JP2006204304A - 低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現する宿主細胞及びその細胞をタンパク質の生産に用いる方法 - Google Patents
低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現する宿主細胞及びその細胞をタンパク質の生産に用いる方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006204304A JP2006204304A JP2006072788A JP2006072788A JP2006204304A JP 2006204304 A JP2006204304 A JP 2006204304A JP 2006072788 A JP2006072788 A JP 2006072788A JP 2006072788 A JP2006072788 A JP 2006072788A JP 2006204304 A JP2006204304 A JP 2006204304A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- metalloprotease
- host cell
- aspergillus
- enzyme
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 230000014616 translation Effects 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 91
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 69
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 56
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims description 56
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 claims description 28
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 23
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 22
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 21
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 10
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 claims description 10
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 claims description 9
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 8
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 6
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 5
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 claims description 5
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 5
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 claims description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 4
- -1 PDGF Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 4
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010005400 cutinase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 claims description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 claims description 3
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 claims description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 3
- 241001246273 Endothia Species 0.000 claims description 3
- 241000223198 Humicola Species 0.000 claims description 3
- 241000223199 Humicola grisea Species 0.000 claims description 3
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 claims description 3
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 claims description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 3
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims description 3
- 241000223257 Thermomyces Species 0.000 claims description 3
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 3
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- 241000221945 Podospora Species 0.000 claims description 2
- 241000231139 Pyricularia Species 0.000 claims description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 claims description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 2
- 241000228437 Cochliobolus Species 0.000 claims 2
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 claims 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 claims 2
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 claims 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 claims 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 claims 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims 1
- KPMKNHGAPDCYLP-UHFFFAOYSA-N nimustine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CNC(=O)N(CCCl)N=O)C(N)=N1 KPMKNHGAPDCYLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 41
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 31
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 102100034374 S-phase kinase-associated protein 2 Human genes 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 101150021792 NpI gene Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 101100523058 Aspergillus niger pyrG gene Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 3
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 3
- 108010080981 3-phytase Proteins 0.000 description 2
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 2
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 2
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 101150021650 gluA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 1
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010087427 Endo-1,3(4)-beta-Glucanase Proteins 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N Methoxyamine Chemical compound CON GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N N-α-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1=CC=CC=C1 DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000700141 Rotifera Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010045422 Xylan Endo-1,3-beta-Xylosidase Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010033095 endo-1,3-alpha-glucanase Proteins 0.000 description 1
- 108010045275 endo-1,6-beta-glucanase Proteins 0.000 description 1
- 108010091371 endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010092450 endoglucanase Z Proteins 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 108090000021 oryzin Proteins 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 238000003751 purification from natural source Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000003641 trioses Chemical class 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000007206 ypm medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】新規な宿主細胞及びタンパク質を生産する方法を提供する。
【解決手段】異種タンパク質の発現に有用な宿主細胞に関してその宿主細胞は有意に低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現するために遺伝的に修飾される。さらに、真菌、細菌由来のインスリン、成長ホルモン、酵素、等の異種タンパク質を生産する方法に関し、その方法は適当な増殖培地中で前記宿主細胞を培養させ、続いて所望のタンパク質を回収することを含むものである。宿主細胞としては、サッカロミセス属の株、特にサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。
【選択図】なし
【解決手段】異種タンパク質の発現に有用な宿主細胞に関してその宿主細胞は有意に低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現するために遺伝的に修飾される。さらに、真菌、細菌由来のインスリン、成長ホルモン、酵素、等の異種タンパク質を生産する方法に関し、その方法は適当な増殖培地中で前記宿主細胞を培養させ、続いて所望のタンパク質を回収することを含むものである。宿主細胞としては、サッカロミセス属の株、特にサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。
【選択図】なし
Description
本発明は新規な宿主細胞及びタンパク質の生産方法に関する。より詳細には、本発明は異種タンパク質の発現に有用な宿主細胞に関し、その宿主細胞は有意に低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現するために遺伝子的に修飾されている。さらに、本発明は異種タンパク質を生産する方法に関し、その方法は、適当な増殖培地中でその宿主細胞を培養し、続いて所望のタンパク質を回収することを含む。
異種タンパク質の発現における組換え宿主細胞の使用は最近、そうでなければ天然源からの精製によってのみ得ることができる、商業的に価値あるタンパク質の大量生産を非常に簡単にした。最近、そこから任意の与えられたタンパク質の産生について選択されるべき、真正細菌宿主及び真核宿主を包含する、様々な発現系の選択がある。適当な発現系の選択は、活性状態で十分な量のタンパク質を産生する宿主細胞の能力に依存するだけでなく、大部分はそのタンパク質の目的とする最終用途により左右されるだろう。
よく遭遇する1つの問題は、特定の宿主細胞中または培地中に産生される高レベルのタンパク質分解酵素である。特異的タンパク質分解化合物を産生する能力を剥奪された宿主生物体を供給することができることが示唆されてきた。たとえば、国際特許出願 WO 90/00192 号明細書は酵素的に活性なアスパルチンプロテイナーゼを排出することができる糸状菌宿主を記載し、ヨーロッパ特許第574347号明細書は、ズブチリシン型のセリンプロテアーゼを欠損するアスペルギルス属宿主を記載する。
メタロプロテアーゼは多数の真核源から単離されてきた。アスペルギルス属の株から単離された、中性メタロプロテアーゼ、すなわち、中性のpHで最適活性を有するメタロプロテアーゼも報告された。中性メタロプロテアーゼは、2つのグループ、すなわち、NpI及びNpIIに分類されてきた〔Sekine「Agric. Biol. Chem.」 36, p.207〜216(1972年)〕。最近、アスペルギルス・オリザエからの中性メタロプロテアーゼII cDNA のヌクレオチド配列が開示された〔 Tatsumi H, Murakami S, Tsuji R F, Ishida Y, Murakami K, Masaki A, Kawabe H, Arimura H, Nakano E及び Motai H「Mol. Gen. Genet.」 228, p.97〜103(1991年)〕。アスペルギルス・オリザエからの中性メタロプロテアーゼI cDNA のヌクレオチド配列は開示されたことがない。
メタロプロテアーゼは報告されたけれども、これらの生物体から得られた産物の安定性を低下させることに関するそれらの役割は報告されたことがない。
発明の概要
本発明により、いまや、驚くべきことにメタロプロテアーゼは細胞により得られた産物の安定性を有意に低下し得ることが見い出された。
本発明により、いまや、驚くべきことにメタロプロテアーゼは細胞により得られた産物の安定性を有意に低下し得ることが見い出された。
したがって、本発明は異種タンパク質産物の発現について有用な宿主細胞を提供するものであり、前記細胞は、親細胞に比較して、有意に低下されたレベルのメタロプロテアーゼを発現するために遺伝子的に修飾されている。
他の面では、本発明は本発明の宿主細胞中で異種タンパク質産物を生産する方法を提供し、その方法は、宿主細胞にそのタンパク質をコードする核酸配列を導入し、その宿主細胞を増殖培地中で培養し、異種タンパク質産物を単離することを含む。
本発明の方法により、メタロプロテアーゼから生ずるタンパク質分解作用が有意に低下され、それにより、その方法により得られたタンパク質の安定性が改善される。さらに、本発明の方法により得られたタンパク質は、前駆体タンパク質、すなわち、チモーゲン、ハイブリッドタンパク質、プロ配列もしくはプレプロ配列として得られたまたは未成熟形のタンパク質で得ることができる。
発明の詳細な説明
宿主細胞
本発明は異種タンパク質の発現に有用な宿主細胞を提供し、その細胞は親細胞に比較した時、有意に低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現させるために遺伝子的に修飾されている。
発明の詳細な説明
宿主細胞
本発明は異種タンパク質の発現に有用な宿主細胞を提供し、その細胞は親細胞に比較した時、有意に低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現させるために遺伝子的に修飾されている。
親細胞は前記宿主細胞の源である。それは野生型細胞でもよい。代りに、それは、メタロプロテアーゼレベルの減少の他に、他の面で遺伝子的に変更されていてもよい。
所望のタンパク質を産生するために、本発明の宿主細胞は明らかに所望の生成物の発現のために必要な構造遺伝子領域(すなわち、コードヌクレオチド配列を含んでいる領域)及び調節(すなわち、たとえば転写、翻訳及び終結に必要なヌクレオチドを含有している領域)遺伝子領域を保持しなくてはならない。上記構造及び調節領域の性質は、大きく当該産物及び宿主細胞に依存する。本発明の宿主細胞の遺伝子的設計は、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションについての標準的な組換え DNA技術を用いて、当業者により達成することができる〔たとえば、Sambrook他「Molecular Cloning 」Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年、参照〕。
好ましくは、宿主細胞は、所望の産物をコードする DNAを含む、適当なクローン化媒体、すなわち、プラスミドまたはベクターの導入のために当業界で公知の方法により修飾される。クローン化媒体は、自己複製プラスミドまたは染色体に組み込むかのいずれかにより宿主細胞に導入することができ、好ましくは、クローン化媒体は1つまたは複数の適当な調節領域に操作可能に連結している、1つまたは複数の構造領域を含む。
構造領域は所望の産物をコードするヌクレオチド配列を保持している領域である。調節領域は、転写及び翻訳調節配列を含むプロモーター領域、終結シグナルを含むターミネーター領域及びポリアデニル化領域を包含する。プロモーター、すなわち、選択された宿主細胞における転写活性を示すヌクレオチド配列は、細胞外または細胞内タンパク質、好ましくは酵素、たとえば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、酸化還元酵素、ペクチナーゼ、クチナーゼまたは解糖酵素をコードする遺伝子から由来するものであることができる。真菌宿主細胞における転写のための適当なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエのTAKA−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワムシ(awamsii) のグルコアミラーゼ (gluA) 、アスペルギルス・ニガーのアセタミダーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオースホスファターゼ異性化酵素、リゾプス・メイヘイ(Rhizopus meihei) のアスパルチンプロテイナーゼ及びリゾプス・メイヘイのリパーゼから由来するプロモーターである。アスペルギルス・オリザエのTAKA−アミラーゼ及びアスペルギルス・アワムシのgluAプロモーターが好ましい。
クローン化媒体は、選択マーカー、たとえば、遺伝子、宿主細胞における欠損を相補する生成物または、抗生物質耐性、たとえばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を与えるものも含んでよい。アスペルギルス属の選択マーカーの例はamdS, pyrG, argB, niaD及びsC、すなわちヒグロマイシン耐性を生ずるマーカーを包含する。アスペルギルス属宿主細胞中で用いるのに好ましいものは、アスペルギルス・ニドラン (nidulans) またはアスペルギルス・オリザエのamdS及びpyrGマーカーである。よく用いられる哺乳類のマーカーはジヒドロフォレート還元酵素 (DHFR) 遺伝子である。さらに、選択は共形質転換により達成することができる。
本発明の DNA構築物、プロモーター、ターミネーター及び他の要素を、それぞれ結合するのに用いられる手順及びそれらを複製に必要な情報を含有する適当なクローン化媒体に挿入する手順は、当業者に周知である(たとえば、「Molecular Cloning 」Cold SpringHarbor, ニューヨーク, 1989年、参照)。
本発明の宿主細胞は、タンパク質の異種発現に用いられる、慣用のいずれの宿主細胞でもよい。
好ましくは、本発明の宿主細胞は、所望のタンパク質を産生することができる、酵母または糸状菌である。特に、酵母細胞は、サッカロミセス属の株、特にサッカロミセス・セレビシエであり得る。特に糸状菌は、アクレモニウム (Acremonium) 属、アスペルギルス属、カンジダ属、コクリオボルス(Cocliobolus) 属、エンドチア (Endothia) 属、フザリウム (Fusarium) 属、フミコーラ (Humicola) 属、ニューロスポラ (Neurospora) 属、リゾムコル (Rhizomucor) 属、リゾプス (Rhizopus) 属、サーモミセス(Thermomyces) 属、トリコデルマ(Trichoderma) 属、ポドスポラ(Podospora) 属、ピリクラリア(Pyricularia) 属またはペニシリウム属からなる群から選択された菌株であり得る。
好ましい態様では糸状菌は、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドラン、アスペルギルス・アワモリ(awamori) 、アスペルギルス・フォエニシス(phoenicis)、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・フォエツス (foetus) 、フザリウム・グラミネアルム(graminearum) 、フザリウム・オキシスポルム(oxysporum) 、フザリウム・ソラニ (solani)、フミコーラ・グリセア (grisea) 、ニューロスポラ・クラッサ (crassa) 、ペニシリウム・クリソゲヌム (crysogenum) 、リゾムコル・メイヘイ、トリコデルマ・リーセイ (reesei) またはトリコデルマ・ビリデ (viride) からなる群から選択される菌株である。
産 物
所望の産物、すなわち、本発明の宿主細胞により発現された異種タンパク質は、いかなる真正細菌または真核のタンパク質であってもよい。
所望の産物、すなわち、本発明の宿主細胞により発現された異種タンパク質は、いかなる真正細菌または真核のタンパク質であってもよい。
本明細書では「異種タンパク質産物」は、宿主細胞に対して本来のものでないタンパク質か、または本来の配列を変更するために修飾がなされた、本来のタンパク質、本来のタンパク質の発現に必要な本来の調節因子、たとえばプロモーター、リボソーム結合部位等の小細工、もしくは組換え DNA技術による宿主細胞の他の小細工の結果として発現が定量的に変更されている本来のタンパク質である。
メタロプロテアーゼの不存在のために、宿主細胞により発現された異種タンパク質は、前駆体タンパク質、すなわち、チモーゲン、ハイブリッドタンパク質、プロ配列もしくはプレ−プロ配列として得られたまたは未成熟型タンパク質であってもよい。好ましい態様では、前記産物は酵素である。
より特殊な態様では、前記タンパク質は真核酵素、たとえばインスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF、 VII因子、VIII因子、ウロキナーゼ、 EPO、キモシン、組織プラスミノーゲン活性化剤または血清アルブミンである。
他の好ましい態様では、前記生成物は、真菌、酵母または細菌起源の酵素である。
好ましい酵素は、グリコシダーゼ酵素、たとえば、アミラーゼ、特にα−アミラーゼ(EC 3.2.1.1) 、β−アミラーゼ(EC 3.2.1.2) 、グルカン1,4−α−グルコシダーゼ(EC 3.2.1.3) 、セルラーゼ(EC 3.2.1.4) 、エンド−1,3(4)−β−グルカナーゼ(EC 3.2.1.6) 、エンド−1,4−β−グルカナーゼ(EC 3.2.1.8)、ポリガラクトウロナーゼ(EC 3.2.1.15) 、α−グルコシダーゼ(EC 3.2.1.20) 、β−グルコシダーゼ(EC 3.2.1.21) 、α−ガラクトシダーゼ(EC 3.2.1.22) 、β−ガラクトシダーゼ(EC 3.2.1.23) 、キシラン−エンド−1,3−β−キシロシダーゼ(EC 3.2.1.32) 、エンド−1,3−β−グルカナーゼ(EC 3.2.1.39) 、エンド−1,3−α−グルカナーゼ(EC 3.2.1.59) 、エンド−1,2−β−グルカナーゼ(EC 3.2.1.71) 、エンド−1,6−β−グルカナーゼ(EC3.2.1.75) 、セルロース−1,4−β−セロビオシダーゼ(EC 3.2.1.91、セロビオヒドロラーゼとしても知られている)である。
他の好ましい態様では、酵素は脂肪分解酵素、特にリパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼまたはリゾホスホリパーゼである。
第3の好ましい態様では、酵素はフィターゼ、特に3−フィターゼ(EC 3.1.3.8) または6−フィターゼ(EC 3.1.3.26) である。
第4の好ましい態様では、酵素はタンパク質分解酵素である。
第5の好ましい態様では、酵素は酸化還元酵素、たとえば、ペルオキシダーゼもしくはラッカーゼ、ペクチナーゼまたはクチナーゼである。
好ましいハイブリッドポリペプチドはプロキモシン及びプロ−トリプシン様プロテアーゼである。
メタロプロテアーゼ
本発明の文脈では、メタロプロテアーゼは、ペプチド主鎖の加水分解に関係する触媒の亜鉛金属中心を含有するタンパク質分解酵素である。活性亜鉛中心はカルパインからこれらのプロテアーゼを区別し、それらの活性はカルシウムの存在に依存する。メタロプロテアーゼとしてのプロテアーゼの確認は亜鉛中心の除去により達成される、タンパク質分解活性の喪失である。亜鉛中心は1,10−フェナントロリン(1mM)で除去することができる。Zn2+(0.1〜100 μM) での滴定後、タンパク質分解活性は回復する。
本発明の文脈では、メタロプロテアーゼは、ペプチド主鎖の加水分解に関係する触媒の亜鉛金属中心を含有するタンパク質分解酵素である。活性亜鉛中心はカルパインからこれらのプロテアーゼを区別し、それらの活性はカルシウムの存在に依存する。メタロプロテアーゼとしてのプロテアーゼの確認は亜鉛中心の除去により達成される、タンパク質分解活性の喪失である。亜鉛中心は1,10−フェナントロリン(1mM)で除去することができる。Zn2+(0.1〜100 μM) での滴定後、タンパク質分解活性は回復する。
好ましい態様では、本発明の文脈で期待されるメタロプロテアーゼはフザリウム属のメタロプロテアーゼ、好ましくはフザリウム・オキシスポルムのメタロプロテアーゼである。最も好ましい態様では、メタロプロテアーゼは配列番号2で示されるアミノ酸配列またはこれと相同の配列を有する、フザリウム・オキシスポルムp45のメタロプロテアーゼである。
他の好ましい態様では、本発明の文脈において期待されるメタロプロテアーゼは中性メタロプロテアーゼであって、それは、中性pH領域、すなわち約pH6〜8の範囲、好ましくは約pH 6.5〜7.5 の範囲、pH7付近で最適タンパク質分解活性を有するメタロプロテアーゼである。
より特定的には、本発明の文脈で期待されるメタロプロテアーゼは、NpIまたはNpIIのグループの中性のアスペルギルス属のメタロプロテアーゼである。
好ましい態様では、配列番号4として提示される部分ヌクレオチド配列またはこれと相同の配列を含むcDNAによりコードされる、アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼI(NpI)である。
相同性の程度は、第2の配列から第1の配列の誘導を示す2つの配列の間の同一性の程度として決定し得る。相同性は、コンピュータープログラムにより、公知の方法により、たとえば50塩基対の連続した配列を比較することによって、適切に決定し得る。本明細書の定義では、相同性cDNA配列によりコードされるタンパク質は当該配列と少なくとも70%の相同性、好ましくは80%より多い相同性、より好ましくは90%より多い相同性、最も好ましくは95%より多い相同性の程度を表わす。
メタロプロテアーゼをコードする遺伝子は、そのメタロプロテアーゼのすべてまたは部分をコードする核酸配列についてのハイブリダイズにより、たとえば、cDNA配列、たとえば、配列番号1及び配列番号4として提示されたヌクレオチド配列を基礎として、またはそのメタロプロテアーゼのアミノ酸配列を基礎として調製することができる、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、標準的な技術に従って、スクリーニングすることにより同定できる〔たとえばSambrook他「Molecular Cloning 」Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年、参照〕。
遺伝子的修飾
メタロプロテアーゼの有意に低下したレベルを発現するために遺伝子的に修飾された、本発明の宿主細胞は、当業者に公知の標準的組換え DNA技術を用いて修飾できる。メタロプロテアーゼの産生の原因である遺伝子配列は、不活性化または完全に除去することができる。
メタロプロテアーゼの有意に低下したレベルを発現するために遺伝子的に修飾された、本発明の宿主細胞は、当業者に公知の標準的組換え DNA技術を用いて修飾できる。メタロプロテアーゼの産生の原因である遺伝子配列は、不活性化または完全に除去することができる。
特定の態様では、本発明の宿主細胞はメタロプロテアーゼをコードする構造または調節領域で遺伝子的に修飾されたものである。公知のまたは有用な技術は、限定するわけではないが、特異的またはランダム変異誘発、 PCR生成変異誘発、部位特異的 DNA欠失、挿入及び/もしくは置換、遺伝子破壊 (disruption) もしくは遺伝子置換技術、アンチセンス技術またはそれらの組合せを包含する。
変異誘発は適当な物理的または化学的変異誘発剤を用いて行なわれる。この目的に適切な物理的または化学的変異誘発剤の例は、紫外線(UV)照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG) 、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル(EMS) 、重亜硫酸ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチド類似体を包含する。上記試薬を用いる時、変異誘発は、典型的には、変異誘発を行うのに適当な条件下、選択された変異誘発剤の存在下で変異誘発すべき細胞をインキュベートし、メタロプロテアーゼの有意に低下した産生を有する変異した細胞を選択することによって行なわれる。
修飾はメタロプロテアーゼをコードする配列またはそれらの転写もしくは翻訳に必要な調節要素における、1または複数のヌクレオチドの導入、置換もしくは除去によっても達成することができる。終結コドンの導入、出発コドンの除去またはオープンリーディングフレームの変更を生ずるように、ヌクレオチドをたとえば挿入または除去することができる。構造配列または調節要素の修飾または不活性化は、部位特異的変異誘発または PCR生成変異誘発により、当業界で公知の方法に従って達成できる。原則としては、修飾はインビボ、すなわち、メタロプロテアーゼ遺伝子を担持する細胞上で直接行うことができるけれども、現在、インビトロで修飾を行うことが好まれている。
選択した宿主細胞のメタロプロテアーゼ産生を不活性化または低下させる慣用の方法は遺伝子破壊の原理に基づく。この方法は、破壊することが望まれる内因性の遺伝子または遺伝子フラグメントに相当する DNA配列を用いることを含む。前記 DNA配列はインビトロで欠損のある遺伝子に変異され、宿主細胞に形質転換される。相同組換により、欠損のある遺伝子が内因性遺伝子または遺伝子フラグメントに置換する。メタロプロテアーゼをコードしている遺伝子が修飾されているか、または破壊されている形質転換体の選択のために用い得るマーカーをコードする、欠損のある遺伝子または遺伝子フラグメントが望ましいかもしれない。代りに、メタロプロテアーゼをコードしている配列、たとえば配列番号1及び配列番号4として提示されているヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を用いる確立されたアンチセンス技術を用いることによって、 DNA配列の修飾または不活性化を行うことができる。
遺伝子的修飾のため、本発明の宿主細胞は有意に低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現する。好ましい態様では、宿主細胞により発現されたメタロプロテアーゼのレベルは約50%より多く、好ましくは約85%より多く、より好ましくは約90%より多く、最も好ましくは約95%より多く低下する。最も好ましい態様では、宿主細胞により発現された生成物は、本質的にメタロプロテアーゼ活性を欠く。
タンパク質の生産方法
他の面では、本発明はタンパク質(すなわち、ポリペプチド及び/またはタンパク質)を生産する方法を提供し、その方法は本発明の宿主細胞を適当な増殖培地中で培養し、続いて所望の生成物を回収することを含む。
他の面では、本発明はタンパク質(すなわち、ポリペプチド及び/またはタンパク質)を生産する方法を提供し、その方法は本発明の宿主細胞を適当な増殖培地中で培養し、続いて所望の生成物を回収することを含む。
本発明の方法により、メタロプロテアーゼのタンパク質分解作用は有意に低下し、それにより得られた産物の安定性を改良する。さらに、メタロプロテアーゼの不存在のため、宿主細胞により発現された異種タンパク質は、前駆体タンパク質、すなわちチモーゲン、ハイブリッドタンパク質、プロ配列もしくはプレ−プロ配列として得られた、または未成熟形のタンパク質として得られる。
培養に用いられるブロスまたは培地は、当該宿主細胞を増殖するのに適当ないかなる慣用の培地でもよく、先行技術の原則に従って構成することができる。培地は好ましくは炭素及び窒素源並びに他の無機塩を含有する。適当な培地、たとえば、最少培地または複合培地は商業的な供給者から入手できるか、または、出版された処方、たとえば「the American Type Culture Collection (ATCC) Catalogue of strains」に従って調製することができる。
培養後、タンパク質を慣用のタンパク質の単離及び精製方法により培養ブロスから回収する。周知の精製手順は、遠心またはろ過により培地から細胞を分離し、塩、たとえば硫酸アンモニウムにより培地のタンパク質成分を沈殿させること及びクロマトグラフ法、たとえば、イオン交換クロマトグラフ、ゲルろ過クロマトグラフ、アフィニティクロマトグラフ等を包含する。
例
本発明を請求された発明の範囲をいかなる風にも限定することを意図しない、次の例を参照してさらに説明する。
本発明を請求された発明の範囲をいかなる風にも限定することを意図しない、次の例を参照してさらに説明する。
物質及び方法
菌 株
アスペルギルス・オリザエ IFO 4177は、発酵研究所、日本国大阪府大阪市淀川区十三本町2−17−25、から入手できる。
菌 株
アスペルギルス・オリザエ IFO 4177は、発酵研究所、日本国大阪府大阪市淀川区十三本町2−17−25、から入手できる。
フザリウム・オキシスポルム DSM 2672は、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ドイツ サムルング フォン ミクロオーガニズメン ウント ツェルクルチュレン GmbH (DSM), ドイツ国, DE−3300 ブラウンシュベイヒ, マッシャーオデール ヴェク 1bに1983年6月6日に寄託された。
大腸菌 DH5α, Hanahan D 「J. Mol. Biol. 」166, p.557, 1983年。
遺伝子
NpI この遺伝子は中性メタロプロテアーゼIをコードする。
遺伝子
NpI この遺伝子は中性メタロプロテアーゼIをコードする。
NpII この遺伝子は中性メタロプロテアーゼIIをコードする。
pyrG この遺伝子は、オロチジン−5′−ホスフェートデカルボキシラーゼ(ウリジンの生合成に包含される酵素)をコードする。
プラスミド
pUC118 Yanish-Perron 他「Gene」 33, p.103, 1985年。
プラスミド
pUC118 Yanish-Perron 他「Gene」 33, p.103, 1985年。
pJaL389 コスミド 3E8からのこのプラスミドの構築は、例1に記載されている。
pSO2 このプラスミドの構築は例2に記載されている。
pJers4 pSO2のサブクローン。
pJaL335 pSO2からのこのプラスミドの構築は例2に記載されている。
pSO5 pSO2からのこのプラスミドの構築は例2に記載されている。
pJaL198 pJaL198 からのこのプラスミドの構築は例3に記載されている。
pJaL218 pJaL218 からのこのプラスミドの構築は例4に記載されている。
p3SR2 Kelly J M 及び Hynes M J「EMBO Journal」4, p.475〜479, 1985年。
pToC90 p3SR2 のサブクローン。
pToC56 このプラスミドの構築はヨーロッパ特許第 238,023号明細書に記載されている。
pToC65 このプラスミドの構築はヨーロッパ特許第 531,372号明細書に記載されている。
pCR(商標)II インビトロジェン・コーポレーション (Invitrogen Corporation, 米国, カリフォルニア州 サン・ディエゴ) から入手できる。
例 1
アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼI(NpI)のクローン化
アスペルギルス・オリザエのコスミドライブラリーの構築
ライブラリーを供給者 (Stratagene) の「SuperCos 1 Cosmid Vector Kit」からの指示に従って構築した。
アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼI(NpI)のクローン化
アスペルギルス・オリザエのコスミドライブラリーの構築
ライブラリーを供給者 (Stratagene) の「SuperCos 1 Cosmid Vector Kit」からの指示に従って構築した。
アスペルギルス・オリザエ IFO 4177のゲノム DNAを標準的手順によりプロトプラストから調製した〔たとえば Christensen他「Biotechnology 」 6, p.1419〜1422, 1989年、参照〕。プロトプラストの単離後、これらをLabofuge (商標) T(Heto)中で 2500rpmで5分間の遠心によりペレット化し、ペレットをSuperCos 1 Cosmid Vector Kitからの手引書に記載のように、 DNA調製の残余のように、10mM NaCl、20mM Tris−塩酸(pH 8.0) 、1mM EDTA、 100μg/mlのProteinase (商標) K及び 0.5%の SDS中に懸濁した。
ゲノム DNAのサイズをバイオラド (Biorad) からのCHEF−ゲル装置を用いる電気泳動により分析した。1%のアガロースゲルを10〜50秒パルスを用いて 200ボルトで20時間通じた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、写真をとった。その DNAのサイズは50〜100Kb であった。その DNAは Sau3Aにより部分的に制限された。制限された DNAのサイズは同じ方法で測定して、20〜50Kbであった。
連結反応とパッケージングとして、供給者の手引書に従って、CsClグラジエントバンド(banded) SuperCos 1ベクターを調製した。ライブラリーの滴定後、1つの連結反応及びパッケージングからのすべてのパッケージング混合物を宿主細胞 XL1−Blue MR 中にトランスフェクトし、50μg/mlアンピシリンLBプレート上に塗布した。約3800のコロニーが得られた。10コロニーからのコスミド調製物は、それらのすべてが予期されたサイズの挿入物を有していることを示した。コロニーを別々に採集し、 100μl LB(100μg/mlのアンピシリン) のミクロタイタープレートウェルに接種し、37℃で1晩インキュベートした。各ウェルに 100μlの50%グリセロールを加え、全ライブラリーを−80℃で凍結した。総計3822のコロニーを貯蔵した。これは約 4.4倍のアスペルギルス・オリザエのゲノムを表わす。
フザリウム・オキシスポルムp45メタロプロテアーゼ遺伝子のクローン化
精 製
フザリウム・オキシスポルム DSM 2672ブロスを 9000rpmで10分間遠心し、上清を0.45μmフィルターを通してろ過した。 200mlのろ液をAmiconセル(PM 10膜) 及びCentriprep−O (Amicon) 上で10mlまで濃縮する。5mlの濃縮物を 100mlに希釈し、酢酸でpHを5に調節し、次の緩衝液、すなわち、 0.1M ホウ酸塩、10mM DMG、2mM 塩化カルシウム(pH 5.2) 中で、0〜0.5 Mの塩化ナトリウムグラジエント中で、1ml Mono−Sカラム上に70分間流した。上記と同一の緩衝液中で、流量1ml/分で10分間の洗浄後、 1.5ml分画を捕集し、 Centricon−10 (Amicon) 上で濃縮した。
精 製
フザリウム・オキシスポルム DSM 2672ブロスを 9000rpmで10分間遠心し、上清を0.45μmフィルターを通してろ過した。 200mlのろ液をAmiconセル(PM 10膜) 及びCentriprep−O (Amicon) 上で10mlまで濃縮する。5mlの濃縮物を 100mlに希釈し、酢酸でpHを5に調節し、次の緩衝液、すなわち、 0.1M ホウ酸塩、10mM DMG、2mM 塩化カルシウム(pH 5.2) 中で、0〜0.5 Mの塩化ナトリウムグラジエント中で、1ml Mono−Sカラム上に70分間流した。上記と同一の緩衝液中で、流量1ml/分で10分間の洗浄後、 1.5ml分画を捕集し、 Centricon−10 (Amicon) 上で濃縮した。
Superose−12(HR 10/30, Pharmacia)を用いるゲルろ過を 0.1M ホウ酸塩、10mM DMG、2mM CaCl2 (pH 6.5) 中で流量 0.4ml/分で行なう。 0.4ml分画を捕集する。この 200μlの試料を注入する。
タンパク質分解酵素アッセイ
25℃で、 0.1M TRIS、2mM CaCl2(pH7)(より低いpHでは、 100mM ホウ酸塩、10mM DMG、2mM CaCl2を用いる) 中での30〜60分間の予備インキュベーション後、メタロプロテアーゼ活性をフザリウム・オキシスポルム DSM 2672からのプロ−トリプシン様プロテアーゼからの遊離トリプシン活性として測定する。トリプシン活性をミクロタイタープレート中で測定し、 100μlの試料を 100μlの基質と混合し〔ストック:DMSO中の87mg/mlのL−BAPNA (Sigma) 、緩衝液中に50倍に希釈されている〕、 Molecular Devicesからの Thermomax読取り機を用いて 405nmでの吸収を測定する。
25℃で、 0.1M TRIS、2mM CaCl2(pH7)(より低いpHでは、 100mM ホウ酸塩、10mM DMG、2mM CaCl2を用いる) 中での30〜60分間の予備インキュベーション後、メタロプロテアーゼ活性をフザリウム・オキシスポルム DSM 2672からのプロ−トリプシン様プロテアーゼからの遊離トリプシン活性として測定する。トリプシン活性をミクロタイタープレート中で測定し、 100μlの試料を 100μlの基質と混合し〔ストック:DMSO中の87mg/mlのL−BAPNA (Sigma) 、緩衝液中に50倍に希釈されている〕、 Molecular Devicesからの Thermomax読取り機を用いて 405nmでの吸収を測定する。
SDS−PAGE及びPVDF上への電気ブロット
SDS−PAGE(10〜27%、Novex)を製造者の指示に従って電気泳動する。電気泳動すべき試料を試料緩衝液を加える前にPMSFと予備インキュベートする。プロ−ブロット膜 (Applied Biosystems) 上への電気ブロットを3mM Na2CO3、10mM NaHCO3、20% MeOH (pH 9.9)中で、 Novexからのブロットモジュールを用いて30Vで2時間行なう。プロ−ブロットをApplied Biosystemsに記載されているように染色する。
SDS−PAGE(10〜27%、Novex)を製造者の指示に従って電気泳動する。電気泳動すべき試料を試料緩衝液を加える前にPMSFと予備インキュベートする。プロ−ブロット膜 (Applied Biosystems) 上への電気ブロットを3mM Na2CO3、10mM NaHCO3、20% MeOH (pH 9.9)中で、 Novexからのブロットモジュールを用いて30Vで2時間行なう。プロ−ブロットをApplied Biosystemsに記載されているように染色する。
IEF−上塗り (overlay)
等電点電気泳動(IEF) を Ampholine PAG−プレート(Pharmacia)、pH 3.5〜9.5 上で実施し、製造者の指示に従って染色する。上塗りすべきゲルをまず、 0.1M TRIS、2mM CaCl2 (pH 8.1) 中で15分間平衡化し、次いで10mlの1%アガロース、 0.1M TRIS、2mM CaCl2 (pH 8.1) で上塗りし、 300μlのL−BAPNA (Sigma) ストック及び 500μlのプロ−トリプシン様フザリウム・オキシスポルムDSM 2672プロテアーゼ(約0.25mg/ml) を加える。
等電点電気泳動(IEF) を Ampholine PAG−プレート(Pharmacia)、pH 3.5〜9.5 上で実施し、製造者の指示に従って染色する。上塗りすべきゲルをまず、 0.1M TRIS、2mM CaCl2 (pH 8.1) 中で15分間平衡化し、次いで10mlの1%アガロース、 0.1M TRIS、2mM CaCl2 (pH 8.1) で上塗りし、 300μlのL−BAPNA (Sigma) ストック及び 500μlのプロ−トリプシン様フザリウム・オキシスポルムDSM 2672プロテアーゼ(約0.25mg/ml) を加える。
アミノ酸分析及びアミノ酸配列決定
凍結乾燥試料のマイクロ波促進気相加水分解を MDS−2000加水分解施設(station) (CEM) を用いて行なう。1% フェノールを含有する6N HCl(スカベンジャー)を気相を創造するのに用いる。加水分解時間は、70psi(約 148℃) で20分間である。加水分解された試料を凍結乾燥し、内部標準としての20μlの 500pmol/μlのザルコシン及びノルバリンで再溶解する。分析は製造者の指示に従って、 Hewlett−Packard からのAmicon Quantを用いて行なう。1μlの試料を注入する。アミノ酸配列決定を製造者の指示に従って、Applied Biosystemsからの476Aプロテイン・シークェンサー(Protein Sequencer) を用いて行なう。予備混合緩衝液をオンライン−HPLCのために用いる。
凍結乾燥試料のマイクロ波促進気相加水分解を MDS−2000加水分解施設(station) (CEM) を用いて行なう。1% フェノールを含有する6N HCl(スカベンジャー)を気相を創造するのに用いる。加水分解時間は、70psi(約 148℃) で20分間である。加水分解された試料を凍結乾燥し、内部標準としての20μlの 500pmol/μlのザルコシン及びノルバリンで再溶解する。分析は製造者の指示に従って、 Hewlett−Packard からのAmicon Quantを用いて行なう。1μlの試料を注入する。アミノ酸配列決定を製造者の指示に従って、Applied Biosystemsからの476Aプロテイン・シークェンサー(Protein Sequencer) を用いて行なう。予備混合緩衝液をオンライン−HPLCのために用いる。
フザリウム・オキシスポルムのブロスからのp45の精製
p45メタロプロテアーゼを濃縮及びろ過された発酵ブロスからカチオン交換クロマトグラフ(Mono−S)により精製し、続いて Superose 12でゲルろ過する。Mono−Sからの分画をプロ−トリプシン様フザリウム・オキシスポルムDSM 2672プロテアーゼからの遊離されたトリプシン様活性として、メタロプロテアーゼ活性について検定することにより選択する。
p45メタロプロテアーゼを濃縮及びろ過された発酵ブロスからカチオン交換クロマトグラフ(Mono−S)により精製し、続いて Superose 12でゲルろ過する。Mono−Sからの分画をプロ−トリプシン様フザリウム・オキシスポルムDSM 2672プロテアーゼからの遊離されたトリプシン様活性として、メタロプロテアーゼ活性について検定することにより選択する。
Superose−12からのメタロプロテアーゼ分画をMono−S分画についてと同じ検定手順により同定する。精製されたメタロプロテアーゼは SDS−PAGE上で 45KDaに1本のバンドとして現われる。メタロプロテアーゼの2つのイソ型タンパク質が、IEF(pH 3.5〜9.5)で、それぞれpl 8.4及び 8.7に認められる。
アミノ酸分析の結果は、このメタロプロテアーゼ(p45)は配列番号3として配列表に示されたN末端アミノ酸配列を有していることを示す。
フザリウム・オキシスポルムp45メタロプロテアーゼ遺伝子のクローン化と組換えp45の特徴づけ
フザリウム・オキシスポルムp45のメタロプロテアーゼ遺伝子の一部分を最初に PCRによりクローン化する。1つのプライマーをN−末端タンパク質配列(配列番号3)を用いて設計し、逆プライマーを内部メタロプロテアーゼペプチド配列(配列番号1の 483〜515 残基) から設計する。 PCRをその DNAプライマーとフザリウム・オキシスポルムから単離されたゲノム DNAを用いて行なう。ゲノム DNAは次のようにして単離する。
フザリウム・オキシスポルムp45のメタロプロテアーゼ遺伝子の一部分を最初に PCRによりクローン化する。1つのプライマーをN−末端タンパク質配列(配列番号3)を用いて設計し、逆プライマーを内部メタロプロテアーゼペプチド配列(配列番号1の 483〜515 残基) から設計する。 PCRをその DNAプライマーとフザリウム・オキシスポルムから単離されたゲノム DNAを用いて行なう。ゲノム DNAは次のようにして単離する。
約15gの湿重量のフザリウム・オキシスポルムを MY 50培地 (50g/lのマルトデキストリン、2g/lのMg2SO4、10g/lのKH2PO4、2g/lのクエン酸、10g/lの酵母抽出液、2g/lの尿素、2g/lの K2SO4、 0.5mlの微量金属溶液、5N NaOHでpH6に調節)中で30℃で増殖させる。菌糸体を16mlのTE (10mM TRIS、1mM EDTA、pH 8.0) に懸濁させ、2本の管に分配し、約12gの0.45〜0.52mmのガラスビーズ(Thomas Scientific) を各管に加える。試料を顕著な粘度破壊が生ずるまで、30秒の間隔で交互に渦を巻かせ (vortex) 、氷冷する。試料を更に2回30秒間隔で交互に渦を巻かせる。各試料に 2.5mlの20% SDSを加える。試料を逆さにすることにより混合し、室温で10分間インキュベートし、再度混合する。試料を8分間 3.5Kで室温で回転させる。上清を50ml ポリプロピレン管中に一緒にする。試料をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で平衡化された等量のTEで抽出し(P/C/l抽出された)、次いで10分間、 10,000rpmで4℃で遠心する。上清を 300μlの10mg/mlのプロテイナーゼKで30分間25℃で処理する。 DNAを上記のようにP/C/lで抽出し、エタノール沈殿させ、5mlのTE中に溶解する。試料を 150μlの10mg/lの RNAアーゼAで65℃で15分間処理し、次いで25℃で15分間処理する。試料を再度プロテイナーゼK(100μlの10mg/mlで 1.5時間、25℃)で処理し、P/C/lで2回抽出し、エタノール沈殿させた。 DNAを曲がったパスツールピペット上にプールし、5mlの80%エタノールに移す。試料を3分間、 10,000rpmで回転する。 DNAペレットを手短かに乾燥させ、次いで1mlのTEに溶解する。
フザリウム・オキシスポルムp45遺伝子の一部をクローン化するのに PCRを用いる。50〜100ng のフザリウム・オキシスポルムのゲノム DNAを約 100pmolの1×Taq 緩衝液(ベーリンガー・マンハイム)中の各合成 PCRプライマー DNA及び 100μlの各dGTP, dATP,dTTP及びdCTPの50μl容積へ濃縮物と混合する。 Taq DNAポリメラーゼ (ベーリンガー・マンハイム) 、1〜5ユニットを加え、 PCRインキュベーションは95℃で5分間、次いで35サイクルの〔95℃で30秒、50℃で1分間及び72℃で1分間〕である。
PCR反応は約 1.0及び 1.3Kbの長さの2つの DNAフラグメントを産生する。これらのフラグメントはゲル電気泳動により単離され、精製され、大腸菌複製プラスミド中にクローン化され、分子生物学の技術で公知の標準方法を用いて配列決定する。 1.0Kbの DNAフラグメントは、直接タンパク質配列決定から得たアミノ酸配列を用いる DNAの翻訳との比較により、フザリウム・オキシスポルムp45遺伝子配列を含有していることが見い出される。したがって、この 1.0Kbの PCR生成 DNAフラグメントをプローブとして用い、フザリウム・オキシスポルムのゲノム DNAライブラリーから、完全なメタロプロテアーゼ遺伝子をクローン化する。
ラムダファージにおけるゲノムライブラリーをサムブルック他により記載されたような方法〔Sambrook他「Molecular Cloning 」 Cold Spring Harbor,ニューヨーク, 1989年〕を用いて、フザリウム・オキシスポルムのゲノム DNAから調製した。総計50μgのゲノム DNAを10mM TRIS (pH 7.5)、50mM NaCl、7mM MgCl2、7mM 2−メルカプトエタノール及び4ユニットの制限酵素 Sau3Aを含有する、 200μlの容量中で1分間、25℃で消化した。分子の大きさ10〜20Kbの部分的に消化された DNAをアガロースゲル電気泳動により単離し、続いて、透析膜への電気溶出 (electroelution) 及びElutip−Dカラム (Schleicher及びSchuell)を用いる濃縮を行う。制限酵素BamHIで切断され、ホスファターゼ(Clonetech) で処理された、1μgの EMBL4のファージのラムダアーム(arm) を25mlの容積の 300〜400 μgの Sau3A切断ゲノム DNAと、標準条件下で結合させる〔Sambrook他「Molecular Cloning 」Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年、参照〕。ラムダファージを市販のキット (Gigapack Gold 11, Stratagene) を用いて、製造者の指示に従って、この結合混合物から調製する。約18,000の組換えラムダファージの塗布及びフィルターリフト(N+フィルター、Amershamに)の生成を標準技術〔Sambrook他「Molecular Cloning 」Cold Spring Harbor,ニューヨーク, 1989年、参照〕を用いて行う。フィルターを製造者によりもたらされた指示を用いて、非−放射性核酸検出のためのGenious Kit(ベーリンガー マンハイム)を用いるハイブリダイズのために処理する。p45プローブとして用いられる DNAは上記のようにして得られる 1.0Kb PCRフラグメントである。前記プローブを DIG標準化キット及び製造者により供給された指示を用いて、ジオキシゲニン(DIG) の PCR取り込みにより標識する。15ngの 1.0Kbのp45フラグメントを1×Taq 緩衝液 (ベーリンガー マンハイム)中で各 100pmolのN−末端プライマー及び内部の逆プライマー並びに1〜5ユニットの Taqポリメラーゼ(ベーリンガー マンハイム)を総量80μlで混合する。反応条件は95℃で3分間、次いで35サイクルの〔95℃で30秒、50℃で1分間及び72℃で1分間〕、及び72℃で5分間であった。 DIG標識化プローブを用いるフィルターハイブリダイズ及び洗浄条件は Genious Kitの製造者によりもたらされた指示を用いて行なった。
ハイブリダイズするファージを、製造者(ベーリンガー マンハイム)により記載されているようにLumiphos 530を用いて可視化された、アルカリ性ホスファターゼ−複合アンチ−ジオキシゲニン抗体で検出する。 DNA調製物をQiagen Lambda Midi Kit (QIAGEN, Inc.) を用いて、陽性のラムダクローンから作る。1調製物からの DNAを制限酵素EcoRIで消化し、 6.3KbのフラグメントをプラスミドpUC118中にサブクローン化する。このサブクローンの部分の DNA配列分析は、p45遺伝子(配列番号1参照)の完全なコード領域を同定した。
p45メタロプロテアーゼcDNAのクローン化
次の変更を伴う、過去に出版されたプロトコルに従って〔Chirgwin他「Biochemistry」18, p.5294〜5299, 1988年;Aviv及び Leder「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」69, p.1408〜1412, 1972年、Sambrook他「Molecular Cloning 」Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年〕フザリウム・オキシスポルムから、総 RNA及びポリ−ARNA を調製する。
次の変更を伴う、過去に出版されたプロトコルに従って〔Chirgwin他「Biochemistry」18, p.5294〜5299, 1988年;Aviv及び Leder「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」69, p.1408〜1412, 1972年、Sambrook他「Molecular Cloning 」Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年〕フザリウム・オキシスポルムから、総 RNA及びポリ−ARNA を調製する。
具体的にいうと、菌糸体を液体窒素中で細かい粉末にひき、次に、4M チオシアン酸グアニジウム、 0.5%のNa−ラウリルザルコシン、25mM クエン酸ナトリウム及び 0.1M 2−メルカプトエタノールを含有する溶解緩衝液(pH 7.0) 中に撹拌しながら、室温で30分間再懸濁する。細胞破片を低速(5000rpm、30分間) 遠心により除去する。典型的には、ポリ−A RNA 分画をベーリンガー マンハイムから得たオリゴ(dT) セルロースを用いて単離する。
ヘアピン/RNアーゼH法〔Sambrook他「Molecular Cloning 」Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年〕を用いて、ポリ−A RNA をcDNAを生じさせるのに用いる。具体的にいうと、5μlの水中の5μgのポリ−A RNA を70℃に加熱し、次いで氷の上に置く。ポリ−A RNA 、50mM TRIS (pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、各1mMのdGTP, dATP, dTTP及びdCTP、40ユニットのRNアシン (RNasin) 、10μgのオリゴ(dT 12〜18) プライマー並びに1000ユニットの SuperScript 11 RNアーゼH−逆転写酵素(Bethesda Research Laboratories) を含有する、50μlの総反応混合物を調製する。混合物を45℃で1時間インキュベートする。次いで、30μlの10mM TRIS (pH 7.5)、1mM EDTA、40μgのグリコーゲン担体(ベーリンガー マンハイム)、 0.2容積の10M 酢酸アンモニウム及び 2.5容積のエタノールを加えて核酸を沈殿させる。遠心後、前記ペレットを20mM TRIS (pH 7.4)、90mM KCl、 4.6mM MgCl2、10mM 硫酸アンモニウム、16μM βNaD+ 、各 100μMのdGTP, dATP, dTTP及びdCTP、44ユニットの大腸菌 DNAポリメラーゼ1、6.25ユニットのRNアーゼH並びに10.5ユニットの DNAリガーゼ中に再懸濁する。第2ストランド DNA合成をこの溶液中で16℃で3時間行なう。 DNAをエタノール沈殿で濃縮し、ペレットを30μlの30mM 酢酸ナトリウム(pH 4.6) 、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2%のグリセロール及び30ユニットの Mung Beanヌクレアーゼ (Bethesda Research Laboratories) 中に30℃で30分間再懸濁する。 DNA溶液を70μlの10mM TRIS (pH7.5) 、1mM EDTA、で中和し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させる。ペレットを50μlの緩衝液(20mM TRIS−酢酸塩 (pH 7.9) 、10mM 酢酸マグネシウム、50mM 酢酸カリウム、1mM DTT、各 0.5mMのdGTP, dATP, dTTP及びdCTP) 中で25℃で15分間、 7.5ユニットのT4ポリメラーゼ (Invitrogen) で処理する。EDTAの20mMまでの添加により反応を停止させ、続いてフェノール抽出及びエタノール沈殿をする。この手順の結果は、 DNAリンカーの付着及び任意のベクターへのクローン化に適切なブラント末端の二本鎖cDNAである。
EcoRIリンカーを有するcDNAをアガロース上で分画し、 0.7Kbまたはそれよりも大きい分子サイズのcDNAを得る。cDNAを電気溶出によりゲルから回収し、フェノール抽出及びエタノール沈殿により製造する。サイズ分画化されたcDNAをラムダcDNAライブラリーを構築するのに用いる。cDNAをラムダZIPLOXarms (Gibco BRL)中にクローン化する。全長さのcDNAクローンを、前述のようにプラークリフト及び DNAハイブリダイズ技術により、プローブとしての 467塩基対のジオキシゲニン標識化フラグメント (ゲノムクローンの 336〜803 塩基対)を用いて同定する。全長さのcDNAを製造者(Gibco BRLからの株及びプラスミド) により記載されているようにプラスミドpZL1中に回復する。
全長さのcDNAを配列決定し、ゲノム DNAと比較する。ゲノム DNAは長さ2052塩基対で、3つのイントロンを含有する。プレ−プロp45メタロプロテアーゼの予期されたコード領域は、配列番号1に示されるように、推定の18アミノ酸シグナル配列、 226アミノ酸プロ領域及び 388アミノ酸成熟領域からなる。
フザリウム・オキシスポルムp45メタロプロテアーゼプローブの調製
上記cDNAライブラリーからのクローンを選択し、pDM115と呼んだ。プラスミドpDM115はフザリウム・オキシスポルムのcDNAの1.76Kbフラグメントを含有し、それはp45遺伝子の部分をコードする。このプラスミドを SalIで消化し、そのフラグメントを1%のアガロースゲル上で分離した。 1.5Kbのフラグメントを切り出し、 DNAを溶出した。このフラグメントをランダム開始標識化により、32−P−dATPで標識化し、サザンまたはコロニーリフトプロービングのいずれかに使用した。
上記cDNAライブラリーからのクローンを選択し、pDM115と呼んだ。プラスミドpDM115はフザリウム・オキシスポルムのcDNAの1.76Kbフラグメントを含有し、それはp45遺伝子の部分をコードする。このプラスミドを SalIで消化し、そのフラグメントを1%のアガロースゲル上で分離した。 1.5Kbのフラグメントを切り出し、 DNAを溶出した。このフラグメントをランダム開始標識化により、32−P−dATPで標識化し、サザンまたはコロニーリフトプロービングのいずれかに使用した。
フザリウム・オキシスポルムp45プローブを用いるアスペルギルス・オリザエライブラリーのスクリーニング
ライブラリー中で個々に凍結したコロニーをLB−プレート(100μg/mlのアンピシリン) 上にミクロタイタープレート中に半分はめ込む、6×8ピンを備えた多ピン装置を用いることによって接種した。プレートはライブラリー中のすべてのクローンからのコロニーを含有するように作られた。このプレートを37℃で一晩インキュベートした。ペトリ皿の大きさに切断された殺菌された Whatman 540フィルターを37℃で2時間より長くインキュベートされたコロニー上に置いた。そのフィルターを 200μg/mlのクロラムフェニコールを含有しているLBプレート上に移し、そのプレートを37℃で一晩インキュベートした。次の日、フィルターを 0.5M NaOH中で5分間、2回洗浄し、次いで 0.5M TRIS−塩酸(pH 7.4) 中で5分間2回洗浄し、次いで2×SSC 中で5分間2回洗浄した。フィルターをエタノールで濡らし、空気乾燥した。
ライブラリー中で個々に凍結したコロニーをLB−プレート(100μg/mlのアンピシリン) 上にミクロタイタープレート中に半分はめ込む、6×8ピンを備えた多ピン装置を用いることによって接種した。プレートはライブラリー中のすべてのクローンからのコロニーを含有するように作られた。このプレートを37℃で一晩インキュベートした。ペトリ皿の大きさに切断された殺菌された Whatman 540フィルターを37℃で2時間より長くインキュベートされたコロニー上に置いた。そのフィルターを 200μg/mlのクロラムフェニコールを含有しているLBプレート上に移し、そのプレートを37℃で一晩インキュベートした。次の日、フィルターを 0.5M NaOH中で5分間、2回洗浄し、次いで 0.5M TRIS−塩酸(pH 7.4) 中で5分間2回洗浄し、次いで2×SSC 中で5分間2回洗浄した。フィルターをエタノールで濡らし、空気乾燥した。
フィルターをフザリウム・オキシスポルムからのプロテアーゼ遺伝子を含有するpDM115からの 1.5Kbの32P標識化 DNAフラグメントでハイブリダイズした。ハイブリダイズは10×デンハルト、5×SSC 、0.02M EDTA、1%の SDS、0.15mg/mlのポリA及び0.05mg/mlの酵母tRNA中で65℃で16時間行なわれた。ハイブリダイズ後、フィルターを2×SSC 、 0.1%の SDS中で65℃で2回洗浄し、X線フィルム上に置いた。3つのコロニー、すなわち、3E8, 3C1及び2A5(名称はライブラリー中のそれらの位置に関する)がそのプローブへのハイブリダイズを示した。
コスミドクローンの特徴づけ
制限分析により、3つのコスミドの内2つの(3E8及び3C1)は、アスペルギルス・オリザエのゲノムと同じ領域から由来の挿入物を含有したことが立証された。
制限分析により、3つのコスミドの内2つの(3E8及び3C1)は、アスペルギルス・オリザエのゲノムと同じ領域から由来の挿入物を含有したことが立証された。
3μgのコスミド DNAをEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分画した。その DNAをイムモビラン(Immobilan) −N膜フィルターに移し、pDM115からの 1.5Kbの放射能標識化プローブとハイブリダイズした。プローブは両方のコスミドクローン中の4KbのEcoRIフラグメントにハイブリダイズした。 4.0KbのEcoRIフラグメントをさらなる分析のために選択した。
プラスミドpToC65へのNpIのクローン化とその配列
製造者の指示に従って、プラスミドpToC65を SacIで消化し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理し、5′−リン酸塩基を除去した。その後、それをフェノールで抽出し、沈殿させた。
製造者の指示に従って、プラスミドpToC65を SacIで消化し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理し、5′−リン酸塩基を除去した。その後、それをフェノールで抽出し、沈殿させた。
アスペルギルス・オリザエのNpI遺伝子を含有しているコスミドクローン 3E8からの 5.5Kbの SacIフラグメントをゲル電気泳動により単離し、精製した。
2つのフラグメントをいっしょに混合し、結合させた。大腸菌の形質転換後、正しいプラスミドを担持するコロニーをミニ−プラスミド調製物の制限酵素消化により同定した。このプラスミドを pJaL389と呼んだ。
このサブクローンの一部の DNA配列分析の他の公知のNpI遺伝子配列との比較を、そのサブクローンがアスペルギルス・オリザエのNpI遺伝子のコード領域を含有することを同定するのに用いた。
例 2
アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼNpIのゲノム破壊
NpIの産生が特異的に欠けているアスペルギルス・オリザエの株を生じさせるために、ミラー他(「Mol. Cell. Biol.」 5, p.1714〜1721, 1985年)により記載されているような遺伝子置換方法を用いた。下記に、これらの実験をもっと詳細に記載する。
アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼNpIのゲノム破壊
NpIの産生が特異的に欠けているアスペルギルス・オリザエの株を生じさせるために、ミラー他(「Mol. Cell. Biol.」 5, p.1714〜1721, 1985年)により記載されているような遺伝子置換方法を用いた。下記に、これらの実験をもっと詳細に記載する。
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子のクローン化
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子との交差ハイブリダイズによりクローン化した〔W. van Hartingsveldt他「Mol. Gen. Genet 」 206, p.71〜75, 1987年〕。アスペルギルス・オリザエ IFO 4177の DNAの部分 SauIIIA消化のラムダライブラリーを、アスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子からの1Kbの DNAフラグメントと低ストリンジェントでプローブした。陽性クローンからの DNAをpUC118ベクター中にサブクローン化した。生じたプラスミドであるpSO2はアスペルギルス・ニガーのpyrG−変異体の相補性により、pyrG遺伝子を含有していることが証明された(図1参照)。
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子との交差ハイブリダイズによりクローン化した〔W. van Hartingsveldt他「Mol. Gen. Genet 」 206, p.71〜75, 1987年〕。アスペルギルス・オリザエ IFO 4177の DNAの部分 SauIIIA消化のラムダライブラリーを、アスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子からの1Kbの DNAフラグメントと低ストリンジェントでプローブした。陽性クローンからの DNAをpUC118ベクター中にサブクローン化した。生じたプラスミドであるpSO2はアスペルギルス・ニガーのpyrG−変異体の相補性により、pyrG遺伝子を含有していることが証明された(図1参照)。
アスペルギルス・オリザエpyrG欠損菌株の構築
各末端に約1KbのpyrGフランキング配列を含有しているpyrG欠損プラスミドである、pSO5をプラスミドpSO2から構築した。菌株アスペルギルス・オリザエ IFO 4177をこの構築物で形質転換し、形質転換体を、pyrG変異体の表現型特性である、5−フルオル−オロチン酸耐性により選択した。
各末端に約1KbのpyrGフランキング配列を含有しているpyrG欠損プラスミドである、pSO5をプラスミドpSO2から構築した。菌株アスペルギルス・オリザエ IFO 4177をこの構築物で形質転換し、形質転換体を、pyrG変異体の表現型特性である、5−フルオル−オロチン酸耐性により選択した。
1つの形質転換体、 HowB101は、サザン分析により、pyrG座に予期された欠失があることが証明された。pyrG変異体であるので、 HowB101は増殖のためにウリジンを必要とする。 HowB101は、ウリジン無しで増殖するための能力についての選択により、 wt pyrG遺伝子で形質転換することができる。
HowB101の構築に包含される段階は、図2に図解されている。
プラスミド pJaL335の構築
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子の5′末端から、 479ヌクレオチド上流に位置する 431塩基対のフラグメントを増殖するために、次の2つのオリゴヌクレオチドを作成した。プライマーA:GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC (配列番号5)及びプライマーB:GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC (配列番号6)である。下線の部分はアスペルギルス・オリザエpyrG遺伝子配列に相当する。
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子の5′末端から、 479ヌクレオチド上流に位置する 431塩基対のフラグメントを増殖するために、次の2つのオリゴヌクレオチドを作成した。プライマーA:GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC (配列番号5)及びプライマーB:GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC (配列番号6)である。下線の部分はアスペルギルス・オリザエpyrG遺伝子配列に相当する。
そのプライマーの5′末端はクローン化を容易にするためであった(プライマーAは BglII制限エンドヌクレアーゼ部位を含有し、プライマーBはEcoRI及び HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。)
プラスミドpSO2は PCR反応で鋳型として用いられた。増幅を、 2.5ユニットの Taq−ポリメラーゼ、 100ngのpSO2、50mM KCl、10mM Tris−塩酸 (pH 8.0) 、 1.5mM MgCl2、 250nMの各dNTP及び上記2つのプライマー各10pmolを含有している 100μl容積中で行なった。
プラスミドpSO2は PCR反応で鋳型として用いられた。増幅を、 2.5ユニットの Taq−ポリメラーゼ、 100ngのpSO2、50mM KCl、10mM Tris−塩酸 (pH 8.0) 、 1.5mM MgCl2、 250nMの各dNTP及び上記2つのプライマー各10pmolを含有している 100μl容積中で行なった。
増幅をPerkin−Elmer Cetus DNA Termal 480中で実施し、94℃で3分間の1サイクル、それに続く、94℃で1分間、55℃で30秒間及び72℃で1分間の25サイクルからなる。 PCR反応は、長さ 430塩基対の1つの DNAフラグメントを産生した。このフラグメントを BglII及びEcoRIで消化し、ゲル電気泳動により単離した。それを精製し、プラスミドpSO2中の相当する部位にクローン化した。生じたプラスミドを pJaL335と呼んだ。 pJaL335の構築を図3に図解する。
破壊プラスミド pJaL399の構築
プラスミド pJaL389を BalIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理してブラント末端を作った。 7.1Kbのフラグメントをゲル電気泳動で単離し、精製した。この DNAフラグメントを、次いで製造者の指示に従って、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理して、5′リン酸塩基を取り除き、フェノール抽出し、沈殿させた。
プラスミド pJaL389を BalIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理してブラント末端を作った。 7.1Kbのフラグメントをゲル電気泳動で単離し、精製した。この DNAフラグメントを、次いで製造者の指示に従って、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理して、5′リン酸塩基を取り除き、フェノール抽出し、沈殿させた。
プラスミド pJaL335を HindIIIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理し、ブラント末端を作った。アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をコードする 3.5Kbのフラグメントをゲル電気泳動で単離し、精製した。
2つのフラグメントをいっしょに混合して、結合した。大腸菌の形質転換後、正しいプラスミドを担持するコロニーをミニ−プラスミド調製物の制限酵素消化により同定した。 pJaL399の構築を図4に図解する。
pJaL399は SacI部位に隣接したNpI遺伝子を担持するフラグメントを含有するpToC65ベクターを保持し、そこで、中央の 1.1Kbの BalIフラグメントはアスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をコードする 3.5Kbの DNAフラグメントにより置換されていた。
アスペルギルス・オリザエの形質転換
15μgのプラスミド pJaL399を SacIにより完全に消化する。消化の完全性をゲル上にアリコートを流すことにより調べ、 DNAの残りをフェノール抽出し、沈殿させ、108,25μlの無菌水中に再懸濁する。
15μgのプラスミド pJaL399を SacIにより完全に消化する。消化の完全性をゲル上にアリコートを流すことにより調べ、 DNAの残りをフェノール抽出し、沈殿させ、108,25μlの無菌水中に再懸濁する。
アスペルギルス・オリザエ HowB101宿主株の形質転換をプロトプラスト法により実施する〔 Christensen他「Biotechnology 」 6,p.1419〜1422, 1988年〕。典型的には、アスペルギルス・オリザエ菌糸体を栄養リッチブロス中で増殖させる。菌糸体をろ過によりブロスから分離する。Novozyme (商標、Novo Nordisk A/S, デンマークから入手できる) を浸透圧的に安定化されている緩衝液、たとえばリン酸ナトリウムでpH 5.0に緩衝化された 1.2M MgSO4中の菌糸体に加える。懸濁液を撹拌しながら、37℃で60分間インキュベートする。プロトプラストをミラークロスを通してろ過し、菌糸体の破片を除去する。プロトプラストを収集し、 STC〔 1.2M ソルビトール、10mM CaCl2、 10mM Tris−塩酸 (pH 7.5)〕で2回洗浄する。最後にプロトプラストを 200〜1000μlの STC中に再懸濁する。
形質転換のために、5μgの DNAを 100μlのプロトプラスト懸濁液に加える。 200μlの PEG溶液〔60% PEG4000、10mM CaCl2、 10mM Tris−塩酸 (pH 7.5)〕を加えた。そして、混合物を室温で20分間インキュベートする。プロトプラストを収集し、 1.2M ソルビトールで2回洗浄する。プロトプラストを最後に 200μlの 1.2Mのソルビトール中に再懸濁し、選択プレート〔最少培地+10g/lの Bacto−Agar (Difco)〕上に塗布し、37℃でインキュベートする。37℃で3〜4日の増殖後、安定な形質転換体が、活発に増殖している及び胞子形成しているコロニーとして現われるだろう。
遺伝子破壊の同定
安定なコロニーから、個々の胞子を新鮮な最少プレート上に画線する。単独のコロニーを選択し、再度画線し、純粋な培養を得る。これらを10mlの液状 YPM培地(1% 酵母抽出物、1% ペプトン、2% マルトース)に接種するのに用いる。30℃で18時間及び180rpmでの振盪後、菌糸体をろ紙上に収集する。菌糸体を次に2mlのエッペンドルフ管に移し、凍結乾燥する。
安定なコロニーから、個々の胞子を新鮮な最少プレート上に画線する。単独のコロニーを選択し、再度画線し、純粋な培養を得る。これらを10mlの液状 YPM培地(1% 酵母抽出物、1% ペプトン、2% マルトース)に接種するのに用いる。30℃で18時間及び180rpmでの振盪後、菌糸体をろ紙上に収集する。菌糸体を次に2mlのエッペンドルフ管に移し、凍結乾燥する。
凍結乾燥後、その管の中で乳棒で菌糸体を細かい粉にすることによって、 DNAを個々の菌糸体から調製する。この粉末を 0.5mlの 50mM EDTA (pH 8.0) 、 0.2% SDS、1μl DEP中に、渦を巻かせることにより再懸濁する。65℃で20分間のインキュベーション後、 0.1mlの5M KAc (pH 6.5) を加え、その溶液を混合し、氷上で5分間インキュベートする。細胞の破片を、 20,000rpm、5分間の遠心により、 DNA溶液から分離する。 0.4mlの上清を 0.3mlのイソプロパノールで沈殿させ、 20,000rpmで10分間遠心する。 DNAペレットを 0.1mg/mlの RNAアーゼAを含有している 100μlの無菌TE緩衝液中に再溶解する。
3μgの各 DNAを BalIで消化し、アガロースゲル電気泳動により分画し、イムモビラン−N膜フィルターに移す。このフィルターをNpIプロテアーゼ遺伝子を含有している pJaL389からの 5.5Kbの32P標識化 DNA SacIフラグメントとハイブリダイズした。破壊NpI遺伝子を担う菌株は、 1.1Kbの BalIハイブリダイズフラグメントを欠くこと、並びに他の2つのフランキングフラグメントの変更された移動性を有することにより認識される。
例 3
アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼII(NpII)のクローン化
pJaL198の構築
出版されたアスペルギルス・オリザエのNpIIをコードするcDNAヌクレオチド配列〔 Tatsumi他「Mol. Gen. Genet.」 228, p.97〜103, 1991年〕から、NpII遺伝子のコード部が PCR反応中で増幅されるように、2つのオリゴヌクレオチドを設計した。
アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼII(NpII)のクローン化
pJaL198の構築
出版されたアスペルギルス・オリザエのNpIIをコードするcDNAヌクレオチド配列〔 Tatsumi他「Mol. Gen. Genet.」 228, p.97〜103, 1991年〕から、NpII遺伝子のコード部が PCR反応中で増幅されるように、2つのオリゴヌクレオチドを設計した。
プライマー (CTAGGATCCAAGGCATTTATGCGTGTCACTACTCTC、配列番号7)を、そのヌクレオチド配列の3′末端がNpII遺伝子のN−末端部分(下線をひいた)に相当し、5′−末端がクローン化を容易にするためであるように、構築した(BamHI制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する)。
プライマー(CTACTCGAGTTAGCACTTGAGCTCGATAGC 、配列番号8)を、そのヌクレオチド配列の3′末端がNpII遺伝子のC−末端部(下線をひいた)に相当し、5′−末端がクローン化を容易にするためであるように構築した(XhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する)。
アスペルギルス・オリザエ IFO 4177からのゲノム DNAを PCR反応中で鋳型として用いた。増幅反応を 2.5ユニットの Taq−ポリメラーゼ、 100ngのアスペルギルス・オリザエのゲノム DNA、50mM KCl、 10mM Tris−塩酸 (pH 8.0) 、 1.5mM MgCl2、 250mMの各dNTP及び上記2つのプライマーの各 100pMを含有している 100μlの容量中で行なった。
増幅はPerkin−Elmer Cetus DNA Termal 480 中で実施し、94℃で3分間の1サイクル、続いて、94℃で1分間、55℃で30秒間及び72℃で1分間の25サイクルからなる。 PCR反応は、大きさ約 1.1Kbの1つの DNAフラグメントを産生する。このフラグメントをゲル電気泳動により単離し、精製し、ベクターpCR(商標) II (Invitrogen Corporation) 中にクローン化し、分子生物学の分野で公知の標準的方法を用いて配列決定した。生じるプラスミドを pJaL198と呼んだ。
例 4
NpIIのゲノム破壊
JaL121の構築
NpIIの産生を特異的に欠いているアスペルギルス・オリザエの株を生じさせるために、Miller他(「Mol. Cell. Biol.」 5, p.1714〜1721, 1985年) により記載されている遺伝子置換方法を用いた。
NpIIのゲノム破壊
JaL121の構築
NpIIの産生を特異的に欠いているアスペルギルス・オリザエの株を生じさせるために、Miller他(「Mol. Cell. Biol.」 5, p.1714〜1721, 1985年) により記載されている遺伝子置換方法を用いた。
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子のクローン化
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子との交差ハイブリダイズによりクローン化した〔W. van Hartingsveldt他「Mol. Gen. Genet.」 206, p.71〜75, 1987年〕。部分 SauIIIA消化アスペルギルス・オリザエ IFO 4177 DNAのラムダライブラリーをアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子からの1Kbの DNAフラグメントを用いて低ストリンジェントでプローブした。陽性のクローンからの DNAをpUC118ベクター中にサブクローン化した。生じたプラスミドである、pSO2は、アスペルギルス・ニガーのpyrG変異体の相補性によりpyrG遺伝子を含有することが証明された(図1参照)。
アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子との交差ハイブリダイズによりクローン化した〔W. van Hartingsveldt他「Mol. Gen. Genet.」 206, p.71〜75, 1987年〕。部分 SauIIIA消化アスペルギルス・オリザエ IFO 4177 DNAのラムダライブラリーをアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子からの1Kbの DNAフラグメントを用いて低ストリンジェントでプローブした。陽性のクローンからの DNAをpUC118ベクター中にサブクローン化した。生じたプラスミドである、pSO2は、アスペルギルス・ニガーのpyrG変異体の相補性によりpyrG遺伝子を含有することが証明された(図1参照)。
アスペルギルス・オリザエpyrG欠損株の構築
各末端に約1KbのpyrGフランキング配列を含有しているpyrG欠損プラスミドである、pSO5をプラスミドpSO2から構築した。株アスペルギルス・オリザエ IFO 4177をこの構築物で形質転換し、形質転換体を、pyrG変異体の表現型特性である、5−フルオル−オロチン酸耐性により選択した。1つの形質転換体、 HowB101は、サザン分析により、pyrG座に予期された欠失があることが証明された。pyrG変異体であるので、 HowB101は増殖のためにウリジンを必要とする。 HowB101は、ウリジン無しで増殖するための能力についての選択により、 wt pyrG遺伝子で形質転換することができる。
各末端に約1KbのpyrGフランキング配列を含有しているpyrG欠損プラスミドである、pSO5をプラスミドpSO2から構築した。株アスペルギルス・オリザエ IFO 4177をこの構築物で形質転換し、形質転換体を、pyrG変異体の表現型特性である、5−フルオル−オロチン酸耐性により選択した。1つの形質転換体、 HowB101は、サザン分析により、pyrG座に予期された欠失があることが証明された。pyrG変異体であるので、 HowB101は増殖のためにウリジンを必要とする。 HowB101は、ウリジン無しで増殖するための能力についての選択により、 wt pyrG遺伝子で形質転換することができる。
HowB101の構築に包含される段階は、図2に図解されている。
破壊プラスミド pJaL218の構築
プラスミド pJaL198をBstEIIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理してブラント末端を作った。 4.9Kbのフラグメントをゲル電気泳動で単離し、精製した。この DNAフラグメントを、次いで製造者の指示に従って、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理して、5′リン酸塩基を取り除き、フェノール抽出し、沈殿させた。
プラスミド pJaL198をBstEIIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理してブラント末端を作った。 4.9Kbのフラグメントをゲル電気泳動で単離し、精製した。この DNAフラグメントを、次いで製造者の指示に従って、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理して、5′リン酸塩基を取り除き、フェノール抽出し、沈殿させた。
プラスミドpJers4を HindIIIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理し、ブラント末端を作った。アスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をコードする 1.8Kbのフラグメントをゲル電気泳動で単離し、精製した。
2つのフラグメントを混合して、結合した。大腸菌 DH5αの形質転換後、正しいプラスミドを担持するコロニーをミニ−プラスミド調製物の制限酵素消化により同定した。 pJaL218の構築を図5に図解する。
pJaL218は、EcoRI部位により隣接されたNpII遺伝子を担持するフラグメントを含有するpCR(商標) IIベクターからなり、そこで中央のBstEIIフラグメントはアスペルギルス・オリザエのpyrG遺伝子をコードしている 1.8Kbの DNAフラグメントにより置換されていた。
アスペルギルス・オリザエの形質転換
15μgのプラスミド pJaL218を EcoRIにより完全に消化する。消化の完全性をゲル上にアリコートを流すことにより調べた。 DNAの残りをフェノール抽出し、沈殿させ、10μlの無菌水中に再懸濁した。
15μgのプラスミド pJaL218を EcoRIにより完全に消化する。消化の完全性をゲル上にアリコートを流すことにより調べた。 DNAの残りをフェノール抽出し、沈殿させ、10μlの無菌水中に再懸濁した。
アスペルギルス・オリザエ HowB101宿主株の形質転換をプロトプラスト法により実施した〔 Christensen他「Biotechnology 」 6,p.1419〜1422, 1988年〕。典型的には、アスペルギルス・オリザエ菌糸体を栄養リッチブロス中で増殖させた。菌糸体をろ過によりブロスから分離した。Novozyme (商標、Novo Nordisk A/S, デンマークから入手できる) を浸透圧的に安定化されている緩衝液、たとえばリン酸ナトリウムでpH 5.0に緩衝化された 1.2M MgSO4中の菌糸体に加えた。懸濁液を撹拌しながら、37℃で60分間インキュベートした。プロトプラストをミラークロスを通してろ過し、菌糸体の破片を除去した。プロトプラストを収集し、 STC〔 1.2M ソルビトール、10mM CaCl2、 10mM Tris−塩酸 (pH 7.5)〕で2回洗浄した。最後にプロトプラストを 200〜1000μlの STC中に再懸濁した。
形質転換のために、5μgの DNAを 100μlのプロトプラスト懸濁液に加えた。 200μlの PEG溶液〔60% PEG4000、10mM CaCl2、 10mM Tris−塩酸 (pH 7.5)〕を加えた。そして、混合物を周囲温度で20分間インキュベートする。プロトプラストを収集し、 1.2M ソルビトールで2回洗浄した。プロトプラストを最後に 200μlの 1.2M ソルビトール中に再懸濁し、選択プレート〔最少培地+10g/lの Bacto−Agar (Difco)〕上に塗布し、37℃でインキュベートした。
37℃で3〜4日の増殖後、安定な形質転換体が、活発に増殖している及び胞子形成しているコロニーとして現われる。
遺伝子破壊の同定
安定なコロニーから、個々の胞子を新鮮な最少プレート上に画線する。単独のコロニーを選択し、再度画線して純粋な培養を得る。
安定なコロニーから、個々の胞子を新鮮な最少プレート上に画線する。単独のコロニーを選択し、再度画線して純粋な培養を得る。
形質転換された DNAフラグメントが、 PCRにより染色体上の相当する遺伝子中に二重の交差により組込まれたかどうかを調べるために、33の形質転換体をスクリーニングした。 PCR反応及び形質転換体からのゲノム DNAは上記のように働いた。
用いられたプライマーはCCCTTCTTTCCAAACCG(配列番号9)(それはNpII遺伝子のコード領域から5′に位置する)及びpyrG−5′(GGGTGAGCCACTGCCTC、配列番号10)(それはpyrG遺伝子に特異的である)である。1つの形質転換体は、予期された 1.1Kbの PCR産物をもたらした。
形質転換体及びアスペルギルス・オリザエからのゲノム DNAがEcoRIで消化され、アガロースゲル電気泳動で分画され、イムモビラン−N膜フィルターに移され、NpII遺伝子を含有している pJaL198からの 1.1KbのEcoRIフラグメントとプローブされるサザンブロットから、 3.8Kbの野生型のバンドが形質転換体中の10Kbのバンドにシフトしたことが分かった。これは、形質転換された DNAが複数のコピーでNpII遺伝子中に組込まれたことを示す。この菌株をJaL121と呼んだ。
例 5
JaL121中のキモシンの産生
アスペルギルス・オリザエ菌株JaL121をプラスミドpToC56(図6参照)(それは哺乳類の酵素であるキモシンについての真菌の発現プラスミドである) と、pToC90との共形質転換により、形質転換した。プラスミドpToC56の構築はヨーロッパ特許出願公開第 98993号明細書に記載されている。
JaL121中のキモシンの産生
アスペルギルス・オリザエ菌株JaL121をプラスミドpToC56(図6参照)(それは哺乳類の酵素であるキモシンについての真菌の発現プラスミドである) と、pToC90との共形質転換により、形質転換した。プラスミドpToC56の構築はヨーロッパ特許出願公開第 98993号明細書に記載されている。
形質転換体は10mM アセトアミドを含有している最少培地上での増殖について選択し、キモシンを産生する能力によりpToC56の存在についてスクリーニングした。形質転換体を、マルトデキストリン、ひき割大豆粉及びペプトンを含有している培地中で、30℃で4日間振盪フラスコ中で増殖させた。アスペルギルス・オリザエ IFO4177におけるpToC56形質転換体をJaL121形質転換体といっしょに増殖させた。
各日、発酵ブロス試料を収集し、 SDS−Page及びウェスタンブロットを適用した。ブロット膜をキモシン特異的ウサギ抗体とインキュベートし、続いてペルオキシダーゼに結合したヤギ・ウサギ抗体とインキュベートした。
その膜の染色は、発酵の1日目と2日目には、アスペルギルス・オリザエ IFO 4177の形質転換体からの上清は少量のキモシンまたは他のその分解生成物を含有していたことを明らかにした。後では、キモシンは検出されなかった。それに対して、JaL121の形質転換体は少なくとも10倍の全サイズのキモシンを含有した。上清中のキモシンの量は最初の2〜3日について増加し、次いで一定のままであった。
本発明を添付図面を参照してさらに説明する。
プラスミドpSO2(例2参照)の地図を示す。
アスペルギルス・オリザエ株HowB101(例2参照)の構築を示す。
プラスミドpJaL335(例2参照)の構築を示す。
プラスミドpJaL339(例2参照)の構築を示す。
プラスミドpJaL218(例4参照)を示す。
プラスミドpToC56(例5参照)の地図を示す。
Claims (38)
- 異種タンパク質産物の発現のために有用な宿主細胞であって、親細胞に比較して、有意に低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現するために遺伝子的に修飾されているものである、前記細胞。
- 酵母細胞である、請求項1に記載の宿主細胞。
- サッカロミセス属の株、特にサッカロミセス・セレビシエである、請求項2に記載の宿主細胞。
- 糸状菌である、請求項1に記載の宿主細胞。
- 請求項4に記載の宿主細胞であって、アクレモニウム属、アスペルギルス属、カンジダ属、コクリオボルス属、エンドチア属、フザリウム属、フミコーラ属、ニューロスポラ属、リゾムコル属、リゾプス属、サーモミセス属、トリコデルマ属、ポドスポラ属、ピリクラリア属及びペニシリウム属からなる群から選択した株である、前記宿主細胞。
- 請求項5に記載の宿主細胞であって、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドラン、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエニシス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・フォエツス、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・ソラニ、フミコーラ・グリセア、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・クリソゲヌム、リゾムコル・メイヘイ、トリコデルマ・リーセイ及びトリコデルマ・ビリデからなる群から選択した株である、前記宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、その中の前記メタロプロテアーゼがフザリウム属のメタロプロテアーゼである、前記宿主細胞。
- 請求項7に記載の宿主細胞であって、その中の前記メタロプロテアーゼが、フザリウム・オキシスポルムのメタロプロテアーゼである、前記宿主細胞。
- 請求項8に記載の宿主細胞であって、その中の前記メタロプロテアーゼが、配列番号2として提示されたアミノ酸配列またはこれと相同の配列を有するフザリウム・オキシスポルムp45メタロプロテアーゼである、前記宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、その中の前記メタロプロテアーゼが約pH6〜8の範囲の最適タンパク質分解活性を有する中性メタロプロテアーゼである、前記宿主細胞。
- 請求項10に記載の宿主細胞であって、その中の前記メタロプロテアーゼがNpIまたはNpIIの群の中性のアスペルギルス属のメタロプロテアーゼである、前記宿主細胞。
- 請求項11に記載の宿主細胞であって、その中の前記メタロプロテアーゼが、配列番号4として提示された部分ヌクレオチド配列またはこれと相同の配列を含むcDNA配列によりコードされる、アスペルギルス・オリザエ中性メタロプロテアーゼI(NpI)である、前記宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、前記メタロプロテアーゼをコードする構造領域または調節領域で遺伝子的に修飾されたものである、前記宿主細胞。
- 請求項13に記載の宿主細胞であって、特異的もしくはランダム変異誘発、 PCR生成変異誘発、部位特異的 DNA欠失、挿入及び/もしくは置換、遺伝子破壊もしくは遺伝子置換技術、アンチセンス技術またはそれらの組合せにより遺伝子的に修飾されたものである、前記宿主。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、その細胞中で発現されたメタロプロテアーゼのレベルが約50%よりも多く、好ましくは約85%よりも多く、より好ましくは約90%よりも多く、最も好ましくは約95%よりも多く低下しているものである、前記宿主細胞。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、本質的にいかなるメタロプロテアーゼ活性をも欠いている、前記細胞。
- 請求項1の宿主細胞中で異種タンパク質産物を生産する方法であって、その方法は、
(a)前記宿主細胞に前記タンパク質産物をコードしている核酸配列を導入し、
(b)適当な増殖培地中で、(a)段階の宿主細胞を培養し、そして
(c)前記異種タンパク質産物を単離することを含むものである、前記方法。 - 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記宿主細胞がサッカロミセス属、好ましくはサッカロミセス・セレビシエである、請求項18に記載の方法。
- 前記宿主細胞が糸状菌である、請求項17に記載の方法。
- 請求項20に記載の方法であって、前記宿主細胞が、アクレモニウム属、アスペルギルス属、カンジダ属、コクリオボルス属、エンドチア属、フザリウム属、フミコーラ属、ニューロスポラ属、リゾムコル属、リゾプス属、サーモミセス属、トリコデルマ属、ポドスポラ属、ピリクラリア属及びペニシリウム属からなる群から選択した株である、前記方法。
- 請求項21に記載の方法であって、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドラン、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエニシス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・フォエツス、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・ソラニ、フミコーラ・グリセア、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・クリソゲヌム、リゾムコル・メイヘイ、トリコデルマ・リーセイ及びトリコデルマ・ビリデからなる群から選択した株である、前記方法。
- 請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法において、前記メタロプロテアーゼがフザリウム属のメタロプロテアーゼである、前記方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記メタロプロテアーゼが、フザリウム・オキシスポルムのメタロプロテアーゼである、前記方法。
- 請求項24に記載の方法であって、前記メタロプロテアーゼが、配列番号2として提示されたアミノ酸配列、またはそれに相同の配列を有している、フザリウム・オキシスポルムp45メタロプロテアーゼである、前記方法。
- 請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法であって、前記メタロプロテアーゼが約pH6〜8の範囲の最適タンパク質分解活性を有する中性メタロプロテアーゼである、前記方法。
- 請求項26に記載の方法であって、前記メタロプロテアーゼがNpIまたはNpIIの群の中性のアスペルギルス属のメタロプロテアーゼである、前記方法。
- 請求項27に記載の方法であって、前記メタロプロテアーゼが、配列番号4として提示された部分ヌクレオチド配列またはそれと相同の配列を含むcDNA配列によりコードされる、アスペルギルス・オリザエの中性メタロプロテアーゼI(NpI)である、前記方法。
- 請求項17〜28のいずれか1項に記載の方法であって、前記宿主細胞が前記メタロプロテアーゼをコードする構造領域または調節領域で遺伝子的に修飾されたものである、前記方法。
- 請求項29に記載の方法であって、前記宿主細胞は、特異的もしくはランダム変異誘発、 PCR生成変異誘発、部位特異的 DNA欠失、挿入及び/もしくは置換、遺伝子破壊もしくは遺伝子置換技術、アンチセンス技術またはそれらの組合せにより遺伝子的に修飾されたものである、前記宿主。
- 請求項17〜30のいずれか1項に記載の方法であって、宿主細胞により発現されたメタロプロテアーゼのレベルが、50%よりも多く、好ましくは85%よりも多く、より好ましくは90%よりも多く、最も好ましくは95%よりも多く低下している、前記方法。
- 請求項17〜30のいずれか1項に記載の方法であって、前記宿主細胞により発現された産物が、本質的にいかなるメタロプロテアーゼ活性をも欠いている、前記方法。
- 請求項17〜32のいずれか1項に記載の方法であって、前記タンパク質産物が、真核の酵素、たとえばインスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF、 VII因子、VIII因子、ウロキナーゼ、 EPO、キモシン、組織プラスミノーゲン活性化剤または血清アルブミンである、前記方法。
- 請求項17〜32のいずれか1項に記載の方法であって、前記タンパク質産物が真菌起源のタンパク質である、前記方法。
- 請求項34に記載の方法であって、前記タンパク質産物が、真菌の酵素、特にアミロース分解酵素、たとえば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルロース分解酵素、脂質分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、たとえば、ペルオキシダーゼもしくはラッカーゼ、ペクチナーゼ、またはクチナーゼである、前記方法。
- 請求項17〜32のいずれか1項に記載の方法であって、前記タンパク質産物が細菌のタンパク質である、前記方法。
- 請求項36に記載の方法であって、前記タンパク質産物が、細菌の酵素、特にアミロース分解酵素、たとえば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルロース分解酵素、脂質分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、たとえば、ペルオキシダーゼもしくはラッカーゼ、ペクチナーゼまたはクチナーゼである、前記方法。
- 請求項17〜37のいずれか1項に記載の方法であって、前記タンパク質産物が、前駆体タンパク質、すなわち、チモーゲン、ハイブリッドタンパク質、プロ配列もしくはプレ−プロ配列として得られた、または未成熟の形のタンパク質である、前記方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK28495 | 1995-03-20 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52799896A Division JP3974171B2 (ja) | 1995-03-20 | 1996-03-20 | 低下したレベルのメタロプロテアーゼを発見する宿主細胞及びその細胞をタンパク質の生産に用いる方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006204304A true JP2006204304A (ja) | 2006-08-10 |
Family
ID=8091831
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52799896A Expired - Lifetime JP3974171B2 (ja) | 1995-03-20 | 1996-03-20 | 低下したレベルのメタロプロテアーゼを発見する宿主細胞及びその細胞をタンパク質の生産に用いる方法 |
JP2006072788A Pending JP2006204304A (ja) | 1995-03-20 | 2006-03-16 | 低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現する宿主細胞及びその細胞をタンパク質の生産に用いる方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52799896A Expired - Lifetime JP3974171B2 (ja) | 1995-03-20 | 1996-03-20 | 低下したレベルのメタロプロテアーゼを発見する宿主細胞及びその細胞をタンパク質の生産に用いる方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5861280A (ja) |
EP (1) | EP0815200B1 (ja) |
JP (2) | JP3974171B2 (ja) |
CN (2) | CN1225550C (ja) |
AT (1) | ATE353953T1 (ja) |
AU (1) | AU4940096A (ja) |
DE (1) | DE69636899T2 (ja) |
DK (1) | DK0815200T3 (ja) |
ES (1) | ES2281079T3 (ja) |
WO (1) | WO1996029391A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010515153A (ja) * | 2006-12-27 | 2010-05-06 | イマージョン コーポレイション | 振動触感フィードバックによる仮想回り止め機構 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5776730A (en) * | 1995-12-15 | 1998-07-07 | University Of Hawaii | Neurospora hosts for the production of recombinant proteins, and methods for producing same |
ES2256895T3 (es) | 1996-09-19 | 2006-07-16 | Novozymes A/S | Celulas huesped y metodos de produccion de proteinas. |
US7883872B2 (en) | 1996-10-10 | 2011-02-08 | Dyadic International (Usa), Inc. | Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose |
US6015703A (en) * | 1998-03-10 | 2000-01-18 | Iogen Corporation | Genetic constructs and genetically modified microbes for enhanced production of beta-glucosidase |
AU4188099A (en) * | 1998-05-15 | 1999-12-06 | Novo Nordisk A/S | Methods for producing polypeptides in filamentous fungal mutant cells |
EA005682B1 (ru) | 1998-10-06 | 2005-04-28 | Марк Аарон Эмалфарб | Трансформированные грибы, в частности рода chrysosporium, способные к синтезу гетерологичных полипептидов |
CA2344619C (en) | 1998-10-26 | 2012-01-03 | Novozymes A/S | Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells |
US7063962B2 (en) | 2001-07-20 | 2006-06-20 | Novozymes A/S | DNA sequences for regulating transcription |
CA2499467A1 (en) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Cym1P A/S | Methods for increasing the production of a recombinant polypeptide from a host cell |
US7169881B2 (en) * | 2004-10-29 | 2007-01-30 | Clariant (France) | Aminoplast resin compositions |
EP2505651A3 (en) | 2006-12-10 | 2013-01-09 | Dyadic International, Inc. | Isolated fungus with reduced protease activity |
WO2009033071A2 (en) | 2007-09-07 | 2009-03-12 | Dyadic International, Inc. | Novel fungal enzymes |
JP6245528B2 (ja) | 2012-01-05 | 2017-12-13 | グリコス・フィンランド・オーワイGlykos Finland Oy | プロテアーゼ欠損糸状菌細胞及びその使用方法 |
WO2013174927A1 (en) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Novartis International Pharmaceutical Limited | Production of fucosylated glycoproteins |
CN105980552A (zh) | 2013-07-10 | 2016-09-28 | 诺华股份有限公司 | 多种蛋白酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法 |
CN104711242B (zh) * | 2013-12-12 | 2017-11-10 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种中性蛋白酶及其应用 |
CN104711200B (zh) * | 2013-12-12 | 2018-01-16 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种中性蛋白酶生产菌株及其应用 |
SG11201700446XA (en) | 2014-07-21 | 2017-02-27 | Glykos Finland Oy | Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi |
EP4263822A1 (en) | 2020-12-15 | 2023-10-25 | Novozymes A/S | Mutated host cells with reduced cell motility |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0327797B1 (de) * | 1988-01-05 | 2003-09-03 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen Genprodukten |
AU614121B2 (en) * | 1988-05-04 | 1991-08-22 | Novartis Ag | Improvements in the production of polypeptides |
CA1333777C (en) * | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
JPH06506117A (ja) * | 1991-04-01 | 1994-07-14 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | ピキア(Pichia)蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用 |
IL102259A0 (en) * | 1991-07-01 | 1993-01-14 | Amgen Inc | Isolation and characterization of a protease from streptomyces lividans |
-
1996
- 1996-03-20 CN CN96192700.3A patent/CN1225550C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-20 WO PCT/DK1996/000111 patent/WO1996029391A1/en active IP Right Grant
- 1996-03-20 AU AU49400/96A patent/AU4940096A/en not_active Abandoned
- 1996-03-20 DE DE69636899T patent/DE69636899T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-20 US US08/894,772 patent/US5861280A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-20 EP EP96905768A patent/EP0815200B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-20 ES ES96905768T patent/ES2281079T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-20 CN CN200510093993.2A patent/CN1769423A/zh active Pending
- 1996-03-20 AT AT96905768T patent/ATE353953T1/de active
- 1996-03-20 JP JP52799896A patent/JP3974171B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-20 DK DK96905768T patent/DK0815200T3/da active
-
1998
- 1998-12-08 US US09/207,844 patent/US5968774A/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-03-16 JP JP2006072788A patent/JP2006204304A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010515153A (ja) * | 2006-12-27 | 2010-05-06 | イマージョン コーポレイション | 振動触感フィードバックによる仮想回り止め機構 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1225550C (zh) | 2005-11-02 |
DE69636899T2 (de) | 2007-10-31 |
JPH11502111A (ja) | 1999-02-23 |
US5968774A (en) | 1999-10-19 |
WO1996029391A1 (en) | 1996-09-26 |
US5861280A (en) | 1999-01-19 |
CN1769423A (zh) | 2006-05-10 |
ATE353953T1 (de) | 2007-03-15 |
ES2281079T3 (es) | 2007-09-16 |
EP0815200B1 (en) | 2007-02-14 |
AU4940096A (en) | 1996-10-08 |
JP3974171B2 (ja) | 2007-09-12 |
DK0815200T3 (da) | 2007-06-11 |
CN1179178A (zh) | 1998-04-15 |
EP0815200A1 (en) | 1998-01-07 |
DE69636899D1 (de) | 2007-03-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006204304A (ja) | 低下したレベルのメタロプロテアーゼを発現する宿主細胞及びその細胞をタンパク質の生産に用いる方法 | |
JP4091119B2 (ja) | 新規な宿主細胞およびタンパク質生産方法 | |
EP0894126B1 (en) | Alkaline protease deficient filamentous fungi | |
EP0770139B1 (en) | A FUNGUS WHEREIN THE areA GENE HAS BEEN MODIFIED AND AN areA GENE FROM ASPERGILLUS ORYZAE | |
US9593342B2 (en) | Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of Fusarium venentatum | |
JP2002539793A (ja) | 菌類細胞中で遺伝子を発現させるためのプロモーター | |
JP2012524530A (ja) | 対象組換えポリペプチドの産生方法 | |
JP2007267752A (ja) | areA,pepC及び/又はpepE遺伝子及びプロテアーゼ | |
US5702934A (en) | Processes for producing an enzyme | |
JP2002515252A (ja) | 糸状菌変異体細胞においてポリペプチドを生産するための方法 | |
JP2002536993A (ja) | オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥真菌宿主細胞 | |
JP2003532379A (ja) | 共通翻訳開始配列を用いるポリペプチドの産生方法 | |
JP2002535990A (ja) | 真菌細胞においてポリペプチドを生産する方法 | |
EP2652138B1 (en) | Promoters for expressing genes in a fungal cell | |
JPH0823984A (ja) | 発現系、組込みベクター及びその組込みベクターによって形質転換された細胞 | |
EP1515986A1 (en) | Improved method of producing an aspartic protease in a recombinant host organism | |
JPH0538289A (ja) | 蛋白質の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061003 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070320 |