JP2023517779A

JP2023517779A - 昆虫における組換えタンパク質の産生

Info

Publication number: JP2023517779A
Application number: JP2022581313A
Authority: JP
Inventors: エルジェンディ，マームード; エルガマル，アブドゥラジズ; アデル，アーメド; ハシシュ，ラナ; マドブーリー，ユーセフ; マルーフ，アーメド
Original assignee: プロテイネア，インコーポレーテッド
Priority date: 2020-03-15
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2023-04-26
Also published as: WO2021188445A1; US20230172175A1; BR112022018442A2; MX2022011408A; CN115334876A; AU2021237476A1; IL296417A; EP4120829A1; CA3171935A1; KR20220155584A

Abstract

本開示は、昆虫由来の医薬液体または固体組成物の商業規模の産生及び処理の分野に関し、組成物は、精製された組換えタンパク質、ワクチン、抗体、ペプチド、または化学物質を含む。バイオリアクター内で昆虫及び精製された昆虫由来組換えタンパク質、ワクチン、抗体、ペプチド、殺虫剤、殺菌剤、または化学物質を産生するためのシステム及び方法も記載される。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２０年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／９８９，７２５号に対する優先権の利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、組換えバイオテクノロジーの分野、特にタンパク質発現の分野にある。本発明は、昆虫の幼虫または蛹を使用する、バッチモード及び／または連続モードでの組換えタンパク質の効率的な産生に関する。特に、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ（一般的に、ブラックソルジャーフライとして知られている）に属するものは、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ（一般的に、熱帯イエコオロギとして知られている）、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ（一般的に、Ｊａｍａｉｃａｎｆｉｅｌｄｃｒｉｃｋｅｔとして知られている）、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（一般的に、イエコオロギとして知られている）、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ（一般的に、黄色ミールワームとして知られている）、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ（一般的に、ダークミールワームとして知られている）、Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓ（一般的に、レッサーミールワームとして知られている）のグループに属するものである。本発明は、一般に、遺伝子形質転換によって宿主生物から目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現させる方法に関する。さらに、本発明は、外因性核酸を含む形質転換昆虫自体にも関する。

組換えＤＮＡ技術の出現は、様々な異種システムでの組換えタンパク質の産生を可能にする大きいブレークスルーである。組換えタンパク質は、食品、飲料、化粧品、及び製薬の業界で幅広い用途を有する（Ｐｕｅｔｚ，Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ２０１９，７，４７６）。細菌、酵母、菌類、植物、哺乳動物、及び昆虫の細胞など、産業用途及び治療用途の組換えタンパク質の産生には、様々なプラットフォームが使用され得る。しかし、これらの異なる宿主系は、いくつかの制限を有する。細菌としての原核生物の培養系は、小さくて短いペプチドを産生するために使用できるが、グリコシル化などのフォールディング及び翻訳後修飾を必要とする複雑なタンパク質を産生することはできない（Ｐｕｅｔｚ，Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ２０１９，７，４７６）。酵母の使用は、この制限を部分的に克服し、産生されたタンパク質の比較的単純な下流精製にとって有利であり得る。しかし、酵母の使用は、哺乳動物タンパク質またはプロテアーゼ感受性タンパク質の産生には適していない（Ｐａｌｏｍａｒｅｓ，Ｌ．，ｅｔａｌ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２００４，２６７）。哺乳動物及び昆虫細胞などの動物細胞の使用により、複数の制限が克服され得る。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、哺乳動物の治療用タンパク質を産生するためのゴールドスタンダードなプラットフォームである。それにもかかわらず、動物細胞を培養するための培地が高コストであることは、大規模産生における困難な制約である（Ｐｕｅｔｚ，Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ２０１９，７，４７６）。産生コスト及びバイオリアクターベースのシステムの線形コストにより、様々な業界でのタンパク質ベースの製品の潜在的な使用が妨げられている。これに関して、大規模での組換えタンパク質の迅速かつ費用対効果の高い産生のための革新的なプラットフォームを開発することが最も重要である。したがって、組換えタンパク質を産生する別の方法が必要とされている。

本発明は、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓ中の組換えタンパク質の商業的産生のための方法を開示し、本方法は、目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子のコピーを生成し、次いで、宿主での発現を媒介する様々なアプローチを採用することにより、目的の遺伝子を昆虫体内に送達することを含む。本発明の１つの目的は、昆虫を使用して商業的可能性のある組換えタンパク質を生成するためのプラットフォームを提供することであり、これは費用対効果が高く、迅速な産生サイクル及び高い産生収量を有するなど、複数の利点を有することが期待される。したがって、一般的に使用されるプラットフォームの有望な代替手段である。

一態様では、本明細書に開示されるのは、少なくとも１つの外因性遺伝子を含む形質転換昆虫であって、昆虫は、Ｈｅｒｍｅｔｉａ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓ、Ａｃｈｅｔａ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ、及びＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓからなる群から選択される属の昆虫である。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用できる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、外因性遺伝子は、昆虫の体細胞内に含まれるか、または外因性遺伝子は、昆虫の生殖細胞系列内に含まれる。いくつかの実施形態では、外因性遺伝子は、安定して遺伝性である。いくつかの実施形態では、昆虫は、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、またはＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓからなる群から選択される種の属であり、好ましくは昆虫は、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓである。いくつかの実施形態では、昆虫は、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、及びＡｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓからなる群から選択されるミールワームである。いくつかの実施形態では、昆虫は、胚、幼虫、蛹、または成虫である。いくつかの実施形態では、昆虫は、少なくとも１つの外因性遺伝子によってコードされる組換えタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、昆虫は、少なくとも２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの組換えタンパク質、または少なくとも３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇの組換えタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、昆虫によって発現される総タンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、抗体、抗原、抗原結合分子、酵素、ホルモン、ワクチンの成分、及びウイルス様粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの外因性遺伝子は、トランスポゾン媒介組込みによって昆虫ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの外因性遺伝子は、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｈｓｐ７０プロモーターの制御下にある。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される形質転換昆虫に由来する飼育昆虫であり、飼育昆虫は、少なくとも１つの外因性遺伝子を含む。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、飼育昆虫は、少なくとも１つの外因性遺伝子によってコードされる組換えタンパク質を発現する。飼育昆虫は、形質転換昆虫から１、２、３、４または５世代除去されてもよく、または形質転換昆虫から５世代を超えて除去されてもよい。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の形質転換昆虫または本明細書に記載の飼育昆虫に由来する蛹である。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される形質転換昆虫または本明細書に開示される飼育昆虫に由来する幼虫である。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される形質転換昆虫または本明細書に開示される飼育昆虫に由来する卵である。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される形質転換昆虫または本明細書に開示される飼育昆虫に由来する成体昆虫である。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される形質転換昆虫または本明細書に開示される飼育昆虫から産生されたバイオマスである。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される形質転換昆虫または本明細書に開示される飼育昆虫から単離された組換えタンパク質である。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗原、抗原結合分子、酵素、ホルモン、ワクチンの成分、及びウイルス様粒子からなる群から選択される。

一態様では、本明細書に開示されるのは、以下を含むタンパク質を産生するための方法であって、本方法は、ａ．Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、またはＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓからなる群から選択される昆虫の第１段階を形質転換することであって、形質転換は、昆虫のゲノムへの発現カセットの組込みをもたらし、ここで、発現カセットは、異種タンパク質をコードする遺伝子を含み、異種遺伝子が熱ショックプロモーターの制御下にある、形質転換することと；ｂ．第２段階で形質転換された昆虫に熱ショックを与えることと；ｃ．形質転換昆虫からタンパク質を含むバイオマスを採取することと、を含む。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、第１段階は、卵または胚である。いくつかの実施形態では、第２段階は、幼虫、蛹または成虫である。

一態様では、本明細書に開示されるのは、以下を含むタンパク質を産生するための方法であって、本方法は、ａ．Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、またはＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓからなる群から選択される昆虫を形質転換することであって、形質転換は、昆虫の生殖細胞系列への発現カセットの組込みをもたらし、発現カセットは、異種タンパク質をコードする遺伝子を含む、形質転換することと；ｂ．形質転換昆虫を繁殖させて次世代の昆虫を産生することと；ｃ．次世代の昆虫からタンパク質を含むバイオマスを採取することと、を含む。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、バイオマスを採取するステップの前に、次世代の昆虫を大量飼育するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、形質転換ステップは、昆虫の卵または胚の段階で行われる。いくつかの実施形態では、バイオマスは、幼虫、蛹、または成虫の段階から採取される。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、熱ショックプロモーターの制御下にあり、方法は、バイオマスを採取する前に、次世代の昆虫に熱ショックを与えることをさらに含む。いくつかの実施形態では、熱ショックプロモーターは、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｈｓｐ７０プロモーターである。いくつかの実施形態では、昆虫は、少なくとも２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５、ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの異種タンパク質を発現するか、または昆虫は、少なくとも３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇの異種タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、昆虫によって発現される総タンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％である。いくつかの実施形態では、この方法は、バイオマスから異種タンパク質を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、バイオマスから異種タンパク質を濃縮または部分的に精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、形質転換ステップは、トランスポゾン媒介による発現カセットの組込みを含む。いくつかの実施形態では、形質転換ステップは、昆虫において活性であるトランスポザーゼ酵素を提供するステップをさらに含み、発現カセットは、転移エレメントによって各末端に隣接している。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、ヘルパープラスミド上のコード領域として、または核酸によってコードされるコード領域として、またはトランスポザーゼタンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、昆虫は、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓである。いくつかの実施形態では、昆虫は、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、及びＡｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓからなる群から選択されるミールワームである。いくつかの実施形態では、形質転換ステップは、発現カセットの物理的または化学的送達を含む。いくつかの実施形態では、形質転換ステップは、注入、ＤＮＡ粒子ボンバードメント（ＤＮＡｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション、注入後のエレクトロポレーション、流体力学、超音波、またはマグネトフェクションを含む。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、抗体、抗原、抗原結合分子、酵素、ホルモン、ワクチンの成分、及びウイルス様粒子からなる群から選択される。

一態様では、本明細書に開示される方法のいずれか１つによってバイオ製造される異種タンパク質が本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を発現する。

一態様では、本明細書に開示される方法のいずれか１つによってバイオ製造されるＶＬＰが本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示される方法のいずれか１つによってバイオ製造されるワクチン成分が本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、この方法は、形質転換幼虫の全身から異種タンパク質を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、形質転換幼虫の血リンパ、脂肪体、または分泌腺から異種タンパク質を単離することをさらに含む。

一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって産生される単離異種タンパク質である。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示されるのは、形質転換昆虫を産生するための方法であって、本方法は、昆虫において活性であるトランスポザーゼ酵素、及び発現カセットを提供することによって、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓの昆虫の卵または胚を形質転換することを含み、発現カセットは、異種タンパク質をコードする遺伝子を含み、発現カセットは、転移エレメントによって各末端に隣接し、それによって、形質転換は、昆虫のゲノムへの発現カセットの組込みをもたらす。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、ヘルパープラスミド上のコード領域として、または核酸によってコードされるコード領域として、またはトランスポザーゼタンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、発現カセットは、昆虫の体細胞内に含まれる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、昆虫の生殖細胞系列内に含まれる。いくつかの実施形態では、昆虫は、少なくとも２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５、ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの異種タンパク質を発現するか、または昆虫は、少なくとも３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇの異種タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、昆虫によって発現される総タンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％である。いくつかの実施形態では、方法は、昆虫から異種タンパク質を採取することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ａ．形質転換昆虫を繁殖させて次世代の昆虫を産生するステップ；及びｂ．次世代の昆虫から異種タンパク質を含むバイオマスを採取することをさらに含む。

一態様では、本明細書に開示される方法のいずれかによって産生される形質転換昆虫が本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示される方法のいずれかによって産生される形質転換蛹が本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示される方法のいずれかによって産生される形質転換胚が本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、本明細書に開示される方法のいずれかによって産生される形質転換幼虫が本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

一態様では、バイオマスを採取するステップの前に、形質転換昆虫を大量飼育するステップをさらに含む、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって産生される形質転換昆虫の集団が、本明細書に開示される。本明細書に記載の本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。

ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｈｓｐ７０プロモーターの制御下にあるｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼを含むヘルパープラスミドを示す図である。機能的プロモーターの制御下にある目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むドナープラスミドを示す図である。対照（Ｃ）及びトランスジェニック（Ｔ）Ｈ．ｉｌｌｕｃｅｎｓ（ＢＳＦ）５齢幼虫を撮影した近年の発現研究の画像を示す図である。トランスジェニック（Ｔ）幼虫中のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光は、クラスター中に存在し、幼虫の全身に見られる（中央部の一部が示されている）。対照（Ｃ）幼虫では、蛍光は観察されなかった。

本発明の代表的な実施形態を説明する際に、本明細書は、本発明の方法及び／またはプロセスを特定の一連のステップとして提示し得る。しかし、方法またはプロセスが、本明細書に記載された特定のステップ順序に依存しない限り、方法またはプロセスは、記載された特定のステップ順序に限定されるべきではない。当業者が理解するように、ステップの他の順序が可能であり得る。したがって、明細書に記載されているステップの特定の順序は、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本発明の方法及び／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、記述された順序でそれらのステップを実施することに限定されるべきではなく、当業者であれば、順序が変更され得、依然として本発明の趣旨及び範囲内にあることは容易に理解できる。本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、材料、試薬、及び物質などに限定されないことを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、本発明の範囲を制限するものではなく、それは請求項／条項によってのみ定義される。

本発明において、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓが、商業的可能性のある組換えタンパク質を産生するためのプラットフォームとして使用される。目的のタンパク質を産生するための方法は、目的のタンパク質を発現することができる組換えＤＮＡを含む発現系で昆虫を形質転換することを含む。本発明において、宿主昆虫は、卵期から蛹期までの範囲の異なる発育段階で、目的の遺伝子によって形質転換される。

組換えタンパク質の産生プラットフォームとしての生きた昆虫の使用は、有望なアプローチである。このアプローチでは、昆虫をミニバイオ工場として使用して、目的のタンパク質を得る。昆虫は、代謝が加速されているため、非常に効率的なタンパク質生産者である。昆虫細胞株及び他のプラットフォームと比較すると、昆虫媒介タンパク質の発現全体は、昆虫が大量の組換えタンパク質を産生する能力と共に、生産コストの大幅な削減など、複数の利点をもたらす。生きたバイオ工場としての昆虫は、生産の多様性、スケーラビリティ、自動化可能性、効率性、及び開発スピードにより、昆虫細胞、従来の発酵技術、及び植物由来タンパク質の有望な代替手段を構成する。例えば、生きているバイオ工場としての昆虫は、タンパク質を発現させるためのバイオリアクターが不要になる。バイオリアクターは、非効率的で、高価で、技術的に複雑であるため（構築に数年を要する、検証が困難である、操作には高度な資格のある人員を必要とする、汚染されやすい、及び信頼性が低い）、新規及び既存の組換えタンパク質を産生するには、技術的及び経済的な障壁である。さらに、スケーラビリティの制限の問題に直面する。ミリグラム／リットルの組換えタンパク質を産生する昆虫細胞培養系と比較して、昆虫の幼虫は、最大で数グラムまたは数百グラム／リットルの組み換えタンパク質を産生できる。

ブラックソルジャーフライ（ＢｌａｃｋＳｏｌｄｉｅｒＦｌｙ）は、非選択的昆虫であり、あらゆる飼料源で摂餌する一方で、病原菌を中和するため、タンパク質産生プロセスがはるかに容易になる。集中的研究後、本発明の発明者らは、上記の問題に対する解決策、すなわち、双翅目に属する、より好ましくはＨｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｓｉｏｎ種に属する卵、幼虫、または蛹におけるより効率的なタンパク質発現系を見出した。これは、他の昆虫種よりも効率的であり、さらに前例のないスケールの自動化（スケールアップ）が可能になり、特に産業規模での組換えタンパク質発現に関連する効率が向上し、コストが削減される。イラクサギンウワバ（ｃａｂｂａｇｅｌｏｏｐｅｒ）及び蚕は、１サイクルあたり最大１０００個の卵を産むことができるブラックソルジャーフライまたはミールワームと比較して、比較的少ない１サイクルあたりの産卵数を有する。ブラックソルジャーフライは、繭形成がなく、きわめて接近して産生され（イラクサギンウワバ及び蚕とは異なる）、これは、狭い地域で産生させ得ることを意味する。これにより、スケールアップ産生のために、垂直農業及びそれらを積み重ねる能力がサポートされる。

蚕などのいくつかの昆虫種における、特定の発育段階の遺伝的形質転換に関連する技術的問題は、ブラックソルジャーフライの卵では遭遇しない。ショウジョウバエ及びマウスなどの他の生物で開発された注入法では、卵の絨毛膜が硬くて強いため、蚕ではうまく作動せず、薄ガラスキャピラリーの先端が卵を貫通できない。しかし、ブラックソルジャーフライの卵は、蚕よりもはるかに容易なプロセスで生殖細胞系列の形質転換を確立させる標準的形質転換技術によって容易に貫通させ得る。

したがって、本発明は、大量飼育された昆虫、好ましくは、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ種に属する昆虫の可能性をスケーラブルな組換えタンパク質の産生に活用することに関する。このような昆虫は、卵の孵化から１８日以内に体長が約２４倍、体重が約９，０００倍成長する。

本明細書で使用される「１つ（ｏｎｅ）」、「ａ／ａｎ」は、別段の指示がない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味し得る。単語「含む」と共に使用されるとき、特許請求の範囲で使用される単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味することがある。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも２番目またはそれ以上を意味し得る。

本発明によれば、「幼虫」という用語は、多くの昆虫の卵から孵化する、未熟で無翅の、多くの場合、蠕虫様摂食形態を指す。数回の脱皮を経験して、主に大きさが変化し、最終的に蛹（ｐｕｐａ）または蛹（ｃｈｒｙｓａｌｉｓ）になり、そこから成虫になる。

「蛹」という用語は、形質転換を受ける一部の昆虫の生活段階を指す。蛹段階は、完全な変態を行った、４つの生活段階（胚、幼虫、蛹、及び成虫）を経る完全変態昆虫にのみ見られる。

本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ」は、ＤＮＡを結合するために、１つ以上のＤＮＡ鎖の結合または挿入によって操作される、天然には存在しない人工ＤＮＡ形態を指す。

本明細書では、「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡに由来するタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、ヒト及び動物の利益のために使用することができ、工業的、商業的または治療的用途を有し得る。

昆虫バイオマスから産生された目的の組換えタンパク質は、これらに限定されないが、抗体、酵素、成長因子、サイトカイン、ホルモン、シグナル伝達ペプチド、構造タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、融合タンパク質、インターロイキン、人工設計タンパク質、サブユニットワクチン、モノクローナル抗体、細胞表面受容体、ホルモン受容体、膜輸送タンパク質、サイクリン、Ｆａｂ断片、ナノボディ、アフィボディ及び他の抗体模倣体、ウイルス抗原、ウイルス様粒子、ウイルス受容体、蛍光タンパク質、融合体、コリンエステラーゼ、ペプチダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒトアデノシンデアミナーゼ、ホスホリパーゼ、無脊椎動物免疫タンパク質、ＲＡＳエフェクター、抗菌ペプチド、または任意の他の既知のタンパク質などの任意のタンパク質配列であり得る。

本発明の組換えタンパク質の由来は、限定されない。好ましくは、タンパク質は、哺乳動物、細菌、ウイルス、真菌、植物または水産養殖のタンパク質に由来する。

本明細書で使用される「発現系」は、遺伝子自体及び／またはこの遺伝子の発現を制御する因子（例えばプロモーター）など、特定の遺伝子の発現に関与する組換えＤＮＡエレメントを含む。

トランスジェニック昆虫の産生の成功は、生殖細胞系列または体細胞形質転換のいずれかによって得られる。

本明細書で使用する「トランスジェニック昆虫」とは、外因性核酸を一過的または安定的に発現する昆虫を指す。

本明細書で使用される場合、「安定発現」は、宿主生物のゲノムへの外因性核酸の組込みにより生じる遺伝子発現を指す。

本明細書で使用される場合、「一過性発現」は、宿主ゲノムに組み込まれることなく、宿主生物の細胞内の外因性核酸ビヒクルの存在により生じる遺伝子発現を指す。

本明細書において、「生殖細胞系列形質転換」とは、宿主生物の生殖細胞を標的とし、受け継ぎ、次世代に継承することによって起こる遺伝子形質転換を指す。

本明細書で使用される場合、「体細胞形質転換」は、宿主生物の体細胞内で起こる遺伝子形質転換を指す。

いくつかの実施形態では、遺伝子形質転換は、非ウイルス発現系、例えば、これらに限定されないが、トランスポゾン、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって媒介される。

トランスポゾン：
トランスポゾンは、遺伝的エレメントであり、種のゲノム内のある位置から別の位置に「ジャンプ」または転移することができる。昆虫などの動物に広く分布している。トランスポゾンは、エレメント自体によってコードされるトランスポザーゼタンパク質の活性により、宿主種内で活性であるか、または他の手段、例えば、トランスポザーゼコードｍＲＮＡの注入、トランスポザーゼをコードする第２のコード配列の使用、またはトランスポザーゼタンパク質自体の添加などにより提供される。転移のメカニズムの理解が進んだ結果、遺伝子導入に使用できるトランスポゾンに基づく遺伝的ツールが開発された。

所望の昆虫において活性である任意の転移エレメントを使用することができる。しかし、転移エレメントは、好ましくは、Ｍｉｎｏｓ、ｍａｒｉｎｅｒ、Ｈｅｒｍｅｓ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ及びｐｉｇｇｙＢａｃからなる群から選択される。

ＰｉｇｇｙＢａｃは、バキュロウイルス宿主Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来のトランスポゾンである。チチュウカイミバエの生殖細胞系形質転換へのその使用は、Ｈａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，（１９９８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：７５２０－５によって記載されている。

Ｍｉｎｏｓは、転移エレメントであり、チチュウカイミバエ中で活性である。これは、米国特許第５，８４０，８６５号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。昆虫を形質転換するためのＭｉｎｏｓの使用は、前述の米国特許に記載されている。

Ｍａｒｉｎｅｒは、もともとショウジョウバエから単離されたトランスポゾンであるが、その後、いくつかの無脊椎動物及び脊椎動物の種で発見された。生物を形質転換するためのｍａｒｉｎｅｒの使用は、国際特許出願ＷＯ９９／０９８１７に記載されている。

Ｈｅｒｍｅｓは、一般的なイエバエ由来である。トランスジェニック昆虫の作出におけるその使用は、米国特許第５，６１４，３９８号に記載されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

部位特異的リコンビナーゼ：
部位特異的リコンビナーゼは、核酸セグメントの挿入または切除を触媒する。これらの酵素は、認識及び組換えの両方に有用な比較的短い固有の核酸配列を認識する。例としては、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｔａｌ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ，１９８１，１５０：４６７－４８６）、Ｆｌｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔａｌ，ｃｅｌｌ１９８２，２９：２２７－２３４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，６５４，１８２；５，８８５，３８６；６，１４０，１２９；及び６，１７５，０５８）、及びＲ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔａｌ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９０，１７２：６１０－６１８）が挙げられる。核酸を操作するための部位特異的リコンビナーゼの使用の例は、米国特許第５，５２７，６９５号；同第５，６５４，１８２号；同第５，６７７，１７７号；同第５，８０１，０３０号；同第５，９１９，６７６号；同第６，０９１，００１号；同第６，１１０，７３６号；同第６，１４３，５５７号；同第６，１５６，４９７号；同第６，１７１，８６１号；同第６，１８７，９９４号；及び同第６，２６２，３４１号に記載されている。これらの系による組換えのメカニズムの理解の進歩は、遺伝子導入に使用できるそれらに基づく遺伝的ツールの開発をもたらした。

本発明によれば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）技術を使用することができる。ＲＭＣＥ技術により、大きいＤＮＡ配列のスワッピングが可能になる。この技術は、特定のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１）に隣接する導入遺伝子で操作された親系統の生成に基づく。次いで、第２の導入遺伝子（これも特定のリコンビナーゼ部位に隣接する）を含む交換プラスミドを導入することができる。交換プラスミド＋導入遺伝子は、リコンビナーゼを発現するヘルパープラスミド（例えば、Ｃｒｅ）の存在下で親株にトランスフェクトされる。リコンビナーゼは、親系統に組み込まれた第１の導入遺伝子と交換プラスミド導入遺伝子との間の交換を触媒し、したがって、所望の遺伝子導入を完了することができる。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
ＺＦＮは、２つのドメイン（ＤＮＡ結合亜鉛フィンガードメイン及びＤＮＡ切断ドメイン）を含む人工制限酵素のクラスに属する。このクラスのヌクレアーゼは、ゲノム操作のために、ＤＮＡの特定の領域を標的とするように操作できる。ＤＮＡ結合ドメインは、９ｂｐの標的を認識できる。ＤＮＡ切断ドメインは、標的ゲノムの二本鎖破断を誘導できるように、最初に二量体化させる必要がある（Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．ｅｔａｌ，ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ２０１０，１１，６３６－６４６）。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、一般的に使用される別の遺伝子編集ツールであり、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインの２つのドメインで構成される。ＤＮＡ結合ドメインは、細菌から分泌される転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来し、特定の制御エレメントに結合したときに、宿主植物細胞内のそれぞれの遺伝子を調節する（Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ｅｔａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ２０１３，１４（１），４９－５５）。ＴＡＬＥＮは、遺伝子編集の目的で特定のゲノム領域に結合するように操作することができ、標的認識時に二本鎖破断を導入する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）技術は、強力なツールとして近年出現し、その柔軟性、高い忠実度、及び設計の簡素さにより、ゲノム編集の分野に革命をもたらしている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ酵素及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＲＮＡガイドＤＮＡ切断システムである。ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡとして知られる２つの短いＲＮＡ分子が共に結合して構成している。ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ酵素の結合を担う足場配列を形成する一方で、ｃｒＲＮＡには、プロトスペーサーとして知られる、標的ＤＮＡへの結合を担う可変配列（スペーサー）が含まれている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ作用機序は、Ｃａｓ酵素によるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られている配列の認識に依存し、次いで、スペーサーが標的領域に結合し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性の活性化がもたらされる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性により、標的ゲノム領域に二本鎖破断が形成され、次いで、細胞修復メカニズムによって修復されて、ゲノム操作が可能になる（ＴｅｒｎｓＭ．Ｐ．，ｅｔａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｅｌｌ，２０１８，７２（３），４０４－４１２）。

本発明によれば、形質転換昆虫の作出には、これらに限定されないが、最新技術において知られている物理的及び化学的方法など、任意の可能な手段によって、発現系が宿主昆虫に導入される必要がある。形質転換の１つの形態では、マイクロピペットを使用して、ＤＮＡを細胞に直接マイクロインジェクションする。あるいは、高速弾道を使用して、小さなＤＮＡ関連粒子を細胞内に押し進めることができる。別の形態では、ポリエチレングリコールの存在によって細胞が浸透処理され、拡散によってＤＮＡが細胞に入ることが可能になる。プロトプラストを、ＤＮＡを含む他の実体と融合させることによって、ＤＮＡを細胞に導入することもできる。これらの実体には、ミニ細胞、細胞、リソソーム、または他の可融性脂質表面体が含まれる。エレクトロポレーションも、ＤＮＡを細胞に導入する方法として認められている。この技術では、細胞は、高電界強度の電気インパルスにさらされ、生体膜を可逆的に浸透させ、これにより、外因性ＤＮＡ配列の侵入が可能になる。

遺伝的形質転換に使用されるプラスミドＤＮＡ濃度には、遺伝子導入が成功するであろう任意の量が含まれる。好ましくは、使用される濃度は、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００ｕｇ／ｍｌである。あまり一般的ではない低濃度、０．１～０．２、０．２～０．３、０．３～０．４、０．４～０．５、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、０．９～１ｕｇ／ｍｌが使用される。

他の実施形態では、遺伝的形質転換は、これらに限定されないが、バキュロウイルス、デンソウイルス、ＦＨＶウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、レトロウイルス、パルボウイルス、または単純ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターによって媒介される。

本発明によれば、「バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）」は、外来遺伝子の発現をもたらすように遺伝子改変された組換えバキュロウイルスを指す。ＢＥＶは、培養昆虫細胞及び昆虫の幼虫中で遺伝子を発現するために広く使用されている。外来遺伝子発現に使用される最も一般的な分離株のうちの２つは、ＡｕｔｏｇｒａｐｈａＣａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）及びＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ（蚕）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）である。ＢＥＶが昆虫に導入され、それらが感染し、ウイルスが昆虫内で複製される。

ＢＥＶでは、外来遺伝子コード配列は通常、ウイルスプロモーターの転写制御下に置かれる。このため、通常、外来遺伝子の転写にはウイルス因子が必要である。

本発明によれば、ＢＥＶを含むウイルスベクターは、異なるアプローチにより、任意の発育段階の昆虫に導入することができる。１つの方法は、経口投与、個別注入、エアロゾルスプレー、浸漬、または任意の物理的または化学的方法によって、昆虫の幼虫にウイルスを感染させることである。

本発明によれば、幼虫または蛹は、ＢＥＶまたは任意のウイルスベクターに感染する前にストレスを与えることができる。「ストレスを与えること」という用語は、幼虫または蛹が死に至ることなくストレス（例えば熱ショック）下に置かれることを指す。ストレスを受けた後、幼虫または蛹は回復し、タンパク質を正常に発現する。本発明のいくつかの実施形態では、ストレスを与えることは、以下の手段を単独でまたは組み合わせて行うことによって達成することができる：幼虫もしくは蛹を、低温もしくは通常の成長温度よりも高いが許容温度よりも低い温度に保つこと、幼虫もしくは蛹を飢餓状態にすること、幼虫もしくは蛹を減圧雰囲気環境に置くこと、幼虫もしくは蛹に放射線を照射すること、または幼虫もしくは蛹を化学剤で処理すること。いくつかの実施形態では、幼虫または蛹は、約２℃～約１５℃、好ましくは、約３℃～約１５℃、より好ましくは、約４℃～約１５℃、約４℃～約１２℃、約５℃～約１５℃、または約４℃～約１０℃、もっとも好ましくは、約４℃～約６℃、約４℃～約８℃、または約４℃～約１０℃の低温で維持される。他の実施形態では、幼虫または蛹は、高温、約３０℃～４５℃、好ましくは約３２℃～４５℃、約３２℃～４２℃、約３２℃～４０℃、約３５℃～４５℃または約３５～４０℃で維持させる。いくつかの実施形態では、幼虫または蛹は、低線量のＵＶを照射することによって処理される。他の実施形態では、幼虫または蛹は、減圧雰囲気の環境に置かれることによって処理される。より好ましくは、雰囲気を、５％から５０％減圧する。いくつかの実施形態では、幼虫または蛹は、少なくとも２日間絶食させる。好ましくは、幼虫または蛹は、２、３または４日間絶食させる。

遺伝子形質転換に使用される組換えウイルスベクターの用量には、感染及び導入遺伝子の発現を成功させることができる任意の用量が含まれる。好ましくは、使用される感染多重度（ＭＯＩ）は、０．００１～０．０１ＭＯＩ、０．０１～０．１ＭＯＩ、０．１～１ＭＯＩ、１～３ＭＯＩ、３～５ＭＯＩ、５～１０ＭＯＩ、１０～１５ＭＯＩ、１５～２０ＭＯＩ、２０～３０ＭＯＩ、３０～４０ＭＯＩ、４０～５０ＭＯＩ、５０～６０ＭＯＩ、６０～７０ＭＯＩ、７０～８０ＭＯＩ、８０～９０ＭＯＩ及び９０～１００ＭＯＩである。

本明細書に記載の「感染多重度」とは、感染中に細胞ごとに添加されるビリオンの数を指す。

本明細書に記載の「ビリオン」は、核酸のコア及びカプシドを有する、宿主細胞外のウイルスの完全な感染形態を指す。

外因性核酸の遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、宿主生物において機能する任意のプロモーターであり得、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターのいずれかである。使用できるプロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＨＳＰ７０、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＴＲＥ、Ｕ６、ＵＡＳ、Ｔ７、Ｓｐ６、ｌａｃ、ａｒａＢａｄ、ｔｒｐ、またはＰｔａｃが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「誘導性プロモーター」は、特定の状況下でのみ活性であり、オフ状態からオン状態に切り替えることができるプロモーターを指す。

本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」は、その関連遺伝子の継続的な発現を可能にする調節されていないプロモーターを指す。

好ましい誘導性プロモーターは、幼虫を培養する温度を上昇させることによって誘導される熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０プロモーター、及びテトラサイクリン誘導性発現系である（Ｈｅｉｎｒｉｃｈｅｔａｌ，ＰＮＡＳ２０００，９７：８２２９－８２３２）。

本発明の特定の実施形態では、熱ショックを使用して、ＨＳＰ７０の発現を誘導でき、摂氏２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２度の高温によって誘導される。

Ｍｔｎプロモーター、Ｔｅｔ－ｏｎ、Ｔｅｔ－ｏｆｆ系などの他の適切なプロモーターも使用することができる。

使用される構成的プロモーターには、種自体に由来するか、または任意の他の昆虫種に由来するかにかかわらず、宿主昆虫種において機能する任意のプロモーターが挙げられる。

構成的プロモーターは、細胞質アクチンプロモーターであり得る。Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの細胞質アクチンプロモーターは、クローン化されており（Ａｃｔ５Ｃ）、蚊で非常に活性がある（Ｈｕｙｎｈｅｔａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２８８：１３－２０）。細胞質アクチン遺伝子及びそのプロモーターは、他の昆虫からも単離され得る。

他の例としては、ポリユビキチンプロモーター、細胞質チューブリンプロモーター、ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｃｏｐｉａＬＴＲ、Ｄｓ４７、ＯｐＩＥ１、ＯｐＩＥ２が挙げられる。

あまり一般的ではないが、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒａｄｈ、チューブリン、ＰＧＫ、ＣＭＶ、ＵＢＣ、またはＣＡＧＧなど、他のプロモーターも使用され得る。

他の実施形態では、分泌されたポリペプチドを制御するプロモーターを、任意により適切なシグナル配列と共に使用して、タンパク質の血リンパへの分泌を指示できる。例えば、幼虫血清タンパク質プロモーターを使用することができる。

本発明によれば、生殖細胞系列形質転換を達成するためにいくつかのアプローチを採用することができる。これらのアプローチとしては、これに限定されないが、宿主昆虫の初期段階の胚に対して、所望の発現系のマイクロインジェクションを行うことが挙げられる。いくつかの実施形態では、初期段階の胚は、０～１０、１０～２０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０分の産卵でマイクロインジェクションにより注入される。他の実施形態では、産卵されたばかりの胚を特定の条件下で保存して発育を遅らせ、後にマイクロインジェクションに使用することができる。

別の態様では、本発明は、サブユニットワクチンを産生するための方法を提供する。

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は生物学的物質として定義され得、特定の疾患に対する獲得免疫を提供する生物学的物質として定義され得る。

本明細書で使用される「サブユニットワクチン」は、翻訳後修飾され、正しく折り畳まれて免疫原として作用するサブウイルス成分を含むワクチンとして定義される。

いくつかの実施形態では、サブユニットワクチンは、ウイルス様粒子である。この方法は、宿主生物において、自己組織化してウイルス様粒子を形成することができる１つ以上のウイルス構造タンパク質を発現させることを伴う。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、標準的な天然ウイルスの組織及び構造を模倣する多タンパク質構造であるが、ウイルスゲノムを欠いており、より安全で安価なワクチン候補を産生し得る。

いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス様粒子を単離することをさらに伴い、ＶＬＰは、細胞上清から回収され、ウイルスを精製するために使用されるのと同じ手順を使用して精製され得る。ＶＬＰは、免疫応答の範囲を拡大するように操作され得る。ＶＬＰは、感染によって誘導される免疫応答と区別するように操作され得る。

本明細書では、「自己組織化可能粒子」という用語は、自発的に組織化する少なくとも１つの構成要素によって形成される粒子を指す。成分は、ポリペプチドまたは非ペプチド化合物であり得る。

本発明はまた、ｄｓＲＥＤなどの赤色蛍光タンパク質を、昆虫の幼虫における遺伝子発現のためのレポーターとして使用することにも関し、これにより、標的の遺伝子発現を肉眼で同定できるようになる。

いくつかの実施形態では、ｄｓＲＥＤなどの幼虫で発現したサンゴレッド蛍光融合タンパク質は、幼虫の通常の実験室光で、ヒトの目によって識別され得る。発現されたサンゴ赤色蛍光タンパク質の色は、赤またはピンクであり、いかなる人工物も使用することなく、直射日光下で肉眼で見ることができるほど十分に明るいため、これによって、標的融合タンパク質を発現している昆虫を容易に同定でき、時間を要するいかなる分子分析も不要である。

本発明の方法はまた、任意の簡便な方法による昆虫の幼虫または蛹からの目的の組換えタンパク質の単離にも関する。好適な方法には、昆虫の幼虫／蛹全体及び／または切断された昆虫の幼虫／蛹を下流プロセス用の抽出緩衝液と混合して、目的の組換えタンパク質を単離することを含む。

全昆虫の幼虫、及び／または切断された幼虫が利用されてもよいが、本発明は、典型的には、切断された、または他の方法で完全ではない幼虫を用いて実施される。最初は、幼虫は、細分されているか、または亀裂が生じている可能性がある。

細分の前に、採取した幼虫を洗浄してあらゆる汚れ及び粒子を取り除き、幼虫に病原体または他の汚染物質がないことを確認するために除染することができる。これは、安全かつ高品質の最終産物を得るための重要なステップである。

切断前に、幼虫を凍結させてもよい。凍結は、幼虫の均質化を最小限に抑えるのを助け得る。幼虫は、細断する、ハンマーまたは木槌などで衝撃を与えることによって破砕する、粉砕する、または他の方法で小片に破壊する、または細分することが可能である。他の実施形態によれば、昆虫は、凍結乾燥されている。

いくつかの実施形態では、昆虫由来の組換えタンパク質、ワクチン、抗体、ペプチド、または化学物質は、クロマトグラフィ精製、蒸留、蒸発、吸着、または結晶化によって精製される。

例として本発明で使用されるブラックソルジャーフライ（ＢＳＦ）は、世界の温暖な熱帯温帯地域で一般的に見られるＳｔｒａｉｏｍｙｉｄａｅ科の双翅目である（Ｈｏｃ，Ｂ．，ｅｔａｌ．ＰＬｏＳＯｎｅ２０１９）。ＢＳＦが大きい可能性を有するのは、多くの要因、例えば、その旺盛な食欲、６～７週間の短い生活環、及び不利な条件下での成長が可能な回復力などによるものである（Ｊｏｌｙ，Ｇ．，ｅｔａｌ．ＩＷＭＩ２０１９）。また、食品廃棄物、台所廃棄物、稲わら、動物の糞尿、及び糞便汚泥などの幅広い基質を消費する能力である。ＢＳＦＬは、有害な細菌及び害虫の成長を阻害することが報告されている（Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔａｌ．Ｆｏｏｄｓ２０１７，６）。さらに、成虫ハエは、口器を有さず、疾患を伝播させることは報告されておらず、摂餌をせず、特別な世話を必要としないため、大量産生において大きな利点を示す（Ｒｉｎｄｈｅ、Ｓ．，ｅｔａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｐｐ．Ｓｃｉ２０１９，８，１３２９－１３４２）。この昆虫は、卵の孵化から１８日以内に体長が約２４倍、体重が９，０００倍に成長する。

本発明で使用される熱帯イエコオロギ（Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ）及びイエコオロギ（Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）は、直翅目、コオロギ科に属する。熱帯イエコオロギの飼育には多くの利点、例えば、極端な環境条件での回復、大量飼育の大きな可能性、高集団密度に耐える能力などがある。さらに、幼虫のタンパク質含有量は、６０％～７０％の間で変動する（ＶａｎＨｕｉｓ，Ａ．ｅｔａｌ．ＷａｇｅｎｉｎｇｅｎＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ２０１７）。Ｊａｍａｉｃａｎｆｉｅｌｄｃｒｉｃｋｅｔ（Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ）は同じ特徴を示すが、程度は低く、タンパク質含有量は、５０％～６５％で変動する。

本発明は、それぞれ黄色ミールワーム、ダークミールワーム、及びレッサーミールワームとして一般に知られている、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、及びＡｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓなどの異なるミールワーム種の幼虫も含む。これらの種は、鞘翅目、ゴミムシダマシ科に属する。コオロギと同様に、幼虫は、極端な条件下で成長し、大量飼育に好適であり、５０％～６５％の範囲の高タンパク質含有量を有する。

目的の遺伝子は、ウイルスまたは非ウイルス送達方法を介して宿主昆虫種に導入することができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、世界が現在直面しているＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するワクチンの開発に使用することができる。ワクチン開発のためのプロセスは、２つの主要ステップを経る。第１段階は、開発及び承認である。第２段階は、大規模産生である。これは、典型的な方法では、非常に困難で費用対効果が低い。本発明は、現在のインフラストラクチャを使用して、わずか４日間で数キログラムのワクチンを産生する可能性を有する。さらに、コストが低いため、ワクチンを世界中に配布することが可能になる。

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、シグナル伝達ペプチド、構造タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、融合タンパク質、インターロイキン、または人工的に設計されたタンパク質であり得る。

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、ＨＳＰ７０、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＴＲＥ、Ｕ６、ＵＡＳ、Ｔ７、Ｓｐ６、ｌａｃ、ａｒａＢａｄ、ｔｒｐ、またはＰｔａｃであり得る。

本発明の実施を容易にするために、例示的な手順を以下の非限定的な実施例に記載する。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１：昆虫の飼育］
Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ
ＢＳＦの飼育プロセスは、卵から始まる。卵は、高品質の食餌源で満たされた孵化容器で数日後に孵化する。孵化後、幼虫は、水分含有量７０％の食餌源で５日間食餌する。５日齢幼虫は、容器から採取され、前蛹に形質転換するまで約２週間、有機廃棄物で飼育される。その後、前蛹を採取し、暗いケージに約１０日間入れて、蛹化するようにする。蛹化後、ハエ成虫が、交尾が行われる交尾ケージに現れる。これらのケージは、光源、ハエに水分を与えるための湿った布、及び卵培地（ｅｇｇ）と呼ばれる産卵に好適な培地も備える。交尾すると、雌により、卵培地に卵が置かれ、飼育サイクルは完了する。

Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ
ミールワームの飼育は、卵から始まる。卵は、交尾後４日から１７日で産卵される。１匹の雌は、平均５００個の卵を産むことができる。胚発生は４～６日間続き、温度がわずかに上昇する（２５～２７℃）ことで加速し得る。幼虫期は、オートフレーク５０％、ビール酵母２．５％、小麦粉４７．５％の餌で、２８℃、相対湿度６０％、８Ｌ１６Ｄで飼育される。成熟幼虫の平均体重は、０．２ｇ、体長は、２５～３５ｍｍである。この段階後、幼虫は、蛹に変わる。この段階は、５～６日続き、成体個体になる。

［実施例２：特定の身体部分におけるｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステムによる体細胞形質転換］
Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ由来のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質をコードする遺伝子は、ブラックソルジャーフライ（ＢＳＦ）で発現している。体細胞遺伝子導入は、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステムの使用によって達成された。使用したＰｉｇｇｙｂａｃシステムは、ヘルパープラスミド及びドナープラスミドの２つのベクターで構成されていた。

ヘルパープラスミド（図１）を構築した。このプラスミドは、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｈｓｐ７０プロモーターの制御下にあるｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼ（ＰＢａｓｅ）を含む。

ドナープラスミド（図２）を構築した。このプラスミドは、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｈｓｐ７０プロモーターの制御下にあるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。

本明細書に記載のｃＤＮＡは、メッセンジャーＲＮＡからのＤＮＡコピーである。
体細胞発現のために、健康な５齢ＢＳＦ幼虫（幼虫の数は、５５であった）に、ヘルパー及びドナープラスミドで構成される混合ＤＮＡ溶液５００ｎＬを注入した。混合後の各プラスミドの濃度は、５００ｎｇ／μＬであった。注入直後に電気ショック（１５Ｖ）を加えた。使用量は、ヘルパー０．２５及びドナー０．２５であった。使用した固定方法は、２つのスライド間で機械的であった。その後、幼虫を３７℃の熱ショックで３０分間処理して、トランスポザーゼの発現を活性化した。

ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現は、蛍光顕微鏡でイメージングする前に、３７℃で３０分間熱ショック処理後、幼虫の組織内でｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ固有の蛍光を検出することによってモニターした。ＢＳＦ幼虫は、ＧＦＰ２フィルタセット（Ｌｅｉｃａ：エキサイターフィルタ４８０／４０ｎｍ，バリアフィルタ５１０ＬＰ）、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光と互換性のあるフィルタセットを使用して、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡でスクリーニングした（図３）。５５匹の幼虫の８６％が生存し、５５匹の幼虫の８０％が蛍光を発現した。

［実施例３：ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステムを介したＨｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ（ＢＳＦ）の生殖細胞系列形質転換］
Ａ．マイクロインジェクションによる
生殖細胞系列遺伝子導入は、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステムを使用して達成される。ＢＳＦ野生型株は、すべての実験で使用される。ハエは、標準的条件下で飼育されている。トランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドと一緒にドナープラスミドのＤＮＡ注入を行うことは、以前に記載のとおり、前胚盤葉胚を用いて行われる（ＬｏｕｋｅｒｉｓＴＧ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５；２７０（５２４４）：２００２－５），（ＲｕｂｉｎＧＭ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８２；２１８（４５７０）：３４８－５３）。

使用したＰｉｇｇｙｂａｃシステムは、ヘルパープラスミド及びドナープラスミドの２つのベクターで構成されていた。ドナープラスミドに関しては、２つのｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ構築物が使用される：１つの構築物は、誘導性プロモーター（ショウジョウバエＨｓｐ７０）を使用して、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現を駆動し、もう１つは、構成的プロモーター（ショウジョウバエアクチン５Ｃプロモーター）を使用する。ＢＳＦ幼虫及びＨｓｐ７０／ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ遺伝子は、通常の飼育温度（２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８℃）で、低レベルの蛍光を示し、熱ショック１０～２０分、２０～３０分、３０～４０分、４０～５０分、５０～６０分間さらした後、蛍光が増加した。使用される熱ショック温度は、２８～２９、２９～３０、３０～３１、３１～３２、３２～３３、３３～３４、３４～３５、３５～３６、３６～３７、３７～３８、３８～３９、３９～４０、４０～４１、４１～４２、４２～４３、４３～４４、４４～４５℃である。アクチン５Ｃ／ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ遺伝子を有するＢＳＦ幼虫は、構成的に高レベルのｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光を示す。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、ＢＳＦのすべての組織で発現する。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質は、免疫ブロットアッセイを使用して、トランスジェニック昆虫でも検出される。

典型的な遺伝子導入実験では、ドナープラスミドＤＮＡ及びヘルパープラスミドＤＮＡの混合物を胚盤葉前（産卵後０～２時間）のＢＳＦ胚に同時注入する。トランスジェニックＢＳＦを検出するには、注入された胚（世代Ｇ０）に由来するハエをレシピエント株に戻し交配して繁殖させ、その子孫を幼虫段階でｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現について個別に試験する。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現は、標準的な落射蛍光顕微鏡を使用して、１日で区切られた（ｈｓｐ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎプラスミドによって注入された）幼虫の１つ以上の連続した熱ショック処理後の幼虫の組織におけるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ固有の蛍光を検出することによってモニターされる。

Ｂ．エレクトロポレーションによる：
新鮮な非脱絨毛または脱絨毛卵を、５００μＬのエレクトロポレーション緩衝液を含む０．２ｃｍ電極ギャップキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に入れる。実験を行うために、様々な電圧（３５０Ｖ／ｃｍ～１７００Ｖ／ｃｍ）を使用した。脱絨毛処理された卵は、脆弱であり、乾燥しやすいものであった。いくつかの非脱絨毛卵は、３０秒間隔で２つのパルスでエレクトロポレーションした。成虫として出現して、エレクトロポレーションされた生存ＢＳＦハエは、独立したハエ系統の生成を開始するために、野生型昆虫と個別に交配させた。

新鮮な産卵ＢＳＦ卵には、ＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄのいずれかを含む２００ｎｇ／μＬドナーベクター及びエレクトロポレーション緩衝液中ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼの過剰活性バリアントをコードする３００ｎｇ／μＬヘルパープラスミドをエレクトロポレーションした。

ＢＳＦ幼虫は、ＧＦＰ２フィルタセット（Ｌｅｉｃａ：エキサイターフィルタ４８０／４０ｎｍ、バリアフィルタ５１０ＬＰ）またはＤｓＲｅｄフィルタセット（Ｌｅｉｃａ：エキサイターフィルタ５４５／３０ｎｍ、バリアフィルタ６２０／６０ｎｍ）のいずれかを使用して、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡でスクリーニングする。幼虫及び成虫の両方をスクリーニングに使用した。

ＤｓＲｅｄを発現する凍結幼虫全体をＦｉｔｚｍｉｌｌ細分装置で、ブレード側を前方にして、ふるいスクリーンを取り除いて細断する。幼虫は、３つの異なる速度：３０００ｒｐｍ、６０００ｒｐｍ、及び９０００ｒｐｍで細断する。細分された幼虫のバイオマスは、転倒混合を使用して抽出緩衝液と混合させた。サンプルは、分析のための抽出の過程で取り除かれ、大まかな抽出率を決定し、幼虫全体に対する全体的な抽出レベルを決定する。ＤｓＲｅｄは、半定性ＳＤＳ－ＰＡＧＥＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲルまたはＤｓＲｅｄ特異的ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットのいずれかを使用して検出する。バンドの濃度測定は、Ｋｏｄａｋ１ｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍを使用して実施される。

［実施例４：ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステムを介したＴ．ｍｏｌｉｔｏｒの生殖細胞系列形質転換］
Ｔ．ｍｏｌｉｔｏｒ胚は、一晩産卵（２４時間までの年齢）から収集し、２．５％漂白剤で洗浄し、マイクロインジェクション用のガラスカバースライドの端に置く。ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを一定の比率４００ｕｇ／ｍｌ：１００ｕｇ／ｍｌで注入する。注入後、胚を加湿チャンバ内で培養し、蛹をＴ．ｍｏｌｉｔｏ食を含む２８℃及び６０％ＲＨの両方のペトリ皿に入れる。卵から出現した幼虫をＴ．ｍｏｌｉｔｏ食に置き、導入遺伝子発現についてスクリーニングする。蛹を脱蛹させ、成体を導入遺伝子発現についてスクリーニングした。

［実施例５：導入遺伝子のバキュロウイルス媒介送達及び発現：］
１．バキュロウイルス発現ベクター：
目的のタンパク質をコードする外因性遺伝子が集合すると、バキュロウイルストランスファーベクターにパッケージ化される。トランスファーベクターは、目的の遺伝子をウイルスＤＮＡの所望の部位に組み込むために必要なウイルスゲノムの領域を含むプラスミドベースのベクターである。トランスファーベクターの構築後、組換えバキュロウイルスの産生及び増幅のために、培養昆虫細胞株にウイルスゲノムと共に同時トランスフェクトされる。次に、組換えバキュロウイルスを培養細胞から単離して、精製し、必要な力価で宿主昆虫種に送達する。

２．組換えバキュロウイルスの送達：
ａ．幼虫への組換えバキュロウイルスの注入：
目的の遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは、昆虫の幼虫中で遺伝子発現を駆動できる強力なプロモーターの影響下で構築される。バキュロウイルスの出芽ウイルス形態またはバクミド形態を、それらの第５齢発育段階にあるＢＳＦ幼虫の血体腔内に注入する。注入前に、幼虫を氷中に入れ、動きを制限し、注入を容易にする。力価約１ｘ１０^７ｐｆｕ／ｍｌを有する組換えバキュロウイルス５～５０μｌを、マイクロニードルを使用した注入に使用する。

「バクミド」は、細胞にトランスフェクトさせたときにバキュロウイルスを生成するのに十分な核酸配列を含むプラスミド構築物を指す。

ｂ．エアロゾル感染による組換えバキュロウイルスによる昆虫の幼虫の感染：
包埋形態（ＯＤＶ）の組換えバキュロウイルスは、エアロゾル感染によって、５齢発育段階で昆虫の幼虫に導入される。エアロゾルスプレーには、濃度１ｘ１０^７ｐｆｕ／ｍｌの組換えバキュロウイルス溶液２ｍｌを含めた。

ｃ．経口接種による組換えバキュロウイルスでの昆虫の幼虫の感染：
５齢の幼虫を２４時間飢餓状態にし、その後、包埋形態（ＯＤＶ）の組換えバキュロウイルスを混合した餌を与える。

３．導入遺伝子発現の分析：
上記の経路のいずれかによる蛍光タンパク質（ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ）を含む組換えバキュロウイルスの感染後、幼虫は、特別な餌で飼育し、湿度７０％、２３～２５℃の加湿チャンバに保管され、１６：８光周期（Ｌ：Ｄ）サイクルに晒す。発現は、蛍光顕微鏡により視覚によって監視する。それらが接種され、４日間インキュベート後、その後の分析のために幼虫の体液を集めた。体液に含まれるタンパク質は、ＳＤＳＰＡＧＥ電気泳動によって分析する（ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ８．４０－Ａ８．５５）。ＰＶＤＦ膜を用いたウェスタンブロットイムノアッセイをさらに行う。

［実施例６：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介の安定した組込み］
この実施例では、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のゲノム組み込は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を介して達成する。前述のとおり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、ｇＲＮＡ及びＰＡＭ配列認識によって媒介される正確で安定したゲノム組み込のための魅力的な代替方法を提供する。ゲノム挿入にＣＲＩＳＰＲを使用する１つの方法は、（ＨｏｖｅｍａｎｎＢＴ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ．１９９８Ｏｃｔ９；２２１（１）：１－９），（ＢａｓｓｅｔｔＡ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４Ｓｅｐ；６９（２）：１２８－３６）に記載の標的及びヘルパープラスミドを使用することである。

ＣＲＩＳＰＲ標的配列は、３ステッププロセスで同定される。第１のステップは、ＢＳＦ参照ゲノムに基づいてオフターゲットデータベースを作成することである。このデータベースは、Ｃａｓ１２ａ酵素であるＴＴＴＮのＰＡＭ配列を検索する全ゲノムをループすることによって作成される。第２のステップは、目的の領域内で可能なＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ標的配列を発見することである。アクチン５ｃ遺伝子（ＮＣＢＩＩＤ：ＬＯＣ１１９６４６４６７）及び遺伝子の上流の２ｋ塩基領域の両方を発見するために検索する。アクチン５ｃを選択した理由は、ＢＳＦの様々な生活環を通じて、一貫して、高度に発現する遺伝子の最上位１％のうちの１つであるためである。さらに、この遺伝子は、非常にアクセスしやすいＤＮＡ領域に囲まれており、これは、ＣＲＩＳＰＲ組込みを成功させる決定的な特徴である。遺伝子領域での発見により、２２の可能なＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ標的配列が得られ、上流領域での発見により、１６６の可能な標的配列が得られた。

標的配列の第３段階では、適切なパフォーマンスマトリックスに従って、発見された可能なＣａｓ１２ａ標的をランク付けする。利用される主要パフォーマンスマトリックスは、ステップ１で作成したオフターゲットデータセットとの一致を最小限に抑えることである。同点の標的配列間が存在する場合は、最小自由エネルギーのフォールディングを有し、ＧＣ含有量がより多い配列が選択される。アクチン５ｃ遺伝子内で発見された２２のＣａｓ１２ａ標的配列のうちの３つが、ＢＳＦオフターゲットデータベースでは、一致がゼロである。選択された最良のガイドＲＮＡ、ＴＴＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＣは、ＧＣ含有量５９％及び自由エネルギー－３．６を有する。上流領域で発見された１６６の標的配列に関して、選択された最良の配列、ＴＴＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＧＣＴＡＧＧＧＴは、ＧＣ含有量５８％及び自由エネルギー－３．２を有する。

Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａから単離された強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）は、２つのアプローチによってＢＳＦ中で発現される。第１のアプローチは、ノックインされた遺伝子は、アクチン５ｃの転写機構に依存するため、プロモーターを用いずに、ドナー鋳型がＧＯＩをコードするアクチン５ｃ遺伝子内へ組み込むことである。この場合、遺伝子は、１ｋの相同性アームに囲まれる。第２のアプローチは、適切なプロモーター、ＧＯＩのほかにショウジョウバエのアクチン５ｃを有するドナー鋳型を必要とする遺伝子の上流領域へ組み込むことである。ドナー鋳型の長いインサートには、インサートを囲むために１．５ｋの長い相同アームが必要である。

ヘルパープラスミドには、Ｕ６プロモーター下の部位及び構成的に活性なプロモーターであるポリユビキチン下のＣａｓ１２ａを標的とするｇＲＮＡ配列が含まれている。アクチン５Ｃ／ＥＧＦＰを含むＢＳＦ幼虫は、構成的に、高レベルのＥＧＦＰ蛍光を示す。ＥＧＦＰは、ＢＳＦのすべての組織ではないにしても、ほとんどの組織で発現する。ＥＧＦＰタンパク質は、トランスポゾンベースの上記の技術によって操作された昆虫において説明されているアッセイを使用して、トランスジェニック昆虫でも検出される。標的部位へのＥＧＦＰゲノムの組込みは、ＰＣＲ及び配列決定によって確認した。本明細書に記載の「プライマー」という用語は、ＤＮＡ複製の開始点として機能する核酸鎖を指す。

［実施例７：タンパク質回収を容易にするための細分］
幼虫の細分は、幼虫を顆粒状混合物に形成することによって、幼虫の流動性を高めるため、幼虫の表面積を増加させるため、目的のタンパク質の拡散に必要な距離を減少させるため、幼虫から回収されるタンパク質の収量を増加させるため及び／または他の利点を提供するために行われる。典型的には、幼虫は、約１ｍｍ～約１ｃｍの寸法を有する小片に分割される。このプロセスでは、幼虫全体から約５０ミクロンの小片まで、あらゆる小片を利用し得る。約０．５ｍｍ～約２．５ｍｍの大まかな直径を有する顆粒で好ましい結果を得ることができる。別の実施形態は、幼虫を圧縮して、典型的には約０．１ｍｍ～約５ｍｍ、より典型的には約０．５ｍｍ～約２ｍｍの寸法を有するフレークにすることを含む。１つの特定の実施形態によれば、幼虫は、約２ｍｍ程度の顆粒に細断される。

１．粉砕による細分：
第１の技術は、フライス盤で昆虫の幼虫を細分することを含む。使用され得る特定のフライス盤は、Ｆｉｔｚｍｉｌｌミルフライス盤である。第１の技術によれば、機械は、ブレードが前方に面するように操作され得、これにより、顆粒形態の凍結幼虫となる。粉砕機は、幼虫を様々な程度まで切断するために、様々な速度で操作することができる。例えば、粉砕機は、約３０００～約９０００ｒｐｍで操作できる。特定の実施形態は、約３０００、約６０００、または約９０００ｒｐｍを利用している。細分は、低温で実施され得る。例えば、細分は、約－１００℃～約３０℃の温度範囲で実施され得る。１つの特定の実施形態は、約４℃で実施した。

２．コニカルミルによる細分：
第２の技術は、コニカルミルによる細分である。使用され得る特定のフライス盤は、ＱｕａｄｒｏＣｏｍｉｌである。粉砕機は、幼虫を様々な程度に切断するために、様々な速度及び様々な構成で操作することができる。

３．衝撃による細分：
第３の技術は、衝突による細分を伴う。この方法では、極寒条件下で、ブレードの平らな面、ハンマーまたは木槌で幼虫を叩く。

４．ふるい分けまたはスクリーニングによる細分：
第４の技術は、「ふるい分け」デバイスまたはスクリーンを通して材料をサイズ決めするように調整することを含む。ストライカーのブレードまたはフラットのいずれかを幼虫に対して配向させ得る。サイズ縮小は、スクリーンまたはふるいの上で幼虫を破片にするか引きずることにより制御し得る。

幼虫がバキュロウイルスに感染している場合、処理された幼虫のバイオマスは、ガンマ線照射への曝露によってさらに処理される。この照射の目的は、バキュロウイルスを不活性化し、粉末を滅菌させることでもある。バキュロウイルスが活性でないことを証明するために、昆虫の幼虫でバイオアッセイを行うことにより、各ロットを検査して、感染の有無を調べる。

次に、幼虫の断片、幼虫全体、昆虫全体、及び／または昆虫小片を抽出緩衝液と混合させ得る。抽出緩衝液は、標的タンパク質（複数可）が可溶性である任意の成分を含み得る。一実施形態によれば、緩衝液は、ｐＨ４～８の５０ｍＭＴｒｉｓから０～３００ｎＭＮａＣｌ、及び０～５ｍＭベータ－メルカプトエタノールを含む。

緩衝液は、様々な比率で昆虫または細分された昆虫部分のいずれかと混合させ得る。比率は、実施される実行数に依存し得る。例えば、複数の実行が実施される場合、比率は、より多くの昆虫に偏る可能性がある。利用され得る比率の例は、昆虫対緩衝液１：３である。

昆虫／昆虫片と緩衝液が組み合わされている場合、それらが混合され得る。混合は、複数の異なる装置を用いて様々な方法で実施され得る。例えば、一緒に混合することは、回転混合またはオーバーヘッドライトニングミキサーを用いて実施され得る。

昆虫片を混合後、目的のタンパク質（複数可）を幼虫または幼虫片から抽出し、目的のタンパク質（複数可）を含む緩衝液から小片を分離する。抽出及び清澄化は、別々に、または一緒に行うことができる。抽出及び分離は、複数の異なる方法で実施され得る。例えば、デカンテーション、ふるい分け、スクリーニング、低速遠心分離、向流抽出、デカンター遠心分離、中空管または大口径中空繊維またはプレート及びフレーム接線流濾過、及び／またはパーコレーション抽出が利用可能である。複数の抽出及び／または分離ステップを実施してもよい。また、抽出及び分離において、１つ以上の異なるプロセスが利用され得る。利用される抽出及び分離技術（複数可）は両方とも、他の要因の中でも、関係するタンパク質（複数可）及び昆虫片のサイズに少なくとも一部依存し得る。抽出には、約１５分～約４５分要し得る。目的のタンパク質または物質の抽出時間範囲は、目的のタンパク質または物質、及び抽出プロセスで使用される緩衝液に大きく依存し、１５秒から最大４時間の範囲であり得る。

制御され得る他の抽出パラメーターとしては、温度、遠心分離速度、可能性のある接線流濾過ステップの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）範囲が挙げられる。典型的には、抽出は、約４℃～約４５℃の温度範囲で実施される。２つの特定の実施形態によれば、抽出は、約４℃または約２０℃の温度で実施され得る。抽出のための遠心分離は、約２，０００ｘｇ～約１５，０００ｘｇの速度で実施され得る。抽出のための可能性のある接線流濾過ステップの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）範囲は、約１００ｋＤａＮＭＷＣＯ～約０．２２ミクロンであり得る。

清澄化は、約４℃～約４５℃の温度範囲で実施され得る。特定の一実施形態によれば、清澄化は、約４℃の温度で実施した。清澄化のために実施され得る遠心分離は、約２，０００ｘｇ～１５，０００ｘｇの速度で実施され得る。さらに、清澄化は、約０．０１ｍｍ～約１ｍｍのスクリーンサイズで実施され得る。１つの特定の実施形態は、約０．５ｍｍのスクリーンサイズで実施した。清澄化のための可能性のある接線流濾過ステップの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）は、約１００ｋＤａＮＭＷＣＯ～約０．２２ミクロンの範囲であり得る。

本発明は、関与する生物から任意のタンパク質産物または他の所望の材料または成分を単離するために利用され得る。例えば、昆虫の幼虫によって発現する、または発現する可能性のある任意のタンパク質は、天然であっても組換えであっても、単離させ得る。

［実施例８：組換えタンパク質の精製］
タンパク質含有緩衝液を他の昆虫部分から分離後、タンパク質（複数可）は、緩衝液から単離させる。これは、タンパク質を単離するための既知の方法を利用して実施される。例えば、接線流濾過、液液抽出、カラムクロマトグラフィ、沈殿、膜結合、及び／または任意の他の既知のプロセスの任意の組み合わせによって単離される。

分離プロセス（複数可）は、タンパク質の所望の純度が達成されるまで実施される。典型的には、タンパク質は、純度が少なくとも約８５％に達するまで処理される。より典型的には、タンパク質は、少なくとも約９０％純粋である。場合によっては、タンパク質は、少なくとも約９５％純粋である。タンパク質は、タンパク質が、その最終用途にとっての有効性を有するように典型的に必要である程度の純度を有するまで処理される。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質の精製
この例では、ブラックソルジャーフライＨｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓの幼虫における全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質の最適化された精製プロセスについて記載する。９５％を超える純度に到達するには、３つのクロマトグラフィステップ（２つのイオン交換ステップ及び１つの中間疎水性相互作用クロマトグラフィステップ）が必要である。

簡潔に言えば、採取された幼虫を収集し、組換えタンパク質、総タンパク質、及びプロテアーゼアッセイが準備されるまで－６０°Ｃで凍結する。凍結幼虫を解凍し、ｐＨ４～８の５０ｍＭＴｒｉｓ、０～３００ｍＭＮａＣｌ、及び０～５ｍＭミクロンフィルタ中でホモジナイズする。

スパイクタンパク質は、非イオン性界面活性剤で細胞膜から抽出され、不溶性物質は１０，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって除去させる。Ｓタンパク質オリゴマーは、陰イオン交換、アフィニティーキャプチャー及びサイズ排除クロマトグラフィなどのプロセスを使用して精製する。精製プロセス中、界面活性剤濃度が低下し、これにより、Ｓ三量体がより高次のタンパク質間ミセルナノ粒子を形成できるようになる。精製Ｓナノ粒子は、０．２マイクロメートルのフィルタを通過させ、－８０℃で保存させる。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳｐｉｋｅタンパク質サンプルは、４～１２％勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、ＧｅｌＣｏｄｅＢｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で染色し、ＯｎｅＤｓｃａｎシステム（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、走査デンシトメトリーにより定量化する。精製スパイクタンパク質の総タンパク質濃度は、（ＢＣＡビシンコニン酸タンパク質アッセイ、ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して決定し、Ｓ－タンパク質の粒子サイズ及びサンプルの均質性は、標準的な製造業者が推奨する方法β－メルカプトエタノールを用いて、ＺＥＴＡＳｉｚｅｒＮａｎｏ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ）を使用した動的光散乱によって調べる。ホモジネートを２５，０００ｘｇで４℃で３０分間遠心分離して、大きなデブリを除去する。遠心分離後、上清も０．２２を使用してさらに清澄化させる。

組換えタンパク質の収量
組換えタンパク質の収量は、幼虫あたり２ｍｇ以上である。好ましくは、組換えタンパク質の収量は、幼虫あたり３０ｍｇ～３５ｍｇである。幼虫の重量は、約０．３ｇｍで、乾燥重量４０％である。乾燥質量の４５％は、タンパク質であり、組換えタンパク質は、総タンパク質収量の１０～５０％に達し得る。昆虫由来内因性プロモーターを使用し、コドン最適化することにより、収量は、６０％以上まで増加する（ブラックソルジャーフライの場合、約３５ｍｇ／幼虫）。

［実施例９：血リンパからの組換えタンパク質の回収］
昆虫を出血させることによって容易に行うことができる昆虫から血リンパを回収することによって、タンパク質が収容されている懸濁液を回収する。出血後、血リンパは、酸化反応を受け、濃く粘り気のある色になる。酸化反応は、サンプルを冷蔵保存し、グルタチオンなどの抗酸化剤を添加することによって減速する。血球は、遠心分離によって血リンパからペレット化される。得られた上清をアッセイするか、または後に使用するために凍結保存する。高速液体クロマトグラフィ、アフィニティー結合カラム、及び当業者に既知の他の同様の技術など、好適なタンパク質精製システムを利用して、目的のタンパク質を上清から容易にさらに単離する。

［実施例１０：昆虫の幼虫におけるＶＬＰの産生］
ａ．ＦＭＤＶ型ＶＬＰＯ／ＩＮＤ／Ｒ２／７５
ＦＭＤＶ型ＶＬＰＯ／ＩＮＤ／Ｒ２／７５は、ブラックソルジャーフライの昆虫の幼虫から産生される。このようなＶＬＰをコードする組換えＢＥＶは、Ｋｕｍｅｒｅｔａｌ，２０１６に記載の方法に従って、ＢＳＦ昆虫の幼虫に感染させる（Ｋｕｍａｒ，Ｍ．，ｅｔａｌ，２０１６．Ｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ，２７（１），８４－９０）。簡潔に言えば、組換えバキュロウイルス５０μＬは、各幼虫の血体腔に注入する。幼虫は、行動の変化、摂餌習慣、及びバキュロウイルス感染による死亡率について毎日観察する。全幼虫抽出物の調製及び血リンパの収集は、感染後（ｄｐｉ）１～８日の指定された時間間隔で実施する。

１、２、３、４、５、６、７及び８ｄｐｉで、ＢＳＦから収集された血リンパ（２．５ｍＬ）は、５ｍＬポリアロマーチューブで、１２００００ｘｇ、４℃で１６時間超遠心分離することによって、２０～６０％スクロース勾配（２０％、３０％、４０％、５０％、及び６０％スクロース、各０．５ｍＬ）により精製する。超遠心分離後、それぞれ０．５ｍＬの画分を下から上に集め、Ｓ－ＥＬＩＳＡでテストする。Ｓ－ＥＬＩＳＡは、血リンパ及び全幼虫抽出物に対して行う。簡潔に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを５０マイクロリットル（μＬ）のウサギで産生されたＦＭＤＶ抗１４６Ｓ血清、１０００倍希釈の炭酸塩－重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートする。すべての試薬を、各ウェルに５０μＬの量で添加した。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄する。サンプルは、陽性（ウイルス抗原）及び陰性（Ｓｆ９細胞抗原）対照用にそれぞれ４つのウェルを使用して、２つに添加する。プレートは、前述のようにインキュベートし、洗浄する。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ＋５％成人ドナーのウシ血清）で４０００倍希釈した抗１４６Ｓモルモット追跡抗体を各ウェルに加える。３７℃で１時間インキュベート後、プレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液で３０００倍希釈したウマ西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗モルモットＩｇＧを加えて、インキュベートする。洗浄後、新鮮なオルトフェニレンジアミン／過酸化水素基質を添加し、発色のために３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、１ＭＨ２ＳＯ４を使用して反応を停止する。プレートの吸光度は、参照波長６２０ｎｍを使用して、ＥＬＩＳＡリーダーにより、４９２ｎｍで読み取る。正負のカットオフ値は、４つの中間ブランクウェルの平均±標準偏差の２倍として計算した。

感染ＢＳＦ幼虫から収集された血リンパのピーク画分の組換えタンパク質含有量の観点からのＶＬＰの量は、分光測光法によって決定される。精製ＶＬＰは、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの分光測光読み取りによって定量化する。

ｂ．ＨＩＶＧａｇ１ＶＬＰ：
ヒトのコドン最適化、ミリストイル化ＨＩＶ－１サブタイプＣｇａｇ遺伝子は、様々な調節エレメントに結合させ、ｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドにクローニングさせた。このプラスミドは、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼ酵素をコードするヘルパープラスミドにより、ＢＳＦの前胚盤葉卵に同時形質転換させた。

次いで、Ｌｙｎｃｈら、２０１０年に記載のとおり、トランスジェニックＢＳＦ幼虫または蛹（Ｇ１）からＶＬＰを精製した（ＬｙｎｃｈＡＧ，ｅｔａｌ，２０１０，ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：３０）。

参照による援用
本明細書で述べられるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本出願が、本明細書における任意の定義を含めて優先する。

均等物
当業者らは、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または単なる通常の実験のみを使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims

少なくとも１つの外因性遺伝子を含む形質転換昆虫であって、Ｈｅｒｍｅｔｉａ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓ、Ａｃｈｅｔａ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ、及びＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓからなる群から選択される属の昆虫である、前記昆虫。
前記外因性遺伝子が、前記昆虫の体細胞内に含まれる、請求項１に記載の形質転換昆虫。
前記外因性遺伝子が、前記昆虫の前記生殖細胞系列内に含まれる、請求項１に記載の形質転換昆虫。
前記外因性遺伝子が安定して遺伝する、請求項３に記載の形質転換昆虫。
前記昆虫が、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、またはＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓからなる群から選択される種の属である、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
前記昆虫が、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓである、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
前記昆虫が、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ及びＡｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの群から選択されるミールワームである、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
前記昆虫が、胚、幼虫、蛹または成虫である、請求項１～７のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
前記昆虫が、前記少なくとも１つの外因性遺伝子によってコードされる組換えタンパク質を発現する、請求項１～８のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
前記昆虫が、少なくとも２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの前記組換えタンパク質を発現する、請求項９に記載の形質転換昆虫。
前記昆虫が、少なくとも３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇの前記組換えタンパク質を発現する、請求項９に記載の形質転換昆虫。
前記組換えタンパク質が、前記昆虫によって発現される総タンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％である、請求項９に記載の形質転換昆虫。
前記組換えタンパク質が、抗体、抗原、抗原結合分子、酵素、ホルモン、ワクチンの成分、及びウイルス様粒子からなる群から選択される、請求項９～１２のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
前記少なくとも１つの外因性遺伝子が、トランスポゾン媒介組込みによって昆虫ゲノムに組み込まれる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
前記少なくとも１つの外因性遺伝子が、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｈｓｐ７０プロモーターの制御下にある、請求項１～１４のいずれか１項に記載の形質転換昆虫。
飼育昆虫が、前記少なくとも１つの外因性遺伝子を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換昆虫由来の飼育昆虫。
前記少なくとも１つの外因性遺伝子によってコードされる組換えタンパク質を発現する、請求項１６に記載の飼育昆虫。
前記形質転換昆虫から１、２、３、４または５世代除去される、請求項１６または請求項１７に記載の飼育昆虫。
前記形質転換昆虫から５世代を超えて除去される、請求項１６または請求項１７に記載の飼育昆虫。
請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換昆虫または請求項１６～１９のいずれか１項に記載の飼育昆虫に由来する蛹。
請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換昆虫または請求項１６～１９のいずれか１項に記載の飼育昆虫に由来する幼虫。
請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換昆虫または請求項１６～１９のいずれか１項に記載の飼育昆虫に由来する卵。
請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換昆虫または請求項１６～１９のいずれか１項に記載の飼育昆虫に由来する成体昆虫。
請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換昆虫または請求項１６～１９のいずれか１項に記載の飼育昆虫から産生されるバイオマス。
請求項１～１５のいずれか１項に記載の形質転換昆虫または請求項１６～１９のいずれか１項に記載の飼育昆虫から単離される組換えタンパク質。
前記タンパク質が、抗体、抗原、抗原結合分子、酵素、ホルモン、ワクチンの成分、及びウイルス様粒子からなる群から選択される、請求項２５に記載の組換えタンパク質。
タンパク質を産生するための方法であって、前記方法が、
ａ．Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、またはＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓからなる群から選択される昆虫の第１段階を形質転換することであって、前記形質転換が、前記昆虫のゲノムへの発現カセットの組込みをもたらし、前記発現カセットは、異種タンパク質をコードする遺伝子を含み、異種遺伝子が、熱ショックプロモーターの制御下にある、前記形質転換することと；
ｂ．第２段階で前記形質転換昆虫に熱ショックを与えることと；
ｃ．前記形質転換昆虫から前記タンパク質を含むバイオマスを採取することと、を含む、前記方法。
前記第１段階が、卵または胚である、請求項２７に記載の方法。
前記第２段階が、幼虫、蛹または成虫である、請求項２７に記載の方法。
タンパク質を産生するための方法であって、前記方法が、
ａ．Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓ、Ｇｒｙｌｌｏｄｅｓｓｉｇｉｌｌａｔｕｓ、Ｇｒｙｌｌｕｓａｓｓｉｍｉｌｉｓ、Ａｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ、またはＡｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｄｉａｐｅｒｉｎｕｓからなる群から選択される昆虫を形質転換することであって、前記形質転換が、前記昆虫の生殖細胞系列への発現カセットの組込みをもたらし、前記発現カセットが、異種タンパク質をコードする遺伝子を含む、前記形質転換することと；
ｂ．前記形質転換昆虫を繁殖させて次世代の昆虫を産生することと；
ｃ．前記次世代の昆虫から前記タンパク質を含むバイオマスを採取することと、を含む、前記方法。
前記バイオマスを採取するステップの前に、前記次世代の昆虫を大量飼育するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
前記形質転換ステップが、前記昆虫の卵または胚の段階で行われる、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
前記バイオマスが、幼虫、蛹、または成虫の段階から採取される、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
異種遺伝子が熱ショックプロモーターの制御下にあり、前記バイオマスを採取する前に前記次世代の昆虫に熱ショックを与えることをさらに含む、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。
前記熱ショックプロモーターが、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｈｓｐ７０プロモーターである、請求項２７または請求項３４に記載の方法。
前記昆虫が、少なくとも２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの前記異種タンパク質を発現する、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記昆虫が、少なくとも３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇの前記異種タンパク質を発現する、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記異種タンパク質が、前記昆虫によって発現される総タンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％である、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記バイオマスから前記異種タンパク質を単離することをさらに含む、請求項２７～３８のいずれか１項に記載の方法。
前記バイオマスから前記異種タンパク質を濃縮または部分的に精製することをさらに含む、請求項２７～３８のいずれか１項に記載の方法。
前記形質転換ステップが、前記発現カセットのトランスポゾン媒介組込みを含む、請求項２７～４０のいずれか１項に記載の方法。
前記形質転換ステップが、前記昆虫において活性であるトランスポザーゼ酵素を提供することをさらに含み、前記発現カセットは、転移エレメントによって各末端に隣接している、請求項４１に記載の方法。
前記トランスポザーゼ酵素が、ヘルパープラスミド上のコード領域として、または核酸によってコードされるコード領域として、またはトランスポザーゼタンパク質として提供される、請求項４２に記載の方法。
前記昆虫が、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓである、請求項２７～４３のいずれか１項に記載の方法。
前記昆虫が、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂｓｃｕｒｕｓ及びＡｃｈｅｔａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの群から選択されるミールワームである、請求項２７～４３のいずれか１項に記載の方法。
前記形質転換ステップが、前記発現カセットの物理的または化学的送達を含む、請求項２７～４５のいずれか１項に記載の方法。
前記形質転換ステップが、注入、ＤＮＡ粒子ボンバードメント（ＤＮＡｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション、注入後のエレクトロポレーション、流体力学、超音波、またはマグネトフェクションを含む、請求項２７～４５のいずれか１項に記載の方法。
前記異種タンパク質が、抗体、抗原、抗原結合分子、酵素、ホルモン、ワクチンの成分、及びウイルス様粒子からなる群から選択される、請求項２７～４７のいずれか１項に記載の方法。
請求項２７～４７のいずれか１項に記載の方法によってバイオ製造される異種タンパク質。
発現ベクターが、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を発現する、請求項２７～４７のいずれか１項に記載の方法。
請求項５０に記載の方法によってバイオ製造されるＶＬＰ。
請求項２７～４９のいずれか１項に記載の方法によってバイオ製造されるワクチン成分。
形質転換幼虫の全身から前記異種タンパク質を単離することをさらに含む、請求項２７～４９のいずれか１項に記載の方法。
形質転換幼虫の血リンパ、脂肪体、または分泌腺から前記異種タンパク質を単離することをさらに含む、請求項２７～４９のいずれか１項に記載の方法。
請求項５３または請求項５４に記載の方法によって産生される、単離異種タンパク質。
形質転換昆虫を産生するための方法であって、前記方法が、前記昆虫において活性であるトランスポザーゼ酵素、及び発現カセットを提供することによって、Ｈｅｒｍｅｔｉａｉｌｌｕｃｅｎｓの昆虫の卵または胚を形質転換することを含み、前記発現カセットが異種タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記発現カセットは、転移エレメントによって各末端に隣接し、それによって、前記形質転換が、前記昆虫のゲノムへの前記発現カセットの組込みをもたらす、前記方法。
前記トランスポザーゼ酵素が、ヘルパープラスミド上のコード領域として、または核酸によってコードされるコード領域として、またはトランスポザーゼタンパク質として提供される、請求項５６に記載の方法。
前記発現カセットが、前記昆虫の体細胞内に含まれる、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
前記発現カセットが、前記昆虫の前記生殖細胞系列内に含まれる、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
前記昆虫が、少なくとも２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの前記異種タンパク質を発現する、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
前記昆虫が、少なくとも３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇの前記異種タンパク質を発現する、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
前記異種タンパク質が、前記昆虫によって発現される総タンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％である、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
前記昆虫から前記異種タンパク質を採取することをさらに含む、請求項５６～６２のいずれか１項に記載の方法。
ａ．前記形質転換昆虫を繁殖させて次世代の昆虫を産生することと；
ｂ．前記次世代の昆虫から前記異種タンパク質を含むバイオマスを採取することと、を含む、請求項５６～６３のいずれか１項に記載の方法。
請求項５６～６４のいずれか１項に記載の方法によって産生される形質転換昆虫。
請求項５６～６４のいずれか１項に記載の方法によって産生される形質転換蛹。
請求項５６～６４のいずれか１項に記載の方法によって産生される形質転換胚。
請求項５６～６４のいずれか１項に記載の方法によって産生される形質転換幼虫。
前記方法が、前記バイオマスを採取するステップの前に、前記形質転換昆虫を大量飼育するステップをさらに含む、請求項６４に記載の方法によって産生される形質転換昆虫の集団。