JPH0372870A - サッカロミセスセレビーセの改良超分泌性変異体とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） イースト細胞は遺伝子の異種産生物を産生ずる宿主とし
て有用であることが知られている。パン焼き用イースト
であるサ　カロミセスセレビーセのようなイーストは簡
単な培地中で、廉価に、高い細胞密度に細胞を成育させ
ることができるので、有用な遺伝子技術と分子遺伝学的
方法が利用できる。したがって、人、アルファー１−ア
ンチトリプシンの製薬やＢ型肝炎用ワクチンがイースト
細胞の原形質中でつくられ、細胞を溶解して、目的とす
る蛋白質を精製することによって単離する。

（Ｖａｌｅｎｚｎｅｌａ、　Ｐ、＋等Ｎａｔｕｒｅ　　
２９８巻３４７−３５０頁（１９８２）；　Ｔｒａｖｉ
ｓ、　Ｊ、、等Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０
巻４３８４−４３８’９頁（１９８５））　　ｌ、かし
ながら、成る種の蛋白質、例えば、プロキモシンおよび
プロウロキナーゼ（又、単鎖のウリナリープラスミノゲ
ンアクティベーター、或いは５ｃｕ−ＰＡ）はもつとず
−っと効率的に、イースト細胞の分泌で産生される、明
らかにそれらの蛋白質は普通それらの本来の宿主細胞か
ら分泌される、そしてポリペプチド鎖の形態は正しく、
二硫化結合は分泌過程でのみつくられる。（Ｓ＋５ｉｔ
ｈ、　Ｄｕｎｃａｎ、およびＭｏ１ｒ、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２２９Ｓ　１２１９−１２２４頁（１９８５）；　
Ｍｏ１ｒ等、第９回線維素溶解に関する国際会議からＡ
ｂｓｔｒａｃｔ　１９．　　アムステルダム、オランダ
国（１９８８））。

イースト細胞から得られる異種蛋白質の分泌量は限られ
たものである。大部分の非イースト蛋白質はイースト細
胞からは全く非効率的にしか分泌されない。例えば、以
下に示すすべての場合、少なくとも異種蛋白質は細胞内
に見られる程しか、ブイヨン培養時に細胞の外部に見い
だされない、或いはせいぜい細胞膜と壁との間に見いだ
されるにすぎない。このことは子牛プロキモシン（Ｓｍ
ｉｔｈＤｕｎｃａｎ、およびＭｏ１ｒ、　５ｃｔｅｎｃ
ｅ　　２２９巻１２１９−１２２３頁（１９８５））　
、人、アルファー１−アンチトリプシン（門ｏｉｒおよ
びＤｔｖａｉｓ＋　Ｇｅｎｅ　　５６巻　２０９−２１
７頁（１９８７））人、テッシュブラスミノゲンアクチ
ベータ（Ｌｅｍｏｎｔｔ等、、　［ｌＮＡ　４巻４１９
−４２８頁（１９８５））、アンカー・マイナスインフ
レンザヘムアグルチニン（ＪａｂｂａｒおよびＮａｙａ
ｋ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　　７巻１４
７６−１４８５頁（１９８７））アルファ・インターフ
ェロン（）Ｉｉｔｚｅｍａｎ等５ｃｉｅｎｃｅ　２１９
巻６２０−６２５頁（１９８３）　）、コンセンサスイ
ンターフェロン（Ｚｓｅｂｏ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｌｌｌ、　２６１巻５８５８−５８６５頁（１９
８６））、　　ミュアリンランダおよび逅ユイムノグロ
プリン鎖（Ｗｏｏｄ等、Ｎａｔｕｒｅ　３１４巻４４６
−４４９頁（１９８５））および人、リゾチーム（Ｊｉ
ｇａ＋ｗｉ等　Ｇｅｎｅ　４３巻２７３−２７９頁（１
９８６））においてもいえることである、明らかに、こ
れらの方法はこれらの蛋白質およびその他の非イースト
蛋白質のイースト細胞からの分泌の効率を増加させる必
要がある。そのような方法があれば、治療上の、および
工業的に有用な蛋白質をもっと経済的に供給し得るだろ
う。

（従来の技術） ＤｕｎｃａｎおよびＳａ＋ｉｔｈ　（ヨーロッパ特許出
ＶＪＭＥＰ２０１２０３号明細書４月８日、１９８６年
）は、突然変異体イースト細胞によってイーストからの
異種蛋白質の分泌の収率を増加させ、目的とする突然変
異体細胞を選択する方法について記載した。これらの方
法は有効な方法で、多くの異った“超分泌“突然変異体
をもつ新しいイースト株を得た。そこには例えば鎚虹、
　鎚４および鎚Ｑのような、異種蛋白質分泌の収率を十
分に増加させた突然変異体を含んでいる。しかしながら
、これ等突然変異は生きたイースト細胞に化学的な突然
変位起源の方法を与えて得られるので、そしてそのよう
な方法は、得られた突然変異が非漏出或いは非回復であ
るかどうか確かでない方法で得られている。更にこれら
の方法は非機能的遺伝子産生物を生ずる突然変異と異っ
た機能をもった遺伝子産生物を生ずる突然変異との間の
区別がつかない。

漏出型突然変異とは遺伝子の活性を完全に封じることが
出来なくて、そのため、若干の機能の残留表現が残って
いる突然変異のことである。

（Ｌ　Ｈａｙｅｓ、″バクテリヤおよびそのビルスの遺
伝学”　（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒＶｔｒｕｓｅｓ”）第２
版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、
＋ＮＹ、　３２０頁（１９６８））遺伝子の活性を完全
に封じて、非機能的にする、Σ辺遺伝子に対する非漏出
型突然変異は、ＳＳＣ遺伝子の活性が全体として削減さ
れているであろうので、よりよい超分泌株が得られるい
とう期待がもてる。

化学的手段によって誘導された多くの突然変異は、Ｄｕ
ｎｃａｎ及びＳｌｌ　ｉ　Ｌｈが指摘しているように、
（ｕ匹と１９８６）生きている細胞全体に処理が加えら
れ、単一のヌクレシドに変化をもたらす点状突然変異で
ある。　ＤＮＡ配列の失火や切断を起す場合に対して、
このような点状突然変異はしばしば漏出型突然変異であ
る。更に多く、の点状突然変異は、野性遺伝子への真の
回復によって回復することがある或いは表現型が種々の
形の抑制によって回復するかもしれない。真の回復が起
らない、或いはフレーム・シフトナンセンス、或いは遺
伝子内等種々の抑制因子（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）によ
って抑制されない超分泌突然変異が有用であり、か＼る
突然変異を与える方法がイースト細胞による異種分泌を
改良するのに有益である。

ＤａｃａｎおよびＳｍ１ｔｈ　　（ｕ匹と１９８６）の
突然変異は、概ね有用であるが、これらの突然変異体を
生成する方法は非漏出の非回復性の超分泌株を確実に提
供しない、結果として、超分泌型株の最も有用な形を提
供していない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的の一つは高レベルで異種蛋白質を分泌する
、そして非漏出で非回復性の改良された、超分泌型イー
スト突然変異体株を提供することである。

本発明の今一つの目的はハプロイドイースト株を非漏出
で非回復性の超分泌型株に変える簡単な操作法（ｐｒｏ
ｃｅｅｄｕｒｅｓ）を提供することである。

本発明の今一つ他の目的は株中の遺伝子を切断して遺伝
子をしてもはや機能的な蛋白質を産生出来ないようにす
ることによって、超分泌性イースト株を得る方法を提供
することにある。

本発明の今一つ他の目的は超分泌性突然変異体を相補す
る、野性型遺伝子をクローニングする方法を提供するこ
とにある。

本発明の更に他の目的は、こ覧に提供するＤＮＡ配列を
もった、単一の形の（ｉｎ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｏｒ
ｍｒ）ＳＳＣＩ遺伝子を提供することである。

本発明のもう一つの目的は超分泌型イースト突然変異体
を選別する新しい方法を提供することにある。

本発明によれば、機能的蛋白質を産生ずることが出来な
い切断された遺伝子を持つ超分泌性イースト細胞或いは
株は非漏出であり、非回復性である。そして異種の蛋白
質の多量を分泌する。多分この遺伝子は５ｓｃｉとして
よい。この遺伝子はＡＴＰアーゼと相同的な蛋白をコー
ドしている。この遺伝子はグリコプロティンに対するマ
ンノーズ付加を調節する蛋白質をコードしている。

第５図に示したアミノ酸とヌクレオチド配列をもつサツ
カロ嵩セスセレビーセの超分泌性ＳＳＣ１遺伝子は単離
され、はっきりと決定された。

異種の蛋白質を分泌するイースト細胞或いは株から蛋白
質産生物を得る方法を提供する。この方法は５ｓｃｔ遺
伝子内部でＥｃｏＲＩ部位より以降のすべてのコードを
欠落させたＳＳＣ１遺伝子をもつ細胞あるいは株を選別
することより戒る。そこでこの株が蛋白質を分泌するべ
く培養される。

本発明の工程の一つにおいて、非回復性かつ非漏出な超
分泌イースト株かえられ、その株は分泌蛋白質産生物を
産生ずるべく育成する。この細胞はその中の遺伝子がａ
）少な（とも一つの他の遺伝子でもって切断されるか或
いはｂ）遺伝子の一部が欠落することによって一連の細
胞が、非回復性にかつ非漏出になるよう変化した、その
一連の細胞から導びかれる。

野性の対立遺伝子は、第１レベルの発芽できるＳＳＣ突
然変異に相同的なジプロイド株を選択し、少くとも異質
的な状態が一つの劣性な薬品耐性マーカーをもつことに
よって得られる。この株を発芽条件におき、薬品耐性マ
ーカーを持ち、そのマーカーが耐性を与える薬品に抵抗
性を持つハプロイド株が結果として選択される。

今一つ別の方法ではＳＳＣ遺伝子の野性対立遺伝子のク
ローニングは組換えＤＮＡを持ち、第１レベルで異種蛋
白質を分泌出来るＳＳＣ株を選んで行われる。野性イー
ストゲノムから切り出された１）ＨＡ断片を持つプラス
ミツドの集団（ａ　１ｉｂｒａｒｙ）が多数の株をつく
るために導入され、得られた株から、第１レベルより低
いレベルで異種蛋白質を分泌する株が選択される。また
一つの他の方法では、この選別が、最初の（ｂｅｇｉｎ
ｎｉｎｇ）の株から分泌されるマンノーズの第１レベル
より大きいマンノーズの第２レベルを付加する結果を得
た株を選んで行なわれる。

（課題を解決するための手段） イースト細胞に、超分泌型を与える上記突然変異体の野
性型をコードするＤＮＡを単離する方法が見出された。

この方法は、機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）でない蛋
白質産生物を産生ずる遺伝子の型が有用な超分泌型の真
の成因を与える（ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒ）かど
うかを決定することが出来る。我々はこの機能の欠落は
超分泌株をつくる、と決定した。ハプロイド株中の適当
な遺伝子に非機能性産生物を産生ずる遺伝子型を置換し
、それによってイースト株を超分泌型イースト株に変え
るのに種々の方法がある。

本発明の方法を追跡することによっていかなるハプロイ
ドイースト株をも超分泌型株に変えられるのみならず、
この新しい超分泌型イースト株は又Ｄｕｎｃａｎ及びＳ
ｓ＋ｉｔｈ　　（ｓＭ！Ｌ！Ｌ１９８６）によって提案
された株よりも良い性質をもっている１例えば、本発明
の方法によってつくられた新しい突然変異種は、フレー
ムシャフト、ナンセンス、或いは遺伝手内抑制剤によっ
て、回復されたり、抑制されたりしない、だから変異種
は大規模醗酵にも使えるし長期間の連続醗酵にさえも、
醗酵種子（ｆｅｒｗｅｎｔｏｒ　５ｅｅｄ　５ｔｏｃｋ
）を再クローニングする必要がない。

次に示す諸方法は機能的蛋白質産生物を産生しない、超
分泌遺伝子の型をつくり、野性のイースト株に挿入する
のに用いられる。イーストの挿入タイプの形質転換は事
実上専ら、相同的組み換えによっておこなわれ、特別の
遺伝子位置に直接挿入させることが出来る。例えば０ｒ
ｒ−Ｗｅａｖｅｒ等、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　１０１巻２２８−２４５頁（１９８３
））はイースト細胞を、プラスミツド上のイースト遺伝
子内で制限エンドヌクレアーゼで切断して直鎖にしたプ
ラスミツドを用いて形質転換すると殆んどの場合、イー
スト染色体内のそのイースト遺伝子内（ｗＨｈｉｎ）に
挿入されることを示した。この観察を延長して、Ｒｏｔ
ｈｓｔｅｉｎ等（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｙｙｍｏ
ｌｏｇｙ１０１巻２０２−２１１　（１９８３））はイ
ーストＤＮＡの直鎖状断片はイースト染色体内の相同的
断片におきかわることを示した。だから、これ等の方法
を用いて、興味の対象の遺伝子の配列がわかっていれば
イースト細胞中のその遺伝子を形質転換によって切断し
たり欠落させたりすることができる。

例えば、どのハプロイドイースト株のｈ奴型でも、窒素
源としてアルファ・アミノアジペートを含む寒天培質上
で育成して選別して得ることができる。（Ｃｈａｔｏｏ
等Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９３巻５ｌ−６５Ｗ　（１９７９
））、このクローンされた４録遺伝子（Ｂａｅｎｅｓお
よびＴｈｏｒｎｅｒ＋　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｔｏ
ｌ、　６巻２８２２−２８３８頁（１９８６））　ラフ
ローンした鎚り遺伝子のそのコードされた領域に導入で
きる、だから読みとり枠＜ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ
）を切断、あるいはそのコドンの部分をおきかえること
ができる。ｈ姪をもっていない宿主株をＢ遺伝子で切断
したｓｓｃ遺伝子をもつ直鎖状ＤＮＡ断片で形質転換し
て、Ｌｙｓ　’の形質転換体を選別するとＳＳＣ遺伝子
が切断された型のものと置換されている。

新しい方法では又、適宜に指定した遺伝子に対して、そ
の遺伝子を用いて形質転換して超分泌イースト株をつく
ることが出来ることが見出された。

驚くべきことに、この遺伝がコード付けしている蛋白質
は高度にＡＴＰアーゼに相同しており、そしてこの遺伝
子がコード付けしている蛋白質は他の蛋白質にマンノー
ズ炭化水素を付加することに関与している、このような
遺伝子が超分泌イースト株を産生ずるように形質転換で
きることが判明した。

例えば、こ＼に配列が提供されたｌ蛋白質は多くのＡＴ
Ｐアーゼに高度に相同的であり、加うるにこの遺伝子に
形質転換した細胞は驚くべきことに、短かいマニノーズ
外部鎖をもつインベルターゼを分泌させる。更にＳＳＣ
１遺伝子の非機能性型をもつ細胞は超分泌性形質転換体
である。

カチオンを輸送する＾ＴＰアーゼはバクテリア、真菌お
よび哺乳動物の細胞中に存在し、お互に全く相同的であ
る。これら酵素は栄養の吸収に関与し、細胞中のＨ”、
　Ｃａ”およびに゛の濃度を調節していると思われる。

若干のイースト＾ＴＰアーゼの遺伝子がクローンされた
、（Ｓｅｒｒａｎｏ、　Ｒ０＋　Ｋｉｅｌｌａｎｄ−Ｂ
ｒａｎｄｔ、　Ｍ、　Ｃ，、およびＦｉｎｋ、　Ｇ、　
Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ　３１９巻６８９−６９３　（１９８
６）；　１ｌｕｄｏｌｐｈ、　Ｈ，、Ａｎｔｅｂｉ、　
Ａ、およびＦｕｎｋ、　Ｇ、　Ｒ，イースト遺伝学およ
び分子生物学に関する１４回国際会１１ｓ３５７．　Ｊ
ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　　＆５ｏｎｓ、　Ｌｔｄ、　（１
９８８））そして、この［ｌＮＡ、　　ＰＭＡＩすなわ
ちイースト原形質膜（ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｕｅ
）　ＡＴＰアーゼのアミノ酸残基の配列は公表された（
Ｓｅｒｒａｎｏ。

Ｒ１１等」出出（１９８６）　）、ＰＭＡＩ機能を取り
除く形質転換は、イースト細胞には致命的な処理で、そ
の他の関係ＡＴＰアーゼの形質転換は、イースト細胞に
有害な効果を与えると予想される、なぜならか＼る蛋白
質は膜輸送およびイオン平衡に関係すると思われもので
あるから、驚くべきことに高度にＡＴＰアーゼに相同的
である、成る種の蛋白質出量のような、の遺伝子におこ
なう形質転換は、有用な細胞を生み出す、特に、ずっと
効率的に多くの異種蛋白質を分泌する細胞を生み出す。

グリコプロティンに付加するマンノーズ鎖の大きさの変
化ばか繁る超分泌形質転換体の表現型（ｐｈｅｎｏ　ｔ
ｙｐｅ）の一部であって、かような形質転換が、グリコ
プロティン同様多くのグリコジル化されていない蛋白質
の分泌収率を増加させるのは明らかである。かくてより
短かいマンノーズ鎖が単に、より小さな異種蛋白質が細
胞膜或いは壁をより簡単に通す（ｅｓｃａρｅ）ことで
はないのである。むしろこの効果は、突然変異細胞それ
自身の生理によるものに違いない。

多くのいろいろな遺伝子に起る突然変異がイースト分泌
過程でのグリコプロティンに付加するマンノーズ残基の
数に影響を与えることが知られている。グリコジル化は
２つの基本的段階を経て起り、その段階に突然変異が影
響することが説明されて来た。最初は、マンノーズ残基
の中心部単位（ｃｏｒｅ　ｕｎＩｔ）　％　Ｎ−アセチ
ル・グリコサミン残基、およびグルコーズ残基如すビッ
ト中間体上に形成され、ついで細胞の小胞体中のグリコ
プロティン上の適当なアスパラギン残基に移る。Ｈｕｆ
ｆａｋｅｒおよびＲｏｂｂｉｎｓ　Ｕ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｗ　２５７巻３２０３−３２１０頁（１９８２）
；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ８０巻７４６６７４７０頁（１９８３）　）の
指摘した紅虹突然変異は、この過程の段階の多くに影響
を与えた。第２にこの中心の単位が、グリコプロティン
に付加して後着るしい修飾をうける（ｍｏｄｉｆｙ）　
、そしてこの変化は細胞のゴルジ部内でおこる。マンノ
ーズ残基によっては、除去されるが、何首という単位が
、外部鎖（ｏｕｔｅｒ　ｅｈａｊｎ）として知られてい
る長い調和した構造として、集中的に（ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｖｅｌｙ）に付加される。［ｌａｌｌｏｗおよびその
協同研究者（Ｃ，Ｅ。

Ｂａ１ｌａｅ、”イーストサツカロミセスの分子生物学
の中の、メタボリズムおよび遺伝子発現”ＧｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｄｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ
、Ｙ、　３３５−３６０頁（１９８２））のいうａ＋ｎ
ｎ突然変異体は、この過程の段階に影響を与える。

驚くべきことに、１遺伝子に起る突然変異は、成る種の
相同的蛋白質の分泌にのみでなく、インベルターゼのよ
うな分泌性蛋白質上のマンノーズの大きさにも影響する
ことがわかった。反対に我々は又ニおよびｍ突然変異は
、より短かいマンノーズ書貞をもったインベルターゼを
分泌するのみでなく、又若干の異種蛋白質をもより効率
よく分泌することが明らかになった。だから異種蛋白質
をより効率的に分泌するある細胞の新しい特性が明らか
になった。より短かいマンノーズ鎖をもった分泌性蛋白
質を産生ずる株を試験すると、超分泌型（ｓｕｐｅｒｓ
ｅｃｒｅｔｅｒ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の株が得られる
であろう。

この発明の結果として、超分泌型を与える劣性突然変異
体遺伝子の野性型をクローニングする新らしい方法が得
られる０例えば多くの出し突然変異は、例えばｆｉおよ
び鎚４は、ジプロイド細胞中に相同的形で存在するとジ
プロイド細胞が効率よく発芽することを妨げる。この方
法は本発明では、発砲形成に欠陥ある表現型ができるの
を相補する遺伝子の野性型をクローニングするのに役立
つ、この方法は出（突然変異に相同的なジプロイドと異
種状態で存在する劣性な薬品ｍｌヱニ皇二記、減数分裂
および発砲形成がうまく完全に終結しないと、そのジプ
ロイドから□１旦工上り株坐ｒｏ　ｅｎｃ　　ｓ　ｏｒ
ｅの　にあられれないという原理に暴いている。形質転
換によって、ジプロイドの中にイーストの野性株からの
ＤＮＡ断片を導入して、発砲形成の欠落を相補し、一つ
或いはそれ以上の薬品に耐性のある、バブロイド発砲を
つくることが出来る断片を持つ細胞を選択出来る。

劣性曵突然変異体で、超分泌性の遺伝子の野性型を持つ
ＤＮＡ断片の性格付けをするもう一つの新しい方法は、
異種蛋白質の分泌レベルの劣化を直接鳳粗ｔゑ；点上意
味する。例えば超分泌性突然変異をうけたイースト細胞
は野性細胞よりもっと効率的に人、ｕ−ＰＡを分泌する
。単一の細胞から誘導された個々のイーストコロニーの
大よそのｕ−ＰＡの分泌レベルを測定する簡単な方法を
見出した。

ｕ−ＰＡを産生ずる超分泌性細胞は、野性のイースト株
からのＤＮＡ断片を持つベクターで形質転換させ、その
形質転換体を栄養づけした寒天ペトリ皿上においた膜の
表面に植えつけた。コロニーを育成した後膜を、温和な
（Ｉｌｏｄｅｒａ　ｔｅ）イオン強度の塩を含んだ異っ
た栄養づけした寒天皿上に移す、次に牛のプラスミノゲ
ンに富んだフィブリン皿へ移す。

このコロニーは、ｕ−ＰＡの分泌が、出り突然変異を相
補する野性遺伝子が存在して、抑制されていないならば
、濁ごったフィブリン細胞に透明なゾーンをつくるであ
ろう。

これら上記両方の場合、望（突然変異を相補する野性の
ＤＮＡ断片を持つベクターを含むイーストコロニーが一
度決定されたならば、プラスミツドベクターをコロニー
から単離しプラスミツド上の野性の鎚り遺伝子の位置づ
けをし、その遺伝子の配列が決定され、そして、いかな
るハプロイドイーストでも、出し株に変えることができ
る切断用ベクトルをつくることが可能である。

次に挙げる例示は本発明を制限するための例ではなく、
実証するためのものである。

〔実施例〕

次の実施例は本発明を実証するものであるが、制限する
ものではない。

（実施例１） ａ）　形質変換のために適した宿主の決定と、ＳＳＩ遺
伝子を含んでいるイーストＤＮＡ断片の決定ＳＳＩは突
然変異と同質形質のジプロイド株が効率よく発芽しない
ことを利用して、ＳＳＣ１遺伝子をもつイーストＤＮＡ
断片をもつクローンを選ぶことができる。こ覧で使用さ
れた宿主株は下記のような同一遺伝子構造（Ｇｅｎｏｔ
ｙｐｅ）をもったＣＧＹ２０１４である。すなわち： 門ＡＴａ／ＭＡＴ　ａｌｐｈａ　ＳＳＣ１／ＳＳＣ１　
”／ｃａｎ’　１ｙｓ２／＋　Ｉｅｕ２：：５ｃｕ−Ｐ
＾＋ＬＥＵ／Ｉｅｕ２：：５ｃｕ−ＰＡ＋ＬＥＵ２　ｕ
ｒａ３／ｕｒａ３／ＣＧＹ２０１４株の構造は下記の通
りである。

株ＣＧＹ１４６５（ＭＡＴ　ａｌｐｈａ、　１ｅｕ２−
３．１１２　ｕｒａ３ＳＳＣ１）および株ＣＧｙ１４６
６（ＭＡａ　１ｅｕ２−３＋　１１．２　ｕｒａ３　Ｓ
ＳＣ１）株ＣＧＹ１２８５（ＳＴＣＣ２０７５０−ＭＡ
Ｔ　ａｌｐｈａ　ｕｒａ３ＳＳＣ１−１）。

標準ラボ用イースト株ＣＧＹ４８７　（Ｍ＾Ｔａ　Ｉｅ
ｕ２−３．１１２ｕｒａ３　ｃａｎ’　）　　と共にＣ
ＧＹ１２８５はＣＧＹ９９８　（ＡＴＣＣ２０７５３：
Ｍａｔａｌｐｈａ　ｕｒａ３　ｈｉｓ４／ｐｃＧｓ５１
４）のエチルメタン・スルホネート（ＥＭＳ）で起きた
突然変異の産物である。標準のラボ用イースト株は自律
複製性ベクターを用いて形質転換してイーストインベル
ターゼとボーパンプロキモシン細胞融合して得られた遺
伝子の発現を目ざしたもの、得られた誘導体は、ポーパ
ンプロキモシンをもっと効率的に分泌する変種（ｒａｒ
ｉａｎｔ）を得るために選択される。（欧州特許第２０
１２０８明細書および、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｒ，Ａ、＋　Ｄ
ｕｎｃａｎ。

Ｍ、　Ｊ、、　　およびＭｏ１ｒ＋　Ｄ、　Ｔ、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２２９巻１２１９１２２４頁（１９８５）
参照〉。カナバニン耐性突然変異（ｃａｎ’　）はＣＧ
Ｙ４８７株で与えられるがしかし適当な天然のｃａｎ’
突然変異は毒性のあるアルギニンに類似のカナバニンに
耐性のあるものを選択することによって分離することも
できた。　（Ｆｒｉｎｈ、　Ｇ、　Ｒ，。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　１７
Ａ巻５９−７８頁（１９７０）参照） ＣＧＹ１４６５のｈ４ｍ導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）
はＳｈｅｒｍａｎ。

Ｆｉｎｋおよび旧ａｋｓ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙ
ｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９頁Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮＹ（
１９８６））の方法に従って８ＭＳ突然変異をおこない
、Ｃｈａ　ｔｏ。

等（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　９３巻５１−６５頁（１９７
９））の記録（ｐｒ。

ｔｏｃｏ＋）に従って、ロイシン、ウラシル、リジンお
よびα−アミノ・アシアジベイトを含む最小栄養の寒天
媒体上で培養した突然変異体から選ぶことによって得ら
れる。この新らしいｃｃＹ１４６５の誘導体をＣＧＹ１
９９８と名づける。

ＣＧＹ１９９ＢとＣＧＹ１４６６は共に、イースト・イ
ンベルターゼ分泌暗号をコードする領域および人・単鎖
ウリナリ・プラスミノゲン・アクティベータ（ｓｃｕ−
ＰＡ）の補足ＤＮＡ遺伝子とに結びついたイースト・ホ
スホグリセレートキナゼ（ＰＧに）プロモーターをのも
つ転写単位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｕｎｉ
ｔ）を導入するために、挿入用プラスミツドｐｃＧｓ７
４０を用いて形質転換する。　５ｃｕ−ＰＡは野性のイ
ースト細胞からは非常に非効率な分泌しかされない。し
かし出量イースト細胞からはもっとずっと効率的に分泌
される。それ故５ｃｕ−ＰＡの分泌の劣化するレベルが
、補足１遺伝子（ｃｏ＋ｓｐｌｅｍｅｕｔｉｎｇ　ＳＳ
Ｃ１　ｇｅ＋ｗｅ）をコードするＤＮＡ断片が１宿主中
に存在することの第２の確認標識（ｃｏｓｆｉｒｍａｔ
ｏｒｙ　５ｃｒｅｅｎ）となる。

プラスミツドｐｃＧｓ７４０は普通イースト挿入型プラ
スミツドＹ１ｐ５　（Ｓｔｒｕｈｌ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ’１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７６巻１０３５−１０３９頁（１
９７９）　）から導びかれる。このプラスミツドはＰＧ
Ｋに促進されたインベルターゼ分泌性シグナル−５ｃｕ
−ＰＡ遺伝子とイーストＬＥＵ２遺伝子とを形質転換体
の選択枝として含んでいる。このプラスミツドは次のよ
うにしてくみ立てられる。

２つの５ｃｕ−ＰＡ補足ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）クローン
が次のイーストプラスミツドをつくるために用いられる
。：ｐｃＧＥｌ、９２はＨＯＩＩＩｌｅｓ等（■匹紅（
１９８５））の配列、すなわち、ヌクレオシド１１９か
ら２３０４までの配列、ｐｃＧＥ１９５はＨｏｌ＋ｗｅ
ｓ等（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ　３巻９２３から９２
９真（１９８５））の、配列の、ヌクレオシド１から２
３０４までの配列をそれぞれ含んでいる。

天然の５ｃｕ−ＰＡを分泌するジクナル・コドンをイー
スト・インベルターゼ分泌性シグナル・コドンでおきか
える、これは、次のようにして行う　（第１図参照）、
プラスミツドｐｃＧＥ６８　（Ｇｏｆｆ等、、　Ｇｅｎ
ｅ２７巻３５−４巻真５１９８４））は、目的とする５
ｃｕ−ＰＡをコードする（［１ＮＡ）断片をうけとる受
容（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）ベクターとして用いられる。

プラスミツドｐＣＧＥ６８のＤＮ＾ヲＸｂａ　ｌ　と匪
■制限エンドヌクレアーゼで切断する、そして、約５．
３ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法で精製
する。

５ｃｕ−ＰＡア５ノ酸残基９から８８の座を含む約０．
２３ｋｂの断片を、プラスミツドｐｃＧＥ１９２からＢ
ｒｌ　　ＩＩとｎＬ■の２つの制限エンドヌクレアーゼ
で切りとり、アガロースゲル電気泳動法で単離する。こ
れ等２つの単離された断片を次の図のような合威のオリ
ゴデオキシヌクレオチソド対で、Ｘｂａ　Ｉ　とＴａｇ
　Ｉで導出される末端と相同（ｃｏｈｅｃｉｖｅ）な末
端をもっている、オリゴデオキシヌクレチッド対の存在
で一緒に接合される。

結合された混合物は、適当な（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）　
ＨＢＩＯＩ。

Ｅ、Ｃｏ１１細胞を、アンビジィリン抵抗性をもつよう
に、形質転換をするのに用いて、得られたプラスミツド
ルＣｒ；８１９９．をもつコロニーを、数ケの形質転換
コロニーから導びかれる制限エンドヌクレアーゼ地図に
照して決定する。プラスミツドｐｃＧＥ１９９は、活性
の（ｍａｔｕｒｅ）ｓｃｕ−ＰＡの最初のアビノ酸残基
をコードする補足ＤＮＡを含んでいて、活性な５ｃｕ−
ＰＡの最初のアミノ酸の座の一つ前に直接に、特徴ある
、独虹■制限エンドヌクレアーゼの位置をもついる。（
第１図） 次に、３本のＤＮＡ分子を単離し、−緒に接合し、イー
ストによって５ｃｕ−ＰＡを合威し、分泌するプラスミ
ツドを生成する。（第２図）最初に、プラスミツドｐＣ
ＧＥ１９９のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ■ａ１．
で切断し、突き出ている、末端を取り除くために単鎖の
特殊ヌクレアーゼＳ１で処理する０次に８１を取りはづ
して、更に、エンドヌクレアーゼｌｎで切断する。活性
の５ｃｕ−ＰＡの最初の８８アミ酸残基に対するコドン
をもつ約０．２６ｋｂ断片をアガロース・ゲル電気泳動
法が単離する。独虹ｌの位置（ｓｉｔｅ）はＳ、ヌクレ
アーゼ修正（ｔｒｉｓｎｉｎｇ）をうけて失なわれる、
第２図には括弧をつけて表示した。

５ｃｕ−ＰＡの残りの部分は、プラスＱ　７ドｐｃＧＥ
１９５から誘導する、５ｃｕ−ＰＡ補足ＤＮＡのもう一
つのサブクローンはｐＢＲ３２２にある。しかしまづ、
５ｃｕ−ＰＡ補足ＤＮＡは、次の工程によってイースト
・Ｅ、Ｃｏ１１−シャトルベクトルに入れるのがより簡
便な処理法である（第２図）、イースト・Ｅ、Ｃｏ１１
シヤトルプラスミントｐｃＧｓ１６８（Ｇｏｆｆ等、Ｇ
ｅｎｅ　２７巻３５−４６１（１９８４））のＤＮＡを
、制限エンドヌクレアーゼｈ虹Ｒ１で完全に切断し、ヌ
クレアーゼＢｉｎｄｌｌｌで部分的に切断する。イース
ト・Ｅ、ｃｏｌｉシャトルベクトルを含む約８ｋｂ切断
をイース）ＳｔｌＣ２遺伝子からの転写端末領域（ｔｒ
ａｎｓａｒｉｐｔｉｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｒｅ
ｇｉｏｎ）と併せて、アガロース・ゲル・電気泳動によ
って単離される。Ｅｃｏ　Ｒ１およびＨｉｎｄＩ［Ｉ接
合末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄｓ）は４種すべての
デオキシヌクレオシド・三燐酸の存在下、Ｅ、Ｃｏ１１
　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ　　断片）で
埋められる。これら２ケの失なわれた位置は第２図中括
弧につ＼んで表わされている。

次に、プラスミッド１９５から制限エンドヌクレアーゼ
Ｘｂａ　Ｉで完全にＤＮＡが切断され４種すべてのデオ
キシヌクレオシド三燐酸の存在下、Ｅ　ＣｏｌｉＤＮＡ
ポリメラーゼＩ　（ｋｌｅｎｏ−断片）で接合末端が埋
められ、全５ｃｕ−ＰＡ補足ＤＮＡを含む約２．２ｋｂ
断片をアガロース・ゲル電気泳動によって単離する。

これら２種の単離した断片をお互−緒に接合し、接合混
合物を、適当な（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＨＢＩＯＩ　Ｅ
　Ｃｏｌ細胞を、アンピシリン耐性にする形質転換に、
使用する。目的とするプラスミツドｐｃＧｓ６９６Ａを
もつコロニーを、数ケの形質転換コロニーから単離した
プラスミツドの制限酵素地図に照して検定する。

イーストの発現（ｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）および分泌
ベクターの構成に必要な第２のＤＮＡ断片は、次のよう
にしてプラスミツドｐＣＧＳ６９６＾から単離する。（
第２図）、プラスミツドｐＣＧＳ６９６ＡからのＤＮＡ
は制限エンドヌクレアーゼＬ■およびＰｒｕ　■で切り
出し、イースト・ｋｋ旦シャトルベクター配列をもつ約
８．４ｋｂ断片と５ｃｕ−ＰＡ補足ＯＮ＾の大部分とを
、アガロース寒天電気泳動によって単離する。

最終的にプラスミツドｐｃＧｓ６８５は、イーストリオ
ーズ燐酸イソメラーゼプロモータと末端にＮｃｏ　Ｉ感
光（ａｃｃｅｓｓ）位置を持つインベルターゼ分泌シグ
ナルをコードする領域とをもっている。（第２図）、こ
れはプラス１　”／ドｐｃＧｓ６８１　（Ｍｏｉｒおよ
びＤｕｍａｉｓ。

Ｇｅｎｅ　５６巻２０９−２１７頁（１９８７））と、
次の点を除けば仝じである。すなわち、インベルターゼ
分泌シグナルをコードする領域の終りにある肢虹【位置
が、分泌シグナルの最終アラニン残基をあられすＧＣＣ
コドンに、そのコドンの２つの全残基の間ではなしに、
ＧＣＣコドンに直接に続いているということを除けば、
である。このことは、ｐｃＧ５６８１（Ｍｏｉｒおよび
Ｄｕ＋ｍａｉｓ、　■肛虹（１９８７））の構成として
は終っているか合成オリゴヌクレオチドの配列を適当に
変えるためである。プラスミツドｐＣＧＳ６８５の［ｌ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ　Ｉで切断し突き
出ている末端を単鎖の特別のヌクレアーゼＳで処理して
取り除き、次いでＳ、ヌクレアーゼを除去し、更にエン
ドヌクレアーゼＰｖｕ　Ｉで制限的に切断する。イース
トＴＰＩプロモータとインベルターゼ分泌シグナルとを
持つ約１．５ｋｂ断片をアガロース・ゲル電気泳動法で
単離する０以上これまでの節で記述した３種の単離した
ＤＮＡ断片を一緒に接合し、接合混合物を、適当なＨＢ
ＩＯＩ　Ｅ、Ｃｏｌ＋細胞をアンピシリン耐性にするた
めの形質転換のために使用する。目的とするプラスミツ
ドｐｃＧｓ７１５を持つコロニーを、数ケの形質転換コ
ロニーから単離されたプラスミツドの制限酵素地図に照
して特性づけされた。プラスミツドｐｃＧｓ７１５は自
律的複製をするイーストベクターで、人・５ｃｉ−Ｐ＾
補足ＤＮ＾遺伝子の構成性発現を導き、ウラシルがない
場合形質転換したｕｒａ　３株の要求成長（Ｄｅｍａｎ
ｄｉｎｇ　ｑｒｏｗｔｈ）があって、このプラスミツド
の存在が維持される。

Ｓ１ヌクレアーゼ処理したＤＮＡ断片の接合に由来する
すべてのＤＮＡ接合の配列はＳＩが正しく重なり合った
ＤＮＡ鎖を整理・接合したかさを各段階毎に確かめられ
る。若し、整理（ｔｒｉｖｗｉｎｇ）が正しくなければ
、それにつづいて形質転換をおこなってそれらのプラス
ミツドが整理が正しくおこなわれた場合の形質転換プラ
スミツドであるか試験される。

次に挿入型イーストベクターｐｃＧｓ７４０を、プラス
ミツドＹＩＰ５　（ｓｔｒｕｈ１等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ　７６１！！１０４５−１０３９頁（１９７９）
）に基づいて構成する。このベクター構成のためにＹｌ
ｐ５をつぎのように変性する。ＪＲ初、朋遺伝子を、末
端にと虹！位置をもっている機能性Ｂ遺伝子でもって肢
虹！位置で切断する。このｆｉ遺伝子はり、　Ｆｒａｎ
ｋｅｌ（Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ＋　Ｈａｒｖａｒｄ　ＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ
＋　Ｂｏｓｔｏｎ＋　ＭＡ）　、からのプラスミツドｐ
ＪＳ３４の中から得た。　ＹＩＧ１５およびｐＪＳ３４
　ＤＮＡをシ四−■を用いて切断し、４種すべてのデオ
キシヌクレオシドの存在下、Ｌ劫貝ＯＮ＾ポリメラーゼ
Ｉ　（ｋｌｅｎｏ御　断片）で処理しＮｃｏ　１位置を
埋める。かくして得た」用遺伝子をコードする約３ｋｂ
ＤＮＡ断片をアガロース・ゲル電気泳動法で単離し、切
断されたＤＮＡに二本鎖接合する（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ
　ｌｉｇａｔｅＬ得られたＹｌｐ　５０２プラス逅ツド
は機能性のｇ遺伝子を持っているがＮｃｏ　１位置はも
っていない０次に、ＹＴｐ５０２中のＢａｍ旧サイトを
、シ坤−旧で切断してＮｃｏ　１サイトに変える。突出
して末端をＥ　Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（ｋ
ｌｅｎｏｈ　　断片）と４種類すべてのデオキシヌクレ
オチットとで埋め、モしてＮｃｏ　Ｉ　リンカ−（Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ
、　Ｂｅｄｆｏｒｄ＋　ＭＡ）で接合する。得られたプ
ラスミツド、ＹＩｐ５０３、は先のＢａ＋ｗ−旧位置の
代りに一つの新しいＮｃｏ　１位置が入っている。

イーストＰＧＫ遺伝子をコードするＤＮＡは、プラスミ
ツドｐＰＧにＨｋａｗａｓａｋｉおよびＦｒａｅｎｋｅ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍ５ｕｎｉｃ、
　　１０８巻　１１０７−１１２真（１９８２））に含
まれて、Ｄ、　Ｆｒａｅｎｋｅｌ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ、　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏ１．　Ｂｏｓｔｏｎ。

ＨＡ）から得た。プロモーターと構造遺伝子を含んだ約
３．１ｋｂ　Ｈｆｎ　ｄｌ［［断片（（Ｈｉｔｚｅｍａ
ｎ、等。Ｎｕｃ！。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＋　１０巻７７９１−７８０８　（
１９８２）　）の第１図を参照〕をｐＢＲ３２２のＨｉ
ｎｄｌ［［位置にサブクローンして、プラスミツドｐＰ
ＧＫ１０２を得る。　ｐＰＧＫ１０２プラスミツドから
のＤＮＡは、ＰＧＫアご）酸の残基１５４のコドンを、
特異なＳａｃ　１位置で切断し、このＤＮＡをエキソヌ
クレアーゼＢａｌ　３１（Ｎｅｗ　［！ｎｇｌａｎｄ　
ＢｉｏｌａｂｓＢｅｖｅｒｌｅｙ、　Ｍ＾〉、で調整す
る（ｔｒｉｍ）、　Ｂａｌ　３１で処理した後、このプ
ラスミツドを、Ｎｅｏ　Ｉオリゴヌクレオチットリンカ
−の存在で、Ｔ、ＤＮ＾リガーゼと共に温熱処理（ｉｎ
ｃｕｂａｔｅ）する、そしてこのＤＮＡを適当なＬｋ旦
　１１８ＩＯＩをアンピシリン耐性に形質転換するのに
用いて、いくつかの形質転換プラスミツドを検査して、
そのうちの一つ、ｐｃＧｓ５２１と名付けた、後調した
（ｔｒｉｍｍｅｄ　ｂａｃｋ）プラスミツドが、ＰＧＫ
の翻訳開始位置ＡＴＧの−１にあるＡ残基に直接につい
ているＮｃｏ　１をもっている。

約１．２ｋｂのＰＧＫプロモータ領域はＨｉｎ　ｄｕｌ
で切断して、ｐｃＧｓ５２１から切り離し、４種類すべ
てのデオキシヌクレオチットの存在下に、Ｅ、　（：ｏ
ｌｉ　ＯＮ＾ポリメラーゼＴ　（ｋｌｅｎｏｉ＋　　断
片）で処理し、ＤＮＡポリメラーゼ■を除去し、Ｎｅｏ
　ｒで切断し、アガローズゲルで精製（単離）する、こ
のＤＮＡ断片はＹｌｐ５０３の中に、Ｂｉｎ　ｄｌ［［
および肢虹■位置の間の約０．３５ｋｂ　ＤＮＡ断片の
位置に挿入した。得られた、プラスミツドｐＰＧＫ１０
４は、Ｌ餞旦ＤＩＩＡポリメラーゼ（ｋｌｅｎｏ＠断片
〉を作用させたためにＨ４ｎｄＩ１１位置は脱落し、そ
してＤＮＡ断片のＨｉｎ　ｄｌ［［末端の両方に４種類
すべてのデオキシヌクレオチドがあり、組み立てに用い
られる。

３種のＤＮＡ断片を一緒に結び合わせると、プラスミツ
ドｐｃｃｓ７４０が生ずる。　ＮＣｏ　ＩとＳａｌ　１
位置の間にあるｐＰ（Ｊ１０４の約０．２８ｋｂの断片
をｐｃＧｓ７１５からの）Ｉｊｎｄｌ［Ｉと鍾ＩＩとの
間の約２．２ｋｂ断片（第２図）、およびＮｃｏ　Ｉと
Ｈｉｎｄｌ１１位置を結びつけ（ｂｒｉｄｄｇｊｎｇ）
、インベルターゼの最初の３コドンを提供する、−対の
合成オリゴデオキシヌクレオチドとで、おきかえる、　
ｐｃＧｓ７１５からの２．２ｋｂの断片は５ｕｃ−Ｐ＾
コドンのすべてと結びついたインベルターゼ分泌シグナ
ルの少なくとも１６ケのコドンを、インベルターゼ、転
写ター壽ネータと併せて、含んでいる０合成オリゴデオ
キシヌクレオチットの配列は、下記の通りである。

５’ＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＡ　　　　３’３’
　　　ＴＡＣＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＧＡ　　５’得られ
たプラスミツドｐｃＧｓ７４０を第３図に示した。

このプラスミツドは５ｃｕ−ＰＡについている（ｆｕｓ
ｉｏｎｔｏ）　Ｐ（Ｊで促進されるインベルターゼシグ
ナル配列を示している。このシグナル配列があるかは、
１２の作用が要求されるかによって判定（ｓｅｌｅｃｔ
）できる、　ＰＧＫプロモータ、インベルターゼ分泌シ
グナルコード領域およびプラスミツドＰＣＧ７４０の５
ｃｕ−ＰＡ補足ＤＮＡ遺伝子の間の結合遺伝子の配列は
次の通りである。

ｌ　５ｃｕ−ＰＡ　ｃｏｄｏｎｅ ａｓ　Ｉ＋ｍ　Ｈｏｌｌ１ｅｓ、ｅｔ　ａｌ、＋　１９
８５１匹匹ＬＣＧＹ１９９８とＣＧＹ１４６６をｐｃＧ
ｓ７４０で形質転換するとｐｃＧｓ７４０はイース）■
Ｌ１の座に挿入され乙、この処理はｐｃＧｓ７４０　Ｄ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＣ１ａ　Ｉで部分的に切
断され、ＰＧＫ遺伝子と２遺伝子とに分かれる（第３図
）　、　Ｏｒｒ−ｍｅａｖｅｒ　　等（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｒｎ　［！ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１巻２２８−２
４５頁（１９８３））は、適当な宿主株の形質転換の後
に、イースト遺伝子中に二本鎖切断を起したプラスミツ
ドが、イースト染料体中の、その遺伝子の中に挿入する
ことを示した。従って、ｐｃＧＫ７４０の一度切断した
（ｃｎｃｅ−ｃｕｔ）直鎖形が、アガロースゲル法で単
離されて、ＣＧＹ１９９８とＣＧＹ１４６６を、ロイシ
ン栄養型に形質転換するのに使用される。イース）ＬＥ
Ｕ２遺伝子遺伝子穴されたｐＣＧＳ７４０プラスミツド
の位置は数種の形質転換体のサウザンプロット分析法（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｔｓ）によ
って確認された。

ＣＧＹ１９９８およびＣＧＹ１４６６株から誘導された
形質転換体ＣＧＹ１９９１およびＣＧＹ１９９３は夫々
、目標となれた形質転換をもつことが決定され、ジプロ
イド宿主株ＣＧＹ２０１４が一緒に発生することは阻止
できた。

ｂ、　同遺伝子形質の５ｓｃｉジプロイドＣＧＹ２０１
４は発芽に障害を与える。

５ｓｃｉ同遺伝子形質ジプロイド株の発砲形成は全く非
能率的である。例えば胞子形成のための媒体上にジプロ
イド株をおいて（（Ｓｈｅｒｓａｎ、　Ｆｉｎｋ、およ
び旧ｃｋｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｐ１６７゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮＹ、　（
１９８６））を参照］６日間、保温処理（ｉｎｃｕｂａ
ｔｉｏｎ）の後グルサルラーゼ（ｇｌｕｓｕｌａｓｅ）
で隠やかに処理し、そしてａｓｃｔを切断するために超
音波処理する（Ｓｈｅｒｍａｎ。

Ｆｉｎｋ、およびＨｉｃｋｓ、ユ」■４４頁１９８６）
、ごく僅かのｃａｎ’或いは、アルファ・アミノアジペ
ート耐性の胞子が見られた。胞子のどちらの型も５０％
の頻度であられれることが予想されている。なぜならｃ
ａｎ’およびＩ２４は関連していない遺伝子であり、通
常減数分裂および発砲形成の間分離して存在しているか
らである。　ｃａｎ’およびアルファ・アミノアジベイ
ト耐性の両方の突然変異をもっている発砲は２５％も存
在が予想されない。実際ｃａｎ’発胞（発砲ｏｒｅ）は
２％以下、アルファ・アミノアジベイト耐性発砲は１７
％以下で、両方の耐性をもっている発砲は、０．２％よ
りも小さくしか見い出されない。反対にｆｉ突然変異を
持っていない、全様なジプロイドの発砲形成は、耐性発
砲の頻度は予想通りであった。だからジプロイドＣＧＹ
２０１４は発砲形成欠落であり明らかに一連のイースト
断片での形質転換に適した宿主であり、平常の発砲形成
が出来るものに代り得る。

Ｃ１特別のイース）ＤＮＡ断片はＣＧＹ２０１４の発砲
形成欠落を正常化するものである。イース）　ＤＮＡ断
片を持つ４つの種Ｍ　（ｆｏｕｒ　Ｈｂｒａｒｉｅｓ）
のプラス逅ッドをジプロイドＣＧＹ２０１４の宿主の中
に入れて、形質転換をおこなった。これらプラスミツド
の型はｔｈｅ　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｉｎ５ｔ
ｊｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ　Ｍ＾〉にあるｔｈｅ　Ｗｈｉｔｅｂｅａｄ　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｆｏｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒ
ｅ５ｅａｅｃｈから入手したものである。これらはＲｏ
ｓｅ、　Ｎｏｖｔｃｋ、　Ｔｈｏｍａｓ　　Ｂｏｔｓｔ
ｅｉｎ＋及びＦｊｎｋ　（Ｇｅｎｅ　６０巻２３７−２
４３頁（１９８７））によって記載されている集落（ｐ
ｏｏｌｓ）　Ａｓ＋＾４．Ｃ２およびＣ５から誘導され
たものである。これらのプラスξラドは自律的に複製す
る動源体（ｃｅｎ　ｔｒｏｍｅｒｅ）を持つプラスミツ
ドｙｃｐｓｏ、のＢａｍ＋　８１中に挿入されたイース
トＤＮＡの無秩序な断片を含むものである。だから平均
して、イースト細胞中に１細胞当り約ｌコピー存在し、
形質転換によって導入されると思われる。特別のイース
ト遺伝子が多（（ｍａｕｙｃｏｐｉｅｓ）あるいはイー
スト細胞に有毒だから、そして、か＼る遺伝子をもつプ
ラスミツドを宿しているクローンが得られないというこ
とは重要なことである。動源体プラスミツド環を使用す
ることは、鎚址遺伝子を持つクローンが、イースト形質
転換体が多くてその毒性のために、失なわれるというこ
とが起らないことを保証（ｉｎｓｕｒｅ）　している。

種（ｌ　１ｂｒａｒｙ）の各々からのプラスミツドＤＮ
Ａは、プラスミツドを宿しているＥＣｏｌｉ細胞の成育
でつくられ、細胞が溶解され、そしてエチジウムブロマ
イドを含む、セシウムクロライド密度勾配上で標準過程
（例えばＭａｎｉａｔｉｓ＋　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　　お
よびＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、　ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　ＮＹ８６頁（１９８２）を参照〉に従
って、精製して準備した。

分離したＤＮＡは、ＢｕｒｇｅｒｓおよびＰｅｒｃｉｖ
ａｌの過程に従って（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　
１６３巻３９１−３９７頁（１９８７））ｕｒａｓｉｌ
栄養型にＣＧＹ２０１４を形質転換するのに使用される
。

４つの種類の各々から約ｓ　、　ｏｏｏから１０．００
０形質転換体を得た。各種類から約１０００の形質転換
体を集めて、発砲形成媒地上においた。（Ｓｈｅｒｍａ
ｎ。

Ｆｉｎｋおよび旧ｃｋｓ　Ｌ旧υ【−１６７頁（１９８
６））　３０°Ｃ６日間の後、発砲形成媒地上のコロニ
ーを無菌水で洗浄し、ａｓｃｉを５ｈｅｒ＋ｗａｎ、　
ＦｉｎｋおよびＨ４ｃｋｓ（那狙り一４４頁（１９８６
））の記載に従って切断（ｄｉｓｒｕｐｔ）　Ｌ、その
発砲をカナパイン（８０μｓ／ｄ）　、アルファ・アミ
ノアジベイト（０，２Ｘ）およびリジン（０，００３χ
）を含むＳＤ媒地上においた。若干のコロニーはこの選
択媒地上で成育し、彼等がカナパインとアルファ・アミ
ノアジベイトの両方に耐性を獲得した遺伝子で、多分彼
等は減数分裂と発砲形成とを通して２つの遺伝子を組か
えてた結果であることを示している。特にＡ１種からの
４つのコロニーと、＾４からの２つ、およびＣ３からの
９つのコロニーは選ばれた媒地上で成育し、更に試験さ
れた。

ｄ、　これら［ｌＮＡ断片は又、ｕ−ＰＡ分泌のレベル
を低下した。

第２のテストはこれ等のコロニーから細胞によって５ｃ
ｕ−ＰＡの分泌の量を測定するテストである。

ｌ遺伝子を持つこさら細胞は、これらＪの欠点を補足す
るために、ＳＳＣ１遺伝子を持たない細胞よりも５ｃｕ
−ＰＡを少なく分泌する。５ｃｕ−ＰＡ分泌に対する次
のような試験が行なわれた。細胞を３０℃、ＳＤ＋リジ
ン寒天媒地（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆｉｎｋおよび旧ｃｋ
ｓ　。

■肚直１９８６）を参照）−昼夜斑点状（ｐａ　ｔｃｈ
）に育威し、次にＳＤ＋リジン、ブイヨン（ｂｒｏｔｈ
）培地で、約に１ｅｔｔ　１０（グリーンフィルター）
で、２４時間育育成る０次に細胞をＳＭ−ＩＩ＋リジン
Ｋ１１ｅｔｔ　２００（グリーンフィルター）で予備培
養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）し、続いて２４時間育戒す
る。ＳＭ−Ｉ［培地の成分は次の通り、（特に示さなけ
れば）括弧内の量は１リットル当りのグラム数で与えら
れる。

グルコース（８０，０）、ＫＨｚ（Ｐｏｔ）（７，５）
　、ＮａＣ１（３，０）、（Ｎｌ＋４＞　１ＦＩＰＯ４
（２０，０）イースト抽出物（Ｄｉｒｃｏ）　（３，７
５）、Ｍｇ５Ｏｓ（０，３５）、Ｚｎ５Ｏ，（０，０３
）　　、Ｃｕ５Ｏ４（０，００４５）　　、ＦｅＮＨ４
（Ｓｏｎ）ｘ　（０，０１５）パントテン酸カルシウム
（ユニオン・カーバイト）　（０，２５ａｖｆｆｉ／　
ｊ！　）最後に、細胞は、超遠心分離してベレットにし
、ブイヨン（ｂｒｏｔｈ）の２０ｐ１を牛プラスξノゲ
ンに富んだ、フィブリン・アガロース皿の中におく　ｅ
　（Ｂｒａｋｍａｎ。

Ｐ、、　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ＝標準化されたフィ
ブリン皿測定法とプラスミツドンのフィブリン溶解的試
験、Ｓｃｈｅｌｔｅｗａ　＆　Ｈｏｌｋｅｍａ、アムス
ナルダム（１９６７））３７°Ｃ１６時間低温処理後、
透明になった領域の径を、よく知られた標準によってつ
くられた領域の径と比較する。そしてイーストブイヨン
中の５ｃｕＰＡの量は、標準曲線上に内挿して計算する
。野性イースト株は１ミリリットル当り５ｃｕ−ＰＡの
国際単位（１０）で３より小さく、（注意、このレベル
はフィブリン皿試験法によっては認められないレベル）
、一方、ＳＳＣ１株の典型的な場合、これらの条件下で
２０と４０１υ／ｄの間分泌する。　（このレベルは１
３−１７ｓａ＋径に達する透明領域をる、但し、７ｍｍ
は、試料をおく場所（ｈｅｌｌ）それ自身の径を含んで
いる） この第２のテストの結果は３つのコロニーが、５ｃｕ−
ＰＡを認め得るレベルにまでは分泌しないことを表わし
ている。この結果は、このコロニーが、それらが種類か
ら受けついだｙｃｐｓｏプラスミツド上ミツｌ遺伝子を
もっている可能性とよく一致している。これらコロニー
の一つ、ＣＧＹ１９８２は更に解析するのに用いた。

更に、ＣＧＹ、　１９８２がもっているプラスミツドが
５ＣＵ−ＰＡ分泌に影響しており、だから、これは多分
ＳＳＣ１遺伝子をもっていることを更に証明するために
、ＣにＹ１９８２株のプラスミツドを養生し、そのプラ
スミツドで再形質転換する。プラスミツドの存在は宿主
がＵｒａ３であり、プラスミツドがｔｌＲＡ３遺伝子を
もっているので淘汰によってウラシル栄養要求性が保た
れている。プラスミツドはウラシル栄養要求性について
の淘汰なしに成長につれて失なわれる。そしてプラスミ
ツドのなくなった細胞はＢｏｅｋｅおよびＦｉｎｋ　（
Ｍｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ＋　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９７巻
３４５　貞（１９８４）　）の方法に従って５−フルオ
ローオロチック酸を含む、ＳＤ＋リジン培地でのｄｅｍ
ｄｎｄｉｎｇｇｒｏｗｔｈによって淘汰される。プラス
ミツドドを失ってＵｒａ−になったＣＧＹ１９８２誘導
体は上記した処方（Ｐｒｏｔｏｃｏ＋）に従って、５ｃ
ｕ−ＰＡの分泌について試験される。そして約１３ｍ５
の透明部分の領域を示すほど十分に５ｃｕ−ＰＡを分泌
することが見出された。従って、プラスミツドのそう失
が細胞の５ｃｕ−ＰＡ分泌レベルの向上と一致する。こ
れら、ｃｕｒｅｄ″誘導体の一つＣＧＹ２００Ｓは更に
研究された。

プラスミツドをＣＧＹ１９８２細胞から、次の如く分離
された、細胞ＣＧＹ１９８２がＳＤ＋リジンの液体培地
が一夜養生され、ｌＯｄ　ＹＰＤ液体液体中地中分離培
養され、輌ｉｄ−１ｏｇに成長した。　（約２Ｘ１０’
ゼル／ｉｄ）　、５ｂｅｒｖａｎ、　Ｆｉｎｋおよび旧
ｃ　ｋ　（ｓｇ！ＬＬ１２７頁（１９８６））に従って
細胞を遠心分離によって集め、細胞膜消化（ｗａｌｌ−
ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ）酵素チモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙ
ａｓｅ）で処理して溶菌し、イーストＤＮＡを部分的に
精製したａｍ製したＤＮＡをアンピシリン耐性をもつよ
うＥ、Ｃｏ１１８Ｂ１０１株の形質変換に用いた。プラ
スミツドＤＮＡは既に述べた数ケのＥ、Ｃｏ１１形質変
換体からつくられる（ＭａｎｉａｔｉＬ　Ｐｒ１ｔｓｃ
ｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、　…旺シ（１９８２））、
実際に、この種から２つ或いはそれ以上のいろいろなＹ
Ｃｐ５０をベースにしたプラスミツドが、形質転換を通
じて、単鎖のイースＩＩ胞に挿入でき、多世代にわたっ
て、細胞およびその子孫の中に保たれる。従って、数ケ
のＢ、ＣｏＨ形質転換体からのプラスもラドＤＮＡは、
すべてのＤＮＡが仝じか、或いはプラスミツドの若干の
タイプは単離されたか、決定するための制限酵素解析法
によって検査される。単一のプラスミツドがＣＧＹ１８
９２から得られ、このプラスミッドがｐｃＧｓ８６１と
名付られた。若し１つの型以上が見出されたなら、その
ときは、ｌ遺伝子を持つものを決定するための、以下に
述べる方法を用いて解析されることになろう。

プラス込ツドｐｃＧｓ８６１を“修復された”（ｃｕｒ
ｅｄ）ＣＧＹ２００３に対して、ウラシル栄養要求性へ
の形質転換に用いる時、形質転換体は、上に述べた指針
書（ｐｒｏｔｏｃｏ＋）に従って測定したとき、５ｃｕ
−ＰＡが認められるほとに、それを分泌しないことがわ
かった。無秩序なイーストＤＮＡ断片ではなく、プラス
ミツドＹＣＰ５０が、ＣＧＹ２００３を形質転換するの
に用いられたならば、得られた形質転換体はＣＧＹ２０
０３のそれと区別出来ない位（仝じ位の〉　レベルで５
ｃｕＰ＾を分泌することになろう。従って、プラスミツ
ドｐｃＧｓ８６１の存在、そして特に、プラスミツドに
組み込まれたイースｌ−ＤＮＡが存在することが、５ｃ
ｕＰＡの分泌を抑えている。この結果はｐｃＧｓ８６１
がＳＳＣ１遺伝子を持っている事実と一致する。

ｅ、　プラスミツドｐｃＧｓ８６１の特性付け、−一制
限エンドヌクレアーゼ切断位置の地図の導入（ｇｅｎｅ
ｒａｔｅ） プラスミツドｐｃＧｓ８６１の［ｌＮＡは制限エンドヌ
クレアーゼｈ虹Ｒ１，Ｂｉｎ　ｄ　ｍ、および３ａｍ　
ＩＴ、を単独に、および組み合せて使用して切断される
。その切断生成物のおおよその大きさは、アガローズゲ
ル中の移動から演釈される。これらの結果から作威した
制限エンドヌクレアーゼ切断位置の地図を作威しく第４
図）に示した。

ｆ６　　プラスミツドｐｃＧｓ８６１上のＳＳＣ１遺伝
子の位置づけ（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ） ｐｃＧｓ８６１中に添入されたイーストＤＮＡの部分を
含む、数ケの新らしいプラスごラドが、第４図に示され
た制限エンドヌクレアーゼ位置に基づいてくみ立てられ
た。特に３つのＢａｍ旧および４つのＥｃ。

Ｒ１位置は、第４図に示されたＢ、、　Ｂ□Ｂｓ、Ｅ＋
、Ｅｔ。

Ｅｓ、　Ｅａ、−ａｇおよび−Ｂ、の各プラスミツドを
くみ立てる（ｂｕｉｌｄ）するのに用いられた。加える
に、一つのプラスミツドはＨｉｎ　ｄＩ［Ｉで切断して
つくられ、Ｒ１と名づけられた。すべてのこれらの新ら
しいプラスミツドはｙｃｐｓｏ中に存在した、図示した
断片から威り立っている。これら新らしいプラスミツド
は夫々、ＣＧＹ２０６３を形質転換して、ウラシル要求
栄養型にするのに用いた。形質転換体について５ｃｕ−
ＰＡ分泌レベルの試験（ｑｓ！Ｉａｙ）をおこなった、
新しいプラスミツドでは、ＣＧＹ２００３中でＳＳＣ１
−１を補足するものはなく　、５ｃｕ−ＰＡレベルを抑
えたものはなかった。（第４図参照）、それ故、どのプ
ラスミツドも完全なｆｉ遺伝子はもっていない。

従って、ｐｃＧｓ８６１のより大きい鎖部分をもってい
るプラスミツドは、Ｅｃｏ　Ｒ１を用いて部分的に切断
して、プラスミツド−Ｅ、（・Ｅ＋−ｚ、３）として、
つくられた、このプラスミツドを用いて、ＣＧＹ２００
３株を形質転換した結果、測定にか覧るほどのレベルの
５ｃｕ−Ｐ＾を分泌しなかった。それ故、ｐ（：Ｇ５８
６１と仝様プラスミツドーＥ４は完全なＳＳＣ１遺伝子
をもっているに違いない。これらの結果のすべての一致
する唯一の１遺伝子の位置は、第４図に矢印でもって表
わしたもので、この領域と重なる賎（旧とＥｃｏ　ＲＴ
の位置は１つづＸである。

（実施例２） 星り遺伝子のＤＮＡ配列 ＳＳＣ１遺伝子をコードするプラスミツドｐｃＧｓ６８
１の領域中にあるＤＮＡ塩基の配列を、ＤＮＡ配列決定
法のうち、ジデオキシ・鎖切断法により＜ＣｈｅＩｌ、
　Ｆ、。

Ｙ、　およびＳｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、　Ｉｌ、、　ＤＮ
Ａ　４巻１６５−１７０（１９８５）；　Ｔａｂｏｒ、
　Ｓ、およびＲ４ｃｈａｒｄｓｏｎ＋　Ｃ，ｃ、ＩＰｙ
ｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ
　８４巻４７６７−４７７１頁（１９８７））合成のオ
リゴデオキシヌクレオチド、プライマーを用いて、おこ
なった。合成オリゴデオキシヌクレオチド、ブライマー
の配列はＹＣｐ５０の配列既知領域とわかるようになる
％遺伝子の領域とに基づいている。翻訳された蛋白生成
物のものと併せてその配列は第５図に示されている。

（実施例３） ！遺伝子生成物とＡＴＰアーゼとの相同性発表されてい
る蛋白質配列を調査すると、ＳＳＣ１遺伝子生戒物は、
次のような蛋白質と、非常に同一形質であるが、一致は
していないことがわかる。

（この蛋白質と２遺伝子生底物との間の近似的相同性の
百分率は括弧内に示されている。）羊のＮａ’／Ｋ”＾
ＴＰアーゼ（３０Ｘ）（ｓｈｕｌｌ、　Ｇ、　Ｅ、　Ｓ
ｃｈｗａｒｇｚ。

＾、、およびＬｉｎｇｒｅｌ、　Ｊ、　Ｂ、、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３１６巻６９１６９５頁（１９８５））　、兎
の急速短縮性筋肉（３５χ）から、および緩慢な短縮性
筋肉（３５Ｘ）からの（Ｈ１＋″−輸送＾ＴＰアーゼ（
Ｂｒａｎｄｌ、　Ｃ，Ｊ１Ｇｒｅｅｎ＋　Ｎ、　Ｍ、ｔ
Ｋｏｒｃｚａｋ、　Ｂ、およびＭａｃＬｅｎｎａｎ、　
Ｄ、　Ｈ，、Ｃｅ１１４４！　５９７−６０７真（１９
８６）；　Ｍａｃｌｅｎｎａｎ＋　Ｄ、　Ｈ，ｌ　Ｂｒ
ａｎｄｌ＋Ｃ，Ｊ、、　Ｋｏｒｃｚａｋ＋　Ｂ、＋　お
よびＧｒｅｅｎ＋　Ｎ、　Ｍ、＋　Ｎａｔｕｒｅ３１６
壱６９６−マ００真（１９８５））；およびＬ聾旦から
のに゛輸送ＡＴＰアーゼ（３０％）（Ｈｅｓｓｅ、　Ｊ
、　Ｅ、、　Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ。

Ｌ、＾１ｔｅｎｄｏｒｆ、　　Ｋ、＋　　Ｒｅ１ｃｉｎ
、　　Ａ、　　Ｓ、、　　Ｄｏｒｕｓ、　　Ｅ、ｔおよ
びＥｐｓｔｅｉｎ、　ｔ＋、ｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’
１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８１巻４７４６−４７５０（１９８４））　、
加えるに、鎚出遺伝子生成物は、もう一つのイースト蛋
白、すなわち原形質膜（ｐｌａｓｍａ　ｓ＋ｅｍｂｒａ
ｎｅ）　ＡＴＰアーゼである皿１遺伝子生戒物と非常に
相同的である、が同しではないｅ　（Ｓｅｒｒａｎｏ、
　Ｋｅｉｌｌａｎｄ−Ｂｒａｎｄｔ、　　およびＦｒ１
ｎｋ、　」迎ｎ（１９８６））、それ故、ＳＳＣ１遺伝
子がコードする蛋白質は、バクテリアから哺乳動物まで
のＡＴＰアーゼと非常に相同的であり、この蛋白質は、
イースト細胞内でＡＴＰアーゼとして非常に似た働きを
する。この出願中で用いられる時、遺伝子生成物と＾Ｔ
Ｐアーゼとの比較に用いられる、“相同性“なる言葉は
、アミノ酸残基の少なくとも３０％が仝じで、今比べて
いる２種類の蛋白質について、相対的位置が同じである
ことを示すのに用いる。

（実施例４） ｌ遺伝子の切断は、超分泌性イースト株を生ずる。

５５１遺伝子の切断された遺伝子をもつイースト株は本
質的に５ｈｏｒｔｌｅ等によって示されたアクチン遺伝
子のような構成をもっている（ｓｃｉｅｎｃｅ　２１７
巻３７１−３７３頁（１９８２））鍾■遺伝子内に存在
する１、２ｋｂのＢａ＋ｍ旧とＥｃｏ　Ｒｒ制限酵素で
切られた断片（第４図）をイーストプラスミツドベクタ
ーＹＩｐ５に挿入した（Ｓｔｒｕｈ＋等−鈷且劇（１９
７９））、そして３７８ｂｐのＢａｇ旧−Ｅｃｏ　Ｒ１
で切断された断片におきかえる。

この新らしいｐＣＧＳ８６２と名づけられたベクターは
イースト皿遺伝子をもつイーストゲノム（ｇｅｒｌｏｍ
ｅ）に相同的な、再結合をおこなって、挿入させること
だけで、ウラシル栄養要求性のｕｙ□イースト株に形質
転換できる。この挿入は、１をコードするＤＮＡとして
切断する、制限エンドヌクレアーゼｃｌａ　ＩでｐｃＧ
ｓ６８２を直鎖化して、出■の座に対しておこなわれる
。ＳＳＣ１座への挿入は、プラス【ラドによって運ばれ
る遺伝子の部分のみが二重になっていて、２遺伝子内に
ある直接くり返しの配列を発生している、ＳＳＣ１遺伝
子の蛋白をコードする部分を切断することになる。従っ
て、鎚■遺伝子のくり返し複写物（ｃｏｐｉｅｓ）の各
々は不完全で、ｐＣＧＳ８６２上のＳＳＣ１遺伝子の領
域内で、２つの制限酵素Ｒａｍ旧およびに虹ＲＩの位置
の一つで夫々終っている。

このように、本質的な遺伝子の切断は致命的な出来事な
ので、ハプロイド株でもジプロイド株でも形質転換をお
こなうと、成育しうる形質転換物が得られとはいえない
。分泌に関して野性である標準の実験用イースト株を形
質転換に用いた。それらの遺伝子因子（Ｇｅｎｏｔｙｐ
ｅｓ）は次の通りである。

ハプロイドではＭＡＴ　ａｌｐｈａ　ｕｒａ３１ｅｕ２
　、ジプロイドではＭＡＴａ／Ｍ＾Ｔａ１ｐｈａ　ｕｒ
ａ３／ｕｒａ３１ｅｕ２／１ｅｕ２　ｍ　イースト形質
転換はＩｔｏの方法でおこなった。（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５３巻１６３−１６８頁（１９
８３））　、ハプロイドおよびジプロイドイースト株は
、形質転換され、ブラスミフドｐＣＧＳ７４０上の５ｃ
ｕ−ＰＡ転写単位を含み（影狙■−例１）上記方法（実
施例１）によってｕ敗の座に挿入される。かくして、次
に５ｃｕ−ＰＡの分泌性が追跡される。成育し得るハプ
ロイド形質転換体が得られ、次にＵｒ１コロニーを選ん
でｐｃＧｓ８６２で形質転換されＪが本質的な遺伝子で
ないことが示された。

プラスミツド挿入位置を確かめるために、サウザン法Ｕ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　８７巻５０３頁（１９７５）
）　Ｄａｒｔｓ等（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｊｎｅｅｒｉｎｇ／Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

ＮＹ、）によって修正された方法によってゲル・転写、
異性化（ｈｙｂｒｊｄｉｚａｔｉｏｎ）実験がおこなわ
れた。

イーストＤＮＡは、５ｈｅｒ量ａｎ、　Ｆｒ１ｎｋおよ
び旧ｃｋｓ（幻狙蝕−１２７頁（１９８６））によって
記載されたように準備した。そしてそれぞれの分割試料
について、夫々、Ｅｃｏ　Ｒ［＋…ｎｄｎＩ、あるいは
ＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで切断処理をおこなっ
た。　（第４図）のＳＳＣ１遺伝子のシ堕−旧−Ｂｃｏ
　Ｒ１で切った１、２ｋｂ断片である試料を、ラベルさ
れたヌクレオチットの存在で切れ目移動法（ｎｉｃｋ−
ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）　（Ｄａｒｉｓ等、■匹虹１
９８０））によって３！Ｐでラベルされる。

若し、ρＣＧ５８６２が、ＳＳＣ１遺伝子の中に挿入さ
れ、および遺伝子を切断したとすると、次のような大き
さの断片が５ｓｃｉ座の中のよく知られた制限酵素位置
にもとづいて、その試料（ｐｒｏｂｅ）と雑種化（ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚｅ）する。

表１ いろいろなハプロイド形質転換体からのＤＮＡ　、　一
つは指定されたものを含む、一つは指定されたＣＧＹ２
１９７を含む、数ケのハプロイド形質転換体からのＤＮ
Ａは切断されたｆｉ遺伝子から予想された大きさの断片
を生み出す、それ故この株は、もはや機能的な（本来の
）出ム遺伝子産生物を産生しない、若干の他の形質転換
体からのＤＮＡは無傷の座および切断されたＳＳＣ１の
座の両方から予想されるバンドを生ずる。これ等の形質
転換ＥＬは多分１遺伝子をもつ染色体の異数体（ａｎｅ
ｎｐｌｏｉｄ）である、それ故−つの切断されたｌ遺伝
子と、今一つ無傷の％遺伝子をもっている。このような
形質転換体は本発明の実施上は有用ではない、なぜなら
そのような転換体は野性細胞より効率的に５ｃｕ−ＰＡ
を分泌しないからである。

形質転換体ＣＧＹ２１９７は、ｌ遺伝子の切断が、ＳＳ
Ｃ１−１突然変異体対立遺伝子（ｍｕｔａｎｔ　ａｌｌ
ｅｌｅ）をもつ株の場合（ヨーロッパ特許第２０１２０
８号明細書）と同じように、同上したレベルの５ｃｕ−
ＰＡ分泌を生むかどうかを験べるために更に解析された
。外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）インベルターゼも、ＳＳＣ
１−１突然変異体対立遺伝子の場合と仝じように、ＳＳ
Ｃ１遺伝子切断が、マンノーズ外部鎖に影響を与えるか
どうかを決定するために試験された。

ＣＧＹ２１９７からおよび形質転換されていない親細胞
から分泌された５ｃｕ−ＰＡの量が、上記、実施例１で
記載されたようにして決定された。培養用ブイヨン（ｂ
ｒｏｔｈｓ）をフィブリン皿の試料くぼみ（ｗｅｌｌ）
に入れ、３７°Ｃ１６時間保温処理して、透明になった
領域の径を測定した。ＣＧＹ２１９７は、ＳＳＣ１−１
対立遺伝子をもつ株の分泌と仝じレベルに５ｃｕ−ＰＡ
を分泌することがわかった。ＣＧＹ２１９７の育成から
の培養ブイヨンは径で１３から１５ｍｍのフィブリン溶
解領域をつくった。仝し５ｃｕ−ＰＡ転写単位をもって
いるが、機能性のあるＳＳＣ１遺伝子をもっている親株
からの培養ブイヨンは認められる程のフィブリン溶解ゾ
ーン〈即ち、径で７１Ｉ１１より小さい）領域をつくる
。

だから非機能性遺伝子を生ずるＳＳＣ１遺伝子の切断は
、５ｃｕ−ＰＡの分泌を向上させる結果を生む。

（実施例５） ＳＳＣＩ−１対立遺伝子あるいはＳＳＣ１遺伝子の切断
は、短かいマンノーズ鎖をもつインベルターゼを分泌す
る。

出出−１あるいは切断されたｆｉで突然変異された対立
遺伝子をもつイースト株は、払鶴での突然変異体株で見
られた（Ｂａｔ　Ｉｏｕ、　　等Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｗ。

２５５巻５９８６−５９９１真（１９８０）；　Ｔｓａ
ｉ、等Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｓ、　２５９巻３８０５−３８１１頁（１９８
４））ように短かい外部鎖をもつインベルターゼを産生
ずる。しかし補足解析をするとＪと７突然変異は異った
遺伝子を生成する（ｄｂｆｉｎｅ）ことを示している。

いろいろなイースト株から産生される外部（ｅｘｔｅｒ
ｎａｌ）インベルターゼについているマンノーズ外部鎖
の大よその大きさが、Ｋａｉｓｅｒ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ
　　２３５巻３１２−３１７頁（１９８７）　）　（に
よって記載された、方法によって変性されない（ｎａｔ
ｉｖｅ）ポリアクリルアミドゲル上での解析によって測
定された。但し、次の点では異なった方法によった。

ｉ）インベルターゼの活性は最初Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎお
よびＬａｍｐｅｎ　（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　４２Ｃ巻５０５頁（１９７５））の方法で
、Ｃａｒｌｓｏｎ等（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１０７Ｓ１９
頁（１９８４））およびＣｅ１ｅｎｚａおよびＣａｒｌ
ｓｏｎ（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｊｏｌ　４巻４９頁（１９８４））によ
って修正された方法で定量された。十分量の細胞を溶菌
し、各遺伝子系列当りインベルターゼは１０００−１１
０００を負荷した。

ｉｉ）細胞は溶菌バッファー１００ｐＺ中で溶菌した。

ｔｉｉ　）粗抽出物は、４％無変性アクリルアミド・ゲ
ル上に負荷するに先立ち、インベルターゼを単一の減数
型（ｏｌ　ｉｇｏｍｅｒｙ）にかえる（Ｅｓｍｏｎ等Ｊ
、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ　２６２巻４３８７−４３９４頁（１９８７）
）ために、５０゛Ｃ１３０分間、加熱した。

次のような分泌性を持ち、グリコシレージョン性を示す
遺伝子型をもった株が本解析に用いられた。　（第６図
参照） ＣＧＹ４８９およびＣＧＹ１９７４　（それぞれａおよ
びｆ列）はグリコシレージョンおよび分泌に関して野性
；ＣＧＹ１０２８　（ｃ列）　ＳＳＣ１−１突然変異遺
伝子を持つ株；ＣＧＹ２１９７　（ｇ列）は野性株であ
る。　ＣＧＹ１９７４はｐＣＧＳ６８２で形質転換をう
けると、ＳＳＣ１遺伝子は切断される。　；　ｃｃｙ２
２０２　（Ｄ列）・はＣＧＹ１０２８が機能性廻■遺伝
子をもつρＣＧ５８６１で形質転換をうけた株である。

、　Ｃｃｙ１５７０　（ｂ列）はｍｎｎ９突然変異体を
もっている。　；　ＣＧＹ２２１６　（ｅ列〉は−ｎｎ
９ＳＳＣ１株の朋Ｊ株による交雑で生ずるジプロイド。

第６図に示される結果は次のようなことを明らかにして
いる、すなわちＣＧＹ２２１６　（ｅ列）はインベルタ
ーゼに対し、野性のマンノーズ外部鎖を付加する。ＳＳ
Ｃ１−１とｍｎｎ９を夫々もつ株はお互にインベルター
ゼのマンノーズ付加に関して相補的で、従って、ＳＳＣ
１とｍｎｎ２は違った遺伝子であることをはっきり示し
ている。出歩−１対立遺伝子をもっている株および切断
されたＳＳＣ１遺伝子をもつ株は、ｍｎｎ７ｍｎｎ８＋
　あるいは＋＊ｎｎ１Ｏをもつ株（Ｂａｌｌｏｕ、　　
ｓｇ！ＬＬ（１，９８２））よりもインベルターゼによ
り短かいマンノーズ鎖は付加する。だからＳＳＣ１遺伝
子は、よく知られているマンノーズ鎖をきりつめる突然
変異をするものと、はっきり異つなものに違いない。

ＣＧＹ２１９７　（ｇ列）は出出−１対立遺伝子をもつ
ＣＧＹ１０２８（０列）の株と余禄、インベルターゼに
より短かいマンノーズ外部鎖を付加する。かくの如＜　
５ｓｃｔ遺伝子の切断は］−１突然変異がもたらす株と
仝じように、仝じグリコシレージョン相同体遺伝子をも
つ株を生成する。−一すなわち、インベルターゼを分泌
するとき外部鎖のセンノース鎖はより短かい。

ＳＳＣ１−１突然変異によって与えられるインベルター
ゼに対する短かいマンノーズ外部鎖を付加する（中間は
ブラスミソドｐｃＧｓ８６１上にあるＳＳＣ１遺伝子に
よっても又補足される、なぜなら、ＣＧＹ２２０２は野
性の型である、長いマンノーズ外部鎖をもったインベル
ターゼを産生し、一方ＣＧＹ１０２Ｂはより短かいマン
ノーズ鎖をもったインベルターゼヲ産生ずる（それぞれ
ｄおよび０列）、だからｐｃＧＹ８６１が存在するとＳ
ＳＣ１−１突然変異対立遺伝子をもつイースト株中での
・Ｃンベルターゼのマンノーズ外部鎖を付加するグリコ
シレージョン機能を修復する。

（実施例６） その他のグリコシレージもン突然変異は、異種蛋白質分
泌に影響を与える。

グリコシレージョンに当って、付加するマンノーズ鎖の
大きさに影響する突然変異をうけた多くのイースト株は
、異種の蛋白質を分泌し、特にグリコプロティンをより
効率的に分泌する。例えば下の第２表に示す株は、人、
ｕ−ＰＡを産生し分泌するように導く、プラス湾ツドｐ
ｃＧｓ７１５で、ウラシル栄養要求性に、形質転換をう
け、そのｕ−ＰＡ分泌のレベルが、牛プラス５ノゲンに
冨む、フィブリン皿試験（ａｓｓａｙ）によって試験さ
れた（■匹紅例１）株は５Ｍ−１１（鱈上り一　例１参
照）中に、Ｋｌｅｔｔ圧で（グリーンフィルター）接種
され（ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）。

３０’Ｃ４１３時間育成された。２０９１の無菌ブイヨ
ン（ｂｒｏｔｈ）をフィブリン皿の試料溜め（ｗｅｌｌ
）において、３７°Ｃ１１６時間後（透明領域の）径が
測定された。

ｕ−ＰＡ分泌のレベルはこれら突然変異体によって蛋白
質に付加されたマンノーズ鎖の予測された（ｐｒｅｄ　
ｉｃ　ｔｅｄ）大きさと直接には相関していないけれど
も、それにもかかわらず、より少いマンノーズ残基が付
加が起る株は実際野性株よりも著るしく多くのｕ−ＰＡ
を分泌する。

（実施例７） ハプロイドイースト株中でＳＳＣ１遺伝子を切断する方
法２遺伝子のそのコード領域に皿遺伝子を挿入すること
によって鍾■株へのハプロイドイースト株を変質させる
ことができる。その理由は、イーストＬＹＳ２の生物学
的挙動が特異な姿をしているからである。Ｃｈａｔｏｏ
等（影坐り一（１９７９））および、Ｓｈｅｒｍａｎ＋
　Ｐｉｎｋおよび旧ｃｋｓ　　（ｕ匹と（１９８６））
は、窒素源としてリジンおよびアルファ・ア朶ノアジビ
ン酸を与えて最低培地上に株を植えることによって、ど
のようなハプロイドイースト株の中にでも、ｈＬ２突然
変異に対する選択をおこなわせることが出来ることを示
した。育ったコロニーについて、それ等が、よく知られ
ているｎ４株を補足できなかったかをしらべる０株がｈ
社をもっていない時は、コロニーからＬｙｓ　”のもの
を選んでＬＹＳ２遺伝子を含んでいるＳＳＣ１切断プラ
スミツドで、Ｗをもっていない株を形質転換する。あと
で述べるようにしてＳＳＣ１切断ベクターをつくって、
０ｒｒＷｅａｖｅｒ等の方法によって（ｕｕ虹１９８３
）挿入形質転換によってｌ遺伝子を切断する。

次の如く、三つのＤＮＡ断片をつなぎ合せてプラスミツ
ドＤＮＡ　ｓｓｃ＋をっくる。先づ、２遺伝子の一部を
もっているプラスミツドｐＣＧＳ８６２（、ＵｇＬＬ約
６．５ｋｂ）を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１
で直鎖にする。次に、ＬＹＳ２遺伝子がＥｃｏ　Ｒ１お
よびＢｉｎｄＩ［［を用いて、制限的にプラスミツドｙ
ｒｐ６ｏ。

（ＢａｒｎｅｓおよびＴｈｏｒｎｅｒ、　−靭且ｕ（１
９８６））から切り取られる。続いて、アカローズ・ゲ
ル法で約５ｋｂ断片を単離する。最後にプラスくツドＹ
Ｃｐ５０　（Ｒ２）（第４図、例ｉｆ）を制限エンドヌ
クレアーゼＥｃ。

Ｒ１で完全に切断し、次にＨｉｎｄＩｆｆで部分的に切
断して、最初のＥｃｏ　Ｒ１からＦｌｉｎｄｌｆｆの断
片（第４図の最左）を除いてＹＣｐ５０　（Ｒ２）中に
ある挿入物のすぺてをもっている約６．４ｋｂ断片をア
ガロースゲルから単剤する。上記３つの断片が一緒に結
合されその結合混合物で、Ｅ、Ｃｏ１１　ＨＢＩＯＩを
アンピシリン耐性に形質転換する。いくつかの形質転換
体からのプラスミツドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
地図によって験して、一つのプラスミツドｐＤＩ　ｓｓ
ｃ＋が見出される。このプラスミツドは２つの１遺伝子
の部分の間にＬＹＳ２遺伝子が接合されているものを含
んでいることがわかっている。

野性のイースト株ＣＧＹ１５０　（−町４１１ムａ　　
ｕｒａ３−５２Ｉｅｕ２−３）の１ｙｓ２型が、アルフ
ァーアミノアジピン酸培地上で選んで得られる。（Ｓｈ
ｅｒｍａｎ、　Ｐｉｎｋおよび旧ｃｋｓ、−ｕハ１１９
８６）　ＣＧＹ１５０のこのＩｉＡ型はＣＧＹ１５０Ｌ
と呼ばれ、プラスミツドｐｃＧｓ７４０（ｓ並旦例１）
でＬｅｕ’に形質転換される、次に挿入された５ｕｎ−
ＰＡ転写単位をもっている、得られたＣＧＹ１５０Ｌ／
ｐｃＧｓ７４０株が、ｐＤＩＳ　ｓｓｃ＋の直鎖状断片
で形質転換されるｍ　ｐＤＩｓ　ｓｓｃ＋　のプラスミ
ツドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＣ１ａ　Ｉで切断
して、これでＣＧＹ１５０／ｐＣＧＳ７４０を形質転換
し、Ｌｙｓ”　コロニーを選ぶ、サウザン・プロット法
で確認すると新しい形質転換体ＣＧＹ１５０Ｌ／ｐｃＧ
ｓ７４０／ｐＤＩｓ　！３ｅｌの一つの染色体上の（ｃ
ｈｒｏ＋ｍｏｓｏｍａｌ）囚劇遺伝子はその中に挿入さ
れたｌ遺伝子が含まれていることが確かめられる。　Ｃ
ＧＹ１５０Ｌ／ｐＣＧＳ７４０およびＣＧＹ１５０Ｌ／
ｐＣＧＳ７４０／ｐＤＩｓ　ｓｓｃ＋　の両方は、共に
、ＳＭ−ＩＩブイヨン培地（実施例１参照）中で培養し
、２０ｐｌの条件づけしたブイヨン（ｂｒｏｔｈ）を牛
プラスごノゲンに富んだフィブリン寒天皿の試料たまり
（ｗｅｌｌ）におく。

ＣＧＹｌ、５ＯＬ／ｐｃＧｓ７４０／ｐＤ［ｓ　３３ｃ
＋　からのブイヨンは、ＣＧＹ１５０Ｌ／ＰＣＧＳ７４
０からのブイヨンよりもより大きいフィブリン溶解領域
をつくった。だから、野性のイースト株中のＳＳＣ１遺
伝子が切断していると、野性の株よりも十分効率的に人
、５ｃｕ−ＰＡを分泌する超分泌株をつくることがわか
る。

（実施例８） 切断されたＳＳＣ１遺伝子をもつ株は牛プロキモシンを
より効率的に分泌する。

野性タイプイースト株ＣＧＹ１５０−団ＡＴａ力→ａ　
ｕｒｆ纏−５２１ｅｕ２−３）のｎｎ型は上の実施例７
に記載されたようにしてえられ、ＣＧ’／１５０Ｌと命
名された。このプラスミントは次に切断されたＳＳＣ１
遺伝子であるプラスミツドｐａｌｓ　ｓｓｃ＋　の直鎖
状断片で形質転換される。ｐＤＩｓ　ｓｓｃ＋のプラス
ミツドＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼｃｌａ　Ｉで切
断され、ＣＧＹ１５０を形質転換するのに使用され、Ｌ
ｙｓ”コロニーが選ばれる。新しい形質転換体ＣＧＹ１
５０Ｌ／ｐＤＩｓ　！３ＣＩ　（７）　一つの染色体に
あるＳＳＣ１遺伝子はその中に挿入した形でＬ’／Ｓ２
遺伝子をもっていることがサウザン・プロット（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）で確かめられた。この切断され
たＳｌ遺伝子をもっている株はプラス多ツドｐｃＧｓ５
１４　（ＤｕｎｃａｎおよびＳｍ１ｔｈ、　　ヨーロッ
パ出願特許ＥＰ　２０１２０８号（１９８６）　；　プ
ラスミツドｐＣＧＳ５Ｉ４はイースト株ＣＧＹ９９８中
にある。　ＣＧＹ９９８はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに収集番号＾Ｔ
ＣＣ２０７５３として登録されているとの記録がある。

）でＵｒａ　”に形質転換され、イーストインベルター
ゼ分泌シグナルに接合し、イースト・トリオーズホスフ
ェート・イソメラーゼプロモータの指令の下に、牛プロ
キモシン遺伝子を与える。

プラスミツドｐｃＧｓ５１４で形質転換されたＣＧＹ１
５０ＬおよびＣＧＹ１５０Ｌ／ｐＤＩｓ　ｓｓｃ＋によ
って分泌されるプロキモシンのレベルを、Ｓ＋ｗｉｔｈ
、　ＤｕｎｃａｎおよびＭｏ１ｒ　（ｕ匹と、　１９８
５）の培養（ｇｒｏｉｉ　ｔｈ）と評価操作に従って比
較した０株ＣＧＹ１５０Ｌ／ｐＤｒｓ　５３ＣＩ　は、
株ＣＧＹ１５０Ｌよりも、共にプラスミツドｐｃＧｓ５
１４で形質転換されたとき、−層顕著にプロキモシンを
分泌する。だから野性のイースト株中あるＳＳＣ１遺伝
子の切断は、超分泌型株をつくり、野性の株よりもずっ
と顕著に牛ブａキモシンを分泌する。

（実施例９） ｕ−ＰＡ分泌の低下を選んで５ＳＣ２遺伝子をクローニ
ングする。株ＣＧＹ１２９１　（ＭＡＴａ力ｔｈａ　ｈ
ｉｓ４　Ｕｒａ３−５２ＳＳＣ２−１＝ＡＴＣＣ２０７
５２）はＳｈｅｒ−ｍａｎ＋　Ｆｉｎｋ、　　および旧
ｃｋｓ　（ユｕ■４９−５２頁（１９８６）　）の方法
に従って、ヒスチジン、ウラシル、リジンで補足され、
窒素源としてアルファ・アミノアジピン酸を含む、最小
栄養価の培地上で育成したコロニーの中から選択して、
分離した。　Ｕ、　Ｃ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙのｔｈｅ　Ｙ
ｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒか
ら得られた、純正なｈ婬株を補足することができなかっ
たのは、選択したコロニーＤ？ＩＹ１２９、にｈ社突然
変異体を含んでいたことを表わしている。

ｎ社遺伝子を含んだイーストの挿入型プラスミントおよ
び人・５ｃｕ−ＰＡ転写ユニットは次のようにしてつく
られる。　ＰＧＭプロモータ、イーストのインベルター
ゼ分泌シグナル、人・５ｃｕ−Ｐ＾補足ＤＮＡ遺伝子、
およびイーストのインベルターゼ・ターミネータを含む
４．７ｋｂ　ＤＮＡ断片は、プラスミントｐｃＧｓ”１
４０ｃユ旺ｕ　　例１から）先づＬＬＬｄＩＩＮで部分
的に切断し、（ｐｒａｔｉａｌ　ｒｅｓｔｒｊｃｔｉｏ
ｎ）　、Ｓａｌ　Ｉで完全に切断し、アガローズ・ゲル
で電気化学的に分離して導入された。機能的ＬＹＳ２遺
伝子およびｐＢＲ３２２配列を含んだ約８．６ｋｂ　［
ｌＮＡ断片はプラスミツドＹ　Ｉｐ６００　（Ｂａｒｎ
ｅｓおよびＴｈｏｒｎｅｒ、　」肚■１９８６）から制
限エンドヌクレアーゼＨ４ｎ　ｄｌｌＩおよびＳａｌ　
ｒで完全に切断して導かれる。この２つの断片は一緒に
接合され、接合混合物は、Ｅ、Ｃｏ１１　ＨＢＩＯＩを
形質転換してアンピシリン耐性にするのに用いる。

これらプラス短ツドＤＮＡは、いくつかの形質転換体か
ら試験され、ＹＩｐ６１１と名づけられた一つは、ＹＩ
ｐ６００のＨｉｎｄｌｌｌとＳａｔ　Ｉで切断した約０
．８ｋｂ断片に置換された、全５ｃｕ−ＰＡ転写単位を
もっていることがわかった。

株Ｄ）ＩＹ１２９はＬＹＳ２遺伝子のところで制限酵素
…ｏｌで直鎖化されたＹＩｐ６１１で、ＬＹＳ’に形質
転換される。典型的なＬＹＳ’形質転換体である、ＤＭ
Ｙ１３０は牛、プラスミントンに冨んだフィブリン皿に
入れた、形質転換用培養法（Ｊ迎■　例１）からのブイ
ヨン（ｂｒｏｔｈ）によってつくられたフィブリン溶解
の領域の大きさを測定して、測定にか＼る大きさの５ｃ
ｕ−ＰＡを分泌することが示された。

株口ＭＹ１３０は、Ｒｏｓｅ等（鋭匹Ｌ１９８７）のサ
ンプル（ｂｉｌｒａｒｙ）のうちからｙｓｐｓｏをベー
スにしたイーストの＾１＾４＋　ｃｚおよびＣ８のブー
ルからのプラスミツドＤＮＡ断片を用いてＩＬｏ等（Ｊ
、　ＢａｃＬｅｒｉｏ１１５３巻１６３−１６８頁（１
９８３））の方法によってＵｒａ”に形質転換した。そ
れらはコロニーに育成した後、突然変異体は無菌水で皿
から洗い出して、ヒスチジンで補足したＳＤ培地上に、
無菌のナイロンフィルターの表面におき直す（Ｓｈｅｒ
ｍａｎ、　ＦｉｎｋおよびＮ１ｃｋｓ　■肛虹１６４（
１９８６）。３０°Ｃ，３目抜ナイロンフィルターを皿
からはがして、コロニー側を上にして、ＳＭ−ｎ培養液
を含んだ寒天皿の表面におく。

ＳＭ−ＩＩｎ培養液＆ｌＩ威はく特に指定しなければ）
括弧中にリットル当りのグラム数で示した単位で、次の
通りであるグルコース（８０，０）、Ｋｌ（！（ＰＯ４
）（７，５）、ＮａＣ１（３，０）　、（ＮＨａ）ｇＨ
ＰＯ４（２０，０）　ＮＨＪｔＰＯｎ（２０，０）、ミ
オイノシトール（０，３）　、イースト抽出物（Ｄｉｒ
ｃｏ）（３，７５）、Ｍｇ５Ｏａ（０，３５）　、Ｚｎ
５Ｏｎ（０，０３）、　ＣｕＳＯｍ（０，００４５）、
ＦｅＮＨｎ（ＳＯａ）ｚ（０，０６）　、チア電ン（０
，０５２）　、ピリドキシン（０，０１５）　、パント
テン酸カルシウム（０，００７５）、および、ビオチン
（０，０１）、　３０℃で２−４日後、ナイロンフィル
ターをはづして、それを牛・プラスミツドンに冨んだフ
ィブリン皿の表面にコロニーを上にしておく、（■肚虹
　例１）３７°で４から１６時間内に、フィブリン溶解
領域が、鎚４遺伝子体であるコロニーの下に作られる。

中には、溶解領域を形づくらないコロニーもある。成る
ものは大多数のコロニーよりばずっとゆっくりと領域を
形づくるコロニーもある。これらのゆっくりと領域をつ
くるコロニーの若干のものがｙｃｐｓｏを基礎にしてプ
ラスミツドに、鎚４遺伝子を含んだコロニーである。

例えばＢｏｅｋｅ等、（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ
ｔ＋　１９７巻３４５−３４６頁（１９８４））の方法
に従って、５−フルオロ−オルチック酸を含む培養液上
で成育する、これらゆっくりと領域形成をする形質転換
体のうち若干のものからのＹＣｐ５０を基礎にしたプラ
スミツドのコロニーが、形質転換していないＤＭＹ１３
０株と仝じ程の効率で５ｃｕ−ＰＡを分泌すひるコロニ
ーになる。

これらのコロニーが１遺伝子を含んだｙｃｐｓｏを基礎
にしたプラスミツドを含んでいる。

このプラスミツドをイースト株から分離し、１）ＣＧＳ
８６１（ｓｕ且競　例１）で記載されたと全く仝じよう
に、Ｅ、Ｃｏ１１を用いてクローンされる。この５ＳＣ
２遺伝子は縮小細分（ｓｍａｌｌｅｒ　ａｎｄ　ｓｍａ
ｌｌｅｒ　ｆｒａｇＩｌｅｎｔｓ）サブクローニング法
でプラスミツド上に集められ、その遺伝子が、５ｃｕ−
ＰＡを十分分泌するように、ＤＭＹ１３０株を補足する
かどうかを吟味して、その中に機能性鎚４遺伝子が存在
するかどうかをしらぺる。

聾４遺伝子のＤＮＡ配列は回出遺伝子の配列を決定した
ときに用いたと仝じ方法で決定される。　ＬＹＳ２遺伝
子が、ｍ遺伝子の読みとり枠（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｖａ
ａ＋ｅ）の中に、プラス果ツドを形成するように挿入さ
れる、そのプラスミツドはハプロイドイースト株の中で
、ｐＤＩｓ、、。（鱈且ｒａ−例７）について述べられ
たように、５ＳＣ２を切断するのに用いられるプラスミ
ントである。　５ＳＣ２の座で切断された株は、野性の
株より、もっと効率よく、多くの異性蛋白質を分泌する
。更に鎚４が切断されている株による超分泌は回復され
ないし、フレーム・ジャスト、ナンセンスあるいは遺伝
手間抑制剤によって抑制をうけない。

上記した例はイースト中に異種蛋白質の生成を増加する
ために、超分泌株を選ぶ特別な具体例を示している。こ
の方法はすべてのイースト細胞に適用できる、それぞれ
の場合、この発明の操作を行なった後、イースト細胞は
、異種の蛋白質を少なくとも２倍増加させるように変化
したと決定されるような選別をうける。

細胞をクローニングし、育成して蛋白質を分泌するのを
増加させる、特別に工夫された方法は当業者が知るよう
に自由に変えることができる。又例えばイーストを、当
業者が容易に類推できるような、いろいろな培養法を用
い、醗酵条件をかえて育成することができる。

すべての場合において、本発明の方法に従って試験され
たイーストによって蛋白質の分泌が２倍に増加すること
は、有用なことである。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミツドｐｃＧＥ１９９の構造をあきらか
にする概略図、 第２図はプラス壽ツドｐｃＧｓ７１５の構造をあきらか
にする概略図、 第３図はプラスごツドｐｃＧｓ７４０の概略図、第４図
はプラスミツドρｃｇｓ６８１に添入されたＳＳＣＩ位
置まわりの制限エンドヌクレアーゼ切断図を表わしてい
る。 この図は又ρＣＧ５６８１から誘導される、ＹＣｐ５０
ベクターに挿入されるより小さなりＮＡ断片を示してい
る。そしてそれらＤＮＡ断片がイースト細胞による５ｃ
ｕ−ＰＡの分泌のためのＳＳＣ１−１形質で転換を補足
するかどうかを示している。 第５図はＳＳＣ１遺伝子のＤＮＡ配列と解読された蛋白
質の配列を示している。 第６図はグリコプロティンへのマンノーズ付加に関して
、種々の遺伝で形質転換されたイースト細胞から分泌さ
れたインベルターゼの変性されていないポリアクリルア
ミド・ゲルによる分離状態をあられす写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、切断されているか、欠失している遺伝子を持つ超分
   泌性イースト細胞、 該細胞は、該遺伝子に、機能性蛋白質の産生をできなく
   させ、その細胞の超分泌性を非漏出性かつ非回復性にす
   る。 ２、請求項１、の超分泌性イースト細胞において、該遺
   伝子がＳＳＣ１．である。 ３、請求項１、の超分泌性イースト細胞において、該遺
   伝子はＡＴＰアーゼと相同的である。 ４、サッカロミセスセレビーセのＳＳＣ１遺伝子は第５
   図に示した核酸配列と核酸配列から読み出されたアミノ
   酸配列をもっている。 ５、請求項１の超分泌性イースト細胞において該遺伝子
   がコードする蛋白質はグリコプロテインに付加するマン
   ノーズを調整する。 ６、非回復性でかつ非漏出性の超分泌性イースト株から
   蛋白を得る製造方法、 該製造方法は、分泌生成物をつくり出すために、細胞を
   選択し、その細胞を成育させることから成る。 該細胞は非回復性および非漏出性にするために、ａ）遺
   伝子を少なくとも一つの他の遺伝子を用いて切断するか
   、ｂ）遺伝子の一部が失欠するか、何れかの方法から一
   つの方法を選んで、変化させた遺伝子をもつ細胞から導
   く。 ７、請求項６の製造方法において、製造法中の該遺伝子
   が少なくとも一つの他の遺伝子を用いて切断される製造
   方法。 ８、請求項６の製造方法において、製造法中の該遺伝子
   の一部が失欠して該一連の細胞を非回復性および非漏出
   性にする製造方法。 ９、請求項６の製造方法において製造法中該遺伝子がコ
   ードする蛋白質がグリコプロテイン類に付加するマンノ
   ース鎖を調節する、製造方法。 １０、請求項６の製造方法において製造方法中、該遺伝
   子はＳＳＣ１である。 １１、請求項６の製造方法において製造方法中該遺伝子
   はＡＴＰアーゼに相同的である。１２、異種蛋白質を分
   泌しうるイースト細胞株から蛋白質生成物を取得する方
   法、 該方法は遺伝子を修飾し遺伝子ＳＳＣＩ中のＥｃｏＲＩ
   位置より先にあるすべてのコドンを脱落させたＳＳＣ１
   遺伝子を含む細胞株を選択する方法。 １３、ＳＳＣ遺伝子の野性の対立遺伝子をクローニング
   する製造方法は次の製造方法から構成される。 組み換えられたＤＮＡをもち、第１次レベルで異種蛋白
   質を分泌しうるＳＳＣ株を選択し、 該株に、野性のイースト・ゲノムからのＤＮＡ断片をも
   つ一連のプラスミッドを導入して、株に多様性を与え、 そして得られた株から第１次レベルを下まわるレベルで
   該異種蛋白質を分泌する株を選択することよりなる製造
   方法。 １４、請求項１３の製造方法において、蛋白質は人のｕ
   −ＰＡである。 １５、ＳＳＣ遺伝子の野性対立遺伝子をクローニングす
   る製造方法は、グリコプロテインに第１量のマンノーズ
   を付加し、この￥ＳＳＣ￥株を選別し、該株に野性のイ
   ーストゲノムからのＤＮＡをもつ一連のプラスミッドを
   導入し、株に多様性を与え、上記最初のレベルよりも多
   量のマンノーズの第２レベルを付加する株を選択する製
   造方法。 １６、請求項１５の製造方法において、製造方法中、該
   蛋白質はイースト・インベルターゼである。 １７、イースト株の異種の蛋白質の分泌を増加させる方
   法、この方法は、該株のもつ、少なくとも一つの遺伝子
   を切断することより成る、該切断された遺伝子は、ＡＴ
   Ｐアーゼと相同する蛋白質をコードし、或いは、グルコ
   プロテインへのマンノーズ付加を調節する蛋白質をコー
   ドする遺伝子である、そして切断されない、野性の遺伝
   子をもつ株よりも、異種の遺伝子産物を少なくとも倍以
   上分泌する、該株を選択する方法。 １８、グルコプロテインにマンノーズ外部鎖が全長の形
   で付加するように選択することで、￥ＳＳＣ￥遺伝子の
   野性対立遺伝子をクローニングする製造方法。 １９、ＳＳＣ遺伝子の野性の対立遺伝子をクローニング
   する製造方法。 該製造方法は、第１レベルで発胞形成出来るＳＳＣ突然
   変位に相同的で、異種的な状態で少なくとも一つの劣性
   な薬品耐性マーカーを持っているジプロイド株を選択す
   る。 多数の株を形づくるために、野性のイースト・ゲノムか
   らのＤＮＡ断片を含む一連のプラスミッドを該株の中に
   導入し、 該、多数の株を発胞形成状態に置きそして得られたハプ
   ロイド株中、薬品耐性マーカーを持ち、そのマーカーが
   耐性を提供する薬品に対して耐性を持つハプロイド株を
   選択する。ことから成る製造工程。