MXPA02003883A - Sistema de produccion de proteina. - Google Patents
Sistema de produccion de proteina.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para producir una proteína de interés, que comprende transformar un insecto con un sistema de expresión no viral capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto;criar el insecto para producir larvas;cultivar las larvas;y aislar la proteína de interés a partir de las larvas;la transformación se lleva a cabo de manera ventajosa por medio de un vector con transpos
Description
SISTEMA DE PRODUCCION DE PROTEINA
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La presente invención se refiera a un sistema para la producción de proteínas en larvas de insectos. En particular, la invención abarca la producción de proteína de interés en larvas de Drosofila y de Mosca mediterránea del fruto. Los sistemas de producción de proteínas, en los cuales los polipéptidos o proteínas de interés se producen en organismos recombinantes o en células, son la estructura base de la biotecnología comercial. Los sistemas más tempranos, que se basan en la expresión bacteriana en hospederos tales como E coli, se han unido a sistemas basados en hospederos de eucariontes, en particular células de mamífero en cultivo, células de insecto tanto en cultivo como en la forma de insectos completos, y mamíferos transgénicos tales como ovejas y cabras. Los sistemas de cultivo de células procariontes son fáciles de mantener y no son costosos de operar. Sin embargo, las células procariontes no son capaces de modificación post-traduccional de proteínas eucariontes. Además, muchas proteínas se pliegan de manera incorrecta, requiriendo procedimientos específicos para replegarlas, lo cual se añade al costo de producción.
Los sistemas de cultivo de células eucariontes se han descrito para numerosas aplicaciones. Por ejemplo, las células de mamífero son capaces de modificación post-traduccional, y generalmente producen proteínas las cuales están correctamente plegadas y son solubles. Las desventajas principales de los sistemas de células de mamífero incluyen el requerimiento para instalaciones de cultivo especializadas y costosas, y el riesgo de infección, que puede llevar a pérdida del todo el cultivo. Los sistemas de producción en plantas pueden utilizarse para la expresión de proteína, y pueden lograr una producción de alto rendimiento. Sin embargo, las cosechas de plantas transgénicas son difíciles de contener, incrementando el riesgo de contaminación del medio ambiente con material genéticamente manipulado. Las células de insecto también son útiles para la expresión de polipéptido. El sistema de expresión más ampliamente extendido utilizado en células de insecto se basa en vectores de baculovirus. Un vector de expresión de baculovirus se construye al remplazar el gen de polihedrina de baculovirus, el cual codifica una proteína estructural principal del baculovirus con un gen heterólogo, bajo el control del promotor fuerte de polihedrina nativa. Las células hospederas de insecto cultivadas se infectan con el virus recombinante, y la proteína producida de esta manera puede recuperarse a partir de las células mismas o a partir del medio de cultivo si se emplean las señales de secreción adecuadas. Estos sistemas también, sin embargo, padecen de algunos problemas asociados con la infección del cultivo y el requerimiento para instalaciones de cultivo especializadas. Los sistemas de expresión basados en organismos evitan muchas de la desventajas de infección y son más fáciles para crecer que los cultivos celulares. Por ejemplo, el uso de vectores virales tales como baculovirus permite la infección de insectos completos, los cuales tienen menos requerimientos para condiciones especiales de crecimiento. Los insectos más grandes, tales como las polillas de la seda, proveen un alto rendimiento de proteína heteróloga. La proteína puede extraerse a partir de los insectos de conformidad con las técnicas convencionales de extracción. También se conocen técnicas basadas en la expresión de proteínas de interés en mamíferos tales como cabras y ovejas, bajo el control de las secuencias control de la expresión de la proteína de leche de tal manera que estas se expresan en la leche. Dichas técnicas tienen grandes ventajas potenciales, pero son costosas debido al requerimiento para el aislamiento de los virus endógenos de mamífero, priones y proteínas a partir del producto final. Además, el costo de generar y mantener animales transgénicos grandes es alto. El uso del larvas de insecto, como aquellas de Tichoplusa ni, se ha propuesto para uso en sistemas de producción de proteínas (Pham et al., 1999 Biotech Bioeng 62:175-182). Sin embargo, dichos sistemas han sido solamente sugeridos en combinación con tecnología de vector viral basada alrededor de baculovirus.
Cuando las proteínas se pretenden para uso en la dieta o uso farmacéutico, el uso de los sistemas bacterianos y/o vectores virales no es deseable. Por lo tanto hay un requerimiento en la técnica para un sistema de producción de proteína el cual sea vigorosa y escalar, como lo son los sistemas basados en organismo completo, y este libre de vectores basados en virus, así como que no sea costoso para operar en un ambiente contenido.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
De conformidad con un primer aspecto, la presente invención provee un método para producir una proteína de interés que comprende: (a) transformar un insecto con un sistema de expresión no viral capaz de expresar la proteína de interés en la larva del insecto; (b) cruzar el insecto para producir larvas; (c) cultivar las larvas; y (d) aislar la proteína de interés a partir de las larvas. El método de conformidad con la presente invención permite la producción rápida de cantidades de miligramos de polipéptidos para propósitos de investigación, la producción de cantidades de kilogramos de proteínas para aplicaciones clínicas y diagnosticas y potencialmente miles de kilogramos de enzimas industriales a bajo costo, debido a la facilidad con la cual las larvas de insecto pueden cultivarse utilizando técnicas de cultivo establecidas.
Las ventajas de los métodos de conformidad con la invención son múltiples. La crianza en masa de larvas de insecto es posible utilizando tecnología existente y permite la producción de productos polipeptídicos a un costo extremadamente bajo, en un ambiente controlado de producción. Esto facilita la aprobación reglamentaria con respecto a los organismos completos tales como que mamíferos, en donde la ausencia de virus y priones debe efectuarse antes de que se de la aprobación. Además, el método de la invención evita las desventajas asociadas con el cultivo de células animales (incluyendo insectos), las cuales incluyen el mayor riesgo de infección, y el riesgo de contaminación viral o de prión en el caso de los cultivos de célula de mamífero o en los sistemas de producción transgénica. El término "proteínas" incluye moléculas polipeptídicas de una sola cadena así como complejos múltiples polipeptídicos en donde los polipéptidos individuales constituyentes están enlazados mediante modos covalentes o no covalentes. El término "polipéptido" incluye péptidos de dos o más aminoácidos en longitud, típicamente teniendo más de 5, 10 ó 20 aminoácidos. Un sistema de expresión no viral, como se refiere en la presente, incluye cualquier técnica para transformar insectos la cual no se basa en un virus, tal como baculovirus. Por ejemplo, los sistemas de expresión no viral incluyen aquellos basados en la plásmidos autónomamente replicantes que integran plásmidos y sistemas basados en transposón. El sistema de expresión preferido para el uso de larvas de insectos se base en transposones. El sistema de expresión preferido para el uso en larvas de insecto se basa en transposones. Los transposones adecuados se describen con más detalle a continuación. El sistema de expresión utilizado en el método de la invención comprende elementos control los cuales son activos en células de insectos, y particularmente en larvas de insectos. Muchas secuencias control de insecto, incluyendo varios promotores, están activos en varias especies diversas. Por lo tanto, no es esencial que se utilicen la secuencias derivadas a partir del insecto en cuestión. Las secuencias inducibles o constitutivamente activas pueden utilizarse. Preferiblemente, la secuencias control son secuencias inducibles. Un promotor inducible preferido es el promotor de la proteína HSP70 de choque térmico, la cual se induce al incrementar la temperatura a la cual se cultivan las larvas, y los sistemas de expresión inducibles por tetraciclina (Heinrich y Scott, PNAS 97:8229-8232, 2000). Con el objeto de incrementar la producción de proteína, pueden utilizarse múltiples sistemas de expresión. Estos sistemas pueden disponerse con dos o mas secuencias codificantes presentes en cada sistema, o como múltiples sistemas particulares. En cada caso, un cromosoma balanceador, puede utilizarse con el objeto de favorecer la retención del sistema de expresión y la transmisión a la progenie durante la cruza del insecto. Una ventaja del cultivo de larva de insecto es que los cultivos pueden sincronizarse, de manera que todas las larvas alcancen el mismo nivel de madurez al mismo tiempo. Esto puede lograrse al variar la temperatura de cultivo, puesto que la larva se desarrolla más lentamente a temperaturas más bajas. Por ejemplo a 18°C, la larva se desarrolla a la mitad de la velocidad en comparación con un crecimiento a 25°C. Las ventajas adicionales de la invención incluyen el hecho de que la acumulación de proteína puede dirigirse a la grasa corporal, o la proteína puede secretarse hacia la hemolinfa bajo el control de regiones control adecuadas y señales peptídicas, tales como las secuencias de proteína larval de suero.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra la estructura del transposón pMiHispGFP/CcW el cual expresa GFP y el gen blanco bajo el control del promotor Hsp70. La figura 2 muestra la estructura del plásmido pMiAct5CGFP, el cual expresa GFP bajo el control del gen de actina 5C de Drosophila. La figura 3 muestra la expresión de GFP en una mosca mediterránea del fruto transgénica y larva de mosca mediterránea del fruto después del choque térmico. La figura 4 muestra la expresión constitutiva de GFP en moscas
Drosophila.
La figura 5 muestra la expresión constitutiva de GFP en Drosophila adulta. La fluorescencia observada es dependiente de la dosis del gen. La figura 6 muestra la expresión de GFP en larvas de Drosophila (superior: transgénico; inferior: tipo silvestre). La figura 7 muestra la estructura de una vector para la expresión de una proteína en hemolinfa larval. LsP/L es el promotor del gen de la proteinasa de suero larval de Drosophila o Mosca mediterránea del fruto (Lsp), seguido por el líder no traducido Lsp 5' (casilla a rayas) y el péptido señal Isp (casilla negra). El gen de interés se fusiona en marco con el péptido líder. HspP y HspT son el promotor y terminador del gen de la proteína de choque térmico 70, respectivamente. CcW es el gen blanco de mosca mediterránea del fruto, utilizado como un marcador visible dominante para detectar a los transformantes . MiL y MiR son los extremos del elemento Minos. La figura 8 es una secuencia preliminar de una clona de anticuerpo PERV p30 aislada a partir de una librería de anticuerpo camelid y expresada en larvas de mosca mediterránea del fruto.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Aunque en general las técnicas mencionadas en la presente se conocen bien en la técnica, se hace referencia en particular a Sambrook er a/., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Ed. John Wiley & Sons, Inc.
Transposones Los transposones son elementos genéticos que son capaces de
"brincar" o transponerse de una posición a otra dentro del genoma de una especie. Estos están ampliamente distribuidos entre animales, incluyendo insectos. Los transposones están activos dentro de las especies hospederas debido a la actividad de una proteína transposasa codificada por los mismos elementos, o provista por otros medios- tal como mediante la inyección de ARNm que codifica la transposasa, el uso de una segunda secuencia codificante que codifica transposasa o la adición de proteína transposasa misma. Los avances en el entendimiento de los mecanismos de transmisión han resultado en el desarrollo de herramientas genéticas basadas en transposones las cuales pueden utilizarse para la transferencia de genes. Cualquier elemento activo de transposición en el insecto deseado puede utilizarse. Preferiblemente, sin embargo, el elemento de transposición se selecciona a partir del grupo que consiste de Minos, mariner, Hermes, Sleeping, y piggyBac. Minos es un elemento de transposición el cual está activo en la Mosca mediterránea del fruto. Este se describe en la patente de E.U.A. 5,840,865, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
El uso de Minos en insectos transformados se describe en la patente de E.U.A. precedente. Mariner es un transposón originalmente aislado a partir de Drosophila, pero desde entonces se ha descubierto en varias especies de invertebrados y vertebrados. El uso de mariner para transformar organismos se describió en la solicitud de patente internacional W099/09817. Hermes se deriva a partir de la mosca casera común. Su uso para crear insectos transgénicos se describe en la patente de E.U.A. 5,614,398, incorporada en la presente como referencia en su totalidad. PiggyBac es un transposón derivado a partir del hospedero baculpvirus Trichoplusia ni. Su uso para la transformación de la línea germinal de la Mosca mediterránea del fruto se ha descrito por Handler et al., (1998) PNAS (USA) 95:7520-5. La transferencia génica se lleva a cabo mediante la transformación probada de la línea germinal mediada por transposón. El transposón de elección es Minos, el cual se ha mostrado que funciona como un vector de transgénesis en mosca mediterránea del fruto (Loukeris et al., 1995)y Drosophila. Otros transposones que son funcionales en mosca mediterránea del fruto, tal como piggyBac (McCombs et al., 1998) y que pueden utilizarse como alternativas. La metodología de transformación de Mosca mediterránea del fruto se conoce bien en la literatura (Loukeris et al., 1995). Brevemente, el ADN plasmídico circular contiene un transposón que contiene un gen de interés (tal como eritropoietina, más las secuencias de ADN reguladoras apropiadas) flanqueado por los dos extremos del transposón se co-inyecta dentro de embriones de mosca mediterránea del fruto en etapa de pre-blastodermo junto con una fuente de transposasa (un plásmido que expresa transposasa, ARNm sintetizado in vitro que codifica transposasa, o la proteína transposasa misma). En los embriones tempranos, la transposasa interactúa con los extremos del transposón y cataliza la escisión del transposón y la reintegración dentro de cromosomas en posiciones aleatorias. Usualmente, para facilitar la detección de las moscas transgénicas, un "gen marcador", tal como un gen que confiere un fenotipo dominante, visible o de otra manera seleccionable, también se incluye en el transposón. Las moscas transgénicas se detectan de entre la progenie de las moscas inyectadas utilizando el fenotipo de gen marcador y luego se cruzan para llevarlas a homocigosidad. Varias de dichas cepas, cada una conteniendo una inserción en una posición diferente en el genoma, puede producirse en cada experimento de transformación que implica la inyección de varios cientos de huevos.
Inserciones múltiples Con el objeto de incrementar los niveles de expresión, las cepas que contienen inserciones múltiples pueden construirse mediante la inter-cruza de cepas transgénicas diferentes. Este procedimiento puede facilitarse mediante el uso de cromosomas balanceadores. Los cromosomas balanceadores contienen varias inversiones que se sobreponen, una o más 1
mutaciones letales recesivas y al menos una mutación dominante visible. Estos cromosomas suprimen la recombinación y pueden utilizarse para mantener y manipular cromosomas que portan varios genes mutantes. Un cromosoma balanceador de mosca mediterránea del fruto, FiM 1, se ha descrito. Al suprimir la recombinación en una región grande del cromosoma 5, se puede obtener la construcción de un cromosoma 5 que porta varias inserciones de transposón.
Elección del insecto v promotor Varias larvas de insecto podrían ser adecuadas para uso en la presente invención, incluyendo cualesquiera de Bactrocera oleae (mosca del olivo), Bactrocera orientalis (mosca oriental del fruto), Heliothis armígera (gusano del algodón), Trichoplusa ni (gusano de la calabaza), Manduca sexta (gusano con cuernos del tabaco), Lobesia botrana (polilla de la vid), Anopheles gambiae (mosquito), Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla), Glossina morsitans (mosca tse-tse), Simulium sp. (moca negra), Phiebotomus sp. (mosca de la arena), Musca domestica (mosca domestica) y Ceratitis capitata (Mosca mediterránea del fruto). Sin embargo, se prefiere a la mosca mediterránea del fruto. Preferiblemente, el promotor utilizado es un promotor fuerte.
Están disponibles para uso dos categorías alternativas de promotores: promotores inducibles y constitutivos.
Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, promotores de choque térmico. Preferiblemente, el promotor de choque térmico es un promotor de choque térmico de insecto, por ejemplo el promotor hsp70 de Drosophila melanogaster, el cual es capaz de dirigir la expresión de genes en organismos heterólogos, incluyendo la mosca mediterránea del fruto. La invención también abarca el uso del promotor hsp70 de la mosca mediterránea del fruto (Papadimitriou et al., (1998) Insecto Mol Biol 7:279-90). Los sistemas alternativos pueden basarse en la inducción con el antibiótico tetraciclina (Heinrich y Scott, PNAS 97:8229-8232, 2000). Los promotores de choque térmico son inducibles mediante la elevación de la temperatura en las condiciones bajo las cuales la mosca mediterránea del fruto se va a cultivar. Por ejemplo, a 23-25°C, el promotor hsp70 está activo a niveles bajos o no está activo del todo. Esto permite que la larva de insecto se desarrolle sin tensión inducida por la producción de una proteína heteróloga. A temperaturas superiores, sin embargo, tales como 37-42°C, el promotor hsp70 se induce y expresa la proteína heteróloga a un nivel elevado. Los promotores inducibles pueden construirse basándose en elementos de control génico conocidos inducibles. Por ejemplo, los promotores inducibles pueden construirse al combinar un elemento de respuesta a un fármaco u hormona el cual puede ser administrado en la dieta. En una modalidad preferida, un elemento de respuesta a estrógeno humano (ERE) puede utilizarse para regular la expresión de la proteína de interés, siempre y cuando el insecto se transforme con una segunda secuencia codificante la cual exprese el receptor de estrógeno humano. Los promotores constitutivos también pueden utilizarse para expresar la proteína de interés y/o otras proteínas requeridas en las larvas de insectos. Por ejemplo, el promotor constitutivo puede ser un promotor citoplásmico de actina. El promotor citoplásmico de actina de D. Melanogaster se ha clonado (Act5C) y está altamente activo en mosquitos (Huynh y Zieler, (1999) J. Mol. Biol. 288:13-20). Los genes citoplásmicos de actina y sus promotores también pueden aislarse a partir de otros insectos, incluyendo la mosca mediterránea del fruto. Otros ejemplos incluyen del promotor citoplásmico de tubulína, por ejemplo el promotor citoplásmico de tubulina de mosca la mediterránea del fruto. Los promotores que controlan los polipéptidos secretados pueden utilizarse, opcionalmente junto con secuencias señal apropiadas, para dirigir la secreción de la proteína a la hemolinfa. Por ejemplo, puede emplearse el promotor de la proteína de suero larval (Benes et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 249(5):545-56).
Crianza de larvas La tecnología de crianza en masa para la mosca mediterránea del fruto está altamente desarrollada. Existen instalaciones para crianza en masa las cuales producen alrededor de 1 ,000 millones de moscas por semana. Estas moscas se utilizan para control de plaga de la mosca mediterránea del fruto mediante la técnica de insecto estéril: estás se esterilizan mediante la exposición a la radiación en la etapa pupal, y luego se liberan al campo. El ciclo de vida de la mosca mediterránea del fruto es de aproximadamente 25 días a 25°C y una hembra normalmente oviposita 100-200 huevos. Como todo insecto holometabólico, la mosca mediterránea del fruto tiene cuatro etapas de desarrollo distinta: embrionaria (que dura aproximadamente 2 días), larval (de aproximadamente 8 días), pupal (de aproximadamente 10 días) y adulta. La madurez sexual se logra dentro de los 4-6 días de vida adulta. Justo antes de la pupación, cada larva es de aproximadamente 10 mg en masa y contiene aproximadamente 200 microgramos de proteína. Para la producción de proteína, los cultivos larvales que se han iniciado a tiempos diferentes pueden sincronizarse mediante regímenes de cambio de temperatura apropiados. Esto es posible debido a que la velocidad de crecimiento depende de la temperatura del ambiente; a 18°C la velocidad de crecimiento de la larva disminuye por aproximadamente 50°C. Para la producción a escala de laboratorio, se prefiere el uso de insectos más pequeños tales como Drosofila. Aunque se produce menos proteína por larva, el cíelo de vida es más corto y la producción puede establecerse más rápidamente. Por ejemplo, el ciclo de vida de Drosofila es de 12 días, con una larva de 1 mg capaz de rendir 20µg de proteína cada una.
La invención se describe, para los propósitos de ilustración solamente en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 Producción de GFP en larvas de mosca mediterránea del fruto y de Drosofila
El gen que codifica la proteína fluorescente verde a partir de la medusa de mar Aequoría victoria se ha expresado en mosca mediterránea del fruto, Ceratitis capitata y en la mosca del fruto Drosofila melanogaster. Las larvas, pupas y adultos transgénicos de Drosofila y de la mosca mediterránea del fruto que contienen inserciones particulares y múltiples de un transposón inos/GFP en su genoma muestran fluorescencia característica de GFP. Dos construcciones GFP se i!í :|izan, una con un promotor inducible (el Hsp70 de Drosofila) y una con un promotor constitutivo (el promotor actina 5C de Drosofila). Las larvas de Drosofila y de la mosca mediterránea del fruto con el gen Hsp70/GFP muestran niveles bajos de fluorescencia a la temperatura de crianza normal (22°C) y fluorescencia elevada después de la exposición por 1 hora a una temperatura elevada (39°C). Las larvas de Drosofila con el gen Actina 5C/GFP muestran niveles altos constitutivos de fluorescencia GFP. GFP se expresa en la mayoría, sino es que en todos los tejidos de Drosofila y de la mosca mediterránea del fruto. La proteína GFP también se detectó en insectos transgénicos utilizando un ensayo de inmunoblot. La comparación de varias líneas transgénicas mostró que los niveles de expresión de GFP dependen de la posición de la integración del transgen y del número de copias de transgen presentes en el genoma.
Materiales y métodos Moscas e inyección de ADN: la cepa vw de Drosofila y la cepa A71 de Ceratitis capitata, una cepa de ojos blancos homocigota para el gen w1 se utilizaron en todos los experimentos; las moscas se criaron a 22°C bajo condiciones estándares. Las inyecciones de ADN de plásmido con transposón junto con un plásmido auxiliar que expresa transposasa se llevaron a cabo utilizando embriones en etapa de pre-blastodermo como previamente se describió (Loukeris et al, 1995, Science).
Construcciones de plásmido y análisis de ADN: El plásmido pMiHsp70/GFP se construyó al insertar un fragmento amplificado por PCR que contiene el gen GFP dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido pHSS6Hsp70PT, en la orientación apropiada.
El plásmido pHSS6Hsp70PT contiene, en las orientaciones apropiadas, el promotor y la señal de poliadenilación del trailer de ARNm hacia 3' (en adelante denominado "terminador") del gen Hsp70 de Drosofila melanogaster.
El promotor y el terminador están separados por un sitio de clonación múltiple.
El promotor Hsp70 también contiene la secuencia líder no traducida 5' del ARNm de Hsp70 para incrementar la estabilidad de ARNm. El cassette promotor/GFP/terminador se clona entonces como un fragmento Notl dentro del vector Minos, que contiene el ADNc de tipo silvestre del gen blanco de la mosca mediterránea del fruto (Loukeris et al., 1995, Science). El gen blanco se utilizó como un marcador genético primario visible para la detección de transformantes (Loukeris et al., 1995, Science). La estructura del transposón se muestra en la figura 1 El plásmido pMiHspGFP/HspCcW (figura 2) contiene el gen GFP hacia el extremo 3' del fragmento de 2kb del gen de Drosofila melanogaster que contiene el promotor del gen Actina 5C, el cual codifica una actina citoplásmica que se expresa de manera ubicua. El plásmido pMiAct5CGFP no contiene el gen blanco como un marcador principal, y los transformantes generados con este plásmido se identificaron con base en la expresión de GFP solamente (véase a continuación). En un experimento de transgénesis típico, una mezcla del ADN de plásmido con transposón y ADN de plásmido auxiliar se co-inyecta dentro de embriones de Drosofila o de la mosca mediterránea del fruto en etapa de pre-blastodermo (0.1 horas post-oviposición) homocigotos para la mutación para color blanco del ojo. Para detectar mosca mediterránea del fruto transgénicas, las mocas derivadas a partir de embriones inyectados (generación G0) se cruzan mediante retrocruza a la cepa recipiente, y iuego la progenie se evalúa individualmente en la etapa larval para la expresión ya sea del gen blanco (moscas inyectadas con pMiHspGFP8HspCcW) o GFP (moscas inyectadas con pMiAct5cGFP). La expresión de blanco es detectable como un cambio del color del ojo a partir de blanco a coloreado (variando de amarillo pálido a rojo tipo silvestre). La expresión de GFP se monitorea al detectar la fluorescencia específica de GFP en los tejidos de las larvas después de dos tratamientos sucesivos de calor a la larva por 1 hora a 39°C separados por un día, utilizando microscopía de epifluorescencia estándar. Las larvas transgénicas individuales (generación G1 ) se cruzan mediante retrocruza con la cepa recipiente y la progenie individual que expresa blanco GFP (G2) se entrecruza para producir progenie homocigota (G3). La intensidad del color del ojo o de la fluorescencia es dependiente de la dosis del gen. Los individuos homocigotos se detectaron, por lo tanto, entre la progenie G3 al seguir estos fenotipos. Los individuos homocigotos G3 putativos se entrecruzan y progenie se analiza mediante Southern blot para determinar si éstos contenían inserciones particulares o múltiples. Las cepas homocigotas para las inserciones particulares se establecieron mediante este procedimiento.
Expresión inducible por calor de GFP en larvas de Drosofila v mosca mediterránea del fruto Las larvas transgénicas de Drosofila y de la mosca mediterránea del fruto homocigotas para las inserciones de transposón MiHspGFP/HspCcW crecieron a la temperatura estándar de 22-24°C mostraron niveles bajos pero detectables de fluorescencia GFP en comparación con las larvas no transgénicas. La fluorescencia se incrementó dramáticamente después del choque térmico (figura 3).
Expresión constitutiva de GFP en Drosofila La Drosofila transgénica homocigota para las inserciones de transposón MiAct5CGFP que se creció la temperatura estándar de 22-24X muestra niveles altos de fluorescencia GFP en comparación con las moscas adultas (figura 4) y larvas (figura 6) no transgénicas. Los niveles de fluorescencia son dependientes de la dosis del gen (figura 5). Ninguna mosca mediterránea del fruto que expresa GFP se detectó en la progenie de más de 1000 G0 inyectadas con MiAct5CGFP. Los inventores concluyen que el promotor actina 5C de Drosophila es un promotor débil en la mosca mediterránea del fruto y que el promotor homólogo de actina tendrá que utilizarse en la mosca mediterránea del fruto para lograr niveles elevados de expresión constitutiva de las proteínas heterólogas. Varias líneas transgénicas de Drosophila homocigotas para M¡Act5CGFP se compararon entre sí para la expresión de GFP. Aunque todas las líneas demostraron niveles altos de fluorescencia, las diferencias en las intensidades específicas de las líneas son detectables.
EJEMPLO 2 Producción de hormona de crecimiento humana en larvas de la Mosca mediterránea del fruto
Una secuencia de ADNc que codifica hGH se clonó hacia el extremo 3' del promotor de D. Melanogaster para el gen Hsp 70 de choque térmico. El promotor Hsp 70 también contiene la secuencia líder no traducida 5' del ARNm de Hsp 70 para la estabilidad incrementada del ARNm. El trailer no traducido de D. melanogaster, que contiene una señal de poliadenilación, se clonó hacia el extremo 3' de la secuencia que codifica Hsp70 hacia 3'. La construcción se insertó en un vector hGH que también contenía una construcción marcadora. La construcción marcadora consiste del gen de proteína fluorescente verde Minos (GFP) a partir de Aequoria victoria dirigido por el promotor Hsp 70 de D. melanogaster y también contiene la región Hsp 70 hacia 3'. Este marcador confiere un genotipo visible (fluorescencia GFP) en los organismos transgénicos y es útil para detectar la mosca mediterránea del fruto transgénica en la etapa embrionaria, larval, o adulta. La estructura general del transposón completo es, por lo tanto: Repetido Minos invertido izquierdo -construcción de expresión de hGH- construcción de expresión de marcador GFP- - repetido Minos invertido derecho. El transposón se construyó en E. Coli en un vector BlueScript.
El ARNm sintetizado in vitro que codifica la transposasa Minos se utilizó como una fuente de transposasa en experimentos de transgénesis. El ARNm se sintetizó in vitro utilizando como un templado un plásmido vector de expresión que contiene el gen de transposasa clonado hacia el extremo 3' a partir de un promotor del fago T7 y T7 RNA polimerasa comercialmente disponible. La secuencia de ADN completa no interrumpida que codifica Minos transposasa se obtuvo mediante la transcripción reversa del ARNm Minos a partir de D. Melanogaster transgénicas que expresan Minos transposasa. El ADN plasmídico que contiene transposón se co-inyectó con ARNm de Minos transposasa dentro de embriones en etapa de pre-balstodermo (0.1 horas post-ovisposición). Las condiciones para el manejo de los embriones de la mosca mediterránea del fruto y la inyección han sido descritas en la literatura (Loukeris et al., 1995). Bajo estas condiciones, 10-20% de las moscas fértiles derivadas a partir de dos embriones inyectados se espera que den una progenie transgénica. Para detectar a las moscas mediterráneas del fruto transgénicas, las moscas derivadas a partir de embriones inyectados (generación C0) se cruzan mediante retrocruza con la cepa recipiente, y su progenie se evalúa individualmente en la etapa larval para la expresión de GFP. Esto se realizar mediante la detección de la fluorescencia específica de GFP en los tejidos de larvas después de dos tratamientos sucesivos de 1 hora a 39°C, separados por un día, utilizando microscopía de epifluorescencia estándar.
Las larvas transgénicas individuales (generación G1 ) se cruzan mediante retrocruza con la cepa recipiente y la progenie individual que expresa GFP (G2) se entrecruza para producir progenie homocigota (G3). Los individuos homocigotos (G3) se detectan mediante la medición de la expresión de GFP mediante microscopía de epifluorescencia cuantitativa. Se establecieron las cepas homocigotas para las inserciones particulares. En dichas cepas transgénicas, los niveles de expresión del transgen dependen no solamente del promotor y de las condiciones de inducción, sino también del punto de inserción del transgen. Varias cepas independientemente obtenidas (es decir, cepas derivas a partir de diferentes moscas G0, se evaluaron para los niveles de expresión de hGH y aquellas que mostraron los niveles más altos se caracterizaron adicionalmente en los niveles moleculares y citogenéticos. La caracterización molecular consiste de análisis Southern, y, para las cepas que eventualmente se utilizaran para la producción de proteína, clonación y secuencíación del transgen. La caracterización citogénica se realizó mediante hibridación in situ de los cromosomas politenos de la glándula salival para determinar el punto de inserción cromosomal. Para construir cepas con inserciones múltiples, las cruzas apropiadas se llevaron a cabo entre miembros de diferentes cepas. La progenie de estas cruzas se entrecruzó, y los individuos homocigotos múltiples se recuperaron utilizando GFP como un marcador. Dependiendo de la posición cromosomal de las inserciones, las cepas que portan cromosomas balanceadores pueden utilizarse para facilitar estas construcciones. Tres a cuatro generaciones se requieren para construir cepas estables con inserciones múltiples. La crianza en masa de larvas se llevó a cabo de conformidad con los procedimientos establecidos. Las larvas se criaron sobre un alimento semi-seco que consistía de una base de salvado suplementada con levadura. El crecimiento larval se sincronizó mediante cambios apropiados de temperatura y las larvas en etapa de tercera crisálida se trataron a 39-41 °C por el tiempo requerido para una inducción máxima del transgen. Las larvas en etapa de tercera crisálida tardía se movieron lejos de la comida, en búsqueda de un lugar para pupar. Esta conducta se utilizó para cosechar las larvas de la comida para la producción de moscas en masa en instalaciones de crianza en masa; esto también se aplicó a la cosecha de larvas libres de comida para la producción de proteína y purificación. Las larvas de la Mosca mediterránea del fruto se lavaron con solución salina enfriada y luego se homogeneizaron en la presencia de inhibidores de proteasa. La hGH se purificó a partir del homogeneizado de conformidad con los procedimientos estándares.
EJEMPLO 3 Producción de un anticuerpo camelid en larvas de la mosca mediterránea del fruto
Un vector diseñado para la expresión de una proteína en hemolinfa larval se muestra en la figura 7. LspP/L es el promotor del gen de la proteína de suero larval de Drosophila o de la Mosca mediterránea del fruto (Lsp) (Benes et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 249(5):545-56), seguido por el líder no traducido Lsp5' (casilla a rallas) y el péptido señal Lsp (casilla negra). El gen de interés, en este caso el gen del anticuerpo camelid, se fusiona en marco al péptido líder. HspP y HspT son el promotor y el terminador del gen de choque térmico 70, respectivamente. CcW es el gen blanco de la mosca mediterránea del fruto, utilizado como un marcador visible dominante para detectar transformantes. MiL y MiR son los extremos del elemento Minos. Un anticuerpo camelid se aisló a partir de la librería de expresión del fago (Unilever). El anticuerpo es específico para el retrovirus porcino PERV (retrovirus endógeno porcino) y reconoce el componente p30 de las proteínas PERV (las proteínas del núcleo viral). Una clona p30 se expresó en el vector de expresión pHEN1 con el objeto de obtener antígeno para seleccionar la librería del anticuerpo, y las clonas de anticuerpo se seleccionaron de conformidad. Una secuencia preliminar y la traducción del anticuerpo utilizado en este experimento se establecen en la figura 8.
Las moscas transgénicas se identificaron mediante la expresión de blanco, como en el ejemplo 1. La expresión del anticuerpo se detectó en la hemolinfa de las larvas de moscas transgénicas. El anticuerpo se purificó mediante la homogeneización del extracto larval y purificación mediante cromatografía en columna con proteína A. Las immunoglobulinas se unieron a la proteína A a pH 8.6 y se eluyeron a partir de la columna a 4.3. Esta elución se hizo al disminuir el pH de la columna de proteína A. La agarosa proteína A (0.25 g; Sigma) se hizo turgente en solución salina amortiguada con Tris (Tris 0.05 M, NaCI 0.15 , pH 8.6) y luego se empacó en una columna (el volumen de los glóbulos es de 1 mi). El sobrenadante de cultivo se ajustó a pH 8.6 al añadir NaOH diluido y luego se centrifugó a 600 g por 30 minutos a 4°C. Después de que la muestra se cargó, la columna de proteína A se lavó con solución salina amortiguada con Tris, pH 8.6, hasta que ya no se eluyeron proteínas a partir de la columna. Luego, los pasos de elución se llevaron a cabo con PBS (fosfato 0.05 M / NaCI 0.15 M, pH 7.0), solución salina amortiguada con citrato (citrato 0.05 M / NaCI 0.15 M, pH 5.5) y solución salina amortiguada con acetato (acetato 0.05 M / NaCI 0.15 M, pH 4.3) hasta que el anticuerpo se eluyó. Las fracciones que contribuyen al pico de A 280 se agruparon, se dializaron en PBS 0.01 x, se liofilizaron, se redisolvieron en 500 µ? de PBS y se almacenaron a -70°C. La pureza del pico de proteínas se analizó mediante SDS/PAGE. La columna se regeneró al lavarla con solución salina amortiguada con glicina (glicina 0.05 M /HCI/ NaCI 0.15 M, pH 2.3) seguido por solución salina amortiguada con Tris (pH 8.6, que contiene NaN3 al 0.02%). Un ensayo de ELISA se llevó a cabo utilizando antígeno p30 inmovilizado, producido como se mencionó anteriormente, y un anticuerpo monoclonal de murino anti-camelid marcado. La especificidad del anticuerpo diluido a partir de la larva de la mosca mediterránea del fruto para PERV p30 se confirmó entonces.
EJEMPLO 4 Producción de ct-glucosidasa de humano en larvas de la mosca mediterránea del fruto
Se construyó un sistema de expresión de transposón inducible por choque térmico de conformidad con el ejemplo 1, utilizando el gen de a-glucosidasa de humano (GenBank Gl:182907) en lugar del gen GFP. Una mezcla del ADN del plásmido con transposón y del ADN del plásmido con auxiliar, como para el ejemplo 1 , se co-inyectó dentro de embriones de Drosofila o de la mosca mediterránea del fruto en etapa de pre-blastodermo (0-1 horas post-oviposición) homocigotos para la mutación del color blanco de los ojos. Para detectar a las moscas mediterráneas del fruto transgénicas, las moscas derivadas a partir de los embriones inyectados (generación G0) se cruzan mediante retrocruza con la cepa recipiente, y su progenie se evalúa individualmente en la etapa larval para la expresión del gen blanco. La expresión de blanco es detectable como un cambio en el color del ojo a partir de blanco a coloreado (variando de amarillo pálido a rojo tipo silvestre). Las larvas transgénicas individuales (generación G1 ) se cruzan mediante retrocruza con la cepa recipiente y la progenie blanco individual (G2) se entrecruza para producir progenie homocigota (G3). La intensidad del color del ojo dependiente de la dosis del gen. Los individuos homocigotos se detectaron, por lo tanto, entre la progenie G3 al seguir estos fenotipos. Los individuos G3 homocigotos putativos se entrecruzan y su progenie se analiza mediante Southern para determinar si éstos contienen inserciones particulares o múltiples. Las cepas homocigotas para la inserciones particulares se establecieron mediante este procedimiento.
Expresión inducible por calor de -qlucosidasa en larvas de Drosophila y mosca mediterránea del fruto Las larvas Drosophila y de la mosca mediterránea del fruto transgénicas homocigotas para las inserciones del transposón MiHsp -glucosidasa/HspCcW que se crecieron a la temperatura estándar de 22-24 grados C mostraron niveles bajos pero detectables de a-glucosidasa en comparación con las larvas no transgénicas en las almohadillas de grasa, como se evalúo mediante immunocuantificación de conformidad con Umapathysivam et al., Clin Chem 2000 46(9):1318-25. La cantidad de -glucosidasa se incrementó marcadamente después del choque térmico.
Claims (10)
1.- Un método para producir una proteína de interés, que comprende: (a) transformar la línea germinal de un insecto con un sistema de expresión no viral capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto; (b) cruzar el insecto para producir larvas; (c) cultivar las larvas; y (d) aislar la proteína de interés a partir de las larvas.
2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la transformación del insecto comprende los pasos de: a) proveer un elemento de transposición el cual codifica una proteína transposasa la cual está activa en el insecto; b) modificar el elemento de transposición al insertar una secuencia codificante que codifica la proteína de interés; c) transformar los insectos blanco con el elemento de transposición modificado.
3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el elemento de transposición se selecciona a partir del grupo que consiste de Minos, mariner, Hermes, sleeping beauty y piggyBac.
4. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque las larvas de insecto se crían en masa.
5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el sistema de expresión comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de interés, bajo el control de un elemento de control transcripcional inducible el cual es operativo en las larvas de insecto.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el sistema de control inducible se regula mediante tetraciclina o estrógenos.
7. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el sistema de expresión comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de interés, bajo el control de un elemento de control transcripcional constitutivo el cual es operativo en las larvas de insecto.
8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el elemento de control constitutivo se selecciona a partir del grupo que consiste del promotor citoplásmico de actina, tal como el promotor Act5C de Drosophila, y el promotor citoplásmico de tubulina.
9. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la secuencia control de expresión inducible es un promotor de choque térmico, tal como el promotor hsp70 de Drosophila o de la mosca mediterránea del fruto.
10. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el producto proteico se acumula principalmente en los cuerpos grasos o en la hemolinfa. 1 1 . - El método de conformidad con la reivindicación 10, 5 caracterizado además porque el promotor de la proteína de suero larval dirige la expresión del producto proteico hacia la hemolinfa, y el promotor H5p70 se utiliza para la expresión en los cuerpos grasos. 12. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el insecto se 10 transformar con dos o más sistemas de expresión, o un sistema de expresión que comprende dos o más secuencias codificantes. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la retención del sistema de expresión se favorece mediante el uso de un cromosoma balanceador. 15 14.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la proteína de interés se selecciona a partir del grupo que consiste de una enzima, una ? citosina, una hormona, o un fármaco proteináceo. 15.- El método de conformidad con cualesquiera de las 20 reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el insecto se selecciona a partir del grupo que consiste de Bactrocera oleae (mosca del olivo), Bactrocera orientalis (mosca oriental del fruto), Heliothis armígera (gusano del algodón), Trichoplusa ni (gusano de la calabaza), Manduca sexta (gusano con cuernos del tabaco), Lobesia botrana (polilla de la vid), Anopheles gambiae (mosquito), Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla), Glossina morsitans (mosca tse-tse), Simulium sp. (moca negra), Phiebotomus sp. (mosca de la arena), Musca domestica (mosca domestica) y Ceratitis capitata (Mosca mediterránea del fruto). 16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el insecto es Cerotitis capitata. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el insecto es Drosophila melanogaster. 18.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque los cultivos larvales se sincronizan mediante la manipulación de las temperaturas de cultivo.
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| CN104186425B (zh) * | 2014-07-15 | 2016-08-24 | 中山大学 | 利用耐烟碱家蝇幼虫生物处理不适用鲜烟叶同时获得有机肥和生物蛋白的方法 |
| CN104381221B (zh) * | 2014-10-11 | 2017-01-25 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 桔小实蝇规模化饲养方法 |
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