JP2001513336A

JP2001513336A - トランスジェニック動物の生産における「マリーナ」トランスポザンの使用

Info

Publication number: JP2001513336A
Application number: JP2000507225A
Authority: JP
Inventors: サングヘレン; ジョンフインガンデイヴィッド
Original assignee: ロスリンインスティチュート（エディンバラ）
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-21
Publication date: 2001-09-04
Also published as: CA2300972A1; WO1999009817A1; EP1006790A1; AU8817798A

Abstract

(57)【要約】トランスジェニック動物の胚を調製する方法であって、転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）を動物の胚細胞中に導入する工程を含み、そして外因性トランスポザーゼタンパク質、又はトランスポザーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を導入する工程を任意選択可能に含んで成る方法。その結果得られる胚はさらなる胚を形成させるために又は動物に発育させるために使用することができる。本発明は、選択した動物に外来ＤＮＡを導入する上で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は動物の胚に転移遺伝子を導入する方法に関し、そしてそれからのトラ
ンスジェニック動物の調製に関する。

【０００２】新たな受精卵内に、その胚細胞の最初の卵割の前に、マイクロインジェクショ
ンにより外来性のＤＮＡを導入する方法は、トランスジェニック動物の確立され
た生産方法となってきた。この外来性ＤＮＡは動物の染色体内に組み込まれ、そ
して創始動物であるトランスジェニック動物の子孫により安定な付加的配列とし
て遺伝的に承継される。

【０００３】この染色体への組み込みが起こる頻度は種間で変動する。この頻度は注入の場
所によっても影響される。このＤＮＡが受精卵の前核の一つの中に導入されると
きは、トランスジェニック動物の生産の頻度は一般に高くなる。

【０００４】転移因子とは、生物のゲノム内の異なる部位に転移することができるＤＮＡの
配列と定義される。転移因子は、一つのゲノム部位から別のゲノム部位に移動す
るために使用するメカニズムにより、幾つかの異なるクラスに分けることができ
る。転移因子の能力は、特定の種由来の転移因子をその種のゲノム中に外来遺伝
子を導入するためのベクターとして使用することを可能とするように修飾されて
きた。例えば、ドロソフィラ・メラノガスター由来のＰ因子はディー．メラノガ
スターを形質転換するために広く使用されている（ルービン，ジー．エム．及び
スプラドリング，エイ．シー．，Science 218 348-353 (1982)及びＵＳ−Ａ−４
６７０３８８）。

【０００５】新たな受精卵由来のニワトリ胚を培養して孵化したニワトリを生産する方法が
発展し、それはＥＰ−Ａ−０２９５９６４及びペリー，エム．エム．Nature 331 70-72 (1988) に記述されている。続いて、ニワトリの接合体の細胞質内にＤＮ
Ａを注入する方法、すなわちジャーミナル・ディスクがサング，エイチ．エム．
及びペリー，エム．エム., Mol. Reprod. Development 1 98-106 (1989) 及びペ
リーら Roux's Archive of Developmental Biology 200 312-319 (1991) 。トラ
ンスジェニック鳥の生産におけるこれらの技術の使用はラブら Bio/Technology 12 60-63 (1994) で報告された。しかしながら、トランスジェニック鳥の生産の
ためのこの手順を継続的に使用すると、得ることができるトランスジェニック鳥
の頻度は、その子孫へ移転される外来性ＤＮＡの組み込みで判断すると、低い、
すなわち生ニワトリ総数２５４からの、生殖系列トランスジェニック鳥は３羽で
あった。

【０００６】従って、この方法の効率は比較的低く、ＤＮＡ注射後に孵化されたニワトリの
僅か１％又はそれ未満しかそのゲノム中に注射されたＤＮＡを組み込まなかった
。さらに、これらのトランスジェニック鳥のそれぞれから１個のトランスジェニ
ック系列しか得られなかった。すなわち、このトランスジェニック子孫は１個の
染色体部位に外来性ＤＮＡを数コピー含むだけである。

【０００７】細胞質中へのＤＮＡ構築物の注入も、前核注射に比べると、哺乳動物では極め
て非効率的である（ブリンスターら Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82 4438-4442
(1985))。また、前核注射により生産された転移遺伝子の大部分は注射されたＤ
ＮＡ構築物の多重コピーのアレーから成る。これらのアレーの構造は転移遺伝子
の発現に対し負の効果を及ぼし得る、すなわち、発現のレベルを減少させあるい
は発現の組織特異性に悪影響を与え得る。

【０００８】トランスジェニック鳥はレトロウイルスベクターの感染を用いても生産されて
きた（ボセルマンら Science 243 533-535 (1989))。しかしながら、レトロウイ
ルスベクターの使用は幾つかの不利益がある。家禽集団に広く拡がる野生型レト
ロウイルスとウイルスベクターの組換えの危険性は最も深刻な問題と考えられる
。レトロウイルスベクターはそれを用いて作業するのに極めて複雑でありそして
約８キロ塩基対より大きな構築物を組み込むことにその能力が制限される。

【０００９】転移因子「マリーナ」は最初ドロソフィラ・マウリティアーナのゲノム中で発
見されたが、密接に関連する因子が脊椎動物及び無脊椎動物の両方の広範囲の種
で発見されてきた（ロバートソン，エイチ．エム．Nature 362 241 (1993))。そ
れは、ライシュマニアなどの病原性生物を研究するためにも使用されてきた（グ
エイロス−フィルホ，エフ．ジェイ．及びビバリー，エス．エム．Science 276 1716-1719 (1997)及びハートル，ディー．エル．Science 276 1659-1660 (1997)
) 。しかしながら、グエイロス−フィルホら及びハートルにより記述された「マ
リーナ」の使用は遺伝的道具としての使用、すなわち、挿入的突然変異誘発用に
関連するもののみであり、そして遺伝子導入（transgenesis) 又は突然変異誘発
によりトランスジェニック動物を調製するための手段としての使用には関連しな
かった。要するに、「マリーナ」はトランスジェニック動物の生産における役割
について適当であるとは記述されず、そしてそのような使用は先行技術では決し
て期待されていないのである。

【００１０】驚くべきことに、「マリーナ」因子はトランスジェニック動物の調製における
ベクターとして使用することができることがここに発見されたのである。

【００１１】本発明の第１の側面によれば、転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬ
Ｅ）を動物の胚細胞内へ導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパク
質又はトランスポザーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を導入する工程
を任意選択可能に含んで成るトランスジェニック動物胚を調製する方法が提供さ
れる。

【００１２】トランスジェニックという用語は、本発明の文脈においては、外来性ＤＮＡの
配列がトランスジェニック子孫動物の代々の世代へと譲渡されるように「マリー
ナ」−様因子（ＭＬＥ）によって導入される外来性ＤＮＡの配列が動物染色体内
に安定に組み込まれた動物を記述するために用いられる。このような状況では、
最初のトランスジェニック動物は「創始」動物として知られる。この創始動物は
その子孫が安定にこの転移遺伝子を遺伝的に承継するように、組み込まれた外来
性ＤＮＡ又は転移遺伝子をその細胞のすべてに又は十分な割合で持っている。転
移遺伝子がその動物の細胞の一部にだけ存在するときは、この動物はキメラと呼
ばれる。本発明は安定に又は直接的に転移遺伝子を染色体中に組み込んでいる動
物であってその子孫まで遺伝子を譲渡することなくその体細胞中に転移遺伝子を
発現する動物にも広げられる。

【００１３】動物に関して「トランスジェニック」という用語は、別の種由来の一つ以上の
遺伝子をその生殖系列中に含む動物を指すことに限定するものと解すべきでない
。ただし、多くのトランスジェニック動物はそのような遺伝子又は遺伝子群を含
むであろうが。むしろ、この用語は、もっと広く、その生殖系列が「マリーナ」
−様因子（ＭＬＥ）の導入の対象となったすべての動物を指すのである。そうで
あるから、例えば、その生殖系列において内因性遺伝子が欠失、重複、活性化、
又は修飾されてしまった動物は、外因性ＤＮＡ配列がその生殖系列に付加された
動物と同様に本発明の目的にとってはトランスジェニック動物である。

【００１４】原理的には、本発明は、鶏などの鳥類、両生類及び魚類を含むすべての動物に
適用可能である。しかしながら、実用的には、最大の商業的に有用な適用可能性
が現在予想されるのは、非−ヒト動物（温血脊椎動物）、殊に（非−ヒト）哺乳
動物、特に胎盤哺乳動物、そして鳥、特に家禽に対するものである。この発明が
最も有用であるように思われるのは、有蹄類、牛、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダ
及びブタなどの特に経済的に重要な有蹄類についてである。鳥類の中では、本発
明は、鶏、ガルス・ドメスティクス、七面鳥及びホロホロチョウなどの家禽に対
する特別な適用を有する。本発明は、例えば、馬、ラマ又はラット、マウス又は
ウサギなどのげっ歯類のような他の経済的に重要な動物種に適用可能でもある。

【００１５】本発明の方法は動物胚細胞内への外来性ＤＮＡ又は転移遺伝子の導入に直接向
けられる。この胚細胞は接合体段階である受精直後の単一細胞段階にあるもので
よい。しかしながら、その導入は胚発育の後期の段階、例えば、２−細胞、４−
細胞、８−細胞、１６−細胞、３２−細胞、又は６４−細胞段階の胚からの、又
はさらに後の段階からの胚細胞内へのものでもよい。このような後期段階胚から
作成された創始動物であるトランスジェニック動物は、従って、キメラであるこ
とがあるが、その子孫から全ての細胞中に転移遺伝子が存在するものを選択する
ことが可能である。

【００１６】「マリーナ」−様因子はドロソフィラ・マウリティアーナ由来の転移因子「マリ
ーナ」であることもあり、又は別の脊椎動物もしくは無脊椎動物種由来の近縁の
因子であってもよい（ロバートソン，エイチ．エム．Nature 362 241 (1993))。
「マリーナ」−様因子は、便宜的に、染色体変更の対象となる動物の細胞から誘
導することもできる。「マリーナ」−様因子のヌクレオチド配列は、細胞内に導
入されるとき転移因子として働くその能力によって規定することができる。

【００１７】「マリーナ」−様転移因子は約３６ｂｐの末端の逆方向反復を持つ約１，３０
０ｂｐ長のものである。「マリーナ」−様因子はそれぞれ、トランスポザーゼと
推定されるポリペプチドであって、他の「マリーナ」−様因子がコードするポリ
ペプチドと平均して３４％のアミノ酸配列同一性を持つポリペプチドをコードす
る。すべての「マリーナ」−様因子の推定的トランスポザーゼのアミノ酸配列は
Ｄ、Ｄ３４Ｄとして知られる特徴的なモチーフを含む。ここで、「Ｄ」はアスパ
ルギン酸残基を表す。このモチーフの第３のアスパラギン酸の直ぐ後にチロシン
残基がくる（ロバートソン，エイチ．エム．J. Insect Physiol. 41 99-105 (19
95))。

【００１８】転移遺伝子は「マリーナ」−様因子内では「マリーナ」配列内のどの位置にで
も含まれることができる。理論にとらわれることなく、「マリーナ」−様因子の
それぞれの末端の最後のほぼ１００塩基がＭＬＥの機能にとってそして細胞染色
体中へのその組み込みにとって重要であると信じられている。こうして、転移遺
伝子は、それぞれの末端からほぼ１００塩基以内を除き、ＭＬＥ内のどこにでも
配置されうる。転移遺伝子はＭＬＥの中央の配列を置換してその因子の末端のみ
が残っているものを生ずることもできる。

【００１９】「マリーナ」−様因子内に含まれる転移遺伝子配列は望ましい外来遺伝子配列
のいかなるものでもよい。特に好ましい遺伝子配列としては、酵素、ホルモン又
は他の機能的に活性なタンパク質、例えば、免疫グロブリン、ヘモグロビン、ミ
オグロビン、チトクローム等の治療上有用なタンパク質をコードする遺伝子配列
が挙げられるが、これらに限定されない。他の遺伝子配列は、その遺伝子が存在
しないか又は突然変異しており対応するタンパク質が生産されず又は活性型で生
産されないタンパク質をコードすることができる、すなわち、嚢胞性腺維症又は
筋ジストロフィーなどの疾病状態の原因となる遺伝子である。

【００２０】転移遺伝子配列が、動物の乳の分泌のための乳腺などの選択された組織中に、
卵黄もしくは卵のアルブミン中に、又は血液中に転移遺伝子の発現を指示するた
めのプロモーター配列を含むことは一般的である。さらなる適用では、トランス
ジェニック宿主動物の器官を、その細胞内で発現する免疫タンパク質に対し同種
異系である受容体中への異種移植に使用できるように免疫拒絶を制御する調節タ
ンパク質の発現を含んでいる。同様に、同種移植も含まれる。

【００２１】農業への適用では、本発明の方法は改良された農場動物を生産するために使用
することができる。動物中に導入される転移遺伝子としては、疾病抵抗性遺伝子
、生長促進性遺伝子、又は特定の性質に改良された特徴を付与しもしくは新規な
性質を導入する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２２】「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）の導入は、細胞質中へ又は接合体の前核もし
くは動物胚細胞の核中へＭＬＥを注入することにより便宜的に達成することがで
きる。電気穿孔又はリポソームなどの、導入の他の経路も本発明の方法に同様に
効果的であり、使用することができる。

【００２３】このＭＬＥは「マリーナ」−様因子のＤＮＡ配列及び望ましい転移遺伝子を含
む構築物の形で導入することができ、あるいは単に「マリーナ」−様因子のヌク
レオチド配列と望ましい転移遺伝子それ自体を導入することもできる。ベクター
系導入法が用いられる場合、構築物はプラスミド、コスミド又は酵母人工染色体
（ＹＡＣ）もしくは細菌人工染色体（ＢＡＣ）などの人為的染色体であってもよ
い。この構築物は、必要なときは、導入される外来ＤＮＡに応じて、プロモータ
ー又はエンハンサーなどの付加的な調節配列を含んでいてもよい。従って、本発
明のさらなる側面は上述の転移遺伝子をふくむ「マリーナ」−様因子を含む構築
物又はベクターである。一般に、ＭＬＥは転移遺伝子の操作及びクローニングの
し易さの観点からプラスミド中にクローニングされる。転移を促進するためＤＮ
ＡがスーパーコイルとなるようにＭＬＥベクターを環状分子にすることも好まし
い。

【００２４】本発明の方法は、「マリーナ」−様因子の導入の時に、又はその少し前又はそ
の少し後に、外因性トランスポザーゼタンパク質、又はトランスポザーゼをコー
ドするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を導入する付加的な任意選択可能な工程を含ん
でもよい。

【００２５】細胞内に導入される「マリーナ」−様因子及びトランスポザーゼは同一動物種
由来でも異なる種由来のものでもよい。

【００２６】本発明の第２の側面によれば、転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬ
Ｅ）を動物の成熟細胞中に導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパ
ク質又はトランスポザーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を導入する工
程を任意選択可能に含んで成るトランスジェニック動物胚を調製する方法が提供
される。

【００２７】本発明の第３の側面によれば、転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬ
Ｅ）を動物の胎児細胞中に導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパ
ク質又はトランスポザーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を導入する工
程を任意選択可能に含んで成るトランスジェニック動物胚を調製する方法が提供
される。

【００２８】本発明の第１、第２及び第３の側面に記載の方法のいずれか一つにおいて、そ
の結果得られる動物胚は（ｉ）転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子の導入そ
して染色体中へのその挿入の後、その細胞の核を取り出す工程、そして（ii) 続
いて、その核を除核卵母細胞中へ導入しそれを動物胚に発育させる工程により調
製することができる。核転移技術を用いる動物胚の調製を記述した幾つかの方法
があり、そして好ましい技術としては、ＷＯ−Ａ−9607732 、ＷＯ−Ａ−970766
9 及びＷＯ−Ａ−9707668 に記述されたものが挙げられるが、これらに限定され
ない。

【００２９】上述の発明の方法では、核は供与細胞から受容細胞へ転移される。この方法の
使用は特定の供与細胞型に限定されない。供与細胞は、ウイルマットら Nature 385 810 (1997)、キャンベルら Nature 380 64-66 (1996)、又はシベッリら Sci
ence 280 1256-1258 (1998) に記述されているようなものである。核転移に使用
して成功し得る胚細胞、胎児細胞及び成熟体細胞を含む正常な核型の細胞はすべ
て、原理的には本発明の方法に用いることができる。胎児繊維芽細胞は特に有用
な供与細胞のクラスである。一般に適する核転移の適当な方法は、キャンベルら
Theriogenology 43 181 (1995) 、コラスら Mol. Reprod. Dev. 38 264-267 (1
994)、キーファーら Biol. Reprod. 50 935-939 (1994)、シムズら Proc. Nat'l
. Acad. Sci. USA 90 6143-6147 (1993)、ＷＯ−Ａ−9426884 、ＷＯ−Ａ−9424
274 、ＷＯ−Ａ−9807841 、ＷＯ−Ａ−9827214 、ＷＯ−Ａ−9003432 、ＵＳ−
Ａ−4994384 及びＵＳ−Ａ−5057420 に記述されている。従って、本発明は、完
全に分化した細胞を含む少なくとも部分的に分化した細胞の使用を予定する。供
与細胞は培養細胞でもよいが、これに限られる必要はなく、静止細胞でもよい。
静止している核の供与細胞は静止に入るように誘導され得る細胞又はイン・ビボ
で静止状態で存在する細胞である。培養された牛の一次繊維芽細胞、胚由来のヒ
ツジ細胞系（ＴＮＴ４）、６歳の成熟ヒツジからのヒツジ乳上皮細胞由来の細胞
系（ＯＭＥ）、ヒツジ胎児組織由来の繊維芽細胞の細胞系（ＢＬＷＦ１）及び９
日齢ヒツジ胚由来の上皮−様細胞系（ＳＥＣ１）がＷＯ−Ａ−9707669 及びＷＯ
−Ａ−9707668 に記述されている。ＴＮＴ４細胞系を含む本発明に有用な胚由来
の細胞系の１クラスがＷＯ−Ａ−96/07732に記述されている。培養された内部細
胞マス（ＣＩＣＭ）細胞はＷＯ−Ａ−9737009 及びＷＯ−Ａ−9827214 に記述さ
れ、そして胚細胞系又は幹−様細胞系はＷＯ−Ａ−9807841 に記述されている。
核供与体として使用するためのトランスジェニック牛の繊維芽細胞はザワダら (
Nature Medicine 4 (5) 569-574 (1998)及びシベッリら (Science 280 1256-125
8 (1998)に記述されている。

【００３０】供与細胞が静止していると記述される場合、このような細胞は分裂細胞周期に
より活発に増殖していることはないであろう。静止供与細胞の使用はＷＯ−Ａ−
9707669 に記述されている。分裂細胞周期には四つの異なる相、すなわち、Ｇ１
、Ｓ、Ｇ２及びＭがある。細胞周期における開始の事象は「開始点（細胞周期の
）」と呼ばれ、Ｇ１相で起こり、そしてユニークな機能を持っている。別の細胞
周期を受けようとする決定又は約束は「開始点」でなされる。一旦細胞が「開始
点」を通過すると、それは前−ＤＮＡ合成相である、Ｇ１相の残りを通過する。
第２の段階であるＳ相はＤＮＡ合成が起こる相である。この相の次にＤＮＡ合成
と有糸分裂の間の期間であるＧ２相が来る。有糸分裂それ自体はＭ相で起こる。
静止細胞（静止が誘導された細胞並びにある種の完全に分化した細胞などの自然
状態で静止している細胞を含む）は一般にこの周期の四つの相のいずれにも存在
しないものとみなされる。これらの静止細胞は、これらがこの周期を通って正常
に進行しないことを示すために、Ｇ０状態にあると通常記述される。静止Ｇ０細
胞の核は内容物として二倍体ＤＮＡを持っている。

【００３１】培養細胞は、化学的処理、栄養枯渇、成長阻害又は遺伝子発現の操作などを含
む種々の方法により静止状態に入るように誘導することができる。今日では、培
養培地中の血清レベルの減少を用いて、ヒツジ及び牛両方の細胞系で静止を誘導
するのに成功している。この状況では、細胞はＧ１相の間の成長周期を出て、上
に説明したように、いわゆるＧ０段階に置かれている。このような細胞は再び刺
激され成長周期に再突入するときまで、数日間（おそらく細胞によってはもっと
長く）この状態に留まることができる。Ｇ０状態に置かれた静止細胞は二倍体で
ある。このＧ０状態は、細胞がそれから分化することができる細胞周期の中の重
要な点である。静止の際に、幾つかの代謝的変化が報告されてきており、これら
には、モノリン酸化ヒストン、繊毛中心粒、全てのタンパク質合成の減少又は完
全停止、タンパク質分解の増加、転写の減少及び総細胞ＲＮＡの減少をもたらす
ＲＮＡの代謝回転の増加、ポリリボソームの分解、不活性８０Ｓリボゾームの蓄
積及びクロマチン縮合が含まれる（ホイットフィールドら，Control of Animal
Cell Proliferation, 1 331-365 (1985)) 。

【００３２】これらの特徴の多くは、除核卵母細胞に核を移転した後に起こるために要求さ
れる特徴である。Ｇ０状態が細胞の分化と関連しているという事実は、これが受
容体細胞の細胞質による改造及び／又は再プログラミングをより受け易い核／ク
ロマチン構造を提供することを示唆する。このようにして、静止状態にある核供
与体のお蔭で、核が発育を指示することができるように胚の再構成又は再構築の
前に供与体の核のクロマチンが修飾されうるのである。これは、供与体細胞のク
ロマチンが核供与体として細胞が使用する前に修飾されるという点で、従来報告
された核の転移方法のいずれとも異なっている。

【００３３】供与体細胞からの核がそれに転移される受容体細胞は卵母細胞又は別の適当な
細胞でありうる。受容体卵母細胞の好ましいクラスはＷＯ−Ａ−9707668 に記述
されている。

【００３４】中期Ｉにある卵母細胞から、中期IIにある卵母細胞を経て、接合体及び２細胞
胚までの、種々の異なる発育段階にある受容体細胞が使用されうる。それぞれは
、その利点および不利益を持っている。受精卵の使用は効率的な活性化を保証す
るが、卵母細胞については単為発生の活性化が必要となる（後記参照）。一部の
種では、卵割−段階の胚の使用を有利にする別のメカニズムは、遺伝子発現の再
プログラミングが必要となる程度である。マウスでは、複写は第２細胞周期の間
に開始され、そして合成されるタンパク質の性質の大きな変化は、胚盤胞の段階
まで二次元電気泳動では認められない（ハウレット及びボルトン J. Embryol. E
xp. Morphol. 87 175-206 (1985)) 。そうはいっても、多くの場合、受容体細胞
は卵母細胞である。

【００３５】受容体は除核されていることが好ましい。核転移手順における受容体卵母細胞
の除核は必須であると一般に考えられてきたが、この判断の実験的確認は公表さ
れていない。有蹄類に対して記述された最初の手順は、細胞を２個の１／２細胞
への分割を含み、その一つは除核されていたようであった（ウイラドセン Natur
e 320 (6) 63-65 (1986)) 。この手順は、他方の未知の１／２細胞がなお中期の
組織を持ちそして細胞質の容積の減少が新たな胚の分化のパターンを加速すると
考えられるという不利益を持っている（エヴィスコフら，Development 109 322-
328 (1990)) 。

【００３６】より最近になって、最少量の細胞質を含む染色体を除去する試みの中で、異な
る手順が用いられてきた。第１の極体と近くの細胞質の吸引により、ヒツジ卵母
細胞の６７％で中期II組織を除去することが見出された（スミス及びウイルマッ
ト Biol. Reprod. 40 1027-1035 (1989)) 。ＤＮＡ特異的蛍光色素（ヘキスト33
342)を使用した場合のみ、除核の際、細胞質容量の最少の減少を保証する方法が
提供された（ツノダら，J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)) 。家畜類では、こ
れはおそらく現在日常的に使用される方法となっている（プラザー及びファース
ト J. Reprod. Fertil. Suppl. 41 125 (1990)、ウェススシンら Biol. Reprod.
(Suppl.) 42 176 (1990)) 。

【００３７】哺乳動物での除核への非浸襲的取り組みについての報告は極めて少ないが、両
生類では日常的手順として紫外線照射が用いられている（ガードン，キュー．J.
Microsc. Soc. 101 299-311 (1960))。ＤＮＡ特異的蛍光色素の使用の過程で、
マウスの卵母細胞を３０秒より長く紫外線に曝すと細胞の発育能力を低下させた
ことに注目された（ツノダら，J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)) が、哺乳動
物でのこのアプローチの使用についての詳細な報告はない。

【００３８】本発明の第４の側面によれば、動物を調製する方法であって、（ａ）本発明のこれまで記載した側面のいずれかの胚を調製する工程、（ｂ）前記胚から分娩まで動物を発育させる工程、及び（ｃ）このようにして形成された動物から任意選択可能に増殖させる工程、
を含んで成る方法が提供される。

【００３９】本発明のこの側面に従って調製された動物の胚は、胚の完全発育の前に、さら
に操作することができる。これは、付加的遺伝物質の導入又は特定の遺伝的特性
もしくはある遺伝子の有無のためのその胚の検定を含む。胚の細胞が分娩まで発
育させられる二以上の胚を調製するために使用される場合には、その胚から二以
上の動物を誘導することができるということもあり得る。

【００４０】従って、本発明は、本発明の第４の側面に記載の方法により調製される動物に
も及ぶ。

【００４１】本発明の第５の側面によれば、遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹
起される疾病状態の治療における「マリーナ」−様因子の使用が提供される。本
発明のこの側面は遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹起される疾病状
態の予防又は治療のための薬剤の調製における「マリーナ」−様因子の使用にま
でも拡張される。このような治療方法は転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子
の動物細胞中への導入を含みうる。トランスポザーゼタンパク質、又はトランス
ポザーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列も導入される場合には、この工
程はＭＬＥの導入と同時に、連続して又は別々に行われうる。

【００４２】従って、本発明は、遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異と関連する疾病状態
の治療に胚の細胞が用いられる本発明のこれまで記載の側面のいずれか一つに記
載の胚の調製にも及ぶ。このような細胞は、患者の細胞がもはや活性でなく、有
効でない疾病状態、特に神経障害又はホルモン障害を治療するために使用するこ
ともできる。

【００４３】第２及びその後の側面にとっての好ましい特徴は、必要な変更を加え、第１の
側面にとってのそれと同様である。

【００４４】実施例１：トランスポザーゼの調製以下の実験に使用する「マリーナ」トランスポザーゼは、プラスミドｐＢＣＰ
Ｍｏｓ１を保持する大腸菌株ＢＬ２１ＤＥ３（ステゥディアら，Methods in Enz
ymology 185 60-89 (1991)) から精製した。これは発現ベクターｐＢＣＰ３６８
から誘導した（ヴェルテロップら Gene 153 63-65 (1995)) 。因子Ｍｏｓ１由来
の「マリーナ」トランスポザーゼの完全コード配列をｐＢＣＰＭｏｓ１のＮｄｅ
Ｉ部位に挿入した。これらの細胞を軌道振盪機（２００rpm ，３７℃）上、ルー
リアブロス（ＬＢ）中でＯＤ₅₅₀が０．８になるまで成長させ、この時点でＩＰ
ＴＧを０．５ｍＭまで添加して細胞を２時間誘導させた。誘導の後、細胞を収穫
し、必要になるまで−２０℃で貯蔵した。１リットル培養からのペレット状の細
胞を５ｍｌの５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、２
ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁した。０．１ｍｇ／ｍｌの濃度まで
リゾチームを添加し、そして細胞を室温で５分間インキュベートした。ついで、
２５ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、４ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ＭのＮａＣ
ｌ、１％デオキシコール酸塩、１％のＮＰ４０、１ｍＭのＤＴＴを含む洗剤緩衝
液を１０ｍｌ添加することにより細胞を溶解し、そしてさらに１５分間室温でイ
ンキュベートした。２０００ユニット／ｍｌのＤＮアーゼＩの１００μｌと共に
ＭｇＣｌ₂を最終濃度１０ｍＭになるまで添加した。抽出物を粘性が減少するま
でピペットで数回上下させ、ついで室温に１０分間放置した。次いで、全細胞抽
出物を２０，０００ｇで３０分間遠心分離した。そのペレットを０．５％ＮＰ４
０（ｖ／ｖ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で３回洗浄した後、６Ｍ尿素中で１回洗浄し
、最後に１ｍｌの２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、６Ｍグアニジン塩酸、
５ｍＭのＤＴＴ中に再懸濁した。１３，０００ｇで１０分間遠心分離した後、そ
の上清を２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、８Ｍ尿素、５ｍＭのＤＴＴ、１
０％のグリセロール緩衝液中に１００倍希釈し、５０ｍＭのＮａＣｌを補充した
同じ緩衝液で予め平衡化した２ｍｌファスト・フローＣＭセファロース・カラム
（シグマ）上に載せた。

【００４５】これらの条件の下で、変性した「マリーナ」トランスポザーゼはこのカラムに
結合した。タンパク質は１ｍｌ／分の速度で８〜０Ｍ尿素の２００ｍｌ直線勾配
を通過させることによりそのカラム上で再生された。再生の後、結合したタンパ
ク質をバッファーＡ（２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＤＴＴ
、１０％のグリセロール）中の５０ｍＭ〜１．０ＭのＮａＣｌ直線勾配の２０ｍ
ｌで溶出した。「マリーナ」トランスポザーゼを含む画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥで
確認し、セントリコン（アミコン）カラム（３０Ｋ分子量カットオフ）を通す回
転によりさらに濃縮した。このタンパク質を約０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃
度で凍結貯蔵した。

【００４６】実施例２：ニワトリ胚中への「マリーナ」の注入「マリーナ」因子を含むプラスミドＭｏｓ１（メドホラら Genetics 128 311-
318 (1991)) を、サング及びペリー（Mol. Reprod. Dev. 1 98-106 (1989))が記
述したように、５ｍＭの酢酸マンガンを含む又は含まない、１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、２５ｍＭのヘペスｐＨ７．７、２ｍＭのジチオトレイトール、５％（ｖ／ｖ
）グリセロール、２５μｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含む緩衝液中、０．０５
〜０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度の精製「マリーナ」トランスポザーゼと共に、２
５μｇ／ｍｌの濃度でニワトリ胚中に注入した。注入した胚をペリー（Nature 3 31 70-72 (1988))が記述したように培養した。「マリーナ」配列を含む細胞を持
つ孵化した雛は、「マリーナ」に特異的なプライマー及び孵化中の雛の漿尿膜か
ら調製したＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより同
定した。実験中に死んだが、注入後少なくとも１２日間生存した胚も「マリーナ
」配列の存在について分析した。

【００４７】実施例３から８：材料及び方法：プラスミド構築物及びトランスポザーゼタンパク質の調製プラスミドｐＭｏｓ１ＴｅｔはｐＭｏｓ１中の「マリーナ」のオープンリーデ
ィングフレーム中に存在するユニークＳａｌＩ部位中にテトラサイクリン耐性遺
伝子を挿入することにより構築した。Ｔｅｔ^R遺伝子はＡｖａＩ及びＥｃｏＲＩ
でｐＢＲ３２２を消化することにより得た。ｐＭｏｓ１はＳａｌＩで線状化しそ
して末端を満たすためクレノウポリメラーゼで処理した後この二つの断片を連結
した。組換え体−誘導「マリーナ」トランスポザーゼの発現及び調製は他の場所
（エイ．ドーソン及びディー．フィンガン、準備中）で詳細に記述されるであろ
う。簡単に述べれば、ｐＭｏｓ１由来の「マリーナ」トランスポザーゼ遺伝子を
発現ベクターｐＢＣＰ３６８（ヴェルテロップら Gene 153 63-65 (1995)) に挿
入し、ｐＢＣＰＭｏｓ１を構築した。この構築物を大腸菌株ＤＨ５α中に転移さ
せ、そしてタンパク質発現の誘導の後、細胞を収穫した。このトランスポザーゼ
タンパク質は、不溶性の沈澱物として回収され、可溶化され、そしてファスト・
フローＣＭセファロースカラム（シグマ）に結合させた。このタンパク質は８Ｍ
尿素中で再生させそしてイン・ビトロ転移検定法でその活性を測定した。

【００４８】ミクロ注入及び雛胚の培養雛胚の培養は、( ラブら Bio/Technology 12 60-63 (1994))に注記された修正
を施し、実質的には（ペリー，Nature 331 70-72 (1988))が記述したとおりに行
った。２５μｇ／ｍｌの濃度の無切断プラスミド１〜２ｎｌを、確立された手順
（ラブら Bio/Technology 12 60-63 (1994))に従って、接合体の卵核ディスク（
germinal disc)中に注入した。このＤＮＡを転移緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ
、２５ｍＭのヘペスｐＨ７．９、２ｍＭのジチオトレイトール、５０ｍＭの酢酸
マンガン、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５％のグリセロール）中で希釈し、必要な
ときは、トランスポザーゼタンパク質を１５ｎｇ／ｍｌの濃度まで添加した。

【００４９】ＰＣＲ分析組織試料（漿尿膜、肝臓及び生殖腺）は１２日間以上インキュベートした後に
培養中に死んだ胚から切り取り、そしてＤＮＡはピュアジーン（フローゲン）ゲ
ノミックＤＮＡ精製キットを用いて抽出した。ゲノムＤＮＡ試料は生存している
雛の孵化中の漿尿膜から取得し、血液試料はより成熟した（older)ニワトリから
取得しそして精液は成熟おんどりから得た。ＰＣＲ分析は「マリーナ」因子及び
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＭｏｓ１実験）又はＴｅｔ^R遺伝子及びベクターク
ロラムフェニコール（ＣＡＴ）耐性遺伝子（ｐＭｏｓ１Ｔｅｔ実験）の存在を調
べるため０．５〜１μｇのＤＮＡ試料について行った。コピー数を推定するため
、対照のＰＣＲ反応を、既に記述された（ラブら Bio/Technology 12 60-63 (19
94))ように、１個のコピー遺伝子（１×）、１０倍希釈（０．１×）及び１００
倍希釈（０．０１×）の量と当量になるように添加したｐＭｏｓ１又はｐＭｏｓ
１ＴｅｔＤＮＡと共に雛のゲノムＤＮＡの１μｇ部分について平行して行った。
使用したプライマーは、（ｉ）「マリーナ」＋５’−ＴＣＡＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧ − ５’−ＡＡＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＴＣＴＧＡＴＣＣ (ii)ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋５’−ＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣ − ５’−ＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴ (iii) Ｔｅｔ^R ＋５’−ＣＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＣＡＧ − ５’−ＴＴＴＧＣＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＣ (iv) ＣＡＴ＋５’−ＡＡＡＡＴＧＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣ − ５’−ＡＧＧＴＴＴＴＣＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＧＣである。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル上で分析し、構築物配列のコピー
数は対照反応との比較により推定された。

【００５０】サザン転移分析及び組み込まれた「マリーナ」因子の単離ＰＣＲによってトランスジェニックとして同定されたＧ₁雛からのＤＮＡは、
ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルで電気
泳動しそしてハイボンドＮ（アマシャム）に転移させた。「マリーナ」−特異的
プローブはこの因子の両末端に近いプライマーを用いるＰＣＲにより形成させそ
してランダム−プライミングにより標識化した（レディプライム，アマシャム）
。ＥｃｏＲＩで消化したＧ₁雛１３からのＤＮＡの０．１μｇ部分をラムダＺａ
ｐII・ＥｃｏＲＩ−カット・アームズ（ストラタジーン）の１μｇに連結し、ギ
ガパック・ゴールド（ストラタジーン）でパッケージした。約２５０，０００個
のプラークをプレートに播き、そして「マリーナ」−特異的プローブでスクリー
ニングした。一つの陽性プラークを同定し、精製し、そしてストラタジーン・プ
ロトコールに従ってプラスミドとしてその挿入体を回収した。このクローン、ｐ
Ｚａｐ１３は、ＥｃｏＲＩで消化し、その挿入体のサイズを雛１３のゲノムＤＮ
Ａ中に存在する「マリーナ」にハイブリダイズする断片と比較し、約８ｋｂ断片
と共移動することが見出された。このｐＺａｐ１３クローンは、この因子の両端
を含み隣接するゲノムＤＮＡにはいる所まで配列決定するように設計された「マ
リーナ」の５’及び３’末端近くのプライマー、すなわち、左末端プライマー５’−ＴＣＧＧＣＡＣＧＡＡＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧ右末端プライマー５’−ＧＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＧＡＡＴＡＡＡＴＧを用いて配列決定された。

【００５１】実施例３：「マリーナ」プラスミドの注入後の雛胚の分析確立された手順を用いて雛接合体中に活性な「マリーナ」因子Ｍｏｓ１（図１
（ａ））（メドホラら Genetics 128 311-318 (1991)) を保持するプラスミドを
注入する一連の実験を行った。精製した「マリーナ」トランスポザーゼタンパク
質はその注入の約半分に含まれていた。総数９７の接合体に注入し、５１はプラ
スミド＋トランスポザーゼタンパク質を注入した。ＤＮＡは、少なくとも１２日
のインキュベーションの間生存したが孵化の前に死んだ胚の組織から、そして孵
化した雛の漿尿膜から抽出した。これらのＤＮＡ試料を「マリーナ」因子（ＭＡ
Ｒ）とプラスミドベクター（ＰＢＳ，図１（ａ））を同時に検出するためＰＣＲ
で分析した。「マリーナ」配列とプラスミドベクター配列のコピー数は存在する
雛ゲノムＤＮＡの量に関して推定された、すなわち、１コピー（ゲノム当量当た
り１コピー又はそれ以上）、ゲノム当たり０．０５〜０．５コピーそしてゲノム
当たり０．０５コピー未満。操作された胚の中の４４が少なくとも１２日のイン
キュベーションの間生存し、ｐＭｏｓ１＋トランスポザーゼタンパク質の注入後
２３日間生存した。

【００５２】ｐＭｏｓ１をトランスポザーゼタンパク質を加え又は加えずに注入した後の「
マリーナ」及びプラスミドベクターの存在についてのＰＣＲ分析の結果は表１に
示してある。これらの結果は、リゾチーム遺伝子由来の標準遺伝子構築物（エイ
．シャーマン，未発表データ）の注入により得られた結果と比較して図１Ｂにグ
ラフ的に示してある。ｐＭｏｓ１の注入後に「１コピー」胚が見出される頻度は
リゾチーム構築物実験におけるよりも劇的に高くなった。リゾチーム実験で得ら
れた胚の１％未満は、構築物中のゲノム当たり１コピー当量でみるとｐＭｏｓ１
を注入された胚の２７％に相当するレベルで構築物を含んでいた。トランスポザ
ーゼを加え又は加えずに注入した胚の分析から得られた結果は極めてよく似てい
る（表１，図１（ｂ））。このことは、ＰＣＲ分析で検出された「マリーナ」配
列が転移の結果として存在するならば、そのときは、転移は外因性トランスポザ
ーゼタンパク質の不存在で起こることができるに違いないということを示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】これらの胚試料について、ｐＭｏｓ１のプラスミドベクターが存在するか分析
した。トランスポザーゼタンパク質を加え又は加えずにｐＭｏｓ１を注入した後
分析した２９の胚、これらはゲノム当たり０．０５コピー以上と推定されたレベ
ルで「マリーナ」を含んでいた、のうち、６個（２１％）がプラスミドベクター
配列をも含んでいた（表１）。残りの胚には「マリーナ」が存在していたが検出
可能なプラスミドベクター配列が欠如していたということは、ｐＭｏｓ１中の「
マリーナ」因子は、プラスミド構築物からもしかすると雛のゲノムＤＮＡ中に転
移したことを示唆するものであった。

【００５５】実施例４：「マリーナ」の生殖系列伝達上記の実験で得られた３羽の雛は性的成熟に至るまで生存した。１羽の雛は孵
化時にｐＭｏｓ１についてトランスジェニックではないかと同定された。「マリ
ーナ」配列とプラスミドベクター配列は両方とも漿尿膜試料からのＤＮＡ及び血
液試料からのＤＮＡでＰＣＲにより検出され、そのコピー数は０．１〜０．５ゲ
ノム当量であった。この評価は、このおんどりが性的成熟に達した時、精子試料
の分析により確認された。このおんどりは家畜めんどりと交配され、子孫を孵化
され、トランスジェニック雛の検出のためスクリーニングされた。総数９３羽の
Ｇ₁雛をスクリーニングし、その中の２７羽（２９％）が「マリーナ」に対する
トランスジェニックであるとＰＣＲにより同定された。

【００５６】Ｇ₀おんどりの生殖系列への「マリーナ」挿入の頻度及び起こった異種転移事
象の数を求めるため、Ｇ₁雛のそれぞれを分析した。２３羽の雛からのゲノムＤ
ＮＡ試料をサザンブロットにより分析して「マリーナ」の挿入を含んだ制限断片
の数とサイズを求めた。このゲノムＤＮＡ試料を「マリーナ」それ自体の内部を
切断しない制限酵素であるＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、「マリーナ」
−特異的プローブ（図２（ａ））とハイブリッド形成をさせた。これも「マリー
ナ」内部を切断しない、さらなる制限酵素ＥｃｏＲＩ（図２（ｂ））を用いる分
析により、異なるＧ₁雛の中に存在する幾つかの「マリーナ」−ハイブリダイジ
ング制限断片を決定することができた。それぞれのＧ₁雛は、ＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 及びＥｃｏＲＩ、「マリーナ」−ハイブリダイジング制限断片のサイズ
により分類された（表２）。「マリーナ」を含む６個の異なる断片が同定された
。それぞれの１例は図２（ａ）及び（ｂ）に示してある。３個の断片（表２、図
２（ａ）及び（ｂ）、レーン７）は最も普通であり、そして親のおんどり中に明
らかに存在していた（図２（ａ）及び（ｂ）、レーン８）。Ｇ₁雛の中の３羽は
「マリーナ」と同様にプローブベクター配列を含むことがＰＣＲにより確認され
た。サザン転移分析（例えば、図２（ａ）及び（ｂ）、レーン１）はそれらが５
ｋｂ（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 消化物）又は８ｋｂ（ＥｃｏＲＩ消化物）の制
限断片を含むことを示した。この観察は、これらのトランスジェニック鳥が完全
なｐＭｏｓ１プラスミドの多重コピーの組み込みの結果として生じたということ
を示している。そしてそれは、ＰＣＲによりＧ₀おんどり由来のゲノムＤＮＡ試
料中にプラスミドベクター配列が検出されたことを説明する。Ｇ₁雛由来のゲノ
ムＤＮＡの分析により、「マリーナ」が発育の初期段階でｐＭｏｓ１からＧ₀お
んどりの染色体中へ転移したこと、そして多重転移事象が起こったことが示唆さ
れる。

【００５７】

【表２】

【００５８】実施例５：雛ゲノム中への「マリーナ」の転移「マリーナ」にハイブリダイズする制限断片が雛ゲノムＤＮＡ中に組み込まれ
た「マリーナ」のコピーに実際に相当することを明らかにするため、「マリーナ
」の１コピーを含む制限断片を１羽のＧ₁雛（雛１３、図２（ｂ），レーン２）
のゲノムＤＮＡからクローニングした。雛１３由来のＥｃｏＲＩ断片のライブラ
リーを構築し、「マリーナ」プローブでスクリーニングした。図２（ｂ），レー
ン２の低い方のバンドに相当する８．２ｋｂ断片を含むクローンを単離した。こ
のクローン、ｐＺＡＰ１３は、図２（ｂ）に示されたサザンブロットを再調査す
るために使用した（図３（ａ））。このプローブにより、野生型雛由来のＤＮＡ
を含む、全てのニワトリのゲノムＤＮＡ試料中から一連のＥｃｏＲＩ制限断片が
同定された（図３（ａ），レーン９）。「マリーナ」ハイブリダイジング断片も
かすかに検出可能である。このクローンも、挿入された「マリーナ」因子が完全
なときはその両端をおおう配列をプライムするように設計された「マリーナ」の
両端の内部のプライマーを用いて、ＤＮＡ配列決定により分析した。生成した配
列（図３（ｂ））は「マリーナ」因子の両端の配列に完全に対応するが、ｐＭｏ
ｓ１中のこの因子に隣接するドロソフィラ・ゲノムＤＮＡとは異なる配列が両側
に隣接する。ニワトリのＤＮＡ中に存在するこの因子にはＴＡジヌクレオチド反
復が隣接し、この配列は「マリーナ」トランスポザーゼにより媒介される転移に
よって特徴的に形成される。これらの結果は「マリーナ」がｐＭｏｓ１からの転
移によってニワトリの染色体ＤＮＡ中に組み込まれたことを示す。

【００５９】実施例６：トランスポザーゼ機能の起源接合体注入実験においてｐＭｏｓ１プラスミドにトランスポザーゼタンパク質
の付加が転移にとって必要であるという証拠は存在しなかった（図１（ｂ）及び
表１）。トランスポザーゼ活性は、Ｍｏｓ１トランスポザーゼ遺伝子の発現又は
ニワトリ接合体中に存在する内因性活性によるものであったであろう。これらの
可能性の間を区別するため、「マリーナ」トランスポザーゼ遺伝子がトランスポ
ザーゼのコード領域内にテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ^R）を挿入するこ
とにより不活性化された構築物（ｐＭｏｓ１Ｔｅｔ）を用いて、一連の注入実験
を行った。トランスポザーゼタンパク質は、再び、接合体注入の約半数に取り込
まれた。胚及びニワトリからのＤＮＡ試料をＰＣＲによりＴｅｔ^R遺伝子及びプ
ラスミドベクターの存在について分析し、そしてそれらのコピー数を評価した。
プラスミドのみを注入した２９の胚及びプラスミド＋外因性トランスポザーゼを
注入した３４の胚を分析し、その結果を図４にグラフ的に示してある。０．０５
ゲノム当量より上のレベルでＴｅｔ^R配列を含む胚の割合（トランスポザーゼな
しの胚の１７％そしてトランスポザーゼ添加の胚の２４％）は、完全な「マリー
ナ」の導入の後に検出されたもの（トランスポザーゼなしの胚の６６％そしてト
ランスポザーゼありの胚の７８％）よりもはるかに低い。「マリーナ」配列を含
む胚ＤＮＡ試料はすべて検出可能な量のプラスミドベクターをも含んでいた（デ
ータは示していない）。一つのレベルで構築物を含む胚の少数は完全なプラスミ
ドの無差別組み込みの結果であったであろう。再び、外因性トランスポザーゼの
機能についての証拠はなかった。これらの結果から、ｐＭｏｓ１からニワトリゲ
ノムＤＮＡ中への「マリーナ」因子の転移をもたらすトランスポザーゼ活性は、
この構築物による機能性トランスポザーゼの発現から誘導されたものであること
が示唆される。この結果は外因性トランスポザーゼタンパク質が機能的であった
という可能性を決して排除するものではない。しかしこの結果はｐＭｏｓ１から
「マリーナ」の転移にとってそれは必要でなかったことを強く示している。

【００６０】実施例７：組み込まれた「マリーナ」因子の生殖系列安定性それぞれが異なる染色体部位に組み込まれた１コピーの「マリーナ」を持って
いる２羽のＧ₁鳥、おんどり３および７（図２（ａ）、レーン４及び５）は、Ｇ ₂ 世代への生殖系列伝達の後のこの因子の安定性を分析するために選択した。こ
れらをそれぞれ家畜めんどりと交配し、その結果生じた胚からＤＮＡを抽出し、
そしてトランスジェニック胚を同定するためＰＣＲによりスクリーニングした。
おんどり３及びおんどり４からの非−トランスジェニック子孫に対するトランス
ジェニック子孫の比（６５：５９及び６４：５７）は、予想されたメンデル比で
ある１：１と有意に異なることはなかった。トランスジェニック胚からのゲノム
ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、そして「マリーナ」−ハイブリ
ダイジング断片のパターンをトランスジェニック親中に存在する１本のバンドと
比較した。両おんどりからのトランスジェニック子孫はすべて親おんどり中に存
在する制限断片と共−移動する１本の「マリーナ」バンドを持っていた（データ
は示していない）。不安定性の低いレベルは検出されなかったであろうが、転移
後の「マリーナ」の不安定性の証拠はない。

【００６１】実施例８：マウスにおける「マリーナ」転移のテスト完全なプラスミド構築物（ｐＭｏｓ１）をマウスの受精卵の前核または細胞質
に約１．５ｎｇ／μｌの濃度で注入する。使用する方法はホワイトローら（Bioc
hemical J. 286 31-39 (1992))に記述されているとおりであり、そしてブリンス
ターら（Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82 4438-4442 (1985)) に基づいている。
一部の実験では組換え体由来の、精製された「マリーナ」トランスポザーゼタン
パク質又はｍＲＮＡが含まれる。マウス胚を代理母に転移させそして新たに生ま
れたマウスを「マリーナ」に関する何等かのトランスジェニックを検出するため
スクリーニングする。トランスジェニックマウスはすべてさらに分析して、「マ
リーナ」因子がトランスポザーゼにより触媒された転移の結果としてマウス中に
存在するのかそれとも全プラスミド構築物の無差別組み込みの結果なのかを決定
する。

【００６２】討論本研究はドロソフィラ・マウリティアーナの転移因子「マリーナ」がニワトリ
接合体中への微量注入によるその導入後にニワトリゲノム中へ転移することがで
きることを示している。「マリーナ」−含有プラスミドの運命を、ニワトリ胚へ
の注入後、接合体状態でそして少なくとも１２日の胚の発育時において分析した
。従来の結果とは対照的に、同一の手順に従って、しかし様々な遺伝子構築物を
用いて、「マリーナ」が２０％を越える胚において細胞当たり１コピー当量のレ
ベルで存在したことを見出した。「マリーナ」因子を保持したこのプラスミドベ
クターはこれらの胚のほとんど８０％において検出可能な程には存在しなかった
。これらの結果から、「マリーナ」因子は最初のプラスミドから転移し、そして
ニワトリのゲノム中に組み込まれることが示唆された。この解釈は、性的成熟ま
で生存しそしてその子孫のほぼ３０％に「マリーナ」のコピーを伝達した「マリ
ーナ」に対するトランスジェニックおんどりの分析により確認された。個々のＧ ₁ 鳥の分析から、「マリーナ」の全部で６種の異なる挿入が異なる個体で存在す
ることが示された。さらに、Ｇ₁トランスジェニック鳥から「マリーナ」の１コ
ピーを単離したことから、完全な因子がニワトリのゲノムＤＮＡ中に転移しそし
てこの転移事象が挿入部位において予想されたＴＡ反復を形成したことが確認さ
れた（ブライアンら Genetics 125 103-114 (1990)) 。Ｇ₂世代への生殖系列伝
達後では、「マリーナ」の組み込まれたコピーの安定性に関する証拠は得られな
かった。

【００６３】この分析により示されたニワトリゲノム中への「マリーナ」転移の頻度は高い
（２０％を越える）。しかしこれは付加的トランスジェニック鳥の形成により確
認されねばならない。同一「マリーナ」因子のドロソフィラ・メラノガスターへ
の導入により得られた生殖系列の形質転換の頻度は４％と３１％の間で変動し（
ガルザら Genetics 128 303-310 (1991)) 、類似の値である。Ｇ₀おんどりから
遺伝的に承継したＧ₁鳥の割合はほぼ３０％であり、線状の遺伝子構築物の導入
後に得られた場合よりも１０倍高い伝達頻度であった（ラブら Bio/Technology 12 60-63 (1994))。Ｇ₁鳥の分析から、「マリーナ」の多重挿入があったことが
示された。導入されたプラスミドから幾つかの独立の転移事象が起こったか、又
は「マリーナ」の１コピーがニワトリのゲノムに転移しそしてこれが２回目の転
移事象を受けたのかという二つの可能な説明のうちのいずれかの間を区別するこ
とは未だできない。「マリーナ」の二つのコピーがＧ₂世代へ安定に伝達された
という事実は、ニワトリのゲノム中に一旦組み込まれれば、「マリーナ」因子は
安定である。「マリーナ」は、ディー．メラノガスターのゲノム中に転移した後
にも安定であり、推定された除去割合は０．１％未満であった（ローエら Genet
ics 140 183-192 (1995)) 。

【００６４】精製したトランスポザーゼタンパク質を微小注入の半分にｐＭｏｓ１ＤＮＡと
共に含めたが、ＰＣＲ分析により、転移の頻度がこの酵素の添加により増加しな
かったことが示唆された。トランスポザーゼ遺伝子がＴｅｔ^Rの挿入により不活
性化されたときは、転移は検出されなかった。従って、観察された「マリーナ」
転移事象はｐＭｏｓ１中のトランスポザーゼ遺伝子の発現により触媒されたもの
と結論される。これまで、ニワトリ接合体に注入されたプラスミドＤＮＡは胚の
発育の最初の２４時間の間にほぼ２０倍複製されること（サング，エイチ．エム
．及びペリー，エム．エム．Mol. Reprod. Dev. 1 98-106 (1989))そしてレポー
ター遺伝子構築物は注入の９時間以内に検出され得ること（ペりーら Roux's Ar
ch. Dev. Biol. 200 312-319 (1991))が示されてきた。従って、トランスポザー
ゼ遺伝子の複製のための鋳型として働くことができる発育の初期の段階の間に細
胞当たりｐＭｏｓ１の高いコピー数が存在するであろうと予想される。たとえ転
写及び翻訳の効率が悪いとしても、転移を触媒するのに十分なトランスポザーゼ
が合成されうる。一旦「マリーナ」因子が組み込まれると、それらが完全なトラ
ンスポザーゼ遺伝子を保持するとしても、明らかに安定である。一旦この因子が
ニワトリの染色体中に組み込まれると、トランスポザーゼ遺伝子の発現は極めて
効率が悪く、細胞当たりのコピー数は少数に過ぎなくなるであろう。

【００６５】これらの結果及びミノカサゴ（zebrafish)における「マリーナ」の転移に関す
る最近記述された証拠（ファデゥールら Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95 5182
-5186 (1998)) は脊椎動物の遺伝子転移（transgenesis) 用のベクターとしての
「マリーナ」の開発を支持する有力な証拠である。遺伝子転移のために「マリー
ナ」由来のベクターを使用することは、幾つかの潜在的長所、特に家禽の遺伝子
転移のための操作にとっての長所を持っている。組み込みの頻度は現在可能なレ
ベルを越えて増加させうる。多重組み込み事象が一つのＧ₀トランスジェニック
鳥の生殖系列に存在するという観察から、一つの創始鳥 (founder birds)から増
殖させることにより、ゲノムの異なる部位に挿入を有する幾つかのトランスジェ
ニック系列を確立しうることが示唆される。１コピー転移遺伝子の発現が多重コ
ピー配列で組み込まれた転移遺伝子よりも発現の低レベル制御を受け難いという
証拠が蓄積しつつある（ガリックら Nature Genetics 18 56-59 (1998)) 。

【００６６】「マリーナ」ベクターが１コピーとして転移遺伝子を組み込むという事実は、
転移遺伝子の発現レベルをより一層予想可能とする結果を生ずるというさらなる
長所を持つことになる。転移遺伝子を保持する「マリーナ」ベクターに「トラン
ス位に」トランスポザーゼ活性を与える方法を研究することが計画できる。転移
遺伝子を組み込むように改変された「マリーナ」因子の転移の頻度そして「マリ
ーナ」ベクターが保持することができる転移遺伝子のサイズが確立されねばなら
ない。転移遺伝子発現の分析により、１コピーとして「マリーナ」ベクターに導
入された転移遺伝子の発現が多重コピー配列における転移遺伝子の発現よりもよ
り予想可能であるかどうかが確立されるであろう。「マリーナ」は「マリーナ」
−様因子のスーパーファミリーの中で遺伝子転移のためのベクターとしての開発
のための潜在能力を有する唯一のものである（ドーソン，エイ．及びフィネガン
，ディー．ジェイ．Nature Bio. 16 20-21 (1998) 、ラズら Current Biol. 8 8
2-88 (1998))。将来の発展は、特定の因子が他のものよりもベクターとしてより
一層有効であるかどうか、又は特定の因子が別のものよりも一つの適用に関して
より有用であるかどうかを明らかにするであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は「マリーナ」−含有プラスミドｐＭｏｓ１の注入後少なくとも１２日間
生存した胚及び雛から抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析を示す。図１（ａ）は、Ｐ
ＣＲによって同定された配列及びユニークな制限部位を示すｐＭｏｓ１の線図を
示す。図１（ｂ）は表１に示した結果のグラフ表示である。先の一連の実験で注
入された（ｎ＝１８６）リゾチーム遺伝子構築物のゲノム等量当たりの推定コピ
ー数が「マリーナ」配列の推定コピー数と比較される。組換え体由来のトランス
ポザーゼタンパク質を付加してｐＭｏｓ１を注射した場合と付加しないで注射し
た場合の結果を比較する。

【図２】図２は「マリーナ」プローブとハイブリッド形成した個々のＧ₁トランスジェ
ニックー雛から単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す。図２（ａ
）は、それぞれが「マリーナ」とハイブリッドを形成する断片の新規なパターン
を持つ個々の雛（レーン１〜７）及び親のＧ₀おんどり（レーン８）のＢａｍＨ
Ｉ／ＨｉｎｄIII 消化物を示す。非トランスジェニックー雛のＤＮＡの対照消化
物はレーン９に流した。図２（ｂ）は図２（ａ）の場合と同じ鳥から得た試料の
ＥｃｏＲＩ消化物を示す。レーン２で矢印をしたバンドはｐＺＡＰ１３にクロー
ニングしたＥｃｏＲＩ断片である（図３を参照）。

【図３】図３は１個の組み込まれた「マリーナ」因子の特性決定を示す。図３（ａ）は
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で消化したＧ₁雛それぞれ由来のゲノムＤＮＡのサザ
ンブロット（図２（ａ）からのもの）を細長く裁断しそしてｐＺＡＰ１３からの
ＥｃｏＲＩ挿入物で再調査した結果を示す。ある範囲の制限断片とのハイブリッ
ド形成を、負の対照（レーン９）を含め、試料のすべてで観察することができる
。図３（ｂ）はｐＭｏｓ１とｐＺＡＰ１３中の「マリーナ」因子の左端と右端を
またぐ配列の比較を示す。

【図４】図４は、ｐＭｏｓ１Ｔｅｔの導入後少なくとも１２日のインキュベーションの
間生存した胚及び雛からのＤＮＡ中にＴｅｔ^R遺伝子が存在するか否かのための
ＰＣＲ分析を示す。Ｔｅｔ^R遺伝子のコピー数は「材料及び方法」で記述したよ
うに推定し、そしてトランスポザーゼタンパク質の共−注入の結果はプラスミド
単独注入の結果と比較した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月２１日（２０００．２．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項２】前記鳥類が家禽である、例えばガルス・ドメスティクスであ
る、請求項１記載の方法。

【請求項３】前記非−ヒト哺乳動物が有蹄類である、請求項１記載の方法
。

【請求項４】前記有蹄類が雌牛もしくは雄牛、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラク
ダ又はブタである、請求項３記載の方法。

【請求項５】前記非−ヒト哺乳動物がげっ歯動物である、請求項１記載の方法。

【請求項６】前記げっ歯動物がラット又はマウスである、請求項５記載の方法。

【請求項７】前記非−ヒト哺乳動物がウサギである、請求項１記載の方法。

【請求項８】前記「マリーナ」−様因子がドロソフィラ・マウリティアー
ナ由来の転移因子「マリーナ」である、請求項１〜請求項７いずれか１項に記載
の方法。

【請求項９】転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子がコンストラクト中
の細胞内に導入されるものである、請求項１〜請求項８いずれか１項に記載の方
法。

【請求項１０】「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）の導入が細胞質中への又
は接合体の前核もしくは鳥類又は非−ヒト哺乳動物胚細胞の核中へのＭＬＥの注
入により達成されるものであり、又はＭＬＥの導入が電気穿孔法により又はリポソームを用いることにより達成されるものである、先行する請求項のいずれか１
項に記載の方法。

【請求項１１】転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）を成熟
細胞内に導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパク質又はトランス
ポザーゼをコードするＤＮＡの共−導入を任意選択可能に含んで成る鳥類又は非 −ヒト哺乳動物のトランスジェニック胚を調製する方法。

【請求項１２】転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）を胎児
細胞内に導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパク質又はトランス
ポザーゼをコードするＤＮＡの共−導入する工程を任意選択可能に含んで成る鳥類又は非−ヒト哺乳動物のトランスジェニック胚を調製する方法。

【請求項１３】結果として得られる鳥類又は非−ヒト哺乳動物胚が、（ｉ
）転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子を導入しそれを染色体中に挿入した後
その細胞の核を取得する工程、及び(ii)続いて除核された卵母細胞中にその核を
導入し、この細胞を発育させる工程により調製されるものである、先行する請求
項いずれか１項に記載の方法。

【請求項１４】（ａ）先行する請求項のいずれか１項に記載の胚を調製す
る工程、（ｂ）該胚から分娩まで鳥類又は非−ヒト哺乳動物を発育
させる工程、そして、任意選択可能に（ｃ）工程（ｂ）でこうして形成された鳥類又は非−ヒト哺乳動物から増殖させる工程、を含んで成る鳥類又は非−ヒト哺乳動物を調製する方法。

【請求項１５】前記胚の完全発育の前に該胚がさらに操作されるものであ
る、請求項１４記載の方法。

【請求項１６】請求項１４又は請求項１５記載の方法により調製されるト
ランスジェニック鳥類又は非−ヒト哺乳動物。

【請求項１７】転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）を鳥類又は哺乳動物細胞内に導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパク質又はトランスポザーゼを封入する（enclosing)ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の共− 導入を任意選択可能に含んで成る鳥類又は哺乳類のトランスジェニック細胞を調製する方法。

【請求項１８】遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹起される病
的状態の治療に使用するための「マリーナ」−様因子。

【請求項１９】遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹起される疾
病の予防又は治療のための薬剤の調製における「マリーナ」−様因子の使用。

【請求項２０】遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹起される病
的状態の治療方法であって、転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子を鳥類又は哺乳動物細胞中に導入する工程を含み、トランスポザーゼタンパク質又はトラン
スポザーゼをコードするＤＮＡを導入する工程を任意選択可能に含んで成る方法
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA11 AA20 BA07 BA10 BA80 CA02 CA12 DA02 DA06 EA04 GA12 GA13 GA14 GA30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物胚細胞中に、転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（
ＭＬＥ）を導入する工程を含み、外因性のトランスポザーゼタンパク質又はトラ
ンスポザーゼをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの配列を導入する工程を任意選択可
能に含んで成るトランスジェニック動物胚を調製する方法。
【請求項２】前記動物が鳥類である、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記動物が家禽、例えばガルス・ドメスティクスである、請
求項２記載の方法。
【請求項４】前記動物が有蹄類である、請求項１記載の方法。
【請求項５】前記動物が雌牛又は雄牛、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダ又は
ブタである、請求項３記載の方法。
【請求項６】前記「マリーナ」−様因子がドロソフィラ・マウリティアー
ナ由来の転移因子「マリーナ」である、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載
の方法。
【請求項７】転移遺伝子を含む前記「マリーナ」−様因子がコンストラク
ト中の細胞内へ導入されるものである、請求項１〜請求項６いずれか１項に記載
の方法。
【請求項８】前記「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）の導入が細胞質中への
又は接合体の前核もしくは動物胚細胞の核中への電気穿孔又はリポソームを用い
るＭＬＥの注入によるものである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項９】転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）を動物の
成熟細胞中へ導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパク質又はトラ
ンスポザーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の共−導入を任意選択可能
に含んで成るトランスジェニック動物胚を調製する方法。
【請求項１０】転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）を動物
の胎児細胞中へ導入する工程を含み、外因性トランスポザーゼタンパク質又はト
ランスポザーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の共−導入する工程を任
意選択可能に含んで成るトランスジェニック動物胚を調製する方法。
【請求項１１】結果として得られる動物胚が、（ｉ）転移遺伝子を含む「
マリーナ」−様因子（ＭＬＥ）の導入しそれを染色体中に挿入した後その細胞の
核を取得する工程、及び(ii)その後にその核を除核された卵母細胞中に導入し、
この細胞を動物胚に発育させる工程により調製されるものである、先行する請求
項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】（ａ）先行する請求項のいずれか１項に記載の胚を調製す
る工程、（ｂ）該胚から分娩まで動物を発育させる工程、そして（ｃ）こうして形成された動物から任意選択可能に増殖さ
せる工程、を含んで成る動物を調製する方法。
【請求項１３】該動物胚が胚の完全発育の前にさらに操作されるものであ
る、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】請求項１２又は請求項１３記載の方法により調製されるト
ランスジェニック動物。
【請求項１５】遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹起される病
的状態の治療における「マリーナ」−様因子の使用。
【請求項１６】遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹起される疾
病の予防又は治療用の薬剤の調製における「マリーナ」−様因子の使用。
【請求項１７】遺伝子の不存在又は遺伝子の突然変異により惹起される病
的状態の治療方法であって、転移遺伝子を含む「マリーナ」−様因子を動物細胞
中に導入する工程を含み、トランスポザーゼタンパク質又はトランスポザーゼを
コードするＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を導入する工程を任意選択可能に含んで成
る方法。