KR20070084256A - 다가 재조합 항원의 조합 기반 생산 방법 및 그 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사상 진균 이형다핵세포를 사용하여 다가 재조합 백신을 신속하게 생산하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 병원성 유기체로부터 유래 된 항원 변이체를 암호화하는 재조합 DNA 분자가 도입된, 2종 이상의 모 균주의 조합으로부터 생성되는 사상 진균 이형다핵세포의 사용을 필요로 한다. 생성된 백신은 다가(多價)이다.

이형다핵세포(heterokaryon), 다가 재조합 백신

Description

다가 재조합 항원의 조합 기반 생산 방법 및 그 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR COMBINATORIAL-BASED PRODUCTION OF MULTIVALENT RECOMBINANT ANTIGENS}

[0002] 본 발명은 분자생물학 분야 및 병원성 유기체에 대한 다가(多價) 백신의 생산에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구체예는 다가 백신의 집단을 생산하는데 사용될 수 있는 이형다핵세포성(heterokaryotic) 사상(絲狀) 진균(眞菌)에서 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 항원 집단을 제공하는 방법 및 조성물을 특히 제공한다.

[0003] 백신은 현재 다양한 방법으로 생산된다. 전형적으로, 인플루엔자 백신은 닭의 수정란을 사용하여 생산된다. 미국에서는, 질병통제센터가 특히 독감 시즌에 가장 발병할 것 같은 바이러스를 대표하는 것으로 여겨지는 3 가지 바이러스 주를 선택할 것이다. 그 선택된 바이러스의 샘플은 필요한 항원 특징을 가진 종자 바이러스 스톡(stock)으로 제조업자에게 제공된다. 그 종자 바이러스는 닭의 수정란으로 주입된다. 이러한 계란은 인플루엔자 바이러스가 증식하는 동안 배양된다. 적절한 기간 후에 그 계란을 까서 계란 흰자를 채취한다. 이러한 샘플은 바이러스를 함유한다. 그 바이러스를 계란 물질로부터 정제하고 불활성화시킨다. 그 각각의 바이러스 스톡(stock)은 그 후 결합되어 일반적으로 3가 백신인 보통의 인플루엔자 백신을 만든다.

[0004] 발생 가능하고 전체 백신 뱃치(batch)를 손상시킬 수 있는 다양한 문제들이 있다. 예를 들어, 불임에 관한 문제가 2004년에 Chiron's 백신 생산 시설의 인증을 취소하도록 하였다. 이러한 사태는 전통적인 백신 생산 방법이 얼마나 신뢰할 수 없는 것인지를 설명한다. 더욱이, 현재의 인플루엔자 백신 생산 방법은 매년 수억 개의 계란을 사용한다. 보관, 취급 및 가공 단계들은 시간이 걸리고 노동 집약적이다. 추가적으로, 그러한 긴 생산 시간 때문에, 만약 그, 만약 새로운 인플루엔자 바이러스주가 독감 시즌 동안 유행한다면, 현재의 계란 기반의 생산 방법은 새로운 백신을 생산하는데 수 개월이 걸릴 것이다.

[0005] 이러한 제한들에 비추어서, 예컨대 인플루엔자 백신과 같은, 항원 물질을 생산하는 더 융통성이 있고 효율적인 방법이 절실하게 요구된다.

관련 출원

[0001] 본 출원은 2004년 10월 15일자에 출원된 미국 가출원 제60/619,364호와 연관되고, 이는 그 전부가 여기에 참조로서 통합된다.

단백질의 재조합 진균 발현

[0006] 진균에서 이종 유전자의 클로닝 및 발현은 다양한 유용한 단백질을 생산하는데 사용되어 왔다. 예를 들어: Lambowitz의 미국 특허 제4,486,533호는 미토콘드리아 플라스미드 DNA에 의한 사상 진균용 DNA 벡터의 자가 복제 및

뉴로스포라(Neurospora) 내로의 이종 유전자의 도입과 발현을 개시하고; Yelton 등의 미국 특허 제4,816,405호는 사상 자낭균류(ascomycetes)의 중요 균주

를 변형시켜 목적 이종 단백질을 대량으로 생산하고 분배시킬 수 있는 도구 및 시스템을 개시하며; Buxton 등의 미국 특허 제4,885,249호는 숙주 A.니거(A. niger) 세포 속으로 도입되는 것이 가능한 선택 표지(selectable marker)를 함유하는 DNA 벡터에 의한 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)의 형질전환(transformation)을 개시하고; 및 McKnight 등의 미국 특허 제4,935,349호는 아스퍼질러스 및 다른 사상 진균에서 이종 유전자의 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 수반하는 아스퍼질러스에서의 고등 진핵세포 유전자의 발현 방법을 개시한다. 유사한 기술들이 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa , "N. crassa")에서 아미노산 운반과 연관된 mtr 유전자를 클로닝 하는데 및 생체 내(in vivo)에서 클로닝된 DNA를 이 유전자에 인접하는 유전체 표지에의 빈틈없는 결합을 증명하는데 사용되어 왔다. Stuart, W. D. 외(外) Genome (1988) 30:198-203; Koo, K. 및 Stuart, W. D. Genome (1991) 34:644-651.

[0007] 사상 진균은 이들을 진핵세포 단백질의 생산에 사용하기 위한 좋은 후보가 되게 하는 많은 특징이 있다. 사상 진균은 복합 단백질을 분비할 수 있고; 이황화 결합 형성을 포함하여 3차원 단백질을 정확하게 폴딩(folding)할 수 있으며; 번역에 이어서 단백질분해적으로(proteolytically) 단백질을 자를 수 있고; 및 N-연결 및 O-연결 글라이코실화 반응을 이용하여 단백질을 글라이코실화 할 수 있다. 이러한 능력들은 이러한 생물군을 분비 재조합 단백질의 생산을 위한 매력적인 숙주로 만든다.(MacKenzie, D. A. 외(外), J Gen Microbial (1993) 139:2295-2307; Peberdy, J. F., Trends in BioTechnology (1994) 12:50-57).

[0008] 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)가 재조합 동종 및 이종 단백질 생산을 위한 숙주 세포로서 사용되어왔다. (Carattoli, A., 외(外), Proc Nat Acad Sci USA,(1995) 92:6612-6616; Yamashita, R. A. 외(外), Fungal Genetics Newsletter (1995 부록) 42A; Kato, E. 외(外), Fungal Genetics Newsletter (1995 부록) 42A; Buczynski, S. 외(外), Fungal Genetics Newsletter (1995 부록) 42A, Nakano, E. T. 외(外), Fungal Genetics Newsletter (1995 부록) 40:54 0). 추가적으로, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)는 이형다핵세포(heterokaryon)(미국 특허 5,643,745 1997년 7월 Stuart 435/69.1)를 사용한 재조합 이질이합(heterodimeric) 및 다합(multimeric) 단백질의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용되어 왔다.

발명의 요약

[0009] 본 발명은 다가 백신을 생산하는 이형다핵세포 사상 진균을 제공한다.

[0010] 본 발명의 각각의 이형다핵세포는 제1 모(母) 진균 균주 및 제2 모(母) 진균 균주를, 3가 백신의 경우에는 제3의 모(母) 진균 균주, 그리고 더 높은 수준의 백신 가(價)의 경우에는 각각의 추가된 항원 세트에 대해 하나의 추가적인 모 균주의 융합에 의해 만들어지고, 각 모 균주는 이형다핵세포 상태를 유지하는 것뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 다가 백신 항원의 변이체, 합리적으로 디자인된 다가 백신 항원의 변이체 또는 무작위적으로 생성된 다가 백신 항원의 변이체를 암호화하는 발현 유닛을 유지시키는 필수적인 마커를 함유하는 것이다. 따라서, 자연적인 변이체에 추가하여, 화학적, 물리적 또는 자리 지정(site-directed) 돌연변이유발 또는 기타 다른 기술들의 사용을 통하여 생성되는 변이체가 생산될 수 있다.

[0011] 본 발명의 이형다핵세포는 정해진 항원의 원하는 다가 백신을 선택적으로 생산하는데 유용하다.

[0012] 상기한 바에 기초하여, 본 발명은 다가 백신의 변이체를 생산하는 이형다핵세포를 제공한다.

발명의 상세한 설명

[0022] "이형다핵세포 (heterokaryon)" (또는 이형다핵성 세포(heterokaryotic cell))는 2개 (또는 그 이상)의 사상 진균 모 균주의 융합으로 형성되는 세포이고, 따라서 각각의 이형다핵세포는 2개 (또는 그 이상)의 유전적으로 상이한 핵을 함유한다. 이형다핵세포는 모든 이형다핵세포 화합성(compatibility) 대립유전자 (tol 유전자가 존재할 때의 교배형 대립유전자의 경우는 제외)에 대해 일반적으로 동종접합성인 모 균주로부터의 핵을 함유한다. 이형다핵세포 비화합성에 대한 적어도 10개의 염색체의 유전자 좌(chromosomal loci)가 동정되었다: het-c, het-d, het-e, het-i, het-5, het-6, het-7, het-8, het-9 및 het-10, 그리고 더 많이 존재할 것이라고 추측된다. Peris 외(外), "Chromosomal Loci of Neurospora crassa", Microbiological Reviews (1982) 46:426-570, at 478.

[0023] 본 발명은 이형다핵세포성 사상 진균을 사용하는 다가 백신 집단의 생산 방법 및 조성물을 제공하여 미국 특허 제5,643,745호, 제5,683,899호 및 제6,268,140호에서 공개된 연구를 진전시킨다. 그러한 방법 및 조성물은 항바이러스 백신, 항균 백신 및 항진균 백신과 같은 다가 백신의 발견과 생산에 유용하다.

바람직한 구체예의 설명

[0024] 본 발명은 다가 백신 집단을 생성하는 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 그 다가 백신은 정해진 항체의 순차적 또는 무작위의 조합으로부터 생성된다. 다가 백신을 얻기 위해, 다가 백신의 정해진 항원을 암호화하는 제1의, 제2의 및 때때로 제3의 또는 그 이상의 DNA 분자의 집단을 제1의, 제2의 진균 및 때때로 제3의 또는 그 이상의 모(母) 숙주 속으로 도입시키는 단계, 제1의, 제2의 및 때때로 제3의 또는 그 이상의 진균 모(母) 숙주를 사용한 이형다핵세포성 진균 균주를 형성하는 단계, DNA를 암호화하는 서브유닛이 발현되는 조건 하에서 그 생성된 이형다핵세포를 배양시키는 단계 및 목적 특성을 갖는 다가 백신의 생산을 위해 그 생성된 이형다핵세포를 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 방법으로 이형다핵세포가 수득된다. 각 성분들, 즉 모(母) 진균들, DNA 분자 및 융합 방법은 하기에서 상세하게 설명된다.

사상 진균의 특성 및 이형다핵세포 형성을 위해 필요한 배경

[0025] 진균은 사상(絲狀) 다핵 가닥, 효모 세포, 다양한 포자를 가진 자실체(fruiting bodies) 및/또는 성(性)적으로 분화된 세포를 산출하는 단일 단핵 세포에서 발생할 수 있다. 이들은 또한 다핵형으로 존재할 수 있다. 곰팡이 같은 진균의 성장형태의 주요한 성분은 약 2 μm∼10 μm 직경의 분지형 관 구조인 균사(hypha)이다. 균사는 그 말단의 연장(꼭대기 성장) 및 곁가지의 생산에 의해 성장한다. 따라서, 콜로니 성장처럼, 그 균사는 얽힌 가닥의 덩어리를 형성한다.

[0026] 배지의 표면 위로 돌출하는 일부 균사는 "기중균사체 (aerial mycelium)"를 구성하면서, 그 진균이 영양소를 흡수하여 성장하는 배양 배지를 관통한다. 대부분의 콜로니는 불규칙적이고, 건조하며, 섬유질의 매트(mats)와 같은 고체 또는 액체 배지의 표면에서 성장한다. 대부분의 종에서, 균사는 "격벽(septa)"라고 불리는 가로벽에 의해 나누어진다. 그러나 이러한 격벽은 섬세한 중심 구멍을 가진다. 따라서, 격벽으로 나누어진 균사도 핵을 가진다. 연속적인 세포질 덩이 속에 둘러싸인 핵을 가지고, 실질적으로는, 이동가능한 세포질 내에 여러 개의 핵을 함유하는 것이다.

[0027] "사상 진균"이라는 용어는 분지형이고, 서로 얽힌 필라멘트 덩어리를 통한 균사체를 형성할 수 있고, 비록 가로벽에 의해 차단되었지만, 가로벽에 있는 구멍 때문에 칸 사이의 세포질의 통과가 허용가능한 진균을 말한다. 이러한 진균 중 많은 수는 유성(有性) 번식될 때 낭(囊) 내에 감수분열 포자(meiotic spores)를 형성한다. 적절한 자극이 주어지면, 그러나 그 매카니즘은 완전히 이해되지 않으나, 무성(無性) 생식이 일어날 수 있다. 이러한 생식 방식 중에서, "분생포자(conidia)"로 알려진 포자는 필라멘트를 따라 다양한 위치에서 형성되는 발아 돌기의 말단에서 외부로 생겨난다.

[0028] 본 발명의 이형다핵세포 패널(panels)을 생성하는데 사용되는 사상 진균은 일반적으로 피코마이세테스(Phycornycetes), 아스코마이세테스(Ascomycetes), 바시디오마이세테스(Basidiomycetes) 및 듀테로마이세테스(Deuteromycetes)이다.

피코마이세테스(Phycomycetes)는 일부 격벽이 있는 것뿐만 아니라 모든 격벽이 없는 사상 진균을 포함한다. 그들의 무성 포자는 종류가 다양하고, 특수한 줄기의 말단에 형성되는 낭 내에 들어있는 포자낭포자(sporangiospores)를 포함한다. 상이한 종은 상이한 유성(有性) 사이클을 가진다.

[0029] 아스코마이세테스(Ascomycetes)는 자낭포자(ascospores)로 알려진 유성 포자가 들어있는 낭(囊) 유사 구조인 자낭(子囊)에 의해 다른 진균과 구별된다. 자낭포자는 교배(mating), 숫(male) 핵과 암(female) 핵의 융합, 2 번의 감수분열 및 한 번의 마지막 유사분열의 최종 생성물이다. 바시디오마이세테스(Basidiomycetes)는 특수한 구조의 표면상에 형성되는 유성 포자에 의해 구별된다. 듀테로마이세테스(Deuteromycetes)는 "불완전균류(imperfect fungi)"로 종종 언급되는데 아직까지 유성생식 단계가 관찰된 적이 없기 때문이다. 그들의 균사는 격막이 있고, 분생포자형은 아스코마이세테스(Ascomycetes)의 그것과 유사하다.

[0030] 바람직한 사상 진균은 아스코마이세테스(Ascomycetes) 군(群)이고, 더 바람직하게는 뉴로스포라(Neurospora ), 아스퍼질러스(Aspergillus ), 푸사리움(Fusarium ), 트리코더마( Tricoderma ), 크리노스포리움( Chrysosporium ) 및 페니실리움(Penicillium ) 속(屬)이다. 특히 유용한 종은 N. 인터메디아(N. intermedia ), N. 크라사(N. crassa ), N.시토풀라(N. sitopula ) 및 N.테트라시포라(N. tetraspora)를 포함하는 뉴로스포라(Neurospora )에 속하는 종이고, 그 중에서 가장 바람직한 종은 N. 크라사(N. crassa)이다. 아스퍼질러스(Aspergillus)의 유용한 종은 A. 니듈란스(A. nidulans ), A. 니거(A. niger ), A. 테레우스(A. terreus ) 및 A.푸메가투스(A. fumegatus)를 포함한다.

[0031] 사상 진균의 영양 성장(vegetative growth)은 세포 분열(유사분열)을 포함하는 핵 분열과 연관된다. 이러한 세포 분열 유형은 무성 생식, 즉 생식세포의 연관 없이 그리고 분생포자 방식에 의한 핵 융합 없이 새로운 클론을 형성하는 것으로 구성된다. 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora) 종은 그들의 핵 내에 7개의 상이한 염색체을 포함하고, 그 각각은 단일 사본을 가지는 것으로서, 즉 영양 유기체(vegetative organism)는 반수체(haploid)이다. 이러한 반수체 상태는 균사의 성장 동안 및 분생포자의 형성을 통한 무성 생식 동안 일반적으로 유지된다.

[0032] 유성 생식 또한 일어날 수 있고, 그 후 상이한 교배형의 두개의 반수체 세포(균사 또는 분생포자)가 융합하여 2개의 상이한 핵을 함유하는 2핵성(dikaryotic) 세포를 형성한다. 따라서 2개의 반수체 핵은 동일한 세포질 내에서 공존하고, 잠시 동안 다소 공시(共時)적으로 분열한다. 그러나 세포가 자낭포자를 형성하기 시작하면, 2개의 상이한 반수체 핵은 실질적으로 융합하여 상동 염색체 짝을 함유하는 이배체 핵을 형성할 수 있다. 이러한 이배체 세포는 그 후 감수분열을 시작한다.

[0033] "이형다핵세포" (또는 이형다핵성 세포)는 2 개의 (또는 그 이상의) 유전적으로 상이한 핵을 가진 세포를 말한다. 본 발명의 이형다핵세포는 모든 이형다핵세포 화합성 대립유전자 (tol 유전자가 존재할 때 교배형 대립유전자는 제외)에 대해서 동형인 (homozygous) 세포로부터의 핵을 함유하여야만 한다. 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora)의 경우, 적어도 10개의 염색체 좌가 이형다핵세포 비화합성으로 확인되었다: het-c, het-d, het-e, het-i, het-5, het-6, het-7, het-8, het-9 및 het-1 0, 그리고 그 이상 존재할 것으로 추측된다. Perkins 외(外), "Chromosomal Loci of Neurospora crassa", Microbiological Reviews (1982) 46:426-570, at 478.

[0034] 만약 두 개의 균주가 하나 이상의 het 좌에서 상이한 대립유전자를 가진다면, 이들은 안정한 이형다핵세포를 형성할 수 없다. 비유사 균사의 융합 후 또는 비유사 균주 내로 세포질 또는 추출물을 미세 주사(microinjection)한 후에 원형질 사망(Protoplasmic killing)이 일어난다. 복제물(부분적 이배체)이 1 이상의 het 대립유전자에 대해 이형접합체일 때, 성장이 억제되고 이는 매우 이례적이다. 많은 이형다핵세포 비화합 좌 (특히, het-c, -d, ㅇ-e 및 -i)는 이형다핵세포 시험에 의해 먼저 정해진다. het-5 내지 -10 좌는 복제를 이용하여 자연적인 집단에서의 보통인 경우 het 좌의 차이로서 탐지하였다. Id.

[0035] 비록 이형다핵세포성 성장이 늦어질 수도 있지만, 교배형 대립유전자 "A" 및 "a"는 또한 N.크라사(N. crassa ) 내에서 het 유전자와 같이 행동한다. 미세 주사 실험은 그러한 사망 반응에 단백질을 연관시켰다. 따라서, 역 교배형 (opposite mating types)이 이형다핵세포성 자낭생산균사(aseogenous hyphae)의 증식과 관련된 복잡한 사건에 있어 또한 일반적으로 중요하다. Id. 436 및 478에서. 그러나, 만약 tol 유전자가 존재한다면, 역 교배형 대립유전자 A 및 a와 연관된 그 영양 (이형다핵세포) 비화합성은 영향받는 성(性) 화합성 없이 억제된다. 따라서, 만약 다른 het 좌가 동일한 대립유전자(또는 같은대립유전자성(conallelic))이고 tol 유전자가 존재할 때 A/a 복제가 일반적으로 일어난다면, (tol; A+a; a) 이형다핵세포는 완전히 공존될 수 있고, 안정할 수 있다.

[0036] 만약 그 화합성 좌에서 같은대립유전자성인 2개의 상이한 균주로부터의 균사가 제공된다면, 같은 배지에서 자랄 때, 특히 아래에서 설명된 것과 같이 융합이 강제될 때, 그들은 융합할 수 있다. 그 후 그 결과 배양체는 공통의 균사상 매트(mycelial mat)의 공유된 세포질에서 순환하는 양쪽 균주로부터의 핵을 함유할 것이다.

정해진 항원의 혼합 집단을 암호화하는 발현 유닛의 제조

[0037] 본 발명의 설명에 있어서, 다음의 용어는 아래 기재된 정의에 따라서 사용될 것이다:

[0038] 본 발명은 사상 진균 이형다핵세포에서 "이종유래 다가 백신"의 생산과 관련된다. 본 발명에서, "이종유래"는 그 단백질이 그 진균에 의해 보통 생산되는 것이 아닌 것을 의미한다. "다가"는 최종 백신 생성물이 적어도 2개의 항원 또는 항원 변이체로 구성되는 것을 의미한다. 생성물은 완전히 상이한 항원들로 구성되는 것인 이종다가(heteromultivalent) 백신일 수 있거나 또는 단일 서브유닛의 변이체들로 구성되는 동종다가(homomultivalent)일 수 있다. 다가 백신의 예는 세포 표면으로부터의 재조합 항원, 바이러스 외피 단백질, 특정 병원성 단백질 항원 등의 혼합물을 포함하지만 이것에 한정되는 것은 아니다.

[0039] "항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 적절한 조절 서열과 작동가능하게 연결될 때, 전사물이 폴리펩티드로 번역되는 서열 부분이다. 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 개시 코돈 및 3'(카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 이러한 암호화 서열은 예를 들어, 원핵세포 유전자, 진핵세포 mRNA로부터의 cDNA, 진핵세포 DNA (예컨대 진균)로부터의 유전체 DNA 서열로부터 유도될 수 있거나, 또는 합성 DNA를 포함할 수도 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 암호화 서열의 3'쪽에 위치될 것이다.

[0040] 암호화 서열은 조절 서열이 적절한 숙주세포에서 암호화 서열의 발현을 초래할 때 조절 서열과 "작동 가능하게 연결"된다.

[0041] "발현 유닛"은 적절한 조건하의 적절한 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 서열의 전사 및 번역을 지시하는 "조절 서열 또는 영역"에 작동 가능하게 연결된 암호화 서열을 함유하는 DNA 분자이다.

[0042] 외인성 DNA가 숙주 세포막을 통해 도입되었을 때, 세포가 외인성 DNA에 의해 "형질전환"된 것이다. 세균과 같은 원핵세포의 경우 그 외인성 DNA는 플라스미드와 같은 에피좀성의 성분상에 유지될 수 있다. 사상 진균은 핵을 가지기 때문에 (진핵 세포이다), 안정하게 형질전환된 대부분의 진균 숙주 세포는 염색체 내에 통합된 외인성 DNA를 함유하고, 그 결과 염색체의 복제를 통해 딸 세포에까지 유전된다.

[0043] "재조합 숙주"는 재조합 기술에 의해 만들어진 DNA 서열로 형질전환된, 형질전환되는 또는 형질전환될 세포를 말하고, 최초로 형질전환된 세포, 배양체 및 이들의 자손을 포함한다.

[0044] 다양한 방법이 1) 자연적으로 발생하는 다가 백신의 항원 서브유닛의 변이체, 2) 무작위로 생성되는 또는 선택되는 다가 백신의 항원 변이체, 또는 3) 합리적으로 디자인되는 또는 선택되는 다가 백신의 항원 변이체를 암호화하는 DNA 분자의 집단을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 아래에서는, 인플루엔자 백신이 실례로서 사용된다. 당해 기술분야의 숙련된 기술자는 아래에 개설된 방법 또는 당해 기술분야에 알려진 상응하는 방법을 쉽게 사용하여, 암호화 DNA 분자 서브유닛의 집단을 생성할 수 있다.

[0045] 자연적 이질성을 갖는 항원의 자연적으로 발생하는 항원 변이체를 암호화하는 DNA 분자의 집단이 표준 cDNA 생성/클로닝 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 일반적으로, mRNA 또는 바이러스 유전체 RNA의 집단이 병원체로부터 먼저 분리된다. 또는 예를 들어, 인플루엔자 백신의 경우, 그 바이러스 자체의 유전체 RNA로부터 직접적으로 분리된다. 그 후 RNA 분자의 분리된 집단은 RTPCR과 같은 당업자에게 알려진 클로닝 방법에서 cDNA 분자 생성용의 주형으로서 사용된다. 그렇게 만들어진 cDNA 분자의 집단은 아래에 설명된 것 같은 적절한 발현 유닛 속으로 삽입될 수 있다.

[0046] 다른 방안으로, 그 단백질 서열이 알려진 항원의 경우, 인공적인 cDNA 서열이 당해 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있으며, 여기서 상기 서열은 사상 진균 숙주 균주에서 그 자신의 내부 단백질을 생산하기 위해 높은 빈도로 사용되는 코돈을 결합시키는 것이다.

[0047] 더욱이, 위치 지정 또는 무작위 돌연변이유발이 특정 서브유닛의 비자연적으로 발생하는 변이체를 생산하기 위해 다가 백신의 항원을 암호화하는 분리된 또는 인공적인 cDNA 분자 상에서 수행될 수 있다. 예컨대 무작위 또는 자리 지정 미스매치된(mismatched) PCR 프라이밍, 링커-스캐닝(linker-scanning) 돌연변이유발, 또는 화학적 및 물리적 돌연변이유발과 같은 절차들이 합리적으로 디자인된 또는 무작위로 생성된 항원 변이체를 암호화하는 DNA 분자의 집단을 생성하기 위해 쉽게 사용될 수 있다. 예를 들어, 무작위로 생성되는 또는 합리적으로 디자인된 PCR 프라이머는 암호화 항원 서열에서의 무작위 또는 목적된 이질성을 위해 사용될 수 있다.

[0048] 여기서 사용된 것과 같이, 예컨대 단백질 폴딩 또는 특정 표적 잔기 또는 영역의 선별과 같은 선택 기준이 그 변이체의 생성 또는 변이체를 암호화하는 DNA 분자의 선별에서 사용될 때, 변이체는 합리적으로 디자인된다고 일컬어진다. 변이체를 암호화하는 DNA 분자를 생성 또는 선별할 때 선택 기준이 사용되지 않을 때, 변이체는 무작위로 생성된다고 일컬어진다.

[0049] 다가 백신 서브유닛에서의 이질성의 생성에 있어 바람직한 표적 위치는 면역원성 항원결정기 및 주변 아미노산 서열이다. 인플루엔자 항원 유전자의 경우에서, 변이가 생성되는 이러한 유형은 각각의 항원의 알려진 자연적인 가변 영역 상에 집중될 것이다. 예를 들어, 알려진 변이의 라이브러리를 차례로 생산하기 위한 가변 영역에서 각각의 아미노산을 변화시킬 수 있다.

다가 백신의 항원을 암호화하는 발현 유닛의 제조

[0050] 다가 백신의 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 함유하는 발현 유닛이 잘 알려진 기술을 사용하여 제조된다. 일반적으로, 발현 유닛은 서브유닛 암호화 서열을 최종 사상 진균 숙주 내에서 서브유닛 암호화 서열의 발현을 지시하는 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 위치시킴으로써 생성된다.

[0051] 다양한 조절 인자가 구조적 또는 유도적 방식 중 하나에서 작동가능하게 연결된 단백질 암호화 서열의 발현을 지시하는 것으로 현재 당해 기술분야에서 알려져 있다. 조절 서열의 선택은 사용된 진균 균주, 진균 배양에 사용된 조건, 원하는 단백질 발현 수준 및 원하는 발현 특성(예컨대, 유도성 대 구조성)에 기초하게 될 것이다. 당해 기술 분야의 숙련자는 본 발명 이형다핵세포 패널(panel)에서 사용되는 발현 유닛을 생성하기 위한 당해 기술 분야에 알려진 조절 서열을 쉽게 이용할 수 있다.

[0052] 단백질 암호화 서열의 전사 및 번역을 지시하는 서열에 더하여, 본 발명의 발현 유닛은 신호 서열, 즉 세포 바깥으로의 항원의 배출을 지시하는 발현 조절 인자를 더 조절할 수 있다. 사상 진균에서 알려진 분비 신호의 리뷰가 Dalbey R. E., 외(外), TIBS 17:474-478 (1992)에 의해 제공된다. 당업자는 분비 신호를 함유하는 발현 유닛을 쉽게 생성시킬 수 있다.

[0053] 본 발명의 발현 유닛의 또 다른 형태는 숙주 세포 또는 이종 세포(heterologous cell)의 세포막 고정 서열(anchor sequence)과의 융합을 통해 세포막에 또는 숙주 세포 또는 이종 세포의 세포 표면 분자와의 융합에 의해 세포 표면에 항원이 있도록 지시하는 융합 단백질을 함유한다.

[0054] 하나의 응용예에서, 재조합 유닛이 발현 유닛을 대신하여 생성된다. 그러한 용도에서, 서브유닛 암호화 서열, 또는 항원 암호화 서열의 절편은 숙주 진균 균주에서의 결합 위치에 동종인 서열을 함유하는 DNA 영역의 측면에 위치한다. 그 후 그 동종 서열은 재조합 유닛 및 숙주 염색체 사이의 상동 재조합을 자극 및 지시하기 위해 사용된다. 재조합 유닛이 사용될 때, 숙주 균주는 바람직하게는 먼저 발현 조절 인자를 함유하는 발현 유닛으로, 이어서 목표된 재조합을 위해 사용되는 서열로 형질전환된다. 예를 들어 인플루엔자 항원이 숙주 진균 속으로 도입될 수 있고, 그 후 상동 재조합 유닛이 숙주 염색체의 표적 영역 내에 이질성을 도입하기 위해 사용할 수 있다.

[0055] 중간 숙주가 최종 진균 세포를 형질전환시키는 것이 가능한 중간 백터를 생산하는데 때때로 사용된다. 그 후 그 중간 세균 형질전환주를 성장시켜 원하는 사상 진균 숙주를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 원하는 양의 DNA를 얻을 수 있다. 중간 벡터로 제공될 수 있는, 일반적으로 사용 가능한 세균성 벡터의 예는 예컨대, pBR322, pUC8 및 pUC9를 포함한다. 추가적으로 유용한 중간 벡터는 pHY201, pKBY2, pTZ18R, pX182 및 pCVN2.9, pN807, pN846을 포함한다.

[0056] 또 다른 구체예에서, 관심 항원 또는 항원들은 예컨대 EAS와 같은 진균성 하이드로포빈(hydrophobin)을 가지는 융합 단백질로서 발현된다. 진균성 하이드로포빈은 일반적으로 많은 양으로 발현되고 분비된다. 그 후 진균의 표면은 하이드로포빈으로 피복된다. 또한 이러한 단백질은 용액에서 응집되는 것으로 알려져 있다. 이러한 응집 특성은 항원성 입자를 형성하는, 응집된 재조합 단백질의 제조를 가능하게 한다. 이러한 단백질은 정제될 수 있고 항원으로서 사용될 수 있다. 동일한 배양으로 다중 항원이 발현될 때, 다가 항원성 입자가 생산된다.

[0057] 이러한 본 발명의 설명 및 명세가 본 발명의 사상과 범위 내에 속하는 모든 구체예를 포괄하도록 의도된 것이라는 점이 이해될 것이다. 예를 들어, 해독틀(open reading frame)의 아미노산 서열 내에서 그 분자의 항원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환은 당해 기술분야의 지식 내에 있고, 자연적으로 발생하는 서브유닛에서의 결실, 첨가 또는 치환으로 생성될 수 있는 그러한 다가 항원은 본 발명에 포함된다.

모(母) 균주의 성질

[0058] 본 발명의 이형다핵세포를 만드는데 사용된 각각의 진균 모 균주는 다가 백신의 항원을 암호화하는 DNA 분자 집단의 일원을 함유할 것이기 때문에, 어떤 진균 모 균주는 원하는 다가 백신의 제1 항원 또는 항원 군을 암호화하는 DNA 분자의 제1 집단의 일원을 함유하도록 변형된 핵을 가질 것이고, 이어지는 각각의 진균 모 균주는 상이한 원하는 다가 백신의 항원 또는 항원 군을 암호화하는 DNA 분자의 상이한 집단의 일원을 함유하도록 변형된 핵을 가질 것이다. 예를 들어 2가 인플루엔자 백신을 생산하는 이형다핵세포를 생산하기 위해서, 어떤 진균 모 균주는 A H1 N1형 인플루엔자 cDNA로부터 항원 군을 생산할 것인 반면, 다른 진균 모 균주는 A H3 N2형 인플루엔자 cDNA로부터 항원 군을 생산할 것이다. 3가 인플루엔자 백신을 생산하기 위해서, 제1 진균 모 균주는 A H1 N1형 인플루엔자 cDNA로부터 항원 군을 생산할 것이고, 제2 진균 모 균주는 A H3 N2형 인플루엔자 cDNA로부터 항원 군을 생산할 것이며, 제3 진균 모 균주는 B H N형 인플루엔자 cDNA로부터 항원 군을 생산할 것이다. 뉴클레이티드 및 단백질 서열은 공개적으로 입수할 수 있다. 예를 들어, HA 유전자에 대한 대표적인 서열은 H3N2 (AY738729), 인플루엔자 A 바이러스 (A/Leningrad/54/1(H1N1)) 뉴라미니다제(neuraminidase) 유전자 (M38309), 인플루엔자 A 바이러스 (A/Swine/Ontario/42729A/01 (H3N3)) 뉴라미니다제 (NA) 유전자 (AY619975), 인플루엔자 A 바이러스 (A/Swine/Ontario/K01477/01 (H3N3)) 뉴라미니다제 (NA) 유전자 (AY619966), 인플루엔자 A 바이러스 (A/Swine/Saskatchewan/18789/02 (H1N1)) 뉴라미니다제 (NA) 유전자 (AY619960), 인플루엔자 A 바이러스 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) 단편 6 (NC 004523), 인플루엔자 A 바이러스 (A/mallard/Alberta/211/98(H1N1)) 뉴라미니다제 (NA) 유전자 (AY633214), 인플루엔자 A 바이러스 (A/mallard/Alberta/99/91(H1N1)) 뉴라미니다제 (NA) 유전자 (AY207541) 및 인플루엔자 A 바이러스 (A/duck/Miyagil/9/77(H1N1)) 뉴라미니다제 (NA) 유전자 (AY207534)를 포함한다.

[0059] 위에서 설명한 것처럼, 항원 또는 항원 군을 암호화하는 DNA 분자를 함유하도록 변형된 것에 더하여, 모 균주 각각의 핵은 진균을 이형다핵세포를 형성하는데 사용되는 조건 하에서 생존하기 위한 제2 핵 및/또는 제3 핵 및/또는 추가적인 핵의 존재에 의존하게 하는 특성을 갖게 하는 유전체(genome)를 함유해야 한다. 따라서, 각각의 모 균주의 핵은 만약 제2 핵 및/또는 제3 핵 및/또는 추가적인 핵이 또한 존재하지 않는 경우라면 진균이 그 배양 조건하에서 생존하는 것을 포함하는 것에서 실패를 가져오게 될 것인 특성을 부여한다. 예를 들어, 특정 영양소를 요구하는 모 균주는 이러한 영양소의 요구가 없는 모 균주와 함께 그 영양소가 결핍된 배지에서 배양될 수 있다. 만약 균사의 융합이 일어난다면, 그 제2 모 균주의 핵은 이러한 영양소의 결핍하에서 생존하는 능력을 부여하게 된다. 차례로, 그 제2 모 균주는 제1 모 균주에 의해 요구되던 것이 아닌 상이한 영양소를 요구할 수 있을 것이다. 그 후 양쪽 모두의 핵을 함유하는 진균만이 두 개의 영양소 모두가 결핍되는 경우 생존할 수 있다.

[0060] 요구되는 영양소는 진균 균주 세포가 성장을 위해 필요로 하는 또는 그 결핍시 진균 균주의 성장 또는 생존 능력에 심각한 손상을 주는 임의의 물질일 수 있다.

유용한 영양 요구 및 관련된 돌연변이주의 예는 아래의 것을 포함한다:

(1) 아미노산, 예컨대 히스티딘 (his-1 내지 -7 돌연변이주), 프롤린 (aga 돌연변이주), 아르기닌 (arg-11 돌연변이주), 시트룰린 (arg-11 돌연변이주), 아스파라긴 (asn 돌연변이주), 콜린 (chol-1 및 chol-2 돌연변이주), 시스테인 (cys-1 돌연변이주), 글루타민 (gln-1 돌연변이주), 루신 (leu-1 내지 -4), 라이신 (lys-2, -4 및 -5), 메티오닌 (mac 돌연변이주 및 met-6, -9 및 -10 돌연변이주) 및 트레오닌 (thr-2 및 -3 돌연변이주);

(2) 방향성 아미노산의 혼합물, 예컨대 p-아미노벤조산, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌의 혼합물 (aro-6, aro-7 및 aro-8을 제외한 모든 aro 균주에 의해 요구된다), 트립토판 및 페닐알라닌의 혼합물 (aro-6 돌연변이주에서 요구된다), 이소루신 및 발린의 혼합물 (ilv-1, -2 및 -3에서 요구된다) 및 페닐알라닌 및 티로신의 혼합물 (pt 돌연변이주에서 요구된다);

(3) 비타민류, 예컨대 판토텐산 (pan-1 돌연변이주) 및 티아민 (thi-2 및 thi-4 돌연변이주);

(4) 퓨린 염기류, 예컨대 아데닌 (ad-2 내지 ad-4 및 ad-8 돌연변이주), 하이포잔틴 (ad-2 및 ad-3 돌연변이주), 이노신 및 구아닌 또는 구아노신 (gua-1 또는 -2 돌연변이주);

(5) 피리미딘 염기류, 예컨대 우라실 (pyr-1 내지 pyr-6);

(6) 포화 지방산류 (cel 돌연변이주) 또는 불포화 지방산류, 예컨대 9- 또는 11-위치 중 어느 하나에서 시스 형태의 이중 결합을 갖는 C₁₆ 또는 C₁₈ 지방산,

9-위치에서 트란스 형태의 이중 결합을 가진 지방산 및 메틸렌 다리에 의해 차단되는 다중 시스 이중 결합을 갖는 지방산 (ufa-1 및 -2);

(7) 생리학적으로 중요한 이온류, 예컨대 칼륨 (trk);

(8) 당(糖)알콜류, 예컨대 이노시톨 (acu 돌연변이주 및 inl 돌연변이주) 및 글리세롤; 및

(9) 다른 유기 물질, 예컨대 아세테이트 (ace 돌연변이주), I-케토글루타레이트, 숙시네이트, 말레이트, 포름메이트 또는 포름알데하이드 (for mutants), p-아미노벤조산 (pab-1, -2 및 -3 돌연변이주) 및 설폰아마이드 (35℃에서 sfo 돌연변이주).

[0061] 영양 요구에 기초한 구체적인 일례가 효소 오르니틴 트란스카바밀라제를 암호화하는 Arg B+유전자이다. 이 효소는 야생형 A. 니거(A. niger)에 존재한다. 이 효소가 결핍된 돌연변이주 (Arg B- 균주)가 자외선 처리와 같은 보통의 비특이적 기술에 의해서 만들어질 수 있고, 이어서 아르기닌 함유 배지에서 성장하는 능력과 짝지워진 최소 배지에서의 성장 불능에 기초하여 선별할 수 있다. 이러한 유전체를 함유하는 진균은, 만약 Arg B+ 핵을 또한 함유한다면, 최소 배지에서 성장할 것이다.

[0062] 다양한 세포독성제 중의 임의의 하나에 대한 저항성을 부여하는 유전자는 이형다핵세포 형성을 강제하는데 또한 유용하다. 예를 들어, 다른 구체예에서는, 모 균주 중의 하나가 영양소에 대한 요구성 뿐만 아니라 유해 화합물, 항생 물질 또는 바이러스, 또는 가혹한 환경 조건, 예컨대 나머지 모 균주에게는 민감한 미리 결정된 온도 범위에 의해 유도되는 독성 효과에 대한 저항성을 가질 수 있다.

[0063] 독성 효과를 나타낼 수 있는 유해 화합물의 구체적인 예는 아크리플라빈 (acr에 의해 일반적으로 부여되는 저항성, acr-4 및 acr-6에 의한 저항성에 있어서 요구되는 shg 유전자의 존재하에서); 3-아미노-1,2,4-트리아졸 (acr-2, atr-1, cpc, leu-1 또는 leu-2에 의해 부여되는 저항성); 염료, 예컨대 말라카이트 그린 (acr-3에 의해 부여되는 저항성); 카페인 (caf-1에 의해 부여되는 저항성); 퓨린 유사체 (aza-1에 의해 부여되는 8-아자아데닌 및 2,6-디아미노퓨린에 대한 저항성; aza-2에 의해 부여되는 8-아자아데닌 및 8-아자구아닌에 대한 저항성; aza-3에 의해 부여되는 8-아자구아닌 및 6-머캅토퓨린에 대한 저항성; mep(3) 및 mep(10)에 의해 부여되는 6-메틸퓨린에 대한 저항성); 시안화물 (성장의 최초 24시간 내의 cni-1에 의해 부여되는 무감응성); 테트라졸리움 (cya-6 및 cya-7에 의해 부여되는 저항성); 시클로헥시미드 (cyh-1, -2 및 -3에 의해 부여되는 저항성); 크롬산염 (cys-13에 의해 부여되는 저항성); 2-데옥시-D-글루코스 (dgr^-에 의해 부여되는 저항성); 에데인(edeine) (edr-1 및 -2에 의해 부여되는 저항성); 에티오닌 (eth-1에 의해서, p-플루오로페닐알라닌의 존재하에서 nap에 의해서 및 에티오닌이 D형인 경우 oxD에 의해서 부여되는 저항성); 플루오로 화합물, 예컨대 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우라실 및 5-플루오로우리딘 (fdu-2에 의해 부여되는 3개 모두에 대한 저항성; 암모니아가 없는 최소 배지에서 uc-5에 의해 부여되는 5-플루오로우라실에 대한 저항성; ud-1에 의해 부여되는 5-플루오로데옥시우리딘 및 5-플루오로우리딘에 대한 저항성); 및 플루오로페닐알라닌 (특정 조건하에서 fpr-1 내지 -6에 의해 부여되는 저항성); 8-아자아데닌 (mts에 의해 부여되는 저항성); 메틸 메탄 설포네이트 (upr-1에 의한 무감응성 또는 근소한 감응성); 표면활성제, 예컨대 데퀄리니움 클로라이드(dequalinium chloride), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드 및 벤즈알코니움 클로라이드 (sur-1에 의해 부여되는 저항성); 및 금속 이온류, 예컨대 바나듐산염 (van에 의해 부여되는 저항성)을 포함한다.

[0064] 독성 효과를 전형적으로 발휘하는 항생물질의 예는 베노밀, 메틸-1-(부틸카밤올벤즈이미다졸-2-일)카바메이트 (Bml에 의해 부여되는 저항성); 안티마이신 A (성장의 최초 24시간 내의 cni-1에 의해 부여되는 무감응성); 폴리엔 항생물질, 예컨대 니스타틴(nystatin) (erg-1 및 3에 의해 부여되는 저항성); 및 올리고마이신 (oli에 의해 부여되는 저항성)을 포함한다.

[0065] 예컨대 높은 또는 낮은 온도, 산소의 부족 (an에 의해 부여되는 저항성), 계속적인 빛 (lis-1, -2 및 -3에 의해 부여되는 저항성) 또는 빛이 없는 조건, UV 조사, 전리 방사선, 높은 또는 낮은 삼투압과 같은 극한의 다양한 환경 조건에 대한 저항성을 부여하는 유전자도 또한 유용하다. 특히 바람직한 구체예에서는, 독성 효과에 대한 저항성은 히그로마이신(hygromycin)과 같은 항생물질에 대한 저항성이다.

[0066] 본 발명에서 일반적으로 유용한 균주는 솜으로 막힌 테스트 로브(robes) 내에서 1X 보겔 최소 배지 (N 배지) 상에서 그 균주의 표현형에 따라 첨가되는 보충물, 예컨대 히스티딘, 아르기닌 및/또는 이노시톨과 함께 성장할 수 있다. 전형적인 균주를 예를 들어 "FGSC"(Fungal Genetics Stock Center) 및 스텐포드 대학의 D. D. Perkins로부터 얻을 수 있다. 유용할 것으로 믿어지는 또 다른 N. 크라사(N. crassa ) 균주는 M246-89601-2A이다(Dr. Mary Case, University of Georgia, Athens로부터 얻어진 것). 이러한 균주는 야생형 74A로부터 유도된 것으로서, 안정한 qa-2 돌연변이 (M246), arom-9 돌연변이 (M6-11) 및 inos (io601) 돌연변이를 함유한다. 이중 돌연변이주 qa-2, arom-9는 생합성적 및 이화적 데하이드로퀴나제(dehydroquinase) 활성이 모두 부족하고, 방향성 아미노산, 예컨대 약 80 μg/ml 농도의 페닐알라닌의 보충이 없다면 최소 배지에서 성장이 불가능하다.

[0067] 유용한 A.니거(A. niger ) 균주 (ATCC 46951)는 또한 FGSC로부터 입수할 수 있고, 푸사리움(Fusarium), 겔라시노스포라(Gelasinospora) 및 소르다리아 피미콜라(Sordaria fimicola)도 마찬가지이며, 또는 UV광으로 돌연변이를 유발시키고 한정 최소 배지에서의 성장에서 오르니틴 또는 아르기닌을 요구하는 분리주를 형성시켜서 제조될 수 있다. 오르니틴 카르바모일 트란스퍼라제 결핍의 이러한 균주는 arg B (350(-)52)로 지칭된다. A.니거(A. niger ) 또는 A.니듈란스(A. nidulans)의 성장용 배지는 Cove, Biochim Biophys Acta (1966) 113:51-56에서 설명된다.

[0068] 표준 절차가 균주의 유지 및 분생포자의 제조에 일반적으로 사용된다 (Davis 및 de Serres, Methods Enzymol (1971 ) 17A:79-141). Lambowitz 외(外) J Cell Biol (1979) 82:17-31에서 설명된 것과 같이, 균사체(Mycelia)는 전형적으로 액체 배양에서 약 14 시간 동안 (25℃) 성장한다. 일반적으로 숙주 균주는 적절한 영양소(들), 예컨대 히스티딘; 아르기닌; phe, tyr 및/또는 trp (각각 약 80 μg/ml); p-아미노벤조산 (약 2 μg/ml); 및 이노시톨 (약 0.2 mg/ml)을 보충한 보겔(Vogel's) 또는 프라이스(Fries) 최소 배지 중 어느 쪽에서라도 성장가능하다.

[0069] 원하는 특성을 가진 많은 진균 균주를 공개적으로 입수할 수 있다. 그러나, 만약 쉽게 입수할 수 없다면, 당해 기술분야의 통상적인 기술자는 원하는 돌연변이주를 또는 원하는 특징을 제공하기 위해 가공된 핵을 분리시키기 위한 당해 기술 분야에서 잘 알려진 선별 기술을 사용할 수 있다. 예시적인 모 균주 조합을 아래의 표에 나타낸다.

2핵성세포(diakaryon) 조합: 모균주 1 모균주 2 표현형 요구 히스티딘 트립토판 또는 요구 아르기닌 라이신 또는 요구 우라실 티미딘

3핵성세포(trikaryon) 조합: 모균주 1 모균주 2 모균주 3 표현형 요구 히스티딘 트립토판 아르기닌 및 트립토판 아르기닌 히스티딘 (제공되는 융합 파트너가 가진 것) (아르기닌) (히스티딘) (트립토판)

4핵성세포(tetrakaryons): 모균주 1 모균주 2 모균주 3 모균주 4 표현형 요구 히스티딘 트립토판 아르기닌 루신 및 트립토판 아르기닌 루신 히스티딘 및 아르기닌 루신 히스티딘 트립토판 (제공되는 융합 파트너가 가진 것) (루신) (히스티딘) (트립토판) (아르기닌)

[0070] 상기 표에 나타나는 것처럼, 다양한 상보적 특징/특성 조합이 다양한 융합 조건에 화합하도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 영양 요구성은 돌연변이 균주에 의해 증명되고, 특정 물질에 저항하는 능력이 그 저항 유전자용 발현 시스템을 가진 핵의 변형에 의해 더 편리하게 부여될 수 있다. 다른 방도로서, 영양 요구성은 재조합 기술, 예컨대 형질전환 백터를 포함한 상동 재조합을 사용하여 초래될 수 있고, 그 저항성은 독성 조건이 존재하는 환경 하에서의 돌연변이에 의해 부여될 수 있다.

[0071] 본 발명의 하나의 구체예에서는, 숙주 세포는 형질전환을 위해 스페로플라스트(spheroplasts)로 변환된다. 스페로플라스트가 사용될 때, 바람직한 방법 또는 그것의 제조법은 예컨대 키티나아제(chitinase)/글루타마아제(glutamase)의 사용에 의한 것과 같은 세포벽의 효소적 소화이다. 효소적 소화를 위한 적절한 효소의 선별은 당해 기술 분야의 통상의 기술 수준 내에 있다. 유용한 효소는 다당류 복합체를 소화시키는 것이 가능한 것이고, 매우 다양한 진균 종의 진균성 세팔로플라스트를 제조하는데 효과적인 것으로 알려진 것들 중에서 발견된다. 적절한 효소의 구체적인 예는 노보자임(Novozyme) 234 (효소들의 불순한 혼합물) 및 베타-글루쿠로이다제(Beta-glucurouidase)를 포함한다. 다른 적절한 방법이 스페로플라스트를 만들기 위해 사용될 수 있다. 만약 벡터의 사용에 의한 세포 벽 관통을 위한 적절한 방법이 확인된다면, 진균 숙주의 모든 세포에 스페로플라스트와 함께 또는 대신해서 사용될 수 있을 것이다.

[0072] 다가 백신의 특정 서브유닛을 암호화하는 DNA을 위한 발현 유닛을 함유하도록 진균 숙주 균주의 핵을 변형시키기 위해서, 본 발명의 실험에서는, 별도로 설명하지 않는 경우라면, 당해 기술분야의 통상의 기술수준 내에 속하는 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용한다. 그러한 기술들은 관련 기술문헌에서 충분히 설명된다. 예컨대, Maniatis 외(外), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); D. N. Gover 외(外), DNA Cloning: A Practical Approach (1985) Volumes I 및 II; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nuclei Acid Hybridization (Hames 외(外) eds. 1985); Transcription and Translation (Hames 외(外) eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshhey ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press 1986); B. Perbat, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)를 참조하라.

N. 크라사( N. crassa )의 형질전환을 위한 일반적인 절차

[0073] 다가 항원을 암호화하는 DNA 분자의 집단이 발현 유닛 속에 위치되는 때, 예컨대 Smart, "Heterologous dimeric proteins produced in heterokaryons"에서 설명되는 것처럼, 그 DNA 분자는 사상 진균의 숙주 모 균주를 형질전환시키는데 사용된다. 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 균주는 FGSC로부터 공개적으로 입수가능하지만, 독자적으로 제조된 균주를 사용하는 것 또한 가능하다. Stadler 외(外) Genetics (1966) 54:677-685 및 Haas 외(外) Genetics (1952) 37:217-26에서 설명된 것처럼, 돌연변이주는 새로(de novo) 분리될 수도 있다. 유용한 균주를 스탠포드 대학의 D. D. Perkins로부터 또한 얻을 수 있다. 전형적으로 균주는 솜으로 막힌 테스트 로브(robes) 내에서 1X 보겔 최소 배지 ("N 배지") 상에서 그 균주의 표현형에 따라 첨가되는 적절한 보충물과 함께 성장한다.

[0074] 스페로플라스트는 형질전환의 대상으로 사용된다. 분생포자의 스페로플라스트를 만들기 위해, 솜으로 막힌 4 내지 5개의 125 ml 얼렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 적절한 보충물과 함께 25 ml의 고체 N 배지 상에 진균을 접종한다. 그 배양체를 5-6일 동안 실온에서 성장시킨다.

[0075] 각각의 플라스크에 N 배지를 10 ml 추가하고, 솜 마개를 제거한 후, 분생포자를 채취하고, 플라스크를 빙빙 돌려서 분생포자를 채취한다. 수 분 동안 고체가 가라앉도록 둔다. 상기 분생포자 혼합물을 얼렌마이어 플라스크의 입구에 매달린 가압멸균된 치즈클로스(cheesecloth) 자루에 붓고, 1개 이상의 고무 밴드로 단단히 고정한다. 그 여과액을 회수하고, 함께 계산되는 체인을 가진 혈구계(hemocytometer) 계산에 의해 분생포자의 농도를 측정한다.

[0076] 2x10⁹개 분생포자 양을 1.5% 수크로스 및 적절한 부가물을 함유하는 150 ml의 액체 N 배지에 첨가한다. 75%를 초과하는 분생포자가 발아되고 그 발아관의 길이가 1-4 분생포자 직경이 될 때까지, 5-6 시간 동안 실온에서 진탕 (150-200 rpm)하면서, 그 분생포자를 솜으로 막힌 플라스크에서 발아시킨다. 약 1500-2000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 그 세포를 회수한다. 그 세포 펠렛(pellet)을 물로 세번 헹군다.

[0077] 그 펠렛을 그 후 10 ml의 1.0M 솔비톨에 재현탁하고, 그 스페로플라스트가 형성될 때 그것이 "터지는" 것을 막기 위한 등장(等張) 조건하에서 효소를 사용한 강한 분생포자 세포벽의 효소성 제거에 의해 스페로플라스트를 제조한다. 그 프로토콜은 Vollmer 및 Yanofsky, Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83:4869-73의 방법으로부터 수정된 것이다.

[0078] 특히, 멸균한 250 ml 얼렌마이어 플라스크에서, 상기 분생포자 현탁액은 일반적으로 노보자임 234(Novozyme 234)라는 상표명으로 Interspex사에 의해 시판되는 50 mg의 고체 효소에 첨가된다. 그 혼합물을 30℃에서 약 1 시간(4±10 분) 동안 진탕하여 (100 rpm) 세포벽을 소화시켰다. 상기 스페로플라스트 형성 과정을 그 혼합물의 작은 부분을 커버 유리 아래에서 현미경으로 조사하여 모니터한다. 스페로플라스트는 커버 유리의 한쪽 끝에 물을 바를 때 삼투압에 의해 터지기 때문에 탐지될 수 있다. 그 과정은 스페로플라스트 형성의 뒷 단계에서 자주 모니터되어야 한다.

[0079] 그 스페로플라스트 혼합물을 멸균 15 ml 원뿔 원심분리 튜브 속으로 가만히 따르고, 스윙잉 버켓 탁상용 원심분리기(swinging bucket table top centrifuge)에서 500 rpm (10분)의 원심분리에 의해 스페로플라스트를 회수한다. 그렇게 만들어진 펠렛을 1.0M 솔비톨 10 ml로 2번 헹구고, 다음의 STC 용액 (91 g 솔비톨; 50 mM Tris. Cl; 50 mM CaCl₂ ; pH 8.0에 맞추기 위한 충분한 NaOH; 및 500 ml까지 충분량(q.s.))으로 1번 헹군다.

[0080] 그렇게 만들어진 스페로플라스트 펠렛을 16.0 ml STC, 200 μl DMSO 및 4 ml의 다음의 PTC 용액의 혼합물에서 현탁시켰다: "4000"이라는 상표명으로 Sigma사에 의해 시판되는 200 g 폴리에틸렌 글리콜; 50 mM Tris. Cl; 50 mM CaCl₂; pH 8.0에 맞추기 위한 충분한 NaOH; 및 50 ml까지 충분량(q.s.).

[0081] 그 최종적인 스페로플라스트 현탁액을 직접 사용하거나 또는 1.0 ml 부분을 -80℃에서 동결시켜 저장할 수 있다.

[0082] 멸균된 15 ml 스크류 캡 튜브에서, 2.0 μl의 50 mM 스페르미딘(Spermidine) 용액, 트랜스펙션될 5.0 μl의 플라스미드 DNA, 예컨대 베노밀(benomyl) 저항성(일반적으로 약 1.0 mg/ml의 농도)과 같은 선택 표지를 갖는 원하는 다가 백의 항원을 위한 발현 시스템을 함유하는 것 및 5.0 μl의 5 mg/ml 헤파린 용액을 그 튜브를 손가락으로 튀겨서 혼합시킨다. 상기 스페르미딘 용액은 12.73 mg 의 스페르미딘을 1.0 ml TE에 용해시키고, pH 8.0을 맞추어서 제조되고 -20℃에 보관될 수 있다. 상기 헤파린 용액은 헤파린의 나트륨염 50 mg을 10 ml STC에 용해시켜서 제조되고, 일부분을 동결시켜서 보관할 수 있다.

[0083] 튜브를 탁상용 원심분리기에서 간단히 빼내고 (펄스), 얼음 수조에 위치시킨다. 약 50-100 μl의 해동된 스페로플라스트를 그 튜브에 첨가한다. 그 혼합물을 얼음에서 약 30분 동안 배양하지만, 그러나 얼음에서 약 20분의 배양기간이 성공적이었다. 약 1 ml의 PTC를 첨가하고 그 튜브를 손가락으로 튀겨서 잘 혼합시킨다. 그 혼합물을 실온에서 약 20분 동안 더 배양한다.

[0084] 재생 "상부(Top)" 한천(Agar)를 20 ml 50x 보겔 최소 배지; 825 ml 물; 182 g 솔비톨; 및 28 g 아가를 혼합시켜 제조한다. 그 상부 한천을 가압 멸균하고, 100 ml의 10x FIGS 용액 (5 g/l 프럭토스, 2 g/l 이노시톨, 2 g/l 글루코스 및 200 소르보스를 함유하는 것)을 첨가한다. 그 상부 한천 15 ml를 50℃-55℃에서 배양하고, 스페로플라스트 및 플라스미드 DNA를 담고 있는 튜브 안으로 붓는다. 튜브를 2-3번 뒤집고 손가락으로 튀겨서 그 내용물을 즉시 혼합하고, 그 후 깔려있는 "하부(bottom)" 한천의 층 위로 균등하게 붓는다.

[0085] 그 "하부" 한천은 1xN 배지에서 임의의 필요한 부가물을 혼합하고; 가압멸균하고; 및 10x FIGS 및 베노밀(만약 표지로서 베노밀 저항성이 사용되는 경우라면)을 첨가하여 각각 1x 및 0.5 μg/ml의 최종 농도로 제조된다. 25 ml 부피의 "하부" 한천을 페트리 평판 내에 붓고, 굳게 한다.

[0086] 상부 한천을 하부 한천 위에 부은 후에, 기포를 불로 제거한다. 그 평판을 상부 한천이 고체화될 때까지(약 5분) 위쪽 방향으로 유지시킨다. 만약 상부 한천이 너무 이르게 경화되는 경향이 있다면, 하부 한천 평판을 미리 따뜻하게 할 수 있다. 일단 상부 한천이 경화되면, 위치를 반대로 하여 30℃에서 그 평판을 배양한다.

[0087] N.크라사(N. crassa) 형질전환주의 선택을 위해서, 그 숙주를 적절한 배지 (형질전환된 세포만이 이용할 수 있는 조성물을 함유하거나 또는 형질전환된 세포만이 내성이 있는 항생물질을 함유하는 것) 상에서 배양하고, 약 34℃ 항온배양한다. 성공적인 형질전환의 증거를 평판 배양 후 24-36 시간에 확인할 수 있다. 안정한 형질전환주는 3일의 성장 후에 일반적으로 확인한다. 형질전환주를 찾아내기 위한 배양기간은 숙주 균주 및 표현형 표지에 따라 변할 것이다.

[0088] 선택된 형질전환주를, 예컨대 적절한 ELISA, 콜로니 블롯 면역분석, 제한 효소 분석, 필터 혼성화 (filter hybridization), 네스티드 델리션 서브클로닝(nested deletion subcloning) 등과 같은 표준 방법에 의해서, 원하는 항원 서브유닛의 발현에 대해 선별할 수 있다.

[0089] 본 발명에서 있어서, 전술한 재조합 기술은 원하는 재조합 항원 또는 항원군을 발현하는 진균 숙주 균주를 생산하기 위해 사용되는데, 여기서 각각의 숙주 균주는 특수한 조건 하에서 성장에 음성적으로 영향을 미치지만 1개 이상의 다른 핵에 의해 부여된 특성에 의해 고쳐질 수 있는 1개 이상의 특징을 갖는 것이다.

[0090] 그로부터 생산된 숙주 균주는 본 발명의 이형다핵세포를 형성하는데 사용되는 모 균주이다.

[0091] 다른 것으로, 전기천공법(electroporation)을 예컨대 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 사상 진균의 새롭게 채취된 분생포자를 형질전환시키는데 사용할 수 있다(Van, D. C. Fungal Genetics Newsletter No. 42A (Supplement) (1995)). 일반적으로, 분생포자를 7-28 일이 지난 배양체로부터 채취한다. 그 세포를 1 M 솔비톨 용액으로 씻고 최종 농도 2.5x10⁹ 세포/ml가 되도록 현탁한다. 대략 5 μg의 선형 DNA를 분생포자 현탁액의 일정부분에 첨가하고, 이러한 부분을 전기천공 큐벳(cuvette), 예컨대 0.2 cm 간격을 갖는 전기천공 큐벳의 바닥에 위치시킨다. 예컨대 InVitrogen Electroporator II와 같은 전기천공기를 약 7.25 kb/cm의 전압 차 및 약 71 μF 및 약 200 옴의 셋팅으로 조절한다. 전기천공에 이어서, 전술한 상부 한천을 반드시 가지거나 가지지 않도록 한 적절한 배지에 세포를 평판 배양한다.

[0092] 형질전환에 이어서, 각각의 분자 변이체를 형성하도록 유도된 안정한 생산 균주를 각각의 경우에 사용된 특정 숙주 세포 및 발현 유닛에 대한 선택 배지 상의 배양체를 확장시켜 만든다.

이형다핵세포의 생산

[0093] 모든 진균 숙주 균주는 모든 이형다핵세포 화합 대립 유전자 (전술한 것처럼 tol 유전자가 존재할 때 교배 대립 유전자를 제외한다)에 관해서 같은대립유전자성(conallelic)이 되도록 선택되기 때문에, 숙주 균주 중 어느 것도 혼자서는 생존할 수 없는 조건 하에서 숙주 균주들이 함께 배양될 때, 그 진균은 융합되고 그 결과 본 발명의 이형다핵세포성 진균이 된다. 균사의 융합에 의해서, 숙주 진균의 상이한 반수체 핵은 같은 세포질 내에 공존하게 된다. 어떠한 이론에 의해 한정되는 것을 원하는 것은 아니지만, 출원인들은 막 융합이 단백질이 없는 영역 사이에서의 세포 접촉을 가능하게 하는, 각각의 세포 내에서 막내 입자의 응집으로부터 기인한 것이라고 믿는다. 그 후 접촉 영역에서의 지질의 전위는 완전한 융합을 이끈다.

[0094] 각각의 모 균주는 다가 백신의 상이한 항원을 생산하는 핵을 함유하기 때문에, 최종 이형다핵세포는 다중 항원을 포함하는 완전한 다가 백신을 생산하는 것이 가능하다.

[0095] 따라서 생성된 이형다핵세포는 안정하고 대략 같은 비율로 분할하는 핵을 가진다.

정해진 다가 백신을 생산하는 이형다핵세포의 생성

[0096] 본 발명의 조성물 및 방법은 병원성 유기체로부터 유래되는 면역성 항원을 발현하는 이형다핵세포를 사용한다. 전술한 것처럼, 상기 이형다핵세포는 2 이상의 숙주 균주로부터 생성되고, 여기서 각각의 이형다핵세포는 상이한 다가 백신을 생산하는 것이다.

[0097] 일례는 일플루엔자 항원 변이체를 생산하는 이형다핵세포이다. 그러한 균주를 생성하기 위해서, 고체 배지 기질 상에서 어떠한 영양 부가물 없이 각각의 모 균주의 분생포자 현탁액을 함께 혼합하거나, 또는 내성 유전자를 가진 숙주세포의 경우 세포독성제를 함유하는 배지에서 그렇게 한다. 미량 역가판(microtiter plate) 또는 다른 편리한 형태을 사용한 매트릭스에서 이형다핵세포의 라이브러리를 형성시킬 수도 있고, 미리 예정한 모 균주의 조합으로부터 만들어진 이형다핵세포를 형성시킬 수도 있다. 이용가능한 많은 조합 중 몇몇을 하기 표, 표 2에 설명하는 데, 이것은 예를 들기 위해 주어진 것이지, 어떤 식으로도 한정하려고 하는 것이 아니다.

다가 백신 생산용 이형다핵세포의 생성 모 숙주 세포는 인플루엔자주(株)로부터의 유전자를 함유한다 AH1N1 또는 AH3N2 또는 BHN 포함하는 항원성 변이체 a,b,c,... d,e,f,... g,h,i,... 단일 백신 생산 균주는 사용자의 선택에 따라 생성될 수 있다 이형다핵세포의 구성: 균주 c + 균주 f + 균주 h 또는 백신 생산 균주의 패널은 다음과 같은 이형다핵세포를 생성할 수 있다 이형다핵세포 1의 구성: 균주 a + 균주 d + 균주 g 이형다핵세포 2의 구성: 균주 a + 균주 e + 균주 h 이형다핵세포 3의 구성: 균주 b + 균주 f + 균주 i 등의 원한다면 가능한 모든 조합으로 생성할 수 있다. 여기서: 'A' = A형 인플루엔자; 'B' = B형 인플루엔자; 'H' = 적혈구응집소; 'N' = 뉴라미니다제; "변이체" = 인플루엔자형(型) 및 주(株)의 H 및 N 항원의 항원 종류(classes)의 상이한 조합.

[0098] 전형적인 최소 배지는, 배지가 고체형이 되는 경우, 리터당, 5.0 g 덱스트로스, 염 용액 50.0 mls (아래), 1.0 ml 미량 원소 (아래) 및 12.5 g 한천 (pH 6.5로 조정된 것)을 함유한다. 상기 염 용액은 120.0 g NaNO₃, 10.4 g KCl, 10.4 g MgSO₄ 및 30.4 g KH₂ PO₄를 함유한다.

[0099] 상기 미량 원소 용액은 1.1 g (NH₄)₆Mo₇ O₂₄.4H₂O, 11.0 g H₃BO₃, 1.6 g CoCl₂.6H₂O, 1.6 g CuSO₄, 50.0 g Na₂EDTA, 5.0 g FeSO₄.7H₂O, 5.0 g MnCl₂.4H₂O 및 22.0 g ZnSO₄.7H₂O (pH 6.5)를 함유한다.

[00100] 따라서, 이형다핵세포성 사상 진균을 그 이형다핵세포 상태로 유지하기 위해서, 외적 강제(forcing)가 유지된다. 최소 배지 상에서 이형다핵세포성 진균 세포의 성장은 그 균주가 함께 유지되도록 "강제한다(forces)". 만약 교배형이 반대라면, tol 유전자의 존재가 안정한 (A+a) 이형다핵세포를 유지하는데 사용될 수 있다.

[00101] 다가 백신은 그 항원의 생산에 화합한 조건 하에서 본 발명의 이형다핵세포를 배양하는 것에 의해 생성된다. 그 다가 백신 항원은 그 항원의 구조를 보존하기 위해 필요에 따라 당연히 수정된 표준 기술에 따라 배양체로부터 회수될 수 있고, 정제될 수 있다.

[00102] 바람직하게는, 이형다핵세포성 사상 진균은 숙주를 최소 성장 배지로 직접 원하는 다가 백신을 분비하도록 배양되게 하는 발현 유닛을 함유하고, 그 결과 상기 다가 백신(들)은 세포가 없는 배지로부터 직접 정제될 수 있다. 또는 이형다핵세포성 사상 진균은 세포 표면에 항원을 발현하도록 지시하는 발현 유닛을 함유한다. 세포내에 생산되는 다가 항원은 세포 용해물로부터 분리될 수 있다.

알려진 절차에 따른 유용한 정제 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술에 속하며, 예컨대 분자 크기 배제, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 친화 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등이다.

항원

[00103] 본 발명은 항원성 조성물, 예컨대 병원체에 대한, 특히 그 항원 특성을 변화하는 능력을 나타내는 병원체에 대한 백신의 제조에 관한 것이다. 본 설명된 발명의 용도로 진핵세포성, 바이러스성, 세균성 및 진균성 항원이 모두 고려된다. 본 발명의 또 다른 용도는 많은 상이한 항원을 동시에 대항할 수 있는 항원성 조성물을 제조하는 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예는 다가 인플루엔자 백신의 제조에 관한 것이다. 인플루엔자 바이러스는 언제나 변이하고 새로운 변이주를 생성한다. 따라서, 본 발명에서 사용하는 개개의 유전자들의 목록은 불필요하게 한정되는 것이며, 본 발명은 어떠한 인플루엔자주에도 또는 그 문제에 대한 어떠한 병원체주(株)에도 적용가능하다.

[00104] A, B 및 C의 3개의 인플루엔자 형(型)이 있다. A 및 B 형 바이러스는 거의 매 겨울마다 유행성 질병을 일으키는 반면, C 형 바이러스는 단지 가벼운 호흡기 질환을 일으키며 임상학적으로 중요하게 고려되지 않는다. A 형 인플루엔자 바이러스는 그 바이러스 표면의 2개의 단백질, 즉 적혈구응집소 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)에 따라 아형(亞型)들로 나누어진다.

인간을 감염시키는 A 형 인플루엔자 바이러스의 최근의 아형은 A(H1N1) 및 A(H3N2)이다. 인간도 또한 감염시킬 수 있는 것으로 알려진 조류 인플루엔자 바이러스 (H5N1)에 대해 현재 크게 다루어지고 토론된다.

[00105] 그 인플루엔자 바이러스는 엄청난 항원성 유동(antigenic drift)을 아주 잘 겪는다. 그 바이러스의 항원성 유동을 모니터하기 위해 전세계에서 막대한 노력이 바쳐진다. 그 결과 발생하는 어떠한 새로운 변이주라도 확인될 수 있고, 그 후 주어진 독감 유행시기 내에 인간을 감염시킬 것 같은 균주와 거의 가깝게 일치하는 최신의 백신을 생산하는데 사용될 수 있다. 관심 대상인 인플루엔자 주의 확인과 동시에, 본 발명의 방법이 그 후 백신의 제조에 사용될 수 있는 다가 항원성 물질을 생성하는데 사용될 수 있다

[00106] 또 다른 구체예는 인간에게 말라리아를 일으키는 4가지 종(種)을 포함하는 원생동물의 한 속(屬)인, 말라리아원충(Plasmodium)에 대한 다가 백신의 제조에 관한 것이다. 그 4개의 종의 예는 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax) 및 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)을 포함한다. 다가 백신이 숙고되는 병원체의 일반적인 목록은 인간 유두종 바이러스 16, 18 및 31, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 수두대상(水頭帶狀)포진바이러스 (herpes varicella virus), 홍역 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 3, 제1형 단순포진바이러스 및 제2형 단순포진바이러스를 포함한다. 본 발명에 있어서 목표로 적합한 항원은 숙주에서 면연 반응을 일으키는 것이 가능한 이러한 유기체로부터의 임의의 단백질을 포함한다.

분비된 항원의 분석

[00107] 이형다핵세포 숙주는 고체 최소 배지 상에 보관될 수 있고, 또한 다가 항원의 발현에 유리한 조건하에서 최소 액체 배지 상에서 배양될 수 있다. 2-7일의 성장에 이어, 그 후 액체 배지를 무균 조건 하에서 수집할 수 있고, 각각 특유의 원하는 항원의 존재 여부를 ELISA, PAGE, 모세관 전기영동 및 분광법을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아닌 표준 분석 방법에 의해서 시험할 수 있다.

[00108] 다가 백신의 바람직한 변이체를 생산하는 배양체를 분리하자마자, 고체 배지 상에 보관된 세포를 표준 방법에 의해 더 큰 발효 배양으로 확장시킬 수 있다. 사용된 특정 진균 숙주에 있어서 최적의 조건하에서 성장될 때, 이러한 확장된 숙주 배양은 원하는 생성물을 추가적인 연구 평가 및 재조합 백신으로서의 최종적인 용도에 충분한 양으로 생산할 것이다.

세포 표면 지향(志向) 항원의 분석

[00109] 이형다핵세포를 진균 포자의 표면에 바이러스성 항원을 드러내게 하는 융합 단백질을 발현하도록 만들 수 있다. 일반적으로 진균 세포 표면을 지향하는 선천적인 단백질로 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora)의 EAS 단백질 및 투과효소(permease) 단백질, 뉴로스포라(Neurospora)의 MTR 단백질과 같은 하이드로포빈 단백질이 있다. 이러한 단백질은 바이러스성 항원의 세포 표면 지향 융합 파트너로서 유용하다. 융합 단백질은 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 제조되고 발현된다. 세포 표면에 항원을 발현하는 개개의 균주는 표준 분석 방법에 의해 분석될 수 있다. 이러한 방법으로는 바이러스성 항원에 특유한 항체에 의해 직접 또는 간접적인 세포 표지를 하고, 이어서 다양한 수단으로 특유한 결합을 탐지하는 방법을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 그러한 수단은 ELISA, 시각 또는 형광 분광법 및 흐름세포측정(flow cytometry)를 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 뒤에 융합될 수 있는 항원을 발현하는 개개의 균주는 각각 발현된 표면 항원의 동시 발현에 대해 다시 시험되고, 그에 따라 직접적으로 또는 정제 후 중 어느 하나에서 재조합 백신에 유용한 면역 시스템에서의 다가 표적을 만든다.

비(非)분비 항원의 분석

[00110] 만약 항원이 분비되지 않는다면, 각각의 액체 배양체 내의 세포 덩어리는 표준 방법에 의해 제거되고, 파열되며, 그 세포 상청액(上淸液) 및 조직파편은 바람직한 특징을 갖는 다가 백신에 대해 분석된다. 일단 원하는 변이체를 생산하는 균주가 표준 방법에 의해 분리되면, 고체 배지 상에 보관된 그 균주를 접종하여 확장된 배양을 하게 하는데 사용될 수 있다. 특정 이형다핵세포에 있어서 최적의 조건 하에서 자란 경우, 이러한 확장된 숙주 배양은 추가적인 측정 및 사용에 충분한 양으로 원하는 생성물을 생산할 것이다.

[00111] 하기 실시예들은 예증을 위해 제공된 것이지 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예 1

합성 HA 유전자 제조

[00112] 합성 유전자 (A/New Caledonial/20/1999/H1N1의 HA0, A/Vietnam/1194/2004/H5N1의 HA 및 A/Vietnam/1194/2004/H5N1의 M1)를 하기 방법에 의해 디자인하였다.

[00113] 각각의 유전자에 대한, 아미노산 서열을 공공 NCBI 데이터베이스로부터 얻었다. HA 및 HA0 유전자에서, 본래의 선도(leader) 서열을 진균 신호 서열 로 대체하였다.이러한 서열을 사용하는 경우, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 코돈 선호를 사용하여 진균 발현용 유전자를 역번역하고, 코돈 최적화하였다. 그 서열을 낮은 자유에너지 형태로 고치는데, 이는 초기 mRNA에서의 2차 구조를 감소시키도록 계산된 것이다. 그 결과로서 생기는 유전자는 인트론 스플라이싱 제공 및 수용 부위가 찾아지는 선(線)이었다. 그러한 부위를 제거하기 위해 서열을 변화시킨 후에, 그 서열에서 전사 종결 위치를 또한 조사하고, 임의의 우발적인(fortuitous) 위치를 제거하였다.

[00114] 그 후 최적화된 서열을 서열분석 하였다. 그 결과 DNA를 E. coli에 서브클로닝 하고, 그 후 서열분석을 하여 합성의 오류 여부를 조사하였다. 서열 확정 후, DNA를 발현 백터(HA 및 HA0 유전자의 경우 pHDKXL1, M1 유전자의 경우 pALGAM) 속으로 서브클로닝 하고, 뉴로스포라(Neurospora) 안으로 형질전환시켰다. HA 및 HA0 유전자를 뉴로스포라(Neurospora)의 His-3 위치에 통합시키는 것이 목적이고, M1 유전자를 뉴로스포라(Neurospora)의 Am 유전자에 통합시키는 것이 목적이었다.

실시예 2

N. 크라사( N. crassa )에서 HAO 의 발현

[00115] 실시예 1에서 논의한 것처럼, 단백질 생산을 촉진하기 위해 붙여진 진균 신호 서열과 함께 합성 적혈구응집소 0 (HA0) 유전자를 암호화하는 발현 백터를 만들었다.

[00116] 형질전환주는 히스티딘-3에서의 돌연변이을 가진 숙주 균주를 사용 하여, 히스티딘 원영양체(prototrophy) (pHDKXL1/HA 또는 HA0 형질전환주) 또는 하이그로마이신 B 내성 (pALGAM/M1 형질전환주) 어느 것이라도 선택될 수 있다. 선택 배지에서의 반복적인 스트리킹에 의한 형질전환된 균주의 정제 후, 형질전환주를 ELISA에 의해 상기 유전자의 발현에 따라 선별하였다. 분비된 인플루엔자 하원을 진탕 플라스크로부터 배지 내에서 탐지하였다. 125 ml 얼렌마이어 내에 25 ml 최소 보겔 염과 0.5% 효모 추출물을 함유하는 플라스크에 대략 100만 분생포자/ml로 접종하였다. 시료를 26℃에서 200 rpm 진탕과 함께 또는 같은 온도에서 정적 배양 중 어느 하나에 의해 성장시켰다. 성장 2, 3, 4, 5 및 6 일 후에 시료를 채취하였다. ELISA는 인플루엔자 단백질에 대한 항체를 사용하도록 개발된 것으로 BIODESIGN사로부터 구입한 것이었다. 표준적으로 사용된 대조구 항원을 Protein Sciences Corporation사로부터 구입하였다. ELISA-양성 시료를 표준 방법 및 시료를 사용한 웨스턴블롯으로 재선별하였다.

[00117] 다양한 성장 조건을 시험하였다. 특히, 진탕 및 정적 배양을 특별히 시험하였다. 일반적으로, 효모를 2 내지 6일 동안 배양하고, 분석을 위해 시료를 채취하였다.

[00118] 시료를 SDS-PAGE 에 의해 분별시키고, 영상을 위해 니트로셀룰로스로 블로팅시켰다. 적혈구응집소를 염소 폴리클론 항HA(H1N1) 항체를 사용하여 탐지하였고, 항염소 Ig-알칼리성 인산염의 결합이 이어졌다. 결합을 비색계 탐지에 의해 측정하였다.

[00119] N. 크라사(N. crassa)에서 합성 HAO 발현의 웨스턴 블롯 탐지결과가 도 7에 있다. 도 8은 2개의 상이한 HAO 클론으로부터의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 도 9는 HA05의 정적 배양 발현의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 이러한 데이터는 진균에서 인플루엔자 단백질을 재조합적으로 발현하는 본 발명의 시스템의 능력을 실증한다.

실시예 3

진균성 이형다핵세포에서 인플루엔자 항원의 다가 발현

[00120] 발현 백터를 실시예 1에서 논의된 방법에 따라 제조하였다. DNA를 전기천공법에 의해 뉴로스포라(Neurospora) 내로 넣고, 실시예 2의 방법에 따라 형질전환주를 선별한다. 발현 백터가 HA0, HA 및 M1 매트릭스 단백질을 암호화하기 때문에, 인플루엔자 바이러스 단백질의 다가 혼합물이 배양체로부터 생산된다.

[0013] 도 1은 합성 적혈구응집소(hemagglutinin) 0 (HA0) 유전자 (A/New Caledonial/20/1999/H1N1)의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:1) 및 진균 발현에 대한 개념적 번역(comceptual translation)을 나타낸다. 개시 코돈이 밑줄쳐져 있다.

[0014] 도 2는 합성 적혈구응집소 0 (HA0) 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2)을 나타낸다. 진균 신호 서열은 굵은 글씨로 표시된다.

[0015] 도 3은 합성 적혈구응집소 (HA) 유전자 (A/Vietnam/1194/2004/H5N1)의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:3)을 나타낸다. 개시 코돈이 밑줄쳐져 있다.

[0016] 도 4는 합성 적혈구응집소 (HA) 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 (SEQ ID NO:4)을 나타낸다. 진균 신호 서열은 굵은 글씨로 표시된다.

[0017] 도 5는 합성 M1 매트릭스 단백질 (A/Vietnam/1194/2004/H5N1)의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:5)을 나타낸다. 개시 코돈이 밑줄쳐져 있다.

[0018] 도 6는 M1 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 (SEQ ID NO:6)을 나타낸다.

[0019] 도 7은 N. 크라사(N.crassa)에서 합성 HA0의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검출을 나타낸다. HAO5 및 HAO8 균주뿐만 아니라 형질전환되지 않은 대조구(C)와 대조구 HA 50 및 200 ng (A/New Caldonia 20/99, Protein Sciences)의 2일의 진탕 플라스크 배양으로부터의 배지를 SDS PAGE에 의해 분별시키고 니트로셀룰로스에서 블롯시켰다. 적혈구응집소가 염소 다클론성 항HA (H1N1) 항체(BioDesign사 제품)를 사용하여 검출되었고, 이어서 항염소 Ig-알칼리성 인산분해효소 짝지음 및 비색법(比色法)에 의한 탐지가 잇따른다.

[0020] 도 8은 HAO5 및 HAO8의 2일의 진탕 플라스크 배양으로부터의 배지의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색된 겔을 나타낸다. 이러한 조건 하의 진탕 플라스크에서 2일까지 생산된 분비 단백질은 상대적으로 거의 없다.

[0021] 도 9는 HAO5의 정적 배양 발현을 나타낸다. HAO5의 6일간의 정적 배양으로부터의 배지의 웨스턴 블롯. HA 단백질은 상기 도 7에서와 같이 검출되었다. 이 실험에서, 대조구 HA 단백질 (C)의 72 kDA과 대비하여 주 검출 밴드는 ~57 kDa에 있다.

<110> NEUGENESIS CORPORATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR COMBINATORIAL-BASED PRODUCTION OF MULTIVALENT RECOMBINANT ANTIGENS <130> KP-CH-077419/HJJ <150> US 60/619,364 <151> 2004-10-15 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1718 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hemagglutinin 0 (HA0) gene (A/New Caledonial/20/1999/H1N1) <400> 1 agatcttcgc aatgaagttt cttcaagttc ttccagcact catccccgcc gcgctcgccc 60 aagaccaaat ctgcatcgga tatcatgcaa acaactccac cgaacaagtc gataccatta 120 tggaaaagaa cgtcactgtt acccatgcac aagacatcct ggaaaaaacg cacaacggca 180 aactctgtga cctggacggg gtcaagcccc ttattttgcg cgattgctca gtcgccggct 240 ggctcctcgg aaacccaatg tgcgacgagt ttatcaatgt ccccgagtgg tcttatattg 300 ttgaaaaagc caacccagtg aacgatctgt gctatcccgg cgattttaac gactacgaag 360 agctcaaaca ccttctctcc cgtatcaatc actttgagaa gattcagatc atccccaagt 420 cctcctggag cagtcacgag gcatcactgg gcgtcagcag cgcctgtcct tatcagggca 480 agtcctcttt ctttcgcaac gtcgtctggc tcatcaagaa gaactccacg tacccaacca 540 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caacgttaag aacctctacg acaaggtgag actccaactc cgcgacaacg 1440 ctaaggagct tggcaacggt tgctttgagt tctaccacaa gtgcgataac gaatgcatgg 1500 aatccgtcag aaatggcacc tacgactacc cccaatactc cgaagaagca cgattgaatc 1560 gcgaagaaat ttctggtgtc aaacttgaat ctatcggaat ctaccaaatc ctctctatct 1620 actcaaccgt cgcttcctcc ctcgccctcg ctatcatggt tgccggtctt tctctctgga 1680 tgtgttcaaa tggctccctt caatgtcgct aatctaga 1718 <210> 2 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hemagglutinin 0 (HA0) amino acid sequence <400> 2 Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gln Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr 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Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile 515 <210> 3 <211> 1718 <212> 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caagccaaac gacgccatca 780 acttcgaatc aaatggcaac ttcatcgcac ccgaatacgc ctacaagatc gtgaaaaaag 840 gagatagtac aatcatgaag tcagagcttg aatatggcaa ctgtaatacg aagtgtcaaa 900 ctcccatggg ggcgatcaat agcagcatgc ctttccataa cattcacccc cttactattg 960 gcgaatgccc aaaatatgtc aagtcgaatc gcctcgtgct cgcaaccggc cttcgcaact 1020 ctccccagcg cgaaaggagg cggaagaagc gcggtctttt cggtgcaatc gcaggcttca 1080 tcgaaggcgg atggcagggc atggtcgacg gctggtacgg ataccatcac tcaaacgaac 1140 aaggctctgg ttatgcagcg gacaaggaat cgacacaaaa ggcaattgac ggcgtcacca 1200 acaaagttaa ctctattatc gacaaaatga acacccaatt cgaggccgtg ggacgtgaat 1260 ttaataacct cgagcgccgc atcgagaact tgaacaaaaa gatggaggat ggcttcttgg 1320 acgtctggac ttacaatgcc gagttgctcg tgctcatgga aaatgaaaga acgctcgact 1380 tccacgattc caacgttaag aacctctacg acaaggtgag actccaactc cgcgacaacg 1440 ctaaggagct tggcaacggt tgctttgagt tctaccacaa gtgcgataac gaatgcatgg 1500 aatccgtcag aaatggcacc tacgactacc cccaatactc cgaagaagca cgattgaatc 1560 gcgaagaaat ttctggtgtc aaacttgaat ctatcggaat ctaccaaatc ctctctatct 1620 actcaaccgt cgcttcctcc ctcgccctcg ctatcatggt tgccggtctt tctctctgga 1680 tgtgttcaaa tggctccctt caatgtcgct aatctaga 1718 <210> 4 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hemagglutinin (HA) <400> 4 Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gln Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln 20 25 30 Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp 35 40 45 Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val 50 55 60 Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe 115 120 125 Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala 130 135 140 Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr 165 170 175 Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr 195 200 205 Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln 210 215 220 Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser 225 230 235 240 Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile 245 250 255 Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys 260 265 270 Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr 275 280 285 Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300 Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala 340 345 350 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp 355 360 365 Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp 370 375 380 Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn 385 390 395 400 Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu 405 410 415 Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu 420 425 430 Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu 435 440 445 Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn 450 455 460 Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu 465 470 475 480 Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met 485 490 495 Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu 500 505 510 Ala Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile 515 520 525 Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu 530 535 540 Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn 545 550 555 560 Gly Ser Leu Gln Cys Arg 565 <210> 5 <211> 776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic M1 matrix protein (A/Vietnam/1194/2004/H5N1) <400> 5 agatcttcgc aatgtctctt ctcactgaag ttgaaactta cgtgctttcc atcatcccgt 60 ctggtccact caaagctgaa atcgcacaaa aacttgaaga tgtcttcgcc ggcaagaaca 120 ctgatctcga agctctcatg gaatggctga aaacgcgccc gattctctca ccactcacca 180 agggcatcct cggttttgtc tttaccctta cagtcccctc agaacgcgga ctccaaagac 240 gtagatttgt gcaaaacgcc ctgaacggta acggagaccc taacaatatg gaccgcgcag 300 tcaagctcta caaaaaactc aagagagaga ttactttcca cggtgctaag gaagttgccc 360 tctcatattc taccggtgct ctcgcttctt gcatgggcct catttacaac cgcatgggaa 420 cggttaccac tgaagttgct tttggccttg tctgcgccac atgcgaacaa attgctgact 480 ctcaacatcg ctctcatcgt caaatggcca caatcacaaa ccccctcatc cgacacgaaa 540 atagaatggt cctcgcatca acaacagcaa aggctatgga acaaatggca ggctcatcag 600 aacaggcagc cgaagctatg gagatcgcaa accaagcccg acagatggtt caagctatgc 660 gcaccattgg cactcaccct aattcctcag caggtcttag agacaatctc ctcgaaaatc 720 ttcaagccta ccaaaaacga atgggcgtcc aaatgcaacg ctttaaataa tctaga 776 <210> 6 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic M1 protein <400> 6 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Ile Ala Asn Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250

Claims (15)

1. 다가 재조합 항원 변이체를 생산하고, 2 이상의 진균 모 균주의 융합에 의해 형성되는 사상 진균의 이형다핵세포(heterokaryon)로서,

   여기에서 상기 이형다핵세포는 생존을 위해 모든 진균 모(母) 핵의 존재를 요구하고, 상기 진균 모 균주 각각은 병원성 유기체로부터 유래 된 항원 변이체를 암호화하는 외인성으로 공급된 핵산 분자를 함유하고, 상기 진균 모 균주는 모든 이형다핵세포 화합성 대립유전자에 대해 동형접합성인 것인 이형다핵세포.
2. 제1항에 있어서, 상기 다가 항원은 가용성 단백질로서 배양 배지로 분비되는 것인 이형다핵세포.
3. 제2항에 있어서, 상기 다가 항원은 입자로 응집하는 것인 이형다핵세포.
4. 제1항에 있어서, 상기 다가 항원은 그 진균 이형다핵세포의 표면에 표시되는 것인 이형다핵세포.
5. 제1항에 있어서, 상기 다가 항원은 그 진균 이형다핵세포의 세포질 내에 보유되는 것인 이형다핵세포.
6. 제1항에 있어서, 상기 병원성 유기체는 바이러스인 것인 이형다핵세포.
7. 제1항에 있어서, 그 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 인간 유두종 바이러스 16, 인간 유두종 바이러스 18, 인간 유두종 바이러스 31, 수두대상(水頭帶狀)포진 바이러스, 홍역 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 3, 제1형 단순포진바이러스 및 제2형 단순포진바이러스로 구성되는 군중의 하나인 것인 이형다핵세포.
8. 제1항에 있어서, 그 바이러스 항원은 A형 인플루엔자 및 B형 인플루엔자로부터 유래 되는 것인 이형다핵세포.
9. 제4항에 있어서, 그 항원은 A형 인플루엔자 및 B형 인플루엔자의 적혈구응집소 및 뉴라미니다제(neuraminidase)의 변이체를 포함하는 것인 이형다핵세포.
10. 제1항에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 및 B형 인플루엔자의 적혈구응집소 및 뉴라미니다제(neuraminidase)의 변이체 각각은 자연적으로 발생하는 변이체인 것인 이형다핵세포.
11. 제1항에 있어서, 각각의 상기 A형 인플루엔자 및 B형 인플루엔자의 적혈구응집소 및 뉴라미니다제(neuraminidase)의 변이체는 자연적으로 발생하는 서브유닛 변이체가 아닌 것인 이형다핵세포.
12. 제1항에 있어서, 상기 병원성 유기체는 세균인 것인 이형다핵세포.
13. 제1항에 있어서, 상기 병원성 유기체는 진균인 것인 이형다핵세포.
14. 제1항에 있어서, 상기 병원성 유기체는 바이러스, 세균 및 진균 유기체의 임의의 및 모든 조합의 혼합물을 포함하는 것인 이형다핵세포.
15. 외인성으로 공급되는 핵산 분자가 발현되는 조건하에서 제1항의 이형다핵세포를 배양하여 다가 백신을 형성시키는 단계를 포함하는 다가 백신의 생산 방법.

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