CN103833846A - 重组载体及应用该重组载体的转基因鱼卵和生物材料 - Google Patents

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Abstract

一种重组载体及应用该重组载体产生的转基因鱼卵与生物材料，可提供能够于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。

Description

重组载体及应用该重组载体的转基因鱼卵和生物材料
技术领域
本发明为一种生物医学材料的制备技术，特别是一种重组载体及应用该重组载体而产生的转基因鱼卵与生物材料。 
先前技术 
由于胶原蛋白是生物医学材料的重要组成材料，主要包括使组织生长、整型、烧烫伤敷料、伤口愈合等功能，并且市场规模不断地扩大，因此，开发更具医疗价值及更多样性的胶原蛋白及其衍生物，以应用于各种用途，是现今研发者所希望解决的课题。 
目前生产重组胶原蛋白的表达系统包括大肠杆菌（Escherichia coli；E.coli）、酵母菌、哺乳动物细胞株、昆虫细胞株、转基因动物以及转基因植物。然而，大肠杆菌表达系统没有翻译后修饰。酵母菌表达系统缺乏脯氨酸4-羟化酶活性，但甲醇酵母中的胶原蛋白产量却又是这些表达系统中最高的。哺乳动物细胞株的表达系统产量低且受限于特定细胞类型。昆虫细胞的表达系统中脯氨酸4-羟化酶活性又低。而转基因动物（如，蚕或小鼠）以及转基因植物（如，烟草），其胶原蛋白产物会过度交联。 
目前已建立有含有编码人类脯氨酸4-羟化酶以及胶原蛋白的基因的杆状病毒表达系统（参照美国专利第5,077,214号以及第5,593,859号）。然而，经转染的昆虫细胞在72小时内死亡，造成仅有暂时性的重组胶原蛋白生产。此外，由于胞溶作用，因此将很难回收或纯化重组胶原蛋白。而且，杆状病毒对于内质网或高尔基氏体的破坏更限制了胶原蛋白的生产。 
发明内容
在一实施例中，一种生物材料包括：由鱼体生产并获得的重组人类前 胶原蛋白或胶原蛋白。 
在一些实施例中，此生物材料更包括鱼体的至少鱼鳞，并且各鱼鳞具有表达的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。 
在一些实施例中，重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白是由转移到鱼体中的人类胶原蛋白基因表达的。 
在另一实施例中，一种转基因鱼卵包括鱼类染色体以及重组载体。重组载体整合到鱼类染色体中，并且此重组载体包括人类胶原蛋白基因。 
在又一实施例中，一种重组载体包括上游基因以及人类胶原蛋白基因。上游基因是由鱼体获得，而人类胶原蛋白基因是连接在上游基因的下游。其中，上游基因可为在鱼体中存在的启动子、增强子或其组合。 
在一些实施例中，重组载体更包括报道基因，并且此报道基因是连接在人类胶原蛋白基因的下游。 
综上，根据本发明的重组载体及应用其产生的转基因鱼卵和生物材料可提供能于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。所述生物材料已在位于德国D-38124布伦瑞克茵荷芬斯特街7B号的德国微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏日期为2013年8月20日，保藏编号为DSM27616，分类命名为：斑马鱼角蛋白4启动子在tol2载体连接第1型α1人类胶原蛋白基因（zebrafish Keratin4promoter link human Collagen1A1gene in tol2vector，pT2-zK4hC1A1）。 
附图简要说明 
图1为根据本发明一实施例的转基因鱼卵的转化方法的流程图。 
图2为根据本发明一实施例的重组载体的示意图。 
图3为图1步骤S10的一实施例的详细流程图。 
图4为图3步骤S110的一实施例的详细流程图。 
图5为图3步骤S120的一实施例的详细流程图。 
图6为图3步骤S130的一实施例的详细流程图。 
图7为图3步骤S140的一实施例的详细流程图。 
图8为具有第1型人类胶原蛋白基因的重组质粒的一实施例的示意图。 
实施方式 
以下所述的「第一」至「第二十三」等序号用语是用于区别所指的组件，而非用于排序或限定所指组件的差异性，且也非用于限制本发明的范围。 
参照图1，一种转基因鱼卵的转化方法包括构建具有人类胶原蛋白基因的重组载体（步骤S10）、利用适当的限制性酶（Restriction Enzyme）将构建好的重组载体（Recombinant Vector）变成线性（步骤S20）、以及将线性的重组载体引入鱼类的胚胎中以整合到胚胎中的鱼类染色体中（步骤S30）。 
在此，参照图2，重组载体更具有上游基因UG，而人类胶原蛋白基因hCG是连接在此上游基因UG的下游。此上游基因UG至少包括可特异性在在特定组织驱动下游基因序列（即，人类胶原蛋白基因hCG）表达（expression）的启动子（promoter）、作用于此启动子的增强子（enhancer）或其组合。换言之，将此重组载体引入至鱼体之后，此重组载体能在鱼体上表达人类前胶原蛋白或胶原蛋白（procollagen or collagen）。 
在此，激活子存在于鱼体中且具有组织特异性的表达。增强子存在于鱼体中。 
在一些实施例中，启动子例如可为角蛋白4（keratin4；K4）启动子、角蛋白5（keratin5；K5）启动子或角蛋白1c6（krtt1c6）启动子。 
其中，角蛋白4启动子为SEQ ID NO:1所示的序列。角蛋白1c6启动子为SEQ ID NO:2所示的序列。 
在一些实施例中，人类胶原蛋白基因hCG可为单股或三股的人类胶原蛋白的氨基酸序列。 
人类胶原蛋白基因hCG可为第1型至第28型中的任一种或其配体。人类胶原蛋白基因hCG可为单链或多链。举例来说，第1型人类胶原蛋白具有二条α1链以及一条α2链，而第2型人类胶原蛋白具有三条α1链。人类胶原蛋白的配体总体为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。 
其中，第1型人类胶原蛋白基因为SEQ ID NO:3及4所示的序列。第 2型人类胶原蛋白基因为SEQ ID NO:5所示的序列。在此，示范性列出第1及2型人类胶原蛋白基因的单一链的基因序列，但本发明不限于此。 
在一些实施例中，重组载体更具有报道基因RG，并且此报道基因RG是连接在人类胶原蛋白基因CG的下游。 
在此，报道基因RG可为萤光素酶（luciferase）基因、荧光蛋白（fluorescent protein）基因或lacZ（β-半乳糖苷酶；β-galactosidase）基因等。 
其中，荧光蛋白基因可为绿色荧光蛋白（green fluorescent protein；GFP）基因、修饰绿色荧光蛋白（modified green fluorescent protein）基因、增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein；EGFP）基因、红色荧光蛋白（red fluorescent protein；RFP）基因、增强红色荧光蛋白（enhanced red fluorescent protein，ERFP）基因、蓝色荧光蛋白（blue fluorescent protein；BFP）基因、增强蓝色荧光蛋白（enhanced blue fluorescent protein；EBFP）基因、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein；YFP）基因、增强黄色荧光蛋白（enhanced yellow fluorescent protein；EYFP）基因、靛色荧光蛋白（cyan fluorescent protein；CFP）基因或增强靛色荧光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein；ECFP）基因等。 
在一些实施例中，重组载体可为重组质粒（plasmid）、重组病毒载体、粘粒（cosmid）或人工染色体（artificial chromosome）等。 
在步骤S30中，将重组载体引入胚胎的方法包括：显微注射，转染（例如：以DEAE-右旋糖酐或磷酸钙沉淀）、以病毒载体（例如：反转录病毒、腺病毒）感染、电穿孔法、细胞膜通透性增加、基因枪、脂质体传递（例如：
Figure BDA0000375183520000041
（脂质体转染试剂）、
Figure BDA0000375183520000042
（脂质体转染试剂）、 （脂质体转染试剂）、
Figure BDA0000375183520000044
（脂质体转染试剂）或其它根据公知方法发展出的脂质体），或受体中介的吸收及其它胞饮机制等。 
参照图3，步骤S10可包括克隆鱼类的启动子（步骤S110）、克隆人类胶原蛋白基因hCG（步骤S120）、利用克隆的启动子与第一表达载体构建上游基因UG（步骤S130）、以及利用克隆的人类胶原蛋白基因hCG以及上游基因UG构建重组载体（步骤S140）。 
参照图4，步骤S110包括根据在基因数据库中所找出的启动子（或增强子）的氨基酸序列设计对应的正向引物（forward primer；5’primer）与反向引物（reverse primer；3’primer）（步骤S111）、利用鱼体（鱼类组织）进行DNA（脱氧核糖核酸；deoxyribonucleic acid）提取以得到基因组DNA（genomic DNA）（步骤S112）、使用步骤S112所取得的基因组DNA作为模板（template）以及步骤S111所设计的正向引物及反向引物作为引物，并利用DNA聚合酶（DNA polymerase）及三磷酸脱氧核糖核苷（deoxyribonucleoside triphsphate；dNTP）等试剂共同进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction；PCR）以得到第一产物（步骤S113）、将得到的第一产物与第一载体接合以产生第二载体（步骤S114）、将第二载体转化至感受态细胞（competent cell）中进行培养以及菌落筛选以得到含有启动子（或增强子）的菌株（步骤S115）、以及由含有启动子的菌株中纯化的所需的启动子（或增强子）并利用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）确认（步骤S116）。 
其中，鱼体可为斑马鱼（Zebra fish）等。以SEQ ID NO:1所示的启动子为例，正向引物可为SEQ ID NO:6所示的序列以及反向引物可为SEQ ID NO:7所示的序列。 
参照图5，步骤S120包括根据在基因数据库中所找出的人类胶原蛋白基因hCG的mRNA（信使核糖核酸；message RNA）序列设计对应的正向引物与反向引物（步骤S121）、利用人类细胞进行RNA（核糖核酸；ribonucleic acid）的提取，并通过柱层析（chromatography）进行分离和纯化以取得mRNA（步骤S122）、使用步骤S122所取得的mRNA作为模板及步骤S121设计的反向引物作为引物，进行反转录（reverse transcription）以得到cDNA（互补脱氧核糖核酸；complementary DNA）（步骤S123）、使用步骤S123所取得的cDNA作为模板以及步骤S121所设计的正向引物及反向引物作为引物，并利用DNA聚合酶及三磷酸脱氧核糖核苷等试剂共同进行PCR以得到第二产物（步骤S124）、将得到的第二产物与第三载体接合以产生第四载体（步骤S125）、将第四载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有人类胶原蛋白基因hCG的菌株（步骤S126）、以及 由含有人类胶原蛋白基因hCG的菌株中纯化所需的人类胶原蛋白基因hCG并利用琼脂糖凝胶电泳确认（步骤S127）。 
其中，人类细胞可为纤维母细胞（fibroblast）、或软骨细胞（chondrocyte）等。以SEQ ID NO:3所示的人类胶原蛋白基因hCG为例，正向引物可为SEQ ID NO:8及10所示的序列以及反向引物可为SEQ ID NO:9及11所示的序列。以SEQ ID NO:4所示的人类胶原蛋白基因hCG为例，正向引物可为SEQ ID NO:12所示的序列以及反向引物可为SEQ ID NO:13所示的序列。以SEQ ID NO:5所示的人类胶原蛋白基因hCG为例，正向引物可为SEQ ID NO:14及16所示的序列以及反向引物可为SEQ ID NO:15及17所示的序列。 
参照图6，步骤S130包括利用一个或二个限制性酶分别对步骤S116所得到的启动子以及第一表达载体进行剪切（步骤S131）、接合剪切后的启动子以及第一表达载体以形成上游基因UG（步骤S132）、将上游基因UG转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有启动子的菌株（步骤S133）、以及由含有启动子的菌株中纯化出所需的上游基因UG并利用琼脂糖凝胶电泳确认（步骤S134）。 
参照图7，步骤S140还可包括利用一个或二个限制性酶分别对步骤S127所得到的人类胶原蛋白基因hCG以及步骤S134所得到的上游基因UG进行剪切（步骤S141）、接合剪切后的人类胶原蛋白基因hCG以及上游基因UG以形成第二表达载体（步骤S142）、将第二表达载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有人类胶原蛋白基因hCG的菌株（步骤S143）、由含有人类胶原蛋白基因hCG的菌株中纯化出所需的第二表达载体并利用琼脂糖凝胶电泳确认（步骤S144）、利用一个或二个限制性酶分别对步骤S144所得到的第二表达载体以及报道基因RG进行剪切（步骤S145）、接合剪切后的第二表达载体以及报道基因RG以形成重组载体（步骤S146）、将重组载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有报道基因RG的菌株（步骤S147）、以及由含有报道基因RG的菌株中纯化出所需的重组载体并利用琼脂糖凝胶电泳确认（步骤S148）。 
在一些实施例中，当重组载体不插入报道基因RG时，则无需步骤S145至步骤S148，此时步骤S144所得到的第二表达载体即为所需的重组载体。 
在此，本领域技术人员都应该知晓许多适合的感受态细胞，且许多感受态细胞是可以购得的，例如：细菌或真核细胞等，故不在此赘述。 
本领域技术人员都应该知晓，在本发明中所述的转基因鱼卵是指人工引入前述的重组载体的胚胎、或此胚胎孵化成的鱼体所产生的鱼卵、或此鱼体的后代所产生的鱼卵。为了方便说明，人工引入前述的重组载体的胚胎所孵化成的鱼体及其后代在本文中通称为转基因鱼。换言之，转基因鱼的细胞中具有重组载体的至少一复制体。为了方便说明，人工引入的重组载体及其复制体在下文中通称为重组基因结构。 
因此，根据选用的上游基因UG的种类，复制体中的上游基因UG可直接或间接驱动复制体中的人类胶原蛋白基因hCG在转基因鱼的鳞片、表皮或眼睛等特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。进一步可利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体特定部位作为生物材料（例如：具有重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白及无机成份的生物材料）或纯化出其中的重组人类胶原蛋白。 
在此，各重组人类前胶原蛋白可为第1型至第28型胶原蛋白中的任一条链。各重组人类胶原蛋白可为第1型至第28型胶原蛋白中的任一种或其配体。再者，分泌的重组人类胶原蛋白的三条链可均源自于人类胶原蛋白基因hCG，或者仅其中的一条链或两条链源自于人类胶原蛋白基因hCG而其余的链则源自于鱼胶原蛋白基因。 
在一些实施例中，具有重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼的特定部位可为鱼鳞、皮肤、鱼眼等部位中的一个或其组合。 
以下通过实例更进一步地详细说明，但这些实例仅是作为举例说明，而非用以限定本发明的范围。在此，涉及的DNA序列是交由源资国际生物科技股份有限公司协助测序，而其所使用的测序机型为ABI3730Genetic Analyzer。所使用的LB（Luria-Bertaini）培养液的配制为取20g LB粉末（powder）加水至1L，然后以灭菌釜灭菌后即可使用。LB粉末（购自Bio Basic Inc.）的成份包括：10g的胰蛋白胨（Trypton）、5g的酵母提取物（Yeast extract）以及5g的氯化钠（Sodium chloride；NaCl）。LB/Amp（LB plate  with ampicillin）培养基则是在LB培养液中加入50μg/mL的氨苄青霉素（抗生素）。 
实例一：利用鱼体进行DNA提取 
在此，以野生型斑马鱼（Danio rerio，AB系）为例，利用基因组DNA纯化试剂盒（GenoMaker试剂盒）进行斑马鱼的基因组DNA的提取。GenoMaker试剂盒包括GenoMaker试剂（GenoMaker reagent）、RNA酶混合物（RNase cocktail）和乙醇沉淀缓冲液（Ethanol precipitate Buffer）。 
首先，用液态氮研磨或用组织匀浆机研磨斑马鱼组织。然后，取约10mg～100mg的研磨后的鱼组织，并以1ml GenoMaker试剂来裂解细胞以得到裂解均质的样品。将裂解均质的样品（1ml）放置于室温下3～5分钟，随后加入500μl的酚（Phenol）/氯仿（Chlorform）（1：1），并均匀混和，以得到第一混合液。将第一混合液以转速12000rpm离心5分钟后，小心吸取第一混合液的上清液到新的离心管。再加入0.7～0.8ml的异丙醇至离心管内，并均匀混和，以得到第二混合液。将第二混合液以转速12000rpm离心5分钟后，将离心管中的第二混合液的上清液去除干净，而留下沉淀物于离心管中。加入40μL的RNA酶混合物至具有沉淀物的离心管中并置于37℃中5分钟，以将半湿状态的沉淀物溶解。之后再加入600μL的乙醇沉淀缓冲液于离心管中，并均匀混和，以得到第三混合液。将第三混合液以转速12000rpm离心5分钟后，将离心管中的第三混合液的上清液去除干净，而留下沉淀物于离心管中。最后，再加入50～200uL的TE缓冲液至离心管中以溶解沉淀物，即得到鱼的基因组DNA。将得到的基因组DNA储存于-20℃，待进一步实验使用。 
实例二：克隆鱼类的启动子 
聚合酶链反应： 
以SEQ ID NO:1所示的K4启动子为例，在此正向引物采用SEQ ID NO:6所示的序列，以及反向引物采用SEQ ID NO:7所示的序列。 
依据下列表一加至0.2ml微量试管中进行聚合酶链反应，以得到第一产物。在此，聚合酶链反应的条件为阶段1：94℃反应1分钟；阶段2：58℃反应1分钟；阶段3：72℃反应1分钟10秒；并且3个阶段依序进行35个循环。 
并且，将第一产物利用1％琼脂糖凝胶电泳确认是否存在所需的K4启动子。 
表一 
Figure BDA0000375183520000091
退火（annealing）： 
依据下列表二将反应试剂加至0.2ml微量试管中进行反应（4℃、过夜），以得到第四混合液（其中具有第二载体）。 
表二 
Figure BDA0000375183520000092
Figure BDA0000375183520000101
转化（transformation）： 
在此，使用的感受态细胞为大肠杆菌（E.coli）ECOS101菌株。 
将10μl的第四混合液加入100μl的感受态细胞中，并均匀混和，以形成第一菌液。混合后，马上将第一菌液放入冰浴中约5分钟。随后，再将第一菌液放入42℃水浴中45秒进行热休克（heat-shock）反应。热休克反应后，再将第一菌液马上放入冰浴中5分钟。最后，将冰浴后的第一菌液均匀涂在LB/Amp培养基上，并静置于37℃过夜培养。 
菌落筛选： 
将前述LB/Amp培养基上的菌落重新培养在新的LB/Amp培养基上并静置于37℃过夜培养。 
第一质粒纯化： 
在此，利用Plasmid Mini-prep Purification试剂盒（质粒少量制备纯化试剂盒）（购自波仕特生物科技股份有限公司）进行第一质粒的制备。 
首先，取出1.5ml的第二菌液，以12,000×g离心5分钟。离心后，取得菌体沉淀物。 
在含有菌体沉淀物的微量离心管中加入200μl溶液Ⅰ（Resuspension  solution；重悬溶液），并振荡到菌体呈悬浮状态。再加入200μl溶液Ⅱ（裂解溶液：Lysis solution），轻轻混匀，使菌体完全溶解，以将第一质粒析出。最后，再加入200μl溶液Ⅲ（Neutralization solution；中和溶液），轻轻混合均匀。之后，再以12,000×g离心5分钟，取出上清液加入到离心层析柱（spin column）（其含有DNA吸附膜）和收集管（collection tube）中。将具有上清液的离心层析柱和收集管以12,000×g离心1分钟，使上清液中的DNA吸附于DNA吸附膜上。接着，加入350ml的清洗液（wash solution）到离心层析柱中，再以12,000×g离心1分钟，并重复一次。再将离心层析柱以转速12,000×g离心3分钟，以去除残留的酒精。最后，将离心层析柱放到新的1.5ml的微量离心管中，加入50μl的洗脱缓冲液（elution buffer）（洗脱缓冲液事先预热至68℃），静置5分钟后。最后，再以12,000×g离心3分钟，收集离心的DNA（即，第一质粒），并以限制性酶确定大小。取适量DNA以及适量的限制性酶（BamH I及Sal I），加上10X反应缓冲液（reaction buffer），并加水使体积为15μl，以形成第五混合液。将第五混合液在37℃反应至少1小时，然后以1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，以确定是否含有所要整合的K4启动子的DNA片段。 
实例三：克隆第2型人类胶原蛋白基因hCG 
聚合酶链反应： 
以SEQ ID NO:5所示的第2型人类胶原蛋白基因（hCollagen type2alpha1；hCT2A1）为例，在此正向引物采用SEQ ID NO:14所示的序列，以及反向引物采用SEQ ID NO:15所示的序列。 
依据下列表三将反应试剂加至0.2ml微量试管中进行聚合酶链反应，以得到第二产物。在此，聚合酶链反应的条件为阶段1：98℃反应10秒；阶段2：64℃反应30秒；阶段3：72℃反应4分钟30秒；并且3个阶段依序进行30个循环。 
并且，将第二产物利用1％琼脂糖凝胶电泳确认是否存在所需的人类胶原蛋白基因hCG。 
表三 
Figure BDA0000375183520000121
其中，模板DNA为人类胶原蛋白基因hCG的cDNA。 
退火： 
依据下列表四将反应试剂加至0.2ml微量试管中进行反应（22℃、4小时），以得到第六混合液（其中具有第四载体）。 
表四 
Figure BDA0000375183520000122
转化（transformation）： 
将制备的E.coli TOP10菌液加入10μl的第六混合液，并于冰上静置30分钟，随后再放入42℃水浴中1至2分钟进行热休克反应。热休克反应后，马上放入冰浴中3至5分钟，然后再加入LB培养液使其总体积为1ml，以得到第三菌液。将第三菌液于37℃下振荡培养1小时。在LB-Amp培养基上涂100μl的100mM IPTG（isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）与20μl50mg/ml的X-gel（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside；5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷），最后将第三菌液均匀涂在LB-Amp培养基上并于37℃静置培养12至16小时。 
在此，亦可以诸如报道基因分析（reporter gene assay）等快速筛菌方式初步筛选含有人类胶原蛋白基因的菌株。快速筛菌方式为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。 
第二质粒纯化： 
用微量吸管挑取白色单一菌落在试管中与10ml的LB/amp培养基混和培养8小时。然后，挑选数个菌落，并于37℃振荡培养14小时，以供纯化含有人类胶原蛋白基因hCG的第二质粒（hCT2A1-yt&A）使用。在此，利用Plasmid Mini-prep Purification试剂盒（购自波仕特生物科技股份有限公司）制备第二质粒，并以限制性酶（BamH I及Sal I）确定大小。然后以1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，以确定是否含有所要整合的人类胶原蛋白基因的DNA片段。其中，纯化方式为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。 
实例四：构建适用于第2型人类胶原蛋白基因hCG的上游基因
依据下表五，利用限制性酶（ApaI及BamHI）对第一质粒（K4-yt&A）以及第一表达载体（pT2-LFABP-tTa）进行剪切（37℃下静置作用至少2小时）而分别得到第七混合液（含K4）以及第八混合液（含pT2-tTa）。 
表五 
Figure BDA0000375183520000131
Figure BDA0000375183520000141
作用后，将第七混合液（含K4）以及第八混合液（含pT2-tTa）分别注入至1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，并切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution试剂盒（胶体DNA回收试剂组）（购自GeneMark）回收DNA产物（即，K4以及pT2-tTa）。 
依据下表六，先将两种DNA产物（即，K4以及pT2-tTa）混合并于70℃处理3分钟，然后马上置于冰浴中。随后，再加入其余试剂均匀混合，并于22℃下静置作用4小时进行反应，以得到第九混合液（其中具有上游基因）。 
表六 
Figure BDA0000375183520000142
以E.coli TOP10的菌株作为感受态细胞，并将第九混合液中的上游基因转化至E.coli TOP10中，进行培养（菌株培养）。然后，从培养出的菌株中筛选出具有上游基因的菌株，并利用纯化试剂盒纯化出上游基因 （pT2-K4-tTa）。 
其中，菌株培养方式、筛菌方式及纯化方式为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。 
实例五：构建重组质粒 
依据下表七，利用限制性酶（Sal I及BamH I）对pT2-K4-tTa以及hCT2A1-yt&A进行剪切（37℃下静置作用至少2小时）而分别得到第十混合液（含pT2-K4）以及第十一混合液（含hCT2A1）。 
表七 
Figure BDA0000375183520000151
作用后，将第十混合液（含pT2-K4）以及第十一混合液（含hCT2A1）分别注入至1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，并切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution试剂盒（胶体DNA回收试剂组）（购自GeneMark）回收DNA产物（即，pT2-K4以及hCollagen T2A1）。 
依据下表八，先将两种DNA产物（即，pT2-K4以及hCollagen T2A1）混合并以70℃处理3分钟，然后马上置于冰浴中。随后，再加入其余试剂均匀混合，并于22℃下静置作用4小时进行反应，以得到第十二混合液（其中具有第二表达载体）。 
表八 
Figure BDA0000375183520000161
以E.coli TOP10的菌株作为感受态细胞，并将第十二混合液中的第二表达载体转化至E.coli TOP10中，进行培养（菌株培养）。然后，从培养的菌株中筛选出具有第二表达载体的菌株，并利用纯化试剂盒纯化出第二表达载体（pT2-K4-hCT2A1）。 
在此，采用绿色荧光蛋白基因作为报道基因。 
依据下表九，利用限制性酶（Sal I及Cla I）对报道基因（IRES-hrGFP）以及pT2-K4-hCT2A1进行剪切（37℃下静置作用至少2小时）而分别得到第十三混合液（含IRES-hrGFP）以及第十四混合液（含pT2-K4-hCT2A1）。 
表九 
Figure BDA0000375183520000162
作用后，将第十三混合液（含IRES-hrGFP）以及第十四混合液（含pT2-K4-hCT2A1）分别注入至1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，并切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution试剂盒（胶体DNA回收试剂组）（购 自GeneMark）回收DNA产物（即，IRES-hrGFP以及pT2-K4-hCT2A1）。 
依据下表十，先将两种DNA产物（即，IRES-hrGFP以及pT2-K4-hCT2A1）混合并以70℃处理3分钟，然后马上置于冰浴中。随后，再加入其余试剂均匀混合，并于22℃下静置作用4小时进行反应，以得到第十五混合液（其中具有重组质粒）。 
表十 
Figure BDA0000375183520000171
以E.coli TOP10的菌株作为感受态细胞，并将第十五混合液中的重组质粒转化至E.coli TOP10中，进行培养（菌株培养）。然后，从培养出的菌株中筛选出具有重组质粒的菌株。其中，菌株培养方式及筛菌方式为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。 
在此，重组质粒转化至E.coli TOP10后，可加入冷冻保存液（20%Glycerol:LB=1:1）混合。 
重组质粒纯化： 
将筛选到定序确认的菌株接种至200ml LB-Amp培养液中，并在37℃下以175rpm振荡培养。培养后，以13,000×g离心5分钟，以得到取得菌体沉淀物。 
先将平衡柱（balance column）加入10ml的平衡缓冲液（equilibration buffer），然后将离心的菌体沉淀物加入4ml的细胞悬浮缓冲液（cell  suspension buffer），并振荡至没有沉淀物为止，以得到第十六混合液。 
加入4ml的细胞裂解缓冲液至第十六混合液中，并小心混合后在室温下放置5分钟。再加入4ml的中和缓冲液，并小心混合后以15,000×g离心10分钟（25℃）。离心完后将上层液吸取到平衡管柱中，并以10ml的清洗液洗两次。再加入5ml的洗脱缓冲液到平衡管柱中，收集流出的DNA溶液。 
接着，加入3.5ml的异丙醇至收集到的DNA溶液中，然后以15,000×g离心30分钟。离心后，倒出上层液留下沉淀物，再加入3ml的70﹪酒精。然后，再以15,000×g离心5分钟，以去除酒精。去除酒精后，将风干的DNA加入200μl的TE缓冲液以溶解DNA，即得到含有重组质粒（pT2-K4-hCT2A1-IRES-hrGFP）的溶液。待DNA全部溶解后，取2μl来测吸光度（OD260nm），以进行DNA定量，其余则保存在-80℃下。 
在此，降温方式可为先置于4℃中1小时，再放置于-20℃中1小时，最后再放入-80℃中保存。 
实例六：克隆第1型人类胶原蛋白基因hCG 
以SEQ ID NO:3所示的第1型人类胶原蛋白基因（hCollagen type1alpha1；hCT1A1）为例，在此正向引物采用SEQ ID NO:8所示的序列，以及反向引物采用SEQ ID NO:9所示的序列。 
实验流程大致上相同于上述实例三，在此不再赘述。在此，得到含有人类胶原蛋白基因hCG的第二质粒（hCT1A1-yt&A）。 
实例七：构建适用于第1型人类胶原蛋白基因hCG的上游基因 
依据下表十一，利用限制性酶（ApaI及BamHI）对第一质粒（K4-yt&A）以及第一表达载体（pT2-LF2.9-AmCyan1）进行剪切（37℃下静置作用至少2小时）而分别得到第十七混合液（含K4）以及第十八混合液（含pT2-AmCyan1）。 
表十一 
Figure BDA0000375183520000191
作用后，将第十七混合液（含K4）以及第十八混合液（含pT2-AmCyan1）分别注入至1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，并切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution试剂盒（胶体DNA回收试剂组）（购自GeneMark）回收DNA产物（即，K4以及pT2-AmCyan1）。 
依据下表十二，先将两种DNA产物（即，K4以及pT2-AmCyan1）混合并以70℃处理3分钟，然后马上置于冰浴中。随后，再加入其余试剂均匀混合，并于22℃下静置作用4小时进行反应，以得到第十九混合液（其中具有上游基因）。 
表十二 
Figure BDA0000375183520000192
以E.coli TOP10的菌株作为感受态细胞，并将第十九混合液中的上游 基因转化至E.coli TOP10中，进行培养（菌株培养）。然后，从培养出的菌株中筛选出具有上游基因的菌株，并利用纯化试剂盒纯化出上游基因（pT2-K4-AmCyan1）。 
其中，菌株培养方式、筛菌方式及纯化方式为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。 
实例八：构建重组质粒 
依据下表十三，利用限制性酶（Sal I及Age I）对pT2-K4-AmCyan1以及hCT1A1-yt&A进行剪切（37℃下静置作用至少2小时）而分别得到第二十混合液（含pT2-K4）以及第二十一混合液（含hCT1A1）。 
表十三 
Figure BDA0000375183520000201
作用后，将第二十混合液（含pT2-K4）以及第二十一混合液（含hCT1A1）分别注入至1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，并切下特定大小DNA片段，再利用Gel Elution试剂盒（胶体DNA回收试剂组）（购自GeneMark）回收DNA产物（即，pT2-K4以及hCT1A1）。 
依据下表十四，先将两种DNA产物（即，pT2-K4以及hCT1A1）混合并以70℃处理3分钟，然后马上置于冰浴中。随后，再加入其余试剂均匀混合，并于22℃下静置作用4小时进行反应，以得到第二十二混合液（其中具有重组质粒）。 
表十四 
Figure BDA0000375183520000211
将第二十二混合液中的重组质粒转化至E.coli TOP10中，进行培养（菌株培养）。然后，从培养出的菌株中筛选出具有重组质粒的菌株，并利用纯化试剂盒纯化出重组质粒（pT2-K4-hCT1A1）。 
再将pT2-K4-hCT1A1的重组质粒转化至E.coli TOP10中，进行培养（菌株培养）。然后，从培养出的菌株中筛选出具有pT2-K4-hCT1A1重组质粒的菌株并进行纯化，以获得构建好的pT2-K4-hCT1A1重组质粒，如图8所示。其中，实验流程大致上相同于上述实例五。 
在图8中，K4P1.2K（keratin4P1.2K）是指斑马鱼角蛋白4启动子1.2kb的片段；COL1A1是指第1型人类胶原蛋白α1的cDNA；以及Tol2是指作为转位（transposition）的转位子Tol2（transposable element of Oryzias latipes，number2）转位酶识别序列（transposase recognition sequence）。在此，以斑马鱼K4启动子ApaI/BamHI置换pT2-LF2.9-AmCyan1的LF2.9启动子ApaI/BamHI酶切位点，以成为pT2-K4-AmCyan1。然后以hCT1A1AgeI/SalI置换pT2-K4-AmCyan1的Amcyan1AgeI/XhoI（SalI与XhoI的酶切位点为同切点酶(Isoschizomers)，并且于接合后SalI及XhoI同时被破坏）而得到pT2-K4-hCT1A1。 
所述生物材料（pT2-K4-hCT1A1重组质粒）已在位于德国D-38124布伦瑞克茵荷芬斯特街7B号的德国微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏日期为2013年8月20日，保藏编号为DSM27616，分类命名为：斑马鱼角蛋白4启动子在tol2载体连接第1型α1人类胶原蛋白基因（zebrafish Keratin 4promoter link human Collagen1A1gene in tol2vector，pT2-zK4hC1A1）。 
实例九：鱼类胚胎的制备： 
将野生型斑马鱼（Danio rerio，AB系）的成鱼在28℃恒温下饲养。饲 养条件为光周期设定14小时日光/10小时暗室，并早晚喂食饲料。 
固定早上进行公母混缸（公：母=2：1）以交配产卵。交配约30～40分钟后收集胚胎（此时胚胎的时期约为一细胞期（1-cell stage）），以供基因克隆使用。 
实例十：欲引入的重组质粒的制备： 
依据下表十五，将反应试剂混合均匀，然后37℃下静置作用至少3小时，以利用适当的限制性酶将构建好的重组质粒（如同实例五或实例八的产物）变成线性的DNA。 
表十五 
Figure BDA0000375183520000221
利用Gel Elution试剂盒（购自GeneMark）回收DNA产物，并加入适量的无菌水回溶DNA，以使线型DNA的最后浓度为0.1μg/μl。 
在显微注射前，先取40μl线型DNA与5μl的1％追踪染剂（在此使用酚红（phenol red））均匀混合，以得到第二十三混合液。将第二十三混合液保存在-20℃下，等待显微注射用。 
实例十一：重组质粒的引入 
将收集的胚胎置于琼脂糖凝胶的沟内，使之固定胚胎。透过显微注射方式将前述的第二十三混合液注入固定的胚胎内。 
注射后的胚胎移入孵化槽中培养24小时，再经由荧光显微镜观察在胚 胎上表达的绿色荧光蛋白（hrGFP），并拍照纪录。在此，荧光蛋白表达即代表人类胶原蛋白基因也有表达。 
以转基因胚胎建立亲代（F0代）的转基因斑马鱼。再将F0代的转基因斑马鱼养至性成熟（约3-5个月），可与野生型斑马鱼的种鱼进行交配，以获得有荧光表达的F1代（子代）转基因斑马鱼。F1代转基因斑马鱼再经3-5个月饲养，即可交配产生F2代（子代）转基因斑马鱼。 
在此，K4角蛋白可驱动人类胶原蛋白基因表达在鱼鳞上，即使得转基因斑马鱼分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白于鱼鳞上。 
虽然在此是利用报道基因确认引入的重组基因结构的表达，但本发明不限于此。本领域技术人员都应该知晓对于具有重组基因结构的鱼体的检验方法能以任何适合方法进行。例如，可以PCR检查该鱼体的染色体，以检测出其是否具有重组基因结构。针对重组基因结构的表达产物（重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白）进行检测，则可以检测出实际上表达转基因的鱼体。再者，目前公知可用于转基因动物的相关检验方法亦可应用于转基因鱼体的鉴定，例如：以RNA印迹法或DNA印迹法来检测鱼体中是否具有转基因的核酸序列、或使用聚合酶链反应以及其它具有序列特异性的核酸扩增技术来进行上述检测。 
实例十二：重组质粒的引入 
另外，可参照日本Kawakami学者所发展的转基因技术，以细胞外转录（in-vitro transcription）合成Tol2转位酶mRNA，并与第二十三混合液一同显微注射至斑马鱼胚胎中。转基因技术请参考下列文献“Transposon tools and methods in zebrafish（斑马鱼的转位子工具及方法）”Dev.Dyn.234(2):244-254,2005。 
实例十三：生物材料的制备 
由转基因鱼收集一个或多个鱼鳞，并将收集到的鱼鳞经过洗净、去细胞及脱水等处理步骤，以将各个鱼鳞处理成具有重组人类前胶原蛋白或胶 原蛋白的生物材料。 
在此，可再进行挤压步骤，以将前述处理后的单个或多个鱼鳞挤压成特定形状和/或特定尺寸的具有重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的生物材料。 
再者，在挤压前，可先将前述处理后的单个或多个鱼鳞进行研磨处理。此外，研磨后的鱼鳞颗粒可通过过筛将不同粒径的粉末分离，而以不同粒径的粉末提供具有重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的生物材料。 
另外，这些生物材料还可进行灭菌，以产生无菌的生物材料。 
相关处理步骤可参考美国第12/324,551、12/659,282、12/880,349及13/019,134号专利申请。 
实例十四：E.coli TOP10感受态细胞的制备 
在此，使用的E.coli TOP10的基因型为F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ΔlacΧ74recA1araD139Δ(ara-leu)7697galU galK rpsL(StrR)endA1nupGλ-。 
取E.coli TOP10于适量的LB培养基中过夜培养，再取其至5ml的LB/Amp培养基（加入约1/100体积菌液）中进行二次培养，置于37℃的培养箱中振荡摇晃至OD600吸光度为约0.5-0.6之间。 
接下来的步骤全部在冰上操作。将菌液置于冰上放置10分钟，接着取2mL培养至OD值为0.5的菌液以4000×g在4℃下离心3分钟（或以5000xg于4℃离心4分钟）。离心完成后，以微量移液器（pippet）去除上清液，再加入1mL的250mM（或200mM）氯化钙（CaCl2），混合均匀使菌完全回溶。再将回溶的菌液置于冰上10分钟后，再次离心。离心完成后，再以移液器去除上清液，然后再加入CaCl2约150μl至200ml，混合均匀使菌完全回溶，放置冰上10分钟以上，供进一步使用。 
综上，根据本发明的重组载体及应用其而产生的转基因鱼卵与生物材料可提供能于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为 生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。 
虽然本发明以前述的实施例公开如上，然其并非用于限制本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内可进行修改和变化，因此本发明的专利保护范围应由本说明书所附的权利要求界定。 
符号说明 
S10构建具有人类胶原蛋白基因的重组载体 
S20利用限制性酶将构建好的重组载体变成线性 
S30将线性的重组载体引入鱼类的胚胎中以整合到胚胎中的鱼类染色体中 
S110克隆鱼类的启动子（或/和增强子） 
S120克隆人类胶原蛋白基因 
S130利用克隆的启动子（或/和增强子）与第一表达载体构建上游基因 
S140利用克隆的人类胶原蛋白基因以及上游基因构建重组载体 
S111设计对应于启动子（或增强子）的氨基酸序列的正向引物与反向引物 
S112利用鱼体进行DNA提取以得到基因组DNA 
S113利用所取得的基因组DNA作为模板以及对应的正向引物及反向引物作为引物进行聚合酶链反应以得到第一产物 
S114将得到的第一产物与第一载体接合以产生第二载体 
S115将第二载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有启动子（或增强子）的菌株 
S116由含有启动子（或增强子）的菌株中纯化出所需的启动子（或增强子）并利用琼脂糖凝胶电泳确认 
S121设计对应于人类胶原蛋白基因的氨基酸序列的正向引物与反向引物 
S122利用人类细胞进行RNA的提取，并通过柱层析进行分离和纯化以取得mRNA 
S123使用所取得的mRNA作为模板及设计的反向引物作为引物进行反转录以得到cDNA 
S124利用所取得的cDNA作为模板以及对应的正向引物及反向引物作为引物进行聚合酶链反应以得到第二产物 
S125将得到的第二产物与第三载体接合以产生第四载体 
S126将第四载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有人类胶原蛋白基因的菌株 
S127由含有人类胶原蛋白基因的菌株中纯化出所需的人类胶原蛋白基因并利用琼脂糖凝胶电泳确认 
S131利用限制性酶分别对启动子（或增强子）以及第一表达载体进行剪切 
S132接合剪切后的启动子（或增强子）以及第一表达载体以形成上游基因 
S133将上游基因体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有启动子（或增强子）的菌株 
S134由含有启动子（或增强子）的菌株中纯化出所需的上游基因并利用琼脂糖凝胶电泳确认 
S141利用限制性酶分别对人类胶原蛋白基因以及上游基因进行剪切 
S142接合剪切后的人类胶原蛋白基因以及上游基因以形成第二表达载体 
S143将第二表达载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到 
含有人类胶原蛋白基因的菌株 
S144由含有人类胶原蛋白基因的菌株中纯化出所需的第二表达载体并利 
用琼脂糖凝胶电泳确认 
S145利用限制性酶分别对纯化的第二表达载体以及报道基因进行剪切 
S146接合剪切后的第二表达载体以及报道基因以形成重组载体 
S147将重组载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有报道基因的菌株 
S148由含有报道基因的菌株中纯化出所需的重组载体并利用琼脂糖凝胶 电泳确认 
UG上游基因 
hCG人类胶原蛋白基因 
RG报道基因 
Figure IDA0000375183600000011
Figure IDA0000375183600000021
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Claims (10)

1.一种生物材料，包括：由鱼体获得的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的生物材料，进一步包括该鱼体的至少鱼鳞，其中各该鱼鳞具有表达的该重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
3.如权利要求1所述的生物材料，其中该重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白是由人类胶原蛋白基因在该鱼体表达的。
4.一种转基因鱼卵，包括：
鱼类染色体；以及
重组载体，其整合到该鱼类染色体中，其中该重组载体包括人类胶原蛋白基因。
5.如权利要求4所述的转基因鱼卵，其中该重组载体进一步包括上游基因，该人类胶原蛋白基因连接在该上游基因的下游。
6.如权利要求5所述的转基因鱼卵，其中该上游基因为在鱼体中存在的启动子、增强子或其组合。
7.如权利要求4或5所述的转基因鱼卵，其中该重组载体进一步包括报道基因，该报道基因连接在该人类胶原蛋白基因的下游。
8.一种重组载体包括：
上游基因，由鱼体获得；以及
人类胶原蛋白基因，连接在该上游基因的下游。
9.如权利要求8所述的重组载体，进一步包括报道基因，该报道基因连接在该人类胶原蛋白基因的下游。
10.如权利要求8所述的重组载体，其中该上游基因为在该鱼体中普遍存在的启动子、增强子或其组合。
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