JP5060958B2 - 多価組換え抗原のコンビナトリアルベースの生産のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、全体として参照により本明細書によって組み入れられる、2004年10月15日に提出された米国仮出願第60/619,364号と関連する。
開示される発明は、分子生物学の分野、および病原性生物に対する多価ワクチンの生産に関する。本発明の一つの態様は、多価ワクチンの集団を生産するのに使用され得るヘテロカリオン性(heterokaryotic)糸状菌において抗原をコードするヌクレオチド配列の集団を提供する方法および組成物を、具体的に提供する。
ワクチンは、現今、様々な方法によって生産される。典型的には、インフルエンザワクチンは、受精した鶏卵を用いて生産される。米国においては、the Centers for Disease Controlが、特定のインフルエンザの季節において、攻撃する可能性が最も高いウイルスを代表すると考えられる3種類のウイルス株を選択するであろう。選択されたウイルスの試料は、所望の抗原性の特徴を所有する種ウイルスストックとして、製造業者に提供される。種ウイルスは受精した鶏卵中に注入される。これらの卵は、インフルエンザウイルスが増殖する間インキュベーションされる。適当な期間の後、卵が開けられて、卵白が採取される。この試料がウイルスを含む。ウイルスは卵材料より精製されて、不活性化される。個々のウイルスストックは、その後、典型的には三価のワクチンである、共通インフルエンザワクチンを創出するために混合される。
真菌における異種遺伝子のクローニングおよび発現は、様々な有用タンパク質を生産するのに使用されてきた。例えば:Lambowitz、米国特許第4,486,533号は、ミトコンドリアプラスミドDNAによる糸状菌のためのDNAベクターの自律複製、ならびに、ニューロスポラ属(Neurospora)への異種遺伝子の導入および発現を開示する;Yeltonら、米国特許第4,816,405号は、大量の所望の異種タンパク質を生産し、かつ分泌するために、糸状子嚢菌の重要な株の修飾を可能にする道具および系を開示する;Buxtonら、米国特許第4,885,249号は、宿主アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)細胞へ組み込まれ得る選択マーカーを含むDNAベクターによるA.ニガーの形質転換を開示する;および、McKnightら、米国特許第4,935,349号は、アスペルギルス属(Aspergillus)および他の糸状菌において、異種遺伝子の発現を指示し得るプロモーターを含む、アスペルギルス属において高等真核生物遺伝子を発現するための方法を開示する。同様の技術は、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)("N. クラッサ")においてアミノ酸輸送に関与するmtr遺伝子をクローン化し、かつ、クローン化DNAの、インビボにおいてこの遺伝子に隣接するゲノムマーカーへの強い関連を立証するために使用されてきた。Stuart, W. D. et al., Genome (1988)30:198-203; Koo, K. and Stuart, W. D. Genome (1991)34:644-651。
本発明は、多価ワクチンを生産するヘテロカリオン糸状菌を提供する。
「ヘテロカリオン」(またはヘテロカリオン性細胞)は、二つ(またはそれ以上)の糸状菌親株の融合より形成される細胞であり、こうして各ヘテロカリオン細胞は二つ(またはそれ以上)の遺伝的に異なる核を含む。ヘテロカリオンは、すべてのヘテロカリオン適合性アリルについて一般に同型接合である(tol遺伝子が存在する場合、交配型アリルを除いて)親株由来の核を含む。少なくとも10個の染色体座(het-c、het-d、het-e、het-i、het-5、het-6、het-7、het-8、het-9、およびhet-10)が、ヘテロカリオン不適合性について同定されてきており、かつ、それ以上が存在することが推測されている。Peris et al., "Chromosomal Loci of Neurospora crassa", Microbiological Reviews (1982) 46:426-570, at 478。
本発明は、多価ワクチンの集団を産生するための新規の方法および組成物を提供する。多価ワクチンは、定義された抗原の、順序づけられた、またはランダムな組み合わせより産生される。多価ワクチンを取得するために、多価ワクチンの定義された抗原をコードする第一、第二、および時には第三またはそれ以上のDNA分子の集団を、第一、第二の真菌の、および時には第三またはそれ以上の宿主親に導入する段階、第一、第二、および時には第三またはそれ以上の宿主真菌親を用いてヘテロカリオン性真菌株を形成する段階、および、その後、適切である場合は、所望の性質を有する多価ワクチンの生産のために、結果として生じたヘテロカリオンをDNAをコードするサブユニットが発現する条件の下で培養する段階、および、結果として生じたヘテロカリオンを更にスクリーニングする段階を含む方法において、ヘテロカリオンが取得される。各要素、すなわち、真菌親、DNA分子、および融合方法は、以下に詳細に記述される。
真菌は、糸状多核鎖をもたらす単一の単核細胞、酵母細胞、多様な胞子を伴う子実体、および/または有性的に分化された細胞として生育し得る。それらはまた、多核形態においても存在し得る。カビとしての真菌の成長形態の主な要素は、直径約2μm〜10μmの分岐した管状構造である菌糸である。菌糸は、先端での伸長(頂端生長)および側面の分岐を生ずることによって、増殖する。このように、コロニーが増殖するとき、菌糸は多量の絡み合う繊維を形成する。
本発明を記述するにあたって、以下の用語法が、下記に述べられた定義に従って使用されるであろう:
多価ワクチンの抗原をコードするヌクレオチド分子を含む発現ユニットは、周知の技術を用いて構築される。一般に、発現ユニットは、サブユニットをコードする配列を、最終的な糸状菌宿主においてサブユニットをコードする配列の発現を方向付ける制御配列との作動可能な連結に置くことによって、産生される。
本発明のヘテロカリオンを作製することにおいて使用される各親真菌株は、多価ワクチンの抗原をコードするDNA分子の集団のメンバーを含んでいるであろうため、一つの真菌親は、所望の多価ワクチンの第一の抗原または抗原群をコードする、第一のDNA分子の集団のメンバーを含むように修飾された核を有するであろうし、かつ、それぞれの次の真菌親は、所望の多価ワクチンの異なる抗原または抗原群をコードする、異なるDNA分子の集団のメンバーを含むように修飾された核を有するであろう。例えば、二価のインフルエンザワクチンを生産するヘテロカリオンを生産するために、一つの真菌親は、インフルエンザA型H1 N1からのcDNA由来の抗原群を生産するであろうし、一方、他方の真菌親は、インフルエンザA型H3 N2からのcDNA由来の抗原群を生産するであろう。三価のインフルエンザワクチンを生産するためには、一つの真菌親は、インフルエンザA型H1 N1からのcDNA由来の抗原群を生産するであろうし、第二の真菌親は、インフルエンザA型H3 N2からのcDNA由来の抗原群を生産するであろうし、かつ、第三の真菌親は、インフルエンザB型H NからのcDNA由来の抗原群を生産するであろう。ヌクレオチドおよびタンパク質配列は、公的に入手可能である。例えば、HA遺伝子についての例示的な配列は、H3N2(AY738729)、インフルエンザAウイルス(A/Leningrad/54/1(H1N1))ノイラミニダーゼ遺伝子(M38309)、インフルエンザAウイルス(A/Swine/Ontario/42729A/01(H3N3))ノイラミニダーゼ(NA)遺伝子(AY619975)、インフルエンザAウイルス(A/Swine/Ontario/K01477/01(H3N3))ノイラミニダーゼ(NA)遺伝子(AY619966)、インフルエンザAウイルス(A/Swine/Saskatchewan/18789/02(H1N1))ノイラミニダーゼ(NA)遺伝子(AY619960)、インフルエンザAウイルス(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1))セグメント6(NC004523)、インフルエンザAウイルス(A/mallard/Alberta/211/98(H1N1))ノイラミニダーゼ(NA)遺伝子(AY633214)、インフルエンザAウイルス(A/mallard/Alberta/99/91(H1N1))ノイラミニダーゼ(NA)遺伝子(AY207541)、およびインフルエンザAウイルス(A/duck/Miyagil/9/77(H1N1)ノイラミニダーゼ(NA)遺伝子(AY207534)を含む。
(1)ヒスチジン(his-1〜his-7変異株)、プロリン(aga変異株)、アルギニン(arg-11変異株)、シトルリン(arg-11変異株)、アスパラギン(asn変異株)、コリン(chol-1およびchol-2変異株)、システイン(cys-1変異株)、グルタミン(gln-1変異株)、ロイシン(leu-1〜leu-4)、リジン(lys-2、-4、および-5)、メチオチン(mac変異株、ならびにmet-6、-9、および-10変異株)、およびスレオニン(thr-2および-3変異株)のようなアミノ酸;
(2)p-アミノ安息香酸、チロシン、トリプトファン、およびフェニルアラニンの混合物(aro-6、aro-7、およびaro-8を除くすべてのaro株によって要求される)、トリプトファンおよびフェニルアラニンの混合物(aro-6変異株に要求される)、イソロイシンおよびバリンの混合物(ilv-1、-2、および-3に要求される)、および、フェニルアラニンおよびチロシンの混合物(pt変異株に要求される)のような、芳香族アミノ酸の混合物;
(3)パントテン酸(pan-1変異株)およびチアミン(thi-2およびthi-4変異株)のようなビタミン;
(4)アデニン(ad-2〜ad-4、およびad-8変異株)、ヒポキサンチン(ad-2およびad-3変異株)、イノシン、および、グアニンまたはグアノシン(gua-1または-2変異株)のようなプリン塩基;
(5)ウラシル(pyr-1〜pyr-6)のようなピリミジン塩基;
(6)飽和脂肪酸(cel変異株)、または、9位もしくは11位いずれかでシス構造において二重結合を有するC16もしくはC18脂肪酸、9位でのトランス配置における二重結合を伴う脂肪酸、および、メチレン架橋により分断される多数のシス二重結合を伴う脂肪酸(ufa-1および-2)のような不飽和脂肪酸;
(7)カリウム(trk)のような、生理学的に重要なイオン;
(8)イノシトール(acu変異株およびinl変異株)およびグリセロールのような糖アルコール;および
(9)酢酸塩(ace変異株)、I-ケトグルタル酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩、またはホルムアルデヒド(for変異株)、p-アミノ安息香酸(pab-1、-2、および-3変異株)、およびスルホンアミド(35℃でのsfo変異株)のような、他の有機物。
いったん多価抗原をコードするDNA分子の集団が発現ユニット中に配置されると、DNA分子は、Smartの"Heterologous dimeric proteins produced in heterokaryons"によって記述されるように、糸状菌の親宿主株を形質転換するために使用される。ニューロスポラ・クラッサの株は、the Fungal Genetics Stock Centerより公的に入手可能であるが、独立して調製された株もまた使用され得る。Stadler et al. Genetics (1966) 54:677-685およびHaas et al. Genetics (1952) 37:217-26によって例証されるように、変異株が新たに単離されてもよい。有用な株はまた、Stanford UniversityのD.D.Perkinsより取得され得る。株は、典型的には、綿栓された試験管において、1X Vogel's Minimal Medium("N 培地")上で、株の表現型に依存して添加される適切な栄養補助剤と共に増殖される。
真菌宿主株のすべてが、すべてのヘテロカリオン適合性アリルに関してコンアレリックであるように選択されているため(上記で説明されたように、tol遺伝子が存在する場合は交配アリルを除いて)、いずれの宿主株も単独では生存し得ない条件の下で宿主株を一緒に培養した際、真菌が融合して本発明のヘテロカリオン性真菌が形成される。菌糸の融合によって、宿主真菌の異なる一倍体核が、共通の細胞質において共存することになる。任意の理論に束縛されることを望まないが、出願人らは、膜融合が、各細胞中の膜内粒子の凝集に起因し、タンパク質を含まない領域間で可能な細胞の接触を起こすと信じる。その後、接触領域における脂質の再編成が、完全な融合に導く。
本発明の組成物および方法は、病原性生物由来の免疫原性抗原を発現するヘテロカリオンを使用する。上記に記述されたように、該ヘテロカリオンは、二つまたはそれ以上の宿主株より産生され、各ヘテロカリオンは異なる多価ワクチンを生産する。
親宿主細胞が以下のインフルエンザ株由来の遺伝子を含む
AH1N1 もしくは AH3N2 もしくは BHN
抗原性変異体を伴い a,b,c,... d,e,f,... g,h,i,...
単一のワクチン生産株は使用者の選択に基づいて産生され得る
以下を含むヘテロカリオン: 株c + 株f + 株h
またはワクチン生産株のパネルが次のように産生され得る
以下を含むヘテロカリオン1: 株a + 株d + 株g
以下を含むヘテロカリオン2: 株a + 株e + 株h
以下を含むヘテロカリオン3: 株b + 株f + 株i
その他、望ましい場合は、すべての可能な組み合わせで
ここにおいて:‘A’=インフルエンザA型;‘B’=インフルエンザB型;‘H’=血球凝集素;‘N’=ノイラミニダーゼ;“変異体”=インフルエンザ型および株のHおよびN抗原の抗原性クラスの異なる組み合わせ。
開示された発明は、病原体、特に抗原性の性質を変化させる能力を示す病原体に対する、ワクチンのような抗原性組成物の調製法に向けられる。真核生物、ウイルス、細菌、および真菌抗原はすべて、記述された発明での使用として企図される。本発明についてのもう一つの使用は、いくらかの異なる抗原に対して同時に抗原性組成物を調製することである。本発明の好ましい態様は、多価インフルエンザワクチンの調製法に関する。インフルエンザウイルスは、絶えず突然変異し、かつ、新たな株を産生する。したがって、本発明が任意のインフルエンザ株、または、更に言えば任意の病原体株に適用可能であることから、開示された発明における使用について個々の遺伝子を列挙することは、不必要に限定的であろう。
ヘテロカリオン宿主は、固体最少培地上で保存され得、かつ、また、多価抗原の発現のために有利な条件下で、液体最少培地上で培養され得る。2〜7日の増殖に続いて、その後液体培地が滅菌条件下で収集され得、かつ、ELISA、PAGE、キャピラリー電気泳動、および分光光度法を含むが、それらに限定されない標準的な解析方法によって、特異的な所望の各抗原の存在について試験され得る。
ヘテロカリオンは、真菌胞子の表面上にウイルス抗原をディスプレイする融合タンパク質を発現するように構築され得る。通常真菌細胞表面に方向付けられる天然のタンパク質、例えば、ニューロスポラ属のMTRタンパク質のようなパーミアーゼタンパク質と同様に、ニューロスポラ属のEASタンパク質のようなハイドロフォビンタンパク質。これらのタンパク質は、ウイルス抗原との細胞表面に方向付けられた融合パートナーとして有用である。融合タンパク質は、当業者に周知の手段によって構築され、かつ発現される。細胞表面上に抗原を発現する個々の株は、標準的な解析方法によってアッセイされ得る。これらの方法は、ウイルス抗原に特異的な抗体による直接的または間接的細胞標識、続く様々な手段による特異的結合の検出を含むが、それらに限定されない。そのような手段は、ELISA、可視または蛍光分光光度法、およびフローサイトメトリーを含むが、それらに限定されない。抗原を発現する個々の株は、その後、融合されて、個々に発現された表面抗原の同時発現について再試験されてもよく、こうして、直接または精製後いずれかに組換えワクチンに有用な、免疫系に関する多価標的を結果的に生じる。
抗原が分泌されない場合、各液体培養における細胞集団が除去され、標準的な方法によって粉砕され、かつ細胞上清および残骸が、望ましい性質を伴う多価ワクチンについてアッセイされ得る。いったん所望の変異体を生産する株が標準的な方法によって同定されると、固体培地上に保存された株が、接種し、かつ拡大培養を作製するために使用され得る。再び、特定のヘテロカリオンのための最適条件下で増殖されると、この拡大された宿主培養は、更なる評価および使用に十分な量、所望の産物を生産するであろう。
合成HA遺伝子構築物
合成遺伝子(A/New Caledonial/20/1999/H1N1のHA0、A/Vietnam/1194/2004/H5N1のHA、およびA/Vietnam/1194/2004/H5N1のM1)は、以下の方法によって設計された:
N.クラッサにおけるHA0の発現
タンパク質生産を促進するために付着された真菌シグナル配列を伴う合成血球凝集素0(HA0)遺伝子をコードする発現ベクターは、実施例1において論じられたように産生された。
真菌ヘテロカリオンにおけるインフルエンザ抗原の多価発現
発現ベクターは、実施例1において論じられた方法に従って調製される。DNAは、エレクトロポレーションによってニューロスポラ属に導入されて、形質転換体は実施例2の方法に従って選択される。発現ベクターがHA0、HA、およびM1マトリックスタンパク質をコードするため、インフルエンザウイルスタンパク質の多価混合物が培養より生産される。
Claims (4)
- インフルエンザA型およびB型の血球凝集素およびノイラミニダーゼの変異体を含む、多価の組換え抗原変異体を生産する、糸状菌ヘテロカリオンであって、該多価組換え変異体は凝集し、粒子として培地中に分泌され、該ヘテロカリオンは、二つまたはそれ以上の親真菌株を融合させることによって形成され、かつ生存のためにすべての親真菌の核の存在を要求し、該親真菌株それぞれは該抗原の変異体をコードする外因的に供給された核酸分子を含み、かつ該親真菌株はすべてのヘテロカリオン適合性アリルについて同型接合である、糸状菌ヘテロカリオン。
- インフルエンザA型およびインフルエンザB型の血球凝集素およびノイラミニダーゼの各変異体が、自然に見出される変異体である、請求項1記載のヘテロカリオン。
- インフルエンザA型およびインフルエンザB型の血球凝集素およびノイラミニダーゼの各変異体が、自然に見出される変異体でない、請求項1記載のヘテロカリオン。
- 外因的に供給された核酸分子が多価ワクチンを構成するように発現される条件下で、請求項1記載のヘテロカリオンを培養する段階を含む、多価ワクチンを生産する方法。
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