CN1769423A - 表达降低水平的金属蛋白酶的宿主细胞和在蛋白质产生中使用该宿主细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的宿主细胞和产生蛋白质的方法。更具体地说,本发明涉及对表达异源蛋白质有用的宿主细胞,为了表达明显降低水平的金属蛋白酶,该宿主细胞已经遗传修饰过。此外本发明涉及产生异源蛋白质的方法,该方法包括在适当的生长培养基中培养所述宿主细胞,接着回收所需蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及新的宿主细胞和产生蛋白质的方法。更具体地说,本发明涉及对表达异源蛋白质有用的宿主细胞,为了表达明显降低水平的金属蛋白酶,该宿主细胞已经遗传修饰过。此外本发明涉及产生异源蛋白质的方法,该方法包括在适当的生长培养基中培养所述宿主细胞,接着回收所需蛋白质。
背景技术
近年来在表达异源蛋白质中重组宿主细胞的使用大大简化了商业上有价值的许多蛋白质的产生,这些蛋白质原来仅仅可以通过从它们的天然源纯化产生。当前,有用来产生任何给定的蛋白质的多种供选择的表达系统,包括真细菌和真核宿主。对一个适当的表达系统的选择常常不仅取决于宿主细胞产生足够量的活性状态蛋白质的能力,而且在很大程度上受制于蛋白质的最终用途。
经常遇到的一个问题是给定的宿主细胞产生的或在培养基中的高水平的蛋白酶。已有人提出人们可以提供丧失了产生特异性蛋白酶解化合物能力的宿主生物体。例如,国际专利申请WO 90/00192描述了不能分泌酶活性天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌宿主;EP 574 347描述了缺失枯草杆菌蛋白酶-型丝氨酸蛋白酶的曲霉属宿主。
金属蛋白酶已经从许多真核源分离到。也已报道了从曲霉属菌株分离的中性金属蛋白酶,即,在中性pH时具有最佳活性的金属蛋白酶。中性金属蛋白酶被分成两组:NpI和NpII[Sekine,
农业生物化学,1972 36 207-216]。最近公开了来源于米曲霉的中性金属蛋白酶II cDNA的核苷酸序列[Tatsumi H,Murakami S,Tsuji RF,Ishida Y,Murakami K,Masaki A,Kawabe H,Arimura H,Nakano E和Motai H;
Mol.Gen.Genet.1991 22897-103]。从未公开过来源于米曲霉的中性金属蛋白酶I cDNA的核苷酸序列。
虽然金属蛋白酶已被报道,但从未描述过它们与降低从这些生物体所获产物的稳定性的关系。
发明概要
按照本发明,现已发现金属蛋白酶可以明显地降低从细胞获得的产物的稳定性。
因此,本发明提供了对异源蛋白质产物的表达有用的宿主细胞,为了表达明显降低水平的金属蛋白酶,该宿主细胞已经遗传修饰过。
另一方面,本发明提供了一种在宿主细胞中产生异源蛋白质产物的方法,该方法包括将编码所说蛋白质的核酸序列引入到所说的宿主细胞中,在适当的生长培养基中培养所述宿主细胞,并分离所说的异源蛋白质产物。
通过本发明的方法,金属蛋白酶产生的蛋白酶解作用被明显减小,由此改善了由所述方法获得的蛋白质的稳定性。此外,用本发明的方法获得的蛋白质可以以下列形式获得:前体蛋白(即酶原),杂合蛋白,作为原(pro)序列或原-前(pre-pro)序列或者以非成熟形式获得的蛋白质。
附图简要描述
参照附图进一步说明本发明,在附图中:
图1显示质粒pSO2的图谱,参见实施例2;
图2显示米曲霉菌株HowB101的构建,参见实施例2;
图3显示质粒pJaL335的构建,参见实施例2;
图4显示质粒pJaL399的构建,参见实施例2;
图5显示质粒pJaL218的构建,参见实施例4;和
图6显示质粒pToC56的图谱,参见实施例5。
发明详述
宿主细胞
本发明提供了对表达异源蛋白质有用的宿主细胞,与亲本细胞比较,为了表达明显降低水平的金属蛋白酶,该宿主细胞已经遗传修饰过。
所述亲本细胞是所说宿主细胞的来源。它可以是野生型细胞。此外,除在金属蛋白酶水平上降低之外,它可以在另一方面被遗传改变。
为了产生所需蛋白质,本发明的宿主细胞显然必须拥有表达所需产物所必需的结构基因区(即包含编码核苷酸序列的区)和调节基因区(即包含对例如转录、翻译和终止所必需的核苷酸序列的区)。这样的结构和调节区的性质极大地取决于所述的产物和宿主细胞。本发明的宿主细胞的遗传设计可以由本领域技术人员用转化或转染宿主细胞的标准重组DNA技术[参见例如Sambrook等,
分子克隆,冷泉港,NY,1989]完成。
优选地,所述宿主细胞通过用本领域已知的方法引入适当的克隆载体(即质粒或载体)修饰,所述克隆载体包含编码所需产物的DNA片段。该克隆载体可以作为自主复制质粒引入到宿主细胞中,或者以整合进染色体的方式引入到宿主细胞中。优选的克隆载体包含一个或多个有效连接到一个或多个调节区上的结构区。
所述结构区是拥有编码所需产物的核苷酸序列的区。所述调节区包括包含转录和翻译控制序列的启动子区,包含终止信号的终止子区和聚腺苷酸化区。启动子(即在选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列)可以是来自编码胞外或胞内蛋白质的基因的一种,所述蛋白质优选的是酶,如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶、木聚糖酶、氧化还原酶、果胶酶、角质酶或糖酵解酶。在真菌宿主细胞中转录的合适的启动子的例子是来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、黑曲霉乙酰胺酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸酶异构酶、Rhizopus meihei天冬氨酸蛋白酶和Rhizopus meihei脂酶之基因的启动子。优选的是米曲霉TAKA-淀粉酶和泡盛曲霉gluA启动子。
克隆载体也可以包括一个选择性标记,例如其产物补充宿主细胞的缺陷的一种基因,或赋予抗生素(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素)抗性的一种基因。曲霉属选择性标记的例子包括amdS,pyrG、argB、niaD和sC,产生潮霉素抗性的标记。优选的用于曲霉属宿主细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记。一个经常使用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。此外,选择可以由共-转化完成。
分别连接本发明的DNA构建体、启动子、终止子和其它元件,以及将它们插入到包含复制所需信息的合适的克隆载体中的方法对本领域技术人员来说是已知的[参见例如Sambrook等,
分子克隆,冷泉港,NY,1989]。
本发明的宿主细胞可以是常规用于异源蛋白质表达的的任何宿主细胞。
优选地,本发明的宿主细胞是一种能够产生所需蛋白质的酵母或丝状真菌。具体地说,酵母细胞可以是酵母属的菌株,优选的是啤酒酵母。具体地说,丝状真菌可以是选自顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、Cocliobolus、内座壳属(Endothia)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、链孢霉属(Neurospora)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、Thermomyces、木霉属(Trichoderma)、柄孢壳属(Podospora)、Pyricularia或青霉属(Penicillium)的菌株。
在一个优选的实施方案中,所述丝状真菌是选自米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、Aspergillus foetus、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢(Fusariumsolani)、灰腐质霉(Humicola grisea)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、Rhizomucor meihel、Trichodermareesei和绿色木霉(Trichoderma viride)的菌株。
产物
所需最后产物(即由本发明的宿主细胞表达的异源蛋白质)可以是任何真细菌或真核蛋白质。
如本文所限定的,″异源蛋白质产物″是对宿主细胞非天然蛋白质,或已进行修饰改变了天然序列的天然蛋白质,或作为以下操作的结果其表达被定量改变的天然蛋白质,所说操作是表达天然蛋白质所需调节序列(如启动子、核糖体结合位点等)的操作或经重组DNA技术对宿主细胞进行的其它操作。
由于缺乏金属蛋白酶,由宿主细胞表达的异源蛋白质也可以是前体蛋白质(即酶原)、杂合蛋白、作为原序列或前原-序列或以非成熟形式获得的蛋白质。在一个更优选的实施方案中,所述产物是酶。
在一个特定的实施方案中,所述产物是真核酶,如胰岛素、生长激素、胰高血糖素、生长激素释放抑制因子、干扰素、PDGF、凝血因子VII、凝血因子VIII、尿激酶、EPO、凝乳酶、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂或血清白蛋白。
在另一个更优选的实施方案中,所述产物是真菌、酵母或细菌来源的酶。
优选的酶是糖苷酶,例如淀粉酶,特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、纤维素酶(EC3.2.1.4)、内-1,3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、内-1,4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.8)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、木聚糖-内-1,3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)、内-1,3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)、内-1,3-α-葡聚糖酶(EC 3.2.1.59)、内-1,2-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.71),内-1,6-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)、纤维素-1,4-β-纤维二糖苷酶(EC3.2.1.91,也称作纤维二糖水解酶)。
在另一个优选的实施方案中,所述酶是脂解酶,特别是脂酶、酯酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
在第三个优选的实施方案中,所述酶是肌醇六磷酸酶,特别是3-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8)或6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26)。
在第四个优选的实施方案中,所述酶是蛋白酶。
在第五个优选的实施方案中,所述酶是氧化还原酶(如过氧物酶或漆酶)、果胶酶或角质酶。
优选的杂合多肽是凝乳酶原和原胰蛋白酶类蛋白酶。
金属蛋白酶
在本发明中,所述金属蛋白酶是包含一个催化锌金属中心的蛋白酶,该中心参与肽骨架的水解。活性锌中心区别这些蛋白酶和需钙蛋白酶(其活性依赖于钙的存在)。蛋白酶作为金属蛋白酶的证据是除去锌中心伴随着蛋白酶解活性的丧失。所述锌中心可以用1,10-菲咯啉(1mM)除去。在用Zn2+(0.1-100μM)滴定后,蛋白水解活性恢复。
在一个优选的实施方案中,在本发明中所述的金属蛋白酶是镰孢属金属蛋白酶,优选的是尖镰孢金属蛋白酶。在大多数优选的实施方案中,金属蛋白酶是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其同源序列的尖镰孢p45金属蛋白酶。
在另一个优选的实施方案中,本发明所述的金属蛋白酶是中性金属蛋白酶,其是在中性pH区(即在pH 6-8的范围内,优选的在pH 6.5-7.5(约7)的范围内)具有最佳蛋白水解活性的金属蛋白酶。
更具体地说,本发明所述的金属蛋白酶是NpI或NpII组的中性曲霉属金属蛋白酶。
在一个优选的实施方案中,所述金属蛋白酶是米曲霉中性金属蛋白酶I(NpI),该蛋白酶由包含SEQ ID NO:4所示的部分核苷酸序列或其同源序列之cDNA序列编码。
同源性程度可以以表明第一序列与第二序列差别的两种序列之间的相同性程度确定。用计算机程序通过本领域已知的方法(例如,通过比较50bp的连续序列)可以合适地确定同源性。如本文所限定的,由同源cDNA序列编码的蛋白质显示出与所述的序列至少70%的同源性,优选的超过80%的同源性,更优选的超过90%的同源性,最优选的超过95%的同源性的同源性程度。
编码金属蛋白酶的基因可以按照标准技术[参见例如Sambrook等,
分 子克隆,冷泉港,NY,1989]通过筛选鉴别,该鉴别经利用合成寡核苷酸探针杂交编码全部或部分金属蛋白酶的核酸序列,所述探针可以基于cDNA序列(例如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列)或基于金属蛋白酶的氨基酸序列制备。
遗传修饰
为了表达明显降低水平的金属蛋白酶,经遗传修饰的本发明的宿主细胞可以采用本领域技术人员已知的重组DNA技术进行修饰。在金属蛋白酶的产生中起作用的基因序列可以被灭活或完全除去。
在一个特定的实施方案中,本发明的宿主细胞是在编码金属蛋白酶的结构或调节区经遗传修饰过的一种。已知的和有用的技术包括但不限于特异性或随机诱变;PCR产生的诱变;定点DNA缺失、插入和/或取代;基因破裂或基因置换技术;反义技术或它们的组合。
诱变可以采用一种合适的物理或化学诱变剂进行。适于本发明的目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲烷磺酸乙酯、亚硫酸氢钠、蚁酸和核苷酸类似物。当使用这些诱变剂时,诱变通常经过在适于所述诱变的合适的条件下在选择的诱变剂存在时培养待诱变的细胞进行,然后选择金属蛋白酶产量明显降低的突变细胞。
修饰也可以通过引入、取代或除去金属蛋白酶编码序列中或者其转录或翻译所需的调节元件中的一个或多个核苷酸来完成。可以例如插入或除去核苷酸,以产生终止密码子的引入、起始密码子的除去或开放读框的改变。可以按照本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变完成结构序列或调节元件的修饰或灭活。尽管从原理上说,可以在体内(即直接在携带金属蛋白酶基因的细胞上)完成修饰,但目前优选在体外进行。
一种方便的灭活或降低所选宿主细胞的金属蛋白酶产生能力的方法基于基因中断原理。这一方法包括使用相应于需要消除的内源基因或基因片段的DNA序列。将所说DNA序列体外突变成缺陷基因,并转化进宿主细胞中。经同源重组,缺陷基因取代所说内源基因或基因片段。最好是缺陷基因或基因片段编码可用于选择转化子(其中编码所说金属蛋白酶的基因已被修饰或消除)的标记。
另外,可以经使用已有的反义技术用互补于金属蛋白酶编码序列(例如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列)的核苷酸序列进行DNA序列的修饰或灭活。
由于遗传修饰,本发明的宿主细胞表达明显降低水平的金属蛋白酶。在一个优选的实施方案中,由宿主细胞表达的金属蛋白酶的水平降低约50%以上,优选的约85%以上,更优选的约90%以上,最优选的约95%以上。在一个最优选的实施方案中,由宿主细胞表达的产物基本上没有任何金属蛋白酶活性。
产生蛋白质的方法
在另一方面,本发明提供了产生蛋白质(即多肽和/或蛋白质)的方法,该方法包括在合适的生长培养基中培养本发明的宿主细胞,接着回收所需产物。
通过本发明的方法,金属蛋白酶的蛋白酶解作用被明显减小,由此改善了所获得的产物的稳定性。此外,由于缺乏金属蛋白酶,由宿主细胞表达的蛋白质可以以下列形式获得:前体蛋白(即酶原),杂合蛋白,作为原序列或前原-序列或者以非成熟形式获得的蛋白质。
用于培养的培养液或培养基可以是任何适于培养所说宿主细胞的常规培养基,并且可以根据本领域的原理组成。培养基优选地包含碳和氮源和其它无机盐。合适的培养基(例如,基本或复合培养基)可从商业供给者获得,或者可以按照出版的配方(例如美国典型培养物保藏中心菌种目录)制备。
在培养之后,用从培养液中分离和纯化蛋白质的常规方法回收蛋白质。众所周知的纯化方法包括经离心或过滤从培养物分离细胞,借助盐(如硫酸铵)沉淀培养物的蛋白质组份以及色谱方法如离子交换色谱、凝胶过滤色谱和亲和色谱法等等。
实施例
参照以下实施例进一步说明本发明,无意用所述实施例以任何方式限制所要求的本发明的范围。
材料和方法
菌株
米曲霉IFO 4177,可从大阪发酵研究所,17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-Ku,大阪,日本获得。
尖镰孢DSM 2672,根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约于1983年6月6日保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM),Mascheroder Weg 1b,DE-3300 Braunschweig,德国。
大肠杆菌DH5α,Hanahan D,分子生物学杂志,1983 166 557。
基因
NpI,该基因编码中性金属蛋白酶I。
NpII,该基因编码中性金属蛋白酶II。
pyrG:该基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶,该酶参与尿苷的生物合成。
质粒
pUC118;Yanish-Perron等,1985基因33 103。
pJaL389;从粘粒3E8构建该质粒在实施例1中描述。
pSO2;该质粒的构建在实施例2中描述。
pJers4;pSO2的亚克隆。
pJaL335;从pSO2构建该质粒在实施例2中描述。
pSO5;从pSO2构建该质粒在实施例2中描述
pJaL198;从pJaL198构建该质粒在实施例3中描述。
pJa1218;从pJa1218构建该质粒在实施例4中描述。
p3SR2;Kelly JM和Hynes MJ,EMBO杂志1985 4 475-479。
pToC90;p3SR2的亚克隆。
pToC56;该质粒的构建在EP 238,023 B中描述。
pToC65;该质粒的构建在EP 531 372 B中描述。
pCRTMII;可从Invitrogen公司(San Diego,CA,美国)获得。
实施例1
克隆米曲霉中性金属蛋白酶I(NpI)
构建米曲霉粘粒文库
基本上按照″SuperCosl粘粒载体试剂盒″供给者(Stratagene)的说明构建所述文库。
从用标准方法[参见例如Christensen等,
生物技术1989 6 1419-1422]制备的原生质体制备米曲霉IFO 4177基因组DNA。在分离原生质体后,通过在LabofugeTMT(Heto)中2500rpm下离心5分钟使其沉淀,如Supercos1粘粒载体试剂盒手册中的描述,将该离心沉淀悬浮在DNA制剂其余部分10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100μg/ml蛋白酶TMK和0.5%SDS中。
采用Biorad的CHEF-凝胶装置经电泳分析基因组DNA的大小。用10-50秒脉冲在200伏特下在1%琼脂糖凝胶上电泳20小时。凝胶由溴化乙锭染色并拍照。DNA的大小为50-100kb。DNA用Sau3A部分限制性消化。用相同的方法测定时,限制性消化的DNA的大小是20-50kb。
按照供给者的手册制备CsCl梯度分离的SuperCosl载体,即进行连接和包装。在文库滴定之后,将一种连接和包装的所有包装混合物转染进宿主细胞XL1-Blue MR中,并平板接种到50μg/ml氨苄青霉素LB平板上。获得约3800个菌落。10个菌落的粘粒制剂显示它们均具有所期待大小的插入物。收集单个菌落,在具有100μl LB(100μl/ml氨苄青霉素)的微滴板孔中培养,并于37℃培养过夜。将100μl 50%甘油添加到各孔中。将整个文库在-80℃冷冻。总共贮存3822个菌落。这代表米曲霉基因组约4.4倍。
克隆尖镰孢p45金属蛋白酶基因
纯化
在9000rpm下离心尖镰孢DSM 2672培养液10分钟,经0.45μm滤器过滤上清液。在10ml Amlcon池(PM 10膜)和Centriprep-O(Amlcon)上将200ml滤液浓缩至10ml。把5ml滤液稀释成100ml,用乙酸调节pH至5,并在下列缓冲溶液中通过1ml Mono-S柱:0.1M硼酸盐、10mMDMG、2mM氯化钙,pH 5.2,70分钟内从0M到0.5M氯化钠的梯度。在上述鉴别缓冲液中以1ml/分钟的流速洗涤10分钟之后,收集1.5ml组份,并在Centricon-10(Amlcon)上浓缩。
在下列溶液中进行使用Superose-12(HR 10/30,Pharmacia)的凝胶过滤:0.1M硼酸盐、10mM DMG、2mM CaCl2,pH 6.5,流速0.4ml/分钟。收集0.4ml组份,注射200μl样品。
蛋白酶测定
在25℃于0.1M TRIS、2mM CaCl2,pH7(更低的pH时,使用100mM硼酸盐、10mM DMG、2mM CaCl2)中预培养30-60分钟后,测定从菌株尖镰孢DSM 2672原-胰蛋白酶样蛋白酶释放胰蛋白酶活性的金属蛋白酶活性。胰蛋白酶活性在微滴板中测量,将100μl样品与底物100μl混合(贮存液:87mg/ml在DMSO中的L-BAPNA(西格马),用缓冲液稀释50倍),从Molecular Devices上用Thermomax读数器在405nm测量吸收值。
SDS-PAGE和电印迹到PVDF上
按照制造者的说明进行SDS-PAGE(10-27%,Novex)电泳。在添加样品缓冲液之前将要电泳的样品用PMSF预温育。用Novex印迹模在3mMNa2CO3、10mM NaHCO3、20%MeOH,pH 9.9中于30V下2小时电印迹到预-印迹膜(应用生物系统)上。按照应用生物系统的描述染色预-印迹膜。
IEF-涂盖
在Ampholine FAG-平板(Pharmacia)上,pH3.5至9.5下进行等电聚焦(IEF),按照制造者的说明染色。将要涂盖的凝胶首先在0.1M TRIS、2mM CaCl2,pH 8.1中平衡15分钟,然后添加有300μl L-BAPNA(西格马)贮存液和500μl原-胰蛋白酶样尖镰孢DSM 2672蛋白酶(约0.25毫克/毫升)的10ml 1%琼脂糖,0.1M TRIS、2mM CaCl2,pH 8.1涂盖,。
氨基酸分析和氨基酸测序
利用MDS-2000水解站(CEM)进行冻干样品的微波促进蒸发相水解。包含1%酚(清除剂)的6N HCl用于产生蒸发相。水解时间是在70psi(约148℃)下20分钟。将水解样品冻干并再溶解到20μl 500pmol/μl肌氨酸和正缬氨酸中作为内标。按照制造者的说明用Hewlett-Packard的AminoQuant进行分析。注射1μl样品。按照制造者的说明用应用生物系统的476A蛋白质测序仪进行氨基酸测序。将预混缓冲液用于在线式HPLC。
从尖镰孢培养液纯化p45
从浓缩的和过滤的发酵培养液经阳离子-交换色谱(Mono-S)和接下来的在Superose 12上的凝胶过滤纯化p45金属蛋白酶。通过检查从原胰蛋白酶样尖镰孢DSM 2672蛋白酶释放胰蛋白酶样活性的金属蛋白酶活性选择Mono-S组份。
用与Mono-S组份相同的试验方法鉴别来自于Superose-12柱的包含金属蛋白酶的组份。纯化的金属蛋白酶在SDS-PAGE上显示45kDa的单一带。在IEF(pH3.5-9.5)中分别在pI8.4和8.7观察到金属蛋白酶的两个异型。
氨基酸分析结果表明这一金属蛋白酶(p45)具有SEQ ID NO:3所示的N-末端氨基酸序列。
克隆尖镰孢p45金属蛋白酶基因和确定重组p54的特征
首先经PCR克隆尖镰孢p45金属蛋白酶基因的一部分。利用N-末端蛋白质序列(SEQ ID NO:3)设计一引物,并且从金属蛋白酶内部肽序列(SEQ ID NO:1的残基483-515)设计一逆向引物。用这些DNA引物和从尖镰孢分离的基因组DNA进行PCR。基因组DNA的分离如下。
将约15g湿重尖镰孢在MY50培养基(50g/l麦芽糖糊精、2g/l硫酸镁、10g/l磷酸二氢钾、2g/l柠檬酸、10g/l酵母抽提物、2g/l尿素、2g/l硫酸钾、0.5ml微量金属溶液,以5N NaOH调pH至6)中于30℃生长。将菌丝体悬浮在16ml TE中(10mM TRIS、1mM EDTA,pH 8.0),分装进两根试管中,将12g 0.45-0.52mm玻璃珠(Thomas Scientific)加到每根试管中。以30秒间隔将样品交替涡旋和冰冻,直到出现明显的粘性下降,将样品另外额外地涡旋两个30秒间隔。将2.5ml 20%SDS添加进每种样品中。把样品倒置混合,在室温温育10分钟,并再一次混合。于室温在3.5K下离心样品8分钟。将上清液合并到50ml聚丙烯试管中。用以苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)(P/C/I提取的)平衡过的等体积的TE抽提样品,然后于4℃在10,000rpm下离心10分钟。在25℃用300μl 10毫克/毫升蛋白酶K处理上清液30分钟。如以上所述经P/C/I抽提DNA,乙醇沉淀,并且溶解在5ml TE中。将样品用150μl 10mg/l RNA酶A在65℃处理15分钟,25℃ 15分钟。用蛋白酶K(100μl 10mg/ml 25℃下1.5小时)再次处理该样品,P/C/I抽提两次,并用乙醇沉淀。将DNA收集到弯曲的巴氏移液管中,并转移到5ml 80%的乙醇中。将样品在10,000rpm离心3分钟。简短干燥DNA沉淀,然后溶解在1ml TE中。
用PCR克隆尖镰孢p45基因的一部分。使50-100ng尖镰孢基因组DNA与在1×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)中的约100pmol的各合成PCR引物DNA以及浓度为100μM的dGTP、dATP、dTTP和dCTP在50μl体积中混合。添加Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)1-5单位,PCR温育是在95℃ 5分钟,然后是35个循环[95℃,30秒钟,50℃ 1分钟,72℃ 1分钟]。
PCR反应产生两个长度约1.0和1.3kb的DNA片段,经凝胶电泳分离这些片段,纯化,克隆进大肠杆菌复制质粒中,用分子生物学领域已知的标准方法测序。将DNA翻译产物与直接蛋白质测序获得的氨基酸序列比较发现1.0kb DNA片段包含尖镰孢p45基因序列。因此,将这一1.0kb PCR产生的DNA片段用作探针从尖镰孢基因组DNA文库克隆整个金属蛋白酶基因。
使用例如由Sambrook等[参见例如,Sambrook等,
分子克隆,冷泉港,NY,1989]描述的方法从尖镰孢基因组DNA制备λ噬菌体中的基因组文库。总共50μg基因组DNA在25℃于200μl溶液中消化1分钟,所述溶液包含10mM TRIS(pH 7.5),50mM NaCl,7mM MgCl2,7mM 2-巯基乙醇和4单位限制性内切酶Sau3A。用凝胶电泳分离部分消化的分子大小为10-20kb的DNA,接着电洗脱进透析膜,并用Elutip-D柱(Schleicher和Schuell)浓缩。将1μg EMBL4噬菌体λ臂(其已用限制性内切酶BamH1切割,并用磷酸酶(Clonetech)处理)在标准条件下于25μl体积中与300-400μg Sau3A切割的基因组DNA连接[参见如,Sambrook等,
分子克隆,冷泉港,NY,1989]。用市售的试剂盒(Gigapack Gold II Stratagene)按制造商的说明从这一连接混合物制备λ噬菌体。用标准技术[参见,Sambrook等,
分子克隆,冷泉港,NY,1989]进行约18,000个重组λ噬菌体的平板涂布和膜转移(至N+滤膜上,Amersham)。按照制造者的说明处理滤膜:用Genious试剂盒(Boehringer Mannheim)杂交以检测非放射性的核酸。用作p45探针的DNA是由如上所述获得的1.0kb PCR片段。使用dioxigenin(DIG)标记试剂盒和制造者提供的说明经PCR掺入DIG标记该探针。将15ng 1.0kb p45片段在1×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)中与N-末端引物和内部逆向引物各100pmol以及1-5单位Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)以80μl总体积混合。反应条件是95℃ 3分钟,然后是35个循环[95℃ 30秒;50℃ 1分钟;和72℃ 1分钟],和72℃ 5分钟。按照Genious试剂盒制造者提供的说明,采用DIG标记的探针和洗涤条件进行滤膜杂交。
按照制造者(Boehringer Mannheim)的描述用碱性磷酸酶-结合的抗dioxigenin抗体(用Lumlphos 530可视化)检测杂交噬菌体。用QiagenλMidi试剂盒从阳性λ克隆(QIAGEN Inc.)制备DNA制剂。以限制酶EcoRI消化一种制剂的DNA,并将一6.3kb片段亚克隆进质粒pUC118中,对这一亚克隆部分DNA的序列分析鉴别了p45基因的整个编码区,参见SEQID NO:1。
克隆p45金属蛋白酶cDNA
按照作了以下修改的以前出版的方案[Chirgwin等,生物化学,198818 5294-5299;Aviv和Leder,美国科学院学报,1972;69 1408-1412;Sambrook等,
分子克隆,冷泉港,NY,1989]从尖镰孢制备总RNA和poly-A RNA。
具体地说,将菌丝体在液态氮中研制成细粉,然后在裂解缓冲液中于室温下搅拌30分钟再悬浮,所述裂解缓冲液包含4M硫氰酸胍、0.5%月桂基肌氨酸钠、25mM柠檬酸钠和0.1M 2-巯基乙醇(pH 7.0)。低速(5000rpm 30分钟)离心除去细胞碎片。典型地,用从Boehringer Mannheim获得的oligo(dT)纤维素分离poly-A RNA组份。
利用发夹/RNA酶H方法[参见例如,Sambrook等,
分子克隆,冷泉港,NY,1989]将poly-A RNA用来产生cDNA。具体地说,在5μl水中的5μg poly-A RNA在70℃加热,然后置于冰上。制备50μl总反应混合物,其包含poly-A RNA、50mM TRIS(pH 8.3)、75mM KCl,3mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、dGTP,dATP,dTTP和dCTP各1mM、40单位RNasin、10μg寡(dT12-18)引物和1000单位SuperScriptII RNA酶H-逆转录酶(Bethesda研究室)。将混合物在45℃温育一小时。然后添加30μl 10mM TRIS(pH 7.5)、1mM EDTA、40g糖原载体(Boehringer Mannheim)、0.2体积10M乙酸铵和2.5体积乙醇以沉淀核酸。在离心之后,将沉淀再悬浮于20mM TRIS(pH 7.4)、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM硫酸铵、16μM βNAD+、dGTP,dATP,dTTP和dCTP各100μM、44单位大肠杆菌DNA聚合酶I、6.25单位RNA酶H和10.5单位DNA连接酶中。在这种溶液中于16℃下进行第二链DNA合成3小时。由乙醇沉淀浓缩DNA,于30℃下将沉淀再悬浮于30μl 30mM醋酸钠(pH 4.6)、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM二硫苏糖醇、2%甘油和30单位Mung大豆核酸酶(Bethesda研究室)中30分钟。用10mM TRIS(pH 7.5)、1mM EDTA中和DNA溶液,酚提取,和乙醇沉淀。沉淀于25℃在50μl缓冲液(20mM TRIS-醋酸盐(pH 7.9)、10mM醋酸镁、50mM醋酸钾、1mM二硫苏糖醇、dGTP,dATP,dTTP和dCTP各0.5mM)中用7.5单位T4聚合酶(Invitrogen)处理15分钟。经添加EDTA至20mM终止反应,随后酚抽取和乙醇沉淀。这一方法得到平端的双链cDNA,它适于连接DNA接头和克隆到任何载体中。
在琼脂糖凝胶上大小分级分离具有EcoRI接头的cDNA以获得分子大小为0.7kb或更大的cDNA。经电洗脱从凝胶上回收cDNA,并经酚抽取和乙醇沉淀纯化。将大小分级分离的cDNA用于构建λcDNA文库。把该cDNA克隆进λZIPLOX臂(Gibco BRL)。以467bp dioxigenin标记的片段为探针(336-803bp基因组克隆)用以前描述的噬斑转移和DNA杂交技术鉴别全长cDNA克隆。如制造者(菌株和质粒来源于Bibco BRL)的描述回收质粒pZL1中的全长cDNA。
将全长cDNA测序,并且与基因组DNA序列比较。基因组DNA长度为2052bp,包含三个内含子。前原p45金属蛋白酶的预测的编码区由推定的18个氨基酸的信号序列、226个氨基酸的原区(pro-region)和388个氨基酸的成熟区组成,如SEQ ID NO:1所示。
制备尖镰孢p45金属蛋白酶探针
选择来源于上述cDNA文库的一个克隆,称为pDM115。质粒pDM115包含尖镰孢cDNA的1.76kb片段,其编码部分p45基因。用SaII消化该质粒,在1%琼脂糖凝胶上分离形成的片段,切去1.5kb片段并洗脱DNA。经随机引物标记法用32-P-dATP标记这一片段,并用Southern或菌落转移探测。
用尖镰孢p45探针筛选米曲霉文库
用适配于半微滴盘的具有6×8针的多针(multipin)装置将分别冷冻的文库菌落接种到LB-平板(100μg/ml氨苄青霉素)上,使平板包含文库中的所有克隆的菌落。将平板在37℃培养过夜。将切成培养皿大小的已灭菌的Whatman 540滤膜放置在菌落上,再于37℃培养两小时。将滤膜转移到含有200μg/ml氯霉素的LB平板上,在37℃培养平板过夜。第二天洗涤滤膜:0.5M NaOH洗涤两次,每次5分钟;0.5M TRIS-HCl(pH 7.4)洗涤两次,每次5分钟;2×SCC两次,每次5分钟。滤膜用乙醇润湿并风干。
将所述滤膜与包含尖镰孢蛋白酶基因的pDM115的1.5kb 32P标记的DNA片段杂交。杂交在65℃下在下列溶液中进行16小时:10×Denhart、5×SSC、0.02M EDTA、1%SDS、0.15毫克/毫升polyA和0.05毫克/毫升酵母tRNA。在杂交之后,于65℃将滤膜在2×SSC、0.1% SDS中洗涤两次,并置于X光胶片上。三个菌落显示出与探针杂交,即3E8、3C1和2A5,名称指出它们在文库中的位置。
确定粘粒克隆的特征
限制酶切分析证实三个粘粒克隆中的两个(3E8和3C1)包含插入物,该插入物来源于米曲霉基因组的相同区。
用EcoRI消化3μg粘粒DNA,经琼脂糖凝胶电泳分级分离。将DNA转移到Immobilan-N膜上,与pDM115的1.5kb放射性标记的探针杂交。该探针杂交到两个粘粒克隆的4kb EcoRI片段上。选择4.0kb EcoRI片段供进一步分析。
将NpI克隆进入质粒pToC65并测序
按照制造者的说明用SacI消化质粒pToC65,用细菌碱性磷酸酶处理以除去5’-磷酸基。然后用酚提取和沉淀。
用凝胶电泳分离包含米曲霉NpI基因的粘粒克隆3E8的5.5kb SacI片段,并纯化。
将两个片段混合在一起,并连接。在转化大肠杆菌后,通过少量质粒制备物的限制性内切酶消化鉴别携带正确质粒的菌落。该质粒称为pJaL389。
将这一亚克隆的DNA序列分析结果与其它已知的NpI基因序列比较,以证实所述亚克隆包含米曲霉NpI基因的编码区。
实施例2
米曲霉中性金属蛋白酶NpI的基因组破裂
为了产生特异性NpI生产缺陷的米曲霉菌株,使用了由Miller等,分子细胞生物学,1985 5 1714-1721所描述的基因置换策略。以下详细描述这些实验。
克隆米曲霉pyrG基因
通过与黑曲霉pyrG基因[W.van Hartingsveldt等;Mol.Gen.Genet1987 206 71-75]的交叉杂交克隆米曲霉pyrG基因。在低严格度下用黑曲霉pyrG基因的1kb DNA片段探测SauIII A部分消化米曲霉IFO 4177DNA的λ文库。将阳性克隆的DNA亚克隆进pUC118载体。通过黑曲霉pyrG-突变体的互补作用,显示出形成的质粒pSO2包含pyrG基因,参见图1。
构建米曲霉pyrG阴性菌株
从质粒pSO2构建在各末端包含约1kb pyrG侧翼序列的质粒pSO5,它是一种pyrG缺失。用这一构建体转化米曲霉菌株IFO 4177,通过5-氟-乳清酸抗性(pyrG突变体的表型特征)选择转化子。
通过Southern分析显示一个转化子HowB101在pyrG基因座具有所期待的缺失。由于pyrG突变体,HowB101的生长需要尿苷。通过没有尿苷时生长能力的筛选,可用wt pyrG基因转化HowB101。
构建HowB101中涉及的步骤在图2中说明。
构建质粒pJaL335
为了扩增位于米曲霉pyrG基因5’端上游479个核苷酸上的431bp片段,制备以下两个寡核苷酸;
引物A:GGAGGAAGATCT
CTCTGGTACTCTTCGATCTC;SEQ IDNO:5;和引物B:
GGAGGAGAATTCAAGCTT
CTTCTACATCACAGTTTGAAAGC;SEQ ID NO:6划线部分相应于米曲霉pyrG基因序列。
引物5’末端用来促进克隆(引物A包含BgIII限制性内切核酸酶位点,引物B包含EcoRI和HindIII限制性内切核酸酶位点)。
在PCR反应中质粒pSO2用作模板。扩增在包含2.5单位Taq-聚合酶、100ng pSO2、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1.5mMMgCl2、250nM各dNTP和以上所述两种引物各10pmol的100μl体积中进行。
扩增在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中进行,包括94℃的3分钟的一个循环,其后为94℃的1分钟、55℃的30秒和72℃的1分钟的25个循环。PCR反应产生长度为430bp的一个DNA片段。用BgIII和EcoRI消化该片段,并经凝胶电泳分离。将其纯化并克隆进质粒pSO2的相应位点中。形成的质粒称为pJaL335。pJaL335的构建在图3中说明。
构建破裂质粒pJaL399
用BalI消化质粒pJaL389,用Klenow聚合酶处理以获得平端。凝胶电泳分离7.1kb片段,纯化。按照制造者的说明将这一DNA片段用细菌碱性磷酸酶处理以除去5’磷酸基,用酚提取并沉淀。
以HindIII消化质粒pJaL335,用Klenow聚合酶处理以获得平端。经凝胶电泳分离编码米曲霉pyrG基因的3.5kb片段,并纯化。
将两个片段混合在一起并连接。转化大肠杆菌后,携带正确质粒的菌落通过少量质粒制备物的限制性内切酶消化鉴别。pJaL399的构建在图4中说明。
pJaL399具有pToC65载体,其包含携带有SacI位点在其侧翼的NpI基因的片段,其中,中央1.1kb BalI片段已被编码米曲霉pyrG基因的3.5kb DNA片段替代。
转化米曲霉
15μg质粒pJaL399由SacI完全消化。消化的完全程度通过取样在凝胶上电泳检查,其余DNA用酚提取,沉淀并再悬浮于108,25μl无菌水中。
米曲霉HowB101宿主菌株由原生质体方法[Christensen等;1988生物技术1988 61419-1422]进行转化。典型地,使米曲霉菌丝体在富含营养物的培养液中生长。过滤从培养液分离菌丝体。将NovozymeTM(可从丹麦NovoNordisk A/S获得)添加到渗透稳定的缓冲液(如用磷酸钠缓冲到pH5.0的1.2M MgSO4)中的菌丝体中,于37℃在搅拌下将悬液温育60分钟。原生质体通过mira-cloth过滤除去菌丝体碎片。收获原生质体,并用STC(1.2M山梨醇、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH7.5))洗涤2次。最后,将原生质体再悬浮在200-1000μl STC中。
为了转化,将5μg DNA添加到100μl原生质体悬液中。添加200μlPEG溶液(60%PEG 4000、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH 7.5)),将混合物在室温下温育20分钟,收获原生质体并用1.2M山梨醇洗涤两次。最后将原生质体再悬浮在200μl 1.2M山梨醇中,涂布在选择平板(基本培养基+10g/l Bacto-琼脂(Difco))上,于37℃培养。在37℃生长3-4天后,稳定的转化子将出现旺盛的生长和产孢子菌落。
鉴别基因破裂
从稳定的菌落将单个孢子在新鲜的基本平板上划线培养,选择单菌落并再划线培养产生纯培养物。将这些用于接种10ml液态YPM培养基(1%酵母提取物、1%蛋白胨、2%麦芽糖)。在30℃振荡培养18小时后,将菌丝体收获到滤纸上。然后将菌丝体转移到2ml微量离心管中,并冻干。
在冻干之后,通过用研棒在管中将菌丝体研成细粉,从单独的菌丝体制备DNA。经涡旋将这一粉末再悬浮于0.5ml 50mM EDTA(pH 8.0)、0.2% SDS、1μl DEP中。在65℃温育20分钟后,添加0.1ml 5MKAc(pH6.5),混合溶液,在冰上放置5分钟。在20,000rpm下离心5分钟,从DNA溶液分离细胞碎片。0.4ml上清液用0.3ml异丙醇沉淀,在20,000rpm下离心10分钟。将DNA沉淀再溶解到100μl包含0.1毫克/毫升RNA酶A的无菌TE缓冲液中。
用BalI消化3μg各DNA,经琼脂糖凝胶电泳分级分离,将其转移到Immobilan-N膜上,使滤膜与5.5kb 32P标记的DNA SacI片段杂交,该片段来源于含NpI蛋白酶基因的pJaL389。包含携带有破裂NpI基因的菌株通过缺乏1.1kb BalI杂交片段以及其它两个侧翼片段的迁移改变来识别。
实施例3
克隆米曲霉中性金属蛋白酶II(NpII)
构建pJaL198
从已出版的cDNA核苷酸序列[Tatsuml等,
Mol.Gen.Genet.1991228 97-103]设计两个寡核苷酸,以便在PCR反应中扩增NpII基因的编码部分。
构建A引物
(CTAGGATCCAAGGCATTT
ATGCGTGTCACTACTCTC;SEQ ID NO:7)以便核苷酸序列的3’末端相应于NpII基因的N-末端部分(下划线),5’-末端促进克隆(包含BamHI限制性核酸内切酶位点)。
构建B引物(CTACTCGAG
TTAGCACTTGAGCTCGATAGC;SEQ ID NO:8)以便核苷酸序列的3’末端相应于NpII基因的C-末端部分(下划线),5’-末端促进克隆(包含XhoI限制性核酸内切酶位点)。
在PCR反应中,将米曲霉IFO 4177基因组DNA用作模板。扩增反应在包含2.5单位Taq-聚合酶、100ng米曲霉基因组DNA、50mMKCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1.5mM MgCl2、250nM各dNTP、以上所述的两种引物各100pM的100μl体积中进行。
扩增在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中进行,包括94℃的3分钟的一个循环,其后为94℃的1分钟、55℃的30秒和72℃的1分钟的25个循环。PCR反应产生长度为1.1kp的一个DNA片段。使用分子生物学领域已知的标准方法经凝胶电泳分离这一片段,将其纯化并克隆进载体pCRTMII(Invitrogen公司)并测序。形成的质粒称为pJaL198。
实施例4
NpII的基因组破裂
构建JaL121
为了产生特异性NpII生产缺陷的米曲霉菌株,使用了由Miller等,分子细胞生物学,1985 5 1714-1721所描述的基因置换策略。
克隆米曲霉pyrG基因
通过与黑曲霉pyrG基因[W.van Hartingsveldt等;Mol.Gen.Genet1987 206 71-75]的交叉杂交克隆米曲霉pyrG基因。在低严格度下用黑曲霉pyrG基因的1kb DNA片段探测SauIII A部分消化米曲霉IFO 4177DNA的λ文库。将阳性克隆的DNA亚克隆进pUC118载体。通过黑曲霉pyrG-突变体的互补作用,显示出形成的质粒pSO2包含pyrG基因,参见图1。
构建米曲霉pyrG阴性菌株
从质粒pSO2构建在各末端包含约1kb pyrG侧翼序列的质粒pSO5,它是一种pyrG缺失质粒。用这一构建体转化米曲霉菌株IFO 4177,通过5-氟-乳清酸抗性(pyrG突变体的表型特征)选择转化子。通过Southern分析显示一个转化子HowB101在pyrG基因座具有所期待的缺失。由于pyrG突变体,HowB101的生长需要尿苷。通过没有尿苷时生长能力的筛选可用wt pyrG基因转化HowB101。
构建HowB101中涉及的步骤在图2中说明。
构建破裂质粒pJaL218
用BstEII消化质粒pJaL198,用Klenow聚合酶处理以获得平端。凝胶电泳分离4.9kb片段,纯化。按照制造者的说明将这一DNA片段用细菌碱性磷酸酶处理以除去5’磷酸基,用酚提取并沉淀。
以HindIII消化质粒pJers4,用Klenow聚合酶处理以获得平端。经凝胶电泳分离编码米曲霉pyrG基因的1.8kb片段,并纯化。
将两个片段混合在一起并连接。转化大肠杆菌DH5α后,携带正确质粒的菌落通过少量质粒制备物的限制性内切酶消化鉴别。pJaL218的构建在图5中说明。
pJaL218具有pCRTMII载体,其包含携带有EcoRI位点在其侧翼的NpII基因的片段,其中,中央BstEII片段已被编码米曲霉pyrG基因的1.8kb DNA片段替代。
转化米曲霉
15μg质粒pJaL218由EcoRI完全消化。消化的完全程度通过取样在凝胶上电泳检查,其余DNA用酚提取,沉淀并再悬浮于10μl无菌水中。
米曲霉HowB101宿主菌株由原生质体方法[Christensen等;1988生物技术1988 61419-1422]进行转化。典型地,使米曲霉菌丝体在富含营养物的培养液中生长。通过过滤从培养液分离菌丝体。将NovozymeTM(可从丹麦Novo Nordisk A/S获得)添加到渗透稳定的缓冲液,1.2M MgSO4,磷酸钠缓冲液(pH5.0)中的菌丝体中,于37℃在搅拌下将悬液温育60分钟。原生质体通过miracloth过滤除去菌丝体碎片。收获原生质体,并用STC(1.2M山梨醇、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH7.5))洗涤2次。最后,将原生质体再悬浮在200-1000μl STC中。
为了转化,将5μg DNA添加到100μl原生质体悬液中。添加200μlPEG溶液(60%PEG 4000、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH 7.5)),将混合物在室温下温育20分钟,收获原生质体并用1.2M山梨醇洗涤两次。最后将原生质体再悬浮在200μl 1.2M山梨醇中,涂布在选择平板(基本培养基+10g/l Bacto-琼脂(Difco))上,于37℃培养。
在37℃生长3-4天后,稳定的转化子将出现旺盛的生长和产孢子菌落。
鉴别基因破裂
从稳定的菌落将单个孢子在新鲜的基本平板上划线培养,选择单菌落并再划线培养产生纯培养物。
筛选33个转化子,以了解转化的DNA片段是否已经由PCR经双交叉整合进染色体的相应基因中。PCR反应和转化子的基因组DNA的制备如上所述进行。
所用的引物是CCCTTCTTTCCAAACCG(SEQ ID NO:9),其位于NpII基因编码区的5’,和pyrG-5’(GGGTGAGCCACTGCCTC;SEQ IDNO:10),其对pyrG基因是特异性的。有一个转化子产生期望的1.1kb PCR产物。
从Southern印迹,包括转化子和米曲霉基因组DNA以EcoRI消化,经凝胶电泳分级分离,转移到Immobilan-N膜上,用包含NpII基因的pJaL198的1.1kb EcoRI片段探测,发现野生型3.8kb带在转化子中转移至10kb带。这证明转化的DNA以多拷贝整合进NpII基因。该菌株称为JaL121。
实施例5
用JaL121产生凝乳酶
用质粒pToC56(参见图6)与pToC90共转化米曲霉菌株JaL121,pToC56质粒是哺乳动物凝乳酶的真菌表达质粒。质粒pToC56的构建在EP 98 993A中有描述。
在包含10mM乙酰胺的基本培养基生长选择转化子,就产生凝乳酶的能力对pToC56的存在进行筛选。于30℃在含有包含麦芽糖糊精、大豆粉和蛋白胨的培养基中使转化子在摇瓶中生长4天,使米曲霉IFO 4177中pToC56转化子与JaL121转化子同时生长。
在每天收集发酵液样品,用于SDS-Page和Western印迹法。然后将印迹膜与凝乳酶特异性兔抗体一起温育,接着与连有过氧物酶的羊兔抗体一起温育。
膜染色显示,发酵的第一和第二天,米曲霉IFO 4177转化子的上清液包含少量的凝乳酶,或其降解产物,此后,没有检测到胰凝乳蛋白酶。相反,JaL121转化子含至少10倍的全长凝乳酶。头两三天,上清液中的凝乳酶的量增加,然后保持恒定。
序列表
SEQ ID NO:1的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:2052个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA(基因组)
(vi)原始来源:
(A)有机体:尖镰孢
(B)菌株:DSM 2672
(C)单个分离物:p45
(ix)特征:
(A)名称/关键词:mat_肽
(B)位置:785..2049
(ix)特征:
(A)名称/关键词:sig_肽
(B)位置:55..784
(ix)特征:
(A)名称/关键词:内含子
(B)位置:364..415
(ix)特征:
(A)名称/关键词:内含子
(B)位置:802..854
(ix)特征:
(A)名称/关键词:内含子
(B)位置:1821..1868
(xi)序列描述:SEQ ID NO:1:
ATGCGTTTCT CCGACTCTCT CCTCCTCATC GGCCTATCCA GCCTCGCTGG TGCTCATCCC 60
AGCAGAAGGG CTCCTAATCC TTCACCGCTG AGCAAGCGTG GCCTCGACCT GGAAGCTTTT 120
AAGCTTCCTC CCATGGCCGA-GTACGTTCCT CAGGACGAGG TTCCTGATGA TGTCAGTGCC 180
AAGGTCGTCA CCAAGCGCGC TGATTACACC GAGACTGCCA AGGACTTGGT TAAGTCGACT 240
TTCCCCAAGG CTACTTTCCG TATGGTCACG GATCACTATG TTGGTAGCAA CGGAATTGCG 300
CATGTAAACT TTAAGCAGAC TGTCAACGGT ATTGATATCG ACAATGCTGA TTTCAACGTC 360
AACGTGGGTA TTCTCAAGAC TTTGGGGAGT TTGGAATGTG CTGACATGGA TACAGATTGG 420
CGCTGACGGC GAGGTCTTCT CCTACGGAAA CAGCTTCTAC GAGGGCAAGA TTCCCGGTCC 480
TCTTACCAAG CGTGACGAGA AAGACCCCGT CGACGCTCTC AAGGACACCG TTGATGTTCT 540
TTCTCTCCCC GTTGAGGCTG ACAAGGCCAA GGCTGAGAAG AAGAGCAAGA ACCACTACAC 600
CTTCACTGGT ACCAAGGGTA CCGTCAGCAA GCCCGAGGCT AAGCTCACCT ACCTTGTTGA 660
TGAGAACAAG GAGCTCAAGC TCACATGGAG AGTTGAGACT GATATTGTTG ACAACTGGCT 720
GTTGACTTAT GTCAATGCTG CCAAGACTGA TGAGGTTGTT GGTGTTGTTG ACTACGTCAA 780
TGAGGCGACA TACAAGGTCT AGTACGTATT TCCATAAATT GACGATTGGG AAAGAATTGA 840
CCGTTGTATT ATAGTCCTTG GGGTGTCAAT GATCCCTCCA AGGGATCTCG CTCCACTGTT 900
GAGAACCCCT GGAATCTCGC GGCCTCCGAG TTCACCTGGC TCAGCGACGG CTCAAACAAC 960
TACACCACAA CCCGCGGGAA CAATGGAATT GCACAGGTGA ATCCTTCAGG GGGCTCCACG 1020
TATCTGAACA ATTACCGTCC TGATAGCCCG TCGCTGAAGT TCGAGTATGA TTACTCCACC 1080
AGCACCACTA CACCCACCAC CTACCGCGAT GCTTCCATCG CTCAGCTTTT CTACACAGCC 1140
AACAAGTACC ACGACCTCCT CTACCTTCTT GGCTTTACCG AACAGGCTGG TAACTTCCAG 1200
ACCAACAACA ATGGCCAGGG TGGTGTAGGA AACGATATGG TTATCCTCAA CGCTCAGGAC 1260
GGAAGCGGCA CCAACAACGC CAACTTCGCT ACACCCGCTG ACGGTCAGCC CGGCCGCATG 1320
CGAATGTATC TCTGGACATA CAGCACACCC CAGCGTGACT GCAGTTTCGA CGCTGGCGTT 1380
GTTATCCACG AGTACACTCA CGGTCTCTCC AACCGTCTCA CAGGTGGCCC TGCCAACTCG 1440
GGTTGTCTTC CCGGTGGTGA ATCCGGTGGC ATGGGTGAGG GCTGGGGTGA CTTCATGGCT 1500
ACTGCCATTC ACATCCAATC CAAGGATACC CGCGCTAGCA ACAAGGTCAT GGGTGACTGG 1560
GTGTACAACA ACGCAGCTGG TATCCGAGCT TATCCTTACA GTACAAGCCT TACCACTAAC 1620
CCTTACACTT ACAAGAGTGT TAACAGTCTC AGTGGAGTCC ATGCTATTGG TACTTACTGG 1680
GCTACTGTTC TGTATGAGGT TATGTGGAAC CTCATCGACA AGCATGGGAA GAATGATGCG 1740
GATGAGCCCA AATTCAACAA CGGCGTTCCT ACAGATGGCA AATATCTTGC TATGAAGTTA 1800
GTAGTGGATG GCATGTCGCT_GTAAGTTGTC CCTTGGATTT GTAGGAGTTC TTATCTAACG 1860
TTTAATAGGC AACCTTGCAA CCCCAACATG GTCCAGGCCC GAGACGCCAT CATCGACGCC 1920
GACACCGCTC TTACCAAGGG AGCTAACAAG TGCGAGATCT GGAAGGGCTT TGCCAAGCGT 1980
GGTCTTGGAA CTGGTGCCAA GTATAGTGCT TCCAGCCGTA CTGAGAGCTT TGCTCTTCCT 2040
TCTGGATGTT AA 2052
SEQ ID NO:2的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:388个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:蛋白质
(vi)原始来源:
(A)有机体:尖镰孢
(B)菌株:DSM 2672
(C)单个分离物:p45
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:
Ala Thr Tyr Lys Val Tyr Pro Trp Gly Val Asn Asp Pro Ser Lys Gly
1 5 10 15
Ser Arg Ser Thr Val Glu Asn Pro Trp Asn Leu Ala Ala Ser Glu Phe
20 25 30
Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Thr Thr Thr Arg Gly Asn
35 40 45
Asn Gly Ile Ala Gln Val Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Leu Asn
50 55 60
Asn Tyr Arg Pro Asp Ser Pro Ser Leu Lys Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Ser Thr Thr Thr Pro Thr Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Ile Ala Gln
85 90 95
Leu Phe Tyr Thr Ala Asn Lys Tyr His Asp Leu Leu Tyr Leu Leu Gly
100 105 110
Phe Thr Glu Gln Ala Gly Asn Phe Gln Thr Asn Asn Asn Gly Gln Gly
115 120 125
Gly Val Gly Asn Asp Met Val Ile Leu Asn Ala Gln Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Thr Asn Asn Ala Asn Phe Ala Thr Pro Ala Asp Gly Gln Pro Gly Arg
145 150 155 160
Met Arg Met Tyr Leu Trp Thr Tyr Ser Thr Pro Gln Arg Asp Cys Ser
165 170 175
Phe Asp Ala Gly Val Val Ile His Glu Tyr Thr His Gly Leu Ser Asn
180 185 190
Arg Leu Thr Gly Gly Pro Ala Asn Ser Gly Cys Leu Pro Gly Gly Glu
195 200 205
Ser Gly Gly Met Gly Glu Gly Trp Gly Asp Phe Met Ala Thr Ala Ile
210 215 220
His Ile Gln Ser Lys Asp Thr Arg Ala Ser Asn Lys Val Met Gly Asp
225 230 235 240
Trp Val Tyr Asn Asn Ala Ala Gly Ile Arg Ala Tyr Pro Tyr Ser Thr
245 250 255
Ser Leu Thr Thr Asn Pro Tyr Thr Tyr Lys Ser Val Asn Ser Leu Ser
260 265 270
Gly Val His Ala Ile Gly Thr Tyr Trp Ala Thr Val Leu Tyr Glu Val
275 280 285
Met Trp Asn Leu Ile Asp Lys His Gly Lys Asn Asp Ala Asp Glu Pro
290 295 300
Lys Phe Asn Asn Gly Val pro Thr Asp Gly Lys Tyr Leu Ala Met Lys
305 310 315 320
Leu Val Val Asp Gly Met Ser Leu Gln Pro Cys Asn Pro Asn Met Val
325 330 335
Gln Ala Arg Asp Ala Ile Ile Asp Ala Asp Thr Ala Leu Thr Lys Gly
340 345 350
Ala Asn Lys Cys Glu Ile Trp Lys Gly Phe Ala Lys Arg Gly Leu Gly
355 360 365
Thr Gly Ala Lys Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Thr Glu Ser Phe Ala Leu
370 375 380
Pro Ser Gly Cys
385
SEQ ID NO:3的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:14个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(v)片段类型:N-末端
(vi)原始来源:
(A)有机体:尖镰孢
(B)菌株:DSM 2672
(C)单个分离物:p45
(xi)序列描述:SEQ ID NO:3:
Ala Thr Tyr Lys Val Tyr Pro Trp Gly Val Asn Asp Pro Ser
1 5 10
SEQ ID NO:4的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:747个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA(基因组)
(vi)原始来源:
(A)有机体:米曲霉
(B)菌株:IFO 4177
(C)单个分离物:NpI
(xi)序列描述:SEQ ID NO:4:
GCGTGGGGGA TGAATGACCC GACGGAGGGC CCTCGCACCG TCATCAGCGA TCCATGGGAT 60
TCGTCCGCAT CTGCGTTCAC CTGGATCAGT GACGGAGAAA ACAACTATAC CACAACTCGC 120
GGCAACAACG GTATCGCGCA GTCGAACCCT ACCGGTGGAT CGCAGTACTT GAAGAACTAC 180
CGGCCTGATA GCCCCGATTT GAAATTCCAA TACCCCTATT CGTTCAACGC CACACCCCCA 240
GAGTCCTATA TTGATGCGTC TATCACTCAG CTTTTCTACA CTGCCAACAC GTACCACGAT 300
CTACTCTACA CTCTGGGCTT CAACGAGGAG GCCGGTAATT TCCAGTACGA TAACAATGGA 360
AAAGGAGGTG CTGGAAACGA CTACGTGATC CTCAATGCTC AGGACGGTTC TGGCACCAAT 420
AACGCCAACT TCGCTACGCC CCCGGATGGA CAGCCCGGCC GCATGCGCAT GTACATATGG 480
ACCGAGTCCC AGCCTTACCG TGACGGCTCC TTCGAGGCTG GTATTGTGAT TCACGAGTAT 540
ACTCACGGCC GTATGTATCC CTTATGAACC CCAAGTAAGG CAGTCTGAAC TAACACCACG 600
GCACACAGTC TCTAACCGGC TCACTGGAGG ACCCGCTAAC TCTCGCTGTT TGAATGTCCT 660
TGAATCCGGC GGAATGGGTG AAGGTTGGGG AGACTTCATG GCCACGGTAT TTCGGCTCAA 720
GGTCGGCGAT TCTCACTTCG ATCCTTT 747
SEQ ID NO:5的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:32个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:5:
GGAGGAAGATCTCTCTGGTA CTCTTCGATCTC
SEQ ID NO:6的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:41个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:6:
GGAGGAGAAT TCAAGCTTCT TCTACATCAC AGTTTGAAAGC
SEQ ID NO:7的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:36个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:7:
CTAGGATCCA AGGCATTTAT GCGTGTCACT ACTCTC 36
SEQ ID NO:8的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:30个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:8:
CTACTCGAGT TAGCACTTGA GCTCGATAGC 30
SEQ ID NO:9的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:17个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:9:
CCCTTCTTTC CAAACCG 17
SEQ ID NO:10的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:17个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:10:
GGGTGAGCCA CTGCCTC 17
Claims (26)
1.一种用于表达异源蛋白质的丝状真菌宿主细胞,该宿主细胞已经被遗传修饰过,从而与亲本细胞相比,在相同条件下培养时,其表达在约pH6-8范围内具有最佳蛋白水解活性的中性金属蛋白酶的水平显著降低。
2.按照权利要求1的宿主细胞,其中生成由下述序列所编码的金属蛋白酶的量减少:
(1)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的编码序列或SEQ ID NO:4所示DNA序列的序列;或
(2)包含来自米曲霉的中性金属蛋白酶II cDNA序列的序列;或
(3)与(1)或(2)所述序列至少70%同源的序列。
3.按照权利要求2的宿主细胞,其中由与权利要求2中(1)或(2)所述序列至少80%同源的序列所编码的金属蛋白酶的量减少。
4.按照权利要求2的宿主细胞,其中由与权利要求2中(1)或(2)所述序列至少90%同源的序列所编码的金属蛋白酶的量减少。
5.按照权利要求2的宿主细胞,其中由与权利要求2中(1)或(2)所述序列至少95%同源的序列所编码的金属蛋白酶的量减少。
6.按照权利要求1的宿主细胞,该细胞是选自顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、Cocliobolus、内座壳属(Endothia)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、链孢霉属(Neurospora)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属)(Rhizopus)、Thermomyces、木霉属(Trichoderma)、柄孢壳属(Podospora)、Pyricularia或青霉属(Penicillium)的菌株。
7.按照权利要求6的宿主细胞,该细胞是选自米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、Aspergillus foetus、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、灰腐质霉(Humicola grisea)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、Rhizomucor meihei、Trichoderma reesei和绿色木霉(Trichoderma viride)的菌株。
8.按照任何权利要求1-7任一之宿主细胞,其中所说的金属蛋白酶是镰孢属金属蛋白酶。
9.按照权利要求8的宿主细胞,其中所说的金属蛋白酶是尖镰孢金属蛋白酶。
10.一种在权利要求1的宿主细胞中生产异源蛋白质产物的方法,该方法包括:
(a)将编码所说蛋白质产物的核酸序列引入到权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞中;
(b)在合适的生长培养基中培养步骤(a)的宿主细胞;和
(c)分离所说的异源蛋白质产物。
11.按照权利要求10的方法,其中所说的宿主细胞是选自由顶孢霉属、曲霉属、假丝酵母属、Cocliobolus、内座壳属、镰孢属、腐质霉属、链孢霉属、根毛霉属、根霉属、Thermomyces、木霉属、柄孢壳属、Pyricularia、和青霉属的菌株。
12.按照权利要求11的方法,其中所说的宿主细胞是选自米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、泡盛曲霉、海枣曲霉、日本曲霉、Aspergillus foetus、禾谷镰孢、尖镰孢、腐皮镰孢、灰腐质霉、粗糙链孢霉、产黄青霉、Rhizomucor meihei、Trichoderma reesei和绿色木霉的菌株。
13.按照权利要求10的方法,其中所说的金属蛋白酶是镰孢属金属蛋白酶。
14.按照权利要求13的方法,其中所说的金属蛋白酶是尖镰孢金属蛋白酶。
15.按照任何权利要求10的方法,其中所说的蛋白质产物是真核酶。
16.按照权利要求15的方法,其中所说的蛋白质产物是胰岛素、生长激素、胰高血糖素、生长激素释放抑制因子、干扰素、PDGF、凝血因子VII、凝血因子VIII、尿激酶、EPO、凝乳酶、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂或血清白蛋白。
17.按照权利要求10的方法,其中所说的蛋白质产物是真菌来源的蛋白质。
18.按照权利要求17的方法,其中所说的蛋白质产物是真菌酶。
19.按照权利要求18的方法,其中所说的蛋白质产物是淀粉分解酶,β-半乳糖苷酶,纤维素酶,脂解酶,木聚糖酶,蛋白酶,氧化还原酶,果胶酶或角质酶。
20.按照权利要求18的方法,其中所说的蛋白质产物是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、过氧化物酶或漆酶。
21.按照权利要求10的方法,其中所说的蛋白质产物是细菌蛋白质。
22.按照权利要求21的方法,其中所说的蛋白质产物是细菌酶。
23.按照权利要求22的方法,其中所说的蛋白质产物是淀粉分解酶,β-半乳糖苷酶,纤维素酶,脂解酶,木聚糖酶,蛋白酶,氧化还原酶,果胶酶或角质酶。
24.按照权利要求22的方法,其中所说的蛋白质产物是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、过氧物化酶或漆酶。
25.按照权利要求10的方法,其中所说的蛋白质产物是前体蛋白。
26.按照权利要求10的方法,其中所说的蛋白质产物是酶原、杂合蛋白、作为原序列或前-原序列或者以非成熟形式获得的蛋白质。
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