CN102296071B - 家蚕中肠特异表达启动子p3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及家蚕基因技术，具体为家蚕中肠特异表达启动子P3，具有如SEQIDNo：1所示的部分或全部核苷酸序列；该启动子是通过设计特异引物进行PCR扩增而获得；本发明还涉及含有该启动子的转基因载体，具体为P3-EFGP-SV40表达框和pBac[3XP3-DsRedaf]线性载体连接而得重组载体pBac[P3-EFGP-SV40-3XP3-DsRedaf]；该启动子具有使外源基因特异表达于家蚕中肠，可用于转基因研究家蚕中肠特异表达基因的功能，为研究和利用家蚕中肠特异表达基因提供了有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及家蚕中肠特异表达启动子，还涉及含有该启动子的转基因载体及该转基因载体的应用。
背景技术
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物。家蚕基因组框架图和精细图谱的绘制工作相继在2004和2008完成，标志着人类对家蚕的研究和认识正式进入后基因组时代。对家蚕基因的研究主要采取 “发现基因，研究基因，利用基因” 的策略，目前发现了大量功能未知的家蚕基因，但是对家蚕基因研究进展却十分缓慢，进一步限制了利用家蚕基因。转基因和RNA干扰（RNAi）技术是目前研究基因功能最有效的方法，由于家蚕物种本身的特点，在利用RNAi技术研究基因功能方面存在局限，所以转基因技术是研究家蚕基因功能最有效的手段。但是许多功能基因都为组织特异性表达，因此利用转基因技术研究组织特异表达基因需要由组织特异启动子启动。目前家蚕组织特异表达启动子较单一，只有定位于丝腺和脂肪体表达的组织特异启动子报道，导致家蚕转基因载体中组织特异启动子缺乏，因此限制了对家蚕组织特异表达基因的研究。
研究表明家蚕的许多重要基因都特异表达于中肠。但是，中肠组织特异的启动子未见报道，这使科研人员在通过转基因等技术手段研究中肠组织特异表达基因时感觉很棘手，使相关研究很难开展，同时增加了利用中肠组织特异表达基因的难度。
因此急需一种家蚕中肠启动子，构建含有家蚕中肠启动子P3的表达载体，为家蚕转基因提供中肠组织特异表达载体。
发明内容
有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种启动子，该启动子在家蚕中肠特异性启动。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：
家蚕中肠特异表达启动子P3，所述家蚕中肠特异表达启动子P3含有如SEQ ID No:2所示核苷酸序列，所述家蚕中肠特异表达启动子P3的碱基长度不超过2073，源于家蚕BGIBMGA008060基因。
进一步，所述家蚕中肠特异表达启动子P3的核苷酸序列如SEQ
ID No:1所示。
进一步，所述家蚕中肠特异表达启动子P3的核苷酸序列如SEQ
ID No:2所示的核苷酸序列。
本发明目的之二在于提供家蚕中肠特异性启动子的制备方法，该方法操作简单，重现性好。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
所述家蚕中肠特异表达启动子P3的制备方法，具体步骤如下：以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得家蚕中肠特异表达启动子P3，所述左、右引物分别如SEQ ID No:3和SEQ
ID No:4所示，PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒、49℃退火40秒、72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。
本发明目的之三在于提供一种重组载体，其能在家蚕中肠特异表达。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
家蚕中肠特异表达启动子P3的重组载体。
进一步，根据权利要求5所述家蚕中肠特异表达启动子P3的重组载体，所述重组载体为P3-EGFP-SV40片段同基础载体pBac[3×P3-DsRed af]片段连接而得重组载体pBac[P3-EGFP-SV40-3×P3-DsRed af]。
本发明目的之四在于提供所述家蚕中肠特异性启动子的重组载体的构建方法， 该方法操作简单，稳定性好。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
所述重组载体的构建方法，所述P3-EGFP-SV40片段的构建，具体步骤如下：酶切所述如SEQ ID No:1或如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，连接用相同内切酶酶切的EGFP-SV40-1180载体，所述EGFP-SV40-1180载体由已含有SV40片段的pSLfa1180fa与pBac[3×P3-EGFP afm]中EGFP绿色荧光蛋白构建，得中间载体P3-EGFP-SV40-1180，所得中间载体P3-EGFP-SV40-1180用限制性内切酶AscⅠ酶切，得P3-EGFP-SV40片段。
进一步，所述EGFP-SV40-1180载体的构建，包括以下步骤：所述EGFP绿色荧光蛋白引物，上游引物如SEQ ID No.6所示序列，下游引物如SEQ
ID No.7所示序列，以所述pBac[3×P3-EGFP
afm]质粒为模板，进行PCR扩增；扩增产物用BamHⅠ和NotⅠ进行酶切，得所述EGFP酶切片段，同时用BamHⅠ和NotⅠ酶切所述已包含SV40片段的pSLfa1180fa载体，得所述pSLfa1180fa载体酶切片段，连接酶切所得所述EGFP酶切片段和所述pSLfa1180fa载体酶切片段，得EGFP-SV40-1180载体。
本发明目的之五在于提供所述家蚕中肠特异性启动子P3的应用，该应用为中肠组织特异表达基因提供了新思路。
所述家蚕中肠特异表达启动子P3在家蚕中肠特异表达活性蛋白的应用。
本发明的有益效果在于：本发明成功获得了家蚕中肠特异启动子的核苷酸序列，为后期构建含有家蚕中肠特异启动子的表达载体提供了必要基础；利用该序列本发明还成功的构建了由P3或P3-DI介导的EGFP表达载体P3-EGFP-SV40-1180和P3-DI-EGFP-SV40-1180；同时利用基础载体pBac[3×P3-DsRed af]与P3-EGFP-SV40或P3-DI-EGFP-SV40表达框进行连接获得重组转基因载体pBac[P3-EGFP-SV40-3×P3-DsRed af]和pBac[P3-DI-EGFP-SV40-3×P3-DsRed af]；将P3-PR或P3-DI-PR和辅助质粒对家蚕产下2小时后的非滞育蚕卵进行显微注射，获得了转基因家蚕，在GFP激发光下观察显示由P3或P3-DI介导的EGFP都特异表达于家蚕中肠组织中；同时对EGFP在中肠、脂肪体和血液三个组织的表达谱分析显示，只在家蚕中肠中能够检测到EGFP基因的表达；因此，本发明的家蚕特异启动子P3特异表达于家蚕中肠组织中，并可成功表达外源基因，为研究家蚕中肠特异表达基因提供了有力工具，具有良好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为本发明P3-DI启动子介导的EGFP转基因系统的荧光观察图（A、B和C为明场下观察结果；D、E、F为在GFP激发光下观察结果；A、D为非转基因大造品种；B、E为P3-DI）；
图2为本发明P3-DI转基因系统EGFP组织表达谱（A为P3-DI-1转基因家蚕；B为非转基因家蚕；1、2、3分别为血液、脂肪体、中肠组织）。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1
一、家蚕中肠特异性启动子的获得
（1）以家蚕大造为基因组，提取家蚕基因组DNA，根据已经报道的家蚕全基因组芯片数据和家蚕基因组数据库（http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/），找到一个中肠特异表达基因BGIBMGA008060，经过（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）网站分析该基因5’端的非编码区预测，如SEQ ID No.1所示2073bp的核苷酸序列，结果表明在该序列中有典型的启动子结构区域，称为家蚕中肠特异性启动子（以下简称P3）。因此设计P3的特异引物，引物序列如下：P3 F: 5' ccggaattcaaaaacattccaagatatcc
3 '（SEQ ID No：3），下划线部分为EcoRⅠ酶切位点, P3 R: 5' cgggatcctttattgacattaaaaatattatata
3'（SEQ ID No：4），设计的引物委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。
（2）根据步骤（1）所得家蚕基因组DNA为模板和设计的P3 F、P3 R为P3启动子的上、下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为： 94℃预变性4分钟， 94℃变性1分钟、49℃退火40秒、72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，PCR产物采用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，回收2073bp的目的片段P3，获得P3回收片段，具有如SEQ ID No.1所示2073bp的核苷酸序列；
二、构建
EGFP-SV40-1180
载体
根据EGFP绿色荧光蛋白基因序列设计特异引物，引物序列如下：EGFP
F: 5'cgggatccatggtgagcaagggcgag3'（SEQ
ID No：7），下划线部分为BamHⅠ酶切位点，EGFP R: 5' atagtttagcggccgcttacttgtacagctcgtccatgc
3'（SEQ ID No：8），下划线部分为NotⅠ酶切位点，设计的引物委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。以pBac[3×P3-EGFP afm]质粒为模板，以设计的EGFP
F、EGFP R为上下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、59℃退火1分钟、72℃延伸40秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物分别用 BamHⅠ 和 NotⅠ 进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得EGFP酶切片段，同时用BamHⅠ和 Hind Ⅲ酶切含有SV40终止信号的pSLfa1180fa载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pSLfa1180fa载体酶切片段，连接EGFP酶切片段和pSLfa1180fa载体酶切片段，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小，得含有EFGP绿色荧光蛋白基因的pSLfa1180fa载体（简称EGFP-SV40-1180）。
三、构建
P3-EGFP-SV40-1180
载体
用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分别酶切EGFP-SV40-1180载体和P3回收片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，分别得EGFP-SV40-1180酶切片段和P3酶切片段，连接EGFP-SV40-1180酶切片段和P3酶切片段，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，得家蚕中肠特异性启动子的中间载体，简称P3-EGFP-SV40-1180。
四、构建家蚕中肠特异性启动子的重组载体
用限制性内切酶AscⅠ酶切家蚕中肠特异性启动子的载体P3-EGFP-SV40-1180，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得P3-EGFP-SV40片段；同时用内切酶AscⅠ单酶切pBac[3×P3-DsRed af] 载体，得pBac[3×P3-DsRed af]线性片段，然后对获得pBac[3×P3-DsRed
af] 线性片段5’端去磷酸化，连接P3-EGFP-SV40片段和pBac[3×P3-DsRed af]线性片段，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，得家蚕中肠特异性启动子的转基因载体pBac[P3-EGFP-SV40-3×P3-DsRed af]，简称P3-PR。
本实施例以外源基因EGFP为例，还可以为其他外源基因，也可以为其他中肠特异表达基因。
实施例
2
一、家蚕中肠特异性启动子的获得
（1）以家蚕大造为基因组，提取家蚕基因组DNA，根据已经报道的家蚕全基因组芯片数据和家蚕基因组数据库（http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/），找到一个中肠特异表达基因BGIBMGA008060，与家蚕基因组数据库中该基因EST数据进行比对后发现该基因的翻译起始位点（ATG）位于第2外显子上，即该基因5’端的非编码区包含第一内含子。在（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）网站对该基因5’端的第一内含子上游的非编码区进行预测，如SEQ
ID No：2所示1598bp的核苷酸序列，结果表明在该序列中有典型的启动子结构区域，称为家蚕中肠特异性启动子（以下简称P3-DI）。因此设计P3-DI的特异引物，含有如SEQ ID No.1所示1-1598位的核苷酸序列，即SEQ ID No：2所示序列，引物序列如下：P3-DI F: 5' ccggaattcaaaaacattccaagatatccgccg
3 '（SEQ ID No：5），下划线部分为EcoRⅠ酶切位点，P3-DI R 5' cgggatcccatagcgcgcagctcaccac
3'（SEQ ID No：6），下划线部分为BamHⅠ酶切位点，设计的引物委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。
（2）以设计的P3-DI F、P3-DI R为P3-DI启动子上、下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为： 94℃预变性4分钟， 94℃变性40秒、65℃退火40秒、72℃延伸1分20秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物采用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，切胶回收1598bp的目的片段，得P3-DI回收片段，具有如SEQ ID No：1所示的1-1598位核苷酸序列。
二、构建
EGFP-SV40-1180
载体
根据EGFP绿色荧光蛋白基因序列设计特异引物，引物序列如下：EGFP
F: 5'cgggatccatggtgagcaagggcgag3'（SEQ
ID No：7），下划线部分为BamHⅠ酶切位点，EGFP R: 5' atagtttagcggccgcttacttgtacagctcgtccatgc
3'（SEQ ID No：8），下划线部分为NotⅠ酶切位点，设计的引物委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。以pBac[3XP3-EGFP
afm]质粒为模板，以设计的EGFP F、EGFP
R为上下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为： 94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、59℃退火1分钟、72℃延伸40秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物分别用 BamHⅠ 和 NotⅠ 进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得EGFP酶切片段，同时用BamHⅠ和 Hind Ⅲ酶切含有SV40终止信号的pSLfa1180fa载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pSLfa1180fa载体酶切片段，连接EGFP酶切片段和pSLfa1180fa载体酶切片段，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小，得含有EGFP绿色荧光蛋白基因的pSLfa1180fa载体（简称EGFP-SV40-1180）。
三、构建
P3-DI-EGFP-SV40-1180
载体
同时，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切P3-DI回收片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得P3酶切片段，连接EGFP-SV40-1180酶切片段和P3-DI酶切片段，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，得家蚕中肠特异性启动子的过渡载体，简称P3-DI-EGFP-SV40-1180。
四、构建家蚕中肠特异性启动子的重组载体
用限制性内切酶AscⅠ酶切家蚕中肠特异性启动子的载体P3-DI-EGFP-SV40-1180，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得P3-DI-EGFP-SV40片段；同时用内切酶AscⅠ单酶切pBac[3×P3-DsRed af] 载体，得pBac[3×P3-DsRed af]线性片段，然后对获得pBac[3×P3-DsRed
af] 线性片段5’端去磷酸化，连接P3-DI-EGFP-SV40片段和pBac[3×P3-DsRed af]片段，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，得家蚕中肠特异性启动子的重组载体pBac[P3-DI-EGFP-SV40-3×P3-DsRed af]，简称P3-DI-PR。
本步骤以外源基因EGFP为例，还可以为其他外源基因，也可以为其他中肠特异表达基因。
实施例
3
一、转基因显微注射和阳性个体的筛选
（1）将家蚕大造品种蚕卵浸酸（盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟）解除滞育以后，放于15℃和80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养（温度：25℃，湿度：80%），化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；
（2）将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将P3含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体载体P3-PR和辅助质粒A3H，一起注射进185粒大造蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化，将孵化的115头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，G0代蚕蛾通过自交或回交共获得20蛾圈G1代蚕卵，用 Olympus®电动宏观荧光显微镜观察G1胚胎筛选并获得3个阳性蛾圈，即3个家蚕中肠特异性启动子P3的转基因家蚕，简称P3转基因系统，转化效率为15%；将含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的重组载体P3-DI-PR和辅助质粒A3H，一起注射进200粒大造蚕卵中，共孵化125头G0代蚁蚕，获得34蛾圈G1代蚕卵，筛选得到4个阳性蛾圈，即4个家蚕中肠特异性启动子的转基因家蚕，简称P3-DI转基因系统，转化效率为11.80%。
二、转基因系统的荧光观察和分子检测
（1）将获得的阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大得到3个P3转基因系统和4个P3-DI转基因系统，各自随机选择2个转基因系统（P3-1，P3-2，P3-DI-1，P3-DI-2），在幼虫5龄3天进行荧光观察，结果如附图1所示，P3-DI的转基因系统中肠有绿色荧光，而其他组织没有绿色荧光，包括P3-DI序列在内的P3启动子的转基因系统观察结果和P3-DI类似。表明了如SEQ
ID No:1所示的2073bp核苷酸序列和如SEQ
ID No: 2所示的1598bp核苷酸序列都能成功介导外源基因EGFP特异表达于家蚕中肠。
（2）取P3-1和P3-DI-1转基因系统的中肠、脂肪体和血液组织，分析外源基因EGFP在组织表达谱，根据EGFP基因序列，设计检测引物上游引物序列为：EGFP
F: 5’-cagtgcttcagccgctaccc-3’(SEQ ID No：9)，下游引物序列为：EGFP R: 5’-ggatgttgccgtcctccttg-3’ (SEQ ID No：10)，分别提取P3和P3-DI中肠、脂肪体和血液组织RNA，采用RT-PCR逆转录扩增试剂盒（Takara）进行反转获得各组织cDNA，以BGIBMGA003186基因为内参，上游引物序列为：5’-ttcgtactggctcttctcgt-3’ (SEQ
ID No：11)，下游引物序列为5’-caaagttgatagcaattccct-3’ (SEQ
ID No：12)，进行RT-PCR检测，结果如附图2所示，在脂肪体和血液组织没有检测到EGFP的表达，只在中肠检测到EGFP的表达，以正常大造中肠、脂肪体和血液组织中都未检测到EGFP的表达，说明P3确实是家蚕中肠特异表达启动子。在上述实施例中，其中，P3-1和P3-DI-1均为家蚕中肠特异表达启动子P3。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx moriL.)
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attattcact gacgataaac ggataataaa tgataaatac ataatttggt
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<213> 人工序列
<220>
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<223> 家蚕中肠特异启动子引物 P3-DI F
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caaagttgat agcaattccc t 21
Claims (3)
1.家蚕中肠特异表达启动子P3，其特征在于：所述家蚕中肠特异表达启动子P3如SEQ ID No:2或SEQ ID No:1所示核苷酸序列。
2.权利要求1 中SEQ ID No:1所示家蚕中肠特异表达启动子P3的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得家蚕中肠特异表达启动子P3，扩增所述家蚕中肠特异表达启动子P3的左、右引物分别如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示，PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒、49℃退火40秒、72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。
3.含有权利要求1所述家蚕中肠特异表达启动子P3的重组载体。
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