CN101492678A - 家蚕丝腺特异表达的HLH转录调控因子BmHLH2及用途 - Google Patents

Abstract

一种家蚕丝腺特异表达的HLH转录调控因子BmHLH2，通过对丝腺基因的表达谱进行分析，并经过基因芯片制作及杂交、芯片数据分析等一系列生物技术克隆得到。本发明所获得的HLH型转录调控因子为家蚕丝腺特异表达的新型转录调控因子，荧光定量PCR实验证实其与丝腺的发育、丝腺细胞的分化有重要的联系，对BmHLH2基因的干涉研究表明，HLH型转录因子对细胞分化、器官的特化及基因的特异表达有重要的调控作用。这些研究成果对于提高家蚕产丝量，改善蚕丝品质，促进蚕丝产业发展具有重要意义。

Description

家蚕丝腺特异表达的HLH转录调控因子BmHLH2及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕丝腺特异表达的转录调控因子。

背景技术

丝腺是家蚕唯一能生产茧丝的器官，是整个蚕丝业的生物学基础，一头家蚕一般经过25d左右的生长发育，在幼虫期食下鲜桑叶约22g，合成并分泌0.5～1g的丝蛋白，特别是在5龄中、后期，家蚕能够以惊人的效率将桑叶蛋白转变成丝蛋白。它合成蛋白质的能力和效率，是迄今为止发现的所有生物组织器官中最强最高的一种。根据合成蛋白质的初步推测，这种高效率的蛋白质合成，不但需要众多基因的相互协调，而且基因的表达，大多数都具有高度的组织和时期特异性。家蚕只在其5龄中期后期，丝胶基因于中部丝腺大量表达合成丝胶蛋白，丝素基因(Fib-H，Fib-L，P25)在后部丝腺特异表达合成表达丝素蛋白。研究发现，丝蛋白基因的特异表达是受丝腺组织一些特异的转录调控因子调控，同时一些泛在的转录调控因子也协作参与这一过程。根据丝腺中与蚕丝基因转录有关的转录因子的特性、细胞分别、结合位置以及它们在蚕丝基因表达调节中的作用将转录因子分为两类，一种是组织特异因子，如SGF-1、SGF-2、SGF-B和PSGF。另一种是泛在的共同因子，包括SGF-3、SGF-4、TRIO、UB2a、UB2b及BMFA、FBF-A1。

家蚕丝腺高效合成丝蛋白的一个重要的生物学基础就是家蚕丝腺细胞特殊的分裂方式——细胞不分裂，核分裂。家蚕丝腺起源于外胚层的器官，丝腺细胞仅在胚胎期发生10次细胞分裂，产生约2000个丝腺细胞，目前研究发现多丝量品种的家蚕丝腺细胞比少丝量品种多；幼虫期，丝腺细胞不再发生分裂，细胞数不再增加，只发生细胞的肥大生长，，细胞核在细胞内只发生核的复制和分裂。在家蚕5龄后期的一个丝腺细胞，核内DNA的复制次数可以达到29～30次，少丝量蚕品种约复制29次，多丝量蚕品种约复制30次。家蚕丝腺细胞数的多少及细胞核的复制次数都与家蚕的产丝量紧密相关，而对于家蚕丝腺细胞产生及细胞核复制分裂的理论研究目前还比较少，也还没有找到相关的调控因子。因此，发现与家蚕丝腺细胞分化和控制细胞分裂的调控因子对于提高家蚕产丝量，改善蚕丝品质，促进我国蚕丝产业兴隆方面具有重要的意义。

发明内容

本发明将家蚕丝腺组织基因的特异表达调控研究和家蚕丝腺的应用研究相结合，其目的在于提供一类来自于家蚕丝腺的特异表达的含HLH结构域的新型的转录调控因子基因。该类型的转录调控因子对胚胎期器官的特异化，细胞分裂及基因的特异表达有重要的调控作用，对于家蚕丝腺的理论研究和产业应用有重要的应用价值。

本发明申请人对丝腺基因的表达谱进行了分析，结果发现一个丝腺特异表达的转录调控因子，并对其氨基酸序列分析发现此基因具有HLH结构域且能与DNA序列特异结合，基因命名为BmHLH2。在家蚕丝腺转录调控因子研究方面，已报道的丝腺特异的转录调控因子中大部分为含homeodomain的转录调控因子。通过荧光定量PCR实验，证实BmHLH2仅在家蚕丝腺特异表达，因此认为BmHLH2为家蚕丝腺组织特异表达的新型的转录调控因子。目前对HLH结构域的转录调控因子的研究表明，它们对胚胎器组织器官的特异化和细胞分裂等有重要的调控作用；同时，果蝇的唾液腺的研究结果表明一个含HLH结构域名为Sage的基因对唾液腺基因的特异表达有重要调控作用，而编号为BmHLH2的基因通过分析发现与人的Mist转录因子具有很高的同源性。因此，可断定bmHLH2基因对丝腺组织的特化和细胞分裂及基因的特异表达有重要调控作用。

本发明申请人进行了HLH基因克隆，具体方法如下：

(1)基因芯片制作及杂交：共设计22987条探针，探针包含了家蚕全部预测基因和部分EST序列所代表的转录物，将探针以点阵(微阵列)的形式排布在醛基片上；提取家蚕大造品种5龄3天的不同组织的RNA并经纯化后与探针杂交；

(2)芯片数据分析：首先对总体的荧光强度值进行矫正，使各张芯片的总荧光强度接近该批次芯片总荧光强度的平均值；采用Lowess方法进行芯片内数据的归一化处理；以丝腺芯片数据为分析对象，首先对数据进行过滤，选取实验重复数据半数以上信号强度大于400的探针进行分析；丝腺特异表达基因的筛选在丝腺表达基因中进行筛选，以丝腺组织信号强度大于任一非丝腺组织信号强度2倍以上，且p＜0.01的探针为分析对象；通过对家蚕5龄3天不同组织表达芯片的分析，获得在家蚕丝腺特异表达的含HLH结构域的转录调控因子，其对应的蛋白质序列编号为BmHLH2；

(3)序列同源性分析：结构域分析在SMART元件中进行，分析结果表明含有HLH结构域；相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成，BLAST分析表明，BmHLH2与人的Mist转录因子具有较高的同源性；Mist对于人的肌细胞的特异分化有重要的调控作用；BmHLH2转录调控因子对家蚕丝腺基因的特异表达和细胞特化有重要的调控作用；

(4)BmHLH2基因的克隆分析：根据BmHLH2基因预测序列设计引物进行RT-PCR，扩增片段克隆到pMD18-T(Takara)载体上，序列测定(上海Sangon)结果与预测的基因序列一致，针对核酸序列推测其氨基酸序列，发现克隆的片段包括完整的ORF编码框；

(5)BmHLH2基因干涉载体的构建：将获得的全长cDNA序列亚克隆到干涉载体L4440中，用于表达dsRNA，用于该转录因子对丝腺的功能研究。

上述方法获得的BmHLH2基因核酸序列及其推测的氨基酸序列如下：

ATG CCA CAC TGG GTA ACT GCT GAA GAA GGC ACT GAC ACC GAA TCT

 M   P   H   W   V   T   A   E   E   G   T   D   T   E   S

CCT GAC CAA GTT ATG TTA TAT TAC GAA GAT GAC GCT TCA GAA TAC

 P   D   Q   V   M   L   Y   Y   E   D   D   A   S   E   Y

TAT GAT AAT AAA CCC GAC GGC CCA GAC AAT ATA GAA GAA CAA AAT

 Y   D   N   K   P   D   G   P   D   N   I   E   E   Q   N

GGA GAT TTT TAT GAT AGT GGT AGC GGA AGT GAT GAG CCA GTG CAG

 G   D   F   Y   D   S   G   S   G   S   D   E   P   V   Q

CGC AGG ATG CGC CCA AGA CGC GCT GTA GTA TTA GGG TCT TCA TCA

 R   R   M   R   P   R   R   A   V   V   L   G   S   S   S

TCA GCC GGC AGT ACG GGA CCT CCT TCA GGA CCC GGT CGA CGG CGG

 S   A   G   S   T   G   P   P   S   G   P   G   R   R   R

AGG TGT GGC ATT TCC GCT CGT GAA CGC AAC CTC CGT CGT CTC GAG

 R   C   G   I   S   A   R   E   R   N   L   R   R   L   E

AGC AAT GAA AGA GAA AGA ATG CGA ATG CAT TCC CTC AAC CGA GCT

 S   N   E   R   E   R   M   R   M   H   S   L   N   R   A

TTT GAG GAT TTA CGC CGC GTA ATC CCA CAT GTG AAA AAA GAC AAC

 F   E   D   L   R   R   V   I   P   H   V   K   K   D   N

AGA AGT CTT TCA AAG ATA GAA ACC CTT ACC TTA GCC AAA AAT TAC

 R   S   L   S   K   I   E   T   L   T   L   A   K   N   Y

GTG AAA GCC CTC ACG AAT GCT ATT TGC ACA ATG AGA GGT GAA GTT

 V   K   A   L   T   N   A   I   C   T   M   R   G   E   V

GCT CAT TAT TCA TTC AAT AGC GAC GAT GAA AAC GTG GAA CCC GCA

 A   H   Y   S   F   N   S   D   D   E   N   V   E   P   A

TTT GTA TTG AAT AGG AGG GAT CAG GAG CCG AAC AAC AAC GAG ACT

 F   V   L   N   R   R   D   Q   E   P   N   N   N   E   T

GTC AGT ACG GAC CAG CAA GAA ATT ACG ACA CGG ACG CAA GGT TTC

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BmHLH2基因在培育多丝量蚕品种中的应用。

本发明的优点是：

在家蚕丝腺转录调控研究方面，荧光定量PCR实验证实BmHLH2仅在家蚕丝腺中特异表达，证实其与丝腺的发育、丝腺细胞的分化有重要的联系，对BmHLH2基因的干涉研究表明，注射dsRNA后丝腺细胞发育明显异常，HLH型转录因子对细胞分化、器官的特化及基因的特异表达有重要的调控作用。这些研究成果对于提高家蚕产丝量，改善蚕丝品质，促进蚕丝产业发展具有重要意义。

具体实施方式：

实施例：

通过家蚕基因芯片的信息分析，发现了探针号为sw01142两个对应的基因在家蚕丝腺特异表达，其对应的家蚕的编码蛋白编号为Bmb017097，基因命名为BmHLH2；将其蛋白序列在SMART结构域预测软件进行结构域预测，表明它们是两个含有HLH结构域的蛋白；再在NCBI中运行BLAST程序进行同源基因检索，检索结果BmHLH2蛋白与控制人肌细胞特化的因子有最高相似性，其值为E＝3e-19；分析结果表明，这个在丝腺特异表达的转录因子为新型家蚕丝腺特异表达的bHLH转录调控因子；根据其同源基因的功能研究，表明它们对家蚕丝腺细胞的分化、特化及基因的特异表达有非常重要的作用；根据BmHLH1基因的核酸序列设计引物(BmHLH2F：ATGCCACACTGGGTAAC，BmHLH2R：GAAGAAACCTTGCGTCCG)，以家蚕丝腺cDNA为模板进行PCR扩增，并对PCR产物回收克隆到pMD18-T载体中，对阳性克隆进行测序验证，证实获得了BmHLH2的全长cDNA。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>西南大学

<120>家蚕丝腺特异表达的HLH转录调控因子BmHLH2

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>1129

<212>DNA

<213>家蚕(Bombyx mori)

<400>1

       1 ATGCCACACT GGGTAACTGC TGAAGAAGGC ACTGACACCG AATCTCCTGA

CCAAGTTATG

      61 TTATATTACG AAGATGACGC TTCAGAATAC TATGATAATA AACCCGACGG

CCCAGACAAT

     121 ATAGAAGAAC AAAATGGAGA TTTTTATGAT AGTGGTAGCG GAAGTGATGA

GCCAGTGCAG

     181 CGCAGGATGC GCCCAAGACG CGCTGTAGTA TTAGGGTCTT CATCATCAGC

CGGCAGTACG

     241 GGACCTCCTT CAGGACCCGG TCGACGGCGG AGGTGTGGCA TTTCCGCTCG

TGAACGCAAC

     301 CTCCGTCGTC TCGAGAGCAA TGAAAGAGAA AGAATGCGAA TGCATTCCCT

CAACCGAGCT

     361 TTTGAGGATT TACGCCGCGT AATCCCACAT GTGAAAAAAG ACAACAGAAG

TCTTTCAAAG

     421 ATAGAAACCC TTACCTTAGC CAAAAATTAC GTGAAAGCCC TCACGAATGC

TATTTGCACA

     481 ATGAGAGGTG AAGTTGCTCA TTATTCATTC AATAGCGACG ATGAAAACGT

GGAACCCGCA

     541 TTTGTATTGA ATAGGAGGGA TCAGGAGCCG AACAACAACG AGACTGTCAG

TACGGACCAG

     601 CAAGAAATTA CGACACGGAC GCAAGGTTTC TTCTGAcctt ggcggtctag

tgctcgcata

 661 gctgccaaaa tgcatgctgc gaccaccgct actcacgaca aatttctgat gtaatacgac

 721 gactggattg ccgaggtttt caattttaat tcaattattt actggtttta aatgaatgtc

 781 agatattttt atagtagagc ttgggccaaa atcatatctt agtcaatgtg gtgtgatacc

 841 cttacttttt tttcctgacg tggctagtgg atccattcgg tccatttaat ttaagctcta

 901 atcaaatgat acatacctaa atatataata taaaataaaa tagacttatg acatactttt

 961 tggtgaaatt ttcataagca acaaatttgg tttagtcttt ccatatgttt cgatgtttta

1021 aacggtagtg ttaatttgga attattttaa attaacatat cgaaagctta aacgaagaat

1081 tctaaaaaag ctttttaaga tgctttcaaa gtattcacat agcacaaaa

<210>2

<211>211

<212>PRT

<213>家蚕(Bombyx mori)

<400>1

      1 MPHWVTAEEG TDTESPDQVM LYYEDDASEY YDNKPDGPDN IEEQNGDFYD

SGSGSDEPVQ

     61 RRMRPRRAVV LGSSSSAGST GPPSGPGRRR RCGISARERN LRRLESNERE

RMRMHSLNRA

    121 FEDLRRVIPH VKKDNRSLSK IETLTLAKNY VKALTNAICT MRGEVAHYSF

NSDDENVEPA

    181 FVLNRRDQEP NNNETVSTDQ QEITTRTQGF F

Claims (3)

1、一种家蚕丝腺特异表达的HLH转录调控因子BmHLH2，其特征在于其序列如下：

1 ATGCCACACT GGGTAACTGC TGAAGAAGGC ACTGACACCG AATCTCCTGA CCAAGTTATG

61 TTATATTACG AAGATGACGC TTCAGAATAC TATGATAATA AACCCGACGG CCCAGACAAT

121 ATAGAAGAAC AAAATGGAGA TTTTTATGAT AGTGGTAGCG GAAGTGATGA GCCAGTGCAG

181 CGCAGGATGC GCCCAAGACG CGCTGTAGTA TTAGGGTCTT CATCATCAGC CGGCAGTACG

241 GGACCTCCTT CAGGACCCGG TCGACGGCGG AGGTGTGGCA TTTCCGCTCG TGAACGCAAC

301 CTCCGTCGTC TCGAGAGCAA TGAAAGAGAA AGAATGCGAA TGCATTCCCT CAACCGAGCT

361 TTTGAGGATT TACGCCGCGT AATCCCACAT GTGAAAAAAG ACAACAGAAG TCTTTCAAAG

421 ATAGAAACCC TTACCTTAGC CAAAAATTAC GTGAAAGCCC TCACGAATGC TATTTGCACA

481 ATGAGAGGTG AAGTTGCTCA TTATTCATTC AATAGCGACG ATGAAAACGT GGAACCCGCA

541 TTTGTATTGA ATAGGAGGGA TCAGGAGCCG AACAACAACG AGACTGTCAG TACGGACCAG

601 CAAGAAATTA CGACACGGAC GCAAGGTTTC TTCTGAcctt ggcggtctag tgctcgcata

661 gctgccaaaa tgcatgctgc gaccaccgct actcacgaca aatttctgat gtaatacgac

721 gactggattg ccgaggtttt caattttaat tcaattattt actggtttta aatgaatgtc

781 agatattttt atagtagagc ttgggccaaa atcatatctt agtcaatgtg gtgtgatacc

841 cttacttttt tttcctgacg tggctagtgg atccattcgg tccatttaat ttaagctcta

901 atcaaatgat acatacctaa atatataata taaaataaaa tagacttatg acatactttt

961 tggtgaaatt ttcataagca acaaatttgg tttagtcttt ccatatgttt cgatgtttta

1021 aacggtagtg ttaatttgga attattttaa attaacatat cgaaagctta aacgaagaat

1081 tctaaaaaag ctttttaaga tgctttcaaa gtattcacat agcacaaaa。

2、一种家蚕丝腺特异表达的HLH转录调控因子BmHLH2编码的蛋白质，其特征在于其序列如下：

1 MPHWVTAEEG TDTESPDQVM LYYEDDASEY YDNKPDGPDN IEEQNGDFYD SGSGSDEPVQ

61 RRMRPRRAVV LGSSSSAGST GPPSGPGRRR RCGISARERN LRRLESNERE RMRMHSLNRA

121 FEDLRRVIPH VKKDNRSLSK IETLTLAKNY VKALTNAICT MRGEVAHYSF NSDDENVEPA

181 FVLNRRDQEP NNNETVSTDQ QEITTRTQGF F。

3、BmHLH2基因在培育多丝量蚕品种中的应用。