CN102191249B - 家蚕Bmlp3基因启动子及其运用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及家蚕Bmlp3基因启动子，如SEQIDNO:1所示，该启动子可用于在脂肪体中表达外源蛋白，本发明还包括用于家蚕脂肪体表达外源蛋白的显微注射载体的制备方法，具体为：含有家蚕Bmlp3基因启动子的重组表达载体、表达框的构建及显微注射载体的制备；Bmlp3基因启动子可实现外源蛋白在脂肪体最为发达的发育阶段内进行表达，本方法可实现表达时期的可控性，由piggBac来源的转座子介导的转基因具有稳定性高、可遗传等特征，通过继代饲养可迅速扩大群体，为外源蛋白纯化提供量上的保证。

Description

家蚕Bmlp3基因启动子及其运用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及家蚕Bmlp3基因启动子及其运用。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫，曾为中华民族文化经济社会发展做出了极为重要的贡献。同时，其遗传背景清楚，遗传资源丰富，又是国际公认的鳞翅目模式昆虫。家蚕的重要性状之一就是末龄幼虫脂肪体具有高效合成蛋白质的能力，在五龄后期至化蛹这段时间内，蚕的脂肪体非常发达，约占体重的30%，基于这一特点，将其开发成新型生物反应器，可以利用转基因蚕生产更多种类的有用蛋白，拓宽家蚕的应用领域，提高家蚕的应用价值，推动我国蚕学与昆虫学科的长远发展。

自基于piggBac转座子为介导的家蚕转基因技术获得成功以来，这项技术已经运用于家蚕基因功能的研究以及将转基因家蚕作为“生物工厂”的探索，例如Ras基因功能的研究，丝心和丝胶蛋白基因启动子的鉴定等等，这些都为本研究的工作开展打下了良好的基础。

30K蛋白是家蚕末龄幼虫血液中的主要蛋白，lp3基因是其家族中成员之一，它的以下特征促使将其调控元件作为开发脂肪体生物反应器的启动子：①脂肪体特异表达：所有的30K蛋白基因都是在脂肪体中合成后分泌到血液中，脂肪体是其转录合成的场所；②强大的转录效率：目前鉴定的30K家族成员已达到10个之多，它们的表达水平差异很大，lp3是其中表达量最高的基因之一；③时期表达相对集中：lp3基因从五龄中后期到蛹期这段时间内转录合成，与脂肪体蛋白质含量最高的时期相吻合。这些特征为利用家蚕Bmlp3基因启动子在脂肪体表达外源蛋白提供了理论支持，而且在利用piggBac来源的转座子介导的家蚕转基因的研究报道中，有关利用家蚕30K蛋白基因启动子在脂肪体表达外源蛋白的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基因启动子，该启动子以家蚕的基因组为模板，通过设计的lp3启动子上下游引物来扩增得到的。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述家蚕Bmlp3基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。   

上述序列的获得步骤为：以家蚕品种P50五龄三天的基因组为模板进行PCR扩增，上游引物为：5′-ggaattccagtatagttacaacggctgcccc-3′，下游引物为：5′-cgggatcccgcgtcgagtcctgcaatatgt-3′,扩增条件为94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸80秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

     本发明的目的之二在于提供家蚕Bmlp3基因启动子的运用，该运用为开发家蚕脂肪体外源蛋白表达的生物反应器提供了新思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

所述的家蚕Bmlp3基因启动子在脂肪体中表达外源蛋白的运用。

进一步，所述家蚕Bmlp3基因启动子在脂肪体中表达红色荧光蛋白的运用。

本发明的目的之三在于提供一种重组载体，所述重组载体注射到家蚕早期胚胎后可导致脂肪体表达外源蛋白。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕Bmlp3基因启动子的重组载体，所述重组载体为Bmlp3-DsRed-SV40片段同基础载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接而成的pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体。

本发明的目的之四在于提供一种显微注射载体的制备方法，该方法操作简单。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

用于家蚕脂肪体表达外源蛋白的显微注射载体的制备方法，具体包括以下步骤：

A、pMD19-Bmlp3的构建

如SEQ ID NO:1所示的家蚕Bmlp3基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19-Bmlp3；

B、pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]的构建

分别用EcoR I和BamHⅠ双酶切pMD19-Bmlp3质粒，回收家蚕Bmlp3基因启动子与分别用EcoR I和BamHⅠ双酶切的pSL[MCS-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]；

C、显微注射载体的制备

用AscⅠ酶切步骤B所得pSL[Bm lp3-DsRed-SV40]，将切下的Bmlp3-DsRed-SV40片段连接到AscⅠ酶切的pBac[3xP3-EGFPafm]基础载体，构建成pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体。

进一步，步骤A中，以家蚕基因组为模板进行PCR扩增，其中，上游引物为：5′-ggaattccagtatagttacaacggctgcccc-3′，下游引物为：5′-cgggatcccgcgtcgagtcctgcaatatgt-3′；扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸80秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，得如SEQ ID NO:1所示的家蚕Bmlp3基因启动子，将其与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19-Bmlp3。

本发明的目的之五在于提供pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体的运用，该运用该运用为开发家蚕脂肪体外源蛋白表达的生物反应器提供了新思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体在家蚕脂肪体中表达外源蛋白的应用。

 [0013] 有益效果：1）利用家蚕脂肪体蛋白质的高效合成与储存能力：蚕的脂肪体非常发达，特别在五龄中后期至化蛹这段时间内，其脂肪体约占体重的30%。如果按一头蚕（五龄盛食期）平均体重为5g计算，其脂肪体蛋白含量最高可达到1.5g左右。2）表达时期的可控性：利用Bmlp3基因启动子，可实现外源蛋白在脂肪体最为发达的发育阶段内进行表达；不管是在幼虫期还是蛹期，外源蛋白的特性不会受到影响。3）下游分离纯化的简便性：脂肪体蛋白的分离纯化相对较为简单，在目前的工业生产和实验室研究中均有比较成熟的分离纯化技术体系。利用脂肪体表达的有用蛋白，甚至可不需纯化而直接将蚕幼虫或蛹加工成粉末，作为生产食品、保健品或动物饲料添加剂等的原材料；4）对传统产业的影响小：自古以来，家蚕主要被用于生产蚕丝，按目前我国年均产蚕茧80万吨计算，每年可产生蚕蛹副产物约56万吨。如能利用蚕蛹脂肪体生产有用蛋白，既充分利用了工业生产中废弃的大量蚕蛹资源，又不会影响其主要的蚕丝生产，有利于显著提高产业的综合效益和农民养蚕收益。加之家蚕所具有的遗传背景清楚、高等真核生物的蛋白质后修饰加工、大规模生产成本低和对人畜安全等，满足了新一代生物反应器的基本要求，其开发潜力巨大。5)由piggBac来源的转座子介导的转基因具有稳定性高、可遗传等特征，通过继代饲养可迅速扩大群体，为外源蛋白纯化提供量上的保证。

附图说明

     图1为包含不同长度的Bmlp3启动子的载体转染Bm E细胞后的活性分析，Luc-F1到Luc-F7代表包含不同长度的Bmlp3启动子的载体和pGL3-Basic对照载体，箭头表示转录起始位点与转录方向；长方形表示TATA框，黑方框代表非翻译区，条纹框表示内含子；

图2为转基因家蚕个体的荧光观察后的灰度处理照片，a.卵(白光下)  b.卵(荧光下)  c.成虫(白光下)  d.成虫(荧光下)；

图3为转基因家蚕个体的Southern blot分析，1为G1代蚕蛾DNA（Hind Ⅲ酶切）， 2为G1代蚕蛾DNA（Bgl Ⅱ酶切），3为正常蚕蛾DNA（Bgl Ⅱ酶切）。  

图4为转基因家蚕的荧光观察的灰度处理照片，a, c, e, g, i, k 为白光下观察，b, d, f, h, j, l 为荧光下观察；

图5为转基因蚕中红色荧光蛋白在不同组织中的Western blot分析，1 Marker, 2 对照，3 丝腺，4 中肠，5 脂肪体，6 标准品。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1 家蚕Bmlp3基因启动子的获得

启动子元件的PCR扩增是以家蚕品种P50五龄三天的基因组为模板，根据设计的lp3启动子上下游引物来扩增得到，具体构建如下：

首先是启动子元件的获得：Bmlp3启动子由lp3基因5′-上游序列，外显子1，内含子1和外显子2的17bp组成，它不含lp3基因的信号肽序列，由上下游引物以家蚕品种P50五龄三天的基因组为模板扩增获得，上游引物P-f含有一个EcoR I位点：5′-ggaattcCAGTATAGTTACAACGGCTGCCCC-3′，下游引物P-r含有一个BamH I位点：5′-cgggatccCGCGTCGAGTCCTGCAATATGT-3′,扩增条件为94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸80秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

家蚕基因组中扩增获得的Bmlp3启动子经克隆和测序验证，其序列长度为1 119 bp。对克隆的Bmlp3启动子序列进行分析发现：该序列含有Bmlp3基因的第1外显子、第1内含子、第2外显子的一部分、核心启动区域和5′端旁侧区，跨于基因的-374 到+745位置，其DNA序列为：

agtatagtta caacagctgc cccacccttc aaaccgaaac gcattactgc ttcacggcag  

aaataggcag ggtggtggta cctaaccgtg cgaatccata cgaaaatatt aatattagca  

aaacaaatat acctttcaca tggcatgttt taaactacca cgaacaatgt gaatttttaa  

atgtgtccat taaaattaca catttaaatt ataatgttga cggcttgata atttcactca  

atcaataata aactatatct ttatttcaat gcactttcat ttgacatttg aactatgatg  

ttgatattgc atctgacgtt tttaattcaa aacaatttcg agtataaaag gcagagtttc   

aaaggaaaca ggcagttcgt tcttgggtaa cacacaggtg agatacattt tgtttttaac  

tctggagaat ccgtttcgga tacccagtcg tggggggtaa cagaccgggt tatgtcagac  

ttcggttcct ccaaggaaga gggagaccga ggtcctcctc ttcttctaat tcctgtcgag 

agtctacgtc ttgagatatc tacctaccac acaaaaacgt tttcttctat ttagcgtttg 

ttaaattgta agagtttgag aaaccaattg gccgatattt cgacctctgg catttttttc 

atcactccgc tgacttttct tattcttttt attgcttaga tgggtgaacg agctcacagc 

ccacctggtg ttaagtggtt accggagccc atagacattt acaacgtaaa tgccccaccc 

accttgaaat ttaaggtcta agatctcaag tataggtact tcttgtactg gtctccaaac 

accgatcgta tgaattttgt atcagtggat ataaaattat acactaagat gtttatgtgt 

ctaagctttc aaagaagtca aatatataat atactttttt atttaacaat taatttgtca 

agttcgtttt tgctatatac tcacaaaatc tgcgaccgtt ttgtctcata tatacatcaa 

atatacatat tatgttcaat tctcaatgtg tataattcaa cttacgtttt taaaattcta 

atccttaaca aataatttta catattgcag gactcgacg                            

利用克隆获得的Bmlp3启动子，以含有荧光素酶(luc)报告基因的pGL3-Basic为基础载体，构建Bmlp3-LUC瞬时表达质粒，通过转染Bm E细胞株，检测其启动活性。另外，构建缺失不同调控区域的Bmlp3-LUC瞬时表达质粒，通过Bm E细胞转染实验，确定与表达量调控相关的关键元件。实验结果如图1所示，表明⑴在Bm E细胞中克隆的Bmlp3基因启动子驱动荧光素酶基因强烈的表达，表明Bmlp3启动子在Bm E细胞中有较高的活性；⑵从启动子截短后荧光素酶活的效率比较中可以看出，当启动子从-250bp截短到-150bp的时候，荧光素酶活有一个比较明显的降低，表明截短的这100bp内含有一个转录增强元件；⑶载体LUC-F2与LUC-F7相比，启动子区域多了第一内含子与第二外显子的一部分，然而荧光素酶的活性却大大增强，表明第一内含子与第二外显子的一部分在Bmlp3启动子的活性中起到一个明显的负调控作用。

实施例2 含有家蚕Bmlp3基因启动子的重组载体的获得

本发明利用的pBac[3xP3-EGFPafm]注射转座子载体是piggBac衍生来载体。显微注射载体pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]是参照Horn & Wimmer(2000)利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体采用两步克隆法构建的：将实施例所得，即如SEQ ID NO:1所示的家蚕Bmlp3基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19-Bmlp3；然后是在穿梭载体pSLfa1180fa上构建完整的表达框，如SEQ ID NO:4所示，具体为：分别用EcoR I和BamHⅠ双酶切步骤A所得重组表达载体，得pMD19-Bmlp3质粒，回收家蚕Bmlp3基因启动子，将pMD19-Bmlp3质粒与分别用EcoR I和BamHⅠ双酶切的pSL[MCS-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成pSL[Bm lp3-DsRed-SV40]。

用AscⅠ酶切步骤B所得pSL[Bm lp3-DsRed-SV40]，将切下的Bmlp3-DsRed-SV40片段连接到AscⅠ酶切的pBac[3xP3-EGFPafm]基础载体，构建成pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体。

表达框的序列如下：

agtatagtta caacggctgc cccacccttc aaaccgaaac gcattactgc ttcacggcag      60

aaataggcag ggaggtggta tctaaccgtg cgaatccata cgaaaatatt aatattagca     120

aaacaaatat acctttcaca tggcatgttt taaactacca cgaacaatgt gaatttttaa     180

atgtgtccat taaaattaca catttaaatt ataatgttga cggcttgata atttcactca     240

atcaataata aactatatct ttatttcaat gcactttcat ttgacatttg aactatgatg     300

ttgatattgc atctgacgtt ttttaattca aaacaatttc gagtataaaa ggcagagttt     360

caaaggaaac aggcagttcg ttcttgggta acacacaggt gagatacatt ttgtttttaa     420

ctctggagaa tccgtttcgg atacccagtc gtggggggta acagaccggg ttatgtcaga     480

cttcggttcc tccaaggaag agggagaccg aggtcctcct cttcttctaa ttcctgtcga     540

gagtctacgt cttgagatat ctacctacca cacaaaaacg ttttcttcta tttagcgttt     600

gttaaattgt aagagtttga gaaaccaatt ggccgatatt tcgacctctg gcattttttt     660

catcactccg ctgacttttc ttattctttt tattgcttag atgggtgaac gagctcacag     720

cccacctggt gttaagtggt taccggagcc catagacatt tacaacgtaa atgccccacc     780

caccttgaaa tttaaggtct aagatctcaa gtataggtac ttcttgtact ggtctccaaa     840

caccgatcgt atgaattttg tatcagtgga tataaaatta tacactaaga tgtttatgtg     900

tctaagcttt caaagaagtc aaatatataa tatacttttt tatttaacaa ttaatttgtc     960

aagttcgttt ttgctatata ctcacaaaat ctgcgaccgt tttgtctcat atatacatca    1020

aatatacata ttatgttcaa ttctcaatgt gtataattca acttacgttt ttaaaattct    1080

aatccttaac aaataatttt acatattgca ggactcgacg cgggatccat ggtgcgctcc    1140

tccaagaacg tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc gcatggaggg caccgtgaac    1200

ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg ccacaacacc    1260

gtgaagctga aggtgaccaa gggcggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtccccc    1320

cagttccagt acggctccaa ggtgtacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacaag    1380

aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc    1440

gtggtgaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggct gcttcatcta caaggtgaag    1500

ttcatcggcg tgaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg    1560

gaggcctcca ccgagcgcct gtacccccgc gacggcgtgc tgaagggcga gatccacaag    1620

gccctgaagc tgaaggacgg cggccactac ctggtggagt tcaagtccat ctacatggcc    1680

aagaagcccg tgcagctgcc cggctactac tacgtggact ccaagctgga catcacctcc    1740

cacaacgagg actacaccat cgtggagcag tacgagcgca ccgagggccg ccaccacctg    1800

ttcctgtagc ggccgcgact ctagatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta    1860

cttgctttaa aaaacctccc acacctccca taatggttac aaataaagca atagcatcac    1920

aaatttcaca aataaagcat ttttttcacc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg    1980

ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttctg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc    2040

aatgtatctt aaagctt                                                            2057

实施例3  家蚕Bmlp3基因启动子在脂肪体中表达外源蛋白的运用

pHA3PIG(Tamura et al.,2000)被用作辅助质粒产生转座酶，用QIAGEN Plasimd Mini Kit（Qiagen）质粒抽提试剂盒分别提取pBac[BmLSP-DsRed-SV40,3xP3EGFP]和pHA4PIG质粒按1∶1摩尔比混合后显微注射至357粒已解除滞育的大造早期胚胎（G0代）(产卵后2～5 h)注射后的蚕卵用无毒脱水封口， 25℃催青至孵化， 孵化的幼虫(G0代)采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵（第7天）在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10, 日本)下检测，绿色荧光观察采用波长为460 ～ 490 nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性个体，如图2所示，其中1个蛾圈中有5个筛选出了阳性个体，阳性蛾圈率为16%。挑选阳性个体于胚胎发育后期开始进行连续的荧光检测，发现在幼虫5龄4天时可观察到蚕体尾部发出红色荧光，详见图4，并且随着转基因蚕的发育，红色荧光越来越强，直到整个蚕体都发出红色荧光。在5龄7天时将其解剖后观察发现：红色荧光从脂肪体中发出，且红色荧光蛋白的表达没有性别差异；其它组织中如丝腺、中肠、生殖腺等没有观察到红色荧光。整个蛹期都能观察到强烈的红色荧光蛋白，在蛾期时红色荧光下降并消失。

最后，获得的转基因阳性个体饲养、传代，并在mRNA和蛋白水平进行表达的检测。

启动子特异表达的检测和表达效率的测量可用如下方法：通过Southern blot检测外源基因的插入。在G1代回交制种后，随机挑选G1代转基因蚕蛾提取基因组DNA，用限制性内切酶Hin d Ⅲ和BglⅡ消化过夜，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后转移到尼龙膜上，然后按照DIG DNA Labeling and Detection Kit（Roche公司产品）使用方法进行预杂交、杂交、洗膜和显色检测。杂交探针为地高辛标记的EGFP全长cDNA序列。结果如图3所示：EGFP的插入拷贝数为1个，DsRed与EGFP处在同一个转座子区域中，其插入拷贝数也为1个，表明携带DsRed的piggyBac转座元件在转基因阳性个体的基因组中发生了1次转座事件。

通过RT-PCR检测红色荧光蛋白在mRNA水平的组织与时期特异性。将单拷贝个体回交制种，于G2代蚕卵发育至第6天时筛选出阳性个体，分别取不同发育时期（自4龄直至化蛾）的个体作为材料，并于5龄7天取脂肪体、丝腺、中肠等组织，在液氮中瞬时冷却后放入－80 ℃冰箱备用。抽提所取材料的总RNA，反转录合成cDNA，分别采用DsRed基因特异引物进行RT-PCR检测，以Actin3作为对照。引物序列为：5'-atggtgcgctcctccaagaacg-3'，5'-ctacaggaacaggtggtggcgg-3'，反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共24个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

通过Western blot检测红色荧光蛋白的组织特异性与表达量。取5龄7天脂肪体、丝腺、中肠等组织液氮研磨后溶于1XPBS缓冲液中室温过夜，离心后取上清，测定总蛋白浓度后作为实验分析的样品。这些样品与5X加样缓冲液混合并在100℃变性10分钟后上样于10% SDS-聚丙稀酰胺胶并进行Western blot分析。Western blot分析的抗体是Anti-DsRed(Gene Co),DsRed量的估计的标准品是利用Pure recombinant DsRed with His-tag（BaiRui. Co）。在5龄7天时分别取丝腺、中肠、脂肪体等组织，以大造P50为对照，商品化红色荧光蛋白为标准品，结合红色荧光蛋白抗体进行Western blot分析，结果表明在蛋白水平上，表达的红色荧光蛋白只在脂肪体中监测出来，其它组织中没有信号，详见图5，该结果说明，BmLP3启动子驱动的DsRed可在脂肪体中特异表达。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  西南大学

<120>  家蚕Bmlp3基因启动子及其运用

<160>  8

<210>  1

<211>  1119

<212>  DNA

<213>  家蚕(Bombyx mori)P50

<220> 

<223>  家蚕Bmlp3基因启动子

<400>  1

agtatagtta caacagctgc cccacccttc aaaccgaaac gcattactgc ttcacggcag      60

aaataggcag ggtggtggta cctaaccgtg cgaatccata cgaaaatatt aatattagca     120

aaacaaatat acctttcaca tggcatgttt taaactacca cgaacaatgt gaatttttaa     180

atgtgtccat taaaattaca catttaaatt ataatgttga cggcttgata atttcactca     240

atcaataata aactatatct ttatttcaat gcactttcat ttgacatttg aactatgatg     300

ttgatattgc atctgacgtt tttaattcaa aacaatttcg agtataaaag gcagagtttc     360

aaaggaaaca ggcagttcgt tcttgggtaa cacacaggtg agatacattt tgtttttaac     420

tctggagaat ccgtttcgga tacccagtcg tggggggtaa cagaccgggt tatgtcagac     480

ttcggttcct ccaaggaaga gggagaccga ggtcctcctc ttcttctaat tcctgtcgag     540

agtctacgtc ttgagatatc tacctaccac acaaaaacgt tttcttctat ttagcgtttg     600

ttaaattgta agagtttgag aaaccaattg gccgatattt cgacctctgg catttttttc     660

atcactccgc tgacttttct tattcttttt attgcttaga tgggtgaacg agctcacagc     720

ccacctggtg ttaagtggtt accggagccc atagacattt acaacgtaaa tgccccaccc     780

accttgaaat ttaaggtcta agatctcaag tataggtact tcttgtactg gtctccaaac     840

accgatcgta tgaattttgt atcagtggat ataaaattat acactaagat gtttatgtgt     900

ctaagctttc aaagaagtca aatatataat atactttttt atttaacaat taatttgtca     960

agttcgtttt tgctatatac tcacaaaatc tgcgaccgtt ttgtctcata tatacatcaa    1020

atatacatat tatgttcaat tctcaatgtg tataattcaa cttacgtttt taaaattcta    1080

atccttaaca aataatttta catattgcag gactcgacg                                1119

<210> 2

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  家蚕Bmlp3基因启动子引物F

<400>  2

ggaattccag tatagttaca acggctgccc c  31

 

<210> 3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

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<223>  家蚕Bmlp3基因启动子引物R

<400>  3

cgggatcccg cgtcgagtcc tgcaatatgt   30

 

<210>  4

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  lp3基因表达框

<400>  4

agtatagtta caacggctgc cccacccttc aaaccgaaac gcattactgc ttcacggcag      60

aaataggcag ggaggtggta tctaaccgtg cgaatccata cgaaaatatt aatattagca     120

aaacaaatat acctttcaca tggcatgttt taaactacca cgaacaatgt gaatttttaa     180

atgtgtccat taaaattaca catttaaatt ataatgttga cggcttgata atttcactca     240

atcaataata aactatatct ttatttcaat gcactttcat ttgacatttg aactatgatg     300

ttgatattgc atctgacgtt ttttaattca aaacaatttc gagtataaaa ggcagagttt     360

caaaggaaac aggcagttcg ttcttgggta acacacaggt gagatacatt ttgtttttaa     420

ctctggagaa tccgtttcgg atacccagtc gtggggggta acagaccggg ttatgtcaga     480

cttcggttcc tccaaggaag agggagaccg aggtcctcct cttcttctaa ttcctgtcga     540

gagtctacgt cttgagatat ctacctacca cacaaaaacg ttttcttcta tttagcgttt     600

gttaaattgt aagagtttga gaaaccaatt ggccgatatt tcgacctctg gcattttttt     660

catcactccg ctgacttttc ttattctttt tattgcttag atgggtgaac gagctcacag     720

cccacctggt gttaagtggt taccggagcc catagacatt tacaacgtaa atgccccacc     780

caccttgaaa tttaaggtct aagatctcaa gtataggtac ttcttgtact ggtctccaaa     840

caccgatcgt atgaattttg tatcagtgga tataaaatta tacactaaga tgtttatgtg     900

tctaagcttt caaagaagtc aaatatataa tatacttttt tatttaacaa ttaatttgtc     960

aagttcgttt ttgctatata ctcacaaaat ctgcgaccgt tttgtctcat atatacatca    1020

aatatacata ttatgttcaa ttctcaatgt gtataattca acttacgttt ttaaaattct    1080

aatccttaac aaataatttt acatattgca ggactcgacg cgggatccat ggtgcgctcc    1140

tccaagaacg tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc gcatggaggg caccgtgaac    1200

ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg ccacaacacc    1260

gtgaagctga aggtgaccaa gggcggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtccccc    1320

cagttccagt acggctccaa ggtgtacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacaag    1380

aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc    1440

gtggtgaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggct gcttcatcta caaggtgaag    1500

ttcatcggcg tgaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg    1560

gaggcctcca ccgagcgcct gtacccccgc gacggcgtgc tgaagggcga gatccacaag    1620

gccctgaagc tgaaggacgg cggccactac ctggtggagt tcaagtccat ctacatggcc    1680

aagaagcccg tgcagctgcc cggctactac tacgtggact ccaagctgga catcacctcc    1740

cacaacgagg actacaccat cgtggagcag tacgagcgca ccgagggccg ccaccacctg    1800

ttcctgtagc ggccgcgact ctagatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta    1860

cttgctttaa aaaacctccc acacctccca taatggttac aaataaagca atagcatcac    1920

aaatttcaca aataaagcat ttttttcacc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg    1980

ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttctg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc    2040

aatgtatctt aaagctt                                                            2057

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  DsRed 引物F

<400>  5

atggtgcgct cctccaagaa cg               22

 

<210> 6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  DsRed 引物R

<400>  6

ctacaggaac aggtggtggc gg               22

 

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  Actin3 引物 F

<400>  7

aacaccccgt  cctgctcact  g              21

 

<211>  8

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  Actin3 引物 R

<400>  8

gggcgagacg  tgtgatttcc  t            21

 

Claims (5)

1.家蚕Bmlp3基因启动子，其特征在于，所述家蚕Bmlp3基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的家蚕Bmlp3基因启动子在家蚕脂肪体中表达外源蛋白的运用。

3.根据权利要求2所述的运用，其特征在于，所述外源蛋白为红色荧光蛋白。

4.含有权利要求1所述的家蚕Bmlp3基因启动子的重组载体，所述重组载体为Bmlp3-DsRed-SV40片段同基础载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接而成的pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体。

5.权利要求4所述pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体在家蚕脂肪体中表达外源蛋白的应用。

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