CN102286487B - 家蚕蛹期特异的BmCP283基因启动子及其制备方法与运用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家蚕基因技术，具体为家蚕BmCP283基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO。1所示；该启动子是通过设计特别的引物并进行PCR扩增而获得的；本发明还涉及重组载体，具体为BmCP283-DsRed-SV40片段同基础载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接而成的pBac[BmCP283-DsRed-SV40,3xP3EGFP]重组载体；该启动子及其重组表达载体可以用于调控家蚕蛹后期特异表达外源蛋白或特异干扰某一基因表达，进而实现蛹期发育调控，最终解决鲜茧收烘与蛹发育过短之间的矛盾，改革蚕茧收购-烘干-缫丝的传统生产模式，促使生丝加工工艺的重大改革并显著提高生丝品质。

Description

家蚕蛹期特异的BmCP283基因启动子及其制备方法与运用

技术领域

本发明涉及生物基因技术领域，特别涉及家蚕BmCP283基因启动子及其运用。

背景技术

家蚕属于全变态昆虫，一生经历卵、幼虫、蛹和成虫4个形态特征和生理功能显著不同的发育阶段。从幼虫吐丝完毕至成虫羽化的阶段被称为变态期，包含幼虫-蛹和蛹-蛾的变态。作为重要的经济昆虫，家蚕在生产上主要用于结茧缫丝。家蚕在幼虫末期熟蚕时开始上蔟吐丝，经过3日左右吐丝终了，再经过1～2日蜕皮化蛹，经两周左右羽化成蛾，交配产卵。生产上必须在幼虫化蛹后且化蛾前完成鲜茧的收购，然后利用热能或其他方法烘死蚕蛹和寄生蝇蛆，防止出蛾、出蛆、霉变，并除去蛹体及茧层的自由水分以达到长期安全贮藏的目的。由于时间紧迫，而且要保证蚕茧收购、运输和烘干的顺利进行，给生产造成了一定难度。又由于茧丝成分主要是蛋白质，高温烘烤使蚕丝品质受到破坏，影响后加工。因此，如果能通过遗传改良等方法使蛹期发育延长或停滞，这将有助于解决鲜茧收烘与蛹发育过短之间的矛盾，改革蚕茧收购-烘干-缫丝的传统生产模式，促使生丝加工工艺的重大改革并显著提高生丝品质。

在遗传上实现家蚕蛹期发育调控主要涉及两个关键问题，一是有用于使蛹期发育延长或停滞的靶基因，该基因的转录沉默或超量表达能对蛹期发育进行有效的控制；二是使候选靶基因在蛹期（化蛾前）特异表达，如果在胚胎、幼虫或成虫等其他发育阶段发挥作用，势必达不到预期效果，甚至会影响正常的蚕茧产量。因此，蛹期特异的启动子是实现该目标的重要保证，但至今相关研究较少。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基因启动子，该启动子为家蚕蛹期特异性启动子。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

家蚕BmCP283基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

家蚕BmCP283基因启动子的截短片段，所述截短片段为如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

本发明的目的之二在于提供一种启动子得制备方法，该方法操作简单，适用于普通实验室使用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕BmCP283基因启动子的制备方法，具体步骤为：以家蚕基因组为模板进行PCR扩增，其中上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示；

扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，59.9℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 分钟，得如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子。

本发明的目的之三在于提供一种重组表达载体，其能对蛹期发育进行有效的控制。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕BmCP283基因启动子的重组载体。

进一步，所述重组载体为BmCP283-DsRed-SV40片段同基础载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接而成的pBac[BmCP283-DsRed-SV40, 3xP3EGFP] 的重组载体；

本发明的目的之四在于提供一种所述重组载体的制备方法，该方法适用于普通实验室。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的重组载体的制备方法，将经酶切的如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与经同样酶切的含有具备表达外源蛋白的基因的载体片段连接，得显微注射载体。

进一步，酶切所述显微注射载体后与经同样酶切的含有荧光蛋白标签的基础载体连接，得含有荧光蛋白标签的显微注射载体；

进一步，将如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组载体，分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切pMD19- BmCP283质粒，回收家蚕BmCP283基因启动子与分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切的pSL[ser1-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成pSL[BmCP283-DsRed-SV40]；

进一步，用AscⅠ酶切步骤B所得pSL[BmCP283-DsRed-SV40]，将酶切所获得的BmBmCP283-DsRed-SV40片段连接到AscⅠ酶切的pBac[3xP3-EGFPafm]基础载体，构建成pBac[BmCP283-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体。

本发明的目的之五在于提供所述家蚕BmCP283基因启动子的应用，该应用为实现家蚕蛹期发育调控提供了新思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕BmCP283基因启动子在家蚕蛹后期表达外源蛋白的应用。

本发明的有益效果为：BmCP283基因在家蚕蛹后期特异表达，利用该基因的启动子使外源基因在特定时期表达，将有助于实现人为调控家蚕蛹期发育，实现蛹期发育的延长或停滞的最终目标。

利用BmCP283基因启动子的蛹期特异性，构建GAL4／UAS转基因系，将蛹期特异启动子与酵母转录激活因子GAL4相连接，建立GAL4转基因系，使蛹期特异启动子以时空特异性的方式激活GAL4的表达；同时将UAS与靶基因融合，建立带有UAS-靶基因的转基因系。将两个转基因系进行杂交，在杂交后代中，由于GAL4蛋白只能与UAS相结合，那么特异性表达的GAL4就可以同样的方式调节UAS-靶基因的表达。靶基因的选择可以根据需要进行，如致死基因，通过蛹期特异性启动子启动致死基因在家蚕化蛾前表达，从而避免茧层破坏以及鲜茧烘干对蚕丝品质的破坏，实现蛹期发育调控的最终目标。

更多的有益效果，将在实施例中体现。

附图说明

图1为包含不同长度的BmCP283启动子的载体转染sf9细胞后的活性分析。

图2为转基因家蚕个体的荧光观察后的灰度处理照片，A：卵（白光下）B：卵（荧光下）C：成虫（白光下）D：成虫（荧光下）。

图3为BmCP283P启动子转基因阳性个体中Red基因的胚胎期表达特征； M:DL2000plus；1:产卵5天；2:产卵6天； 3:产卵7天； 4:产卵8天； 5:产卵9天；6:蚁蚕。

图4为BmCP283P启动子转基因阳性个体中Red基因的幼虫期表达特征；M:DL2000plus；1:1龄眠；2:2龄起；3:2龄眠；4:3龄起；5:3龄眠；6:4龄起；7:4龄眠；8:5龄起。

图5为家蚕转基因阳性个体中红色荧光蛋白基因mRNA表达谱的时期特异性；胚胎期：M:DL2000plus； 1:产卵5天； 2:产卵6天； 3:产卵7天； 4:产卵8天； 5:产卵9天； 6:蚁蚕   幼虫期：M:DL2000plus；1:1龄眠； 2:2龄起； 3:2龄眠； 4:3龄起； 5:3龄眠； 6:4龄起； 7:4龄眠； 8:5龄起  变态期：M:DL2000plus； 1:5龄第3天对照； 2:5龄第3天转基因品系1；3:5龄第5天转基因品系2；4:刚上蔟对照；5:刚上蔟转基因品系1；6:刚上蔟转基因品系2； 7:上蔟第3天对照；8:上蔟第3天转基因品系1； 9:上蔟第3天转基因品系2；10:化蛹第4天对照；11:化蛹第4天转基因品系1；12:化蛹第4天转基因品系2；13:化蛹第5天对照；14:化蛹第5天转基因品系1；15:化蛹第5天转基因品系2；16:化蛹第6天对照；17:化蛹第6天转基因品系1；18:化蛹第6天转基因品系2；19:化蛹第7天对照；20:化蛹第7天转基因品系1；21:化蛹第7天转基因品系2；22:化蛹第8天对照；23:化蛹第8天转基因品系1；24:化蛹第8天转基因品系2；25: 蛾对照；26: 转基因品系1的蛾； 27: 转基因品系2的蛾。

图6为BmCP283P启动子转基因阳性个体中Red基因在变态期的组织表达特征；A：BmCP283P启动子转基因阳性个体中Red基因在蛹期体壁组织表达特征；其中M:DL2000plus；1:化蛹第4天对照；2:化蛹第4天转基因品系1；3:化蛹第4天转基因品系2；4:化蛹第5天对照；5:化蛹第5天转基因品系1；6:化蛹第5天转基因品系2；7:化蛹第6天对照；8:化蛹第6天转基因品系1；9:化蛹第6天转基因品系2；10:化蛹第7天对照；11:化蛹第7天转基因品系1；12:化蛹第7天转基因品系2；13:化蛹第8天对照；14:化蛹第8天转基因品系1；15:化蛹第8天转基因品系2；B: BmCP283P启动子转基因阳性个体中Red基因在变态期的组织表达特征 

M:DL2000plus；1:化蛹第5天-头；2:化蛹第5天-翅；3:化蛹第5天-胸；4:化蛹第6天-头； 5:化蛹第6天-翅； 6:化蛹第6天-胸；7:化蛹第7天-头；8:化蛹第7天-翅；9:化蛹第7天-胸；10:化蛹第8天-头；11:化蛹第8天-翅；12:化蛹第8天-胸。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

piggBac转座子介导的家蚕转基因技术，自其成功以来已广泛应用于家蚕基因功能研究以及生物工厂的探索，如Ras基因功能的研究、丝心和丝胶蛋白基因启动子的鉴定等，这些都为下述实施例的工作开展打下了良好的基础。

分析发现，基于家蚕全基因组精细图序列的预测基因BGIBMGA000283与Genbank中的NP_001166680蛋白同源，属于表皮蛋白（cuticular protein）基因家族, 在家蚕蛹期特异表达。为使用方便，将其命名为BmCP283。BmCP283位于家蚕第22号染色体的nscaf1681（位置：3119989- 3121211）。蛹后期的组织表达分析显示，BmCP283基因在化蛹7天和化蛹8天的头、胸、翅、触角及表皮等组织中表达。

实施例1家蚕BmCP283基因启动子的获得

家蚕BmCP283基因启动子元件的PCR扩增是以家蚕品种P50幼虫五龄三天的基因组为模板，根据设计的BmCP283启动子上下游引物来扩增得到，具体构建如下：

首先是BmCP283基因启动子元件的获得：BmCP283启动子由上、下游引物以家蚕品种P50幼虫五龄三天的基因组为模板扩增获得，上游引物如SEQ ID NO:2所示，其BmCP283-F含有一个SalI位点：5′-acgcgtcgacatcctcaccccgatggaagtta-3′，下游引物如SEQ ID NO:3所示，BmCP283-R含有一个BamH I位点：5′-cgggatcctgtgttatcttgatgttccgaa-3′，扩增条件为94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，59.9℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

家蚕基因组中扩增获得的BmCP283基因启动子经克隆和测序验证，其序列长度为2004bp。对克隆的BmCP283基因启动子序列进行分析发现：最可能的转录起始位点是位于翻译起始位点ATG上游30bp处的碱基T，其上游不仅在30bp处存在典型的TATA-box，还存在数个CAAT-box。其DNA序列如SEQ ID NO:1所示：

ttttaggttt aagttacaca gcaaccaatt tttttttttt aactctactc taacctcaac      60

ataatttttt aatgattttc atttttatca cgtattaacg tgcgcaatga gcattgacat     120

ttttttttct gtaactggaa aaccgtttcg agaatttaca ggttacagcc gattaaaaaa     180

acgaatttct aatgaaacgt aattaacaat atttttataa aatacatttg gcctttgttt     240

tttgttttca aatgacgtca ttttttattc aaaaagagac tttagtctat atgcttatat     300

acaatatgtg tacgctcaag tgaaattaca tgatcttatt gataggctta aaacatacaa     360

aataaaggta ggtaggtata tctttgtttt taataaaaat cctttgcctc tgttctatgc     420

tccatgaaaa ttttaatcaa ctcatttcca attgacccac gctaagtgaa atcatgcttt     480

tgattcatgg tcacggttct gtaacgcata gtacgaaata tcctcacccc gatggaagtt     540

aaaggtctaa tcaaagacct acgtcgcaaa gctcccagtt ccgacggtat atctaaccac     600

gttaacgaag cggacgttat cggcatacat caaaaatcat ccgacgagct accgtccgat     660

tagcctcctc atgtctttag gcaaactcta taagcgtctg ctctacaggc gcctcagaga     720

cttcgcctcc tccaaaggca ttctgatcga tgaacaattc agattccgtg caaatcactc     780

atacgtataa caggtgcacc gtctcatgga gcacattctc gtacggctca actgaccaaa     840

accgttctac acgggagccc ttcttttgga cgttgcaaaa gcgtttgaca agcctggcac     900

aacggtttga ttttcgaact attcaacata agcataccag acagtctcgt gctcatcata     960

cggaacttct tatcgaacca ctctcttcca tatggagtcg aaggaacctg cttctcccca    1020

cgacctctca cggctgtaat ctggcaaggc tccctcctct cgccgctcct atttatttta    1080

tttattaacg aaatttcccg gtcgccgccg acctagttag ccttattcgt cggtttgaag    1140

ggtggggcag ccgttgtaac tatacgtgag accttagaac ttatatctca aggtgggtgg    1200

cgcatttgcg ttgtggatgt ctatgagctc cagtagccgc ttcacaccag gtgggctgtg    1260

agctcgtcca cccatctaag caataaaaaa taaataaata aagagtgcaa atgcggtcct    1320

tgggtccgcg gtttcctacc gagatctgcg gaccctccag ttccacatgc accgcgcgca    1380

gcctaggcgc ggagacttcg taggaggttc agccccgacc tagaaaaaag gggttcgacg    1440

aaattaaact atataaagta acaacgaaat tacataacat aacaaaataa aatttaacgg    1500

taggcagcgg cttggctctg cccctgacat tgccgacgtc catgggcgac ggtaaccact    1560

cacaatcagg tgggccctat gctcgtctgc ctttacggca ataaaaaaca aataaaaaac    1620

taggtagaga aaaggtgcaa agtaatatga acaaaaagca aattaaaaat gcattaactg    1680

gacaaacctc aaaaaggcta tagaatccac tataatacac tgttctcgca atgccttaaa    1740

taggaatagc gatgtatcat ttaataaact actcatgaaa cgcacatgca gtaatttaaa    1800

ccaccaacat aacctcgttt tctttcgcag cattgatgaa cacgcccatc ctcaatcgag    1860

aaaatctacc aaatcgatgc gtaattgctt ctaaattaat tcttttgcag gatgccaatg    1920

attactagtc aacattttta tgcgtataaa tacttgaaga ataccatccg atgttacatg    1980

tgttcggaac atcaagataa caca                                                   2004

实施例2 家蚕BmCP283基因启动子活性的检测

利用实施例1克隆获得的BmCP283基因的启动子，以含有荧光素酶（LUC）报告基因的pGL3-Basic为基础载体，构建BmCP283-LUC瞬时表达质粒，通过转染sf9细胞株，检测启动子的活性启动活性。另外，构建缺失不同调控区域的BmCP283-LUC瞬时表达质粒，通过sf9细胞转染实验，确定与表达量调控相关的关键元件。实验结果如图1所示，如其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或如SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:7-10均具有启动子活性。表明⑴在sf9细胞中克隆的BmCP283基因启动子驱动荧光素酶基因表达，表明BmCP283启动子在sf9细胞中具有活性；⑵从启动子截短后荧光素酶活的效率比较中可以看出，当启动子从-2004截短到-1743bp的时候，荧光素酶活有一个比较明显的升高，表明截短的这262bp内含有一个抑制BmCP283基因转录上调表达的调控元件。

实施例3 含有家蚕BmCP283基因启动子的重组载体的获得

本发明利用的pBac[3xP3-EGFPafm]注射转座子载体是piggBac衍生载体。显微注射载体pBac[BmCP283-DsRed-SV40,3xP3EGFP]是参照Horn & Wimmer（2000）利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体采用两步克隆法构建的：将实施例1所得，即如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组载体，即pMD19-BmCP283；然后是在穿梭载体pSLfa1180fa上构建完整的表达框，如SEQ ID NO:4所示，具体为：分别用Sal I和BamHⅠ双酶切TA克隆后得到的重组载体，得pMD19- BmCP283质粒，回收家蚕BmCP283基因启动子，将pMD19-BmCP283质粒与分别用Sal I和BamHⅠ双酶切的pSL[ser1-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成pSL[BmCP283-DsRed-SV40]。

完整表达框的序列如下：

ttttaggtttaagttacacagcaaccaattttttttttttaactctactctaacctcaacataattttttaatgattttcatttttatcacgtattaacgtgcgcaatgagcattgacatttttttttctgtaactggaaaaccgtttcgagaatttacaggttacagccgattaaaaaaacgaatttctaatgaaacgtaattaacaatatttttataaaatacatttggcctttgttttttgttttcaaatgacgtcattttttattcaaaaagagactttagtctatatgcttatatacaatatgtgtacgctcaagtgaaattacatgatcttattgataggcttaaaacatacaaaataaaggtaggtaggtatatctttgtttttaataaaaatcctttgcctctgttctatgctccatgaaaattttaatcaactcatttccaattgacccacgctaagtgaaatcatgcttttgattcatggtcacggttctgtaacgcatagtacgaaatatcctcaccccgatggaagttaaaggtctaatcaaagacctacgtcgcaaagctcccagttccgacggtatatctaaccacgttaacgaagcggacgttatcggcatacatcaaaaatcatccgacgagctaccgtccgattagcctcctcatgtctttaggcaaactctataagcgtctgctctacaggcgcctcagagacttcgcctcctccaaaggcattctgatcgatgaacaattcagattccgtgcaaatcactcatacgtataacaggtgcaccgtctcatggagcacattctcgtacggctcaactgaccaaaaccgttctacacgggagcccttcttttggacgttgcaaaagcgtttgacaagcctggcacaacggtttgattttcgaactattcaacataagcataccagacagtctcgtgctcatcatacggaacttcttatcgaaccactctcttccatatggagtcgaaggaacctgcttctccccacgacctctcacggctgtaatctggcaaggctccctcctctcgccgctcctatttattttatttattaacgaaatttcccggtcgccgccgacctagttagccttattcgtcggtttgaagggtggggcagccgttgtaactatacgtgagaccttagaacttatatctcaaggtgggtggcgcatttgcgttgtggatgtctatgagctccagtagccgcttcacaccaggtgggctgtgagctcgtccacccatctaagcaataaaaaataaataaataaagagtgcaaatgcggtccttgggtccgcggtttcctaccgagatctgcggaccctccagttccacatgcaccgcgcgcagcctaggcgcggagacttcgtaggaggttcagccccgacctagaaaaaaggggttcgacgaaattaaactatataaagtaacaacgaaattacataacataacaaaataaaatttaacggtaggcagcggcttggctctgcccctgacattgccgacgtccatgggcgacggtaaccactcacaatcaggtgggccctatgctcgtctgcctttacggcaataaaaaacaaataaaaaactaggtagagaaaaggtgcaaagtaatatgaacaaaaagcaaattaaaaatgcattaactggacaaacctcaaaaaggctatagaatccactataatacactgttctcgcaatgccttaaataggaatagcgatgtatcatttaataaactactcatgaaacgcacatgcagtaatttaaaccaccaacataacctcgttttctttcgcagcattgatgaacacgcccatcctcaatcgagaaaatctaccaaatcgatgcgtaattgcttctaaattaattcttttgcaggatgccaatgattactagtcaacatttttatgcgtataaatacttgaagaataccatccgatgttacatgtgttcggaacatcaagataacacaacgcgtcgacatggtgcgctcctccaagaacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggcaccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggccacaacaccgtgaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggctgcttcatctacaaggtgaagttcatcggcgtgaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccacaaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagtccatctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggactccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcaccgagggccgccaccacctgttcctgtagcggccgcgactctagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctcccataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcacctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttctgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaaagctt

用AscⅠ酶切步骤B所得pSL[BmCP283-DsRed-SV40]，将酶切获得的BmCP283-DsRed-SV40片段连接到AscⅠ酶切的pBac[3xP3-EGFPafm]基础载体，构建成pBac[BmCP283-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]重组载体，该重组载体为显微注射载体。

本发明不限于如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与上述载体构成重组载体。

实施例4  家蚕BmCP283基因启动子在蛹期特异表达外源蛋白的运用

pHA3PIG（详见Tamura et al.,2000）被用作辅助质粒产生转座酶，用QIAGEN Plasimd Mini Kit（Qiagen）质粒抽提试剂盒分别提取pBac[BmCP283-DsRed-SV40,3xP3EGFP]和pHA4PIG质粒按1∶1摩尔比混合后显微注射至237粒已解除滞育的N4早期胚胎（G0代；产卵后2～5h）注射后的蚕卵用无毒脱水封口，25℃催青至孵化， 孵化的幼虫（G0代）采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵（第7天）在宏观体视荧光显微镜（Olypus MVX10, 日本）下检测，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性个体，如图2所示。筛选19个蛾圈后共获得2个转基因阳性蛾圈。

获得的转基因阳性个体饲养、传代，检测外源基因的表达。

启动子特异表达的检测和表达效率的测量可用如下方法：

通过反向PCR技术分析转基因阳性个体的插入位点。在G1代回交制种后，随机挑选G1代转基因蚕蛾提取基因组DNA，用限制性内切酶HaeⅢ消化过夜，然后对酶切产物进行纯化，连接，以纯化后的环化连接产物为模板，采用piggyBac转座子两臂引物进行PCR扩增，获得的目的片段进行测序分析。结果表明，在该转基因系中，重组载体序列随机插入到了家蚕第8号染色体nscaf2828重叠群的3660956位置上。

通过RT-PCR检测红色荧光蛋白基因在mRNA水平的组织与时期特异性。将所筛选的转基因阳性个体，分不同发育时间点取材，在液氮中瞬时冷却后放入-80℃冰箱备用。抽提所取材料的总RNA，反转录合成cDNA，分别采用DsRed基因特异引物进行RT-PCR检测，以RPL3作为对照。用于DsRed基因扩增的特异引物序列F为：5'-ACCGTGACCC AGGACTCCTC-3'（SEQ ID NO:5），特异引物序列R为:5'- CGCTACAGGAACAGGTGG -3'(SEQ ID NO:6)，反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30s，60℃退火30s，72 ℃延伸40s，共26个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

为胚胎期（图3）、幼虫期（图4）及变态期（图5）的RT-PCR表达谱结果发现，转基因阳性个体后代中DsRed基因只在化蛹7天时特异表达，在胚胎期和幼虫期中没有表达。这与BmCP283基因的表达特征一致，表明BmCP283基因启动子具有蛹期特异性。

进一步分析DsRed基因在转基因阳性个体蛹后期的组织表达发现，由图6所示，DsRed基因在化蛹第6天、7天和8天的头与翅组织中表达，而在表皮、胸组织中不表达。这表明BmCP283基因启动子是一个时期和组织特异的启动子。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

<110>  西南大学

<120>  家蚕蛹期特异的BmCP283基因启动子及其制备方法与运用

<160>  10

 

<210>  1

<211>  2004

<212>  DNA

<213>  家蚕(Bombyx mori)

<220> 

<223>  BmCP283基因启动子

<400>  1

ttttaggttt aagttacaca gcaaccaatt tttttttttt aactctactc taacctcaac      60

ataatttttt aatgattttc atttttatca cgtattaacg tgcgcaatga gcattgacat     120

ttttttttct gtaactggaa aaccgtttcg agaatttaca ggttacagcc gattaaaaaa     180

acgaatttct aatgaaacgt aattaacaat atttttataa aatacatttg gcctttgttt     240

tttgttttca aatgacgtca ttttttattc aaaaagagac tttagtctat atgcttatat     300

acaatatgtg tacgctcaag tgaaattaca tgatcttatt gataggctta aaacatacaa     360

aataaaggta ggtaggtata tctttgtttt taataaaaat cctttgcctc tgttctatgc     420

tccatgaaaa ttttaatcaa ctcatttcca attgacccac gctaagtgaa atcatgcttt     480

tgattcatgg tcacggttct gtaacgcata gtacgaaata tcctcacccc gatggaagtt     540

aaaggtctaa tcaaagacct acgtcgcaaa gctcccagtt ccgacggtat atctaaccac     600

gttaacgaag cggacgttat cggcatacat caaaaatcat ccgacgagct accgtccgat     660

tagcctcctc atgtctttag gcaaactcta taagcgtctg ctctacaggc gcctcagaga     720

cttcgcctcc tccaaaggca ttctgatcga tgaacaattc agattccgtg caaatcactc     780

atacgtataa caggtgcacc gtctcatgga gcacattctc gtacggctca actgaccaaa     840

accgttctac acgggagccc ttcttttgga cgttgcaaaa gcgtttgaca agcctggcac     900

aacggtttga ttttcgaact attcaacata agcataccag acagtctcgt gctcatcata     960

cggaacttct tatcgaacca ctctcttcca tatggagtcg aaggaacctg cttctcccca    1020

cgacctctca cggctgtaat ctggcaaggc tccctcctct cgccgctcct atttatttta    1080

tttattaacg aaatttcccg gtcgccgccg acctagttag ccttattcgt cggtttgaag    1140

ggtggggcag ccgttgtaac tatacgtgag accttagaac ttatatctca aggtgggtgg    1200

cgcatttgcg ttgtggatgt ctatgagctc cagtagccgc ttcacaccag gtgggctgtg    1260

agctcgtcca cccatctaag caataaaaaa taaataaata aagagtgcaa atgcggtcct    1320

tgggtccgcg gtttcctacc gagatctgcg gaccctccag ttccacatgc accgcgcgca    1380

gcctaggcgc ggagacttcg taggaggttc agccccgacc tagaaaaaag gggttcgacg    1440

aaattaaact atataaagta acaacgaaat tacataacat aacaaaataa aatttaacgg    1500

taggcagcgg cttggctctg cccctgacat tgccgacgtc catgggcgac ggtaaccact    1560

cacaatcagg tgggccctat gctcgtctgc ctttacggca ataaaaaaca aataaaaaac    1620

taggtagaga aaaggtgcaa agtaatatga acaaaaagca aattaaaaat gcattaactg    1680

gacaaacctc aaaaaggcta tagaatccac tataatacac tgttctcgca atgccttaaa    1740

taggaatagc gatgtatcat ttaataaact actcatgaaa cgcacatgca gtaatttaaa    1800

ccaccaacat aacctcgttt tctttcgcag cattgatgaa cacgcccatc ctcaatcgag    1860

aaaatctacc aaatcgatgc gtaattgctt ctaaattaat tcttttgcag gatgccaatg    1920

attactagtc aacattttta tgcgtataaa tacttgaaga ataccatccg atgttacatg    1980

tgttcggaac atcaagataa caca                                                   2004

<210>  2

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  BmCP283基因启动子引物F

<400> 2

acgcgtcgac atcctcaccc cgatggaagt ta    32

 

<210>  3

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  BmCP283基因启动子引物R

<400> 3

cgggatcctg tgttatcttg atgttccgaa        30

 

<210>  4

<211>  2943

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  pSL[BmCP283-DsRed-SV40]表达框

<400>  4

ttttaggttt aagttacaca gcaaccaatt tttttttttt aactctactc taacctcaac      60

ataatttttt aatgattttc atttttatca cgtattaacg tgcgcaatga gcattgacat     120

ttttttttct gtaactggaa aaccgtttcg agaatttaca ggttacagcc gattaaaaaa     180

acgaatttct aatgaaacgt aattaacaat atttttataa aatacatttg gcctttgttt     240

tttgttttca aatgacgtca ttttttattc aaaaagagac tttagtctat atgcttatat     300

acaatatgtg tacgctcaag tgaaattaca tgatcttatt gataggctta aaacatacaa     360

aataaaggta ggtaggtata tctttgtttt taataaaaat cctttgcctc tgttctatgc     420

tccatgaaaa ttttaatcaa ctcatttcca attgacccac gctaagtgaa atcatgcttt     480

tgattcatgg tcacggttct gtaacgcata gtacgaaata tcctcacccc gatggaagtt     540

aaaggtctaa tcaaagacct acgtcgcaaa gctcccagtt ccgacggtat atctaaccac     600

gttaacgaag cggacgttat cggcatacat caaaaatcat ccgacgagct accgtccgat     660

tagcctcctc atgtctttag gcaaactcta taagcgtctg ctctacaggc gcctcagaga     720

cttcgcctcc tccaaaggca ttctgatcga tgaacaattc agattccgtg caaatcactc     780

atacgtataa caggtgcacc gtctcatgga gcacattctc gtacggctca actgaccaaa     840

accgttctac acgggagccc ttcttttgga cgttgcaaaa gcgtttgaca agcctggcac     900

aacggtttga ttttcgaact attcaacata agcataccag acagtctcgt gctcatcata     960

cggaacttct tatcgaacca ctctcttcca tatggagtcg aaggaacctg cttctcccca    1020

cgacctctca cggctgtaat ctggcaaggc tccctcctct cgccgctcct atttatttta    1080

tttattaacg aaatttcccg gtcgccgccg acctagttag ccttattcgt cggtttgaag    1140

ggtggggcag ccgttgtaac tatacgtgag accttagaac ttatatctca aggtgggtgg    1200

cgcatttgcg ttgtggatgt ctatgagctc cagtagccgc ttcacaccag gtgggctgtg    1260

agctcgtcca cccatctaag caataaaaaa taaataaata aagagtgcaa atgcggtcct    1320

tgggtccgcg gtttcctacc gagatctgcg gaccctccag ttccacatgc accgcgcgca    1380

gcctaggcgc ggagacttcg taggaggttc agccccgacc tagaaaaaag gggttcgacg    1440

aaattaaact atataaagta acaacgaaat tacataacat aacaaaataa aatttaacgg    1500

taggcagcgg cttggctctg cccctgacat tgccgacgtc catgggcgac ggtaaccact    1560

cacaatcagg tgggccctat gctcgtctgc ctttacggca ataaaaaaca aataaaaaac    1620

taggtagaga aaaggtgcaa agtaatatga acaaaaagca aattaaaaat gcattaactg    1680

gacaaacctc aaaaaggcta tagaatccac tataatacac tgttctcgca atgccttaaa    1740

taggaatagc gatgtatcat ttaataaact actcatgaaa cgcacatgca gtaatttaaa    1800

ccaccaacat aacctcgttt tctttcgcag cattgatgaa cacgcccatc ctcaatcgag    1860

aaaatctacc aaatcgatgc gtaattgctt ctaaattaat tcttttgcag gatgccaatg    1920

attactagtc aacattttta tgcgtataaa tacttgaaga ataccatccg atgttacatg    1980

tgttcggaac atcaagataa cacaacgcgt cgacatggtg cgctcctcca agaacgtcat    2040

caaggagttc atgcgcttca aggtgcgcat ggagggcacc gtgaacggcc acgagttcga    2100

gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggccac aacaccgtga agctgaaggt    2160

gaccaagggc ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tccccccagt tccagtacgg    2220

ctccaaggtg tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacaagaagc tgtccttccc    2280

cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac    2340

ccaggactcc tccctgcagg acggctgctt catctacaag gtgaagttca tcggcgtgaa    2400

cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctccaccga    2460

gcgcctgtac ccccgcgacg gcgtgctgaa gggcgagatc cacaaggccc tgaagctgaa    2520

ggacggcggc cactacctgg tggagttcaa gtccatctac atggccaaga agcccgtgca    2580

gctgcccggc tactactacg tggactccaa gctggacatc acctcccaca acgaggacta    2640

caccatcgtg gagcagtacg agcgcaccga gggccgccac cacctgttcc tgtagcggcc    2700

gcgactctag atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa    2760

cctcccacac ctcccataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata    2820

aagcattttt ttcacctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg    2880

tttattgcag cttctgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaaag    2940

ctt                                                                              2943

 

<210>  5

<211> 

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>  20

<223>  DsRed基因引物F

<400> 5

accgtgaccc aggactcctc     20

 

<210>  6

<211> 

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>  18

<223>  DsRed基因引物R

<400> 6

cgctacagga acaggtgg   18

 

<210>  7

<211>  1743

<212>  DNA

<213>  家蚕(Bombyx mori)

<220> 

<223>  BmCP283基因启动子截短片段1

<400>  7

ttttaggttt aagttacaca gcaaccaatt tttttttttt aactctactc taacctcaac      60

ataatttttt aatgattttc atttttatca cgtattaacg tgcgcaatga gcattgacat     120

ttttttttct gtaactggaa aaccgtttcg agaatttaca ggttacagcc gattaaaaaa     180

acgaatttct aatgaaacgt aattaacaat atttttataa aatacatttg gcctttgttt     240

tttgttttca aatgacgtca ttttttattc aaaaagagac tttagtctat atgcttatat     300

acaatatgtg tacgctcaag tgaaattaca tgatcttatt gataggctta aaacatacaa     360

aataaaggta ggtaggtata tctttgtttt taataaaaat cctttgcctc tgttctatgc     420

tccatgaaaa ttttaatcaa ctcatttcca attgacccac gctaagtgaa atcatgcttt     480

tgattcatgg tcacggttct gtaacgcata gtacgaaata tcctcacccc gatggaagtt     540

aaaggtctaa tcaaagacct acgtcgcaaa gctcccagtt ccgacggtat atctaaccac     600

gttaacgaag cggacgttat cggcatacat caaaaatcat ccgacgagct accgtccgat     660

tagcctcctc atgtctttag gcaaactcta taagcgtctg ctctacaggc gcctcagaga     720

cttcgcctcc tccaaaggca ttctgatcga tgaacaattc agattccgtg caaatcactc     780

atacgtataa caggtgcacc gtctcatgga gcacattctc gtacggctca actgaccaaa     840

accgttctac acgggagccc ttcttttgga cgttgcaaaa gcgtttgaca agcctggcac     900

aacggtttga ttttcgaact attcaacata agcataccag acagtctcgt gctcatcata     960

cggaacttct tatcgaacca ctctcttcca tatggagtcg aaggaacctg cttctcccca    1020

cgacctctca cggctgtaat ctggcaaggc tccctcctct cgccgctcct atttatttta    1080

tttattaacg aaatttcccg gtcgccgccg acctagttag ccttattcgt cggtttgaag    1140

ggtggggcag ccgttgtaac tatacgtgag accttagaac ttatatctca aggtgggtgg    1200

cgcatttgcg ttgtggatgt ctatgagctc cagtagccgc ttcacaccag gtgggctgtg    1260

agctcgtcca cccatctaag caataaaaaa taaataaata aagagtgcaa atgcggtcct    1320

tgggtccgcg gtttcctacc gagatctgcg gaccctccag ttccacatgc accgcgcgca    1380

gcctaggcgc ggagacttcg taggaggttc agccccgacc tagaaaaaag gggttcgacg    1440

aaattaaact atataaagta acaacgaaat tacataacat aacaaaataa aatttaacgg    1500

taggcagcgg cttggctctg cccctgacat tgccgacgtc catgggcgac ggtaaccact    1560

cacaatcagg tgggccctat gctcgtctgc ctttacggca ataaaaaaca aataaaaaac    1620

taggtagaga aaaggtgcaa agtaatatga acaaaaagca aattaaaaat gcattaactg    1680

gacaaacctc aaaaaggcta tagaatccac tataatacac tgttctcgca atgccttaaa    1740

tag                                                                              1743

 

<210>  8

<211>  1485

<212>  DNA

<213>  家蚕(Bombyx mori)

<220> 

<223>  BmCP283基因启动子截短片段2

<400>  8

ttttaggttt aagttacaca gcaaccaatt tttttttttt aactctactc taacctcaac      60

ataatttttt aatgattttc atttttatca cgtattaacg tgcgcaatga gcattgacat     120

ttttttttct gtaactggaa aaccgtttcg agaatttaca ggttacagcc gattaaaaaa     180

acgaatttct aatgaaacgt aattaacaat atttttataa aatacatttg gcctttgttt     240

tttgttttca aatgacgtca ttttttattc aaaaagagac tttagtctat atgcttatat     300

acaatatgtg tacgctcaag tgaaattaca tgatcttatt gataggctta aaacatacaa     360

aataaaggta ggtaggtata tctttgtttt taataaaaat cctttgcctc tgttctatgc     420

tccatgaaaa ttttaatcaa ctcatttcca attgacccac gctaagtgaa atcatgcttt     480

tgattcatgg tcacggttct gtaacgcata gtacgaaata tcctcacccc gatggaagtt     540

aaaggtctaa tcaaagacct acgtcgcaaa gctcccagtt ccgacggtat atctaaccac     600

gttaacgaag cggacgttat cggcatacat caaaaatcat ccgacgagct accgtccgat     660

tagcctcctc atgtctttag gcaaactcta taagcgtctg ctctacaggc gcctcagaga     720

cttcgcctcc tccaaaggca ttctgatcga tgaacaattc agattccgtg caaatcactc     780

atacgtataa caggtgcacc gtctcatgga gcacattctc gtacggctca actgaccaaa     840

accgttctac acgggagccc ttcttttgga cgttgcaaaa gcgtttgaca agcctggcac     900

aacggtttga ttttcgaact attcaacata agcataccag acagtctcgt gctcatcata     960

cggaacttct tatcgaacca ctctcttcca tatggagtcg aaggaacctg cttctcccca    1020

cgacctctca cggctgtaat ctggcaaggc tccctcctct cgccgctcct atttatttta    1080

tttattaacg aaatttcccg gtcgccgccg acctagttag ccttattcgt cggtttgaag    1140

ggtggggcag ccgttgtaac tatacgtgag accttagaac ttatatctca aggtgggtgg    1200

cgcatttgcg ttgtggatgt ctatgagctc cagtagccgc ttcacaccag gtgggctgtg    1260

agctcgtcca cccatctaag caataaaaaa taaataaata aagagtgcaa atgcggtcct    1320

tgggtccgcg gtttcctacc gagatctgcg gaccctccag ttccacatgc accgcgcgca    1380

gcctaggcgc ggagacttcg taggaggttc agccccgacc tagaaaaaag gggttcgacg    1440

aaattaaact atataaagta acaacgaaat tacataacat aacaa                       1485

 

<210>  9

<211>  1189

<212>  DNA

<213>  家蚕(Bombyx mori)

<220> 

<223>  BmCP283基因启动子截短片段3

<400>  9

ttttaggttt aagttacaca gcaaccaatt tttttttttt aactctactc taacctcaac      60

ataatttttt aatgattttc atttttatca cgtattaacg tgcgcaatga gcattgacat     120

ttttttttct gtaactggaa aaccgtttcg agaatttaca ggttacagcc gattaaaaaa     180

acgaatttct aatgaaacgt aattaacaat atttttataa aatacatttg gcctttgttt     240

tttgttttca aatgacgtca ttttttattc aaaaagagac tttagtctat atgcttatat     300

acaatatgtg tacgctcaag tgaaattaca tgatcttatt gataggctta aaacatacaa     360

aataaaggta ggtaggtata tctttgtttt taataaaaat cctttgcctc tgttctatgc     420

tccatgaaaa ttttaatcaa ctcatttcca attgacccac gctaagtgaa atcatgcttt     480

tgattcatgg tcacggttct gtaacgcata gtacgaaata tcctcacccc gatggaagtt     540

aaaggtctaa tcaaagacct acgtcgcaaa gctcccagtt ccgacggtat atctaaccac     600

gttaacgaag cggacgttat cggcatacat caaaaatcat ccgacgagct accgtccgat     660

tagcctcctc atgtctttag gcaaactcta taagcgtctg ctctacaggc gcctcagaga     720

cttcgcctcc tccaaaggca ttctgatcga tgaacaattc agattccgtg caaatcactc     780

atacgtataa caggtgcacc gtctcatgga gcacattctc gtacggctca actgaccaaa     840

accgttctac acgggagccc ttcttttgga cgttgcaaaa gcgtttgaca agcctggcac     900

aacggtttga ttttcgaact attcaacata agcataccag acagtctcgt gctcatcata     960

cggaacttct tatcgaacca ctctcttcca tatggagtcg aaggaacctg cttctcccca    1020

cgacctctca cggctgtaat ctggcaaggc tccctcctct cgccgctcct atttatttta    1080

tttattaacg aaatttcccg gtcgccgccg acctagttag ccttattcgt cggtttgaag    1140

ggtggggcag ccgttgtaac tatacgtgag accttagaac ttatatctc                  1189

 

<210>  10

<211>  389

<212>  DNA

<213>  家蚕(Bombyx mori)

<220> 

<223>  BmCP283基因启动子截短片段3

<400>  10

ttttaggttt aagttacaca gcaaccaatt tttttttttt aactctactc taacctcaac      60

ataatttttt aatgattttc atttttatca cgtattaacg tgcgcaatga gcattgacat     120

ttttttttct gtaactggaa aaccgtttcg agaatttaca ggttacagcc gattaaaaaa     180

acgaatttct aatgaaacgt aattaacaat atttttataa aatacatttg gcctttgttt     240

tttgttttca aatgacgtca ttttttattc aaaaagagac tttagtctat atgcttatat     300

acaatatgtg tacgctcaag tgaaattaca tgatcttatt gataggctta aaacatacaa     360

aataaaggta ggtaggtata tctttgttt                                              389

 

 

Claims (2)

1.家蚕BmCP283基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.家蚕BmCP283基因启动子的截短片段，其特征在于：家蚕BmCP283基因启动子的截短片段，所述截短片段为如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的家蚕BmCP283基因启动子的制备方法，其特征在于，具体步骤为：以家蚕基因组为模板进行PCR扩增，其中上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示；

扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，59.9℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 分钟，得如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子。

4.含有权利要求1所述的家蚕BmCP283基因启动子的重组载体。

5.含权利要求1所述的家蚕BmCP283基因启动子的重组载体的制备方法，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组质粒pMD19-BmCP283，分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切pMD19-BmCP283质粒，回收家蚕BmCP283基因启动子与分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切的pSL[ser1-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成pSL[BmCP283-DsRed-SV40]，然后用AscⅠ酶切所得pSL[BmCP283-DsRed-SV40]，得BmCP283-DsRed-SV40片段，将酶切所获得的BmCP283-DsRed-SV40片段连接到AscⅠ酶切的pBac[3xP3-EGFPafm]基础载体，构建成含家蚕BmCP283基因启动子的重组载体。

6.如权利要求1所述的家蚕BmCP283基因启动子在家蚕蛹后期表达外源蛋白中的应用。

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