ES2241665T5 - Sistema de produccion de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende: (a) transformar la línea germinal de un insecto con un sistema de expresión basado en un transposón, capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto; (b) criar el insecto para que produzca larvas; (c) criar masivamente las larvas; y (d) aislar la proteína de interés a partir de las larvas criadas masivamente.
Description
Sistema de producción de proteínas.
La presente invención se refiere a un sistema
para la producción de proteínas en larvas de insectos.
Particularmente, la invención abarca la producción de proteínas de
interés en larvas de Drosophila y de Moscamed.
Los sistemas de producción de proteínas, en los
que se producen los polipéptidos o proteínas de interés en
organismos o células recombinantes, constituyen la columna vertebral
de la biotecnología comercial. A los primeros sistemas, basados en
la expresión bacteriana en huéspedes tales como E. coli, se
han unido sistemas basados en huéspedes eucarióticos, en particular
cultivos de células de mamífero, células de insectos, tanto
cultivos como en forma de insectos enteros, y mamíferos
transgénicos, tales como ovejas y cabras.
Los sistemas de cultivo de células procarióticas
son fáciles de mantener y fáciles de operar. Sin embargo, las
células procarióticas no son capaces de llevar a cabo la
modificación post-traduccional de las proteínas
eucarióticas. Además, muchas proteínas se encuentran incorrectamente
plegadas, requiriendo procedimientos específicos para plegarlas
nuevamente, lo que incrementa el coste de producción.
Se han descrito sistemas de cultivo de células
eucarióticas en varias aplicaciones. Por ejemplo, las células de
mamífero son capaces de llevar a cabo modificaciones
post-traduccionales y generalmente producen
proteínas que se encuentran correctamente plegadas y son solubles.
Entre las desventajas principales de los sistemas de células de
mamífero se encuentran la necesidad de disponer de equipos
especializados y caros para el cultivo, y el riesgo de infección,
que puede llevar a la pérdida de todo el cultivo.
Los sistemas de producción vegetales pueden
utilizarse para la expresión de proteínas, y pueden conseguir una
producción de alto rendimiento. Sin embargo, los cultivos de plantas
transgénicas son difíciles de contener, planteando el riesgo de la
contaminación del medio ambiente con material que ha sido manipulado
genéticamente.
Las células de insecto también se utilizan para
la expresión de polipéptidos. El sistema de expresión más extendido
que se ha utilizado en células de insecto se basa en los vectores
baculovirus. Un vector de expresión baculovirus se construye
sustituyendo el gen de la polihedrina del baculovirus, el cual
codifica una proteína estructural importante del baculovirus, por
un gen heterólogo, bajo el control del promotor nativo fuerte de la
polihedrina. Las células huésped de insecto en cultivo se infectan
con el virus recombinante, y la proteína producida de esta manera
puede recuperarse de las células mismas, o del medio de cultivo si
se utilizan señales de secreción adecuadas. Estos sistemas, sin
embargo, también adolecen de problemas asociados con la infección
del cultivo y la necesidad de disponer de equipos de cultivo
especializados.
Los sistemas de expresión basados en organismos
evitan muchas de las desventajas de la infección y son más fáciles
de cultivar que los cultivos celulares. Por ejemplo, la utilización
de vectores virus, tales como el baculovirus, permiten la infección
de insectos enteros, que presentan menos requisitos de condiciones
especiales de cría. Los insectos grandes, tales como las mariposas
de la seda, proporcionan un rendimiento elevado de proteínas
heterólogas. Las proteínas pueden extraerse de los insectos de
acuerdo con técnicas de extracción convencionales.
También son conocidas las técnicas basadas en la
expresión de proteínas de interés en mamíferos, tales como cabras y
ovejas, bajo el control de secuencias de control de la expresión de
las proteínas de la leche que permiten la expresión de las mismas
en la leche. Dichas técnicas presentan grandes ventajas potenciales,
pero son caras debido a la necesidad de aislar los virus, priones y
proteínas endógenos del mamífero respecto al producto final.
Además, el coste de generar y mantener animales transgénicos grandes
es elevado.
Se ha propuesto la utilización de larvas de
insecto, aquéllas de Trichoplusa ni, en sistemas de
producción de proteínas (Pham et al., 1999, Biotech. Bioeng.
62:175-182). Sin embargo, tales sistemas tan solo se
han propuesto en combinación con tecnología de vectores virales
basada en los baculovirus.
En el caso de que las proteínas estén destinadas
a la utilización dietética o farmacéutica, no resulta deseable la
utilización de sistemas bacterianos y/o vectores virales. Por lo
tanto, existe una necesidad en la técnica de un sistema de
producción de proteínas que sea robusto y escalable, tal como los
sistemas basados en organismos enteros, y libre de vectores basados
en virus, así como de funcionamiento económico en un ambiente
controlado.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente
invención proporciona:
- (a)
- transformar la línea germinal de un insecto seleccionado de entre el grupo constituido por Bactrocera oleae (mosca del olivo), Bactrocera orientalis (mosca oriental de la fruta), Heliothis armigera (oruga del algodón), Trichoplusa ni (polilla de la col), Manduca sexta (gusano del tabaco), Lobesia botrana (polilla del racimo de la vid), Anopheles gambiae (mosquito), Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla), Glossina morsitans (mosca tse-tse), Simulium sp. (mosca negra), Phlebotomus sp. (mosca de la arena), Musca domestica (mosca doméstica), Drosophila melanogaster y Ceratitis capitata (Moscamed) con un sistema de expresión basado en un transposón, capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto y de secretar la proteína en la hemolinfa bajo el control de las zonas de control y los péptidos de señalización adecuados;
- (b)
- criar el insecto para que produzca larvas;
- (c)
- criar masivamente las larvas; y
- (d)
- aislar cantidades en milígramos de la proteína de interés a partir de las larvas criadas masivamente, en el que el transposón se selecciona de entre el grupo constituido por Minos, mariner, Hermes, sleeping beauty y piggyBac.
El procedimiento de acuerdo con la presente
invención permite la rápida producción de cantidades de miligramos
de polipéptidos con fines de investigación, la producción de
cantidades de kilogramos de proteínas para aplicaciones clínicas y
diagnósticas y potencialmente miles de kilogramos de enzimas
industriales a bajo coste, debido a la facilidad con la que pueden
cultivarse las larvas de insectos utilizando técnicas de cultivo
establecidas.
Las ventajas de los procedimientos de acuerdo
con la invención son múltiples. La cría masiva de larvas de
insectos resulta posible utilizando la tecnología existente y
permite la producción de productos polipéptidos a un coste
extremadamente bajo, en un ambiente de producción controlado. Lo
anterior facilita la obtención de autorización legal en comparación
con organismos enteros, tales como mamíferos, con los que debe
demostrarse primero la ausencia de virus y priones, previamente a
la obtención de la autorización. Además, el procedimiento de la
invención evita las desventajas asociadas con el cultivo de células
animales (incluyendo las de insecto), que conlleva el riesgo más
elevado de infección, y el riesgo de contaminación viral o con
priones en el caso del cultivo de células de mamífero o de los
sistemas transgénicos de producción.
El término "proteína" incluye moléculas de
polipéptido de una sola cadena, así como complejos de múltiples
polipéptidos, en los que los constituyentes polipéptido individuales
se encuentran unidos covalente o no covalentemente. El término
"polipéptido" incluye péptidos de dos o más aminoácidos de
longitud, presentando típicamente más de 5, 10 ó 20
aminoácidos.
El sistema de expresión utilizado en el
procedimiento de la invención comprende unos elementos de control
que se encuentran activos en las células de insecto, y
particularmente en las larvas de insecto. Muchas secuencias de
control de los insectos, incluyendo diversos promotores, se
encuentran activos en varias especies diversas. Por lo tanto, no
resulta esencial utilizar secuencias derivadas del insecto en
cuestión. Pueden utilizarse secuencias activas inducible o
constitutivamente.
Preferentemente, las secuencias de control son
secuencias inducibles. Un promotor inducible preferido es el
promotor de la proteína de choque térmico HSP70, que resulta
inducido al incrementar la temperatura a la que se cultivan las
larvas, y los sistemas de expresión inducibles con tetraciclina
(Heinrich y Scott, PNAS 97:8229-8232, 2000).
Con el fin de incrementar la producción de
proteínas pueden utilizarse múltiples sistemas de expresión. Estos
sistemas pueden construirse con dos o más secuencias codificantes
presentes en cada sistema, o como múltiples sistemas únicos. En
cualquiera de los dos casos, puede utilizarse un cromosoma
equilibrador con el fin de favorecer la retención y transmisión a
la progenie del sistema de expresión durante el cruzamiento de los
insectos.
Una ventaja de la cría de larvas de insecto es
que los cultivos pueden sincronizarse, de manera que todas las
larvas alcancen el mismo nivel de madurez simultáneamente. Esto
puede conseguirse variando la temperatura del cultivo, debido a que
las larvas se desarrollan más lentamente a temperaturas más bajas.
Por ejemplo, a 18ºC las larvas se desarrollan a la mitad de la
velocidad a la que crecen a 25ºC.
La figura 1 muestra la estructura del transposón
pMiHspGFP/HspCcW, que expresa GFP y el gen white bajo el control
del promotor Hsp70.
La figura 2 muestra la estructura del plásmido
pMiAct5CGFP, que expresa GFP bajo el control del gen Actin 5C de
Drosophila.
La figura 3 muestra la expresión de GFP en
moscamed transgénicas y en larvas de moscamed tras el choque
térmico.
La figura 4 muestra la expresión constitutiva de
GFP en moscas Drosophila.
La figura 5 muestra la expresión constitutiva de
GFP en adultos de Drosophila. La fluorescencia observada es
dependiente de la dosis génica.
La figura 6 muestra la expresión de GFP en
larvas de Drosophila (arriba: transgénicas; abajo: tipo
salvaje).
La figura 7 muestra la estructura de un vector
de expresión de una proteína en la hemolinfa de las larvas. LspP/L
es el promotor del gen de la proteína sérica de larvas (Lsp) de
Drosophila o de Moscamed, seguido del líder Lsp 5' no
traducido (segmento rayado) y del péptido de señalización Lsp
(segmento de color negro). El gen de interés se encuentra fusionado
conservando el marco de lectura del péptido líder. HspP y HspT son
el promotor y terminador, respectivamente, del gen 70 de choque
térmico. CcW es el gen white de moscamed, utilizado como marcador
visible dominante para la detección de transformantes. MiL y MiR son
los extremos del elemento Minos.
La figura 8 es una secuencia preliminar de un
clon de anticuerpo anti-PERV p30 aislado a partir de
una biblioteca de anticuerpos de camélido y expresada en larvas de
moscamed.
Aunque en general las técnicas indicadas en la
presente memoria son bien conocidas en la técnica, puede hacerse
referencia en particular a Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (1989) y a Ausubel et al.,
Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4ª edición, John Wiley
& Sons, Inc.
Los transposones son elementos genéticos que son
capaces de "saltar" o transponerse de una posición a otra
dentro del genoma de una especie. Se encuentran ampliamente
distribuidos entre los animales, incluyendo los insectos.
Los transposones son activos dentro de su
especie huésped debido a la actividad de una proteína transposasa
codificada por los elementos mismos, o proporcionada por otros
medios, tales como mediante inyección de ARNm que codifica la
transposasa, mediante la utilización de una segunda secuencia
codificante que codifica la transposasa, o mediante la adición de
la proteína transposasa misma. Los avances en la comprensión de los
mecanismos de transposición han resultado en el desarrollo de
herramientas genéticas basadas en los transposones y que pueden
utilizarse para la transferencia de genes.
El elemento transponible se selecciona de entre
el grupo constituido por Minos, mariner,
Hermes, Sleeping Beauty y piggyBac.
Minos es un elemento transponible que se
encuentra activo en la moscamed. Ha sido descrito en la patente US
nº 5.840.865, que se incorpora a la presente memoria como
referencia. La utilización de Minos para transformar
insectos se describe en la patente US anteriormente indicada.
Mariner es un transposón originalmente
aislado a partir de Drosophila, pero que posteriormente ha
sido descubierto en varias especies de invertebrados y de
vertebrados. La utilización de mariner para transformar
organismos se describe en la solicitud de patente internacional nº
WO99/09817.
Hermes se deriva de la mosca doméstica
común. Su utilización para crear insectos transgénicos se describe
en la patente US nº 5.614.398, incorporada en el presente documento
como referencia en su integridad.
PiggyBac es un transposón derivado del
huésped baculovirus Trichoplusia ni. Su utilización para la
transformación de la línea germinal de Moscamed ha sido descrita por
Handler et al., PNAS (USA) 95:7520-5
(1998).
La transferencia génica se lleva a cabo mediante
transformación demostrada de la línea germinal mediada por
transposón. El transposón seleccionado es Minos, el cual se
ha demostrado que funciona como un vector de transgénesis en la
moscamed (Loukeris et al., 1995) y en Drosophila.
Pueden utilizarse como alternativas otros transposones funcionales
en la moscamed, tales como piggyBac (McCombs et al.,
1998). La metodología de transformación de la moscamed está bien
descrita en la literatura (Loukeris et al., 1995).
Brevemente, se coinyecta en embriones preblástula de moscamed un
plásmido circular de ADN que contiene un transposón consistente en
un gen de interés (tal como eritropoyetina, junto con secuencias de
ADN reguladoras apropiadas), flanqueado por los dos extremos del
transposón, junto con una fuente de transposasa (un plásmido que
expresa transposasa, ARNm sintetizado in vitro que codifica
transposasa, o la proteína transposasa misma). En los embriones
tempranos, la transposasa interactúa con los extremos del transposón
y cataliza la extracción del mismo y su reintegración en los
cromosomas en posiciones aleatorias. Habitualmente, con el fin de
facilitar la detección de las moscas transgénicas, también se
incluye en el transposón un "gen marcador", tal como un gen que
confiera un fenotipo dominante, visible o, de otro modo,
seleccionable. Las moscas transgénicas se detectan en la progenie
de las moscas inyectadas utilizando el fenotipo del gen marcador y
posteriormente se crían hasta la homocigosidad. Pueden producirse
varias de dichas cepas, conteniendo, cada una, una inserción en una
posición diferente del genoma, en cada experimento de
transformación, implicando la inyección en varios cientos de
huevos.
Con el fin de incrementar los niveles de
expresión, pueden construirse cepas que contengan inserciones
múltiples mediante la reproducción cruzada de diferentes cepas
transgénicas. Este procedimiento puede verse facilitado por la
utilizaciónón de cromosomas equilibradores. Los cromosomas
equilibradores contienen varias inversiones solapadas, una o más
mutaciones recesivas letales y por lo menos una mutación dominante
visible. Estos cromosomas suprimen la recombinación y pueden
utilizarse para mantener y manipular los cromosomas que portan
varios genes mutantes. Se ha descrito un cromosoma equilibrador de
moscamed llamado FiM I. Mediante la supresión de la recombinación
en una región de grandes dimensiones del cromosoma 5, puede ser
utilizado para construir un cromosoma 5 que porte varias
inserciones de transposones.
Las larvas de insecto adecuadas para su
utilización en la presente invención son cualquiera de entre
Bactrocera oleace (mosca del olivo), Bactrocera
orientalis (mosca oriental de la fruta), Heliothis
armigera (oruga del algodón), Trichoplusa ni (polilla de
la col), Manduca sexta (gusano del tabaco), Lobesia
botrana (polilla del racimo de la vid), Anopheles gambiae
(mosquito), Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla),
Glossina morsitans (mosca tse-tse),
Simulium sp. (mosca negra), Phlebotomus sp. (mosca de
la arena), Musca domestica (mosca doméstica), Drosophila
melangaster, y Ceratitis capitata (Moscamed). Sin
embargo, se prefiere la moscamed.
Preferentemente, el promotor utilizado es un
promotor fuerte. Se encuentran disponibles para su utilización dos
categorías alternativas de promotor: promotores inducibles y
promotores constitutivos.
Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo,
los promotores de choque térmico. Preferentemente, el promotor de
choque térmico es un promotor de choque térmico de insecto, por
ejemplo, el promotor Hsp70 de Drosophila
melanogaster, que es capaz de regular la expresión de genes en
organismos heterólogos, incluyendo en la moscamed. La invención
también abarca la utilización del promotor Hsp70 de moscamed
(Papadimitriou et al., Insect Mol. Biol.
7:279-90, (1998)). Los sistemas alternativos pueden
basarse en la inducción con el antibiótico tetraciclina (Heinrich y
Scott, PNAS 97:8229-8232, 2000).
Los promotores de choque térmico son inducibles
mediante la elevación de la temperatura de las condiciones bajo las
que se cultiva la moscamed. Por ejemplo, a una temperatura
comprendida entre 23ºC y 25ºC, el promotor Hsp70 se
encuentra activo a niveles bajos o no se encuentra activo en
absoluto. Esto permite que las larvas de insecto se desarrollen sin
estrés inducido por la producción de una proteína heteróloga. Sin
embargo, a temperaturas más elevadas, tales como una temperatura
comprendida entre 37ºC y 42ºC, el promotor Hsp70 resulta
inducido y expresa la proteína heteróloga a un nivel elevado.
Los promotores inducibles pueden construirse
basados en elementos inducibles de control génico conocidos. Por
ejemplo, pueden construirse promotores inducibles mediante la
combinación de un elemento que responda a un fármaco u hormona que
puede administrarse en la dieta. En una forma de realización
preferida, puede utilizarse un elemento que responda al estrógeno
humano (ERE) para regular la expresión de la proteína de interés,
con la condición de que el insecto sea transformado con una segunda
secuencia codificante que exprese el receptor del estrógeno
humano.
También pueden utilizarse promotores
constitutivos para expresar la proteína de interés y/o otras
proteínas necesarias en la larva de insecto. Por ejemplo, el
promotor constitutivo puede ser un promotor de actina
citoplasmática. El promotor de actina citoplasmática de D.
melanogaster ha sido clonado (Act5C) y es altamente
activo en los mosquitos (Huynh y Zieler, J. Mol. Biol.
288:13-20, (1999)). Los genes de la actina
citoplasmática y sus promotores también pueden aislarse a partir de
otros insectos, incluyendo la moscamed.
Entre otros ejemplos se encuentra el promotor de
la tubulina citoplasmática, por ejemplo el promotor de la tubulina
citoplasmática de moscamed.
Pueden utilizarse promotores que controlan los
polipéptidos secretados, junto con secuencias de señalización
apropiadas, con el fin de dirigir la secreción de la proteína hacia
la hemolinfa. Por ejemplo, puede utilizarse el promotor de la
proteína sérica de las larvas (Benes et al., Mol. Gen. Genet.
249(5):545-56, (1995)).
La tecnología de cría masiva de la moscamed se
encuentra altamente desarrollada. Existen instalaciones de cría
masiva que producen más de 1.000 millones de moscas por semana.
Estas moscas se utilizan para el control de las plagas de moscamed
mediante la técnica del insecto estéril: las moscas se esterilizan
mediante exposición a radiación en el estadio de pupa, y después se
liberan en el campo.
El ciclo vital de la moscamed es de
aproximadamente 25 días a 25ºC y una hembra normalmente pone 100 a
200 huevos. Al igual que todos los insectos holometábolos, la
moscamed presenta cuatro estadios de desarrollo diferenciados:
embrión (de duración aproximada 2 días), larva (aproximadamente 8
días), pupa (aproximadamente 10 días) y adulto. La madurez sexual
se alcanza dentro de los 4 a 6 días de vida adulta. Junto antes de
la pupación, cada larva presenta una masa de aproximadamente 10 mg
y contiene aproximadamente 200 microgramos de proteína.
Para la producción de proteínas, los cultivos de
larvas que se han iniciado en diferentes tiempos pueden
sincronizarse mediante cambios apropiados de los regímenes de
temperatura. Esto resulta posible debido a que las tasas de
crecimiento dependen de la temperatura ambiental; a 18ºC, las tasas
de crecimiento de las larvas se reducen en aproximadamente el
50%.
Para la producción a escala de laboratorio, se
prefiere la utilización de insectos más pequeños, tales como
Drosophila. Aunque se produce menos proteína por larva, el
ciclo vital es más corto y la producción puede establecerse con
mayor rapidez. Por ejemplo, el ciclo vital de Drosophila es
de 12 días, siendo capaz cada 1 mg de larva de producir 20 \mug
de proteína.
En los ejemplos siguientes se describe la
invención, únicamente a título ilustrativo.
Ejemplo de Referencia
1
El gen que codifica la proteína fluorescente
verde de la medusa Aequoria victoria ha sido expresado en la
moscamed, Ceratitis capitata, y en la mosca de la fruta,
Drosophila melanogaster. Las larvas, pupas y adultos
transgénicos de Drosophila y de moscamed que contienen
inserciones únicas y múltiples de un transposón Minos/GFP en
su genoma muestran fluorescencia característica de GFP. Se
utilizaron dos constructos de GFP, uno con un promotor inducible
(Hsp70 de Drosophila) y uno con un promotor
constitutivo (el promotor actin 5C de Drosophila). Las
larvas de Drosophila y de moscamed con el gen
Hsp70/GFP mostraban niveles bajos de fluorescencia a la
temperatura normal de cría (22ºC) y fluorescencia elevada tras la
exposición durante 1 hora a una temperatura elevada (39ºC). Las
larvas de Drosophila con el gen actin 5C/GFP mostraban
niveles constitutivamente elevados de fluorescencia GFP. La GFP se
expresa en la mayoría, si no en todos, los tejidos de
Drosophila y de moscamed. La proteína GFP también se detecta
en insectos transgénicos utilizando un ensayo de
inmunotransferencia. La comparación de varias líneas transgénicas
mostraba que los niveles de expresión de GFP dependían de la
posición de integración del transgén y del número de copias del
transgén presentes en el genoma.
Moscas e inyección de ADN: en todos los
experimentos se utilizaron la cepa yw de Drosophila y la cepa
A71 de Ceratitis capitata, una cepa de ojos blancos
homocigótica para el gen w1; las moscas se criaron a 22ºC bajo
condiciones estándar. Las inyecciones de ADN de los plásmidos
transposón, junto con un plásmido auxiliar que expresaba la
transposasa, se llevaron a cabo utilizando embriones preblástula,
tal como se ha descrito anteriormente (Loukeris et al. 1995,
Science).
Se construyó el plásmido pMiHsp70/GFP
insertando un fragmento amplificado por PCR que contenía el gen GFP
en el sitio de clonación múltiple del plásmido pHSS6Hsp70PT,
en la orientación apropiada. El plásmido
pHSS6Hsp70PT contiene, en las orientaciones apropiadas, el promotor y la secuencia 3' de ARNm remolque-señal de poliadenilación (en lo sucesivo denominada "terminador") del gen Hsp70 de Drosophila melanogaster. El promotor y el terminador se separaron mediante un sitio de clonación múltiple. El promotor Hsp70 también contenía la secuencia líder 5' no traducida del ARNm de Hsp70 para incrementar la estabilidad del ARNm. El cassette promotor/GFP/terminador a continuación se clonó como fragmento NotI en un vector Minos que contenía el ADNc de tipo salvaje del gen white de Moscamed (Loukeris et al., Science, 1995). El gen white se utiliza como un marcador genético primario visible para la detección de transformantes (Loukeris et al., Science, 1995). La estructura del transposón pMiHspGFP/HspCcW se muestra en la figura 1.
pHSS6Hsp70PT contiene, en las orientaciones apropiadas, el promotor y la secuencia 3' de ARNm remolque-señal de poliadenilación (en lo sucesivo denominada "terminador") del gen Hsp70 de Drosophila melanogaster. El promotor y el terminador se separaron mediante un sitio de clonación múltiple. El promotor Hsp70 también contenía la secuencia líder 5' no traducida del ARNm de Hsp70 para incrementar la estabilidad del ARNm. El cassette promotor/GFP/terminador a continuación se clonó como fragmento NotI en un vector Minos que contenía el ADNc de tipo salvaje del gen white de Moscamed (Loukeris et al., Science, 1995). El gen white se utiliza como un marcador genético primario visible para la detección de transformantes (Loukeris et al., Science, 1995). La estructura del transposón pMiHspGFP/HspCcW se muestra en la figura 1.
El plásmido pMiAct5CGFP (figura 2) contiene el
gen GFP corriente abajo del fragmento de 2 kb de Drosophila
melanogaster que contiene el promotor del gen Actin 5C, el cual
codifica la actina citoplasmática, de expresión ubicua. El plásmido
pMiAct5CGFP no contiene el gen white como marcador primario, y los
transformantes generados con este plásmido se identifican a partir
únicamente de la expresión de GFP (ver después).
En un experimento de transgénesis típico, se
coinyecta una mezcla de plásmido transposón de ADN y plásmido
auxiliar de ADN en embriones preblástula (de 0 a 1 hora posteriores
a la oviposición) de Drosophila o de moscamed que son
homocigóticos para la mutación white del color de los ojos. Con el
fin de detectar las moscamed transgénicas, las moscas derivadas de
los embriones inyectados (generación G0) se crían mediante
cruzamiento de retorno a la cepa receptora, y la progenie se somete
individualmente a ensayo en el estadio de larva para la expresión
del gen white (moscas inyectadas con pMiHspGFP/HspCcW) o de GFP
(moscas inyectadas con pMiACt5CGFP). La expresión de white es
detectable como un cambio en el color de los ojos de blanco a
coloreado (variando desde amarillo pálido al rojo del tipo
salvaje). La expresión de la GFP se sigue mediante la detección de
fluorescencia específica de GFP en los tejidos de las larvas tras
dos tratamientos térmicos sucesivos separados por un día de 1 hora
a 39ºC, utilizando microscopía de epifluorescencia estándar.
Las larvas transgénicas individuales (generación
G1) se crían mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora y
la progenie individual que expresa white o GFP (G2) se cruza entre
sí para producir progenie homocigótica (G3). La intensidad del
color de los ojos o de la fluorescencia GFP es dependiente de la
dosis génica. Los individuos homocigóticos se detectan, por lo
tanto, de entre la progenie G3 mediante el seguimiento de estos
fenotipos. Los individuos de G3 putativamente homocigóticos se
cruzan entre sí y su progenie se analiza mediante transferencia
southern para determinar si contiene inserciones únicas o múltiples.
Las cepas homocigóticas para las inserciones únicas se establecen
mediante este procedimiento.
Las larvas transgénicas de Drosophila y
de moscamed homocigóticas para las inserciones del transposón
MiHspGFP/HspCcW criados a la temperatura estándar, comprendida entre 22ºC y 24ºC, mostraban niveles bajos pero detectables de fluorescencia GFP en comparación con las larvas no transgénicas. La fluorescencia se incrementa drásticamente tras el choque térmico (figura 3).
MiHspGFP/HspCcW criados a la temperatura estándar, comprendida entre 22ºC y 24ºC, mostraban niveles bajos pero detectables de fluorescencia GFP en comparación con las larvas no transgénicas. La fluorescencia se incrementa drásticamente tras el choque térmico (figura 3).
Las moscas Drosophila transgénicas
homocigóticas para las inserciones del transposón MiAct5CGFP criadas
a la temperatura estándar, comprendida entre 22ºC y 24ºC, mostraban
niveles elevados de fluorescencia GFP en comparación con las moscas
no transgénicas adultas (figura 4) y en estadio de larva (figura 6).
Los niveles de fluorescencia son dependientes de la dosis génica
(figura 5).
No se detectaron moscamed que expresasen GFP en
la progenie de más de 1.000 individuos G0 inyectados con MiAct5CGFP.
Se concluye que el promotor actin 5C de Drosophila es un
promotor débil en la moscamed y que será necesario utilizar un
promotor homólogo de la actina en la moscamed para alcanzar niveles
elevados de expresión constitutiva de proteínas heterólogas.
Se comparó la expresión de GFP de varias líneas
transgénicas de Drosophila que eran homocigóticas para
MiAct5CGFP. Aunque todas las líneas mostraron niveles elevados de fluorescencia, se detectaron diferencias de intensidad que eran específicas de determinadas líneas.
MiAct5CGFP. Aunque todas las líneas mostraron niveles elevados de fluorescencia, se detectaron diferencias de intensidad que eran específicas de determinadas líneas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó una secuencia de ADNc que codificaba
hGH corriente abajo del promotor de D. melanogaster para el
gen de choque térmico Hsp70. El promotor Hsp70 también
contiene la secuencia líder 5' no traducida del ARNm de
Hsp70 para incrementar la estabilidad del ARNm. La secuencia
remolque 3' no traducida de Hsp70 de D. melanogaster,
que contiene una señal de poliadenilación, se clonó corriente abajo
de la secuencia codificante de la hGH. El constructo se insertó en
un vector Minos que además contenía un constructo marcador.
El constructo marcador consistía en el gen de la proteína
fluorescente verde (GFP) de Aequoria victoria,regulado por
el promotor Hsp70 de D. melanogaster y que también
contenía la región 3' de Hsp70. Este marcador confiere un
genotipo visible (fluorescencia GFP) a los organismos transgénicos y
se utiliza para detectar las moscamed que son transgénicas en el
estadio de embrión, de larva o de adulto. La estructura global del
transposón completo es, por lo tanto:
- Repetición invertida izquierda de Minos-constructo de expresión de hGH-constructo de expresión del marcador GFP-repetición invertida derecha de Minos
El transposón se construyó en E. coli en
un vector BlueScript.
Como fuente de transposasa en los experimentos
de transgénesis se utilizó el ARNm sintetizado in vitro que
codificaba la transposasa de Minos. El ARNm se sintetizó
in vitro utilizando como molde un vector de expresión
plásmido que contenía el gen de transposasa clonado corriente abajo
a partir de un promotor de fago T7 y ARN polimerasa de T7
comercialmente disponible. La secuencia de ADN completa e
ininterrumpida que codificaba la transposasa de Minos se
obtuvo mediante transcripción inversa a partir del ARNm de
Minos procedente de D. melanogaster transgénico que
expresaba la transposasa de Minos.
Se coinyectó el plásmido de ADN que contenía el
transposón con el ARNm de transposasa de Minos en embriones
preblástula (de 0 a 1 hora posteriores a la oviposición). Las
condiciones para la manipulación de los embriones de moscamed y las
inyecciones han sido descritas en la literatura (Loukeris et
al., 1995). Bajo estas condiciones, entre el 10% y el 20% de
las moscas fértiles derivadas de los embriones inyectados se
esperaba que diesen lugar a progenie transgénica. Con el fin de
detectar las moscamed transgénicas, las moscas derivadas de los
embriones inyectados (generación G0) se criaron mediante cruzamiento
de retorno a la cepa receptora, y su progenie se sometió a ensayo
individual en el estadio de larva para la expresión de GFP. Esto se
llevó a cabo mediante la detección de fluorescencia específica de
GFP en los tejidos de las larvas tras dos tratamientos sucesivos
separados por un día de 1 hora a 39ºC, utilizando microscopía de
epifluorescencia estándar.
Las larvas transgénicas individuales (generación
G1) se criaron mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora
y la progenie que expresaba GFP (G2) se cruzó entre sí para producir
progenie homocigótica (G3). Los individuos homocigóticos G3 son
detectables midiendo la expresión de GFP mediante microscopía de
epifluorescencia cuantitativa. Se establecieron las cepas
homocigóticas para las inserciones únicas.
En tales cepas transgénicas, los niveles de
expresión del transgén no sólo dependen del promotor y de las
condiciones de inducción, sino también del punto de inserción del
transgén. Se sometieron a ensayo varias cepas obtenidas
independientemente (es decir, cepas derivadas de diferentes moscas
G0) para los niveles de expresión de hGH y aquéllas que mostraban
los niveles más elevados se caracterizaron adicionalmente a niveles
molecular y citogenético. La caracterización molecular consistió en
la transferencia southern y, para las cepas que finalmente se
utilizarían para la producción de proteínas, la clonación y
secuenciación del transgén. La caracterización citogenética se
llevó a cabo mediante hibridación in situ en cromosomas
politénicos de glándula salival con el fin de determinar el punto
cromosómico de inserción.
Con el fin de construir cepas con múltiples
inserciones, se llevaron a cabo cruzamientos apropiados entre
miembros de diferentes cepas. La progenie de estos cruzamientos se
cruzó entre sí y se recuperaron múltiples individuos homocigóticos
utilizando GFP como marcador. Dependiendo de la posición cromosómica
de las inserciones, pueden utilizarse cepas que porten cromosomas
equilibradores con el fin de facilitar estos constructos. Se
requieren de tres a cuatro generaciones para construir cepas
estables con inserciones múltiples.
La cría masiva de larvas se llevó a cabo de
acuerdo con procedimientos establecidos. Las larvas se criaron con
alimento semiseco consistente en una base de salvado suplementada
con levadura. El crecimiento de las larvas se sincronizó mediante
variaciones apropiadas de la temperatura y las larvas de tercer
estadio se trataron a una temperatura comprendida entre 39ºC y 41ºC
durante el tiempo necesario para la inducción máxima del transgén.
Las larvas de tercer estadio tardías se alejan del alimento, en
búsqueda de un lugar para pupar. Este comportamiento se utiliza
para recolectar las larvas del alimento para la producción en masa
de moscas en las instalaciones de cría masiva; también se aplica a
la recolección de larvas limpias de alimento para la producción y
purificación de las proteínas.
Las larvas de moscamed se lavaron con solución
salina fría y después se homogeneizaron en presencia de inhibidores
de proteasa. Se purificó la hGH a partir del homogenado de acuerdo
con procedimientos estándar.
En la figura 7 se muestra un vector diseñado
para la expresión de una proteína en hemolinfa de larva. LspP/L es
el promotor del gen de proteína sérica de larva de Drosophila
o de moscamed (Lsp) (Benes et al., Mol. Gen. Genet.
249(5):545-56, (1995)), seguido de un líder
5' no traducido Lsp (segmento rayado) y del péptido de señalización
Lsp (segmento de color negro). El gen de interés, en este caso el
gen del anticuerpo de camélido, se fusionó conservando el marco de
lectura del péptido líder. HspP y HspT son el promotor y el
terminador, respectivamente, del gen 70 de choque térmico. CcW es
el gen white de moscamed, utilizado como marcador dominante visible
para la detección de transformantes. MiL y MiR son los extremos del
elemento Minos.
Se aisló un anticuerpo de camélido a partir de
una biblioteca de expresión fágica (Unilever). El anticuerpo era
específico para el retrovirus porcino PERV (retrovirus endógeno
porcino) y reconoce el componente p30 de las proteínas gag del PERV
(las proteínas del núcleo viral). Se expresó un clon de p30 en el
vector de expresión pHEN1 con el fin de obtener antígeno para la
exploración de la biblioteca de anticuerpos, y de acuerdo con esto
se seleccionaron los clones de anticuerpo. En la figura 8 se muestra
una secuencia y traducción preliminares del anticuerpo utilizado en
este experimento.
Las moscas transgénicas se identificaron
mediante la expresión de white, tal como en el Ejemplo 1. La
expresión de anticuerpos se detectó en la hemolinfa de las larvas
de las moscas transgénicas.
Se purificó el anticuerpo mediante la
homogenización del extracto de las larvas y la purificación mediante
cromatografía de columna con proteína A. Las inmunoglobulinas se
unen a la proteína A a pH 8,6 y son eluídas de la columna a pH 4,3.
De esta manera, la elución se lleva a cabo reduciendo el pH de la
columna de proteína A. Se hinchó la
agarosa-proteína A (0,25 g; Sigma) en solución
salina tamponada con Tris (Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 8,6) y
después se empaquetó en una columna (el volumen de lecho era de 1
ml). El sobrenadante del cultivo se ajustó a pH 8,6 mediante la
adición de NaOH diluido y después se centrifugó a 600 g durante 30
minutos a 4ºC. Tras cargar la muestra, la columna de proteína A se
lavó con solución salina tamponada con Tris, pH 8,6, hasta el final
de la elución de las proteínas de la columna. A continuación, se
llevaron a cabo eluciones por pasos con PBS (fosfato 0,05 M/NaCl
0,15 M, pH 7,0), solución salina tamponada con citrato (citrato
0,05 M/NaCl 0,15 M, pH 5,5) y solución salina tamponada con acetato
(acetato 0,05 M/NaCl 0,15 M, pH 4,3) hasta la elución del
anticuerpo. Las fracciones que contribuyeron al pico de A 280 se
agruparon, se dializaron en 0,01xPBS, se liofilizaron, se
redisolvieron en
500 \mul de PBS y se almacenaron a -70ºC. La pureza del pico de proteínas se analizó mediante SDS/PAGE. La columna se regeneró mediante lavado con solución salina tamponada con glicina (glicina 0,05 M/HCl/NaCl 0,15 M, pH 2,3) seguido de solución salina tamponada con Tris (pH 8,6, que contenía NaN_{3} al 0,02%).
500 \mul de PBS y se almacenaron a -70ºC. La pureza del pico de proteínas se analizó mediante SDS/PAGE. La columna se regeneró mediante lavado con solución salina tamponada con glicina (glicina 0,05 M/HCl/NaCl 0,15 M, pH 2,3) seguido de solución salina tamponada con Tris (pH 8,6, que contenía NaN_{3} al 0,02%).
Se llevó a cabo un ensayo ELISA utilizando
antígeno p30 inmovilizado, producido tal como se ha indicado
anteriormente, y un anticuerpo monoclonal murino
anti-camélido marcado. De esta manera, se confirmó
la especificidad para p30 de PERV del anticuerpo eluído procedente
de las larvas de moscamed.
Se construyó un sistema de expresión transposón
inducible por choque térmico de acuerdo con el Ejemplo 1,
utilizando el gen de la \alpha-glucosidasa humana
(GenBank GI:182907) en lugar del gen de GFP.
Se coinyectó una mezcla de plásmido transposón
de ADN y plásmido auxiliar de ADN, al igual que en el Ejemplo 1, en
embriones preblástula (de 0 a 1 hora posteriores a la oviposición)
de Drosophila o de moscamed, homocigóticos para la mutación
white del color de los ojos. Con el fin de detectar las moscamed
transgénicas, las moscas derivadas de embriones inyectados
(generación G0) se criaron mediante cruzamiento de retorno a la
cepa receptora, y su progenie se sometió a ensayo individual en el
estadio de larva para la expresión del gen white. La expresión de
white es detectable como un cambio en el color de los ojos de blanco
a coloreado (variando desde el amarillo pálido hasta el rojo del
tipo salvaje).
Las larvas transgénicas individuales (generación
G1) se criaron mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora
y la progenie white individual (G2) se cruzó entre sí con el fin de
producir progenie homocigótica (G3). La intensidad del color de los
ojos es dependiente de la dosis génica. Los individuos homocigóticos
se detectan, por lo tanto, de entre la progenie G3 mediante el
seguimiento de estos fenotipos. Los individuos de G3 putativamente
homocigóticos se cruzaron entre sí y su progenie se analizó mediante
transferencia southern para determinar si contenían una única
inserción o inserciones múltiples. Se establecieron cuáles eran las
cepas que eran homocigóticas para las inserciones únicas mediante
este procedimiento.
Las larvas transgénicas de Drosophila y
de moscamed homocigóticas para las inserciones del transposón
\alpha-glucosidasa MiHsp/HspCcW criadas a la
temperatura estándar, comprendida entre 22ºC y 24ºC, mostraban
niveles bajos pero detectables de
\alpha-glucosidasa en los cuerpos grasos en
comparación con las larvas no transgénicas, según la evaluación
mediante inmunocuantificación de acuerdo con Umapathysivam et
al., Clin. Chem. 46(9):1318-25 (2000).
La cantidad de \alpha-glucosidasa se incrementa
marcadamente tras el choque térmico.
Claims (11)
1. Procedimiento para la producción de una
proteína de interés, que comprende:
- (a)
- transformar la línea germinal de un insecto seleccionado de entre el grupo constituido por Bactrocera oleae (mosca del olivo), Bactrocera orientalis (mosca oriental de la fruta), Heliothis armigera (oruga del algodón), Trichoplusa ni (polilla de la col), Manduca sexta (gusano del tabaco), Lobesia botrana (polilla del racimo de la vid), Anopheles gambiae (mosquito), Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla), Glossina morsitans (mosca tse-tse), Simulium sp. (mosca negra), Phlebotomus sp. (mosca de la arena), Musca domestica (mosca doméstica), Drosophila melanogaster y Ceratitis capitata (Moscamed) con un sistema de expresión a base de transposón, capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto y de secretar la proteína en la hemolinfa bajo el control de las zonas de control y los péptidos de señalización adecuados;
- (b)
- criar el insecto para que produzca larvas;
- (c)
- criar masivamente las larvas; y
- (d)
- aislar cantidades en milígramos de la proteína de interés a partir de las larvas criadas masivamente, en el que el transposón se selecciona de entre el grupo constituido por Minos, mariner, Hermes, sleeping beauty y piggyBac.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la transformación del insecto comprende las etapas
siguientes:
- a)
- proporcionar un elemento transponible que codifica una proteína transposasa que es activa en el insecto;
- b)
- modificar el elemento transponible mediante la inserción de una secuencia codificante que codifica la proteína de interés; y
- c)
- transformar los insectos diana con el elemento transponible modificado.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sistema de expresión
comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de
interés, bajo el control de un elemento de control transcripcional
inducible que se encuentra operativo en las larvas del insecto.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el sistema de control inducible es regulable con tetraciclina
o con estrógenos.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que el sistema de expresión comprende
una secuencia codificante que codifica la proteína de interés, bajo
el control de un elemento de control transcripcional constitutivo
que se encuentra operativo en las larvas de insecto.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el elemento de control constitutivo se selecciona de entre
el grupo constituido por el promotor de la actina citoplasmática,
tal como el promotor Act5C de Drosophila y el
promotor de la tubulina citoplasmática.
7. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la secuencia de control de expresión inducible es un
promotor de choque térmico, tal como el promotor Hsp70 de
Drosophila o de la moscamed.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el insecto se transforma con
dos o mas sistemas de expresión, o un sistema de expresión que
comprende dos o más secuencias de codificación.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de interés se
selecciona de entre el grupo constituido por una enzima, una
citoquina, una hormona o un producto farmacéutico proteico.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el insecto es Ceratitis capitata.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que los cultivos de larvas se
sincronizan mediante la manipulación de las temperaturas de los
cultivos.
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| DK2653540T3 (en) * | 2010-12-15 | 2018-02-05 | Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems | PROCEDURE FOR PRODUCING PROTEIN |
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