TW201408695A - 重組載體及應用其而產生之轉基因魚卵與生物材料 - Google Patents

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Abstract

一種重組載體及應用其而產生之轉基因魚卵與生物材料，可提供能於特定部位分泌重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的轉基因魚，以利用具有分泌出之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的魚體的特定部位作為生物材料或純化出其中之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白。

Description

重組載體及應用其而產生之轉基因魚卵與生物材料
本發明為一種生醫材料的製備技術，特別是一種重組載體及應用其而產生之轉基因魚卵與生物材料。
由於膠原蛋白是生醫材料的重要建材，主要包括使組織生長、整型、燒燙傷敷料、傷口癒合等功能，並且市場規模不斷地擴大，因此，開發更具有醫療價值及更多樣性的膠原蛋白及其衍生物，以應用於各種用途，即是現今研發者所欲解決的課題。
目前生產重組膠原蛋白之表現系統包括大腸桿菌(Escherichia coli；E.coli)、酵母菌、哺乳動物細胞株、昆蟲細胞株、基因轉殖動物以及基因轉殖植物。然而，大腸桿菌表現系統沒有轉譯後修飾。酵母菌表現系統缺乏脯胺酸4-羥化酶活性，但甲醇酵母中的膠原蛋白產量卻又是這些表現系統中最高的。哺乳動物細胞株之表現系統產量低且受限於特定細胞類型。昆蟲細胞之表現系統中脯胺酸4-羥化酶活性又低。而基因轉殖動物(如，蠶或小鼠)以及基因轉殖植物(如，菸草)，其膠原蛋白產物則會過度 交聯。
目前已建立有含有編碼人類脯胺酸4-羥化酶 以及膠原蛋白之基因的桿狀病毒表現系統(參照美國專利第5,077,214號以及第5,593,859號)。然而，經轉染的昆蟲細胞在72小時內會死亡，造成僅有暫時性的重組膠原蛋白生產。此外，由於胞溶作用，因此將很難回收或純化重組膠原蛋白。而且，桿狀病毒對於內質網或高基氏體的破壞更限制了膠原蛋白的生產。
在一實施例中，一種生物材料包括：由一魚體 生產並獲得之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白(procollagen or collagen)。
在一些實施例中，此生物材料更包括魚體之至 少一魚鱗，並且各魚鱗表現具有重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白。
在一些實施例中，重組人類原膠原蛋白或膠原 蛋白是由轉殖入魚體之一人類膠原蛋白基因表現。
在另一實施例中，一種轉基因魚卵包括一魚類 染色體以及一重組載體。重組載體嵌入魚類染色體中，並且此重組載體包括一人類膠原蛋白基因。
在又一實施例中，一種重組載體包括一上游基 因以及一人類膠原蛋白基因。上游基因是由一魚體獲得之，而人類膠原蛋白基因是連接在上游基因的下游。其中，上游基因可為在一魚體中存在的一啟動子、一增強子或其 組合。
在一些實施例中，重組載體更包括一報導基 因，並且此報導基因是連接在人類膠原蛋白基因的下游。
綜上，根據本發明之重組載體及應用其而產生 之轉基因魚卵與生物材料可提供能於特定部位分泌重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的轉基因魚，以利用具有分泌出之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的魚體的特定部位作為生物材料或純化出其中之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白。
S10‧‧‧構築具有一人類膠原蛋白基因之一重組載體
S20‧‧‧利用限制酶將構築好的重組載體變成線性
S30‧‧‧將線性之重組載體引入魚類之胚胎中以嵌入至胚胎中之魚類染色體中
S110‧‧‧選殖魚類的啟動子(或/和增強子)
S120‧‧‧選殖人類膠原蛋白基因
S130‧‧‧利用選殖之啟動子(或/和增強子)與第一表現載體構築上游基因
S140‧‧‧利用選殖之人類膠原蛋白基因以及上游基因構築重組載體
S111‧‧‧設計對應啟動子(或增強子)的胺基酸序列之前置引子與反置引子
S112‧‧‧利用一魚體進行DNA抽取以得到全量DNA
S113‧‧‧利用所取得之全量DNA作為模板以及對應之前置引子及反置引子作為引子進行聚合酶鏈反應以得到第一產物
S114‧‧‧將得到之第一產物與第一載體接合以產生第二載體
S115‧‧‧將第二載體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有啟動子(或增強子)之菌株
S116‧‧‧由含有啟動子(或增強子)之菌株中純化出所需之啟動子(或增強子)並利用瓊脂醣膠電泳確認 之
S121‧‧‧設計對應人類膠原蛋白基因的胺基酸序列之前置引子與反置引子
S122‧‧‧利用人類細胞進行RNA之抽取，並藉由管柱層析進行分離和純化以取得mRNA
S123‧‧‧使用所取得之mRNA作為模板及設計之反置引子作為引子進行反轉錄以得到cDNA
S124‧‧‧利用所取得之cDNA作為模板以及對應之前置引子及反置引子作為引子進行聚合酶鏈反應以得到第二產物
S125‧‧‧將得到之第二產物與第三載體接合以產生第四載體
S126‧‧‧將第四載體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有人類膠原蛋白基因之菌株
S127‧‧‧由含有人類膠原蛋白基因之菌株中純化出所需之人類膠原蛋白基因並利用瓊脂醣膠電泳確認之
S131‧‧‧利用限制酶分別對啟動子(或增強子)以及第一表現載體進行剪切
S132‧‧‧黏合剪切後之啟動子(或增強子)以及第一表現載體以形成上游基因
S133‧‧‧將上游基因體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有啟動子(或增強子)之菌株
S134‧‧‧由含有啟動子(或增強子)之菌株中純化出所需之上游基因並利用瓊脂醣膠電泳確認之
S141‧‧‧利用限制酶分別對人類膠原蛋白基因以及上游基因進行剪切
S142‧‧‧黏合剪切後之人類膠原蛋白基因以及上游基因以形成第二表現載體
S143‧‧‧將第二表現載體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有人類膠原蛋白基因之菌株
S144‧‧‧由含有人類膠原蛋白基因之菌株中純化出所需之第二表現載體並利用瓊脂醣膠電泳確認之
S145‧‧‧利用限制酶分別對純化出之第二表現載體以及報導基因進行剪切
S146‧‧‧黏合剪切後之第二表現載體以及報導基因以形成重組載體
S147‧‧‧將重組載體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有報導基因之菌株
S148‧‧‧由含有報導基因之菌株中純化出所需之重組載體並利用瓊脂醣膠電泳確認之
UG‧‧‧上游基因
hCG‧‧‧人類膠原蛋白基因
RG‧‧‧報導基因
第1圖為根據本發明一實施例之轉基因魚卵的轉殖方法的流程圖。
第2圖為根據本發明一實施例之重組載體的示意圖。
第3圖為第1圖步驟S10之一實施例的細部流程圖。
第4圖為第3圖步驟S110之一實施例的細部流程圖。
第5圖為第3圖步驟S120之一實施例的細部流程圖。
第6圖為第3圖步驟S130之一實施例的細部流程圖。
第7圖為第3圖步驟S140之一實施例的細部流程圖。
第8圖為具有第一型人類膠原蛋白基因的重組質體之一實施例的示意圖。
以下述及之「第一」至「第二十三」等序號用語，其係用以區別所指之元件，而非用以排序或限定所指 元件之差異性，且亦非用以限制本發明之範圍。
參照第1圖，一種轉基因魚卵的轉殖方法包括 構築具有一人類膠原蛋白基因之一重組載體(步驟S10)、利用適當的限制酶(Restriction Enzyme)將構築好的重組載體變成線性(步驟S20)、以及將線性之重組載體引入魚類之胚胎中以嵌入至胚胎中之魚類染色體中(步驟S30)。
於此，參照第2圖，重組載體更具有一上游基 因UG，而人類膠原蛋白基因hCG是連接在此上游基因UG的下游。此上游基因UG至少包括可專一性於特定組織驅動下游基因序列(即，人類膠原蛋白基因hCG)表現之啟動子(promoter)、作用在此啟動子之增強子(enhancer)或其組合。換言之，將此重組載體引入至魚體之後，此重組載體能在魚體上表現人類原膠原蛋白或膠原蛋白。
於此，啟動子是存在在魚體中且具有組織專一 性表現。增強子是存在在魚體中。
在一些實施例中，啟動子例如可為角蛋白4 (keratin 4；K4)啟動子、角蛋白5(keratin 5)啟動子、或角蛋白1c6(krttlc6)啟動子。
其中，角蛋白4啟動子為SEQ ID NO：1所示之 序列。角蛋白1c6啟動子為SEQ ID NO：2所示之序列。
在一些實施例中，人類膠原蛋白基因hCG可 為單股或三股之人類膠原蛋白之胺基酸序列。
人類膠原蛋白基因hCG可為第一型至第二十 八型中之任一種或其配對。人類膠原蛋白基因hCG可為單 股或多股。舉例來說，第一型人類膠原蛋白具有二股α1鏈以及一股α2鏈，而第二型人類膠原蛋白具有三股α1鏈。人類膠原蛋白的配對總類為熟習此項技術者所熟知，故不在此贅述。
其中，第一型人類膠原蛋白基因為SEQ ID NO：3及4所示之序列。第二型人類膠原蛋白基因為SEQ ID NO：5所示之序列。於此，示範性列出第一及二型人類膠原蛋白基因之單一股的基因序列，但本發明不限於此。
在一些實施例中，重組載體更具有一報導基因 RG，並且此報導基因RG是連接在此人類膠原蛋白基因CG的下游。
於此，報導基因RG可為一發光酶(luciferase) 基因、一螢光蛋白(fluorescent protein)基因、或一lacZ(β-半乳糖苷酶；β-galactosidase)基因等。
其中，螢光蛋白基因可為綠色螢光蛋白(green fluorescent protein；GFP)基因、修飾綠色螢光蛋白(modified green fluorescent protein)基因、增強綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein；EGFP)基因、紅色螢光蛋白(red fluorescent protein；RFP)基因、增強紅色螢光蛋白(enhanced red fluorescent protein，ERFP)基因、藍色螢光蛋白(blue fluorescent protein；BFP)基因、增強藍色螢光蛋白(enhanced blue fluorescent protein；EBFP)基因、黃色螢光蛋白(yellow fluorescent protein；YFP)基因、增強黃色螢光蛋白(enhanced yellow fluorescent protein；EYFP)基因、靛色螢光蛋白(cyan fluorescent protein；CFP)基因或增強靛色螢光蛋白(enhanced cyan fluorescent protein；ECFP)基因等。
在一些實施例中，重組載體可為重組質體、重 組病毒載體、黏接質體(cosmid)或人工染色體(artificial chromosome)等。
在步驟S30中，將重組載體引入胚胎的方法包 括：顯微注射，轉染(例如：以DEAE-右旋糖酐或磷酸鈣沈澱)、以病毒載體(例如：反轉錄病毒、腺病毒)感染、電穿孔法、細胞膜通透性增加、基因槍、脂質體傳遞(例如：Lipofectin®(脂質體轉染試劑)、Lipofectamine®(脂質體轉染試劑)、Superfect®(脂質體轉染試劑)、Transfectam®(脂質體轉染試劑)或其他依據習知方法發展出之脂質體)，或受體中介之吸收及其他胞飲機制等。
參照第3圖，步驟S10可包括選殖魚類的啟動 子(步驟S110)、選殖人類膠原蛋白基因hCG(步驟S120)、利用選殖之啟動子與第一表現載體構築上游基因UG(步驟S130)、以及利用選殖之人類膠原蛋白基因hCG以及上游基因UG構築重組載體(步驟S140)。
參照第4圖，步驟S110包括根據於基因資料 庫所找出之啟動子(或增強子)的胺基酸序列設計對應之前置引子(forward primer；5’primer)與反置引子(reverse primer；3’primer)(步驟S111)、利用一魚體(魚類組織)進行DNA(脫氧核醣核酸；deoxyribonucleic acid)抽取以 得到全量DNA(genomic DNA)(步驟S112)、使用步驟S112所取得之全量DNA作為模板(template)以及步驟S111所設計之前置引子及反置引子作為引子，並利用DNA聚合酶(DNA polymerase)及三磷酸去氧核糖核酸(deoxyribonucleoside triphsphate；dNTP)等試劑共同進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction；PCR)以得到第一產物(步驟S113)、將得到之第一產物與第一載體接合以產生第二載體(步驟S114)、將第二載體轉形至勝任細胞(competent cell)中進行培養以及菌落篩選以得到含有啟動子(或增強子)之菌株(步驟S115)、以及由含有啟動子之菌株中純化出所需之啟動子(或增強子)並利用洋菜膠電泳(agarose gel electrophoresis)確認之(步驟S116)。
其中，魚體可為斑馬魚(Zebra fish)等。以 SEQ ID NO：1所示之啟動子為例，前置引子可為SEQ ID NO：6所示之序列以及反置引子可為SEQ ID NO：7所示之序列。
參照第5圖，步驟S120包括根據於基因資料 庫所找出之人類膠原蛋白基因hCG的mRNA(訊息核糖核酸；message RNA)序列設計對應之前置引子與反置引子(步驟S121)、利用人類細胞進行RNA(核糖核酸；ribonucleic acid)之抽取，並藉由管柱層析(chromatography)進行分離和純化以取得mRNA(步驟S122)、使用步驟S122所取得之mRNA作為模板及步驟 S121設計之反置引子作為引子，進行反轉錄(reverse transcription)以得到cDNA(互補脫氧核醣核酸；complementary DNA)(步驟S123)、使用步驟S123所取得之cDNA作為模板以及步驟S121所設計之前置引子及反置引子作為引子，並利用DNA聚合酶及三磷酸去氧核糖核酸等試劑共同進行PCR以得到第二產物(步驟S124)、將得到之第二產物與第三載體接合以產生第四載體(步驟S125)、將第四載體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有人類膠原蛋白基因hCG之菌株(步驟S126)、以及由含有啟動子之菌株中純化出所需之人類膠原蛋白基因hCG並利用洋菜膠電泳確認之(步驟S127)。
其中，人類細胞可為纖維母細胞(fibroblast)、 或軟骨細胞(chondrocyte)等。以SEQ ID NO：3所示之人類膠原蛋白基因hCG為例，前置引子可為SEQ ID NO：8及10所示之序列以及反置引子可為SEQ ID NO：9及11所示之序列。以SEQ ID NO：4所示之人類膠原蛋白基因hCG為例，前置引子可為SEQ ID NO：12所示之序列以及反置引子可為SEQ ID NO：13所示之序列。以SEQ ID NO：5所示之人類膠原蛋白基因hCG為例，前置引子可為SEQ ID NO：14及16所示之序列以及反置引子可為SEQ ID NO：15及17所示之序列。
參照第6圖，步驟S130包括利用一個或二個 限制酶分別對步驟S116所得到之啟動子以及第一表現載體進行剪切(步驟S131)、黏合剪切後之啟動子以及第一 表現載體以形成上游基因UG(步驟S132)、將上游基因UG轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有啟動子之菌株(步驟S133)、以及由含有啟動子之菌株中純化出所需之上游基因UG並利用洋菜膠電泳確認之(步驟S134)。
參照第7圖，步驟S140亦可包括利用一個或 二個限制酶分別對步驟S127所得到之人類膠原蛋白基因hCG以及步驟S134所得到之上游基因UG進行剪切(步驟S141)、黏合剪切後之人類膠原蛋白基因hCG以及上游基因UG以形成第二表現載體(步驟S142)、將第二表現載體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有人類膠原蛋白基因hCG之菌株(步驟S143)、由含有人類膠原蛋白基因hCG之菌株中純化出所需之第二表現載體並利用洋菜膠電泳確認之(步驟S144)、利用一個或二個限制酶分別對步驟S144所得到之第二表現載體以及報導基因RG進行剪切(步驟S145)、黏合剪切後之第二表現載體以及報導基因RG以形成重組載體(步驟S146)、將重組載體轉形至勝任細胞中進行培養以及菌落篩選以得到含有報導基因RG之菌株(步驟S147)、以及由含有報導基因RG之菌株中純化出所需之重組載體並利用洋菜膠電泳確認之(步驟S148)。
在一些實施例中，當重組載體不插入報導基因 RG時，則無需步驟S145至步驟S148，此時步驟S144所得到之第二表現載體即為所需之重組載體。
於此，凡熟習此技藝的人士應該都知曉許多適 合的勝任細胞，且許多勝任細胞是可以購得的，例如：細菌或真核細胞等，故不在此贅述。
凡熟習此技藝的人士應該都知曉，在本發明中 所述之轉基因魚卵是指人工引入前述之重組載體的胚胎、或此胚胎孵化成的魚體所生產的魚卵、或此魚體的後代所生產的魚卵。為了方便說明，人工引入前述之重組載體的胚胎所孵化成之魚體及其後代在本文中通稱為轉基因魚。 換言之，轉基因魚的細胞中具有重組載體之至少一複製體。為了方便說明，人工引入之重組載體及其複製體在下文中通稱為重組基因結構。
因此，根據選用之上游基因UG的種類，複製 體中之上游基因UG可直接或間接驅動複製體中之人類膠原蛋白基因hCG在轉基因魚的鱗片、表皮或眼睛等特定部位分泌重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白。進一步可利用具有分泌出之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的魚體的特定部位作為生物材料(例如：具有重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白及無機成份之生物材料)或純化出其中之重組人類膠原蛋白。
於此，各重組人類原膠原蛋白可為第一型至第 二十八型膠原蛋白中之任一股。各重組人類膠原蛋白可為第一型至第二十八型膠原蛋白中之任一種或其配對。再者，分泌出之重組人類膠原蛋白的三股可均源自於人類膠原蛋白基因hCG，或者僅其中之一股或二股源自於人類膠 原蛋白基因hCG而剩餘股則源自於魚膠原蛋白基因。
在一些實施例中，具有重組人類原膠原蛋白或 膠原蛋白之魚的特定部位可為魚鱗、皮膚、魚眼等部位中之一或其組合。
以下藉由實例而作更進一步地詳細說明，但此些實例僅是作為舉例說明，而非用以限定本發明之範疇。於此，涉及之DNA定序是交由源資國際生物科技股份有限公司協助定序，而其所使用之定序機型為ABI 3730 Genetic Analyzer。所使用的LB(Luria-Bertaini)培養液的配製為取20g LB粉末(powder)加水至1L，然後以滅菌釜滅菌後即可使用。LB粉末(購自Bio Basic Inc.)的成份包括：10g之Trypton(胰化蛋白)、5g之Yeast extract(酵母菌萃取物)、以及5g之氯化鈉(Sodium chloride；NaCl)。LB/Amp(LB plate with ampicillin)培養基則是在LB培養液中加入50μg/mL之ampicillin(抗生素)。
實例一：利用魚體進行DNA抽取
於此，以野生型斑馬魚(Danio rerio，AB strain)為例，利用全量DNA純化套組(GenoMaker kit)進行斑馬魚的全量DNA抽取。GenoMaker kit包括GenoMaker reagent(GenoMaker試劑)、RNase cocktail(分解酶混合物)和Ethanol precipitate Buffer(乙醇沉澱緩衝液)。
首先，用液態氮研磨或用組織均質機研磨斑馬魚組織。然後，取約10mg~100mg的研磨後之魚組織，並以1ml GenoMaker reagent來裂解細胞以得到裂解均質的樣 品。將裂解均質的樣品(1ml)放置於室溫3~5分鐘，隨後加入500μl的酚(Phenol)/氯仿(Chlorform)(1：1)，並均勻混和，以得到第一混合液。將第一混合液以轉速12000rpm離心5分鐘後，小心吸取第一混合液的上清液到新的離心管。再加入0.7~0.8ml的異丙醇至離心管內，並均勻混和，以得到第二混合液。將第二混合液以轉速12000rpm離心5分鐘後，將離心管中之第二混合液的上清液去除乾淨，而留下沈澱物於離心管中。加入40μL的RNase cocktail至具有沈澱物的離心管中並置於37℃中5分鐘，以將半濕狀態的沈澱物溶解。之後再加入600μL的Ethanol precipitate Buffer於離心管中，並均勻混和，以得到第三混合液。將第三混合液以轉速12000rpm離心5分鐘後，將離心管中之第三混合液的上清液去除乾淨，而留下沈澱物於離心管中。最後，再加入50~200uL的TE buffer至離心管中以溶解沈澱物，即得到魚的全量DNA。將得到之全量DNA儲存於-20℃，待進一步實驗使用。
實例二：選殖魚類的啟動子
聚合酶鏈反應：以SEQ ID NO：1所示之K4啟動子為例，於此前置引子採用SEQ ID NO：6所示之序列，以及反置引子採用SEQ ID NO：7所示之序列。。
依據下列表一加至0.2ml微量試管中進行聚合酶鏈反應，以得到第一產物。於此，聚合酶鏈反應的條件為階段1：94℃反應1分鐘；階段2：58℃反應1分鐘； 階段3：72℃反應1分鐘10秒；並且3個階段依序進行35個循環。
並且，將第一產物利用1%洋菜膠電泳確認是否存在所需之K4啟動子。
黏合反應(annealing)：依據下列表二將反應試劑加至0.2ml微量試管中進行黏合反應(4℃、隔夜)，以得到第四混合液(其中具有第二載體)。
表二
轉形反應(transformation)：於此，使用的勝任細胞為大腸桿菌(E.coli)ECOS 101之菌株。
將10μl之第四混合液加入100μl的勝任細胞中，並於均勻混和，以形成第一菌液。於混合後，馬上將第一菌液放入冰浴中約5分鐘。隨後，再將第一菌液放入42℃水浴中45秒進行熱刺激(heat-shock)反應。熱刺激反應後，再將第一菌液馬上放入冰浴中5分鐘。最後，將冰浴後之第一菌液均勻塗在LB/Amp培養基上，並靜置37℃隔夜培養。
菌落篩選：將前述LB/Amp培養基上之菌落重新培養在新的LB/Amp培養基上並靜置37℃隔夜培養。
第一質體純化：於此，利用Plasmid Mini-prep Purification kit (質體少量製備純化套組)(購自波仕特生物科技股份有限公司)進行第一質體之製備。
首先，取出1.5ml的第二菌液，以轉速12,000×g離心5分鐘。離心後，取得菌體沈澱物。
在含有菌體沈澱物的微量離心管中加入200μl solution I(Resuspension solution；重懸浮液)，並振盪到菌體呈懸浮狀態。再加入200μl solution Ⅱ(Lysis solution)，輕輕混勻，使菌體完全溶解，以將第一質體溶離出。最後，再加入200μl solution Ⅲ(Neutralization solution；中和溶液)，輕輕混合均勻。之後，再以轉速12,000×g離心5分鐘，取出上清液加入到離心層析管柱(spin column)(其含有DNA吸附膜)和收集管(collection tube)中。將具有上清液的離心層析管柱和收集管以轉速12,000×g離心1分鐘，使上清液中的DNA能吸附於DNA吸附膜上。接著，加入350ml的清洗液(wash solution)到離心層析管柱中，再以轉速12,000×g離心1分鐘，並重複此動作一次。再將離心層析管柱以轉速12,000×g離心3分鐘，以去除殘留的酒精。最後，將離心層析管柱放到新的1.5ml的微量離心管中，加入50μl的引流緩衝液(elution buffer)(引流緩衝液事先預熱至68℃)，靜置5分鐘後。最後，再以轉速12,000×g離心3分鐘，收集離心下來的DNA(即，第一質體)，並以限制酶確定大小。取適量DNA以及適量的限制酶(BamH I及Sal I)，加上10X反應緩衝液(reaction buffer)，並加水使體積為15μl， 以形成第五混合液。將第五混合液在37℃反應至少1小時，然後以1%洋菜膠進行電泳分析，以確定是否含有所要嵌入的K4啟動子的DNA片段。
實例三：選殖第二型人類膠原蛋白基因hCG
聚合酶鏈反應：以SEQ ID NO：5所示之第二型人類膠原蛋白基因(hCollagen type 2 alpha 1；hCT2A1)為例，於此前置引子採用SEQ ID NO：14所示之序列，以及反置引子採用SEQ ID NO：15所示之序列。
依據下列表三將反應試劑加至0.2ml微量試管中進行聚合酶鏈反應，以得到第二產物。於此，聚合酶鏈反應的條件為階段1：98℃反應10秒；階段2：64℃反應30秒；階段3：72℃反應4分鐘30秒；並且3個階段依序進行30個循環。
並且，將第二產物利用1%洋菜膠電泳確認是否存在所需之人類膠原蛋白基因hCG。
其中，Template DNA為人類膠原蛋白基因hCG的cDNA。
黏合反應(annealing)：依據下列表四將反應試劑加至0.2ml微量試管中進行黏合反應(22℃、4小時)，以得到第六混合液(其中具有第四載體)。
轉形反應(transformation)：將製備之E.coli TOP 10菌液加入10μl的第六混合液，並於冰上靜置30分鐘，隨後再放入42℃水浴中1至2分鐘進行熱刺激反應。熱刺激反應後，馬上放入冰浴中3至5分鐘，然後再加入LB培養液使其總體積為1ml， 以得到第三菌液。將第三菌液於37℃下震盪培養1小時。 在LB-Amp培養基上塗100μl之100mM的IPTG(isopropyl-b-d-thiogalactopyranoside；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)與20μl 50mg/ml之X-gel(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside；5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)，最後將第三菌液均勻塗在LB-Amp培養基上並37℃靜置培養12至16小時。
於此，亦可以諸如藍白菌株篩選(reporter gene assay)等快速篩菌方式初步篩選含有人類膠原蛋白基因的菌株。快速篩菌方式為熟習此項技術者所熟知，故不在此贅述。
第二質體純化：用微量吸管挑取白色單一菌落在試管中與10ml的LB/amp培養基混和培養8小時。然後，挑選數個菌落，並於37℃震盪培養14小時，以供純化含有人類膠原蛋白基因hCG之第二質體(hCT2A1-yt&A)使用。於此，利用Plasmid Mini-prep Purification kit(購自波仕特生物科技股份有限公司)製備第二質體，並以限制酶(BamH I及Sal I)確定大小。然後以1%洋菜膠進行電泳分析，以確定是否含有所要嵌入的人類膠原蛋白基因的DNA片段。其中，純化方式為熟習此項技術者所熟知，故不在此贅述。
實例四：構築適用於第二型人類膠原蛋白基因hCG的上游基因
依據下表五，利用限制酶(ApaI及BamHI) 對第一質體(K4-yt&A)以及第一表現載體(pT2-LFABP-tTa)進行剪切(37℃下靜置作用至少2小時)而分別得到第七混合液(含K4)以及第八混合液(含pT2-tTa)。
作用後，將第七混合液(含K4)以及第八混 合液(含pT2-tTa)分別注入至1%洋菜膠中進行電泳分析，並切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution Kit(膠體DNA回收試劑組)(購自GeneMark)回收DNA產物(即，K4以及pT2-tTa)。
依據下表六，先將二DNA產物(即，K4以及pT2-tTa)混合並以70℃處理3分鐘，然後馬上置於冰浴中。隨後，再加入其餘試劑均勻混合，並於22℃下靜置作用4小時進行黏合反應，以得到第九混合液(其中具有上游基因)。
以E.coli TOP 10之菌株作為勝任細胞，並將 第九混合液中的上游基因轉形至E.coli TOP 10中，進行培養(菌株培養)。然後，從培養出的菌株中篩選出具有上游基因的菌株，並利用純化套組純化出上游基因(pT2-K4-tTa)。
其中，菌株培養方式、篩菌方式及純化方式為 熟習此項技術者所熟知，故不在此贅述。
實例五：構築重組質體
依據下表七，利用限制酶(Sal I及BamH I) 對pT2-K4-tTa以及hCT2A1-yt&A進行剪切(37℃下靜置作用至少2小時)而分別得到第十混合液(含pT2-K4)以及第十一混合液(含hCT2A1)。
作用後，將第十混合液(含pT2-K4)以及第 十一混合液(含hCT2A1)分別注入至1%洋菜膠中進行電泳分析，並切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution Kit(膠體DNA回收試劑組)(購自GeneMark)回收DNA產物(即，pT2-K4以及hCollagen T2A1)。
依據下表八，先將二DNA產物(即，pT2-K4 以及hCollagen T2A1)混合並以70℃處理3分鐘，然後馬上置於冰浴中。隨後，再加入其餘試劑均勻混合，並於22℃下靜置作用4小時進行黏合反應，以得到第十二混合液(其中具有第二表現載體)。
以E.coli TOP 10之菌株作為勝任細胞，並將 第十二混合液中的第二表現載體轉形至E.coli TOP 10中，進行培養(菌株培養)。然後，從培養出的菌株中篩選出具有第二表現載體的菌株，並利用純化套組純化出第二表現載體(pT2-K4-hCT2A1)。
於此，採用綠色螢光蛋白基因作為報導基因。
依據下表九，利用限制酶(Sal I及Cla I)對 報導基因(IRES-hrGFP)以及pT2-K4-hCT2A1進行剪切(37℃下靜置作用至少2小時)而分別得到第十三混合液(含IRES-hrGFP)以及第十四混合液(含pT2-K4-hCT2A1)。
作用後，將第十三混合液(含IRES-hrGFP) 以及第十四混合液(含pT2-K4-hCT2A1)分別注入至1%洋菜膠中進行電泳分析，並切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution Kit(膠體DNA回收試劑組)(購自 GeneMark)回收DNA產物(即，IRES-hrGFP以及pT2-K4-hCT2A1)。
依據下表十，先將二DNA產物(即， IRES-hrGFP以及pT2-K4-hCT2A1)混合並以70℃處理3分鐘，然後馬上置於冰浴中。隨後，再加入其餘試劑均勻混合，並於22℃下靜置作用4小時進行黏合反應，以得到第十五混合液(其中具有重組質體)。
以E.coli TOP 10之菌株作為勝任細胞，並將 第十五混合液中的重組質體轉形至E.coli TOP 10中，進行培養(菌株培養)。然後，從培養出的菌株中篩選出具有重組質體的菌株。其中，菌株培養方式及篩菌方式為熟習此項技術者所熟知，故不在此贅述。
於此，重組質體轉型至E.coli TOP10後，可加 入冷凍保存液(20% Glycerol：LB=1：1)混合。
重組質體純化： 將篩選到定序確認的菌株接種至200ml LB-Amp培養液中，並在37℃下以175rpm振盪培養。培養後，以13,000×g離心5分鐘，以得到取得菌體沈澱物。
先將balance column(平衡管柱)加入10ml的equilibration buffer(平衡緩衝液)，然後將離心完之菌體沈澱物加入4ml的cell suspension buffer(細胞懸浮緩衝液)，並震盪至沒有沉澱物為止，以得到第十六混合液。
加入4ml的cell lysis solution至第十六混合液中，並小心混合後在室溫下放置5分鐘。再加入4ml的中和緩衝液，並小心混合後以15,000×g離心10分鐘(25℃)。離心完後將上層液吸取到平衡管柱中，並以10ml的清洗液洗兩次。再加入5ml的引流緩衝液到平衡管柱中，收集流出的DNA溶液。
接著，加入3.5ml的異丙醇至收集到的DNA溶液中，然後以15,000×g離心30分鐘。離心後，倒出上層液留下沉澱物，再加入3ml的70%酒精。然後，再以15,000×g離心5分鐘，以去除酒精。去除酒精後，將風乾的DNA加入200μl的TE buffer以溶解DNA，即得到含有重組質體(pT2-K4-hCT2A1-IRES-hrGFP)的溶液。待DNA全部溶解後，取2μl來測吸光值(OD260nm)，以進行DNA定量，其餘則保存在-80℃中。
於此，降溫方式可為先置於4℃中1小時，再放置於-20℃中1小時，最後再放入-80℃中保存。
實例六：選殖第一型人類膠原蛋白基因hCG
以SEQ ID NO：3所示之第一型人類膠原蛋白基因(hCollagen type 1 alpha 1；hCT1A1)為例，於此前置引子採用SEQ ID NO：8所示之序列，以及反置引子採用SEQ ID NO：9所示之序列。
實驗流程大致上相同於上述實例三，在此不再贅述。於此，得到含有人類膠原蛋白基因hCG之第二質體(hCT1A1-yt&A)。
實例七：構築適用於第一型人類膠原蛋白基因hCG的上游基因
依據下表十一，利用限制酶(ApaI及BamHI)對第一質體(K4-yt&A)以及第一表現載體(pT2-LF2.9-AmCyan1)進行剪切(37℃下靜置作用至少2小時)而分別得到第十七混合液(含K4)以及第十八混合液(含pT2-AmCyan1)。
作用後，將第十七混合液(含K4)以及第十 八混合液(含pT2-AmCyan1)分別注入至1%洋菜膠中進行電泳分析，並切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution Kit(膠體DNA回收試劑組)(購自GeneMark)回收DNA產物(即，K4以及pT2-AmCyan1)。
依據下表十二，先將二DNA產物(即，K4以 及pT2-AmCyan1)混合並以70℃處理3分鐘，然後馬上置於冰浴中。隨後，再加入其餘試劑均勻混合，並於22℃下靜置作用4小時進行黏合反應，以得到第十九混合液(其中具有上游基因)。
以E.coli TOP 10之菌株作為勝任細胞，並將 第十九混合液中的上游基因轉形至E.coli TOP 10中，進行培養(菌株培養)。然後，從培養出的菌株中篩選出具有上游基因的菌株，並利用純化套組純化出上游基因(pT2-K4-AmCyan1)。
其中，菌株培養方式、篩菌方式及純化方式為 熟習此項技術者所熟知，故不在此贅述。
實例八：構築重組質體
依據下表十三，利用限制酶(Sal I及Age I)對pT2-K4-AmCyan1以及hCT1A1-yt&A進行剪切(37℃下靜置作用至少2小時)而分別得到第二十混合液(含pT2-K4)以及第二十一混合液(含hCT1A1)。
作用後，將第二十混合液(含pT2-K4)以及 第二十一混合液(含hCT1A1)分別注入至1%洋菜膠中進行電泳分析，並切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution Kit(膠體DNA回收試劑組)(購自GeneMark)回收DNA產物(即，pT2-K4以及hCT1A1)。
依據下表十四，先將二DNA產物(即，pT2-K4 以及hCT1A1)混合並以70℃處理3分鐘，然後馬上置於冰浴中。隨後，再加入其餘試劑均勻混合，並於22℃下靜置作用4小時進行黏合反應，以得到第二十二混合液(其 中具有重組質體)。
將第二十二混合液中的重組質體轉形至E.coli TOP 10中，進行培養(菌株培養)。然後，從培養出的菌株中篩選出具有重組質體的菌株，並利用純化套組純化出重組質體(pT2-K4-hCT1A1)。
再將pT2-K4-hCT1A1的重組質體轉形至E.coli TOP 10中，進行培養(菌株培養)。然後，從培養出的菌株中篩選出具有pT2-K4-hCT1A1重組質體的菌株並進行純化，以獲得構築好的pT2-K4-hCT1A1重組質體，如第8圖所示。其中，實驗流程大致上相同於上述實例五。
在第8圖中，K4 P1.2K(keratin 4 P1.2K)是 指斑馬魚角蛋白4啟動子1.2kb之片段；COL1A1是指人類第1型α1膠原蛋白之cDNA；以及Tol2是指作為轉位(transposition)之轉位子Tol2(transposable element of Oryzias latipes，number 2)轉位酶辨識序列(transposase recognition sequence)。於此，以斑馬魚K4 promoter ApaI/BamHI置換pT2-LF2.9-AmCyan1之LF2.9 promoter ApaI/BamHI切位，以成為pT2-K4-AmCyan1。然後以hCT1A1 AgeI/SalI置換pT2-K4-AmCyan1之Amcyan1 AgeI/XhoI(SalI與XhoI之切位為Isoschizomers，並且於ligation後SalI及XhoI同時被破壞)而得到pT2-K4-hCT1A1。
實例九：魚類胚胎之製備：
將野生型斑馬魚(Danio rerio，AB strain)的 成魚在28℃恆溫下飼養。飼養條件為光週期設定14小時日光/10小時暗室，並早晚餵食飼料。
固定早上進行公母混缸(公：母=2：1)以交 配產卵。交配約30~40分鐘後收集胚胎(此時胚胎的時期約第一細胞期(1-cell stage))，以供基因轉殖使用。
實例十：欲引入之重組質體之製備：
依據下表十五，將反應試劑混合均勻，然後 37℃下靜置作用至少3小時，以利用適當的限制酶將構築好的重組質體(如同實例五或實例八之產物)變成線性的DNA。
利用Gel Elution Kit(購自GeneMark)回收 DNA產物，並加入適量的無菌水回溶DNA，以使線型DNA的最後濃度為0.1μg/μl。
在顯微注射前，先取40μl線型DNA與5μl的 1%追蹤染劑(於此使用phenol red(酚紅))均勻混合，以得到第二十三混合液。將第二十三混合液保存在-20℃下，等待顯微注射用。
實例十一：重組質體引入
將收集之胚胎置於洋菜膠的溝內，使之固定胚 胎。透過顯微注射方式將前述之第二十三混合液注入固定之胚胎內。
注射後的胚胎移入孵化槽中培養24小時，再 經由螢光顯微鏡觀察在胚胎上表現的綠螢光蛋白(hrGFP)，並拍照紀錄。於此，螢光蛋白表現即代表人類膠原蛋白基因也有表現。
以轉基因胚胎建立親代(F0世代)之轉基因 斑馬魚。再將F0世代之轉基因斑馬魚養至性成熟(約3-5個月)，可與野生型斑馬魚之種魚進行交配，以獲得有螢光表現之F1世代(子代)轉基因斑馬魚。F1世代轉基因斑馬魚再經3-5個月飼養，即可交配產生F2世代(子代)轉 基因斑馬魚。
於此，K4角蛋白可驅動人類膠原蛋白基因表 現在魚鱗上，即使轉基因斑馬魚分泌重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白於魚鱗上。
雖然於此是利用報導基因確認引入之重組基 因結構的表現，但本發明不限於此。凡熟習此技藝的人士應該都知曉對於具有重組基因結構的魚體之檢驗方法能以任何適合方法為之。例如，可以PCR檢查該魚體之染色體，以偵測出其是否具有重組基因結構。針對重組基因結構之一表現產物(重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白)進行偵測，則可以檢測出實際上有表現轉殖基因的魚體。再者，目前習知可用於轉殖動物的相關檢驗方法亦可應用於轉基因魚體之鑑定，例如：以北方墨漬法或南方墨漬法來偵測魚體中是否具有轉殖基因之核酸序列、或使用聚合酶鏈反應以及其他具有序列特異性之核酸放大技術來進行上述偵測。
實例十二：重組質體引入
另外，可參照日本Kawakami學者所發展的基 因轉殖技術，以in-vitro transcription(細胞外轉錄)合成Tol2 transponase mRNA(Tol2轉位酶訊息核糖核酸)，並與第二十三混合液一同顯微注射至斑馬魚胚胎中。基因轉殖技術請參考下列文獻“Transposon tools and methods in zebrafish(斑馬魚之轉位子工具及方法)”Dev.Dyn.234(2)：244-254,2005。
實例十三：生物材料之製備
由轉基因魚收集一個或多個魚鱗，並將收集到 的魚鱗經過洗淨、去細胞及脫水等處理步驟，以將各個魚鱗處理成具有重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白之一生物材料。
於此，可再進行擠壓步驟，以將前述處理後之 單個或多個魚鱗擠壓成特定形狀和/或特定尺寸之具有重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的生物材料。
再者，在擠壓前，可先將前述處理後之單個或 多個魚鱗進行研磨處理。此外，研磨後的魚鱗顆粒可藉由過篩將不同粒徑的粉末分離，而以不同粒徑的粉末提供具有重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的生物材料。
另外，此些生物材料還可進行滅菌，以產生無菌的生物材料。
相關處理步驟可參考美國第12/324,551、12/659,282、12/880,349、及13/019,134號專利申請案。
實例十四：E.coli TOP 10勝任細胞之製備
於此，使用的E.coli TOP 10之基因型(genotype)為F-mcrA △(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ801acZ△M15 △lacX74 recA1 araD139 △(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)endA1 nupGλ-。
取E.coli TOP 10於適量的LB培養基中隔夜培養，再取其至5ml之LB/Amp培養基(加入約1/100體積菌液)中進行二次培養，置於37℃培養箱震盪搖晃至OD600吸光度約0.5-0.6間。
接下來的步驟皆在冰上操作。將菌液置於冰上 放置10分鐘，接著取2mL培養至O.D值為0.5的菌液以4000×g在4℃下離心3分鐘(或以5000xg於4℃離心4分鐘)。離心完成後，以微量分注器(pippet)清除上清液，再加入1mL之250mM(或200mM)氯化鈣(CaCl2)混合均勻使菌完全回溶。再將回溶之菌液置於冰上10分鐘後，再次離心。離心完成後，再以pippet清除上清液，然後再加入CaCl2約150μl至200ml混合均勻使菌完全回溶，放置冰上10分鐘以上，再進一步使用。
綜上，根據本發明之重組載體及應用其而產生 之轉基因魚卵與生物材料可提供能於特定部位分泌重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的轉基因魚，以利用具有分泌出之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白的魚體的特定部位作為生物材料或純化出其中之重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白。
雖然本發明以前述之實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習相像技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之申請專利範圍所界定者為準。
【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
財團法人食品工業發展研究所、2013/08/13、BCRC940656
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
德國、DSMZ、2013/08/20、DSM 27616
<110> 柏登生醫股份有限公司
<120> 重組載體及應用其而產生之轉基因魚卵與生物材料
<130> N/A
<150> US 61/694877
<151> 2012-08-30
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> 斑馬魚(Danio rerio,AB strain)
<400> 1
<210> 2
<211> 1570
<212> DNA
<213> 斑馬魚(Danio rerio,AB strain)
<400> 2
<210> 3
<211> 4752
<212> DNA
<213> Homo sapiens collagen,type I,alpha 1(hCT1A1)
<400> 3
<210> 4
<211> 4572
<212> DNA
<213> Homo sapiens collagen,type I,alpha 2(hCT1A2)
<400> 4
<210> 5
<211> 4937
<212> DNA
<213> Homo sapiens collagen,type II,alpha 1(hCT2A1)
<400> 5
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 6
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 7
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 8
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for collagen type 1 alpha 1 collagen COL1A1-3'P-Sal1
<400> 9
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for collagen type 1 alpha 1 and Bgl2-Nhe1
<400> 10
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for collagen type 1 alpha 1 and Sal1
<400> 11
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for collagen type 1 alpha2 and BamH1-Nhe1
<400> 12
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for collagen type 1 alpha2 and Sal1-Cla1
<400> 13
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for collagen type 2 alphal and EcoRI
<400> 14
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for collagen type 2 alphal and SolI
<400> 15
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for collagen type 2 alphal and BamH1-Nhe1
<400> 16
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for collagen type 2 alphal and Sal1-Cla1
<400> 17
UG‧‧‧上游基因
hCG‧‧‧人類膠原蛋白基因
RG‧‧‧報導基因

Claims (10)

  1. 一種生物材料，包括：由一魚體獲得之一重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白。
  2. 如請求項1所述之生物材料，更包括該魚體之至少一魚鱗，其中各該魚鱗具有表現該重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白。
  3. 如請求項1所述之生物材料，其中該重組人類原膠原蛋白或膠原蛋白是由人類膠原蛋白基因在該魚體表現。
  4. 一種轉基因魚卵，包括：一魚類染色體；以及一重組載體，嵌入該魚類染色體中，其中該重組載體包括一人類膠原蛋白基因。
  5. 如請求項4所述之轉基因魚卵，其中該重組載體更包括一上游基因，該人類膠原蛋白基因連接在該上游基因的下游。
  6. 如請求項5所述之轉基因魚卵，其中該上游基因為在一魚體中存在的一啟動子、一增強子或其組合。
  7. 如請求項4或5所述之轉基因魚卵，其中該重組載體更包括一報導基因，該報導基因連接在該人類膠原蛋白基因的下游。
  8. 一種重組載體包括：一上游基因，由一魚體獲得之；以及一人類膠原蛋白基因，連接在該上游基因的下游。
  9. 如請求項8所述之重組載體，更包括一報導基因，該報導 基因連接在該人類膠原蛋白基因的下游。
  10. 如請求項8所述之重組載體，其中該上游基因為在該魚體中普遍存在的一啟動子。
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JP7460178B2 (ja) * 2018-11-15 2024-04-02 中国▲農▼▲業▼大学 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｊ酵素およびシステム

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5077214A (en) 1989-07-07 1991-12-31 The Texas A&M University System Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells
US5593859A (en) 1991-10-23 1997-01-14 Thomas Jefferson University Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems
FR2678624A1 (fr) * 1991-07-04 1993-01-08 Coletica Utilisation de la peau non pigmentee de poisson, en particulier de poisson plat comme nouvelle source industrielle de collagene, procede d'extraction, collagene et biomateriau ainsi obtenus.
AU680606B2 (en) * 1991-10-23 1997-08-07 Academy Of Finland Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems
US7135613B1 (en) * 1999-02-18 2006-11-14 The National University Of Singapore Chimeric gene constructs for generation of fluorescent transgenic ornamental fish
JP2002272481A (ja) * 2000-07-25 2002-09-24 Takeda Chem Ind Ltd 組換え蛋白質の製造法
AU2003228471A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 F.C. Thomas Allnut Enclosed aquacultural systems for production of purified recombinant proteins
US20040115771A1 (en) * 2002-09-27 2004-06-17 Thomas Jefferson University Recombinant collagen-like proteins
TWI263678B (en) * 2004-10-27 2006-10-11 Fisheries Res Inst Council Of Collagen of fish scale and method of making thereof
EP1906727A4 (en) * 2005-07-19 2010-04-07 Temasek Life Sciences Lab Ltd MODEL FISH CANCER
KR20090090328A (ko) * 2006-11-09 2009-08-25 시나게바 바이오파르마, 코포레이션 조류 유래 에리트로포이어틴
US7838038B2 (en) * 2006-12-04 2010-11-23 Chien-Cheng Lin Biomaterial and preparation method thereof
JP2007326869A (ja) * 2007-07-27 2007-12-20 Seiwa Kasei Co Ltd 魚鱗由来加水分解コラーゲン
JP4369969B2 (ja) * 2007-10-26 2009-11-25 株式会社アールビーエス 生体適合性材料並びにその製造方法
EP2644620B1 (en) * 2010-11-26 2017-06-28 Tokyo Institute of Technology Non-fibrogenesis collagen material and a manufacturing method thereof

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