invención. Un componente del medio esencial es la
sorbosa. La sorbosa permite que Neurospora crezca en forma
de colonias individuales cuando se cultiva en placa sobre medio
sólido.
El medio de cultivo en placa contiene
adicionalmente un sustrato de proteasa que es de ligeramente a
sumamente opaco. Los ejemplos de tales sustratos de proteasa
incluyen, pero no están limitados a agar-gelatina,
albúmina, sólidos de leche desnatada, caseína y citocromo c.
El medio preferido contendrá una pequeña
cantidad de un nutriente esencial, por ejemplo carbono, nitrógeno,
o azufre, o contendrá uno o más de estos componentes en una forma
que necesita ser degradada antes de que pueda entrar en (ser
transportada a) la célula de Neurospora. Se ha demostrado que
semejante medio incrementa la producción/actividad de proteasas
secretadas a partir de Neurospora, Abbott, R.A. et al.,
J. Bacteriol. (1984)
159(2):505-510; Hanson, M.A. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
72(4):1240-1244 (1975).
El pH del medio también se puede variar como un
medio para identificar las mutaciones en las clases de proteasas
específicas. Las proteasas se pueden clasificar según el pH
necesario para la actividad, por ejemplo, proteasas ácidas,
alcalinas y neutras. Cultivando en placa Neurospora
mutagenizada sobre el medio con un pH concreto, se pueden
identificar mutaciones que afectan a esa clase de proteasas.
El método de cultivo en placa/selección
utilizado en los siguientes ejemplos permite rastrear un gran número
de colonias locales después de la mutagénesis. Se pueden utilizar
métodos alternativos para identificar los anfitriones mejorados de
la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos que
detectan directamente la presencia de proteasas secretadas para
identificar la Neurospora anfitriona de la presente
invención. La actividad proteasa se puede someter a ensayo
directamente a partir de sobrenadantes de cultivo utilizando los
métodos descritos en la técnica. Alternativamente se puede
determinar la presencia de una proteasa concreta utilizando ensayos
inmunológicos, tales como un ensayo ELISA.
En los presentes métodos, se utilizan dos o más
rondas de mutagénesis. Se ha observado que se requieren dos o más
rondas de mutagénesis para identificar líneas celulares anfitrionas
que no produzcan halos después de ocho días de cultivo a 30ºC sobre
placas de SGA. Tal selección identifica cepas con incrementos
multiplicativos en la producción de proteína secretada recuperable
en comparación con las cepas de partida. En una aplicación del
presente método, se aísla una cepa utilizando dos o más rondas de
mutagénesis/selección antes de introducir un ADN exógeno en la
célula para su uso en la producción de una proteína heteróloga.
Alternativamente, se utiliza una única ronda de
mutagénesis/selección antes de introducir un ADN exógeno en la
célula y después se realizan una o más rondas de
mutagénesis/selección adicionales después de la introducción del ADN
exógeno.
Una vez aislada, la Neurospora anfitriona
mejorada de la presente invención se puede utilizar para producir
proteínas recombinantes. La producción de proteínas se intensificará
significativamente debido a la reducción de actividad de las
proteasas secretadas cuando se compara con las cepas de tipo
salvaje.
Los mecanismos normalizados para la
transformación de hongos filamentosos y el cultivo de hongos son
bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar para transformar
los anfitriones mejorados de la presente invención para la
producción de proteínas recombinantes. Una revisión extensa de los
mecanismos aplicados a N. crassa se encuentra, por ejemplo
en Davis et al., Methods Enzymol. (1971)
17A:79-143. Los procedimientos normalizados
se utilizan generalmente para el mantenimiento de cepas y la
preparación de conidios. Los micelios se desarrollan típicamente en
cultivos líquidos durante aproximadamente 14 horas (25ºC), como
describen Lambowitz et al., J. Cell Biol. (1979)
82:17-31. Las cepas anfitrionas se pueden
desarrollar generalmente en medio mínimo de Vogel o Fries
enriquecido con los nutrientes apropiados, tales como, por ejemplo,
histidina; arginina; phe, tyr, y/o trp (cada uno aproximadamente 80
\mug/ml); ácido p-aminobenzoico (aproximadamente 2
\mug por ml); e inositol (aproximadamente 0,2 mg por ml).
Cuando se ha activado la expresión y se ha
producido la proteína deseada, se puede recuperar la proteína del
cultivo utilizando mecanismos generalmente reconocidos en la
técnica. Puesto que la proteína es secretada al medio, el medio se
puede separar y la proteína secretada purificar utilizando
mecanismos convencionales tales como exclusión por tamaños,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase reversa,
centrifugación diferencial, y similares. Los protocolos adecuados
dependerán de la naturaleza del producto proteico.
El anfitrión mejorado de la presente invención
está destinado al uso en la producción de una proteína recombinante
secretada. Para ayudar a este uso, la cepa de partida puede contener
un marcador auxotrófico que se puede complementar con un único gen
o se puede emplear un marcador seleccionable/agente de selección. La
elección apropiada del marcador seleccionable dependerá de la
naturaleza de la proteína que se va a producir y de la naturaleza
de la cepa de partida. Una elección directa podría ser, por ejemplo,
un sistema de expresión que produce una enzima responsable de una
resistencia a antibióticos frente a un antibiótico al cual es
susceptible el anfitrión, tal como benomilo. Alternativamente, si
se selecciona un anfitrión, por ejemplo con una deficiencia
nutricional, se puede utilizar un gen de tipo salvaje para remplazar
la deficiencia. Para hacerlo, no obstante, se requiere un mutante
adecuado.
Aunque se puede preparar generalmente una cepa
de partida, son fácilmente asequibles numerosos mutantes de
Neurospora que hacen más diverso el diseño de vectores de
transformación que contienen medios para la selección. Por ejemplo,
en un método muy simple para la selección se utiliza una cepa con un
requerimiento por un nutriente concreto donde el medio marcador
seleccionable se proporciona remplazando el gen defectuoso que
representa este requerimiento nutricional. Como ilustración, si se
utiliza una cepa incapaz de desarrollarse en ausencia de histidina
como cepa de partida, se pueden seleccionar los transformantes
acertados utilizando como "marcador" ácido nucleico que
contiene el tipo salvaje del gen que es defectuoso en el mutante y
haciendo crecer las células transformadas sobre medio mínimo.
Solamente los transformantes acertados serán capaces de crecer en
ausencia de histidina. Asimismo se conocen mutaciones similares que
dan como resutado una dependencia de la presencia de otros
aminoácidos u otros nutrientes del medio. En N. crassa, por
ejemplo, los mutantes conocidos incluyen mutantes que tienen
requerimientos nutricionales específicos. Los ejemplos de los
requerimientos de nutrientes útiles y los mutantes relevantes
incluyen:
incluyen:
(1) aminoácidos tales como histidina
(mutantes his-1 a -7), prolina (mutantes aga),
arginina (mutantes arg-11), citrulina (mutantes
arg-11), asparragina (mutantes asn), colina
(mutantes chol-1 y chol-2), cisteína
(mutantes cys-1), glutamina (mutantes
gln-1), leucina (leu-1 a -4), lisina
(lys-2, -4 y -5), metionina (mutantes mac y
mutantes met-6, -9 y -10), y treonina (mutantes
thr-2 y -3);
(2) mezclas de aminoácidos aromáticos,
tales como una mezcla de ácido p-aminobenzoico,
tirosina, triptófano, y fenilalanina (requerida por todas las cepas
aro excepto aro-6, aro-7 y
aro-8), una mezcla de triptófano y fenilalanina
(requerida para los mutantes aro-6), una mezcla de
isoleucina y valina (requerida para ilv-1, -2 y
-3), y una mezcla de fenilalanina y tirosina (requerida para los
mutantes pt).
(3) vitaminas tales como ácido pantoténico
(mutantes pan-1) y tiamina (mutantes
thi-2 y thi-4);
(4) bases de purina tales como adenina (mutantes
ad-2 a ad-4 y ad-8),
hipoxantina (mutantes ad-2 y ad-3),
inosina, y guanina o guanosina (mutantes gua-1 o
-2);
(5) bases de pirimidina tales como uracilo
(pyr-1 a pyr-6);
(6) ácidos grasos saturados (mutantes cel) o
ácidos grasos insaturados tales como ácidos grasos C_{16} o
C_{18} que tienen un doble enlace en la conformación cis en
posición 9 u 11, ácidos grasos con un doble enlace en configuración
trans en la posición 9, y ácidos grasos con múltiples dobles enlaces
en cis interrumpidos por puentes metileno (ufa-1 y
-2);
(7) iones fisiológicamente importantes tales
como potasio (trk);
(8) alcoholes de azúcares tales como inositol
(mutantes acu y mutantes inl) y glicerol; y
(9) otras entidades orgánicas tales como acetato
(mutantes ace), I-cetoglutarato, succinato, malato,
formiato o formaldehído (para los mutantes), ácido
p-aminobenzoico (mutantes pab-1, -2
y -3), y sulfonamida (mutantes sfo a 35ºC).
También se pueden utilizar otros sistemas
marcadores seleccionables, tales como la inclusión de genes que
confieren resistencia a sustancias tóxicas u otras condiciones de
cultivo perjudiciales. Por ejemplo, se pueden utilizar genes que
codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos donde
la selección se realiza en medios que contienen el antibiótico. En
el caso de los hongos filamentosos, tales antibióticos incluyen
benomilo.
La presente invención proporciona adicionalmente
un anfitrión aislado mediante los métodos descritos en la presente
memoria. Un ejemplo de un anfitrión aislado con los presentes
métodos es indicado como Hep-25/24 y se ha
consignado en la Colección Americana de Cultivos Tipo el 14 de
Diciembre de 1995, bajo los términos del Tratado de Budapest. La
producción del anfitrión Hep-25/24 se describe con
detalle en los ejemplos.
Los siguientes ejemplos están destinados a
ilustrar pero no limitar la invención.
Todas las cepas de partida se obtuvieron del
Fungal Genetics Stock Center (FGSC), Department of Microbiology,
University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas 66103. Las
cepas se identifican por el nombre de su locus y su número de
partida del FGSC según se enumeran en el "Catalog of Strains"
asequible del Stock Center.
Todas las técnicas para el desarrollo,
emparejamiento y recuperación de la progenie de los cultivos de
Neurospora siguen métodos bien establecidos que están bien
descritos en "Genetics and Microbiological Research Techniques
for Neurospora crassa" de R.H. Davis, and F.J. DeSerres,
Methods in Enzymology Volumen 17A, 79-143, 1970.
Las técnicas específicas para la identificación
de productos recombinantes utilizan ensayos normalizados
desarrollados para cada producto concreto. Estos incluyen pero no
están limitados a los ensayos de inmunoabsorción con enzima ligada
(ELISA) y los ensayos de actividad normalizados.
La cepa exo-1 (FGSC núm. 2256)
es un sobreproductor de enzimas extracelulares que incluye amilasa e
invertasa (H. Gratzner and D. Sheehan, J. Bact. 97: pág.
544-549, 1969). La cepa his-3 (FGSC
núm. 2278) requiere enriquecimiento con histidina en el medio
debido a una mutación en un gen complejo que codifica múltiples
actividades enzimáticas en la ruta biosintética de la histidina de
Neurospora (D.D. Perkins, et al., Microbiological
Reviews, 46:p426-570, 1982).
La cepa exo-1 se cruzó con la
cepa his-3 y se recuperó una progenie doble mutante
exo-1;his-3. Esta progenie se
denominó hisexo y se recuperaron ejemplos de ambos tipos de
emparejamiento de Neurospora A y a.
Un producto aislado denominado
hisexo-1a se desarrolló sobre medio sólido conocido
por inducir la producción de proteasa extracelular (Lindberg, R.A.,
et al., J. Biol. Chem. 256(2):811-814
(1981). Esta cepa producía halos visibles sobre placas de
sorbosa-agar-gelatina después de
cuatro días de crecimiento a 30ºC.
La mutagénesis de la cepa
hisexo-1a se completó exponiendo una suspensión de
conidióforos obtenidos de un cultivo inclinado sólido de
hisexo-1a a una fuente de luz Ultravioleta (W
Crosslinker, FB-UVX-1000 Fisher
Scientific) durante un tiempo suficiente (20 segundos) para obtener
una destrucción del 60-80% a partir de la
exposición a UV. Las células supervivientes se cultivaron en placa
sobre un medio de inducción de proteasa sólido en placas de Petri
normalizadas a una dilución calculada para rendir
50-100 colonias por placa. Las colonias resultantes
se puntuaron después de 4 días de crecimiento. Las colonias con
halos no visibles se seleccionaron y se transfirieron a cultivos
inclinados en agar con medio mínimo de Vogel (Davis and DeSerres)
para una prueba adicional. Aproximadamente se puntuaron 20.000
colonias y se seleccionaron 67 para la prueba adicional. Una
colonia seleccionada producía un fenotipo estable y reproducible sin
halo el día 4 y se denominaba Hep-25
(histidina-proteasa exoextracelular). Las colonias
de Hep-25 desarrollaban halos visibles si se dejaban
crecer durante 8 días.
Se realizó una segunda ronda de mutagénesis como
se ha descrito antes utilizando Hep-25 como cepa de
partida y puntuando las colonias resultantes que carecían de halos
después de 8 días. De nuevo se puntuaron aproximadamente 20.000
colonias y se seleccionaron 52 para un estudio adicional. Una de
estas producía un fenotipo estable y reproducible y se denominaba
Hep-25/24.
Se transformó Hep-25/24 mediante
métodos normalizados (Vollmer, S.J. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83:4869-4873 (1986)) con una muestra
de ADN que contenía el plásmido pNH60 (obtenido de FGSC) que
contenía la secuencia del gen his-3 de tipo salvaje
y un plásmido que contenía un vector de expresión de
Neurospora conducido por el promotor de la ARN polimerasa
del gen de la glucoamilasa de Neurospora (Patente Pendiente
PTC, Alan Radford and University of Leeds, United Kingdom), que
contenía un gen de ADNc que codificaba la subunidad de la cadena
kappa humana de la inmunoglobulina G humana (IgG) que incluía el
extremo amino que codificaba el sitio de reconocimiento de la
partícula de reconocimiento de la señal y la señal de secreción y
terminaba en el sitio de terminación de la transcripción de la
glucoamilasa y el sitio de poliadenilación (Radford op cite). Los
transformantes se seleccionaron en cuanto al crecimiento de las
colonias sobre medio mínimo sólido enriquecido con sorbosa pero sin
un suplemento de histidina.
Las colonias transformadas se seleccionaron con
pipetas desechables de vidrio estéril, se transfirieron a placas de
microtitulación estériles que contenían filtros de 0,45 \mu en la
base del pocillo (Millipore) cubierto con un forro de plástico
estéril para evitar el derramamiento y se hicieron crecer en medio
de Vogel líquido (Davis and DeSerres op cite) enriquecido con 2% de
sorbosa a 30ºC con sacudimiento a 150 rpm. Después de 48 horas se
separó el forro de plástico y el medio se empujó a través de los
filtros del fondo y se recogió en una placa de microtitulación
normalizada utilizando un colector diseñado para semejante
recolección (Millipore). La placa que contenía las células se
almacenó a 4ºC mientras el medio se sometía a ensayo en cuanto a la
presencia de la proteína de la cadena kappa humana mediante un
ELISA sándwich.
Los cultivos identificados mediante el ensayo
por producir elevados niveles de proteína kappa en el medio se
transfirieron desde la placa de cultivo de microtitulación a
cultivos inclinados en agar sólido. En muchas series de
experimentos paralelos, el porcentaje de colonias transformadas que
también producían la proteína recombinante variaba del
10-30% de todos los transformantes seleccionados.
Como práctica general, los seis cultivos más elevados se
transfieren normalmente para su estudio adicional. Después los
grandes productores estables se hacen pasar a través de una fase de
crecimiento de microconidios para asegurar los núcleos
homocarióticos en la cepa de producción (Ebbole, D. et al.,
Fungal Genetics Newsletter 37:17-18
(1990). Los subcultivos de microconidios se seleccionaron del medio
de las colonias en placas de Petri y se transfirieron a un nuevo
grupo de placas de cultivo de microtitulación con filtros en el
fondo y se desarrollaron y se sometieron a prueba como se ha
descrito antes para el procedimiento de selección original. Las
colonias que producían la mayor cantidad de producto recombinante
(en este ejemplo la cadena kappa humana identificada mediante ELISA)
se transfirieron a medio sólido mínimo en tubos inclinados.
Se llevó a cabo una ronda del protocolo de
mutagénesis adicional de las cepas con microconidios que se demostró
que eran productores estables y se cultivaron en medio mínimo para
colonias sólido. En este protocolo las colonias que aparecían al
cabo de 2-3 días se escogieron sobre placas de
crecimiento de microtitulación/filtro y después de 2 días de
crecimiento se seleccionaron en cuanto al aumento de producción de
la proteína recombinante (en este caso la cadena kappa humana
identificada mediante ELISA). Entre el 1 y el 2% de todas las
colonias examinadas presentaba un aumento de producción. Los 6
mayores productores se sometieron a prueba en cuanto a la
estabilidad de los niveles de producción en cultivos con
sacudimiento líquidos de 25 ml. El mayor productor, más estable se
seleccionó como cepa parental para una segunda ronda de mutagénesis
y selección como se ha descrito antes.
Los experimentos se han realizado utilizando
tres rondas de este procedimiento de selección. Se encontró que en
cada nivel, es típica una mejora de 3-5 veces en los
niveles de producción para los mutantes de producción más elevada.
Estas mejoras no son aditivas sino multiplicativas de manera que
después de tres rondas de mutación y selección, el incremento en
los niveles de producción de proteína recombinante oscila entre 27 y
125 veces. No se ha alcanzado un límite superior de la mejora de
producción posible mediante este método aunque claramente debe
existir uno ya que el número y el tipo de genes que controlan la
producción y la secreción de las proteasas y las proteínas
recombinantes debe estar limitado por el tamaño y la complejidad del
genoma de Neurospora.
Las cepas desarrolladas por los métodos
descritos antes se pueden utilizar como anfitriones para las
proteínas recombinantes distintas de la proteína recombinante
original utilizada en el procedimiento de selección. Esto se puede
efectuar de la siguiente manera.
Si el ADN transformante para el locus
his-3 (u otro selectivo) en la línea celular
transformada original está dirigido específicamente a ese locus
utilizando métodos normalizados de transformación de solamente una
secuencia parcial del gen marcador (esto es his-3)
pero una secuencia parcial que abarca el sitio de mutación genómica
del gen marcador, es probable que la célula transformada porte
solamente una secuencia génica marcadora recombinante, funcional,
intacta. De un modo similar, si la casete de expresión del gen de
ADNc recombinante está flanqueada por secuencias largas de ADN
genómico de Neurospora, es muy probable que se produzca la
inserción de la casete de expresión como un único evento en el
sitio del ADN que flanquea el gen recombinante. Ambas posibilidades
son fácilmente verificadas mediante simples transferencias Southern
del ADN genómico del transformante inicial utilizando el marcador y
el ADN de la casete de expresión como sondas. Si la secuencia de ADN
limítrofe se selecciona cuidadosamente de manera que la inserción
ocasione la mutagénesis de un gen no esencial pero seleccionable
(p. ej., am (nitrato reductasa) o mtr (transporte de aminoácidos
neutros) o caf (resistencia a la cafeína) por mencionar solamente
tres de los muchos sitios potenciales (ver Perkins et al., op
cit.)) la inserción se puede seleccionar como una pérdida de
función del gen de la secuencia limítrofe.
Las cepas anfitrionas modificadas con las
características anteriores se pueden transformar después
simultáneamente con una mezcla de ADN que contiene la secuencia
plasmídica del gen marcador (p. ej. his-3) que se ha
construido para llevar a cabo una pequeña deleción interna en la
región codificadora que por lo tanto codifica un polipéptido no
funcional y la secuencia de ADN genómico de tipo salvaje en el locus
de la secuencia limítrofe en torno a la secuencia de la casete de
expresión del gen del ADNc original (p. ej. cadena kappa
humana).
Primero se seleccionarían los transformantes
para la restauración del fenotipo de la secuencia del gen limítrofe
(esto es, reversión a am+) cuando crecieran sobre medio enriquecido
con histidina, después se someterían a prueba en cuanto a la
pérdida de esta función de tipo salvaje his-3
sometiendo a prueba la pérdida de capacidad para crecer en medio no
enriquecido con histidina y finalmente, se sometería a prueba en
cuanto a la pérdida de capacidad para producir el producto
recombinante original. Se esperaría que tal transformante fuera
idéntico a la cepa de la célula anfitriona modificada excepto que
ahora habría perdido de nuevo su gen marcador de tipo salvaje (p.
ej. his-3) y habría remplazado el constructo de
expresión de ADNc que contiene la secuencia de la proteína
recombinante original (proteína kappa humana) por una secuencia
genómica de ADN de tipo salvaje de Neurospora normal. Una
vez más esta expectativa se verifica mediante transferencia Southern
utilizando las sondas de ADN apropiadas.
Esta nueva célula anfitriona está lista ahora
para ser transformada con un segundo constructo de expresión de
ADNc similar al primero descrito en esta ilustración pero que
contiene una secuencia de ADNc diferente para la expresión (p. ej.,
anticuerpo de cadena gamma humana, tPA humano, insulina humana,
etc.). Una vez más, se pueden escrutar los transformantes iniciales
mediante selección por transformación simultánea con una secuencia
marcadora de tipo salvaje funcional (p. ej., his-3)
como se ha descrito originalmente antes.
Claims (9)
1. Una cepa mutante de Neurospora, donde
la cepa mutante presenta una reducción de la actividad de la
proteasa secretada como se determina mediante la ineficacia de
dicha cepa mutante para producir halos después del crecimiento
durante 8 días a 30ºC sobre placas de
sorbosa-agar-gelatina (SGA).
2. Una cepa mutante según la reivindicación 1,
donde la cepa mutante tiene un genotipo exo-1 y un
requerimiento de aminoácidos para el crecimiento.
3. Una cepa mutante según la reivindicación 2,
donde el requerimiento de aminoácidos es para la histidina.
4. Una cepa mutante según la reivindicación 3,
donde el genotipo comprende un genotipo his-3.
5. Un método para producir una proteína
recombinante, comprendiendo el método utilizar una cepa mutante de
Neurospora según una cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
6. Un método para aislar una cepa mutante de
Neurospora según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, comprendiendo el método utilizar dos o más rondas de mutagénesis
y selección para identificar la cepa mutante de Neurospora,
donde las células de Neurospora se seleccionan después de
cada ronda de mutagénesis por el requerimiento de más días de
incubación para producir un halo en las placas de
sorbosa-sustrato de proteasa que los requeridos por
la cepa sometida a mutagénesis, donde al menos una de las rondas de
mutagénesis y selección se realiza después de introducir un ADN
exógeno que codifica una proteína recombinante en el anfitrión.
7. Un método según la reivindicación 6, donde se
utiliza la mutagénesis no dirigida.
8. Un método según la reivindicación 7, donde se
utiliza la iluminación UV para la mutagénesis no dirigida.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, donde se llevan a cabo tres rondas de
mutagénesis.
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