KR101236724B1 - 단백질 과발현 카세트를 포함하는 유전자 타겟팅 넉인 벡터, 이의 제조 방법 및 이 벡터가 도입된 이종간 이식용 형질전환 복제동물 - Google Patents
단백질 과발현 카세트를 포함하는 유전자 타겟팅 넉인 벡터, 이의 제조 방법 및 이 벡터가 도입된 이종간 이식용 형질전환 복제동물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 단백질 과발현 카세트가 넉인된 유전자 적중 벡터 제조 방법 및 이 벡터가 도입된 이종간 이식용 형질전환 복제동물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 사용 목적에 따라 프로모터의 선택이 가능하여 과발현시키기 위한 유전자의 발현 조절이 가능하며, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 효과적으로 넉아웃시킴과 동시에 사람 CD46(MCP) 과발현 카세트가 상기 선택된 프로모터에 의해 과발현되도록 넉인됨으로써, 이식거부반응이 억제된 형질전환 복제 미니어쳐 복제 돼지를 생산할 수 있으며, 이들 및 이들의 자손을 이용하여 이종간 세포와 장기의 이식에 널리 사용할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 단백질 과발현 카세트가 넉인된 유전자 적중 벡터 제조 방법 및 이 벡터가 도입된 이종간 이식용 형질전환 복제동물에 관한 것이다.
유전공학 기술의 발달과 더불어 유전자의 기능과 발현을 제어할 수 있는 외래의 유전자가 도입뿐만 아니라, 이 외래 유전자가 다음 세대로 유전되는 형질전환 동물의 생산이 가능하게 되었다. 생쥐나 래트(Rat)같은 실험동물에서는 주로 유전자의 기능과 역할을 규명하기 위한 연구목적으로 많은 형질전환 동물이 생산되고 있고, 토끼, 돼지, 양, 면양, 젖소 등의 가축에서는 상업적인 목적으로 형질전환 동물이 생산되고 있다.
형질전환 동물 생산 방법으로는 재조합된 유전자를 무작위로 숙주 동물의 염색체에 삽입시키는 방법과 특정 유전자의 원하는 위치에 타겟팅시키는 방법이 있다. 무작위 삽입 방법으로는 수정란의 전핵에 미세주입시킨 후 이 수정란을 이식하여 산자를 생산시키는 미세주입방법이 가장 널리 사용되고 있다. 미세주입방법은 유전자의 재조합이 비교적 간단하고, 산자 생산이 용이하나, 태어난 산자에서 형질전환된 개체가 생성되는 비율이 매우 낮으며, 재조합된 유전자가 숙주동물의 염색체 내로 삽입되는 위치를 제어할 수 없어 발현정도를 예측할 수 없고, 이에 의해 다른 유용한 유전자의 기능을 저해할 수 있다는 단점이 있다.
특정 유전자 위치에 재조합 유전자를 삽입시킬 수 있는 특정 유전자 타겟팅 방법은 상동 재조합 기술의 개발과 함께 확립되었다. 타겟팅 방법은 처음에 배양된 세포에서 시도되어 특정 유전자의 제거나 변경이 가능하다는 것이 밝혀진 후, 생쥐 배아줄기 세포가 확립됨과 동시에 형질전환 동물 생산을 위한 강력한 기술로 발전하였다. 현재 타겟팅 벡터는 주로 생쥐에서 특정유전자의 기능을 제거(넉아웃)시키기 위하여 사용하며, 유전자가 제거되었을 때 나타나는 표현형을 통하여 그 유전자의 기능을 연구하기 위한 목적으로 사용되고 있다. 외래 유전자가 타겟팅된 배아 줄기세포만을 선별한 후 생쥐의 배반포에 삽입시켜 산자를 생산하여 유전자가 넉아웃된 동물의 생산이 가능하게 되었다. 현재, 많은 수의 유전자가 넉아웃된 생쥐가 생산되어 질환이나 동물의 발달과정에 대한 연구에 사용되고 있다(Evans & Kaufman, Nature, 292: 154-156, 1981; Doetschman et al., Nature, 330: 576-578, 1987; Zijlstraet al., Nature, 342(6248): 435-438, 1989 Thomas & Capecchi, Nature, 346: 847-850, 1990; Jackson et al., J. Exp.Med., 182(3): 751-758, 1995; Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,93(15): 7983-43, 1996; Fong et al., Development, 126(13): 3015-3025, 1999; Woodman et al., J. Biol. Chem, 277(41): 38988-38997, 2002; Piccenna et al., Ann. NY. Acad. Sci., 1041: 197-204, 2005; Lucerna et al., Blood, 109(1): 122-129, 2007; Cheng et al., Respri. Res., 10(1): 115-124, 2009)
생쥐 이외의 대동물에서 형질전환 동물은 주로 의약품을 대량 생산하기 위한 바이오리엑터(bioreactor)로서, 또는 이종 장기 이식을 위한 용도로서, 그리고 질환 모델로 사용하기 위해 생산되고 있다. 특히, 조직으로부터 채취한 1차 체세포를 체외에서 배양한 후 공여세포로 사용한 최초의 복제 동물 돌리의 탄생으로 동물의 일반 체세포가 유전자가 타겟팅에 사용될 수 있다는 가능성이 제시되었다(Campbell et al., Nature, 380(6569): 64-66, 1996). 생쥐에서와 같이 상동재조합을 이용하는 타겟팅 벡터를 체외에서 배양한 1차 세포에 다양한 방법으로 트랜스펙션(transfection) 시킨 후 유전자가 타겟팅된 세포만을 선별하여 핵치환을 통해 복제방법으로 형질전환 넉아웃 동물의 생산이 가능해졌다.
유전자 타겟팅 벡터는 상동 재조합이 일어나는 두 개의 영역인 레프트암과 라이트 암, 양성선별 마커, 그리고 음성 선별마커로 구성된다. 양성 선별마커는 기능을 제거하기 위한 타겟 유전자와 치환하기 위하여 통상 상동 재조합이 일어나는 두 개의 영역 사이에 위치하게 된다. 양성 선별마커는 유전자 타겟팅 벡터가 삽입된 세포만을 선별하는 데 사용되므로, 항생제 내성 양성 선별마커 유전자가 발현되어야 한다. 한편 제거된 유전자의 기능을 추척하기 위하여 형광단백질이나, 베타 갈락토시다제(β-galactosidase)와 같은 리포터 유전자를 양성 선별마커 유전자와 동시에 사용하기도 하며, 이러한 벡터를 넉인벡터 (knock-in vector)라고 한다. 일반적으로, 리포터 유전자를 발현시키기 위하여 타겟팅 유전자 자체의 프로모터를 사용하도록 고안하며, 이러한 이유로 기능을 제거하기 위한 유전자의 타겟 위치는 번역 개시 코돈이 포함된 엑손으로 제한된다.
알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제는 돼지의 장기를 사람으로 이식할 시에 초급성 면역거부반응(hyperacute rejection)을 일으키는 유전자이다. 영장류 이외의 모든 동물 세포의 표면에 존재하는 갈락토즈라는 항원에 대한 항체가 인체 내에 자연적으로 존재하기 때문에 항체-항원반응이 일어나고 이로 인해 초급성 면역거부반응이 유발되는데 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 갈락토즈를 합성한다. 이 유전자의 기능을 못하게 할 경우 장기부족 문제 해결을 위한 이종장기이식의 현실화 연구에 있어서 크게 이용될 수 있다. 2002년 유전자 타겟팅 방법을 통해 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 제거된 복제돼지가 세계 최초로 생산되었다(Yifan Dai et al,. Nat Biotechnology, 20;251-255, 2002). 곧이어 2003년에는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 두 좌위가 모두 제거된 동형접합 복제돼지가 생산되어 이종장기이식 모델로서 이종장기이식연구에 현실적으로 접근할 수 있는 발판이 마련되었다(Carol J. Phelps, Science, 299;411-414, 2003). 이후 2005년에 동형접합적으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 제거된 복제돼지의 장기를 원숭이에게 이식한 결과 초급성 면역거부반응 없이 이식 후 2-6개월까지 생존하였다(Kenji et al ., Nature medicine, 11(1);29-31, 2005).
세포나 장기를 다른 종에게 또는 동일한 종이라도 이식하게 되면 수여자는 이식된 세포나 장기를 이물질로 인식하여 괴사시킨다. 주요 원인이 항체-항원반응에 의한 면역 거부 반응인데, 수여자의 항체가 이식된 공여 세포나 장기의 항원을 인식하게 되면 보체가 활성화되어 세포막을 파괴하는 단백질 복합체가 생성되어 거부반응을 유도한다. 막공동조절단백질인 CD46(MCP)은 항원-항체와 보체가 결합(C1)하여 세포막을 파괴하는 단백질복합체(C9)으로 전개되는 과정 중 C3b와 C4b의 분해를 촉진시키고, CD55(DAF)는 C3와 C5의 결합체를 붕괴하는 역할을 하여 보체의 활성화를 억제시킨다. CD46과 CD55는 보체에 의한 세포사를 예방할 뿐만 아니라 C3a와 C5a의 생성과 세포 표면에서 백혈구의 식균작용을 돕는 물질인 옵소닌의 생성도 억제하는 역할을 한다. 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 제거되었음에도 불구하고 다른 경로를 통해 유발되는 보체활성을 통해 장기 이식시 심각한 거부반응이 초래될 수 있다는 보고가 있다.(Tanemura, M. et al ., Biochem. Biophys. Res. Commun., 235: 359-364, 1997; Komoda, H. et al., Xenotransplantation, 11; 237-246, 2004). 이에 CD46은 일반적인 경로뿐만 아니라 일반적이지 않은 경로에 의한 보체활성에 따른 세포사를 억제하는데 크게 효과적이기 때문에 장기이식시 일어나는 거부반응을 좀 더 효과적으로 억제할 수 있다. 2002년 CD46과 CD55 유전자가 도입된 복제돼지가 생산되어 면역거부반응 연구결과 사람 보체로 인한 세포분해와 C3의 축적(deposition)이 일반돼지에 비하여 크게 감소되었다고 보고되었다(Zhou C-Y et al ., xenotransplantation, 9: 183-190, 2002). 또한 CD46을 과발현하는 혈질전환 돼지의 신장에 면역억제제를 사용하지 않고 원숭이에게 이식한 결과 일반돼지는 평균 3.5시간 생존한 것에 반해 50시간 이상 생존하여 CD46만으로도 이종간 면역거부반응이 효과적으로 억제될 수 있다고 보고되었다.(Loveland BE et al ., xenotransplantation 11:171-183, 2004).
본 발명에서는 단백질 과발현 카세트가 삽입된 유전자 타겟팅 벡터로서 CMV 프로모터에 연결된 CD46 과발현 카세트가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 넉인된 벡터를 제작하였고, 이 벡터가 타겟팅된 형질전환 복제돼지를 생산하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는,
상동 재조합 방법으로 유전자를 넉인(Knock-in)시키는 벡터에 있어서,
포유류의 유전자에 상동인 염기서열을 갖는 제1영역; 단백질 과발현용 카세트; 및 포유류의 유전자에 상동인 염기서열을 갖는 제2영역을 순차적으로 포함하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터가 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 포유류의 유전자는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 포유류는 돼지일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 돼지는 미니어쳐 돼지(miniature Pigs)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1영역은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 인트론 8 또는 엑손 9의 일부를 포함하는 레프트 암(left arm)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1영역의 크기는 2kb 내지 6kb일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1영역은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 단백질 과발현 카세트는 포유류에서 과발현을 유도하는 프로모터, 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열 및 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 동물의 항시적 발현 프로모터(Constitutive promoter), 동물의 조직 특이적 프로모터(Tissue specific promoter), SV40 초기 프로모터, CMV 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 CMV 프로모터 및 사람의 EF1a 프로모터일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 동물의 유전자일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 사람의 유전자일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 사람 CD46(막공동조절단백질; membrane cofactor protein)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 선별 마커 유전자는 내부 리보솜 개시 염기서열(IRES)과 연결된 양성 선별 마커(Positive selection marker) 유전자일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 양성 선별 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycin phosphotransferase), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase), 퓨로마이신(puromycin), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase), 구아닌 포스퍼트랜스퍼라제(guanine phosphotransferae), 및 제오신(zeocin)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제2영역은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 엑손 9의 일부 또는 전체를 포함하는 라이트 암(right arm)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제2영역의 크기는 0.5kb 내지 3kb일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제2영역은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 벡터는 음성 선별 마커 유전자를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 음성 선별 마커 유전자는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제(Herpers simplex virus-thymidine kinase), 히포산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제(Hypoxanthine phosphoribosyltransferase), 시토신 디아미나아제(Cytosine deaminase) 및 디프테리아 톡신-A(Diphtheria toxin-A)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자 타겟팅 넉인 벡터가 삽입된 형질전환 세포주가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 세포주를 핵 이식하여 생산되는 비인간 복제 동물이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 비인간 복제동물은 미니어쳐 복제 돼지(miniature Pigs)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 비인간 복제동물은 NIH-미니어쳐 복제 돼지(NIH-miniature Pigs)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 비인간 복제동물을 사육하여 장기를 적출하거나, 이들의 생식세포 또는 체세포를 이용하여 장기를 생산하는 것을 포함하는 이식용 이종 장기의 생산방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 사용 목적에 따라 프로모터의 선택이 가능하여 과발현시키기 위한 유전자의 발현 조절이 가능하며, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 효과적으로 넉아웃시킴과 동시에 사람 CD46(MCP) 과발현 카세트가 상기 선택된 프로모터에 의해 과발현되도록 넉인됨으로써, 이식거부반응이 억제된 형질전환 복제 미니어쳐 복제 돼지를 생산할 수 있으며, 이들 및 이들의 자손을 이용하여 이종간 세포와 장기의 이식에 널리 사용할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 대표도면으로 자체 프로모터가 포함된 과발현 카세트가 넉인된 유전자 적중 벡터의 구조이다.
도 2는 과발현 카세트 CMV-MCP-IRESneo를 제작하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 과발현 카세트 CMV-MCP-IRESpuro를 제작하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 4는 과발현 카세트 pBKS-EF-MCPIRESneoNX를 제작하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 5은 도 4, 5, 6의 과발현 카세트가 정상적으로 단백질을 발현하는지 HEK293 세포에 도입한 후 분석한 결과이다.
도 6은 도 4, 5, 6의 과발현 카세트가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 2개의 상동 영역 사이에 삽입된 3종의 넉인벡터 모식도이다. 이 때, Gal-T는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 의미하고, KO는 Knock-out을 의미한다.
도 7은 미니어쳐 돼지의 세포에 유전자를 도입한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 미니어쳐 돼지의 세포에서 유전자적중 넉인벡터의 도입 여부를 분석하한 DNA 전기영동 결과이다.
도 9는 유전자적중 넉인벡터가 삽입된 체세포에서 MCP의 과발현 여부를 분석한 결과이다.
도 10은 유전자적중 넉인벡터가 삽입된 체세포의 핵 치환으로 생산된 돼지의 사진이다.
도 11은 핵 치환으로 생산된 미니어쳐 돼지의 형질전환 여부를 분석한 결과이다.
도 2는 과발현 카세트 CMV-MCP-IRESneo를 제작하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 과발현 카세트 CMV-MCP-IRESpuro를 제작하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 4는 과발현 카세트 pBKS-EF-MCPIRESneoNX를 제작하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 5은 도 4, 5, 6의 과발현 카세트가 정상적으로 단백질을 발현하는지 HEK293 세포에 도입한 후 분석한 결과이다.
도 6은 도 4, 5, 6의 과발현 카세트가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 2개의 상동 영역 사이에 삽입된 3종의 넉인벡터 모식도이다. 이 때, Gal-T는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 의미하고, KO는 Knock-out을 의미한다.
도 7은 미니어쳐 돼지의 세포에 유전자를 도입한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 미니어쳐 돼지의 세포에서 유전자적중 넉인벡터의 도입 여부를 분석하한 DNA 전기영동 결과이다.
도 9는 유전자적중 넉인벡터가 삽입된 체세포에서 MCP의 과발현 여부를 분석한 결과이다.
도 10은 유전자적중 넉인벡터가 삽입된 체세포의 핵 치환으로 생산된 돼지의 사진이다.
도 11은 핵 치환으로 생산된 미니어쳐 돼지의 형질전환 여부를 분석한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서 사용되는 '넉인(Knock-in)'은 다른 종 또는 원래부터 해당 생명체에 존재하지 않았던 외래의 염기서열을 해당 생명체의 게놈 또는 해당 생명체로부터 유래한 DNA 염기서열에 유전자 재조합 기술을 이용하여 삽입하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 '타겟팅(targeting)'은 원하는 게놈상의 특정 유전자 또는 특정 유전자의 특정염기서열 부위에 재조합 유전자를 삽입하거나 변형(modify)하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 GT는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 상동 재조합에서의 "상동"은 제1영역 또는 제2영역과 이에 해당하는 유전자의 핵산 서열과의 동일성 정도를 나타내는 것으로, 적어도 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 95% 이상 동일하다.
본 발명에서 사용되는 '카세트'는 프로모터-리보솜 결합부위(ribosome binding site) 특정 제한효소 부위(unique restriction site) 및 종결자(terminator)로 구성된 DNA염기서열로서 특정제한부위에 삽입된 외래유전자는 발현암호의 조절하에 놓이게 되는 발현벡터 상의 염기서열 부위를 의미한다.
즉, 상기 카세트는 유전자 재조합기술을 이용하여 삽입하기를 원하는 외래의 염기서열을 자유롭게 삽입할 수 있는 벡터 상의 특정 영역을 의미하며, PCR등을 통해 증폭된 외래의 유전자를 재조합할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "선별 마커(selection marker)"란 세포로 유전자 타겟팅 넉인 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있고, 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.
상기 "양성 선별 마커"는 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 당해 특정 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커를 의미하며, "양성 선별 마커 유전자"는 상기 양성 선별 마커를 암호화하는 유전자를 의미하는데, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(이하, 'neo'라 약칭함)는 항생제 네오마이신이 첨가된 배지에서 진핵세포가 생존할 수 있도록 하는 항생제 내성을 부여함으로써, 진핵세포에 있어서 안정적 형질감염 세포를 선별하는데 사용된다.
상기 "음성 선별 마커 유전자"는 무작위적 삽입(random insertion)이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 음성 선택을 가능하게 하는 마커 유전자로서, 당해 유전자를 발현하는 세포만을 선별적으로 사멸시킴으로써, 무작위적 삽입에 의한 형질도입을 방지하는 역할을 수행한다.
본 발명에서 사용되는 "내부 리보좀 개시 부위(internal ribosome entry site, 이하, 'IRES'로 약칭함)"는 진핵생물의 단백질 합성과정에서, 5'-캡 구조 대신 mRNA 중간 부위에서부터 번역이 가능하도록 기능하는 핵산 서열을 의미하며, 이를 이용할 경우, 하나의 mRNA로부터 복수의 다른 기능을 수행하는 단백질을 생산하는 것이 가능하다.
본 발명에서 사용되는 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 문서에서는 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 "과발현"은 정상 상태의 카피수보다 많은 전사체가 생산된 상태를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "프로모터"에는 전사에 필요한 기본인자(Basal element) 뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "포유류"는 소, 양, 염소, 돼지, 말, 토끼, 개 또는 원숭이일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 기존 유전자 타겟팅 넉인 벡터의 사용 제한을 보환하기 위하여 과발현을 목적으로 넉인시킨 유전자의 발현을 조절하기 위하여 별도의 프로모터를 연결시킨 발현카세트를 유전자 타겟팅 벡터에 삽입시켜, 사용 목적에 따라 프로모터의 선택이 가능하도록 함으로써 과발현시키기 위한 유전자의 발현 조절이 가능하며, 기능을 제거하기 위한 해당 유전자의 엑손을 선택할 수도 있어 유전자 타겟팅 넉인벡터의 제작에 편리성을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 포유류의 유전자에 상동인 염기서열을 갖는 제1영역; 단백질 과발현용 카세트; 및 상기 포유류의 유전자에 상동인 염기서열을 갖는 제2영역을 순차적으로 포함하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터가 제공될 수 있다.
이 때, 상기 유전자는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제일 수 있으며, 상동 재조합이 일어날 수 있는 포유류의 유전자라면 특별한 제한은 없다. 다만, 본 발명에서는 장기 이식시 항원 결정기인 갈락토즈를 합성하는 상기 유전자를 일 예로 들고 있을 뿐이며, 그 어떠한 유전자라도 유리한 형질의 획득을 위해서는 사용될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 포유류는 돼지일 수 있으며, 바람직하게는 미니어쳐 돼지(miniature Pigs)일 수 있고, 보다 바람직하게는 NIH-미니어쳐 돼지일 수 있다. 그러나, 상동 재조합을 통해 본 발명의 벡터로 형질전환이 가능하고, 이를 통해 장기이식에 사용될 수 있는 것이면 어느 것이든 무방하다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1영역은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 인트론 8 또는 엑손 9의 일부를 포함하는 레프트 암(left arm)일 수 있다.
일반적으로 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자는 8개의 인트론과 9개의 엑손으로 구성되어 있고, 엑손 9에 해당하는 단백질 부위에서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 효소 활성을 나타낸다고 알려져 있으므로(Yifan Dai, Nature, 20: 251-255, 2002), 엑손 9의 기능을 저해하도록 넉인 벡터를 제조할 경우에는 보다 효과적으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 기능을 저해할 수 있는 장점이 있다. 본 발명은 상기와 같은 이론적 배경에서 엑손 9의 오픈 리딩 프레임을 교란할 수 있도록 제1영역(레프트 암)과 제2영역(라이트 암)을 개시하고 있다. 이러한 본 발명의 모식도는 도 1에 나타나 있다.
상기 제1영역의 크기는 2kb 내지 6kb일 수 있다. 이 때, 상기 제1영역의 크기가 2kb 미만일 경우에는 상동 재조합이 잘 일어나지 않고, 6kb이상인 경우에는 벡터의 크기가 불필요하게 커져 불안정하게 되거나 형질전환이 원하는대로 잘 이루어지지 않을 수 있어 바람직하지 않다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1영역은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 단백질 과발현 카세트는 포유류에서 과발현을 유도하는 프로모터, 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열 및 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 동물의 항시적 발현 프로모터(Constitutive promoter), 동물의 조직 특이적 프로모터(Tissue specific promoter), SV40 초기 프로모터, CMV 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 CMV 프로모터 및 사람의 EF1a 프로모터일 수 있다. 이 때, 상기 프로모터 대신에 내생으로 존재하는 유전자의 프로모터를 이용할 수도 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 동물의 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 사람의 유전자일 수 있으며, 보다 바람직하게는 사람 CD46(막공동조절단백질; membrane cofactor protein)일 수 있다. 인간 보체 조절 단백질 DAF(decay accelerating factor)는 보체반응경로에서 C2와 C4b의 결합을 방해함으로서 보체의 활성화를 억제하며, MCP(membrane cofactor protein)는 C4b 분해를 촉진하여 보체가 숙주세포에서 활성화되는 것을 억제하며, CD59(homologous restriction factor)는 C7, C8과 C5b6의 결합을 방해함으로서 막 공격복합체(MAC)의 형성을 억제하는 것으로 알려져 있으므로, 이들 유전자에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 선별 마커 유전자는 내부 리보솜 개시 염기서열(IRES)과 연결된 양성 선별 마커(Positive selection marker) 유전자일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 양성 선별 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycin phosphotransferase), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase), 퓨로마이신(puromycin), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase), 구아닌 포스퍼트랜스퍼라제(guanine phosphotransferae), 및 제오신(zeocin)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 CMV 프로모터와 CD46 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 순차적으로 포함하는 CMV-MCP-IRESneo, 퓨로마이신을 양성 선별 마커로 포함하는 CMV-MCP-IRESpuro를 제조하였으며, 그 모식도는 각각 도 2와 도 3에 나타나 있다. 또한, pBKS-EF-MCPIRESneoNX 벡터를 제조하여(도 4 참조) 사람 유래 HEK293세포에서 웨스턴 블롯 방법으로 분석한 결과 CD46(MCP)가 과발현됨을 입증하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.
본 발명의 실시예에 따르면, CD46(MCP) 과발현 카세트 CMV-MCP-IRESneo, CMV-MCP-IRESpuro, pBKS-EF-MCPIRESneoNX가 각각 삽입된 3종의 NIH-미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 타겟팅 Gal-T KO/CMV-MCP-IRESneo, Gal-T KO/CMV-MCP-IRESpuro, Gal-T KO/EF1α-MCPIRESneo 넉인 벡터를 제공될 수 있는데, 도 6에는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포주의 게놈을 나타내는 모식도가 나타나 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제2영역은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 엑손 9의 일부 또는 전체를 포함하는 라이트 암(right arm)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제2영역의 크기는 0.5kb 내지 3kb일 수 있다. 이 때, 상기 제2영역의 크기가 0,5kb를 넘지 않는 경우에는 상동 재조합이 일어날 확률이 매우 낮으며, 3kb를 넘을 경우에는 유전자 재조합이 어렵고, 불필요하게 커진 크기로 인해 벡터가 불안정해질 수 있어 바람직하지 않다.
일 실시예에 따르면, 상기 제2영역은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 벡터는 음성 선별 마커 유전자를 더 포함할 수 있는데, 바람직하게는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제(Herpers simplex virus-thymidine kinase), 히포산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제(Hypoxanthine phosphoribosyltransferase), 시토신 디아미나아제(Cytosine deaminase) 및 디프테리아 톡신-A(Diphtheria toxin-A)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자 타겟팅 넉인 벡터가 삽입된 형질전환 세포주가 제공될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, Gal-T KO/CMV-MCP-IRESneo 벡터가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자에 타겟팅된 NIH 미니어쳐 돼지 세포주가 제공될 수 있다. 이 때, 상기 세포주로 사용될 세포의 종류에는 제한이 없으며, 이를 형질전환하는 방법에도 제한이 없다. 즉, 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 세포주를 핵 이식하여 생산되는 비인간 복제 동물이 제공될 수 있으며, 바람직하게는 미니어쳐 복제 돼지(miniature Pigs), 보다 바람직하게는 NIH-미니어쳐 복제 돼지(NIH-miniature Pigs)가 제공될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, Gal-T KO/CMV-MCP-IRESneo 벡터가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자에 타겟팅된 형질전환 NIH 미니어쳐 돼지를 제공될 수 있으며, 도 10에는 상기 형질전환된 복제 돼지의 사진이 나타나 있다. 도 11에는 이들 형질전환된 돼지를 PCR 방법으로 확인한 결과가 나타나 있다.
상기 복제동물의 제조에 이용되는 핵이식 방법은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하는 것이 가능하나, 보다 바람직하게는 US6,781,030B, US6,603,059B, US6,235,969B, US7,355,094B, US7,071,372B, KR862298B, KR500412B, KR807644B, JP4153878B, US6,700,037B, US7,291,764B, US6,258,998B, US6,548,741B, WO03/089632A, US7,371,922B 등이 사용될 수 있고, 특히 돼지의 경우에는 KR500412B, KR807644, JP4153878B, US6,700,037B,US7,291,764B, US6,258,998B, US6,548,741B, WO03/089632A 또는 US7,371,922B에 기재된 방법을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 특허문헌들은 모두 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 비인간 복제동물을 사육하여 장기를 적출하거나, 이들의 생식세포 또는 체세포를 이용하여 장기를 생산하는 것을 포함하는 이식용 이종 장기의 생산방법이 제공될 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 비인간 복제동물을 사육한 후, 이식에 필요한 장기를 적출하는 단계를 포함하는 이식용 이종 장기의 생산방법을 제공한다. 상기 장기는 수용 대상의 성별, 나이, 체중, 신장 등을 고려하여, 사육시기를 조절하여 공여체 복제동물을 사육한 다음, 통상의 외과적 수술을 통해 적출할 수 있으며, 적출 후 수용 대상에게 바로 이식되거나, 신속하게 냉장보관될 수 있다. 또한, 상기 비인간 복제동물로부터 정자 또는 난자와 같은 생식세포를 추출하여 이를 인공수정 또는 자연수정하여 이들의 자손을 얻을 수도 있으며, 이들 자손을 이용하여 장기 이식 또는 장기 이식을 위한 기타의 부산물의 제조에 사용할 수도 있다. 마찬가지로 상기 비인간 복제동물의 체세포를 추출하여 상기와 같이 장기이식 또는 기타의 부산물의 제조에 사용할 수도 있음은 물론이다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
1. 사람
CD46
(
MCP
) 유전자 염기서열의
클로닝
사람 CD46(MCP)를 과발현하는 카세트를 제작하고자 한국생명공학연구원 21c Frontier human gene bank에서 사람 MCP cDNA 클론(Clone ID, hMU002255)을 구입하였다. PvuII site를 첨가한 프라이머 MCP 1F: 5'-ATCAGCTGATGGAGCCTCCCGGCCGC-3'와 MCP 1R: 5'-GCCAGCTGTCAGCCTCTCTGCTCTGCTGGA-3'를 사용하여 hMCP의 coding region을 PCR로 합성 한 후 pGEM T-easy 벡터에 삽입시켜 (pGEM T-MCP)염기서열 분석으로 100% 일치하는 것을 확인하였다.
실시예
2.
pCMV
-
MCP
-
IRESneo
와
pCMV
-
MCP
-
IRESpuro
카세트 제작
pIRESneo2 (Clontech, USA)와 pIRESpuro3 (Clontech, USA)벡터를 multicloning site에 포함되어 있는 EcoRI과 BstXI으로 절단한 후, DNA blunting kit (Takara, Japan)으로 유전자의 말단을 blunt로 만들었다. pGEM T-MCP 벡터를 제한효소 PvuII로 절단하여 MCP 유전자 단편만을 추출한 후 pIRESneo2와 pIRESpuro3 벡터에 각각 연결하여 pCMV-MCP-IRESneo 벡터와 pCMV-MCP-IRESpuro 벡터를 제작하였다.
실시예
3.
pEF1a
-
MCP
-
IRESneo
카세트 제작
pIRESneo3 벡터에서 IRES 염기서열과 네오마이신 유전자 염기서열 사이에 있는 제한 효소 SmaI 부위를 제거하기 위하여 XmaI으로 절단한 다음 DNA blunting kit (Takara, Japan)으로 유전자의 말단을 blunt로 만들어 다시 연결하여 pIRESneo-SX를 제작하였다. 또한 pBluescript II KS+ 벡터를 제한 효소 NotI으로 절단한 다음 DNA blunting kit (Takara, Japan)으로 유전자의 말단을 blunt로 만들어 NotI 부위를 제거한 후 다시 연결하였다. 그러고 나서 이 벡터를 다시 제한 효소 XbaI으로 절단한 후 DNA blunting kit (Takara, Japan)으로 유전자의 말단을 blunt로 만들어 XbaI 부위를 제거한 후 다시 연결하여 제한 효소 NotI과 XbaI 인식 부위가 제거된 pBKS-NX 벡터를 제작하였다.
EF1a promoter는 pBudCE4.1 벡터 (Invitrogen, USA)를 제한 효소 NheI과 NotI으로 절단, 분리한 후, 제한 효소 NheI과 NotI으로 절단하여 선형으로 만든 pIRESneoSX 벡터에 삽입하여 pEFIRESneoSX 벡터를 완성하였다. 이 벡터를 제한 효소 EcoRV와 SalI으로 절단한 후 EF1a promoter, IRES, neomycin 염기서열만을 추출하였고, 이 단편을 제한 효소 SamI과 SalI으로 선형화로 만든 pBKS-NX 벡터에 연결하여 pEF1a-MCP-IRESneo 벡터를 완성하였다.
실시예
4. 사람
MCP
과발현 카세트로부터의
MCP
과발현의 확인
사람 MCP 과발현 카세트가 구조적으로 정확하게 작동하는지를 알아보기 위하여 사람 유래 HEK293 세포주에 pCMV-MCP-IRESneo 벡터와 pCMV-MCP-IRESpuro 그리고 pEF1a-MCP-IRESneo 벡터를 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)에 의해 유전자를 도입시키는 jetPEITM (Poluplus transfection, USA)를 사용하여 도입하였다. 48시간 후, 세포에서 M-per mammalian protein extract (Thermo Scientific, USA)용액으로 단백질을 추출하였고, 웨스턴 블롯 분석 방법으로 3종의 모든 과발현 카세트에서 MCP가 과발현되는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예
5.
NIH
미니돼지의 알파 1,3-
갈락토실트랜스퍼라제
유전자로부터
레
프트암과
라이트암의
염기서열 동정
다양한 종류의 돼지 중에서 NIH 미니돼지는 장기 이식용으로 육종된 대표적인 품종이다 (Joan Lunney and David Scchs, The Journal of Immunology, 120: 607-612, 1978). 일반적으로 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자는 8개의 인트론과 9개의 엑손으로 구성되어 있고, 엑손 9에 해당하는 단백질 부위에서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 효소 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Yifan Dai, Nature, 20: 251-255, 2002). NIH 미니돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 타겟팅 벡터를 제작하기 위하여, NIH 미니돼지의 귀 조직에서 genomic DNA를 추출하였고, 이를 주형으로 하여 PCR 방법으로 레프트암과 라이트암을 합성하였다. PCR은 교정기능(proof-reading)이 있는 Takara사의 PrimeSTAR HS DNA 중합효소를 사용하였다. 라이트암을 합성하기 위한 프라이머 염기서열은 NotI 제한 효소 인식 부위가 첨가된 R1F: 5'-ATGCGGCCGCATTAGGCTGCTCAGAACT-3' 와 SalI 제한 효소 인식 부위가 첨가된 R1R: 5'-CGGTCGACCATGAAGTATGTATTTGCAGAT-3'이었고, PCR 조건은 98℃에서 3분간 방치 후, 98℃에서 10초, 55℃에서 10초, 72℃에서 5분간 35회 반복하였다. 레프트암을 합성하기 위해 사용된 프라이머 염기서열은 XhoI 제한 효소 인식 부위가 첨가된 L1F: 5'-ATCTCGAGCTGACGAGTTCACCTACGAGAG-3' 와 SalI 제한 효소 인식 부위가 첨가된 L1R: 5'-GCGTCGACTACAAGACTACTTCTCCAGGAT-3'이었고, PCR 조건은 98℃에서 3분간 방치 후, 98℃에서 10초, 55℃에서 10초, 72℃에서 3분간 35회 반복하였다. 5kb의 레프트암과 2kb의 라이트 암을 pGEM T-esay 벡터에 각각 삽입시킨 후 염기서열을 분석하였다.
유전자 타겟팅 벡터 제작의 첫 번째 단계로서, 라이트암을 제한 효소 XhoI과 SalI을 이용하여 추출 한 후, 제한 효소 SalI으로 선형으로 만든 음성 선별 마커인 DT-A가 삽입되어 있는 pMCDT-A 벡터에 삽입시켰다. 그러고 나서, 레프트암을 제한 효소 NotI과 SalI으로 절단하여 추출하였고, 제한효소 NotI과 SalI으로 절단하여 선형으로 만든 라이트암이 삽입된 pMCDT-A 벡터와 연결하여 GT-KO 벡터를 완성하였다.
실시예
6.
GT
-
KO
/
CMV
-
MCPIRESneo
벡터 제작
GT-KO 벡터를 제한 효소 SmaI으로 선형화시킨 후 정제하였다. pCMV-MCP-IRESneo를 먼저 제한 효소 XbaI으로 절단한 후 DNA blunting kit (Takara, Japan)으로 XbaI 인식 부위 말단을 blunt로 변형시켰다. 그러고 나서 제한 효소 NruI으로 절단하여 CMV-MCP-IRESneo 단편만을 추출하여 SmaI으로 선형화된 GT-KO 벡터에 삽입시켜 GT-KO/CMV-MCPIRESneo 벡터를 완성하였다.
실시예
7.
GT
-
KO
/
CMV
-
MCPpuro
벡터 제작
GT-KO 벡터를 제한 효소 SmaI으로 선형화시킨 후 정제하였다. pCMV-MCP-IRESpuro를 먼저 제한 효소 XbaI으로 절단한 후 DNA blunting kit (Takara, Japan)으로 XbaI 인식 부위 말단을 blunt로 변형시켰다. 그러고 나서 제한 효소 NruI으로 절단하여 CMV-MCP-IRESneo 단편만을 추출하여 SmaI으로 선형화된 GT-KO 벡터에 삽입시켜 GT-KO/CMV-MCPIRESpuro 벡터를 완성하였다.
실시예
8.
GT
-
KO
/
CMV
-
MCPpuro
벡터 제작
GT-KO 벡터를 제한 효소 SmaI으로 선형화시킨 후 정제하였다. pEF1a-MCP-IRESneo 벡터를 먼저 제한 효소 XbaI으로 절단한 후 DNA blunting kit (Takara, Japan)으로 XbaI 인식 부위 말단을 blunt로 변형시켰다. 그러고 나서 제한 효소 SmaI으로 절단하여 EF1a-MCP-IRESneo 단편만을 추출하여 SmaI으로 선형화된 GT-KO 벡터에 삽입시켜 GT-KO/EF1a-MCPIRESneo 벡터를 완성하였다.
실시예
9. 사람
MCP
과발현 카세트가 삽입된
NIH
미니돼지의 알파 1,3-
갈락
토실트랜스퍼라제 유전자
타겟팅
벡터가 도입된
체세포주
GT-KO/CMV-MCPIRESneo 벡터를 NIH 미니돼지의 귀 조직에서 추출한 섬유아세포에 Nucleofector (Amaxa Inc, USA)와 electroporator (BTX Havard apparatus)를 사용하여 도입하였다. 10일령 된 NIH-미니돼지에서 귀조직을 배양하여 섬유아 세포를 얻었고 cuvette당 세포는 1x106개, DNA는 2μg을 사용하여 Nucleofector의 U-023program과 2ms, 450V, 4 pulse의 조건으로 BTX를 사용하여 GT-KO/CMV-MCPIRESneo 벡터를 세포에 도입하였다. 유전자가 도입된 세포만을 선별하기 위하여 네오마이신을 400μg/ml의 농도로 처리하였다. 네오마이신 처리 약 2주 후 형성된 콜로니를 24well dish에 각각 옮겼다. 이렇게 분리된 세포들은 24well dish부터 12well, 6well, 6cm, 10cm dish의 순서로 옮겨졌으며 첫 번째 분석은 12well에서 6well dish로 옮길 때 세포 일부를 채취하여 DNA를 추출한 후 PCR분석을 하였다. 첫 번째 분석은 벡터안쪽과 벡터바깥쪽 염기서열을 이용한 분석으로 primer는 GT-KO/CMV-MCPIRESneo벡터의 네오마이신 유전자의 염기서열에 포함하는 정방향 프라이머 GT1F: 5'-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT-3'과 라이트암 영역 외부 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 GT1R:5'-TTATAGAGAAACAAGAGTCCTAATTGACTTGT-3'를 사용하였다. 첫 번째 분석에서 GT-KO/CMV-MCPIRESneo벡터가 도입되었다고 판단되는 세포들은 6well dish 에서 6cm 로 증식될 때 6well dish의 1well당 6cm dish 2개로 나누어 배양하였으며 그 중 한 개는 핵 치환을 위한 공여세포로 사용하기 위하여 동결보존 하였고, 나머지 한 개는 두 번째 분석을 위해 DNeasyBlood&Tissue Kit(QIAGEN)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 두 번째 분석은 정방향 프라이머 GT2F: 5'-TTATAGAGAAACAAGAGTCCTAATTGACTTGT-3' 역방향 프라이머 GT2R: 5'-AATGGTGGAG AGTAGCTGGGAATGTTACAG-3'을 사용하여 PCR을 수행하였다.
최종적으로 GT-KO/CMV-MCPIRESneo벡터가 정확히 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자에 타겟팅이 된 것으로 판명된 세포에서 단백질을 추출한 후 웨스턴 블롯 방법으로 분석한 결과 정상의 세포에서 보다 높은 수준에서 과발현됨을 확인하였다.(도 5 참조)
실시예
10. 체세포의
핵치환
도살장에서 난소를 실험실로 이송한 후 흡입방법으로 난자를 체취하였다. 체외에서 성숙시킨 후 난자로부터 핵을 제거한 후 GT-KO/CMV-MCPIRESneo벡터가 타겟팅된 공여세포를 이식하였고 1.2kV/cm에서 두 번의 DC pulse 전기 자극으로 융합을 실시하였다. 생존한 융합난자만을 선별하여 대리모의 난관에 이식하였다.
실시예
11.
GT
-
KO
/
CMV
-
MCPIRESneo
벡터가
타겟팅된
형질전환 돼지의 생산
자연분만으로 출생한 자손의 꼬리를 1cm 정도 채취 후 Maxwell DNA purification Kit(Promega)로 DNA를 추출하였다. 추출 한 DNA로부터 첫 번째 프라이머 조합 GT3F:TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT과 GT3R:TTATAGAGAAACAAGAGTCCTAATTGACTTGT 그리고 두 번째 프라이머 조합 GT4F:TTATAGAGAAACAAGAGTCCTAATTGACTTGT와 역방향 프라이머 GT4R:AATGGTGGAGAGTAGCTGGGAATGTTACAG을 사용하여 PCR 분석으로 확인하였다. 또한, 레프암 영역과 라이트암 영역 외부 염기서열을 포함하는 프라이머 GT5F:ATGCCAAACAGAAAATTACCGTGGGCTTGA와 프라이머 GT5R:AACTTGCACCATGAAGTCTCTGCACTCCAG을 사용하여 PCR 분석을 실시한 후 유전자 도입여부를 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> Gene targeting knock-in vector containing overexpression
cassette, the method for constructing the same and transgenic
cloned animal carrying the vector for xenotransplantation
<130> NPF18476
<160> 18
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 4821
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
gcggccgcat taggctgctc agaacttcct cttccagagg ttggataggt tcctgtttca 60
gcccccgttt ccttgtttgg aacttttctc cccaaactgt aatcattctt acttaaaagt 120
agtagctgta atgttcgttt aaaatataac ccagttttct tttttagaga atcccccccc 180
cctttttttc caaaacaaaa gcaaaagttc aattttcctg ttcacctccg tgccccttcc 240
ctcccccaca tccatgggcc tttccatctg taccttttct gaaagccaca aagaaacgga 300
atcactttgt tatacagaaa aaattatcac aacattgtaa gacaactata cttcaacaaa 360
acttaaaaaa aaatcagaaa gagaaagaaa gaaaaagaaa aaaaggaagg aaggaaggga 420
gttcccatca tagctcattg gttaatgaat ctgactagca tccatgagga cacaggttca 480
atccctggcc ttgatcagtg ggttaaggat ctggtgttgc cgtgggctgt ggtgtaggtc 540
acagatgcat ttcgaatccc gcattgctgt ggctctgacg caggccaaca tcacagctcc 600
gattggaacc ctagcctggg agggtacagc cctaaaaaag caggaaagga aggaaggaag 660
gaagaaagaa aaggaaggaa gggaaagaga aagagaaaga gagaaagaga gaaagggaga 720
aaggaagaaa ggaagaaaga aaggaagaaa gaaagaaaga aaggaagaaa gaaagaaaga 780
aggaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gaaggaagga aagaaagaaa gaaagaaaga 840
aagaaagaaa aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaag aaaagaaaag 900
aaaagaagtt agttgacctg ttgcctgtac aaagagaagt gaaggtcaag gttgatctga 960
gtgaagattt aagcgtcctc ctgagacctt ctccaaccta gagcccagaa ggtatcactg 1020
tcactgtact aatcaagtcc taatgtccct gaatgtactg atcccagggg cctgggtggc 1080
atctctaata gagaagggtg actctggagt tttgaccttt cgactagaag aatatgttct 1140
gttaggagtt gggaaagatt cccagctcac ctaatccttt ggtataagag gagaccagcc 1200
agccatactg cagattgatt taaccttggt gtttccaaaa agaacggctc cacattggct 1260
ctagccatct tgttgcagct ttagagaact aaactgtact tggcatgtcc tggtgaaacc 1320
cgcgcactct gctctgaggc gagtgaggac tgtttgtact cagcagcaat aaatcctccc 1380
aagagtggat ttggactttt aggaggtgtg atgtttggtt tattttcaaa tgacaatgca 1440
cagcaccaac tgcagcgctt taatctctaa acaatgttaa acctcacaaa ggtttcctcc 1500
ctcgccccta ggatcacctc ccaagcttca gggcacaata gattttttct taaagttcca 1560
gagtgcagaa gaatttcctg gccattagcc ccagagccat gttgaagtcc ctccttgtat 1620
tgctgagata ttctctccgt ttaaagaatc aatactataa acctggggtt tccagagacc 1680
agcattgaaa gcacagttta tgtttgtagt aatcaaaggg aatccaagca gcaaccaaaa 1740
aacaaaagga agtgccagtc attattacaa aatgtcatca ttggctgata atgtgatcaa 1800
caaattaaat tcagtgcaca gtcactgggc atgagtctgg gtggtgacgt gggttgtgtt 1860
aagccagcca actacttctt cccttctcta tcatccccat ggcttcacag aatagcctgt 1920
atcttggctt acagaagaca ggaatgtgat gggttttttt ttttctcttt ttctttttca 1980
gctgcacctg tggcgtatgg aagttctgag ccacagctgt gaccttctcc atagctgcag 2040
caacactgga tctttaaccc actgtgccac tgccacaatg ggaactcccc cctttccttt 2100
tcttcctgaa catgatggtt tttgaatgaa taggtaaata gctaaaatac cactacacat 2160
ctattagaat gacccaaatc ccaaacactg acaataccag ctgctgatga aaatgtagag 2220
cgataggaaa gcttattcac tgctgctggc aatgcgaaat gatacaacca atttgtaaga 2280
cagtttggca gattcttaca aaactaaaca tactcttacc atacaatcca gcgatggcac 2340
accttagtat ttaccctcaa aagctgaaac tttatgtcta cacaaaaact tgcatacaga 2400
tgtttatagc aggtattttt ttttgggggg ggtgggtttt ggttttttct ttttttgttt 2460
tttttgggcc acacctgcgg catatggagg ttcccaggct aagggttgaa tcagagctac 2520
agctgccggc ctatgccaca gccacagtaa cccgagatct gagccacatc tgcgacctac 2580
accacagctc atggccacac tggatcctta accccctgag cgaggccagg gattgaacct 2640
gcaactaggt gggtttgttg accactgagc cacgaaagga actccgttta tagcactttt 2700
attcataatt gcccaaaact tggaagtaac aggtccttta gtaggcaaat taattgataa 2760
attgtagcac attcagacag tggagtatta gcagtgcttt aaaaaaaaaa atcaatccat 2820
gaaaagacat ggaggaacct caaatgttcg ttaccaagaa accatctgca aagactacct 2880
actatatggt tccaactata tgacattctg gaaaaggtca aaggtactga tccatggaga 2940
cagtaaaaat atcagtagat gccaggcgat ggtgtgggag aatggatgaa tagacagaac 3000
acaggatttt ttagggcagt gaaaatactc tgtatggtac catacatagt gatagataaa 3060
tgtcatttta catttgttca gattcataga aagtctgcca ccaagagtga accttagtgt 3120
aaactacggg cttggtgtga taatgatgtg tcagtgtagt ttcatcagtt gcaacacgtg 3180
ctaccctggt gctggatgtt gatggtggga gaagctggga gtgggagtgg ggggagcggg 3240
gggaattctg cactttcagc tcaattttgc tgtgagccta aacatgttct aaaaactaaa 3300
atctattttt ttaaatgaaa cgagatagtt aaagtaaggt tgaatcagag gtcgtttgct 3360
ctcatatttg gatgggtttt ataatgatgg tgtctggata atgggctggt gtttggggtg 3420
accagcggga aactcacagg gtaaatcagt aagatggaag aatatccata ttccataatc 3480
cattgtttgg gtcccagaga aggataagag agtggcgatg gttaggctta atgacccttg 3540
cacatcacgc ttgcatctgg taggtcagta aaagtattgg aatataggct ggggtttttg 3600
aggaagagct aagaactagt gccccctgat ggtaatcaaa gggtacaaac ttgcagttat 3660
aagatgaata agctctggga tctaatgtac agcatggtga ttgtttttaa tcatactgta 3720
atatatactt taaggttggt cagagaataa gtcctaagtc ttcttgccac aaaaaaatgg 3780
taattatgtg atatgatgaa ggtgtcaagt aatgccacag tggtaatcat ttctaatata 3840
tgagtgtacc agggagtttc cgttgtcact cagtgggtta agaatctgac tagtaaccat 3900
gaggatttgg gttcgatccc tggccttgct cagtgggtta aaggatcaag cattgccacc 3960
agctgcggtg taggtcatag acaaagctca gatctggtgt tgctgtggct gtggcatggg 4020
ccagcagctg caactgcaat tagaccccta gtctgggaac ctccatatgc tgcggatgtg 4080
gccctaaaaa gacaaaaaat aaaaataaaa ataagtgcat cacatcaaca ctttgcacac 4140
cttaaactta cacaatgata tatgtcagtt atatctgaat aatgcaggaa aaaaggaaga 4200
actagcatct gaactgattg ataaggacaa ggggataaag actaattaag gcagatggta 4260
atgagttatc accttcatta cagttaaagc tggtgttgga gtatgtggct tataactgca 4320
ggccctgggc ttccaaatct tgaaccacag aattagaaag acttaggcat ccaggcacat 4380
acagcacaag taactgcagg cctctggatg tgggagcagg gcctgtgcca ctaaggtacc 4440
actgcaaggc ccagagcagc tgaaaacaca tgttctctct gcctggttgg cttccaagag 4500
tgagagagga aggagcaggg ctgagcatgc ccagccaccc tgccagaatc accagtcagg 4560
taagccactc cacctcccca aagctgaatg actgaatggt ggagagtagc tgggaatgtt 4620
acagcaacag acgtctctca tccaggatgg ggaaaaatca ttcctttcct aaactgcaaa 4680
atacagacta gatgataata gcatattgtc tcctctagaa atcccagagg ttacatttac 4740
cccattcttc tttatttcag atacattgag cattacttgg aggagttctt aatatctgca 4800
aatacatact tcatggtcga c 4821
<210> 2
<211> 1955
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
ctcgagctga cgagttcacc tacgagaggc ggaaggagtc cgcagcctac attccgtttg 60
gccaggggga tttttattac cacgcagcca tttttggggg aacacccact caggttctaa 120
acatcactca ggagtgcttc aagggaatcc tccaggacaa ggaaaatgac atagaagccg 180
agtggcatga tgaaagccat ctaaacaagt atttccttct caacaaaccc actaaaatct 240
tatccccaga atactgctgg gattatcata taggcatgtc tgtggatatt aggattgtca 300
agatagcttg gcagaaaaaa gagtataatt tggttagaaa taacatctga ctttaaattg 360
tgccagcagt tttctgaatt tgaaagagta ttactctggc tacttcctca gagaagtagc 420
acttaatttt aacttttaaa aaaatactaa caaaatacca acacagtaag tacatattat 480
tcttccttgc aactttgagc cttgtcaaat gggagaatga ctctgtggta atcagatgta 540
aattcccaat gatttcttat ctgttctggg ttgagggggt atatactatt aactgaacca 600
aaaaaaaaaa ttgtcatagg caaagaaaaa gtcagagaca ctctacatgt catactggag 660
aaaagtatgc aaagggaagt gtttggcaac aaaataagat tgggaggggt cgtcctcttg 720
attttagcgt cttcctgtct ctgctaagtc taaagcaaca gagttgcttt gcagcaggag 780
atcagagtct accttagcaa tcctcagatg atttcaacag cagaggactt caggttattt 840
gaagtccatg tccttttcgc atcagggttt tgtttggctt ctgcgcagat actgatcaag 900
attcccaatg gtgaatgttg ggagttacag ggaatccgaa tgaaccaatg ggagctcagc 960
acgaaataaa agcacagctt ctaagtaagt ttgccatgaa atagcgaaga cagattggaa 1020
agagaggggg ctgatcactg tggggcaatg ccatttctaa gagacacagg gcatggagtt 1080
ggcatgtaca tacagcttgg atccaggcac tgaatgggag gcaatgagag tggctccagc 1140
ctcctcaacc atatgacaac tagagcagca ctgtcttaga agatgcttct tgctttggcc 1200
aagtcatatt cagtctgcca gactctggaa tttgtgtcta caaatccttg ctcagaggaa 1260
gtggatgatg tcagagtgga cagaggccta cagtgggttg aagtgacttc ctagatcttg 1320
gcttcatgac aatcaggcat cagcaagtcc tgctgccacc tgctctaact ctcagagtcc 1380
ctcagcccat catgggcaac ttgagagcca ccgtcaagga gtggactaga ggaaaagcct 1440
gcttatcagg gaacctctca tttcccctgc cccagctgca ctactgaagt gtaactgccg 1500
gacatgttta ataaagtggt taattgattt tatatcaaag tagagaggat ggcaatggga 1560
gacccagtcc tcatgactaa acagcttttc aatccctttc tctaagaaaa gctatgagat 1620
cttacatgta atttaaagtt aagcagtttg gtgtaaagga agttaggagg caatatttac 1680
atctgcaggt atgtgatata cttttgcttg tgttccagtt taggtcattt gtgtccattt 1740
tcaaatgatt tacttgaaga gccattgcac tgacttgatg ttcagcacga tgggcttctt 1800
tgataaaatg aaacctacat tttctctact gtttccctgg gcctcctact cttcaattct 1860
tgctaaaaat ttttgcaacc cagcaaaata actcaacaaa ataacccaac aaaataactc 1920
aacaaaaatc ctggagaagt agtcttgtag tcgac 1955
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atcagctgat ggagcctccc ggccgc 26
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gccagctgtc agcctctctg ctctgctgga 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 5
atgcggccgc attaggctgc tcagaact 28
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 6
cggtcgacca tgaagtatgt atttgcagat 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 7
atctcgagct gacgagttca cctacgagag 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 8
gcgtcgacta caagactact tctccaggat 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> neomycin marker
<400> 9
tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt 30
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> neomycin marker
<400> 10
ttatagagaa acaagagtcc taattgactt gt 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 11
ttatagagaa acaagagtcc taattgactt gt 32
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 12
aatggtggag agtagctggg aatgttacag 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 13
tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt 30
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 14
ttatagagaa acaagagtcc taattgactt gt 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 15
ttatagagaa acaagagtcc taattgactt gt 32
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 16
aatggtggag agtagctggg aatgttacag 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 17
atgccaaaca gaaaattacc gtgggcttga 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GT-KO/CMV-MCPIRESneo
<400> 18
aacttgcacc atgaagtctc tgcactccag 30
Claims (26)
- 상동 재조합 방법으로 유전자를 넉인(Knock-in)시키는 벡터에 있어서,
포유류의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 인트론 8 또는 엑손 9의 일부를 포함하는 레프트 암(left arm)인 2kb 내지 6kb 크기의 염기서열을 갖는 제1영역;
단백질 과발현용 카세트; 및
포유류의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 엑손 9의 일부 또는 전체를 포함하는 라이트 암(right arm)인 0.5kb 내지 3kb 크기의 염기서열을 갖는 제2영역;
을 순차적으로 포함하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 포유류는 돼지인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제3항에 있어서, 상기 돼지는 미니어쳐 돼지(miniature Pigs)인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제3항에 있어서, 상기 돼지는 NIH-미니어쳐 돼지(NIH-miniature Pigs)인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 제1영역은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 과발현 카세트는 포유류에서 과발현을 유도하는 프로모터, 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열 및 선별 마커 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 프로모터는 동물의 항시적 발현 프로모터(Constitutive promoter), 동물의 조직 특이적 프로모터(Tissue specific promoter), SV40 초기 프로모터, CMV 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터 및 사람의 EF1a 프로모터인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 동물의 유전자인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 사람의 유전자인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열은 사람 CD46(막공동조절단백질; membrane cofactor protein)인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 선별 마커 유전자는 내부 리보솜 개시 부위(IRES)와 연결된 양성 선별 마커(Positive selection marker) 유전자인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제15항에 있어서, 상기 양성 선별 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycin phosphotransferase), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase), 퓨로마이신(puromycin), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase), 구아닌 포스퍼트랜스퍼라제(guanine phosphotransferae), 및 제오신(zeocin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 제2영역은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 음성 선별 마커 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제20항에 있어서, 상기 음성 선별 마커 유전자는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제(Herpers simplex virus-thymidine kinase), 히포산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제(Hypoxanthine phosphoribosyltransferase), 시토신 디아미나아제(Cytosine deaminase) 및 디프테리아 톡신-A(Diphtheria toxin-A)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 포유류의 유전자 타겟팅 넉인 벡터.
- 제1항의 유전자 타겟팅 넉인 벡터가 삽입된 형질전환 세포주.
- 제22항의 형질전환 세포주를 핵 이식하여 생산되는 비인간 복제 동물.
- 제23항에 있어서, 상기 비인간 복제동물은 미니어쳐 복제 돼지(miniature Pigs)인 것을 특징으로 하는 비인간 복제 동물.
- 제23항에 있어서, 상기 비인간 복제동물은 NIH-미니어쳐 복제 돼지(NIH-miniature Pigs)인 것을 특징으로 하는 비인간 복제 동물.
- 제23항의 비인간 복제동물을 사육하여 장기를 적출하거나, 이들의 생식세포 또는 체세포를 이용하여 장기를 생산하는 것을 포함하는 이식용 이종 장기의 생산방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020100117142A KR101236724B1 (ko) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | 단백질 과발현 카세트를 포함하는 유전자 타겟팅 넉인 벡터, 이의 제조 방법 및 이 벡터가 도입된 이종간 이식용 형질전환 복제동물 |
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|---|---|---|---|
| KR1020100117142A KR101236724B1 (ko) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | 단백질 과발현 카세트를 포함하는 유전자 타겟팅 넉인 벡터, 이의 제조 방법 및 이 벡터가 도입된 이종간 이식용 형질전환 복제동물 |
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| KR (1) | KR101236724B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101863653B1 (ko) * | 2016-06-02 | 2018-06-05 | 전남대학교 산학협력단 | 락토페린 발현용 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉인 방법 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090056922A (ko) * | 2007-11-30 | 2009-06-03 | 한국생명공학연구원 | 이종 장기 이식용 미니 복제돼지 생산을 위한 유전자 조작된 세포주 및 그의 생산방법 |
| KR20100013227A (ko) * | 2008-07-30 | 2010-02-09 | 한국생명공학연구원 | 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 및그의 용도 |
| EP2199392A2 (en) | 1999-03-04 | 2010-06-23 | Revivicor, Inc. | Genetic modification of somatic cells and uses thereof |
-
2010
- 2010-11-23 KR KR1020100117142A patent/KR101236724B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2199392A2 (en) | 1999-03-04 | 2010-06-23 | Revivicor, Inc. | Genetic modification of somatic cells and uses thereof |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20120055409A (ko) | 2012-05-31 |
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